DE69025952T2

DE69025952T2 - Antithrombotische peptide und pseudopeptide

Info

Publication number: DE69025952T2
Application number: DE69025952T
Authority: DE
Inventors: Scott Klein; Bruce MOLINO
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer International Holdings Inc
Current assignee: Rhone Poulenc Rorer International Holdings Inc
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-11-28
Publication date: 1996-09-12
Anticipated expiration: 2010-11-29
Also published as: AU6890091A; EP0502926A1; DE69025952D1; WO1991007976A1; EP0502926B1; AU636426B2; US5053392A; CA2069754A1; EP0502926A4; ATE135367T1; JPH05504762A

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue Verbindungen mit antithrombotischer Aktivität. Insbesondere betrifft die Erfindung neue Peptide und Pseudopeptide, die die Thrombozytenaggregation und die Thrombusbildung in Säugerblut hemmen, und dadurch bei der Verhütung und Behandlung von Thrombosen, die im Zusammenhang mit bestimmten Erkrankungszuständen, wie Myokardinfarkt, Schlaganfall, peripherer arterieller Erkrankung und disseminierter intravaskulärer Koagulation stehen, nützlich sind.
Die Hämostase, die Biochemie der Blutgerinnung, ist ein extrem komplexes und bis jetzt nicht vollständig verstandenes Phänomen, wodurch normales Blut und Blutgewebe aus verletzten Blutgefäßen spontan zu bluten aufhören. Eine effektive Hämostase benötigt die kombinierte Aktivität von vaskulären, Thrombozyten- und Plasmafaktoren sowie von Kontrollmechanismen zur Verhinderung einer exzessiven Gerinselbildung. Defekte, Mängel oder Überschüsse irgendeiner dieser Komponenten kann zu hämorrhagischen oder thrombotischen Folgen führen.
Die Thrombozytenadhäsion, ihre Ausbreitung und Aggregation auf extrazellulären Matrices sind zentrale Ereignisse bei der Thrombusbildung. Diese Ereignisse werden durch eine Familie von an den Plättchen haftenden Glykoproteinen, d.h. Fibrinogen, Fibronectin, und von-Willebrand-Faktor gesteuert. Fibrinogen ist ein Kofaktor für die Thrombozytenaggregation. Fibronectin unterstützt die Anhaftungen der Thrombozyten und die Ausbreitungsreaktionen, und der von-Willebrand-Faktor ist wichtig bei Anheftungs- und Ausbreitungsreaktionen der Thrombozyten auf subendothelialen Matrices. Die Bindungsstellen für Fibrinogen, Fibronectin und den von-Willebrand-Faktor wurden auf dem Thrombozytenmembranglykoprotein-Komplex IIb/IIIa lokalisiert.
Ein adhäsives Glykoprotein, wie Fibrinogen, bindet nicht an normale ruhende Thrombozyten. Wenn jedoch ein Thrombozyt mit einem Agonisten, wie Thrombin oder Adenosindiphosphat aktiviert wird, verändert der Thrombozyt seine Form, vielleicht indem er die GPIIb/IIIa-Bindungsstelle für Fibrinogen zugänglich macht. Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen neuen Moleküle können den Fibrinogenrezeptor blockieren, wodurch die Thrombozytenaggregation und die anschließende Thrombusbildung gehemmt werden. Pharmazeutische Mittel und/oder Zusammensetzungen, die einen solchen Hemmeffekt besitzen, können zur Prophylaxe und Behandlung von thrombogenen Erkrankungen, wie Myokardinfarkt, Schlaganfall, peripherer arterieller Erkrankung und disseminierter intravaskulärer Koagulation, bereitgestellt werden.

