DE69818698T2

DE69818698T2 - Inhibitoren von metalloproteinasen, ihre therapeutische verwendung und verfahren zur herstellung der grundstoffe für ihre synthese

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Publication number: DE69818698T2
Application number: DE69818698T
Authority: DE
Inventors: Vincenzo Politi; Enrico Gavuzzo; Carlo Gallina; Giovanni Di Stazio; Silvana D'alessio; Antonio Sella; Cinzia Piazza; Cesare Giordano; Barbara Gorini; Gabriella Panini; Mario Paglialunga Paradisi; Maurizio Cirilli; Giorgio Pochetti; Fernando Mazza
Original assignee: Polifarma SpA; Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Current assignee: Polifarma SpA; Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Priority date: 1997-07-17
Filing date: 1998-07-17
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2018-07-18
Also published as: JP3325017B2; JP2001525315A; US6339160B1; ITRM970441A0; ITRM970441A1; IT1296305B1; WO1999003878A3; DE69818698D1; EP1019434B1; ES2206955T3; EP1019434A2; WO1999003878A2; AU8241898A

Description

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind neue Verbindungen, die in der Therapie einer Reihe von pathologischen Befunden beim Menschen wie etwa einem Tumorwachstum und einer Metastasierung, der Atherosklerose, der Multiplen Sklerose, der Alzheimer-Krankheit, der Osteoporose, der rheumatoiden Arthritis und anderen Entzündungskrankheiten verwendbar sind. Diese Verbindungen wiesen in der Tat als Ergebnis von vitro-Versuchen, die in den folgenden Kapiteln ausführlich beschrieben werden, eine bemerkenswerte Hemmfähigkeit auf bestimmte menschliche Enzyme, die zinkabhängigen Metallproteinasen, auf, welche mit solchen pathologischen Befunden in Verbindung gebracht wurden (siehe z. B.: "Inhibition of matrix metalloproteinases. Therapeutic potential" – Annuals N.Y. Acad. Sci. 732 (1994)). Wenngleich natürlich ein Abgleich der Versuchsdaten mit entsprechenden Beweisen in vitro erforderlich ist, lassen die bisher gesammelten Ergebnisse somit ihre Brauchbarkeit in spezifischen Therapien erwarten. Außerdem wurde eine solche Hemmfähigkeit ursprünglich auch bei einer Reihe von zinkabhängigen Metallproteinasen gezeigt, die aus Schlangengiften extrahiert werden, welche wegen ihrer Fähigkeit, umfangreiche innere Blutungen in den Opfern von Schlangenbissen hervorzurufen, auch als "Hämorrhagine" bezeichnet werden und den am meisten schädigenden Wirkstoff in den Giftmischungen darstellen, welche von Crotalidae und Viperidae hervorgebracht werden. Somit erscheint ihre Brauchbarkeit auch beim Herstellen von spezifischen Gegengiften gegen das Gift von Crotalidae und Viperidae offensichtlich.
Die Planung und Synthese von solchen Verbindungen stellt in der Tat den letzten Schritt in einer langen Folge von Forschungen dar, die auf der Untersuchung der Struktur und des Wirkungsmechanismus von bestimmten speziellen zinkabhängigen Metallproteinasen beruhen, welche als Hämorrhagine bezeichnet werden.
Der Artikel II FARMACO(1993), 48(9), 1271–7 zeigt, dass bei der Untersuchung von Peptidinhibitoren ein konformationell eingeschränktes Modell einer Verbindung, die an der Proteinase II aus Crotalus Adamanteus-Schlangengift getestet wurde, eine merklich niedrigere Hemmwirkung aufweist als die von verwandten Substraten. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Struktur der Inhibitorverbindung einen direkten Einfluss auf das Einpassen und Binden an der aktiven Stelle des Enzyms hat und a priori nicht vorhersehbar ist.
Die sogenannten hämorrhagischen Faktoren oder Hämorrhagine stellen eine sehr wichtige Klasse von Enzymen dar, die in dem Gift von Schlangen entdeckt wurden, die zu der Crotalidae-Familie gehören. Sie sind für die Schlange strukturell von Nutzen, da sie rasch ausgedehnte innere Blutungen in den Opfern auslösen, was zu einem Kreislaufkollaps führt und verhindert, dass das Opfer seinem Schicksal entgeht. Der Mechanismus der hämorrhagischen Wirkung beruht auf der besonderen Leichtigkeit, mit welcher die Enzyme im Stande sind, eine große Zahl von filiformen Proteinen abzubauen, welche die verschiedenen Gefäßendothelzellen binden, wodurch es möglich wird, dass Elemente des Blutes aus den Gefäßen entweichen. Wenngleich ihre Molekulargewichte sich erheblich unterscheiden, behalten die Hämorrhagine jedoch einige festgelegte Eigenschaften an der katalytischen Stelle bei, und zwar im Hinblick auf die Weise, wie Zink an bestimmte Aminosäuren der Proteinkette bindet, und auf die Weise, in der sie die Proteine der Basalmembran von Blutgefäßen angreifen. Sie scheinen auch den Mechanismus gemein zu haben, welcher den Schutz des Organismus der Schlange vor den toxischen Wirkungen ihrer eigenen Metallproteinasen gewährleistet, welcher auf der Erzeugung von Tripeptiden zu beruhen scheint, die als kompetitive Inhibitoren wirken können und mit der aktiven Stelle des Zink enthaltenden Enzyms wechselwirken (Biomed. Biochim. Acta 50, 769–773, 1991).
Nun stellt das Vorhandensein von Zink in der aktiven Stelle des Enzyms einen der interessantesten Aspekte der Untersuchung von Hämorrhaginen dar. In der Tat ist dieses Merkmal nicht nur ihnen eigen, sondern kennzeichnet eine Vielzahl von proteolytischen Enzymen, welche eine Reihe von wichtigen und unterschiedlichen physiologischen und pathologischen Funktionen in anderen Tierorganismen ausüben, die evolutionär ebenfalls ziemlich weit auseinanderliegen. In dieser Hinsicht wurde eine Vergleichsstudie durchgeführt, um mögliche Ähnlichkeiten und Unterschiede der Struktur zu bestimmen.
Durch Untersuchen der Sequenzen der Proteinketten und der Aminosäuren, die an der Zinkbindung beteiligt sind, war es möglich, eine Art von "Stammbaum" für diese Familie von Proteinasen zu erhalten (siehe z. B. FEBS Letters 312, 110–114, 1992 und Developmental Biology 180, 389–401, 1996): es hat sich folglich gezeigt, dass die aktive Stelle von Enzymen, die zu Lebewesen gehören, die voneinander ziemlich weit entfernt sind, wie Astatin (aus einem Flusskrebs extrahiert), Seratin (aus einem Mikroorganismus erhalten), Matrixinen (im Organismus von Säugern vorhanden) und die von hämorrhagischen Faktoren aus Schlangengift sich in Wirklichkeit nur durch eine der vier Aminosäuren unterscheiden, die Zink binden. Somit können sie trotz der Tatsache, dass es starke Unterschiede im Rest der Proteinstruktur gibt, als auf gewisse Weise evolutionär korreliert angesehen werden. Dies ist besonders interessant, wenn man die Tatsache berücksichtigt, dass die von diesen Enzymen ausgeübten Funktionen keineswegs analog sind. In der Tat wurde festgestellt, dass proteolytische Enzyme aus Schlangengift, welche einerseits sehr ähnlich sind und somit die Definition einer richtigen neuen Familie von Proteinasen: Schlangengift-Metallproteinasen ermöglicht haben (siehe z. B. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 373, 381–385, 1992), andererseits keine funktionelle Ähnlichkeit mit irgendeinem anderen Protein der Pflanzen- oder Tierwelt aufweisen. Insbesondere ist eine äußerst relevante Tatsache der Unterschied zwischen der Funktionalität von Hämorrhaginen und der von menschlichen Matrixinen, welche wichtige Auswirkungen auf die Zellwanderung und auf die Wiederherstellung von beschädigten Geweben ausüben. Außerdem sind Hämorrhagine im Augenblick der Verdünnung in dem Blutstrom sofort aktiv, während Matrixine in Form von "Zymogenen" (d. h. inaktiven Enzymen, welche durch das Eingreifen anderer Proteinasen funktionsfähig gemacht werden müssen) freigesetzt werden und durch bestimmte Proteine (TIMP) gehemmt werden können. Trotz solcher strukturellen und funktionellen Unterschiede hat die Anmelderin das Vorhandensein einer starken Übereinstimmung zwischen der Hemmung von Schlangen-Hämorrhaginen und den pharmakologischen Ergebnissen festgestellt, die an Tiermodellen erhalten werden, in welchen das pathogene Agens vermutlich eine zinkabhängige Metallproteinase ist, die durch die Gewebe des Säugers erzeugt wird. Eine solche Übereinstimung scheint die Folge einer strukturellen Ähnlichkeit zu sein, die – wenn auch nur in der aktiven Stelle – zwischen den zwei verschiedenen Arten von Metallproteinasen vorhanden ist, und auf dieser Grundlage hat die Anmelderin ein Verfahren zur Auswahl von Verbindungen für eine mögliche therapeutische Verwendung beim Menschen entwickelt (europäische Patentanmeldung EP0758021).
Viele zinkabhängige Säuger-Metallproteinasen wurden in der Tat mit pathologischen Situationen in Verbindung gebracht, von denen einige vorstehend erwähnt wurden. Zum Beispiel scheinen Gelatinasen an der Tumormetastasierung beteiligt zu sein, während der Collagenasen eine pathogene Rolle in arthritischen Phänomenen spielen.
EP-A-0 401 963 beschreibt Phosphonopeptide, die eine Hemmwirkung in Bezug auf Enzyme der Collagenase-Familie aufweisen, und als solche werden die Verbindungen als brauchbar für die Behandlung von arthritischen und anderen Krankheiten angesehen.
Bestimmte Verbindungen, welche Matrixine hemmen, sind in die Phase der klinischen Entwicklung bei Patienten eingetreten, die an Tumoren oder Arthritis leiden: sie werden jedoch üblicherweise kaum absorbiert, wenn sie oral verabreicht werden, und bestehen aus Hydroxamaten, Verbindungen, welche bei einer chronischen Verabreichung Toxizitätsprobleme aufwerfen können.
