WO1992016549A1 - Para-substituierte phenylalanin-derivate - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to novel proteinase inhibitors which contain phenylalanine as the basic structure, the aromatic radical being substituted in the para position.
- phenylalanine as the basic structure
- aromatic radical being substituted in the para position.
- Proteinase inhibitors are potential drugs that can be used to control physiological processes that are triggered and maintained by proteinases. Numerous endogenous or naturally occurring inhibitors have been shown to influence the activity of proteinases in vivo and to dampen hyperproteolytic states [see Hörl, WH In: Design of Enzyme Inhibitors as Drugs, pp. 573-581, (Sandler, M and Smith, HJ, Eds.) Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press, 1989]. The therapeutic use of these relatively high molecular weight inhibitors is limited due to their special protein structure. Because these inhibitors are not absorbable in the intestine after oral administration on the one hand and an antigenic activity on the other hand was looking for synthetic small molecule enzyme inhibitors.
- the four classes of enzymes responsible for proteinase dependent processes include the serine, thiol, metallo, and aspartate proteinases.
- Serine proteinases are proteolytic enzymes that have a reactive serine residue in the active center.
- the trypsin family of serine proteinases includes enzymes which, like trypsin as such, cleave C-terminal peptide bonds of the basic amino acids arginine and lysine. In this group, those enzymes of particular physiological importance which trigger coagulation and fibrinolysis in the blood, release kinin and bring about complement activation, or those which are themselves components of the enzyme systems mentioned.
- Blood clotting is triggered in two different ways by zymogen activation.
- the first, endogenous route leads to blood coagulation via a reaction chain mediated by blood components.
- the second, exogenous route leads to coagulation via a shorter reaction chain based on an interaction between blood and tissue components. Both routes result in the activation of the zymogen factor X to the serine proteinase factor X a , which in turn catalyzes the activation of the prothrombin to the fibrinogen-coagulating serine proteinase thrombin.
- factor X a As a common product of both the endogenous and the exogenous activation sequence, factor X a was initially regarded as a preferred target enzyme for inhibitory interventions in the blood coagulation process (Tidwell, RR et al., Thromb. Res. 19, 339-349, 1980). However, it has recently been demonstrated that synthetic inhibitors of factor X a do not inhibit coagulation in vitro and in vivo (Sturzbecher, J. et al., Thromb. Res. 54, 245-252, 1989) and are antithrombotic (Hauptmann, J et al., Thromb. Haemostas. 63, 220-223, 1990). For this reason, the development of anticoagulant inhibitors focuses on the discovery of inhibitors of the thrombin.
- Trypsin itself can trigger hyperproteolytic conditions in the pancreas, i.e. in the gland in which it is formed as a zymogen. It must be assumed that traces of trypsinogen in the gland are activated to trypsin and that the trypsin formed also converts other proenzymes into the enzymatically active form.
- inhibitors would therefore be an effective intervention to prevent activation processes.
- the inhibition since the inhibition must primarily take place in the gland, the inhibitor has to get into the cells of the pancreas.
- the naturally occurring inhibitor aprotinin does not stand a chance as a miniprotein in vivo, but can favorably influence secondary events (shock).
- small-molecule inhibitors derived from 4-guanidinobenzoic acid have shown that such compounds are able to reduce enzyme activity in both the gland and the blood in experimental pancreatitis in rats (Iwaki, M. et al., Japan. J. Pharmacol. 41, 155-162, 1986).
- Amino acid derivatives with a benzamidine structure and a para-amido group have proven to be favorable basic structures for the development of effective trypsin inhibitors.
- the inhibitor called NAPAP belongs with a K i of 7.9 x
- one first group includes peptidyl-arginine-chloromethyl ketones, for example Dns-Glu-Gly-Arg-CH 2 Cl, which inhibits trypsin (Kettner, C. et al., Meth. Enzymol. 80, 826-842, 1981) or HD- Phe-Pro-Arg-CH 2 Cl, which also inhibits thrombin (Kettner, C. et al., Thromb. Res. 14, 969-973, 1979).
- a second group includes peptidyl arginine aldehydes, e.g.
- Boc-D-Phe-Pro-Arg-H and HD-Phe-Pro-Arg-H (Bajusz, S., Int. J. Peptide Protein Res. 12, 217-221, 1978) which inhibit trypsin and thrombin with comparable affinity.
- these inhibitors are unstable and, because of their high reactivity, can cause undesirable side reactions. Trypsin and thrombin are also inhibited in a time-dependent reaction by the boronic acid derivative Boc-D-Phe-Pro-Boro-Arg-C 10 H 16 (see European patent application No. 0 293 881).
- the selective thrombin inhibitor (2R, 4R) -4-methyl-1- [N ⁇ - (3-methyl-1,2,3,5-tetrahydro-8-quinoline sulfonyl) -L-arginine] -2-pipecoline carboxylic acid also has some Trypsin inhibitory activity (Kikumoto, R. et al., Biochemistry 23, 85-90, 1984).
- N ⁇ - (2-naphthylsulfonyl) aspartyl-4-amidinophenylalanine piperidide was produced. It was found that this compound did not selectively inhibit trypsin as expected, but surprisingly thrombin. It has also been found that this compound has improved pharmacokinetic properties, and is particularly absorbed through the intestine after subcutaneous administration to rats, remains available in the blood in an effective, anticoagulant concentration for a prolonged period and is very little toxic. This also applies to compounds which carry heteroaliphatic amino acids in the C-terminal part.
- the present invention relates to novel proteinase-inhibiting D, L, L and D-phenylalanine derivatives of the formula
- R 1 is a basic group of the formula
- R 5 and R 6 in formulas (a) and (b) each denote hydrogen or a straight-chain or branched lower alkyl radical
- R 2 (f) can be OH, O-alkyl, O-cycloalkyl, O-aralkyl,
- R 7 is hydrogen or a straight-chain or branched lower alkyl radical and R 8 is a straight-chain or branched lower alkyl radical, a 1- or 2-hydroxyethyl radical, a methylmercaptoethyl radical, an aminobutyl radical, a guanidinopropyl radical, a carboxy (lower) alkyl radical, a carboxamido (low) alkyl radical, one PhenyKniedrigen) alkyl radical, the ring of which is optionally substituted with OH, halogen, lower alkyl or methoxy, a cyclohexyl or cyclohexylmethyl radical, the ring of which is optionally substituted with OH, halogen, lower alkyl or methoxy, or an N-heteroaryl (lower) denote alkyl radicals with 3 to 8 carbon atoms in heteroaryl, for example imidazolylmethyl or indolylmethyl, where group (g) is
- n denotes the number 1 or 2
- one of the methylene groups is optionally substituted by a hydroxyl, carboxyl, lower alkyl or aralkyl radical, the group (h) being racemic or D- or L - can be configured
- (k) represents a piperidyl group which is optionally substituted in one of the positions 2, 3 and 4 with a lower alkyl, hydroxyalkyl or hydr ⁇ xyl radical,
- heterocycloaliphatic rings of the formulas (h), (i), (k) a further aromatic or cycloaliphatic ring, preferably phenyl or Cyclohexyl, in the 2,3 or 3,4 position, based on the hetero atom, can be fused on,
- n ' represents the numbers 1 to 6 and R 10
- R 3 represents hydrogen or a straight-chain or branched lower alkyl, aralkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, carboxamidoalkyl, heteroarylalkyl or a 1 or 2-hydroxyethyl radical, where n denotes the number 0 or 1 and the optionally inserted amino acid can be racemic or D- or L-configured, and
- R 4 is an aryl radical, for example phenyl, methylphenyl, ⁇ - or ⁇ -naphthyl or 5- (dimethylamino) -naphthyl, or one
- Heteroaryl e.g. Quinolyl
- Amidino (a) can be prepared by the methods known per se described below.
- Phenylalanine derivatives are compounds in which
- R 4 denotes ⁇ -naphthyl and n denotes the number 1
- alk is preferably - CH 3 or - C 2 H 5
- alk is preferably - CH 3 or - C 2 H 5
- esterification with a lower alcohol, preferably methanol, in the presence of p-toluenesulfonic acid or sulfuric acid to the 4-cyanophenylalanine alkyl ester IV
- n, R 3 and R 4 in the general formula VI correspond to those of the compounds V.
- R 2 the in the general formula I under (g), (h), (i), (k), (l), (m), (n) and (o) as well as R 3 and R 4 the in have meanings mentioned in this formula and R 9 represents a straight-chain or branched alkoxy or benzyloxy group
- R 9 represents a straight-chain or branched alkoxy or benzyloxy group
- the compounds of the general formula V are reacted with corresponding amino acid esters by the DCC process by reacting the compounds V in a suitable aprotic solvent with dicyclohexylcarbodiimide in the presence of 1-hydroxybenzotriazole and using the amino acid esters or amines mentioned to give VII be implemented.
- the compounds of structure V are isolated after conversion into active esters with, for example, N-hydroxysuccinimide, 2,3,4,5,6, -pentafluorophenol or p-nitrophenol in the presence of dicyclohexylcarbodiimide or without intermediate isolation with corresponding amino acid esters or amines converted to compounds of general formula VII.
- n and R 2 to R 4 correspond to those of the general formula I, alk represents lower alkyl, preferably - CH 3 , and X represents halogen, generally iodine.
- the compounds VII with a lower alcohol optionally in the presence of a Solvents such as dioxane or chloroform, in the presence of anhydrous hydrogen halide in imidate halides X.
- a Solvents such as dioxane or chloroform
- n and R 2 to R 4 correspond to those of the general formula I
- alk represents lower alkyl, preferably -CH 3 or -C 2 H 5
- X represents halogen, generally chlorine.
- the thioimidate salts IX are reacted in alcoholic solution with ammonium acetate or an alkylammonium acetate or the imidic acid ester salts X in alcoholic ammonia solution to XI .
- the cyan compounds VII become catalytic, for example with Raney nickel / hydrogen in alcoholic solution in the presence of ammonia
- Bases are suitably in salts, preferably
- alk is preferably - CH 3 or - C 2 H 5 , by refluxing in a mixture of 3 N.
- the biological activity of the compounds according to the invention was determined both in vitro and in vivo.
- Factor Xa tPA, glandular kallikrein, factor XIIa, and
- Plasma kallikrein according to the formula
- thrombin time TT
- aPTT activated partial thromboplastin time
- PT prothrombin time
- the plasma concentration of selected derivatives after subcutaneous (s.c.) and oral (p.o.) application to rats was determined using the following three-step procedure:
- HPLC high pressure liquid chromatography
- the substance to be tested was dissolved in rat plasma in vitro. This solution was also subjected to HPLC to determine whether the peak characteristic of the substance would reappear at the substance-specific retention time.
- the substance to be tested was dissolved in physiological saline and administered in a dose of 5 or 100 mg per kg body weight sc or po to rats. Blood samples were taken at 15 minute intervals, from which plasma samples were produced by centrifugation, which in turn were subjected to HPLC to determine whether the peak characteristic of the substance would appear again at the substance-specific retention time.
- MERCK thin-layer prefabricated plates with silica gel 60, F 254, as a coating and the following solvent systems (LS) were used to carry out the thin-layer chromatography tests:
- Silica gel 60 with a particle size of 0.035-0.070 mm was used to carry out the column chromatography for the purification of the raw products.
- N- ⁇ - (2-naphthylsulfonyl) -ß-t-butoxycarbonyl- (DL) -aspartyl-4-cyan- (D, L) -phenylalanine piperidide (32) 2.5 g of compound 31 were dissolved in 30 ml of THF, the solution, after cooling to -18 ° C., mixed with 0.52 ml of NMM and 0.62 ml of isobutyl chloroformate and stirred for 15 minutes. Then 0.67 ml of piperidine were added, the mixture was stirred at -18 ° C. for a further 90 minutes and finally until room temperature was reached. Working up was carried out analogously to 11. The crude product obtained was purified by column chromatography over silica gel 60 (chloroform / methanol 95: 5 as eluent). Yield: 86%, amorphous product.