2. Bisherige Entwicklungen

Es wurde beobachtet, daß das Vorhandensein von Arg-Gly-Asp (RGD) in Fibrinogen, Fibronectin und dem von-Willebrand- Faktor für ihre Wechselwirkung mit dem Zelloberflächenrezeptor notwendig ist (Ruoslahti E., Pierschbacher, Cell 1986, 44, 517-18). Zwei andere Aminosäuresequenzen scheinen auch an der Funktion von Fibrinogen, Thrombozyten anzuheften, beteiligt zu sein, nämlich die Gly-Pro-Arg-Sequenz und die Dodecapeptidsequenz, His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln- Ala-Gly-Asp-Val. Synthetische kleine Peptide, die die RGD- -und Dodecapeptideinheiten besitzen, zeigen Aktivität: sie binden an den Thrombozytenrezeptor und hemmen kompetitiv die Bindung von Fibrinogen, Fibronectin und von-Willebrand- Faktor ebenso wie sie die Aggregation von aktivierten Thrombozyten hemmen (Plow et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 8057-61; Ruggen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 5708-12); Ginsberg, et al., J. Biol. Chem. 1985, 260 3931-36; und Gartner et al., J. Biol. Chem. 1987, 260, 11891-94).
Die Erfindung betrifft neue Peptide und Pseudopeptide, die die Thrombozytenaggregation und die anschließende Thrombusbildung hemmen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung umfaßt Peptide und Pseudopeptide der allgemeinen Formel:
worin:
X für H oder Amidino steht;
Y für H oder Amino steht;
m den Wert 1 bis 5 hat;
n den Wert 0 bis 4 hat; und pharmazeutisch verträgliche Salze davon, wobei L-Arginyl-L-prolyl-L-aspartyl-L- valin ausgenommen ist.
Erfindungsgemäß werden neue Verbindungen bereitgestellt, die die Thrombozytenaggregation hemmen, indem sie die Bindung von Fibrinogen an aktivierte Thrombozyten oder andere adhäsive Glykoproteine, die bei der Thrombozytenaggregation und der Blutgerinnung beteiligt sind, hemmen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen gelten, wie durch Verfahren, die eine antithrombotische Aktivität vorhersagen, getestet wurde, als nützlich bei der Verhütung und Behandlung von Thrombose im Zusammenhang mit bestimmten Erkrankungszuständen, wie Myokardinfarkt, Schlaganfall, peripherer arterieller Erkrankung und disseminierter intravaskulärer Koagulation.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch für die Behandlung bestimmter krebsartiger Erkrankungen nützlich, da sie in die adhäsiven Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der extrazellulären Matrix eingreifen (Journ. of Biol. Chem., Bd. 262, Nr. 36, 1987, Seiten 17703-17711; Science, Bd. 233, 1986, Seiten 467-470; und Cell, Bd. 57, 59-69, April 1989).
Die Erfindung umfaßt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verhütung und Behandlung von Thrombose nützlich sind, welche eine vorstehend genannte Verbindung in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Verhütung und Behandlung von Thrombose im Zusammensetzung mit den vorstehend genannten Erkrankungen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können leicht nach Festphasen- oder Lösungsphasen-Standardtechniken zur Peptidsynthese unter Verwendung von Ausgangsmaterialien und/oder Zwischenprodukten, die leicht von Firmen für den chemischen Bedarf, wie Aldrich und Sigma, bezogen werden können oder nach Standardtechniken der organischen Chemie synthetisiert werden können, hergestellt werden (H. Paulsen, G. Merz, V. Weichart, "Solid-Phase Synthesis of o-Glycopeptide Sequences", Angew. Chem. Int. Ausg. Engl. 27 (1988); H. Mergler, R. Tanner, J. Gosteli, und P. Grogg, "Peptide Synthesis by a Combination of Solid-Phase and Solution Methods 1: A New Very Acid-Labile Anchor Group for the Solid-Phase Synthesis of Fully Protected Fragments. Tetrahedron Letters 29, 4005 (1989); Merrifield, R.B., "Solid Phase Synthesis after 25 years: The Design and Synthesis of Antagonists of Glucagon", Makromol. Chem. Macromol. Symp. 19, 31(1989)).
Das Festphasenverfahren wird schematisch wie folgt dargestellt: Fester Träger Abspaltung der Schutzgruppe Kopplung Fester Träger Kopplung Endprodukt Abspaltung der Schutzgruppe, Spaltung
worin: der feste Träger ohne Bschränkung ein p-Alkoxybenzylalkoholharz sein kann; P-NH- &sub2;- -OH ein geschütztes Aminosäurederivat ist; ein geschütztes Derivat einer stickstoffhaltigen heterocyclischen Carbonsäure ist, worin n den Wert 0, 1, 2, 3 oder 4 hat; X- -(CH&sub2;)m- H- -OH ein carbocyclisches Aminosäurederivat ist, worin X für H, Amidino steht, Y für H, Amino steht.
Bei dem Verfahren zur Herstellung der gewünschten Verbindung werden die Aminosäurederivate jeweils einzeln an das unlösliche Harz geknüpft, wodurch das gewünschte Dipeptid- Harzderivat erhalten wird, dann wird das heterocyclische stickstoffhaltige Carbonsäurederivat an den N-Terminus der Kette gekoppelt, anschließend wird das carbocyclische Aminosäurederivat gekoppelt. Beliebige reaktive funktionelle Gruppen dieser Derivate werden durch Schutzgruppen blockiert, um Kreuzreaktionen während des Kopplungsverfahrens zu vermeiden. Diese Schutzgruppen umfassen ohne Beschränkung tert.-Butoxycarbonyl (BOC), Carbobenzoxy (CBZ), Benzyl, t-Butyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (FNOC) und Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl (MTR). Nach Beendigung jeder Kopplungsreaktion wird die α-Aminoschutzgruppe nach Standardverfahren entfernt und die α-Aminogruppe wird ihrerseits an ein Derivat mit einer freien Carbonsäurefunktion gekoppelt. Das Verfahren wird wiederholt, bis das gewünschte Produktderivat gebildet ist. Das Endprodukt wird durch Abspalten der Schutzgruppe und Spaltung des Produkts von dem Harz nach Standardtechniken erhalten.
Alternativ können die erfindungsgemäßen Verbindungen in Lösung, d.h. ohne Verwendung eines festen Trägers, hergestellt werden. Auf eine Art, die der Festphasensynthese ähnlich ist, werden unter Verwendung von Standardverfahren die geschützten Derivate gekoppelt und anschließend von ihrer Schutzgruppe befreit.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden erläuternden Beispiele näher erläutert.