Schließlich wurde in letzter Zeit eine neue Familie von zinkabhängigen Metallproteinasen identifiziert, die sich auf der Zellmembran befinden, welche die gleichen Proteindomänen wie Hämorrhagine besitzen und somit als ihre engsten Verwandten angesehen werden (siehe Developmental Biology 180, 389–401, 1996). Diese Proteinasen, die ADAM (A Disintegrin and A Metalloproteinase Domain) genannt werden, sind mit der Funktionalität des Reproduktionsapparats verbunden, sind aber auch für das Freisetzen von TNF-a (Tumor-Nekrose-Faktor alpha) und ACE in den Kreislauf verantwortlich und scheinen mit ZNS-Erkrankungen, einschließlich der Multiplen Sklerose, korreliert zu sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen mit einer pharmakologischen Aktivität gegenüber menschlichen pathologischen Befunden bereitzustellen, welche in einen sicheren Zusammenhang mit der enzymatischen Aktivität von zinkabhängigen Metallproteinasen gebracht worden sind.
Die zur Lösung dieses Problems befolgte Strategie war, als Ausgangspunkte die nach gewiesene Ähnlichkeit der Struktur der aktiven Stelle, die zwischen Hämorrhaginen und anderen zinkabhängigen Säuger-Metallproteinasen vorhanden ist, und den Schutzmechanismus der Schlange gegen die Wirkungen ihres eigenen Giftes auf der Grundlage der Erzeugung von Peptiden, welche die enzymatische Aktivität von Hämorrhaginen selbst hemmen, heranzuziehen.
Auf der Grundlage dieser Daten wurde die Synthese von neuen Verbindungen geplant, die als Inhibitoren der Schlangenproteinasen dienen können, wobei angenommen wurde, dass sie in Anbetracht der strukturellen Ähnlichkeit in der aktiven Stelle auch als Inhibitoren von humanen zinkabhängigen Metallproteinasen dienen können.
Deshalb bestand ein erster Schritt darin, diese Verbindungen auf der Grundlage der dreidimensionalen Charakteristik der aktiven Stelle eines Hämorrhagins, Adamalysin II, die durch Röntgenstrahlen aufgeklärt wurde, und der bekannten Daten im Hinblick auf die "natürlichen" Inhibitoren eines solchen Enzyms zu planen.
Auf diese Weise ist es in der Tat möglich, nicht nur die relative Struktur von jeder einzelnen Domäne des Proteins sichtbar zu machen, sondern auch die Beziehung der Domänen innerhalb der quaternären Struktur des Proteins zu verifizieren. Es ist deshalb möglich, einige Strukturdaten zu erhalten, welche zusammen mit den enzymatischen Daten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des Wirkungs-Hemmungs-Mechanismus eines bestimmten Proteins ergeben. Es war somit möglich, bestimmte Verbindungen zu planen und zu konstruieren, die möglicherweise im Stande sind, an die aktive Stelle zu binden und als Inhibitoren des Proteins selbst zu wirken.
Als ein Ergebnis dieser Phase war es möglich, zu einer Definition dieser "peptidomimetischen" Verbindungen zu kommen, d. h. Verbindungen, die Peptiden ähnlich sind, denen aber wenigstens eine der Bindungen fehlt, welche die Moleküle durch die proteolytischen Enzyme leicht angreifbar machen, wobei ein wichtiges Merkmal die Substitution des terminalen Tryptophanrests mit dem analogen Phosphonat ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden:
in welcher R H oder CH₂-C₆H₅ sein kann und R' ein gesättigter oder aromatischer Ring, der durch fünf oder sechs Glieder gebildet wird, sein kann, von denen mindestens eines nicht Kohlenstoff ist, sondern unter Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt werden kann. Ein Beispiel wird durch die folgenden Strukturen geliefert:
Solche Verbindungen wurden dann durch zwei verschiedene Syntheseschemata erhalten, die in der letzten Phase ineinander übergehen.
In Diagramm 1 wird der Diethylester von (1)-Phosphotryptophan (1), der durch Verwenden einer modifizierten Version des vorstehend beschriebenen Verfahrens (Subotkowski, J., Kowalik J., Tyka R., Mastalerz P. Pol. J. Chem. 1981, 55, 853–857; Rogers R. S., Stern M. K. Synlett. 1992, 708), (d. h. die Reduktion von 1-Hydroxyamino-2-(3-indolyl)-ethanphosphonat mit Aluminiumamalgam in Gegenwart von wässrigem Ammo niak) erhalten wird, mit einem Pseudopeptid umgesetzt, das durch Acylierung von Leucin mit der Säure R'-COOH erhalten wird, wobei R' einen gesättigten oder aromatischen Ring bedeutet, der aus fünf oder sechs Gliedern gebildet wird, von denen mindestens eines nicht aus Kohlenstoff besteht, sondern unter Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt werden kann. Die resultierenden Diethylester (3) werden somit in die entsprechenden freien Phosphonsäuren umgewandelt, welche isoliert, gereinigt und als Cyclohexylaminsalze (4) aufbewahrt wurden.
In dem speziellen Fall der Verbindung 5 wurde diese Verbindung als inneres Salz erhalten und isoliert. Dies ist auch bei anderen gesättigten Ringen mit 5 oder 6 Gliedern, die Stickstoff enthalten, der Fall.
Die Bedingungen, unter denen die vorstehend erwähnten Versuche durchgeführt wurden, sind durch Symbole in dem Diagramm angegeben und sind die folgenden: (i) DCC, 1-HBT, THF, 15 h, 53–73%; (ii) N,O-Bistrimethylsilylacetamid, Me₃Sil, CH₂Cl₂, 25°C, 2 h; (iii) C₆H₁₁NH₂, AcOEt, 40–86%; (iv) 10% Pd/C, EtOH, 25°C, 2 h, 85%.
In Diagramm 2 wird statt dessen Indolessigsäure (6) in den Benzyldiethylester (8) von Phosphotryptophan umgewandelt.
Die so erhaltene Verbindung (8) wird dann mit den bereits in dem vorstehend beschriebenen Syntheseschema verwendeten Pseudopeptiden umgesetzt.
Das Entfernen von nur einer der zwei Benzylgruppen ergibt den Monobenzylester (10).
Die Reaktionsbedingungen werden hier ebenfalls summarisch durch Symbole unterschieden und sind nachstehend aufgeführt: (i) ClCO-COCl, CH₂Cl₂, 0,3% DMF, Rückfl., 30 min; (ii) Me₃Si-O-P(O-CH₂-C₆H₅)₂, CH₂Cl₂, –18°C, 1 h; (iii) NH₂OH HCl, C₅H₅N, EtOH, von –18 bis 4°C, 15 h, 46%; (iv) AlHg, NH₄OH, EtOH, 25°C, 2 h, 68%; (v) R'-CO-Leu-OH, i-Bu-O-CO-Cl, NMM, THF, –20°C, 88%; (vi) AlHg, NH₄OH, EtOH, 25°C, 4 Tage, 58%.
UNTERSUCHUNG DER PHARMAKOLOGISCHEN AKTIVITÄT
Die therapeutische Aktivität der so erhaltenen Pseudopeptide wurde durch Anwenden des zuvor von der Anmelderin erfundenen Verfahrens (europäische Patentanmeldung 758021) überprüft, wobei die speziellen Merkmale des Falles berücksichtigt wurden.
Die so erhaltenen Verbindungen wurden zuerst Versuchen unterzogen, um ihre tatsächliche Fähigkeit zum Hemmen der enzymatischen Aktivität von Schlangengift-Metallproteinasen zu testen, wobei sie auf die relative dreidimensionale Struktur solcher Metallproteinasen ausgelegt wurden, und zwar im Hinblick auf die Fähigkeit, an die aktive Stelle der Enzyme zu binden und somit als kompetitive Inhibitoren zu wirken.
Diese Eigenschaft wurde insbesondere durch Hemmtests in vitro an der Metallproteinase Adamalysin II, die aus Crotalus Adamanteus-Gift aufgereinigt wurde, überprüft, ein Protein, dessen dreidimensionale Konfiguration vollständig bekannt ist, welches auch ausgewählt wurde, weil es unter Schlangen-Metallproteinasen dasjenige ist, das der menschlichen Metallproteinase am nächsten kommt aufgrund der bemerkenswerten Homologie der primären Aminosäuresequenz, welche sie in der aktiven Stelle aufweist, mit dem Enzym, welches TNF-a beim Menschen freisetzt (TACE). Die in Beispiel 5 ausführlich beschriebenen Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein einer guten Hemmfähigkeit in allen getesteten Verbindungen hin, von denen einige auch eine bemerkenswerte Wirkungsstärke aufweisen (siehe nachstehend Tabelle I). Aufgrund der Ähnlichkeit zwischen Adamalysin II und TACE deuten diese Ergebnisse an sich auch eine mögliche pharmakologische Aktivität der Verbindungen gegen TNF-a an.
Der nächste Schritt bestand deshalb darin, die Hemmfähigkeit solcher Verbindungen auch in Bezug auf menschliche Metallproteinasen zu testen. Als Referenzproteinasen wurden zu diesem Zweck neutrophile Collagenasen und gereinigte Gelatinasen A aus menschlichen Zellkulturen signifikant ausgewählt.
Gelatinase A wird auch als MMP-2 bezeichnet und ist in der Tat ein Enzym, das zu der Matrixin-Familie gehört, von dem nachgewiesen wurde, dass es in vielen pathologischen Situationen in großer Menge erzeugt wird, und von dem angenommen wird, dass es hauptsächlich für die Wanderung von Tumorzellen aus dem Blut in Gewebe verantwortlich ist, welche durch Metastasephasen betroffen sind.
Desgleichen wurden auch neutrophile Collagenasen (die als MMP8 bezeichnet werden), die ebenfalls zu der Matrixin-Familie gehören, mit einer großen Zahl von pathologischen Situtationen in Verbindung gebracht. Insbesondere wird sie als in erster Linie verantwortlich für die Zerstörung von Knorpel angesehen, welche in Fällen einer chronischen Entzündung beobachtet wird. Folglich ist es ziemlich klar, dass die Identifizierung von Inhibitoren der Aktivität dieser beiden Proteine als erster und wichtiger Schritt zur Ausarbeitung neuer effizienter Therapien für diese phathologischen Befunde angesehen werden muss.