- N- ⁇ - (2-naphthylsulfonyl) -4-oxamidino- (DL) -phenylalanyl- (D, L) -1,2.3.4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid hydrochloride (62) 1.14 g of compound 61 were dissolved in 40 ml of methanol, 0.19 g of hydroxylammonium acetate was added to the solution and the reaction mixture was stirred at room temperature for 20 minutes. A solution of 0.145 g of NaHCO 3 in 5 ml of water was then added, about 20 ml of solvent were distilled off and 50 ml of water were added. After 3 days in the refrigerator, the crystallized betaine from compound 62 was suction filtered, washed with water and dried. Yield: 64%, mp 162-178 ° C.
- phenylalanine alkyl hydroxyalkyl- or hydroxy-piperidide phenylalanine-N-alkyl-, N-aryl- or N-alkoxycarbonyl-
- aralkyl and aryl esters phenylalanyl-piperidine-2-, 3- or 4-carboxylic acid and its -alkyl-, -aralkyl- or -arylester phenylalanyl-alkyl-piperidine-2-, 3- or 4-carboxylic acids and their -alkyl-, -aralkyl- , or -arylester phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid and -alkyl-, -aralkyl- or -arylester phenylalanyl-decahydroisoquinoline-3-carboxylic acid and
- phenylalanine alkyl hydroxyalkyl- or hydroxy-piperidide phenylalanine-N-alkyl-, N-aryl- or N-alkoxycarbonyl-
- phenylalanine alkyl hydroxyalkyl- or hydroxy-piperidide phenylalanine-N-alkyl-, N-aryl- or N-alkoxycarbonyl-
- phenylalanine alkyl hydroxyalkyl- or hydroxy-piperidide phenylalanine-N-alkyl-, N-aryl- or N-alkoxycarbonyl-
- phenylalanine alkyl hydroxyalkyl- or hydroxy-piperidide phenylalanine-N-alkyl-, N-aryl- or N-alkoxycarbonyl-
- phenylalanine alkyl hydroxyalkyl- or hydroxy-piperidides phenylalanine-N-alkyl-, N-aryl- or N-alkoxycarbonyl- -piperazides phenylalanyl-proline and -hydroxyproline and -alkyl-,
- phenylalanine alkyl hydroxyalkyl- or. hydroxy-piperidide phenylalanine-N-alkyl-, N-aryl- or N-alkoxycarbonyl-
- Table 1 shows the inhibition of the coagulation enzymes thrombin and trypsin by means of the dissociation constant K. (expressed in ⁇ mol / 1) by the compounds mentioned. All investigated compounds competitively inhibit substrate cleavage caused by both enzymes.
- K. dissociation constant
- the compounds derived from 4-oxamidinophenylalanine and 4-aminomethylphenylalanine produce less antithrombin activity, but some of them have useful K i values for thrombin inhibition in the micromolar range.
- Factor X a and factor XIIa protein Ca, plasmin, plasma kallikrein, tPA and glandular kallikrein are shown.
- the other enzymes are usually inhibited much less, such as protein Ca, plasmin, plasma kallikrein and
- Factor X a K i 2 orders of magnitude larger.
- the derivatives are practically ineffective against factor XIIa, tPA and glandular kallikrein. For the majority of the compounds, one can therefore speak of selective thrombin inhibitors.
- the toxicity of the compounds according to the invention is significantly lower than that of derivatives of benzamidine-containing amino acids tested previously (LD 10-50 mg / kg after iv application). For example, an LD 50 value of 210 mg / kg was found for compound 26 after intravenous administration.
- Table 3 shows the results of the investigations on the pharmacokinetics of two compounds according to the invention and, as a comparison, the values with NAPAP.
- the compounds were administered subcutaneously or orally to rats. After the administration, blood samples were taken from the test animals at intervals of 2 to a maximum of 360 minutes, in which the blood level of the compounds to be tested was determined by means of HPLC.
- the tested derivative 26 shows an improved pharmacokinetic behavior. Relatively high, long-lasting blood levels are found after subcutaneous administration. After oral administration, NAPAP cannot be detected in plasma, while the compounds tested according to the invention reach relatively high concentrations.
- a number of representative compounds according to the invention are anticoagulant in vitro.
- the thrombin time (TT) was most effectively prolonged. This corresponds to the selectivity of these inhibitors, which inhibit thrombin most strongly among the coagulation factors.
- a prolongation of the activated partial thromboplastin time (aPTT), in which, in addition to thrombin, the enzymes involved in the early phase of coagulation also come into play, is achieved by higher concentrations of the inhibitors. This also applies to influencing the prothrombin time (PT), which represents the extrinsic coagulation pathway. This is shown as an example for connection 57 in Fig. 1.
- phenylalanine derivatives prepared by one of the processes according to the invention are expediently converted into suitable application forms as such or as salts with a physiologically tolerable inorganic or organic acid using suitable pharmaceutical auxiliaries.
- suitable pharmaceutical auxiliaries According to the pharmacokinetic behavior, these are, in particular, transdermal therapy systems such as plasters, but also tablets, dragées, capsules, suppositories, solutions, etc.
- the dosage depends on the antithrombin activity, the toxicity, the possible blood level values, the bioavailability and the type of application of the compound used according to the invention, and in general on the blood values, the weight and the general condition of the patient, so that the dosage must ultimately be determined by the practicing doctor .
- the dosage corresponds to that of known thrombin inhibitors Compounds and is between about 0.2 mg / kg and about 20 mg / kg body weight, although higher doses can optionally be administered.
- daily doses of a compound according to the invention of about 50 mg to about 1600 mg or more are thus obtained.
- 1 tablet contains 100 mg of active ingredient, 60 mg of milk sugar, 30 mg of wheat starch and 1 mg of magnesium stearate.
- the active ingredient mixed with milk sugar and wheat starch is moistened uniformly with a 20% ethanolic solution of polyvinyl pyrrolidone, pressed through a sieve with a mesh size of 1.5 mm and dried at 40 ° C.
- the granules thus obtained are mixed with magnesium stearate and compressed into tablets.
- 1 dragee contains 50 mg of active ingredient, 30 mg of milk sugar and 15 mg of wheat starch.
- Example 3 The active ingredient mixed with milk sugar and wheat starch is granulated in the manner described in Example 1 and compressed to oval tablet cores, which are then coated.
- a sugar mixture consisting of 48 g powdered sugar, 18 g gum arabic, 48 g wheat starch and 4 g magnesium stearate and a mixture of equal parts of mucilage gum arabic and water are used as coating agents.
- Example 3 A sugar mixture consisting of 48 g powdered sugar, 18 g gum arabic, 48 g wheat starch and 4 g magnesium stearate and a mixture of equal parts of mucilage gum arabic and water are used as coating agents.
- 1 suppository contains 100 mg of active ingredient and 0.9 g of zetyl phthalate as a basis.
- 1.0 g of the finely powdered active ingredient is triturated with twice the amount of the liquefied base.
- the trituration is partially mixed with the rest of the liquefied base and processed until it is uniform. Near the pourability limit, the mixture is poured into a suitable mold and left to cool.
Abstract
D,L-, L- und D-Phenylalanin-Derivate der im Patentanspruch 1 definierten Formel (I), in denen R1 für eine Amidino-, Guanidino-, Oxamidino-, Aminomethyl- oder Aminogruppe steht, wurden gefunden, die blutgerinnungshemmend resp. antithrombothisch wirksam sind. Die antitrombotisch wirksamen Verbindungen weisen eine geringe Toxizität auf und können peroral, anal, subkutan oder intravenös verabreicht werden.
Description
Para-substituierte Phenylalanin-Derivate
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteinasen-Inhibitoren, die als Grundstruktur Phenylalanin enthalten, wobei der aromatische Rest in para-Stellung substituiert ist. Durch Variation des Substituenten am Phenylrest, Einfügung saurer Aminosäuren in Nα-Position bzw. C-terminale Einführung von insbesondere heterocycloaliphatischen Aminocarbonsäuren mit hydrophoben Eigenschaften wurden Inhibitoren mit verbesserter Bioverfügbarkeit gefunden.
Proteinase-Inhibitoren sind potentielle Arzneimittel, die zur Steuerung physiologischer Prozesse, welche durch Proteinasen ausgelöst und unterhalten werden, verwendet werden können. Für zahlreiche endogene bzw. natürlich vorkommende Hemmstoffe ist gezeigt worden, dass sie in vivo die Aktivität von Proteinasen beeinflussen und hyperproteolytische Zustände dämpfen können [Siehe Hörl, W.H. In: Design of Enzyme Inhibitors as Drugs, S. 573-581, (Sandler, M. and Smith, H.J., Eds.) Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press, 1989]. Der therapeutische Einsatz dieser relativ hochmolekularen Hemmstoffe ist allerdings wegen ihrer besonderen Proteinstruktur begrenzt. Da diese Hemmstoffe einerseits nach oraler Verabreichung im Darm nicht resorbierbar sind und andererseits eine antigene Aktivität
ausüben, wurde nach synthetischen kleinmolekularen Enzym- Inhibitoren Ausschau gehalten.
Die vier Klassen von Enzymen, die für Proteinasen-abhängige Prozesse verantwortlich sind, umfassen die Serin-, Thiol-, Metallo-, und Aspartat-Proteinasen. Serin-Protei- nasen sind proteolytische Enzyme, die einen reaktiven Serin-Rest im aktiven Zentrum besitzen. Zur Trypsin-Familie der Serin-Proteinasen gehören Enzyme, die wie Trypsin als solches C-terminale Peptidbindungen der basischen Aminosäuren Arginin und Lysin spalten. In dieser Gruppe sind diejenigen Enzyme von besonderer physiologischer Bedeutung, welche im Blut Gerinnung und Fibrinolyse auslösen, Kinin freisetzen und die Komplement-Aktivierung bewirken oder solche, die selber Komponenten der genannten Enzymsysteme sind.
Die Blutgerinnung wird über zwei unterschiedliche Wege durch Zymogen-Aktivierung ausgelöst. Der erste, endogene Weg, führt über eine durch Blutkomponenten vermittelte Reaktionskette zur Blutgerinnung. Der zweite, exogene Weg führt über eine kürzere, auf einer Wechselwirkung zwischen Blut- und Gewebekomponenten beruhenden Reaktionskette zur Gerinnung. Beide Wege bewirken die Aktivierung des Zymogens Faktor X zur Serinproteinase Faktor Xa, welche ihrerseits die Aktivierung des Prothrombins zur Fibrinogen-koagulie- renden Serin-Proteinase Thrombin katalysiert. Als gemeinsames Produkt sowohl des endogenen als auch des exogenen Aktivierungsablaufs wurde Faktor Xa zunächst als ein bevorzugtes Zielenzym für hemmende Eingriffe in den Blutgerinnungsvorgang angesehen (Tidwell, R. R. et al., Thromb. Res. 19, 339-349, 1980). In jüngster Zeit wurde aber nachgewiesen, dass synthetische Inhibitoren des Faktors Xa in vitro und in vivo nicht gerinnungshemmend (Stürzebecher, J. et al., Thromb. Res. 54, 245-252, 1989) und antithrombotisch wirksam sind (Hauptmann, J. et al., Thromb. Haemostas. 63, 220-223, 1990). Aus diesem Grund konzentriert sich die Entwicklung von antikoagulativ wirkenden Hemmstoffen auf die Auffindung von Inhibitoren
des Thrombins.
Trypsin selbst kann hyperproteolytische Zustände im Pankreas, also in der Drüse, in der es als Zymogen gebildet wird, auslösen. Man muss davon ausgehen, dass Spuren von Trypsinogen in der Drüse zu Trypsin aktiviert werden und dass das gebildete Trypsin auch andere Proenzyme in die enzymatisch aktive Form überführt.