BEISPIEL 1

N-(5-Guanidinopentanoyl)- azetidin-(2S)-carboxyl-Asp-Val

A. 0,5 g N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-valin-p-alkoxybenzylalkoholharzester (enthaltend etwa 0,28 mmol Aminosäure) wurden durch Schütteln mit 10 ml 20%igem Piperidin in Dimethylformamid bei Raumtemperatur für 1 Stunde von der Schutzgruppe befreit. Das Gemisch wurde filtriert, und das Harz wurde mit Methylenchlorid gewaschen, wodurch L-Valin- p-alkoxybenzylalkoholharzester erhalten wurde.
B. Das Produkt aus Beispiel 1A wurde mit 0,460 g N-FMOC- L-asparginsäure-β-t-butylester, 0,214 g 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC), 0,151 g 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) und 0,16 ml Triethylamin in 10 ml Dimethylformamid 1 Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Gemisch wurde filtriert, das Harzderivat mit Methylenchlorid gewaschen, dann wie in Beispiel 1A von der Schutzgruppe befreit, wodurch L-Aspartyl-β-t-butylester-L- valin-p-alkoxybenzylalkoholharzester erhalten wurde.
C. Eine Lösung aus 0,50 g (S)-(-)-2-Azetidincarbonsäure in 15 ml 10%iger wäßriger Natriumcarbonatlösung wurde mit 113 g 9-Fluorenylmethylchlorformiat in 10 ml Dioxan tropfenweise versetzt, während die Temperatur des Reaktionsgemisches bei 0ºC gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und 3 Stunden lang gerührt, dann in Wasser gegossen, und die wäßrige Lösung wurde mit Ether gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde auf 0ºC abgekühlt und mit 3N Salzsäure auf einen pH-wert von 2 eingestellt und mit Etyhlacetat extrahiert. Die Ethylacetatlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, futriert und im Vakuum eingedampft, wodurch (S)-N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl) azetidin-2-carbonsäure erhalten wurde.
D. Das Produkt aus Beispiel 1C wurde mit 0,271 g N-FMOC- Azetidin-2-carbonsäure, 0,160 g EDC, 0,113 g HOBT und 0,12 ml Triethylamin in 10 ml Dimethylformamid 3 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt, dann futriert, gewaschen und von der Schutzgruppe, wie in Beispiel 1A, befreit, wodurch N-[(5)-Azetidin-2-yl-carboxyl]-L-aspartyl-β-t-butylester-L-valin-p-alkoxybenzylalkoholesterharz erhalten wurde.
E. 5-Guanidinopentansäure wurde nach dem Verfahren von Miller, et al., Synthesis, 777 (1986) hergestellt, worauf hiermit Bezug genommen wird. 2,00 g 5-Aminovaleriansäure wurde in einer Lösung von 2,35 g Kaliumcarbonat in 20 ml Wasser mit anschließender portionsweiser Zugabe von 2,13 g Aminoiminomethansulfonsäure im Verlauf von 10 Minuten aufgelöst. Der nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht gebildete Feststoff wurde gewonnen und aus Wasser umkristallisiert. Das Guanidin wurde in einer verdünnten Salzsäurelösung aufgelöst, und die Lösung wurde im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde mit 2-Propanol gewaschen und wurde dann eingedampft, wodurch 5-Guanidinopentansäurehydrochlorid erhalten wurde.
F. 0,218 g 5-Guanidinpentansäurehydrochlorid&sub1; 0,214 g EDC, 0,151 g HOBT, 0,16 ml Triethylamin und das Produkt aus Beispiel 1D wurden zusammen in 10 ml Dimethylformamid 3 Stunden lang geschüttelt. Das Gemisch wurde filtriert und das Harz wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Das Produkt wurde von der Schutzgruppe befreit und durch 2stündige Behandlung mit 95%iger Trifluoressigsäure von dem Harz abgespalten. Das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat wurde mit 0,5N Essigsäure verdünnt. Die Lösung wurde mit Ethylacetat gewaschen, und die wäßrige Schicht wurde lyophilisiert, wodurch N-(5-Guanidinopentanoyl) azetidin-(2S)-carboxyl-Asp-Val als Trifluoracetatsalz erhalten wurde.