Was diese Überlegungen anbelangt, wurden Tests mit neutrophilen Collagenasen und Gelatinasen A selbst durchgeführt, um die effektive Fähigkeit von synthetisierten Verbindungen zu bestimmen, an die aktive Stelle von menschlicher Metallproteinase zu binden und so als kompetitive Inhibitoren zu dienen.
Die in den Beispielen 5 und 6 ausführlich beschriebenen Ergebnisse haben das Vorhandensein einer guten (wenngleich von Verbindung zu Verbindung schwankenden) Hemmfähigkeit solcher Verbindungen auch für diese Metallproteinasen gezeigt. Auch unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die zwei Proteinasen Funktionen ausüben, welche auch von anderen Matrixinen ausgeübt werden, müssen die für die beiden erhaltenen Ergebnisse deshalb auch als Anzeichen für die mögliche Hemmfähigkeit der Pseudopeptide, die Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind, auf andere zinkabhängige Matrixine angesehen werden, die als pathogene Wirkstoffe an vielen pathologischen Situationen beim Menschen beteiligt sind.
Diese Fähigkeiten deuten somit auf eine mögliche Verwendung von Pseudopeptiden als starke therapeutische Mittel hin, deren Wirksamkeit und pharmakologische Brauchbarkeit durch ihre besonderen chemischen Eigenschaften erhöht wird. Die Modifizierungen der Peptidstruktur dieser Verbindungen machen sie wahrscheinlich gegen proteolytische Enzyme im Magen beständig und deshalb können sie als für eine orale Verabreichung geeignet angesehen werden. Außerdem erhöht die Substitution des terminalen Tryptophanrests durch das analoge Phosphonat merklich die Hemmwirkung auf Enzyme, ohne Gefahren einer systematischen Toxizität von Molekülen einzuführen, die gegenwärtig einer klinischen Untersuchung bei Tumoren und Arthritis unterzogen werden. In der Tat beruhen sie auf Hydroxamatverbindungen, welche ein großes Zinkbindevermögen aufweisen, aber nach einer längeren Verabreichung eine Ansammlung von Hydroxylamin, einem potenziell krebserregenden Mittel, im Organismus herbeiführen. Dagegen weisen die Verbindungen, die Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind, da sie Phosphonate sind, keine Risiken von gefährlichen Nebenwirkungen auf, was durch Arzneimittel dieser Kategorie gezeigt wird, welche bereits auf dem Markt sind.
Bezug nehmend auf alles vorstehend Gesagte, sind die Aufgabe der vorliegenden Erfindung Verbindungen der allgemeinen Formel:
in welcher R H oder CH₂-C₆H₅ sein kann und R' ein gesättigter oder aromatischer Ring mit fünf oder sechs Gliedern sein kann, von denen mindestens eines nicht Kohlenstoff ist und ausgewählt werden kann in einer Gruppe, die Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel einschließt. Ein besonders bevorzugter Fall ist der, bei dem R' aus der Gruppe ausgewählt ist, die einschließt:
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung dieser als Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von mindestens einer der zinkabhängigen Metallproteinasen, die aus dem Gift von Schlangen extrahiert werden, die zu den Familien der Crotalidae und der Viperidae gehören, welche auch als Hämorrhagine bezeichnet werden (insbesondere Adamalysin II), und/oder mindestens einer der zinkabhängigen Metallproteinasen menschlichen Ursprungs, deren aktive Stelle eine dreidimensionale Struktur aufweist, die der Struktur der besagten Schlangen-Metallproteinasen analog ist (insbesondere der neutrophilen Collagenasen, Gelatinasen A und der ADAM).
Als Ergebnis aller bisher angegebenen Beobachtungen müssen die Verwendung solcher Verbindungen als Pharmazeutika für die therapeutische Behandlung von allen menschlichen pathologischen Befunden, bei denen gezeigt wurde, dass der pathogene Mechanismus oder die Symptomatologie mindestens eine zinkabhängige Metallproteinase einschließt, und entsprechende pharmazeutische Verbindungen, welche sie enthalten, ebenfalls in Betracht gezogen werden. Insbesondere wird auf das Tumorwachstum und die Metastasierung, die Atherosklerose, die Multiple Sklerose, die Alzheimer- Krankheit, die Osteoporose, den Hochdruck, die rheumatoide Arthritis und andere Entzündungskrankheiten Bezug genommen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zum Herstellen des (1)-Phosphotryptophandiesters als Ausgangsprodukt für die Synthese der vorstehend beschriebenen Verbindungen, welches als wesentlichen Arbeitsgang die Reduktion von 1-Hydroxyamino-2-(3-indolyl)ethanphosphonat durch Zugeben eines Aluminiumamalgams in Gegenwart von wässrigem Ammoniak einschließt.
Bisher wurde eine allgemeine Beschreibung der vorliegenden Erfindung angegeben. Mit Hilfe der folgenden Beispiele wird nun eine ausführlichere Beschreibung von speziellen Ausführungsformen angegeben, um ein besseres Verständnis der Aufgaben, Merkmale, Vorteile und Betriebsverfahren der Erfindung zu ergeben. Solche Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und beschränken den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht.
Beispiel 1
Herstellung des Oxalats von (1)-Diethyl-1-amino-2-(3-indolyl)ethanphosphonat(Verbindun 1)
Zu einer Lösung von Diethyl-1-hydroxyimino-2-(3-indolyl)ethanphosphonat(Subotkowski, J., Kowalik J., Tyka R., Mastalerz P. Pol. J. Chem. 1981, 55, 853–857) (7,93 g, 25,6 mmol) in EtOH/H₂O 13/1 (38 ml) und wässrigem NH₃ mit einer Konzentration von 25% (11 ml) wurde unter Rühren ein Aluminiumamalgam (15 g) zugegeben. Nach 19 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf Kieselgur filtriert und die Lösung wurde bei vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wurde in EtOAc (500 ml) gelöst und mit 1 N NaOH (100 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (100 ml) extrahiert. Nach dem Trocknen der organischen Phase über Na₂SO₄ wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde in EtOAc (40 ml) unter Rühren gelöst und tropfenweise mit einer Lösung von Oxalsäure (2,30 g, 25,6 mmol) in EtOAc (40 ml) versetzt. Das als ein kristalliner hygroskopischer Feststoff gebildete Salz wurde durch Filtration gewonnen: 9,88 g (100%).
Das in den anschließenden Umwandlungen verwendete (1)-Diethyl-1-amino-2-(3-indolyl)ethanphosphonat (1) wurde durch Trennung von der racemischen Form unter Einsatz von D-(+)-Dibenzylweinsäure erhalten (Lavielle G., Hautefaye P, Schaeffer C., Boutin J. A., Cudennec C. A., Pierré A. J. Med. Chem. 1991, 34, 1998–2003) erhalten.
Beispiel 2
Herstellung der Pseudodipeptide
Herstellung von N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucin (Verbindung 2a)
Zu einer Lösung von Furan-2-carbonsäure (2,0 g, 17,8 mmol) und N-Methylmorpholin (1,95 ml, 17,8 mmol) in wasserfreiem THF (10 ml), die auf –15°C gekühlt war, wurde eine äquivalente Menge an Isobutylchlorformiat (2,33 ml, 17,8 mmol) tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach 30 Minuten wurde eine Lösung von L-Leucin-methylester-hydrochlorid (3,23 g, 17,8 mmol) und N-Methylmorpholin (1,95 ml, 17,7 mmol) in wasserfreiem THF (15 ml) langsam zugegeben, wobei das Gemisch unter Rühren zwei Stunden lang bei –15°C gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH₂Cl₂ (100 ml) verdünnt und mit 1 N HCl (30 ml × 2), gesättigter NaHCO₃-Lösung (30 ml × 2) und gesättigter NaCl-Lösung (30 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Phase über Na₂SO₄ und dem Entfernen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck wurde das Rohprodukt als ein öliger Rückstand erhalten, welcher sich spontan verfestigte. Durch Mahlen bzw. Verreiben der festen Substanz in Petroleumether wurden weiße Kristalle von Ether N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucin-methylester erhalten: 3,32 g (80%); Schmelzpunkt 88–90°C; [α]_D ²² = –23° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3424, 2956, 1741, 1663, 1595, 1517, 1351, 1177 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,95 und 1,02 [zwei s, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,45–2,00 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂], 3,85 (s, 3, OCH₃), 4,73–5,13 (m, 1, aCH), 6,39–7,45 [m, 3, aromatische von Furan und 6,89 (d, 1, NH, J = 8 Hz)]. Berechnet für C₁₂H₁₇NO₄: C, 60,24; H 7,16; N 5,85. Gefunden C 60,15; H 7,22; N 5,88%.
Eine Lösung von N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucin-methylester (2,73 g, 11,4 mmol) und Dioxan/MeOH 7/1 (80 ml) und 1 N NaOH (22,8 ml) wurde eine Nacht lang bei Raumtemperatur gehalten. Nach dem Konzentrieren des Lösungsmittels bei vermindertem Druck wurde die alkalische wässrige Phase in H₂O (20 ml) verdünnt, mit Et₂O (30 ml × 2) gewaschen, mit 2 N HCl angesäuert und mit CHCl₃ (70 + 30 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung (30 ml × 2) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und bei vermindertem Druck abgedampft. Die Kristallisation des Rohproduktes aus CH₂Cl₃/Petroleumether ergab das reine Produkt (2a) in weißer fester Form: 2,24 g (90%); Schmelzpunkt 80–3°C; [α]_D ²² = –10° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3426, 2957, 1721, 1659, 1593, 1419, 1179, 1011 cm^–1; ¹H-NMR (MeOD): d 0,75–1,08 [m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,50–1,83 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂], 4,32–4,80 (m, 1, aCH), 6,30–7,46 (m, 4, Furanprotonen). Berechnet für C₁₁H₁₅NO₄: C, 58,66; H, 6,71; N, 6,22. Gefunden C, 58,34; H, 6,33; N, 6,01%.
Herstellung von N-[(Pyrrol-2-yl)carbonyl]-L-leucin (Verbindung 2b).