Die Ausschaltung der Trypsinaktivität durch Inhibitoren wäre demnach ein wirksamer Eingriff zur Verhinderung von AktivierungsVorgängen. Da die Hemmung aber primär in der Drüse stattfinden muss, muss der Inhibitor in die Zellen des Pankreas gelangen. Der natürlich vorkommende Hemmstoff Aprotinin hat als Miniprotein in vivo dazu allerdings keine Chance, kann aber sekundäre Ereignisse (Schock) günstig beeinflussen. Im Gegensatz dazu konnte mit kleinmolekularen Inhibitoren, die sich von der 4-Guanidinobenzoesäure ableiten, gezeigt werden, dass derartige Verbindungen in der Lage sind, bei der experimentellen Pankreatitis an der Ratte die Enzymaktivität sowohl in der Drüse als auch im Blut zu reduzieren (Iwaki, M. et al., Japan. J. Pharmacol. 41 , 155-162, 1986).
Zur Entwicklung von synthetischen Inhibitoren für Trypsin und seinen verwandten Enzymen sind Derivate des Benzamidins vielfach untersucht worden (Stürzebecher, J. et al., Acta Biol. Med. Germ. 35, 1665-1676, 1976).
Aminosäurederivate mit Benzamidin-Struktur und paraständiger Amidinogruppe haben sich als günstige Grundstrukturen für die Entwicklung von wirksamen Hemmstoffen des Trypsins erwiesen. So ist das Aminosäure-Derivat Nα- (2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidinophenylalanin-piperidid zwar der bisher stärkste, beschriebene Thrombin-Hemmstoff (Ki= 6 x 10-9 Mol/Liter) vom Benzamidintyp. Der als NAPAP bezeichnete Hemmstoff gehört aber mit einem Ki von 7,9 x
10-7 Mol/Liter auch zu den wirksamen Trypsin-Hemmstoffen
(Stürzebecher, J. et al., Thromb. Res. 29, 635-642, 1983).
Es sind noch weitere Typen von Inhibitoren bekannt, die Trypsin bzw. Thrombin ebenfalls wirksam hemmen: Eine
erste Gruppe beinhaltet Peptidyl-arginin-chlormethylketone, z.B. Dns-Glu-Gly-Arg-CH2Cl, welches Trypsin hemmt (Kettner, C. et al., Meth. Enzymol. 80, 826-842, 1981) bzw. H-D- Phe-Pro-Arg-CH2Cl, welches auch Thrombin hemmt (Kettner, C. et al., Thromb. Res. 14, 969-973, 1979). Eine zweite Gruppe beinhaltet Peptidylargininaldehyde, z.B. Boc-D-Phe-Pro- Arg-H und H-D-Phe-Pro-Arg-H (Bajusz, S., Int. J. Peptide Protein Res. 12, 217-221, 1978), welche Trypsin und Thrombin mit vergleichbarer Affinität hemmen. Diese Inhibitoren sind jedoch instabil und können wegen ihrer grossen Reaktionsfähigkeit unerwünschte Nebenreaktionen verursachen. Trypsin und Thrombin werden in einer zeitabhängigen Reaktion ebenfalls durch das Boronsäurederivat Boc-D-Phe- Pro-Boro-Arg-C10H16 (s. Europ. Patentanmeldung No. 0 293 881) gehemmt. Der selektive Thrombininhibitor (2R,4R)-4- Methyl-1-[Nα-(3-methyl-1,2,3,5-tetrahydro-8-chinolinsulfonyl)-L-arginin]-2-pipecolincarbonsäure hat auch eine gewisse Trypsin-hemmende Aktivität (Kikumoto, R. et al., Biochemistry 23, 85-90, 1984).
Als therapeutisch verwendbare nicht-selektive Inhibitoren, die unter anderem Trypsin und Thrombin hemmen, sind das Methansulfonsäuresalz des 4-(6-Guanidino-hexanoyloxy)- benzoesäure-ethylesters (Muramatu, M. et al., Biochim. Biophys. Acta 268, 221-224, 1972) und das Dimethansulfonsäuresalz der 6-Amidino-2-naphthyl-p-guanidinobenzoesäure (s. US Patent Nr. 4 454 338), das zur Behandlung der akuten Pankreatitis vorgeschlagen wurde (Iwaki, M. et al., Japan. J. Pharmacol. 41, 155-162, 1986), beschrieben.
Alle bisher geprüften Benzamidinderivate besitzen für eine therapeutische Anwendung ungünstige pharmakodynamische und pharmakokinetische Eigenschaften. Sie werden bei oraler Applikation nicht im Darm resorbiert, werden schnell aus der Zirkulation eliminiert und ihre Toxizität ist relativ hoch. Das gilt sowohl für die Amide des N-α-arylsulfonylierten (Markwardt, F. et al., Thromb. Res. 17, 425-431, 1980), als auch für Amide des N-α-aryl-sulfonylaminoacylierten 4-Amidinophenylalanins (s. Patentanmeldung No.
DD-A-235 866). Verantwortlich für die unzureichenden pharmakologischen Eigenschaften ist die stark basische Amidinofunktion (Kaiser, B. et al., Pharmazie 42, 119-121, 1987). Versuche, die stark basische Amidinofunktion in hochwirksamen Inhibitoren durch schwächer basische Gruppen zu ersetzen, schlugen fehl; solche Veränderungen hatten einen bedeutenden Verlust an Wirkungsstärke zur Folge (Stürzebecher, J. et al., Pharmazie 43, 782-783, 1988). Auch die Einführung einer Carboxylgruppe in den Inhibitor zur Verminderung der Basizität der Amidinofunktion führte zum Abfall der Inhibitoraktivität. So sind Derivate des 4-Amidinophenylalanins, die C-terminal eine Aminosäure mit freier Carboxylgruppe besitzen, inhibitorisch völlig wirkungslos (Wagner, G. et al., Pharmazie 39, 16-18, 1984; Vieweg, H. et al., Pharmazie 39, 82-86, 1984).
Auch die Abwandlung von NAPAP durch Einführung eines Substituenten am α-Stickstoff, die zu einer geringen Erhöhung der Antithrombinaktivität führte (s. Europ. Patentanmeldung No. FR-A-2 593 812) erbrachte keine Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften (Cadroy, Y. et al., Thromb. Haemostas. 58, 764-767, 1987).
Für die Entwicklung selektiver Hemmstoffe des Trypsins liegen inzwischen günstige Voraussetzungen vor. So sind die Röntgen-Kristallstrukturen der Komplexe von Trypsin nicht nur mit Benzamidin (Bode, W. und Schwager, P., J. Molec. Biol. 98, 693-717, 1975) und seinen einfachen Derivaten (Walter, J. und Bode, W., Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 364, 949-959, 1983), sondern auch mit den Thrombinhemmstoffen Nα-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidinophenylalanin-piperidid (Bode, W. et al., Eur. J. Biochem. 193, 175-182, 1990) und (2R,4R)-4-Methyl-1-[Nα-(3-methyl-1,2,3, 5-tetrahydro-8-chinolinsulfonyl)-L-arginin]-2-pipecolin- carbonsäure (Matsuzaki, T. et al., J. Biochem. 105. 949-952, 1989), die mit Trypsin ebenfalls stabile Komplexe bilden, bekannt.
Ausgehend von den Differenzen in den Bindungsbereichen des aktiven Zentrums zwischen Trypsin und Thrombin, wurde versucht, durch Modifikation der Grundstrukturen therapeutisch verwendbare Trypsin-Inhibitoren mit guten pharmakologischen Eigenschaften zu konzipieren. So war zu erwarten, dass beispielsweise Verbindungen mit einer sauren Aminosäure anstelle von Glycin in dem Hemmstoff Nα-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidinophenylalanin-piperidid nicht mehr an Thrombin gebunden werden, da Thrombin in Position 192 einen Glutaminsäure-Rest besitzt (Bode, W. et al., Eur. J. Biochem. 193, 175-182, 1990). Demgegenüber sollte die Bindungsfähigkeit an Trypsin erhalten bleiben bzw. verbessert werden, da im Trypsin an dieser Stelle ein ungeladener Glutamin-Rest positioniert ist. In diesem Rahmen wurde beispielsweise Nα-(2-Naphthylsulfonyl)-aspartyl-4-amidinophenylalanin-piperidid hergestellt. Es wurde festgestellt, dass diese Verbindung nicht wie erwartet Trypsin selektiv hemmt, sondern überraschenderweise Thrombin. Es wurde ferner festgestellt, dass diese Verbindung verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften besitzt, und insbesondere nach subkutaner Verabreichung an Ratten durch den Darm resorbiert wird, im Blut über einen längeren Zeitraum in wirksamer, blutgerinnungshemmender Konzentration verfügbar bleibt und sehr wenig toxisch ist. Dies trifft auch für Verbindungen zu, die im C-terminalen Teil heteroaliphatische Aminosäuren tragen.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteinasen- hemmende D,L-, L- und D-Phenylalanin-Derivate der Formel
in welcher
R1 eine basische Gruppe der Formel
(d) - CH2 - NH2 oder (e) - NH2
Aminomethyl Amino darstellt, wobei R5 und R6 in den Formeln (a) und (b) je Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest bezeichnen,
R2 (f) OH, O-Alkyl, O-Cycloalkyl, O-Aralkyl sein kann,
(g) eine Gruppe der Formel
darstellt, in welcher R7 Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest und R8 einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest, einen 1- oder 2-Hydroxyethylrest, einen Methylmercaptoethylrest, einen Aminobutylrest, einen Guanidinopropylrest, einen Carboxy(niedrigen)alkylrest, einen Carboxamido(niedrigen)alkylrest, einen
PhenyKniedrigen)alkylrest, dessen Ring gegebenenfalls mit OH, Halogen, niedrig-Alkyl oder Methoxy substituiert ist, einen Cyclohexyl- oder Cyclohexylmethylrest, dessen Ring gegebenenfalls mit OH, Halogen, niedrig-Alkyl oder Methoxy substituiert ist, oder einen N-Heteroaryl(niedrigen)alkylrest mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen im Heteroaryl, z.B. Imidazolylmethyl oder Indolylmethyl, bezeichnen, wobei die Gruppe (g) racemisch oder D- bzw. L-konfiguriert sein kann,
(h) eine Gruppe der Formel
darstellt, in welcher m die Zahl 1 oder 2 bezeichnet, und in welcher eine der Methylengruppen gegebenenfalls mit einem Hydroxyl-, Carboxyl-, niederen Alkyl- oder Aralkyl-rest substituiert ist, wobei die Gruppe (h) racemisch oder D- bzw. L-konfiguriert sein kann,
(i) eine Gruppe der Formel -
darstellt, in welcher p = r = 1 , p = 1 und r = 2 oder p = 2 und r = 1 sind und in welcher eine der Methylengruppen gegebenenfalls mit einem Hydroxyl-, Carboxyl-, niederen Alkyl- oder Aralkyl-rest substituiert ist,
(k) eine Piperidylgruppe darstellt, die gegebenenfalls in einer der Stellungen 2, 3 und 4 mit einem niederen Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Hydrσxyl-rest substituiert ist,
wobei an die. heterocycloaliphatischen Ringe der Formeln (h), (i), (k) ein weiterer aromatischer oder cycloaliphatischer Ring, vorzugsweise Phenyl oder
Cyclohexyl, in 2,3 oder 3,4 Stellung, bezogen auf das Heteroatom, ankondensiert sein kann,
(1) eine Piperazylgruppe, die gegebenenfalls in p-Stellung mit einem niederen Alkylrest, einem Arylrest oder einem Alkoxycarbonylrest substituiert ist, (m) eine Gruppe der Formel
darstellt, in welcher n' die Zahlen 1 bis 6 und R10
Wasserstoff oder den Methyl- oder Cyclohexylrest bezeichnen und R1 = (b) bis (e) sein kann.