BEISPIEL 2

N-(5-Aminopentanoyl)- azetidin-(2S)-carboxyl-Asp-Val

A. Eine Lösung aus 2,00 g 5-Aminopentansäure und 3,62 g Natriumcarbonat in 30 ml Wasser wurde auf 0ºC abgekühlt und 4,41 g 9-Fluorenylmethylchlorformiat in 10 ml Tetrahydrofuran wurden tropfenweise zugesetzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und 2 Stunden lang geruhrt. Das Gemisch wurde dann mit Wasser verdünnt und mit Ether gewaschen. Die wäßrige Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und auf einen pH-Wert von 2 mit 3N Salzsäure eingestellt. Der so erhaltene weiße Feststoff wurde durch Filtration gewonnen und getrocknet, wodurch N-(9-Fluorenylmethyoxycarbonyl)-5-aminopentansäure erhalten wurde.
B. 0,379 g N-FMOC-5-Aminopentansäure, N-[Azetidin-(2S)- carboxyl]-L-aspartyl-β-t-butylester-L-valin-p-alkoxybenzylalkoholesterharz (hergestellt aus 0,50 g N-FMCC-L-valin-p- alkoxybenzylalkoholesterharz, wie in den Beispielen 1A-D), 0,214 g EDC&sub1; 0,151 g HOBT und 0,16 ml Triethylamin wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 10 ml Dimethylformamid geschüttelt. Das Gemisch wurde filtriert und das Harzderivat wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die FMOC-Schutzgruppe wurde durch Behandlung mit 20% Piperidin in DMF, wie in Beispiel 1A, entfernt. Die t-Butylesterschutzgruppe wurde entfernt, und das Produkt wurde von dem Harz durch Behandlung mit 95%iger Triflueressigsäure, wie in Beispiel 1F, abgespalten, wodurch N-(5-Aminopentanoyl)azetidin-(2S)- carboxyl-Asp-Val als das Trifluoracetatsalz mit einem F.p. von 64-66ºC erhalten wurde.