Zu einer Lösung von Pyrrol-2-carbonsäure (1,11 g, 10 mmol), L-Leucinmethylester-hydrochlorid (1,82 g, 10 mmol) und N-Methylmorpholin (1,09 ml, 10 mmol) in EtOAc (25 ml), die auf 0°C gekühlt war, wurde unter Rühren eine Lösung von DCDl (2,06 g, 10 mmol) und HBT (13 mg, 1 mmol) in EtOAc (5 ml) zugegeben. Nach dem Stehen über Nacht bei Raumtemperatur wurden der N,N'-Dicyclohexylharnstoff und das N-Methylmorpholin-hydrochlorid durch Filtration abgetrennt.
Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 100 ml EtOAc verdünnt und mit 1 N HCl (40 + 20 ml), gesättigter NaHCO₃-Lösung (40 + 20 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (40 ml) extrahiert. Nach dem Trocknen der vereinigten organischen Phasen über Na₂SO₄ wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt. Die Kristallisation des Rohmaterials aus 1,2-Dichlorethan/n-Hexan ergab N-[(Pyrrol-2-yl)carbonyl]-L-leucin-methylester als hellrosa Feststoff: 1,73 g (73%); Schmelzpunkt 131–2°C; [α]_D ²² = –13° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3450, 2956, 1737, 1642, 1553, 1551, 1179, 1113 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,88 und 0,95 [zwei s, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,47–1,80 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂], 3,62 (s, 3, OCH₃), 4,50–4,82 4M, 1, ACH7, 5,87–6,75 (m, 4, aromatische von Pyrrol und NH), 9,92 (bs, 1, Pyrrol NH). Anal. Berechnet für C₁₂H₁₈N₂O₃: C, 60,49; H 7,61; N 11,76. Gefunden C 60,72; H 7,82; N 11,87%.
Eine Lösung von N-[(Pyrrol-2-yl)carbonyl]-L-leucin-methylester (1,82 g, 7,62 mmol) in Dioxan/MeOH 7/1 (80 ml) und 1 N NaOH (15,24 ml) wurde eine Nacht lang bei Raumtemperatur gehalten. Nach dem Konzentrieren des Lösungsmittels bei vermindertem Druck wurde die wässrige alkalische Phase in H₂O (15 ml) verdünnt, mit Et₂O (25 ml × 2) gewaschen, mit 2 N HCl angesäuert und mit CHCl₃ (60 + 20 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung (20 ml × 2) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und bei vermindertem Druck eingedampft. Die Kristallisation des Rohproduktes aus 1,2-Dichlorethan ergibt das reine Produkt (2b) als weiße Kristalle: 708 mg (41%); Schmelzpunkt 78–80°C; [α]_D ²² = –8° (1, Acetonitril); IR (CHCl₃): 3448, 3262, 2957, 1713, 1640, 1553, 1437, 1185, 1042, cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,75–1,05 [m, 6, CH₂CH(CH₃)₂], 1,40–1,85 [m, 3, CH₂CH(CH₃)₂], 4,07–4,48 (m, 1, aCH), 5,78–6,72 (m, 3, aromatische von Pyrrol), 7,75 (d, 1, NH, J = 4,5 Hz), 8,0 (s, 1, NH von Pyrrol), 10,59 (bs, 1, COOH). Berechnet für C₁₁H₁₆N₂O₃: C, 58,91; H 7,19; N 12,49. Gefunden C 58,53; H 7,18; N 12,20%.
Herstellung von N-{[(S)-(5-Oxo-tetrahydrofuran-2-yl)carbonyl]}-L-leucin (Verbindung 2e)
Zu einer Lösung von (S)-(+)-5-Oxo-tetrahydrofuran-2-carbonsäure (1,0 g, 7,68 mmol) und N-Methylmorpholin (0,84 ml, 7,68 mmol) in wasserfreiem THF/wasserfreiem Dioxan 2/1 (15 ml), die auf –15°C gekühlt war, wurde die äquivalente Menge an Isobutylchlorformiat (1,04 ml, 7,68 mmol) tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach 30 Minuten wurde eine Lösung von L-Leucin-tertbutylester (1,44 g, 7,68 mmol) und wasserfreiem THF (5 ml) langsam zugegeben, wobei das Gemisch unter Rühren zwei Stunden lang bei –15°C gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH₂Cl₂ (70 ml) verdünnt und mit gesättigter NaCl-Lösung (20 ml), 1M KHSO₄ (20 + 10 ml), gesättigter NaHCO₃-Lösung (20 + 10 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet und bei vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie an Silicagel (CH₂Cl₂/i-PrOH 98/2) gereinigt. Durch Mahlen bzw. Verreiben des festen rohen Rückstands in n-Hexan wurde der N-{[(S)-(5-Oxo-tetrahydrofuran-2-yl)carbonyl]}-L-leucin-tertbutylester als weiße Kristalle erhalten: 920 mg (40%); Schmelzpunkt 79–81°C; [α]_D ²² = –25° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3415, 2934, 1788, 1727, 1677, 1517, 1369, 1149 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,87 und 0,97 [zwei s, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,18–1,62 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂] und 1,40 [s, 9, C(CH₃)₃], 2,15–2,80 (m, 4, Ring CH₂CH₂), 4,25–4,55 (m, 1, Ring CH), 4,62–4,88 (m, 1, aCH), 6,56 (d, 1, NH, J = 8 Hz). Berechnet für C₁₅H₂₅NO₅: C, 60,18; H 8,42; N 4,68. Gefunden C 60,12; H 8,61; N 4,65%.
Zu einer Lösung von N-{[(S)-(5-Oxo-tetrahydrofuran-2-yl)carbonyl]}-L-leucin-tertbutylester (800 mg, 2,67 mmol) in CH₂Cl₂ (3,0 ml), die auf 0°C gekühlt war, wurde frisch destillierte wasserfreie Trifluoressigsäure (0,5 ml) zugegeben. Nach einer Nacht bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde in Et₂O gelöst. Durch Zugeben von n-Hexan trennte sich die Verbindung (2e) als ein braunes Öl ab und wurde getrocknet und in Hochvakuum dekantiert: 650 mg (100%); [α]_D ²² = –7° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3413, 3036, 2957, 1787, 1725, 1678, 1526, 1172, 1151 cm^–1; ¹1H-NMR (CDCl₃): d 0,87 und 0,93 [zwei s, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,37–1,83 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂], 2,06–2,73 (m, 4, Ring CH₂CH₂), 4,30-4,63 (m, 1, Ring CH), 4,67–4,92 (m, 1, aCH), 6,92 (d, 1, NH, J = 8Hz), 8,15 (s, 1, COOH). Berechnet für C₁₇H₃₀N₂O₅·1/2H₂O (Cyclohexylaminsalz): C, 56,66; H 8,89; N 7,77. Gefunden C 57,00; H 9,12; N 8,13%.
Herstellung von N-{[(R)-(2-Oxo-thiazolidin-4-yl)carbonyl]}-L-leucin (Verbindung 2f).
Zu einer Lösung von (R)-(–)-2-Oxo-thiazolidin-4-carbonsäure (1,49 g, 10,2 mmol), L-Leucin-methylester-hydrochlorid (1,85 g, 10,2 mmol) und N-Methylmorpholin (1,12 ml, 10,2 mmol) in wasserfreiem THF (15 ml), die auf 0°C gekühlt war, wurde unter Rühren eine Lösung von DCDl (2,10 g, 10,2 mmol) und HBT (13 mg, 1 mmol) in wasserfreiem THF (8 ml) zugegeben. Nach dem Stehen über Nacht bei Raumtemperatur wurden der N,N'-Dicyclohexylharnstoff und das Hydrochlorid von N-Methylmorpholin durch Filtration abgetrennt und die filtrierte Substanz wurde bei vermindertem Druck konzentriert. Das Produkt wurde durch Verdünnung des rohen Rückstands mit CHCl₃ (50 ml) und Extraktion mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (20 ml × 2) und gesättigter NaCl-Lösung (30 ml) gereinigt. Das Trocknen der vereinigten organischen Phasen über Na₂SO₄ und das Entfernen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck ergab den N-{[(R)-(2-Oxo-thiazolidin-4-yl)carbonyl]}-L-leucin-methylester, welcher mit EtOAc kristallisiert wurde: 1,94 g (69%); Schmelzpunkt 125–6°C; [α]_D ²² = –79° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3412, 2956, 1734, 1678, 1515, 1434, 1338, 1158 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,90 und 0,95 [zwei s, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,42–1,74 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂], 3,37–3,85 [m, 2, CH₂S und 3,63 (s, 3, OCH₃)], 4,18–4,69 (zwei m, 2, aCH und Ring CH), 7,16 (d, 1, NH, J = 8 Hz). Berechnet für C₁₁H₁₇N₂O₄S: C, 48,34; H 6,27; N 10,25. Gefunden C 48,29; H 6,80; N 10,22%.
Eine Lösung von N-{[(R)-(2-Oxo-thiazolidin-4-yl)carbonyl]}-L-leucin-methylester (2,08 g, 7,58 mmol) in Dioxan/MeOH 7/1 (90 ml) und 1 N NaOH (23 ml) wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach dem Konzentrieren des Lösungsmittels in wässriger alkalischer Phase wurde sie mit H₂O (20 ml) verdünnt, mit Et₂O (30 ml × 2) gewaschen, mit 2 N HCl angesäuert und mit EtOAc (70 + 30 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung (20 ml × 2) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und bei vermindertem Druck eingedampft. Durch Kristallisation aus EtOAc wurde das reine Produkt (2f) als weiße Kristalle erhalten: 643 mg (32%); Schmelzpunkt 90–3°C; [α]_D ²² = –69° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3297, 1672, 1446, 1405, 1369, 1157 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d6): d 0,70 und 0,97 [m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,35–1,76 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂], 3,09–3,68 (m, 2, CH₂S), 3,95–4,30 (m, 2, aCH und Ring CH), 7,85–8,07 (m, 2, 2 NH). Berechnet für C₁₀H₁₆N₂O₄S: C, 46,14; H 6,20; N 10,76. Gefunden C 45,75; H 6,16; N 10,36%.