(n) eine Gruppe der Formel
darstellt, wobei R9 in den Formeln (g), (h), (i), (l),
(m) und (n) eine Hydroxyl-, geradkettige oder verzweigte niedrige Alkoxy, Cycloalkoxy oder eine Aralkoxy Gruppe bezeichnet,
oder
(o) eine Kombination von 2 bis 20, vorzugsweise 2 bis
5, insbesondere 2 oder 3, der von den unter (g), (h),
(i), (k), (l), (m) und (n) definierten Gruppen abgeleiteten, durch Amidbindungen verknüpften Resten (R9 =
Einfachbindung) darstellt, wobei der C-terminale Rest gegebenenfalls mit einem Rest R9 verknüpft ist,
R3 Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkyl-, Aralkyl-, Carboxyalkyl-, Alkoxycarbonyl- alkyl-, Carboxamido-alkyl-, Heteroarylalkyl- oder einen 1-oder 2-Hydroxyethyl-Rest darstellt, wobei n die Zahl 0 oder 1 bezeichnet und die gegebenenfalls eingeschobene Aminosäure racemisch oder D- bzw. L-konfiguriert sein kann, und
R4 einen Arylrest., z.B. Phenyl, Methylphenyl, α- oder ß-Naphthyl oder 5-(Dimethylamino)-naphthyl, oder einen
Heteroarylrest, z.B. Chinolyl, darstellt,
wobei niedrig 1-4 Kohlenstoffatome bedeutet.
und deren Salze mit Mineralsäuren oder organischen Säuren. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 =
Amidino (a) können nach den nachfolgend beschriebenen, an sich bekannten Methoden hergestellt werden.
Von den in den allgemeinen Ansprüchen definierten
Phenylalanin-Derivaten sind Verbindungen, bei denen
R2 O-Alkyl, O-Cycloalkyl oder Aralkyl falls n=0, ist, einen heterocycloaliphatischen Rest, der in den
Formeln (h), (i), (k) und (l) näher erläutert ist, darstellt, R4 ß-Naphthyl, bezeichnet und n die Zahl 1, bedeutet,
von besonderer Bedeutung.
4-Cyanbenzyl-acylamino-malonsäurediester der allgemeinen Formel II,
führt.
Durch Sulfonylierung der Verbindungen III mit einem Aryl- bzw. Heteroarylsulfonylchlorid oder Acylierung mit einem sulfonylierten Aminosäurehalogenid in Gegenwart einer Base werden die Verbindungen der allgemeinen Formel V,
in welcher n = 0 oder 1 ist und R3 und R4 die in der allgemeinen Formel I beschriebenen Bedeutungen besitzen, erhalten.
Nach einer zweiten Variante werden zur Darstellung der
Verbindungen V sulfonylierte Aminosäuren mit dem
Carbonsäureester IV nach dem DCC-Verfahren zunächst zu
Verbindungen der allgemeinen Formel VI
mit Carbonsäureesterstruktur umgesetzt, aus denen nach alkalischer Hydrolyse die Verbindungen V erhalten werden. Die Bedeutungen von n, R3 und R4 in der allgemeinen Formel VI entsprechen denen der Verbindungen V.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel VII,
in welcher R2 die in der allgemeinen Formel I unter (g), (h), (i), (k), (l), (m), (n) und (o) sowie R3 und R4 die in dieser Formel genannten Bedeutungen besitzen und R9 eine geradkettige oder verzweigte Alkoxy- bzw. Benzyloxy-Gruppe darstellt, werden gemäss einer ersten Methodenvariante durch Umsetzung der Verbindungen V mit einem entsprechenden Aminosäureester nach dem Mischanhydridverfahren dargestellt, indem die Verbindungen der Struktur V mit vorzugsweise Chlorameisensäureisobutylester in Gegenwart einer geeigneten tertiären Base, z.B. 4-Methylmorpholin, bei -15° bis -20°C in einem aprotischen Lösungsmittel zur Reaktion gebracht und anschliessend mit einem Aminosäureester oder Amin umgesetzt werden.
Gemäss einer zweiten MethodenVariante werden die Verbindungen der allgemeinen Formel V nach dem DCC-Verfahren mit entsprechenden Aminosäureestern umgesetzt, indem die Verbindungen V in einem geeigneten aprotischen Lösungsmittel mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol zur Reaktion gebracht und mit den genannten Aminosäureestern oder Aminen zu VII umgesetzt werden.
Gemäss einer dritten Methodenvariante werden die Verbindungen der Struktur V nach Überführung in aktive Ester mit beispielsweise N-Hydroxysuccinimid, 2,3,4,5,6,-Pentafluorphenol oder p-Nitrophenol in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid isoliert bzw. ohne zwischenzeitliche Isolierung mit entsprechenden Aminosäureestern oder Aminen zu Verbindungen der allgemeinen Formel VII umgesetzt.
Gemäss einer vierten Methodenvariante werden Verbindungen der Struktur V, bei denen n = 0 ist, mit beispielsweise Thionylchlorid in Säurechloride übergeführt, die anschliessend mit entsprechenden Aminosäureestern oder
Aminen zu Verbindungen der allgemeinen Formel VII umgesetzt werden.
Durch milde alkalische oder saure Hydrolyse mit beispielsweise verdünnter NaOH oder Trifluoressigsaure von
Verbindungen der Struktur VII werden die Verbindungen mit Carbonsäurestruktur der allgemeinen Formel VII, wobei R2, R3 und R4 die in der allgemeinen Formel I genannten Bedeutungen besitzen und das in R2 definierte R9 = OH ist, erhalten.
Ausgehend von den Verbindungen mit Carbonsäurestruktur VII können nach den vorher beschriebenen Verfahren weitere Aminosäuren gekoppelt werden.
Durch Addition von H2S an VII mit Carbonsäure- oder Carbonsäureesterstruktur in Pyridin in Gegenwart von Triethylamin werden die Thioamide der allgemeinen Formel VIII
erhalten, wobei die Bedeutungen der Substituenten R2, R3 und R4 denen der allgemeinen Formel I entsprechen.
Durch Umsetzung der Verbindungen VIII mit einem Alkylhalogenid, vorzugsweise Methyliodid, werden die Thioimidsäureesterhalogenide IX
erhalten. Die Bedeutungen von n und R2 bis R4 entspricht denen der allgemeinen Formel I, Alk stellt niedrig Alkyl, vorzugsweise - CH3, dar und X bedeutet Halogen, im allgemeinen Iod.
Ausserdem können die Verbindungen VII mit einem niederen Alkohol, gegebenenfalls in Anwesenheit eines
Lösungsmittels wie beispielsweise Dioxan oder Chloroform, in Gegenwart von wasserfreiem Halogenwasserstoff in Imidsäureesterhalogenide X
übergeführt werden, wobei Verbindungen mit freier -COOH- Gruppe gleichzeitig mit dem verwendeten Alkohol verestert werden. Die Bedeutungen von n und R2 bis R4 entsprechen denen der allgemeinen Formel I, Alk stellt niedrig Alkyl, vorzugsweise -CH3 oder -C2H5, dar und X bedeutet Halogen, im allgemeinen Chlor.
Zur Darstellung der Zielverbindungen XI,
mit n = 0 oder 1 und den Bedeutungen der Substituenten R1 bis R6 analog denen der allgemeinen Formel I und X = Halogen, werden die Thioimidsäureestersalze IX in alkoholischer Lösung mit Ammoniumacetat bzw. einem Alkylammoniumacetat oder die Imidsäureestersalze X in alkoholischer Ammoniaklösung zu XI umgesetzt.
Verbindungen XI mit einem t-Butoxy-Rest (R9) im Substituenten R2 können anschliessend durch Hydrolyse mit
Trifluoressigsaure in Verbindungen XI mit Carbonsäurestruktur (R9 = OH) übergeführt werden.
Verbindungen XI mit einer OH-Gruppe (R2 oder R9) können anschliessend mit vorzugsweise niederen aliphati- schen (C1-C8), cycloaliphatischen oder araliphatischen Alkoholen, in Gegenwart von Chlorwasserstoff oder p-Toluolsulfonsäure in Verbindungen XI mit Carbonsäureesterstruktur (R2, R9 = O-Alkyl, O-Cycloalkyl, O-Aralkyl) übergeführt werden.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 = Oxamidino (c) werden auf dem gleichen Syntheseweg wie die Verbindungen mit R1 = Amidino (a), über die Zwischenprodukte der Formeln II bis IX, dargestellt. Im letzten Syntheseschritt werden die Thioimidsäureestersalze IX mit
Hydroxylammoniumacetat zu Verbindungen der allgemeinen Formel I umgesetzt, wobei R1 die Oxamidino-Gruppe (c) darstellt.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 =
Aminomethyl (d) werden ebenfalls auf diese Weise über die
Zwischenprodukte der Formeln II bis VII dargestellt. Um zu den Zielverbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 =
CH2 - NH2 zu gelangen, werden die Cyanverbindungen VII katalytisch, beispielsweise mit Raney-Nickel/Wasserstoff in alkoholischer Lösung in Gegenwart von Ammoniak, zu den
Aminomethylverbindungen reduziert. Die erhaltenen freien
Basen werden in geeigneter Weise in Salze, vorzugsweise
Hydrochloride, übergeführt.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 = Guanidino (b) können prinzipiell nach dem gleichen Syntheseschema wie die mit Amidinφstruktur (a) dargestellt werden.
Dazu werden 4-Nitrobenzyl-acylamino-malonsäurediester der allgemeinen Formel XII,
in welcher Alk vorzugsweise - CH3 oder - C2H5 bedeutet, durch ruckfliessendes Erhitzen in einer Mischung von 3 N
HCl und Eisessig zu 4-Nitrophenylalanin XIII
umgesetzt, dessen Veresterung mit einem niederen Alkohol, vorzugsweise Methanol, in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure, Schwefelsäure oder Chlorwasserstoff zum 4-Nitrophenylalaninalkylester XIV
führt .
Die Verbindungen XV, XVI und XVII
werden auf die gleiche Weise erhalten wie die entsprechenden Cyanverbindungen V bis VII, wobei auch die Bedeutungen von n, R2, R3 und R4 entsprechend sind.
Durch katalytische Hydrierung mittels beispielsweise
Raney-Nickel/Wasserstoff in einem geeigneten Lösungsmittel werden aus XVII die Aminoverbindungen der allgemeinen
erhalten, die mittels eines geeigneten Guanylierungsreagenses, beispielsweise 1-Amidino-3,5-dimethyl-pyrazol-nitrat, zu den Guanidinoverbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 = Guanidino (b) umgesetzt werden
Verbindungen mit der allgemeinen Formel I mit R 1
Guanidino (b), Oxamidino (c), Aminomethyl (d) bzw. Amino
(e) und einem t-Butoxy-Rest (R9) im Substituenten R2 können
durch Hydrolyse mit Trifluoressigsaure in Verbindungen mit Carbonsäurestruktur (R9 = OH) übergeführt werden, die anschliessend durch Veresterung mit niederen Alkoholen, vorzugsweise Methanol, in Gegenwart von Chlorwasserstoff oder p-Toluolsulfonsäure zu Verbindungen mit Carbonsäureesterstruktur (R9 = Alkoxy) umgesetzt werden können.
Die biologische Aktivität der erfindungsgemässen Verbindungen wurde sowohl in vitro als auch in vivo bestimmt. Zur Charakterisierung der Inhibitoraktivität in vitro wurden die Dissoziationskonstanten Ki für die Hemmung von Trypsin bzw. der verwandten Enzyme Thrombin, Plasmin,
Faktor Xa. tPA, glanduläres Kallikrein, Faktor XIIa, und
Plasmakallikrein nach der Formel
In vitro wurden verschiedene Gerinnungstests benutzt, um die Wirksamkeit der Hemmstoffe gegenüber der durch Thrombin ausgelösten Gerinnung seines natürlichen Substrates Fibrinogen zu bestimmen. Dazu wurde in Human-Plasma die Thrombinzeit (TT), die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und die Prothrombinzeit (PT, Quickwert) bestimmt.
Die Toxizität der erfindungsgemässen Verbindungen wurde durch Bestimmung der LD50 (= Dosis, die bei 50% der Versuchstiere während einer Beobachtungsdauer von einer Woche zum Tode führt) an der Maus nach intravenöser bzw.
peroraler Verabreichung ermittelt.