BEISPIEL 3

N-(L-Arginvl)azetidin-(2S)-carboxyl-Asp-Val

1,36 g Nα-FMOC-Nω-(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl)-L-arginin, N-Eazetidin-25-carboxyl]-L-aspartyl-β-t-butylester-L-valin-p-alkoxybenzylesterharz (hergestellt aus 110 g N-FMOC-L-valin-p-alkoxybenzylesterharz wie in Beispiel 1A-D), 0,428 g EDC, 0,302 g HOBT und 0,31 ml Triethylamin wurden zusammen 2,5 Stunden lang bei Raumtemperatur in 10 ml Dimethylformamid geschüttelt. Die FMOC-Schutzgruppe wurde durch Behandlung mit 10 ml 20%igem Piperidin in DMF, wie in Beispiel 1A, entfernt. Die t-Butylesterschutzgruppe wurde entfernt, und das Produkt wurde von dem Harz durch Behandlung mit 10 ml 95%iger Trifluoressigsäure für 3 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,2 ml 1,2-Ethandithiol abgespalten. Das Harz wurde abfiltriert und mit Trifluoressigsäure gewaschen. Die Lösung wurde im Vakuum bei Raumtemperatur eingedampft. Der Rückstand wurde mit 100%iger Trifluoressigsäure 24 Stunden lang behandelt, um die MTR-Schutzgruppe zu entfernen. Die Lösung wurde mit 0,5N wäßriger Essigsäure verdünnt, und diese Lösung wurde mit Ethylacetat gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde lyophilisiert, wodurch N-[L-Arginyl)azetidin-(2S)-carboxyl- Asp-Val als Trifluoracetatsalz mit einem Fp. von 110 bis 112ºC erhalten wurde.

BEISPIEL 4

N-[1-(L-Arginyl)piperidin-2- yl-carbonyl]-L-aspartyl-L-valin

A. Piperidin-2-carbonsäure wurde wie in Beispiel 1C behandelt, wodurch N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl) piperidin-2- carbonsäure erhalten wurde.
B. N-FMCC-piperidin-2-carbonsäure wurde anstelle von Azetidincarbonsäure wie in Beispiel 1D verwendet und wie in Beispiel 1D behandelt, wodurch N-[Piperidin-2-yl-carboxyl]- L-aspartyl-β-t-butylester-L-valin-p-alkoxybenzylalkoholesterharz, erhalten wurde.
C. Das Produkt aus Beispiel 48 wurde anstelle von Azetidin-(2S)-carboxyl-L-aspartyl-β-t-butylester-L-valin-p-alkoxybenzylesterharz in Beispiel 3 verwendet und wie in Beispiel 3 behandelt, wodurch N-[1-(L-Arginyl) piperidin-2-carboxyl]-L-aspartyl-L-valin als das Ditrifluoracetatsalz mit einem Fp. von 109-112ºC erhalten wurde.