Herstellung von N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucin (Verbindung 2g)
Zu einer Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutaminsäure (1,6 g, 6,0 mmol) und N-Methylmorpholin (0,66 ml, 6,0 mmol) in wasserfreiem THF (10 ml), die auf –15°C gekühlt war, wurde eine äquivalente Menge an Isobutylchlorformiat (0,82 ml, 6,0 mmol) tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach 30 Minuten wurde eine Lösung von L-Leucin-tertbutylester-hydrochlorid (1,34 g, 6,0 mmol) und N-Methylmorpholin (0,66 ml, 6,0 mmol) in wasserfreiem THF (9 ml) langsam zugegeben, wobei die Temperatur 2 Stunden lang bei –15°C gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit EtOAc (70 ml) verdünnt und mit gesättigter NaCl-Lösung (20 ml), 1M KHSO₄ (20 + 10 ml), gesättigter NaHCO₃-Lösung (20 + 10 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck entfernt. Die Kristallisation des Rohmaterials aus EtOAc/n-Hexan ergab N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucin-tertbutylester als weiße Kristalle: 2,0 g (77%); Schmelzpunkt 130–1°C; [α]_D ²² = –70° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3420, 2958, 1794, 1723, 1514, 1303, 1152 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,8–0,91 [m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,20–1,67 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂ und 1,43 (s, 9, OC(CH₃)₃], 2,00–2,93 (m, 4, CH₂CH₂ von pGlu), 4,27–4,61 (m, 2, 2 aCH), 5,22 (s, 2, CH₂ von Benzyl), 6,24 (d, 1, NH, J = 8 Hz), 7,28 (s, 5, aromatische von Benzyl). Berechnet für C₂₃H₃₂N₂O₆: C, 63,87; H 7,46; N 6,48. Gefunden C 64,20; H 7,60; N 6,48%.
Eine Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucin-tertbutylester (1,0 g, 2,3 mmol) in frisch destillierter wasserfreier Trifluoressigsäure (3 ml) wurde 30 Minuten bei 0°C und 4 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Überschüssige Trifluoressigsäure wurde bei vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt wurde 2 Stunden unter Hochvakuum getrocknet. Die Kristallisation aus EtOAc/Et₂O ergab ein reines Produkt (2g) als einen weißen Feststoff: 721 mg (83%); Schmelzpunkt 164–5°C; [α]_D ²² = –45° (1, Methanol); IR (KBr): 3336, 3094, 1767, 1654, 1554, 1305, 1288, 1267, 1197, 1153 cm^–1; ¹H-NMR (MeOD): d 0,75–1,02 [m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,42–1,77 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂], 2,00–2,73 (m, 4, CH₂CH₂ von pGlu), 4,29–4,77 (zwei s, 2, 2 aCH), 5,23 (d, 2, CH₂ von Benzyl, J = 3 Hz), 7,36 (s, 5, aromatische). Berechnet für C₁₉H₂₄N₂O₆: C, 60,63; H 6,43; N 7,44. Gefunden C 60,38; H 6,09; N 7,27%.
Beispiel 3:
Acylierung von (1)-Phosphotryptophan-diethylester und Herstellung von Cyclohexylaminsalzen der Acyl-L-leucyl-Derivate von d(1)-Phosphotryptophan. Allgemeines Verfahren.
A) Zu einer Lösung des geforderten L-Leucylderivats (1 mmol) und von (1)-Phosphotryptophandiethylester (1 mmol) in wasserfreiem THF (5 ml), die auf 0°C gekühlt war, wird unter Rühren eine Lösung von DCDl (206 mg, 1 mmol) und HBT (14 mg, 0,1 mmol) in wasserfreiem THF (5 ml) zugegeben. Nach dem Stehen über Nacht bei Raumtemperatur wird der N,N'-Dicyclohexylharnstoff durch Filtration abgetrennt und bei vermindertem Druck konzentriert. Die Lösung des Rückstandes in 30 ml EtOAc wird mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (20 × 2 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (15 ml) extrahiert. Nach dem Trocknen der vereinigten organischen Phasen über Na₂SO₄ wird das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt.
B) Zu einer Lösung von Acyl-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-diethylester (1 mmol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (10 ml) wird unter Rühren in einer Stickstoffatmosphäre ein Überschuss von N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (BSA) (11 mmol, 2,69 ml) zugegeben. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch auf –20°C gekühlt und ein Überschuss an lodtrimethylsilan (8 mmol, 1,1 ml) wird tropfenweise zugegeben. Am Ende der Zugabe der reaktiven Substanz wird die Lösung innerhalb einer Stunde auf 0°C gebracht und weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Der dunkle ölige Rückstand, der durch Konzentration des Reaktionsgemisches bei niedrigem Druck erhalten wird, wird eine Stunde lang mit CH₃CN/H₂O 7/3 (3 ml) behandelt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck wird der ölige Rückstand in EtOAc (40 ml) gelöst und mit 1,5% Na₂SO₄ in 1 N HCl (10 ml × 2) und gesättigter NaCl-Lösung (10 ml) gewaschen. Die organische Phase wird über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wird bei vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt, das in EtOAc (4,5 ml) gelöst ist, wird tropfenweise mit einer Lösung von Cyclohexylamin (1 mmol) in EtOAc (4,5 ml) behandelt. Nachdem es die Form eines festen hygroskopischen Kristalles angenommen hat, wird das Salz durch Filtration gewonnen.
Herstellung des N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-salzes von Cyclohexylamin (Verbindung 4a).
N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucin (2a, 536 mg, 2,38 mmol) und (1)-Phosphotryptophan-diethylester (705 mg, 2,38 mmol) wurden gemäß Verfahren A umgesetzt. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie an Silicagel (CHCl₃/i-PrOH 98/2) gereinigt, wobei der N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucin-(1)-phosphotryptophan-diethylester (3a) in Form eines Schaumes erhalten wurde: 733 mg (62%); [α]_D ²² = –55° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3478, 3418, 1660, 1474, 1244, 1026 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,88 [(2d, 6, CH₂CH(CH ₃)₂, J = 6,1 Hz], 1,20–1,40 [m, 8, CH ₃CH₂O und 2 von CH ₂CH(CH₃)₂], 1,60 [m, 1, 1 von CH ₂CH(CH₃)₂), 3,11 und 3,35 (zwei m 2, bCH₂ Trp^P), 4,12 (m, 4, 2CN₃CH ₂O), 4,64 (m, 1, aCH Leu), 4,77 (m, 1, aCH Trp^P), 6,56 (d, 1, NH Leu, J = 8,8 Hz), 6,90 (d, 1, NH-CO Trp^P), 6,48–7,61 (m, 8, 5 aromatische von Indol und 3 aromatische von Furan), 8,10 (s, 1, NH von dem Indol). Berechnet für C₂₅H₃₄N₃O₆P·2/3H₂O: C, 58,85; H 6,98; N 8,24. Gefunden C 58,40; H 6,66; N 7,85%.
N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucin-(1)-phosphotryptophan-diethylester (3a, 150 mg, 0,298 mmol), BSA (0,80 ml, 3,27 mmol) und TMSl (0,32 ml, 2,38 mmol) wurden gemäß Verfahren B umgesetzt. Durch die Behandlung mit Cyclohexylamin (29 mg, 0,298 mmol) wird das reine Produkt (4a) als ein hygroskopischer Feststoff erhalten: 128 mg (79%); [α]_D ²² = –67° (1, Methanol); IR (KBr): 3291, 2937, 1631, 1528 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d₆): d 0,80 [(m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 0,95–2,01 [m, 13, CH₂)₅ Cyclohexylamin und CH ₂CH(CH₃)₂], 2,83 (m, 2, CHN Cyclohexylamin und 1H von bCH₂ Trp^P), 3,29 (m, 1, 1H von bCH₂ Trp^P), 4,13 (m, 1, aCH Trp^P), 4,47 (m, 1, aCH Leu), 6,51–7,88 [(m, 9, aromatische von Indol, von Furan und 7,74 (d, 1, J = 9,3 Hz, NH von Trp^P)], 8,48 (d, 1, J = 8,9 Hz, NH Leu), 10,64 (s, 1, NH von Indol). Berechnet für C₂₇H₃₉N₄O₆P·1/2H₂O (Cyclohexylaminsalz): C, 58,37; H 7,26; N 10,08. Gefunden C 58,11; H 6,99; N 9,81%.
Herstellung von N-((Pyrrol-2-yl)carbonyl]-L-leucin-(1)-phosphotryptophan (Verbindung 4b).
N-[(Pyrrol-2-yl)carbonyl]-L-leucin (2b, 303 mg, 1,35 mmol) und (1)-Phosphotryptophan-diethylester (400 mg, 1,35 mmol) wurden gemäß Verfahren A umgesetzt. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie an Silicagel (CHCl₃/i-PrOH 99/1) gereinigt. Durch anschließendes Mahlen bzw. Verreiben des festen Rückstandes in wasserfreiem Et₂O wurde N-[(Pyrrol-2-yl)carbonyl]-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan (3b) als weiße Kristalle erhalten: 415 mg (61%); Schmelzpunkt: 172–4°C; [α]_D ²² = –68° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3278, 2957, 1632, 1553, 1510, 1332, 1199 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,80 und 0,87 [zwei s, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,13–1,83 [m, 8, 2CH ₃CH₂O und zwei CH ₂CH(CH₃)₂], 2,59 und 3,27 (zwei m, 2, bCH₂ Trp^P), 3,79–4,26 (m, 4, 2CH₃CH ₂O), 4,40–5,23 (zwei m, 2, 2 aCH), 5,83–6,41 (m, 4, aromatische von Pyrrol und 1 NH), 6,55–7,55 (m, 5, aromatische von Indol), 8,44 und 8,54 (zwei s, 2, NH von Pyrrol und NH von Indol). Berechnet für C₂₅H₃₅N₄O₅P: C, 59,75; H 7,02; N 11,15. Gefunden C 59,47; H 6,93; N 10,77%.