Zur pharmakokinetischen Charakterisierung wurde die Plasmakonzentration ausgewählter Derivate nach subkutaner (s.c.) und peroraler (p.o.) Applikation an Ratten nach folgendem dreistufigem Verfahren bestimmt:
1. Eine Lösung der zu prüfenden Substanz in physiologischer Kochsalzlösung wurde der Flüssigkeits-Hochdruckchromatographie (HPLC = high pressure liquid chromatography) unterworfen, um den für die zu prüfende Substanz charakteristischen Peak bei der unter den gewählten Versuchsbedingungen substanzspezifischen Retentionszeit zu ermitteln.
2. Die zu prüfende Substanz wurde in vitro in Rattenplasma gelöst. Diese Lösung wurde ebenfalls der HPLC unterworfen, um festzustellen, ob der für die Substanz charakteristische Peak bei der substanzspezifischen Retentionszeit erneut erscheinen würde.
3. Die zu prüfende Substanz wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und in einer Dosis von 5 bzw. 100 mg pro kg Körpergewicht s.c. bzw. p.o. an Ratten verabreicht. In Zeitintervallen von 15 Minuten wurden Blutproben entnommen, aus denen durch Zentrifugation Plasmaproben hergestellt wurden, welche ihrerseits der HPLC unterworfen wurden, um festzustellen, ob der für die Substanz charakteristische Peak bei der substanzspezifischen Retentionszeit wiederum in Erscheinung treten würde.
LEGENDE ZU ZUSAMMENSTELLUNG
LS - Lösungsmittelsystem (siehe unten)
Rf - Retentionsfaktor, bei Angabe von 2
Rf-Werten, Doppelfleckbildung durch
Isomerie
Zur Durchführung der dünnschichtchromatographischen Untersuchungen wurden MERCK-Dünnschicht-Fertigplatten mit Kieselgel 60, F 254, als Beschichtung und die folgenden Lösungsmittelsysteme (LS) verwendet:
LS 1 : organische Phase von Ethylacetat/Essigsäure/Wasser
(4/1/2)
LS 2: Chloroform/Methanol/Essigsäure (40/4/1)
Sprühreagenzien: Ninhydrin - für primäre und sekundäre
aliphatische Aminogruppen
4-Dimethylaminobenzaldehyd - für primäre aromatische Aminogruppen
Zur Durchführung der Säulenchromatographie zwecks Reinigung der Rohprodukte wurde Kieselgel 60 mit einer Korngrösse von 0,035 - 0,070 mm verwendet.
ABKÜRZUNGEN in Beispielen 1 - 11
TEA - Triethylamin
HOBT - 1-Hydroxybenzotriazol
DCC - Dicyclohexylcarbodiimid
NMM - 4-Methylmorpholin
DMF - Dimethylformamid
THF - Tetrahydrofuran
TFA - Trifluoressigsaure
HOSu - N-Hydroxysuccinimid
dc - dünnschichtchromatographisch
Beispiel 1
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-amidino-(D,L)-phenylalanin- (D,L)-pjpecolinsäure (8)
(4-Cyanbenzyl)-acetamino-malonsäure-diethylester (1)
10,0 g 4-Cyanbenzylbromid und 11,0 g Acetamino-malonsäure- diethylester wurden in 100 ml abs. Dioxan gelöst und unter Rühren eine Natriumethylatlösung (1,15 g Natrium/50 ml abs. Ethanol) zugetropft. Der Ansatz wurde 5 Stunden unter Rückfluss erhitzt, anschliessend ausgefallenes NaBr abfiltriert und das Filtrat bis zur beginnenden Kristallisation im Vakuum eingeengt. Es wurden 250 ml Wasser hinzugefügt, der Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und aus Methanol/Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 81%, Smp. 166-168°C.
4-Cyan-(D,L)-phenylalanin-hydrochlorid (2)
12,0 g der Verbindung 1 wurden in einer Mischung aus 32 ml Eisessig und 64 ml 3 N HCl 6 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert und der Rückstand getrocknet. Das erhaltene Rohprodukt wurde in Methanol gelöst und über einer Kolonne (Sephadex LH-20, Pharmacia) mit Methanol als Eluierungsmittel chromatographisch gereinigt. Ausbeute: 70%, Smp. 226-228°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-cyan-(D,L)-phenylalanin (3)
11,5 g der Verbindung 2 wurden in 160 ml 1 N KOH gelöst, eine Lösung von 12,5 g 2-Naphthylsulfonylchlorid in 100 ml Ether zugegeben und die Mischung 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei nach etwa 1,5 Stunden das Kaliumsalz der Verbindung 3 auszukristallisieren begann. Anschliessend wurde der Niederschlag abgesaugt, mit Ether gewaschen,
unter Erwärmen in Wasser gelöst und mit 3 N HCl angesäuert, wobei die Verbindung 3 auskristallisierte. Es wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 60%, Smp. 184-186°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-cyan-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)- pipecolinsäure-ethylester (4)
1,35 g (D,L)-Pipecolinsäure-ethylester und 0,8 g NMM wurden in 20 ml Ethylacetat gelöst, eine Lösung von 3,0 g des aus Verbindung 3 und Thionylchlorid erhaltenen Säurechlorids in 30 ml Ethylacetat zugetropft und der Ansatz 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in 20 ml Methanol gelöst und zur Kristallisation stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abgesaugt und aus Methanol/Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 65%, Smp. 164-166°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-cyan-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-pipecolinsäure (5)
2,0 g der Verbindung 4 wurden in einer Mischung aus je 20 ml Methanol und 1 N NaOH suspendiert und der Ansatz bis zur vollständigen Verseifung (de Kontrolle) bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde die Hälfte des Lösungsmittels im Vakuum abdestilliert und die verbleibende Lösung mit 1 N HCl angesäuert. Das ausgefallene, amorphe Produkt wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 90%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-thiocarboxamido-(D,L)-phenyl¬alanyl-(D,L)-pipecolinsäure (6)
1,0 g der Verbindung 5 wurde in 15 ml Pyridin und 1 ml TEA gelöst, in die Lösung 10 Minuten H2S eingeleitet und der Ansatz 48 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der
Rückstand in Ethylacetat aufgenommen und mit 1 N HCl ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde 1 x mit Wasser gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Das isolierte gelbe, amorphe Produkt wurde in der erhaltenen Form weiterverarbeitet. Ausbeute: 85%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-S-methyliminothiocarbonyl-(D.L)- phenylalanyl-(D,L)-pipecolinsäure-hydroiodid (7)
1,0 g der Verbindung 6 wurde in 20 ml Aceton gelöst, die Lösung mit 3,0 g Methyliodid versetzt und der Ansatz 20 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtschutz aufbewahrt, wobei Verbindung 7 auszukristallisieren begann. Es wurde noch 24 Stunden im Kühlschrank stehengelassen, der Niederschlag abgesaugt, mit Aceton/Ether 1:1 gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 67%, Smp. 203-205°C (Zers.).
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure-hydroiodid (8)
0,6 g der Verbindung 7 wurden in 10 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,1 g Ammoniumacetat versetzt und der Ansatz 3 Stunden bei 60°C im Wasserbad erwärmt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in Ethanol gelöst und Verbindung 8 mit Ether gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 78%, Smp. ab 185°C.
Beispiel 2
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenyl¬alanyl-sarcosin und -methylester (15, 16)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-σlycin (9)
Einer Lösung von 16,5 g Glycin in 440 ml 1 N NaOH wurde eine Lösung von 45 g 2-Naphthylsulfonylchlorid in 200 ml
Ether zugesetzt und das Reaktionsgemisch 4 Stunden intensiv bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde die wäss- rige Phase mit 3 N HCl angesäuert, der ausgefallene Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 76%, Smp. 153-154°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-cyan-(D,L)-phenylalanin (10)
10,0 g der Verbindung 2 wurden in 135 ml 1 N NaOH gelöst, eine Lösung von 11,0 g des aus Verbindung 9 und Thionyl- chlorid erhaltenen (2-Naphthylsulfonyl)-glycylchlorids in 120 ml Ethylacetat zugegeben und der Ansatz 3 Stunden intensiv gerührt. Anschliessend wurde eine geringe Menge unlösliches Nebenprodukt abfiltriert, die wässrige Phase mit 3 N HCl angesäuert und mit Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde 1 x mit Wasser gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel weitestgehend abdestilliert. Der verbleibende Rückstand kristallisierte beim Anreiben mit Ether. Es wurden 50 ml Ether zugefügt, der Niederschlag abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 68%, Smp. 156-158°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-cyan-(D.L)-phenylalanyl-sarcosin-t-butylester (11)
0,61 g Sarcosin-t-butylester-hydrochlorid wurden in 4 ml DMF gelöst, die Lösung mit 0,74 ml NMM und einer Lösung von 1,6 g des aus der Verbindung 10, HOSu und DCC erhaltenen N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-cyan-(D,L)-phenylalanyl-OSu-esters in 20 ml THF versetzt und das Reaktionsgemisch 16 Stunden gerührt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen, die Lösung mit 10%iger Zitronensäure, gesättigter NaHCO3-Lösung und Wasser gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das nach Abdestillieren des Lösungsmittels erhaltene Rohprodukt säulenchromatographisch über Kieselgel 60 (Chloroform/
Methanol 95:5 als Eluierungsmittel) gereinigt. Ausbeute: 55%, Smp. 134-136°C (aus Ethylacetat).
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-thiocarboxamido-(D,L)- phenylalanyl-sarcosin-t-butylester (12)
1,0 g der Verbindung 11 wurde analog 6 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 89%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-S-methyliminothiocarbonyl-(D,L)-phenylalanyl-sarcosin-t-butylester-hydroiodid im
0,85 g des Thioamids 12 wurden in 15 ml Aceton gelöst, 1,5 g Methyliodid zugefügt und die Lösung 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtschutz aufbewahrt, wobei Verbindung 13 auskristallisierte. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Aceton/Ether 1:1 gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 94%, Smp. ab 136°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-sarcosin-t-butylester-hydroiodid (14)
0,85 g der Verbindung 13 wurden in 15 ml Methanol gelöst, 0,16 g Ammoniumacetat zugefügt und analog 8 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 88%, amorphes Pulver.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-sarcosin-hydrochlorid (15)
0,62 g der Verbindung 14 wurden in 3 ml TFA gelöst und 90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der ölige Rückstand in 10 ml Methanol gelöst und die Lösung mit ethanolischer Ammoniaklösung auf pH 7,4 gebracht. Nach 12-stündigem Aufbewahren im Kühlschrank wurde das auskristallisierte Betain von 15 abgesaugt, mit Methanol gewaschen und getrocknet.
Zur Überführung in das Hydrochlorid wurde das Betain in 5 ml Methanol suspendiert, die Suspension mit einigen Tropfen 2 N Ethylacetat/HCl angesäuert und Verbindung 15 aus der erhaltenen Lösung mit Ether ausgefällt. Der gebildete Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 64%, Smp. ab 170°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-sarcosin-methylester-hydrochlorid (16)
0,2 g der Verbindung 15 wurden in 4 ml abs . Methanol gelöst, die Lösung mit 30 Tropfen 2 N Ethylacetat/HCl versetzt und der Ansatz 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Durch Zugabe von Ether wurde Verbindung 16 aus der Reaktionslösung ausgefällt, abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 89%, Smp. ab 120°C.