BEISPIEL 5

L-Arginyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-valin

A. 2,04 ml Triethylamin wurde zu einer Lösung aus 1,4 g EDC in 50 ml Methylenchlorid gegeben. Anschließend wurden 3,0 g N-FMOC-L-asparginsäure-β-t-butylester und 1,32 g L- valin-t-butylester und 0,985 g HOBT zugesetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen und die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Es wurde filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft, wodurch N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-aspartyl-β-t-butylester-L-valin-t-butylester erhalten wurde.
B. 2,0 g des Produkts aus Beispiel 5A in 16 ml Methylenchlorid wurden mit 4 ml Piperidin versetzt. Nach 1stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt, wodurch L-Aspartyl-β-t-butylester-L-valin-t- butylester erhalten wurde.
C. Das Produkt aus Beispiel SB wurde mit 1,18 g N-FMOC- L-prolin in Gegenwart von 0,669 g EDC, 0,472 g HOBT und 0,5 ml Triethylamin in Methylenchlorid wie in Beispiel 5A behandelt, wodurch N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-prolyl-L- aspartyl-β-t-butylester-L-valin-t-butylester erhalten wurde.
D. Das Produkt aus Beispiel 5C wurde ähnlich wie das in Beispiel 5B von der Schutzgruppe befreit, wodurch L-Prolyl- L-aspartyl-β-t-butylester-L-valin-t-butylester erhalten wurde.
E. 0,24 g des Produkts aus Beispiel 5D wurden mit 0,328 g Nα-FMOC-Nω-MTR-L-arginin in Gegenwart von 0,103 g EDC, 0,08 ml Triethylamin und 73 mg HOBT in Methylenchlorid, ähnlich wie das von Beispiel 5A gekoppelt, wodurch Nα-(9- Fluorenylmethoxycarbonyl)-Nω-(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl)-L-arginyl-L-prolyl-L-aspartyl-β-butyl-t-ester- L-valin-t-butylester erhalten wurde.
F. 0,36 g des Produkts aus Beispiel 5E wurden in 16 ml Methylenchlorid aufgelöst, und 4 ml Piperidin wurde zugesetzt. Es wurde 45 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde zwischen Methanol und Hexan verteilt. Die Methanolschicht wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand wurde einer Flashchromatographie in Methanol/Chloroform (1:1) unterworfen, wodurch Nω-(4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl)-L-arginyl-L-prolyl-L-aspartyl-β-t-butylester-L-valin-t-butylester erhalten wurde.
G. 0,26 g des Produkts aus Beispiel 5F wurden in 5 ml Trifluoressigsäure aufgelöst, und 0,2 ml 1,2-Ethandithiol wurden zugesetzt. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde dann im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wurde in 0,5N Essigsäure aufgenommen, und diese Lösung wurde mehrere Male mit Ethylacetat gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde lyophilisiert und der Rückstand wurde in Dioxan aufgenommen. Salzsäuregas wurde dann durch die Lösung geblasen. Das Dioxan wurde im Vakuum entfemt&sub1; und der Rückstand wurde aus Methanol/Ether kristallisiert, wodurch L-Arginyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-valin als das Hydrochloridsalz mit einem Fp. von 150ºC (Zers.) erhalten wurde.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden auf die Hemmung der Thrombozytenaggregation unter Verwendung der folgenden Verfahren getestet:
I. Assay zur Hemmung der Bindung von radioaktiv markiertem (¹²&sup5;I) Fibrinogen, der im wesentlichen auf dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83, Seiten 5708-5712, August 1986 beschriebenen Verfahren beruht und wie folgt durchgeführt wird.
Die Thrombozyten werden durch die Albumin-Dichtegradienten- Technik frei von Plasmabestandteilen gewaschen. In jedem Versuchsgemisch werden die Thrombozyten in modifiziertem Tyrode-Puffer mit menschlichem α-Thrombin bei 22-25ºC 10 Minuten lang stimuliert (3,125 x 10" Thrombozyten pro Liter und Thrombin zu 01 N1H Einheiten/ml). Das Hirudin wird dann in einem 25fachen Überschuß 5 Minuten vor Zugabe des radioaktiv markierten Liganden und jedes konkurrierenden Liganden zugesetzt. Nach diesen Zugaben beträgt die Endzahl der Thrombozyten in dern Gemisch 1 x 10"/Liter. Nach Inkubation für weitere 30 Minuten bei 22-25ºC werden die gebundenen und freien Liganden durch Zentrifugation von 50 µl des Gemisches durch 300 µl 20%ige Saccharose bei 12.000 g für 4 Minuten getrennt. Das Thrombozytenpellet wird dann von dem Rest des Gemisches abgetrennt, um die thrombozytengebundene Radioaktivität zu bestimmen. Die unspezifische Bindung wird in Gemischen, die einen Überschuß an nichtmarkiertem Liganden enthalten, gemessen. Wenn die Bindungskurven durch eine Scatchard-Analyse analysiert werden, wird die nichtspezifische Bindung als ein angepaßter Parameter von der Bindungsisotherme mittels eines Computerprogrammes abgeleitet. Um die Konzentration jeder Hemmkomponente zu bestimmen, die notwendig ist, um 50% der Fibrinbindung an thrombinstimulierte Thrombozyten zu hemmen (IC&sub5;&sub0;), wird jede Verbindung in einer Konzentration von 0,176 µmol/Liter (60 µg/ml) getestet. Der IC&sub5;&sub0;-Wert wird durch Auftragen der verbleibenden Fibrinogenbindung gegen den Logarithmus der Konzentration der Probenverbindung abgeleitet.