N-[(Pyrrol-2-yl)carbonyl]-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-diethylester (3b, 361 mg, 0,72 mmol), BSA (1,93 ml, 7,92 mmol) und TMSl (0,78 ml, 5,76 mmol) wurden gemäß Verfahren B umgesetzt. Durch die Behandlung mit Cyclohexylamin (71,4 mg, 0,72 mmol) wird das reine Produkt (4b) als ein hygroskopischer Feststoff erhalten: 339 mg (86%); [α]_D ²² = –74° (1, Methanol); IR (KBr) 3277, 2937, 1645, 1524, 1140, 1047 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d₆): d 0,80 [m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 0,96–2,00 [m, 13, (CH₂)₅ Cyclohexylamin und CH ₂CH(CH₃)₂], 2,86 (m, 2, CHN Cyclohexylamin und 1 H von bCH₂ Trp^P), 3,30 (m, 1,1H von bCH₂ Trp^P), 4,17 (m, 1, aCH Trp^P), 4,51 (m, 1, aCH Leu) 6,07 (scheinbares s, 1, CH von Pyrrol), 6,75–7,60 [(m, 7, aromatische von Indol und von Pyrrol), 7,72 (d, 1, J = 8,0 Hz, NH von Trp^P)], 8,37 (d, 1, J = 7,7 Hz, NH Leu), 10,67 (s, 1, NH von Indol), 12,01 (s, 1, NH von Pyrrol). Berechnet für C₂₇H₄₀N₅O₅P·7/2H₂O (Cyclohexylaminsalz): C, 53,29; H, 7,72; N, 11,51. Gefunden C, 53,37; H, 7,32; N, 11,41%.
L-Prolyl-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan (Verbindung 5).
N-Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-leucin (Cash W. D. J. Org.Chem., 1961, 26, 2136), (2c 490 mg, 1,35 mmol) und (1)-Phosphotryptophan-diethylester (400 mg, 1,35 mmol) wurden gemäß Verfahren A umgesetzt. Die Kristallisation des Rohmaterials aus wasserfreiem Et₂O ergab den N-Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-diethylester (3c) als einen kristallinen hygroskopischen Feststoff: 570 mg (66%); [α]_D ²² = –72° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3477, 2991, 1687, 1500, 1357, 1217, 1052 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,78 und 0,82 [zwei s, 6, CH ₂CH(CH₃)₂], 1,10–1,39 [m, 9, 2CH ₃CH₂O) und CH ₂CH(CH₃)₂], 1,42–2,05 (m, 4, b,g CH₂ von Pro), 2,81–3,50 (m, 4, CH₂N von Pro und bCH₂ von Trp^P), 3,80–4,48 (m, 7, 2CH₃CH ₂O und 3 aCH), 4,98 (s, 2, CH₂ von Benzyl), 6,34–7,50 [m, 5, aromatische von Indol und 7,10 (5, s, aromatische von Benzyl)], 8,48 (s, 1, NH von Indol). Berechnet C₃₃H₄₅N₄O₇P·2/3H₂O: C, 60,79; H, 7,06; N, 8,59. Gefunden C, 60,47; H, 6,90; N, 8,55%.
N-Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-leucyl-(1)-phosphotryptophandiethylester (3c, 550 mg, 0,86 mmol), BSA (2,3 ml, 9,46 mmol) und TMSl (0,93 ml, 6,88 mmol) wurden gemäß Verfahren B umgesetzt. Nach der Behandlung mit CH₃CN/H₂O und dem Entfernen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck wurde der feste Rückstand mit EtOAc gewaschen und mit HPLC (Waters ODS DeltaPack 19 × 30 mm-Säule; Elutionsmittel H₂O/CH₃CN 70 : 30; Fließgeschwindigkeit 8 ml/Minute; Retentionszeit: 10,34 min) gereinigt, wobei 200 mg reines Produkt (5) in Form eines kristallinen hygroskopischen Feststoffs (40%) erhalten wurde; [α]_D ²² = –97° (1, NaOH 1 N); IR (KBr) 3337, 3262, 2959, 1642, 1135, 1071 cm^–1; Berechnet für C₂₁H₃₁N₄O₅P·2H₂O: C, 51,80; H, 7,19; N 11,51. Gefunden C, 51,70; H, 6,96; N, 10,88%.
Herstellung von N-{[(S)-(5-Oxo-tetrahydrofuran-2-yl)carbonyl]}-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-cyclohexylaminsalz (Verbindung 4e)
N-{[(S)-(5-Oxo-tetrahydrofuran-2-yl)carbonyl]}-L-leucin (328 mg, 1,35 mmol) und (1)-Phosphotryptophandiethylester (400 mg, 1,35 mmol) wurden gemäß Verfahren A umgesetzt. Die Reinigung des Rohmaterials durch Chromatographie an Silicagel (CHCl₃/i-PrOH 95/5) und Kristallisation aus Et₂O Petroleumether ergab den N-{[(S)-(5- Oxo-tetrahydrofuran-2-yl)carbonyl]}-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-diethylester (3e) in hygroskopischer fester Form: 474 mg (68%); [α]_D ²²= –48° (1, Methanol); IR (CHCl₃): 3476, 2992, 1788, 1676, 1517, 1246, 1052 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,77 und 0,85 [zwei s, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,10–1,60 [m, 9, 2CH ₃CH₂O und CH ₂CH(CH₃)₂], 2,04–2,48 (m, 4, CH₂CH₂ von dem Tetrahydrofuranring), 3,08–3,43 (m, 2, bCH₂ von Trp^P), 3,98–5,00 (m, 7, 2 von CH₃CH ₂O, 2 aCH und CH von dem Tetrahydrofuranring), 6,76 (d, 1, NH, J = 9,8 Hz), 6,95–7,75 (m, 5, aromatische von Indol), 8,88 (s, 1, NH von Indol). Berechnet für C₂₅H₃₆N₃O₇P·2/3H₂O: C, 56,28; H, 7,05; N, 7,88. Gefunden C, 55,92; H, 6,83; N, 7,78%.
N-{[(S)-(5-Oxo-tetrahydrofuran-2-yl)carbonyl]}-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-diethylester (3e, 207 mg, 0,40 mmol), BSA (1,10 ml, 4,36 mmol) und TMSl (0,43 ml, 3,2 mmol) wurden gemäß Verfahren B umgesetzt. Durch Behandlung mit Cyclohexylamin (34 mg, 0,40 mmol) wird ein reines Produkt (4e) als hygroskopischer Feststoff erhalten: 157 mg (82%); [α]_D ²² = –63° (1, Methanol); IR (KBr) 3280, 2934, 1777, 1641, 1552, 1177, 1048 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d₆): d 0,77 [m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂), 0,95–2,50 [m, 17, (CH₂)₅ von Cyclohexylamin, CH ₂CH(CH₃)₂ und CH ₂CH ₂ von dem Tetrahydrofuranring], 2,87 (bs, 2, CHN Cyclohexylamin und 1H von bCH₂ Trp^P), 3,24 (bs, 1, 1H von bCH₂ Trp^P), 4,27 (bs, 2, aCH Trp^P und aCH Leu), 4,96 (bs, 1, CH von dem Tetrahydrofuranring), 6,79–7,60 (m, 5, aromatische von Indol), 7,77 (bs, 1, NH Trp^P), 8,91 (bs, 1, NH Leu), 10,55–10,78 (m, 2, NH von Indol und NHCHO). Berechnet für C₂₇H₄₅N₄O₉P·2H₂O (Cyclohexylaminsalz): C, 54,17; H, 7,24; N, 9,36. Gefunden C, 54,22; H, 7,57; N, 9,03%.
Herstellung des N-{[(R)-(2-Oxo-thiazolidin-4-yl)carbonyl]}-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-cyclohexylaminsalzes (Verbindung 4f).
N-{[(R)-(2-Oxo-thiazolidin-4-yl)carbonyl]}-L-leucin (2f, 353 mg, 1,35 mmol) und (1)-Phosphotryptophandiethylester (400 mg, 1,35 mmol) wurden gemäß Verfahren A umgesetzt. Die Reinigung des Rohproduktes durch Chromatografie an Silicagel (CHCl₃/i-PrOH 95/5) und Kristallisation aus CHCl₃/Et₂O ergab N-{[(R)-(2-Oxo-thiazolidin-4-yl)carbonyl]}-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-diethylester (3f) als einen hygroskopischen Feststoff: 572 mg (73%); [α]_D ²² = –89° (1, Methanol); IR (CHCl₃) 3333, 2958, 1678, 1513, 1339, 1260, 1026 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,69–0,92 [m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,08–1,65 [m, 9, 2CH ₃CH₂O und CH ₂CH(CH₃)₂], 2,92–3,47 (m, 4, CH₂S und bCH₂ Trp^P), 3,63–4,90 (m, 7, 2CH₃CH ₂O und 3 aCH), 6,73–7,43 (m, 5, aromatische von Indol), 8,63 (s, 1, NH von Indol). Berechnet für C₂₄H₃₅N₄O₆PS·1/2H₂O: C, 52,64; H, 6,63; N, 10,23. Gefunden C, 52,66; H, 6,45; N, 10,03%.
N-{[(R)-(2-Oxo-thiazolidin-4-yl)carbonyl]}-L-leucyl-(1)-phosphotryptophandiethylester (3f, 404 mg, 0,75 mmol), BSA (2,0 ml, 8,25 mmol) und TMSl (0,82 ml, 6,0 mmol) wurden gemäß Verfahren B umgesetzt. Durch Behandlung mit Cyclohexylamin (74 mg, 0,75 mmol) wird das reine Produkt (4f) als ein hygroskopischer Feststoff erhalten: 312 mg (71%); [α]_D ²² = –70° (1, Methanol); IR (KBr) 3285, 2936, 1641, 1532, 1141, 1047 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d₆): d 0,75 [m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,00–2,00 [m, 13, (CH₂)₅ von Cyclohexylamin und CH ₂CH(CH₃)₂], 2,92 (m, 2, CHN von Cyclohexylamin und 1H von bCH₂ Trp^P), 3,15–3,68 (m, 3, 1H von bCH₂ Trp^P und CH ₂S), 4,05–4,40 (m, 3, aCH Trp^P und aCH Leu überlagert über CHCH₂S), 6,85–7,68 (m, 5, aromatische von Indol), 8,05 (d, 1, J = 8,6 Hz, NH von Trp^P), 8,78 (d, 1, J = 8,6 Hz, NH Leu), 9,00 (bs, 1, NHCH₂S), 10,65 (s, 1, NH von Indol). Die Zuordnung der NH-Gruppen ist austauschbar. Berechnet für C₂₆H₄₀N₅O₆P·1H₂O (Cyclohexylaminsalz): C, 52,02; H, 7,00; N, 11,67. Gefunden C, 52,29; H, 7,07; N, 11,38%.
Herstellung des N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-cyclohexylaminsalzes (Verbindung 4g).