Beispiel 3
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenyl¬alanyl-(D,L)-pipecolinsäure (21_)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-cyan-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure-ethylester (17)
1,5 g (D,L)-Pipecolinsäure-ethylester wurden in 10 ml THF gelöst, 1,4 g HOBT zugefügt und der Ansatz auf 0°C abgekühlt. Nach Zugabe einer Lösung von 3,0 g der Verbindung 10 in 25 ml THF sowie 1,71 g DCC wurde über Nacht gerührt. Anschliessend wurde das ausgefallene Harnstoffderivat abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, die Lösung mit Wasser, 10%iger Zitronensäure, gesättigter NaHCO3-Lösung und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt säulenchromatographisch über Kieselgel 60 (Chloroform als Eluierungsmittel) gereinigt. Ausbeute: 63%,
amorphes Produkt. N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-αlycyl-4-cyan-(D.L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure (18)
2,4 g der Verbindung 17 wurden in einer Mischung aus je 25 ml 1 N NaOH und Methanol gelöst und bis zur vollständigen Verseifung (de Kontrolle) bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurden etwa 30 ml Lösungsmittel abdestilliert, die verbleibende Lösung mit 3 N HCl angesäuert, 100 ml Wasser zugefügt und der gebildete Niederschlag nach mehrstündigem Stehen im Kühlschrank abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Rohprodukt wurde säulenchromatographisch über Kieselgel 60 (Chloroform/ Methanol 90:10 als Eluierungsmittel) gereinigt. Ausbeute: 77%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-thiocarboxamido-(D.L)- phenylalanyl-(D,L)-pipecolinsäure (19)
1,7 g der Verbindung 18 wurden in 20 ml Pyridin und 1,5 ml TEA analog 6 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 94%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-S-methyliminothiocarbo- nyl-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-pipecolinsäure-hydroiodid (20)
1,7 g der Verbindung 19 wurden in 40 ml Aceton gelöst, 6,0 g Methyliodid zugesetzt und die Lösung 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtschutz stehengelassen. Anschliessend wurden 50 ml Ether zugefügt, wobei Verbindung 20 zunächst ölig anfiel. Nach Abgiessen des überstehenden Lösungsmittels und Durcharbeiten mit Ether konnte ein festes, amorphes Produkt erhalten werden. Ausbeute: 76%.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-amidino-(D,L)-phenyl¬alanyl-(D,L)-pipecolinsäure-hydroiodid (21)
1,6 g des Thioimidsäureester-hydroiodids 20 wurden in 15 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,28 g Ammoniumacetat versetzt und der Ansatz 3 Stunden bei 60°C im Wasserbad erwärmt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in 30 ml Methanol gelöst und Verbindung 21 mit Ethylacetat ausgefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ethylacetat und Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 75%, Smp. 197-201°C.
Beispiel 4
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-amidino-(D,L)-phenyl- alanyl-isonipecotinsäure und -methylester (26, 27)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-cyan-(D,L)-phenylalanyl- isonipecotinsäure-ethylester (22)
3,0 g der Verbindung 10 wurden in 30 ml THF gelöst und die Lösung mit 0,7 g NMM versetzt, wobei das NMM-Salz von Verbindung 10 ausfiel. Nach Zugabe von 30 ml DMF wurde unter Rühren auf -4°C abgekühlt, der Suspension 0,98 g Chlorameisensäure-isobutylester zugesetzt und 30 Minuten bei -4°C gerührt. Danach wurde eine Lösung von 1,62 g Isonipecotinsäure-ethylester in 20 ml THF zugesetzt, weitere 60 Minuten bei -4°C gerührt und dies bei Raumtemperatur über Nacht fortgesetzt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit Methanol angerieben, wobei Kristallisation eintrat. Es wurden 50 ml 50%iges Methanol zugefügt, abgesaugt und aus Methanol/ Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 68%, Smp. 169-171 °C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-cyan-(D,L)-phenylalanyl-isonipecotinsäure (23)
2,5 g der Verbindung 22 wurden in einer Mischung aus je 25 ml 1 N NaOH und Methanol gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde die Hälfte des
Lösungsmittels abdestilliert, die verbleibende Lösung mit 1 N HCl angesäuert und 150 ml Wasser zugesetzt. Nach mehrstündigem Stehen wurde der gebildete Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 92%, Smp. ab 110°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-thiocarboxamido-(D,L)- phenylalanyl-isonipecotinsäure (24)
2.1 g der Verbindung 23 wurden in 20 ml Pyridin und 2 ml TEA gelöst und analog 6 umgesetzt und aufgearbeitet. Das erhaltene feste Produkt wurde in 20 ml Methanol suspendiert, abgesaugt, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 70%, Smp. 234-237°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-S-methyliminothiocarbonyl-(D.L)-phenylalanyl-isonipecotinsäure-hydroiodid (25 )
1.2 g der Verbindung 24 wurden unter leichtem Erwärmen in 2 ml DMF gelöst, der Lösung 50 ml Aceton zugesetzt und filtriert. Das Filtrat wurde mit 4,0 g Methyliodid versetzt und das Reaktionsgemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde in 250 ml Ether gegossen, der gebildete Niederschlag abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 74%, amorphes Pulver.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-isonipecotinsäure-hydrochlorid ( 26)
0,8 g des Thioimidsäureester-hydroiodids 25 wurden in 15 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,15 g Ammoniumacetat versetzt und der Ansatz 3 Stunden bei 60°C im Wasserbad erwärmt, wobei das Betain von 26 auskristallisierte. Nach mehrstündigem Stehen wurde der Niederschlag abgesaugt, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 80%, Smp. 235-242°C.
Die Überführung in das Hydrochlorid erfolgte in der unter 15 beschriebenen Weise. Ausbeute: 91%, Smp. ab 165°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-isonipecotinsäure-methylester-hydrochlorid ( 27 )
0,2 g der Verbindung 26 wurden in 5 ml abs. Methanol gelöst, 50 Tropfen 2 N Ethylacetat/HCl zugefügt und die Lösung 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschliessend wurde Verbindung 27 mit Ether ausgefällt, abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 85%, Smp. ab 145°C.
Beispiel 5
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D,L)-aspartyl-, -(D.L)-aspartyl- und -ß-methoχycarbonyl-(D,L)-aspartyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanin-piperidid (35-37)
4-Cyan-(D.L)-phenylalanin-methylester-hydrochlorid ( 28 )
20 g der Verbindung 2 wurden in 150 ml abs. Methanol gelöst, die Lösung unter Eiskühlung mit 15 g konz. H-SO, versetzt und 24 Stunden rückfliessend erhitzt. Anschliessend wurde das Methanol im Vakuum abdestilliert, der Rückstand mit 3 N NaOH alkalisiert und mit 500 ml Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde 2 x mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der ölige Rückstand wurde in 20 ml Methanol gelöst und die Lösung mit methanolischer Salzsäure angesäuert, wobei Verbindung 28 bereits auszukristallisieren begann. Nach Zugabe von 400 ml Ether wurde der Niederschlag abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 78%, Smp. 190-192°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D,L)-aspara¬ginsäure (29)
1,0 g (D,L)-Asparaginsäure-ß-t-butylester wurde in 35 ml 0,33 M Na2CO3-Lösung gelöst, eine Lösung von 1,42 g 2- Naphthylsulfonylchlorid in 15 ml Ether zugegeben und das Reaktionsgemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei das Natriumsalz der Verbindung 29 ausfiel. Anschliessend wurden 100 ml Wasser zugefügt und der Niederschlag unter leichtem Erwärmen gelöst. Die erhaltene Lösung wurde 2 x mit je 50 ml Ether ausgeschüttelt, die wässrige Phase mit 1 N HCl angesäuert und zur Kristallisation stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 66%, Smp. 138-140°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D.L)-aspartyl-4-cyan-(D,L)-phenylalanin-methylester (30)
2,77 g der Verbindung 28 wurden in 15 ml DMF gelöst, 1,28 ml NMM, 1,77 g HOBT und 2,27 g DCC sowie eine Lösung von 4,0 g der Verbindung 29 in 40 ml THF hinzugefügt und das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt. Die Aufarbeitung und säulenchromatographische Reinigung erfolgte analog 17. Ausbeute: 85%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D,L)-aspartyl-4-cyan-(D.L)-phenylalanin (31)
4,22 g der Verbindung 30 wurden in einer Mischung aus 35 ml Methanol und 15 ml 1 N NaOH suspendiert und der Ansatz 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde die erhaltene Lösung mit 200 ml Wasser versetzt, mit 1 N HCl angesäuert und 10 Stunden stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 96%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D.L)-aspartyl-4-cyan-(D,L)-phenylalanin-piperidid (32)
2,5 g der Verbindung 31 wurden in 30 ml THF gelöst, die Lösung nach Abkühlen auf -18°C mit 0,52 ml NMM und 0,62 ml Chlorameisensäure-isobutylester versetzt und 15 Minuten gerührt. Danach wurden 0,67 ml Piperidin zugegeben, weitere 90 Minuten bei -18°C und schliesslich bis zum Erreichen von Raumtemperatur gerührt. Die Aufarbeitung erfolgte analog 11. Das erhaltene Rohprodukt wurde säulenchromatographisch über Kieselgel 60 (Chloroform/Methanol 95:5 als Eluierungsmittel) gereinigt. Ausbeute: 86%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D,L)-aspartyl-4-thiocarboxamido-(D,L)-phenylalanin-piperidid (33)
0,6 g der Verbindung 32 wurden in 10 ml Pyridin und 1 ml TEA analog 6 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 92%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D.L)-aspartyl-4-S-methyliminothiocarbonyl-(D,L)-phenylalanin-piperidid-hydroiodid (34)
0,58 g der Verbindung 33 wurden in 15 ml Aceton gelöst, die Lösung mit 0,8 g Methyliodid versetzt und 15 Minuten im Wasserbad unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde Verbindung 34 durch Zugabe von 100 ml Ether ausgefällt, abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 70%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D.L)-aspartyl-4-amidino-(D.L)-phenylalanin-piperidid-hydroiodid (35)
0,49 g der Verbindung 34 wurden in 10 ml abs. Ethanol mit 0,15 g Ammoniumacetat analog 8 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 86%, Smp. ab 128°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-aspartyl-4-amidino(D,L)-phenylalanin-piperidid-hydrochlorid (36)
2,0 g der Verbindung 35 wurden in 300 ml Ethylacetat suspendiert, die Suspension mit 40 ml 0,2 N NaOH versetzt und ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über Na-SO. getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Die erhaltene freie Base von 35 wurde in 10 ml TFA gelöst, die Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde in 10 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 1 ml 2 N Ethylacetat/HCl versetzt und Verbindung 36 mit Ether ausgefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 79%, Smp. ab 155°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-methoxycarbonyl-(D,L)-aspartyl4-amidino-(D,L)-phenylalanin-piperidid-hydrochlorid (37)
0,25 g der Verbindung 36 wurden analog 16 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 86%, Smp. ab 135°C.
Beispiel 6
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D,L)-aspartyl- und -(D,L)-aspartyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanin (40, 41)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D,L)-aspartyl-4-thiocarboxamido-(D,L)-phenylalanin (38)
0,7 g der Verbindung 31 wurden in 10 ml Pyridin und 1 ml TEA analog 6 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 93%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D,L)-aspartyl-4-S-methyliminothiocarbonyl-(D,L)-phenylalanin-hydroiodid (39)
0,7 g der Verbindung 38 wurden analog 34 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 99%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D,L)-aspartyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanin-hydrochlorid (40)
0,86 g des Thioimidsäureester-hydroiodids 39 wurden in 10 ml Methanol mit 0,3 g Ammoniumacetat analog 8 umgesetzt und aufgearbeitet. Das anfallende Hydroiodid wurde in das Hydrochlorid übergeführt, indem die Verbindung in 5 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 1 ml methanolischer Salzsäure versetzt und das Hydrochlorid sofort mit Ether gefällt wurde. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt. Der gebildete Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 59%, Smp. ab 168°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D.L)-aspartyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanin-hydrochlorid (41)
0,3 g der Verbindung 40 wurden in 4 ml TFA gelöst und 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in 5 ml Ethanol gelöst, der Lösung 0,5 ml 2 N Ethylacetat/HCl zugefügt und Verbindung 41 mit Ether ausgefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 70%, Smp. ab 112°C.