II. Hemmung der fibrinogenvermittelten Thrombozytenaggregation, die im wesentlichen auf dem in Blood, Bd. 66, Nr. 4, Oktober 1985, Seiten 846-952 beschriebenen Verfahren beruht, und wie folgt durchgeführt wird.
Menschliche Thrombozyten wurden aus frisch entnommenem Vollblut isoliert und in 0,14 mol/l NaCl, 2,7 mmol/l KCl, 12 mmol/l NaHCO&sub3;, 0,42 mmol/l Na&sub2;HPO&sub4;, 0,55 mmol/l Glucose und 5 mmol/l Hepes, pH 7,35 bei einer Konzentration von 2 x 10&sup8; Thrombozyten/ml suspendiert. Die Suspension wurde bei 37ºC inkubiert. Ein Aliquot von 0,4 ml der Thrombozytensuspension wurde durch menschliches Thrombin in einer Endkonzentration von 2 µg/ml Thrombin für eine Minute aktiviert. Nach einer Minute wurde die Reaktion durch einen Thrombininhibitor gestoppt. Reihenverdünnungen der Testverbindung wurden dann den aktivierten Thrombozyten zugesetzt, und die Reaktion wurde eine Minute lang ablaufen gelassen, dann wurde menschliches Fibrinogen in einer Endkonzentration von 60 µ/ml Fibrinogen zugesetzt. Die Thrombozytenaggregation wurde dann durch ein Aggregometer aufgezeichnet. Die Aggregationsrate wurde verwendet, um den IC&sub5;&sub0;-Wert zu berechnen.
Die repräsentativen Ergebnisse der Hemmung der Thrombozytenaggregation sind in Tabelle I gezeigt. TABELLE I Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Fibrinogen an die Thrombozyten Hemmung der fibrinogenvermittelten Thrombozytenaggregation % Hemmung bei 100µM N-(5-Guanidinopentanoyl)-azetidin-(2S)-carboxyl-Asp-Val N-(5-Aminopentanoyl)azetidin-(2S)-carboxyl-Asp-Val N-(L-arginyl)azetidin-(2S)-carboxyl-Asp-Val N-[1-(L-Arginyl)piperidin-2-yl-carbonyl]-L-aspartyl-L-valin L-Arginyl-L-propyl-L-aspartyl-L-valin * Hemmte weniger als 50% bei 50 µg/ml ** Diese Verbindung zeigte eine 95%ige Hemmung bei 25 µm
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können oral oder parenteral Säugern verabreicht werden. Die Verbindung kann in pharmazeutische Formulierungen mit für diese Verabreichungen geeigneten Exzipientien, die mit den Verbindungen nicht nachteilig reagieren, eingearbeitet werden, beispielsweise Wasser, Pflanzenöle, bestimmte Alkohole und Kohlenhydrate, Gelatine und Magnesiumstearat. Die pharmazeutischen Formulierungen, die einen erfindungsgemäßen Wirkstoff enthalten, können zu Tabletten, Kapseln, Elixieren, Tropfen oder Suppositorien für die enterale Verabreichung und Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen für die parenterale Verabreichung formuliert werden.
Im allgemeinen wird die erfindungsgemäße Verbindung in Dosen von etwa 1 bis 200 mg pro Dosiseinheit oder höher verabreicht. Die Tagesdosis beträgt etwa 0,02-5 mg/kg Körpergewicht. Es ist jedoch zu verstehen, daß die spezielle Dosis für jeden Patienten, wie üblich, von sehr verschiedenen Faktoren, wie dem Alter, Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Ernährung und dergleichen des Patienten, der Zeit und dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, der Kombination von Medikamenten und der Schwere der Erkrankung abhängt.

Claims

1) Verbindung der Formel

worin X für H oder Amidino steht, Y für H oder Amidino steht, m den Wert 1 bis 5 hat, n den Wert 0 bis 4 hat, und pharmazeutisch verträgliche Salze davon, ausgenommen L-Arginyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-valin.

2) Pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung einer abnormalen Thrombusbildung in einem Säuger, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und eine pharmazeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1.

3) Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhütung oder Behandlung einer Thrombusbildung in einem Säuger.

4) N-(5-Guanidinopentanoyl)azetidin-(2S)-carboxyl-Asp- Val.

5) N-(5-Aminopentanoyl)azetidin-(2S)-carboxyl-Asp-Val.

6) N-(L-Arginyl)azetidin-(2S)-carboxyl-Asp-Val.

7) N-[1-(L-Arginyl)piperidin-2-yl-carbonyl]-L-Asp-L-Val.

8) Verwendung von L-Arginyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-valin zur Herstellung eines antithrombotischen Medikaments.