N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucin (2 g, 507 mg, 1,35 mmol) und (1)-Phosphotryptophandiethylester (400 mg, 1,35 mmol) wurden gemäß Verfahren A umgesetzt. Die Chromatografie an Silicagel (CHCl₃/i- PrOH 95/5) des Rohproduktes ergab N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl-(1)-phosphotryptophandiethylester (3g) in Form eines Schaums: 466 mg (53%); [α]_D ²² = –73° (1, Methanol); IR (KBr) 3287, 2957, 1787, 1654, 1552, 1232, 1028 cm^–1; ¹H-NMR (MeOD): d 0,74–1,00 [m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,13–1,54 [m, 9, 2CH ₃CH₂O und CH ₂CH(CH₃)₂], 2,16–2,41 (m, 4, CH₂CH₂ von pGlu) 3,21–3,48 (m, 2, bCH₂ Trp^P), 4,00–4,91 (3m, 7, 2CH₃CH ₂O und 3 aCH), 5,26 (s, 2, CH₂ von Benzyl), 7,00–7,68 [m, 5, aromatische von Indol und 7,40 (s, 5, aromatische von Benzyl)]. Berechnet für C₃₃H₄₃N₄O₈P: C, 60,54; H, 6,62; N, 8,56. Gefunden C, 60,03; H, 6,63; N, 8,33%.
N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl-(1)-Phosphotryptophandiethylester (3 g, 366 mg, 0,56 mmol), BSA (1,5 ml, 6,16 mmol) und TMSl (0,6 ml, 4,48 mmol) wurden gemäß Verfahren B umgesetzt. Für die Behandlung mit Cyclohexylamin (55 mg, 0,56 mmol) wird das reine Produkt (4 g) als ein hygroskopischer Feststoff erhalten: 195 mg (62%); [α]_D ²² = –72° (1, NaOH 1 N); IR (KBr) 3294, 2936, 1786, 1640, 1548, 1305, 1135, 1046 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d₆): d 0,70 [m, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 0,95–2,40 [m, 17, (CH₂)₅ Cyclohexylamin, CH ₂CH(CH₃)₂ und CH ₂CH ₂ von pGlu], 2,86 (m, 2, CHN von Cyclohexylamin und 1 von bCH₂ Trp^P), 3,25 (m, 1,1 von bCH₂ Trp^P), 4,00–4,30 (m, 2, aCH von Trp^P und von dem Leu), 4,71 (m, 1, aCH pGlu), 5,09 und 5,15 (A und B von einem AB, 2, J = 13 Hz, PhCH ₂O), 6,80–7,68 (m, 12, aromatische von Indol, aromatische von Benzyl und 2 NH), 8,86 (bs, 1, NH), 10,65 (s, 1, NH von dem Indol). Berechnet für C₃₅H₄₈N₅O₈P·1H₂O (Cyclohexylaminsalz): C, 58,67; H, 6,98; N, 9,78. Gefunden C, 58,91; H, 6,97; N 9,33%.
Herstellung des L-Pyroglutamyl-L-leucyl-(1)-phosphotryptophansalzes von Cyclohexylamin (Verbindung 4h).
Eine Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-cyclohexylaminsalz (4f) (50 mg, 0,072 mmol) in EtOH/H₂O 5 : 2 (7 ml) in Gegenwart von Pd/C 10% wurde 2 Stunden lang in einem H₂-Strom gehalten. Nach der Filtration auf Papier und dem Entfernen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck wurde das Produkt (4h) rein in Form eines rosafarbenen hygroskopischen Feststoffs erhalten: 34 mg (85%). [α]_D ²² = –80° (0,5, MeOH); IR (KBr) 3280, 2936, 1642, 1536, 1149, 1047 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d₆): d 0,76 [m, 6, CH₂CH(CH₃)₂], 0,95–2,30 [m, 17, (CH₂)₅ Cyclohexylamin, CH ₂CH(CH₃)₂ und CH ₂CH ₂ von pGlu], 2,87 (bs, 2, CHN von Cyclohexylamin und 1 von bCH₂ Trp^P), 3,24 (m, 1, 1 von bCH₂ Trp^P), 3,97–4,30 (m, 3, aCH von Trp^P, von Leu und von pGlu), 6,80–7,60 (m, 5, aromatische von Indol), 7,91 (d, 1, J = 8 Hz, NH Trp^P), 8,33 (s, 1, NH Lacton), 8,50 (d, 1, J = 7 Hz, NH Leu), 10,66 (s, 1, NH von Indol). Berechnet für C₂₇H₄₂N₅O₆P·3/2H₂O (Cyclohexylaminsalz): C, 54,86; H, 7,62; N, 11,85. Gefunden C, 54,90; H, 7,55; N, 11,50%.
Beispiel 4:
N[(Furan-2-yl)-carbonyl-L-leucyl-phosphotryptophan-monobenzylester (Verbindung 10).
Herstellung von Dibenzyl-1-hydroxyimin-2-(3-indolyl)ethanphosphonat (Verbindung 7).
Zu einer Suspension von Indolessigsäure (6,5 g, 28,5 mmol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (100 ml) und wasserfreiem DMF (0,3 ml) die auf 0°C gekühlt war, wurde tropfenweise unter Rühren und in einer Stickstoffatmosphäre Oxalylchlorid (2,7 ml, 31,4 mmol)innerhalb einer Zeitspanne von 30 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten refluxiert. Am Ende eines solchen Zeitraums wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abgedampft und der ölige Rückstand, welcher das Indolessigsäurechlorid enthielt, wurde in wasserfreiem CH₂Cl₂ (50 ml) gelöst. Zu dieser Lösung, die auf –18°C gekühlt war, wurde tropfenweise unter Rühren und in einer Stickstoffatmosphäre eine Lösung von Dibenzyltrimethylsilylphosphit in wasserfreiem CH₂Cl₂ (100 ml) zugegeben, die aus Dibenzylphosphit (6,33 ml, 28,5 mmol) und Trimethylchlorsilan (5 ml, 39,5 mmol) in Gegenwart von Triethylamin erhalten wurde (Afarinkia K., Rees C. W., Cadogan J. I. G.; Tetrahedron, 1990, 46, 7175–7196), (4,38 ml, 31,4 mmol). Nach einer Stunde wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt und der ölige Rückstand in EtOH (35 ml) und Pyridin (3,44 ml, 42,75 mmol) gelöst. Zu dieser Lösung, die auf –18°C gekühlt war, wurde tropfenweise und unter Rühren eine Lösung von Hydroxylaminhydrochlorid (2,57 g, 37,05 mmol) in MeOH (35 ml) zugegeben. Nachdem das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei 4°C gehalten worden war, wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt und der Rückstand, gelöst in CHCl₃ (400 ml), wurde mit H₂O (100 ml), gesättigter NaHCO₃-Lösung (100 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (100 ml) gewaschen. Die organischen Phasen wurden wiedervereinigt und über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck entfernt. Die Reinigung des Rohmaterials durch Chromatographie an Silicagel (CH₂Cl₂/i-PrOH 95/5) und Kristallisation aus 1,2-Dichlorethan ergab das reine Produkt (7) in Form eines festen weißen Kristalls: 5,74 g (46%); Schmelzpunkt: 130–1°C; IR (KBr): 3428, 3187, 1641, 1455, 1425, 1244, 1057 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d₆): d 3,77 (bs, 2, bCH₂ Trp^P), 4,70–4,90 (m, 4, 2CH ₂Ph), 6,80–7,60 (m, 15, aromatische), 10,60 (s, 1, NH von Indol), 12,27 und 12,33 (zwei s, 1, C=N-OH).
Herstellung von Phosphotryptophan-dibenzylester-oxalat (Verbindung 8).
Zu einer Lösung von Dibenzyl-1-hydroxyimin-2-(3-indolyl)ethanphosphonat (7, 2,61 g, 6,01 mmol) in EtOH/H₂O 13/1 (56 ml) und wässrigem NH₃ in einer Konzentration von 25% (2,6 ml) wurde ein Aluminiumamalgam (3,60 g) zugegeben. Nach 1 Stunde wurde das Reaktionsgemisch auf Kieselgur filtriert und die filtrierte Substanz wurde bei vermindertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wurde in EtOAc (80 ml) gelöst und mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (20 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (20 ml) extrahiert. Nach dem Trocknen der organischen Phase über Na₂SO₄ wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das in EtOAc (10 ml) gelöste Rohprodukt wurde tropfenweise mit einer Lösung von Oxalsäure (600 mg, 6,01 mmol) in EtOAc (10 ml) versetzt. Das reine Produkt (8), das als fester hygroskopischer Kristall abgetrennt wurde, wurde durch Filtration gewonnen: 2,087 g (68%); IR (CHCl₃): 3424, 2925, 1702, 1619, 1453, 1229, 1098, 998 cm^–1; ¹H-NMR (DMSO-d₆): d 2,90–3,43 (m, 2, bCH₂ Trp^P), 3,60–4,03 (m, 1, aCH Trp^P), 4,70–5,13 (m, 4, 2CH ₂Ph), 6,80–7,76 (m, 15, aromatische), 8,07 (bs, 1, NH von Indol).
Herstellung von N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-dibenzylester (Verbindung 9).
Zu einer Lösung von N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucin (2a, 664 mg, 2,95 mmol) und N-Methylmorpholin (0,32 ml, 2,95 mmol) in wasserfreiem THF (10 ml), die auf –15°C gekühlt war, wurde tropfenweise unter Rühren eine äquivalente Menge an Isobutylchlorformiat (0,39 ml, 2,95 mmol) zugegeben. Nach 30 Minuten wurde eine Lösung von Dibenzyl-1-amino-2-(3-indolyl)ethanphosphonat in wasserfreiem THF (10 ml) langsam zugegeben (8), wobei das Gemisch 2 Stunden unter Rühren bei –15°C gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH₂Cl₂ (50 ml) verdünnt und mit 1N HCl (10 ml × 2), gesättigter NaHCO₃-Lösung (10 ml × 2) und gesättigter NaCl-Lösung (10 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Phase über Na₂SO₄ und dem Entfernen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck wurde das Rohprodukt durch Chromatographie an Silicagel (CH₂Cl₂/i-PrOH 95/5) gereinigt, wobei durch Entfernen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck das reine Produkt (9) in Form eines weißen Schaums erhalten wurde: 1,63 g (88%); IR (CHCl₃) 3477, 3419, 1660, 1594, 1512, 1248, 1011, 998 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,70 und 0,80 [zwei s, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,10–1,71 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂], 3,10–3,33 (m, 2, bCH₂ Trp^P), 4,33–4,63 (m, 2, aCH Leu und aCH Trp^P), 4,77–4,97 (m, 4, CH ₂Ph), 6,23–6,67 (zwei m, 2, Amid NH), 6,76–7,47 (m, 18, aromatische), 8,07 (bs, 1, NH von Indol).