Beispiel 7
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D.L)- aspartyl-, -(D.D-aspartyl- und -ß-methoxycarbonyl-(D.L)-aspartyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanin-methylester (44-46)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D,L)-aspartyl-4-thiocarboxamido-(D,L)-phenylalanin-methylester (42)
1,5 g der Verbindung 30 wurden in 15 ml Pyridin und 1,5 ml TEA analog 6 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 89%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D.L)-aspartyl- 4-S-methyliminothiocarbonyl-(D,L)-phenylalanin-methylester- hydroiodid (43)
1,56 g der Verbindung 42 und 2,0 g Methyliodid wurden in 30 ml Aceton analog 34 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 78%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-t-butoxycarbonyl-(D,L)-aspartyl- 4-amidino-(D,L)-phenylalanin-methylester-hydroiodid (44)
1,5 g der Verbindung und 0,5 g Ammoniumacetat wurden in 10 ml Methanol analog 8 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 76%, Smp. ab 126°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-aspartyl-4-amidino-(D,L)- phenylalanin-methylester-hydrochlorid (45)
0,9 g der Verbindung 44 wurden in 200 ml Ethylacetat suspendiert, die Suspension mit 20 ml 0,2 N NaOH versetzt und ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über MgSO. getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert, wobei 0,7 g der freien Base von 44 erhalten wurden. Man löste die Verbindung in 7 ml TFA, rührte 2
Stunden bei Raumtemperatur und destillierte anschliessend das Lösungsmittel ab. Der Rückstand wurde in 8 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 1 ml 2 N Ethylacetat/HCl versetzt und Verbindung 45 mit Ether ausgefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet.
Ausbeute: 77%, Smp. ab 78°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-ß-methoxycarbonyl-(D.L)-aspartyl-4-amidino-(D.L)-phenylalanin-methylester-hydrochlorid (46)
0,25 g der Verbindung 45 wurden in 5 ml abs. Methanol gelöst, die Lösung mit 50 Tropfen 2 N methanolischer Salzsäure versetzt und der Ansatz 20 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Anschliessend wurde Verbindung 46 mit Ether ausgefällt, abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 78%, Smp. ab 84°C.
Beispiel 8
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-leucyl-4-amidino-(D,L)- phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester (53)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-leucin (47)
5,0 g (D,L)-Leucin wurden in 200 ml 0,42 M Natriumcarbonatlösung gelöst, eine Lösung von 10,4 g 2-Naphthylsulfonylchlorid in 150 ml Ether zugesetzt und der Ansatz 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei das Natriumsalz der Verbindung 47 ausfiel. Anschliessend wurde der Niederschlag abgesaugt, mit Ether gewaschen und unter Erwärmen in Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit 1 N HCl angesäuert, der gebildete Niederschlag nach mehrstündigem Stehen abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 52%, Smp. 103-104°C (aus Ethylacetat/Hexan).
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-leucyl-4-cyan-(D.L)-phenylalanin-methylester (48)
3,3 g der Verbindung 28, 1,56 ml NMM und 2,16 g HOBT wurden in 10 ml DMF gelöst, die Lösung auf 0°C abgekühlt und unter Rühren mit einer Lösung von 4,1 g der Verbindung 47 in 30 ml THF sowie 2,77 g DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde analog 17 aufgearbeitet. Ausbeute: 97%, Smp. 105-107°C (aus Ethylacetat/Hexan).
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-leucyl-4-cyan-(D,L)-phenylalanin (49)
6,3 g der Verbindung 48 wurden in 50 ml Methanol gelöst, 25 ml 1 N NaOH zugefügt und bis zur vollständigen Verseifung bei Raumtemperatur gerührt (de Kontrolle). Die Aufarbeitung und säulenchromatographische Reinigung erfolgte analog 18. Ausbeute: 61%, Smp. 146-148°C (aus Methanol/Wasser).
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-leucyl-4-cyan-(D,L)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester (50)
0,68 g (D)-Prolin-t-butylester, 0,67 g HOBT, 0,82 g DCC und 1,78 g der Verbindung 49 in 25 ml THF wurden analog 17 umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte säulenchromatographisch über Kieselgel 60 (Chloroform/Methanol 97:3 als Eluierungsmittel). Ausbeute: 85%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-leucyl-4-thiocarboxamido- (D,L)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester (51)
1,0 g der Verbindung 50 wurde analog 6 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 95%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-leucyl-4-S-methyliminothiocarbonyl-(D.L)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester-hydroiodid (52)
1,0 g der Verbindung 51 und 1,1 g Methyliodid wurden in 20 ml Aceton analog 34 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 60%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-leucyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester-hydroiodid (53)
0,67 g der Verbindung 52 wurden in 10 ml Methanol gelöst.
die Lösung mit 0,1 g Ammoniumacetat versetzt und der Ansatz 3 Stunden bei 60°C im Wasserbad erwärmt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in wenig Methanol gelöst und Verbindung 53 mit Ether ausgefällt. Ausbeute: 65%, Smp. ab 150°C.
Beispiel 9
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-amidino-(D.L)-phenylalanin-4-methylpiperidid (57)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-cyan-(D.L)-phenylalanin- 4-methylpjperidid (54)
0,9 g 4-Methylpiperidin, 1,4 g HOBT, 1,71 g DCC und 1,94 g der Verbindung 10 wurden in 35 ml THF analog 17 umgesetzt und aufgearbeitet. Die Reinigung erfolgte säulenchromatographisch über Kieselgel 60 (Chloroform als Eluierungs- mittel). Ausbeute: 84%, Smp. 202-203°C (aus Ethylacetat/ Hexan).
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-thiocarboxamido-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid (55)
1,85 g der Verbindung 54 wurden in 20 ml Pyridin und 1,5 ml TEA analog 6 umgesetzt und aufgearbeitet, wobei ein festes Produkt erhalten wurde. Es wurden 25 ml Methanol zugefügt, Verbindung 55 abgesaugt, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 95%, Smp. 235-236°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl-4-S-methyliminothiocarbonyl-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid-hydroiodid (56)
1,8 g des Thioamids 55 wurden unter Erwärmen in 3 ml DMF gelöst, 100 ml Aceton und 6 g Methyliodid zugefügt und der Ansatz 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtschutz aufbewahrt. Anschliessend wurde in 250 ml Ether gegossen.
der gebildete Niederschlag abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 85%, amorphes Pulver.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanin-4-methylpiperidid-hydroiodid (57)
1,2 g der Verbindung 56 wurden in 30 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,21 g Ammoniumacetat versetzt und 3 Stunden im Wasserbad bei 60°C erwärmt, wobei schon nach kurzer Zeit ein Niederschlag ausfiel, der sich allmählich wieder löste. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in abs. Ethanol gelöst und Verbindung 57 mit Ether ausgefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 78%, Smp. 198- 204°C (vorher Sintern).
Beispiel 10
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und
-methylester (62, 63)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-cyan-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)- 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure-methylester (58)
2,2 g (D,L)-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure-methylester und 1,1 g NMM wurden in 20 ml Ethylacetat gelöst, dem Reaktionsansatz eine Lösung von 4,0 g des aus Verbindung 3 und Thionylchlorid erhaltenen Säurechlorids in 50 ml Ethylacetat zugetropft und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in 20 ml Methanol gelöst und zur Kristallisation stehengelassen. Der gebildete Niederschlrg wurde abgesaugt, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 65%, Smp. 169-173°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-cyan-(D,L)-phenylalanyl-(D.L)- 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (59)
2,0 g der Verbindung 58 wurden in einer Mischung aus je 20 ml 1 N NaOH und Methanol suspendiert und bis zur vollständigen Verseifung bei Raumtemperatur gerührt, wobei schon nach kurzer Zeit eine klare Lösung erhalten wurde. Anschliessend wurde die Hälfte des Lösungsmittels abdestilliert, 100 ml Wasser zugesetzt und mit 1 N HCl angesäuert. Nach mehrstündigem Stehen wurde der gebildete Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 93%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-thiocarboxamido-(D.L)-phenylalanyl-(D,L)-1,2,3.4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (60)
1,3 g der Verbindung 59 wurden in 20 ml Pyridin und 1,5 ml TEA analog 6 umgesetzt und aufgearbeitet. Ausbeute: 98%, amorphes Produkt.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-S-methyliminothiocarbonyl-(D,L)--phenylalanyl-(D,L)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure-hydroiodid (61)
1,3 g des Thioamids 60 wurden in 20 ml Aceton gelöst, die Lösung mit 4,0 g Methyliodid versetzt und 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtschutz aufbewahrt. Anschliessend wurde in 200 ml Ether gegossen, der gebildete Niederschlag abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 86%, amorphes Pulver.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-oxamidino-(D.L)-phenylalanyl-(D,L)-1,2.3.4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure-hydro- chlorid (62)
1,14 g der Verbindung 61 wurden in 40 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,19 g Hydroxylammoniumacetat versetzt und der Reaktionsansatz 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde eine Lösung von 0,145 g NaHCO3 in 5 ml Wasser zugegeben, etwa 20 ml Lösungsmittel abdestilliert und 50 ml Wasser zugefügt. Nach 3-tägigem Aufbewahren im Kühlschrank wurde das auskristallisierte Betain von Verbindung 62 abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 64%, Smp. 162-178°C.
Die Überführung in das Hydrochlorid erfolgte wie unter 15 beschrieben. Ausbeute: 92%, Smp. ab 165°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-oxamidino-(D.L)-phenylalanyl- (D,L)-1,2,3.4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure-methylester-hydrochlorid (63)
0,3 g der Verbindung 62 wurden in 7,5 ml abs. Methanol gelöst, 40 Tropfen 3 N methanolische Salzsäure zugefügt und der Ansatz 30 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschliessend wurde die Hälfte des Lösungsmittels abdestilliert, Verbindung 63 mit Esther ausgefällt, abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 86%, Smp. ab 90°C.
Beispiel 11
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure (65) sowie -ethyl- (64) und -methylester (66)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure-ethylester-hydrochlorid (64)
2,0 g der Verbindung 4 wurden in einer Mischung aus je 15 ml Dioxan und Methanol gelöst, 20 ml ethanolische Ammoniaklösung zugefügt und in Gegenwart von Raney-Nickel-Katalysator unter Normalbedingungen hydriert. Nach
vollständiger Hydrierung (de Kontrolle) wurde vom Katalysator abfiltriert, das Lösungsmittel abdestilliert und der ölige Rückstand in wenig Ethanol aufgenommen. Die erhaltene Lösung wurde mit 2 N Ethylacetat/HCl angesäuert und Verbindung 64 mit Ether ausgefällt, wobei das Produkt erst nach längerem Stehen fest wurde. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 58%, Smp. ab 115°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure-hydrochlorid (65)
1,14 g der Verbindung 64 wurden in einer Mischung aus je 12 ml 1 N NaOH und Methanol suspendiert und der Ansatz bis zur vollständigen Verseifung bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde die erhaltene Lösung mit 3 N HCl angesäuert und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Zur Entfernung von restlichem Wasser wurde 2 x mit Isopropa- nol/Toluol 1:1 kodestilliert. Der feste Rückstand wurde mit 40 ml abs. Ethanol extrahiert, von ungelöstem NaCl abfiltriert und Verbindung 65 aus dem Filtrat nach Einengen auf etwa 10 ml mit Ether gefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 75%, Smp. ab 155°C.
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D.L)-phenylalanyl-(D,L)-pipecolinsäure-methylester-hydrochlorid (66)
0 32 g der Verbindung 65 wurden in 10 ml abs. Methanol gelöst, die Lösung mit 2 ml 3 N methanolischer Salzsäure versetzt und 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschliessend wurde Verbindung 66 durch Zugabe von Ether ausgefällt, der gebildete Niederschlag abgesaugt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 85%, Smp. ab 130°C.