Herstellung von N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucyl-(1)-phosphotryptophan-monobenzylester (Verbindung 10).
Zu einer Lösung von N-[(Furan-2-yl)carbonyl]-L-leucyl-(1)-phosphotryptophandibenzylester (9) (100 mg, 0,159 mmol) in EtOH/H₂O 13/1 (1,5 ml) und wässrigem NH₃ in einer Konzentration von 25% (0,07 ml) wurde ein Aluminiumamalgam (95 mg) zugegeben. Nach 4 Tagen wurde das Reaktionsgemisch auf Kieselgur filtriert und die filtrierte Substanz wurde bei vermindertem Druck konzentriert. Das rohe Reaktionsprodukt wurde in CHCl₃ (10 ml) gelöst und mit 0,1N NaOH (5 ml × 2) extrahiert. Die wässrigen alkalischen Phasen wurden mit 1N HCl (1,5 ml) angesäuert und mit CHCl₃ (10 ml × 2) extrahiert. Die organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung (5 ml) gewaschen, wiedervereinigt und über Na₂SO₄ getrocknet. Durch Verdampfen des Lösungsmittels bei vermindertem Druck wurde das reine Produkt (10) in Form eines weißen Schaums erhalten: 49 mg (58%); [α]_D ²² = –24° (0,5, MeOH); IR (CHCl₃) 3477, 3414, 1649, 1595, 1516, 1011 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃): d 0,70 und 0,80 [zwei s, 6, CH₂CH(CH ₃)₂], 1,07–1,40 [m, 3, CH ₂CH(CH₃)₂], 3,07–3,43 (m, 2, bCH₂ Trp^P), 4,40–4,73 (m, 2, aCH Leu und aCH Trp^P), 4,83–5,03 (m, 2, CH ₂Ph), 6,07–6,40 (zwei m, 2, Amid NH), 6,57–7,53 (m, 13, aromatische), 8,07 (bs, 1, NH von Indol). Berechnet für C₂₈H₃₂N₃O₆P·1H₂O: C, 60,48; H, 6,12; N, 7,56. Gefunden C, 60,46; H, 5,99; N, 7,50%.
BEISPIEL 5:
Hemmung von Adamalysin II
Das Enzym Adamalysin II, das aus dem Gift der Spezies Crotalus Adamanteus isoliert und in extrem reiner Form von dem Labor von Prof. L. F. Kress (Buffalo, NY, USA) erhalten wurde, wurde im Hinblick auf seine Fähigkeit getestet, das fluoreszierende Substrat 2-Aminobenzoyl-ALA-GLY-LEU-ALA-4-nitrobenzylamid (von der Firma Bachem) zu spalten. Der Verlauf der Erzeugung von fluoreszierenden Verbindungen wurde 30 Minuten lang verfolgt, wobei als Detektor ein Perkin Elmer L 50B Spektralfluorometer ver wendet wurde, das auf 320 nm für die Anregung und auf 420 nm für die Emission fest eingestellt war.
Ergebnisse (IC₅₀ gibt die Konzentration der Verbindung wieder, die die Spaltung des fluoreszierenden Substrats um 50% verringern kann): Tabelle 1
Wie man in der Referenztabelle sehen kann, sind alle getesteten Verbindungen im Stande, das Enzym zu hemmen, und einige weisen eine bemerkenswerte Stärke auf.
BEISPIEL 6:
Hemmung des menschlichen Enzyms Gelatinase A (MMP-2)
Die synthetisierten Verbindungen wurden auch an dem Enzym menschlichen Ursprungs Gelatinase A getestet, das auch als MMP-2 (Matrix-Metallproteinase Nr. 2) bezeichnet wird. Das reine Enzym, das aus menschlichen Kulturen extrahiert und von Prof. G. Murphy (Strangeways Labs., Cambridge, UK) erhalten wurde, wurde zuerst mit p-Aminoquecksilberacetat aktiviert und die proteolytische Aktivität wurde durch die Verwendung eines künstlichen fluoreszierenden Substrats MCA-PRO-LEU-GLY-LEU-DPA-ALA-ARG-NH₂(Strangeways Labs.) in einem Spektralfluorometer Perkin Elmer L 50B nachgewiesen, das auf 328 nm für die Anregung und 393 nm für die Emission fest eingestellt war.
Um die Hemmwirkung zu testen, wurden die synthetisierten Verbindungen 3 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart des Enzyms inkubiert, bevor das Substrat zugegeben wurde.
Die qualitativ angegebenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt: Tabelle II
BEISPIEL 7:
Hemmung des menschlichen Enzyms Collagenase aus Neutrophilen (MMP-8)
Die neu synthetisierten Derivate wurden auch an einer anderen zinkabhängigen Metallproteinase menschlichen Ursprungs getestet: nämlich der Collagenase aus Neutrophilen, die auch als MMP-8 (Matrix-Metallproteinase Nr. 8) bezeichnet wird. Das reine Enzym, das aus menschlichen Zellkulturen extrahiert und von Prof. G. Murphy (Strangeways Labs., Cambridge, UK) erhalten wurde, wurde mit p-Aminoquecksilberacetat (2 Stunden bei 37°C) aktiviert und die enzymatische Aktivität wurde durch das Spektralfluorometer auf die gleiche Weise wie im vorstehenden Kapitel beschrieben verfolgt.
Die qualitativ angegebenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt: Tabelle III

Claims

Verbindungen mit der allgemeinen Formel:
in welcher R H oder CH₂-C₆H₅ sein kann und R' ein gesättigter oder aromatischer Ring mit fünf oder sechs Gliedern sein kann, von denen mindestens eines nicht Kohlenstoff ist und ausgewählt werden kann in der Gruppe, die Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel einschließt.
Verbindungen nach Anspruch 1, in welchen R' ausgewählt ist aus einer Gruppe, die einschließt:
Verfahren zum Herstellen von (1)-Phosphotryptophandiester als das Ausgangsprodukt beim Synthetisieren der in Anspruch 1 beanspruchten Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass als wesentlicher Arbeitsgang die Reduktion von 1-Hydroxyimin-2-(3-indolyl)ethanphosphonat durch Zugeben eines Aluminiumamalgams in Gegenwart von wässrigem Ammoniak eingeschlossen ist.
Verbindungen, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, zur Verwendung als Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von mindestens einer der zinkabhängigen Schlangen-Metallproteinasen, die aus den Giften von Schlangen extrahiert werden, die zu den Familien Crotalidae und Viperidae gehören, welche auch als Hämorrhagine bezeichnet werden, und/oder mindestens einer der zinkabhängigen Metallproteinasen menschlichen Ursprungs, deren aktive Stelle eine dreidimensionale Struktur aufweist, die der Struktur der Schlangen-Metallproteinasen analog ist.
Verbindungen nach Anspruch 4, wobei die menschlichen Metallproteinasen ADAM sind.
Verbindungen nach Anspruch 4, wobei die aus Schlangengift extrahierte Metallproteinase Adamalysin II ist und/oder die Metallproteinasen menschlichen Ursprungs Collagenase und Gelatinase A sind.
Verbindung wie in einem der Ansprüche 4 bis 6 beansprucht, zur Verwendung als Arzneimittel für die therapeutische Behandlung von pathologischen Befunden beim Menschen, bei denen gezeigt wurde, dass an dem pathogenen Mechanismus oder der Symptomatologie mindestens eine zinkabhängige Metallproteinase beteiligt ist.
Verbindung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei der pathologische Befund ein Tumorwachstum und eine Metastasierung ist.
Verbindung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei der pathologische Befund durch Entzündungskrankheiten wie rheumatoide Arthritis dargestellt wird.
Verbindung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei der pathologische Befund die Atherosklerose ist.
Verbindung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei der pathologische Befund die Multiple Sklerose ist.
Verbindung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei der pathologische Befund die Alzheimer-Krankheit ist.
Verbindung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei der pathologische Befund die Osteoporose ist.
Verbindung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei der pathologische Befund der Hochdruck ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die für die Therapie von pathologischen Befunden beim Menschen brauchbar ist, bei deren pathogenem Mechanismus oder deren Symptomatologie eine Beteiligung von mindestens einer zinkabhängigen Metallproteinase nachgewiesen worden ist, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirkstoff mindestens eine der Verbindungen, wie sie in Anspruch 1, 2 oder 4 beansprucht sind, und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel eingeschlossen sind.
Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 15, bei denen die pathologischen Befunde zu der Gruppe gehören, die Osteoporose, Alzheimer-Krankheit, Multiple Sklerose, Entzündungskrankheiten wie rheumatoide Arthritis, Hochdruck, Atherosklerose und Tumorwachstum und Metastasierung einschließt.
Chemische Zusammensetzung bzw. Mischung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine Verbindung, wie sie in Anspruch 1 oder 2 definiert ist, einschließt.
In-vitro-Verfahren zum Bestimmen der therapeutischen Wirkung von Verbindungen, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, in Säugern, umfassend die Schritte des Bestimmens der Wirkungsstärke der Verbindungen als Inhibitoren einer zinkabhängigen Metallproteinase, die aus dem Gift von Schlangen extrahiert wird, die zu den Familien Crotalidae und Viperidae gehören, und anschließendes Überprüfen der inhibitorischen Wirkung der Verbindungen an einer Metallproteinase, die in einem Säugerorganismus vorhanden ist und pathologische Situationen herbeiführt, um ein wirksames Arzneimittel zu erkennen und herzustellen, das in einer Therapie bei Menschen und Tieren brauchbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass die zinkabhängige Metallproteinase, die aus Schlangengift extrahiert wird, Adamalysin II ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die in dem Organismus von Säugern vorhandenen Metallproteinasen Collagenase aus Neutrophilen oder Gelatinase A sind.