Übersicht weiterer, gemäss den vorher angegebenen Herstellungsverfahren synthetisierten Verbindungen, die nicht in den Beispielen 1-11 aufgeführt sind:
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-γ-t-butoxy-(D,L)-glutamyl- 4-amidino-(D,L)-phenylalanin (68)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-γ-t-butoxy-(D,L)-glutamyl- 4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-piperidid (69)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-asparagyl-4-amidino- (D,L)-phenyl-alanyl-(D)-prolin-t-butylester (70)
N-α-(2-Naρhthylsulfonyl)-ß-t-butoxy-(D,L)-aspartyl- 4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-(D)-prolin (71)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-glutaminyl-4-amidino- (D,L)-phenylalanin (72)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenyl¬alanin (73)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenyl¬alanyl-(L)-phenylglyein (74)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycy1-4-amidino-(D,L)-phenyl¬alanyl-(L)-phenylglycin-methylester (75)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-(L)-phenylglycin-t-butylester (76)
7
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (77)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-4-methyl-(D,L)-pipecolinsäure (78)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl-4-methyl-(D,L)-pipecolinsäure-methylester (79)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl-4-methylpiperidid (80)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-glycyl-4-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl-isonipecotinsäure (81)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-amidino-(D,L)-phenylalanin (82 )
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-amidino-(D,L)-phenylalanin4-methylpiperidid (83)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-amidino-(D,L)-phenylalanylisonipecotinsäure (84)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-amidino-(D,L)-phenylalanylisonipecotinsäure-methylester ( 85 )
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-amidino-(D,L)-phenylalanyl(D,L)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (86)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-amidino-(D,L)-phenylalanylpiperid-2-on-3-carbonsäure (87)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-(D,L)-phenylalanyl-4-methyl- (D,L)-pipecolinsäure (88)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-amidino-(D,L)-phenylalany1nipecotinsäure (89)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-amidino-(D,L)-phenylalanylnipecotinsäure-methylester (90)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-oxamidino-(D,L)-phenylalanylnipecotinsäure (91)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-oxamidino-(D,L)-phenylalanylnipecotinsäure-methylester (92)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure (93)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-oxamidino-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-pipecolinsäure-methylester (94)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-oxamidino-(D,L)-phenylalanylisonipecotinsäure (95)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-oxamidino-(D,L)-phenylalanylisonipecotinsäure-methylester ( 96 )
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-oxamidino-(D,L)-phenylalanin4-methylpiperidid (97)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanylnipecotinsäure-ethylester (98)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanylnipecotinsäure (99)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanylnipecotinsäure-methylester (100)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanylnipecotinsäure-n-butylester (101 )
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl-(D,L)-pipecolinsäure-ethylester (102)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanylpipecolinsäure-n-butylester (103)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanylisonipecotinsäure-ethylester (104)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanylisonipecotinsäure (105)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanylisonipecotinsäure-methylester (106)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanylisonipecotinsäure-n-butylester (107)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl(D,L)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäuremethylester (108)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl(D,L)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (109)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl- (D,L)-1, 2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäureethylester (110)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl(D,L)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäuren-butylester (111)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(D,L)-phenylalanyl-4-methylpiperidid (112)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(L)-phenylalanyl-(D)-prolin-t-butylester (113)
N-α-(2-Naphthylsulfonyl)-4-aminomethyl-(L)-phenylalanyl-(D)-prolin (114)
Als Beispiele der allgemeinen Formel I mit para-ständiger basischer Gruppierung (R = (a) bis (e)) sind, sofern sie nicht bereits aufgeführt wurden, zu nennen:
N-α-(Tosyl)- bzw. (1- oder 2-Naphthylsulfonyl)- phenylalanin-alkyl-, aralkyl- und arylester
phenylalanin-alkyl-, hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-pyrrolidide
phenylalanin-alkyl-. hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-piperidide phenylalanin-N-alkyl-, N-aryl- bzw. N-alkoxycarbonyl-
-piperazide
phenylalanyl-prolin und -hydroxyprolin sowie -alkyl-,
-aralkyl- und -arylester
phenylalanyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäure und deren
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-alkyl-ρiperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäuren und deren -alkyl-, -aralkyl-, bzw. -arylester phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure und
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -alkyl-,
-aralkyl- bzw. -arylester
N-α-(Tosyl)- bzw. (1- oder 2-Naphthylsulfonyl)-qlycyl- phenylalanin-alkyl-, aralkyl- und arylester
phenylalanin-alkyl-, hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-pyrrolidide
phenylalanin-alkyl-, hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-piperidide phenylalanin-N-alkyl-, N-aryl- bzw. N-alkoxycarbonyl-
-piperazide
phenylalanyl-prolin und -hydroxyprolin sowie -alkyl-,
-aralkyl- und -arylester
phenylalanyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäure und deren -alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-alkyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäuren und deren -alkyl-, -aralkyl-, bzw. -arylester phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure und
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -alkyl-,
-aralkyl- bzw. -arylester
N-α-(Tosyl)- bzw. (1- oder 2-Naphthylsulfonyl)-alanyl- bzw. -β-alanyl- phenylalanin-alkyl-, aralkyl- und arylester
phenylalanin-alkyl-, hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-pyrroli- dide
phenylalanin-alkyl-. hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-piperidide phenylalanin-N-alkyl-, N-aryl- bzw. N-alkoxycarbonyl-
-piperazide
phenylalanyl-prolin und -hydroxyprolin sowie -alkyl-,
-aralkyl- und -arylester
phenylalanyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäure und deren
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-alkyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäuren
und deren -alkyl-, -aralkyl-, bzw. -arylester phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester
phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure und
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -alkyl-,
-aralkyl- bzw. -arylester
N-α-(Tosyl)- bzw. (1- oder 2-Naphthylsulfonyl)-leucyl-
phenylalanin-alkyl-, aralkyl- und arylester
phenylalanin-alkyl-, hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-pyrrolidide
phenylalanin-alkyl-. hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-piperidide phenylalanin-N-alkyl-, N-aryl- bzw. N-alkoxycarbonyl-
-piperazide
phenylalanyl-prolin und -hydroxyprolin sowie -alkyl-,
-aralkyl- und -arylester
phenylalanyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäure und deren
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-alkyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäuren und deren -alkyl-, -aralkyl-, bzw. -arylester phenylalanyl-1 ,2,3, 4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure und
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -alkyl-,
-aralkyl- bzw. -arylester
N-α-(Tosyl)- bzw. (1- oder 2-Naphthylsulfonyl)-aspartyl- bzw. -ß-alkoxy-aspartyl- phenylalanin-alkyl-, aralkyl- und arylester
phenylalanin-alkyl-, hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-pyrrolidide
phenylalanin-alkyl-. hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-piperidide phenylalanin-N-alkyl-, N-aryl- bzw. N-alkoxycarbonyl-
-piperazide
phenylalanyl-prolin und -hydroxyprolin sowie -alkyl-,
-aralkyl- und -arylester
phenylalanyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäure und deren
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-alkyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäuren und deren -alkyl-, -aralkyl-, bzw. -arylester phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester
phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure und
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester
phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -alkyl-,
-aralkyl- bzw. -arylester
N-α-(Tosyl)- bzw. (1- oder 2-Naphthylsulfonyl)-asparagi- nyl- phenylalanin-alkyl-, aralkyl- und arylester
phenylalanin-alkyl-, hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-pyrrolidide
phenylalanin-alkyl-. hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-piperidide phenylalanin-N-alkyl-, N-aryl- bzw. N-alkoxycarbonyl-
-piperazide
phenylalanyl-prolin und -hydroxyprolin sowie -alkyl-,
-aralkyl- und -arylester
phenylalanyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäure und deren
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-alkyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäuren und deren -alkyl-, -aralkyl-, bzw. -arylester phenylalanyl-1 ,2,3, 4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure und
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -alkyl-,
-aralkyl- bzw. -arylester
N-α-(Tosyl)- bzw. (1- oder 2-Naphthylsulfonyl)-glutamyl- bzw. γ-alkoxy-glutamyl- phenylalanin-alkyl-, aralkyl- und arylester
phenylalanin-alkyl-, hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-pyrroli- dide
phenylalanin-alkyl-. hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-piperidide phenylalanin-N-alkyl-, N-aryl- bzw. N-alkoxycarbonyl- -piperazide
phenylalanyl-prolin und -hydroxyprolin sowie -alkyl-,
-aralkyl- und -arylester
phenylalanyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäure und deren
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-alkyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäuren und deren -alkyl-, -aralkyl-, bzw. -arylester phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure und
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -alkyl-,
-aralkyl- bzw. -arylester
N-α-(Tosyl)- bzw. (1- oder 2-Naphthylsulfonyl)-glutaminyl- phenylalanin-alkyl-, aralkyl- und arylester
phenylalanin-alkyl-, hydroxyalkyl- bzw. hydroxy-pyrrolidide
phenylalanin-alkyl-. hydroxyalkyl- bzw.. hydroxy-piperidide phenylalanin-N-alkyl-, N-aryl- bzw. N-alkoxycarbonyl-
-piperazide
phenylalanyl-prolin und -hydroxyprolin sowie -alkyl-,
-aralkyl- und -arylester
phenylalanyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäure und deren
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-alkyl-piperidin-2-, 3- oder 4-carbonsäuren und deren -alkyl-, -aralkyl-, bzw. -arylester phenylalanyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure und -alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydroisochinolin-3-carbonsäure und
-alkyl-, -aralkyl- bzw. -arylester phenylalanyl-decahydrochinolin-4-carbonsäure und -alkyl-,
-aralkyl- bzw. -arylester
Die aufgeführten Verbindungen können als Racemate sowie nach entsprechender Trennung als reine Enantiomere bzw. Diastereomere vorliegen.
Im folgenden sind die biologischen Eigenschaften von repräsentativen erfindungsgemässen Verbindungen aufgeführt:
In Tabelle 1 ist die Hemmung der Gerinnungsenzyme Thrombin und Trypsin anhand der Dissoziationskonstante K. (ausgedrückt in μmol/1) durch die genannten Verbindungen angegeben. Alle untersuchten Verbindungen hemmen die durch beide Enzyme bewirkte Substratspaltung kompetitiv. Unter den in Tabelle 1 aufgeführten Derivaten des 4-Amidinophenylalanins finden sich eine Reihe von Verbindungen mit hoher Antithrombinaktivität, ' d. h. mit Ki-Werten unter 1 μmol/1. Die Thrombinhemmung ist vergleichsweise stärker als die Hemmung von Trypsin. Die Ki-Werte für die Hemmung von Trypsin liegen gewöhnlich 1 bis 2 Grössenordnungen höher als die für die Thrombinhemmung.
Die Verbindungen, die sich vom 4-Oxamidinophenylalanin und 4-Aminomethylphenylalanin ableiten, bewirken geringere Antithrombin-Aktivitat, einige von ihnen haben aber brauchbare Ki-Werte für die Thrombin-Hemmung im micromolaren Bereich.
Kurzbezeichnungen in Tabellen 1 und 2: für R1, Am = Amidino, Ox = Oxamidino, AMe = Aminomethyl für R2, Ppd = Piperidid, Ppd(4-Me) = 4-Methylpiperidid, OH
= Carbonsäure, OMe = Methylester, OEt = Ethylester, OnBu = n-Butylester, OtBu = t-Butylester, Pro = Prolin, Pip-OH = Pipecolinsäure, iNip-OH = Isonipecotinsäure, Nip-OH = Nipecotinsäure, Sar-OH = Sarcosin, Tic-OH = 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure, Phg-OH = Phenylglycin, Pip(4-Me)-0H = 4-Methyl-D,L-pipecolinsäure, 2-Ppn-3-COOH = piperid-2-on-3-carbonsäure für R4, Na = 2-Naphthyl
Tabelle 1
Hemmung ven Thrombin und Trypsin durch Nα-geschützte 4-substituierte Phenylalaninderivate
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Verbindung R1 R2 n R3 R4 Thrombin Trypsin - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
NAPAP Am Ppd 1 H Na 0,006 0,69
36 Am Ppd 1 CH2CO-OH Na 0,45 7,5
41 Am OH 1 CH2CO-OH Na 640 300
45 Am OMe 1 CH2CO-OH Na 60 107
37 Am Ppd 1 CH2CO-OMe Na 0,24 5,9
46 Am OMe 1 CH2CO-OMe Na 7,1 27
35 Am Ppd 1 CH CO-OtBu Na 0,47 12
40 Am OH 1 CH2CO-OtBu Na 17 66
44 Am OMe CH2CO-OtBu Na 3,8 46
70 Am D-Pro-OtBu CH-CO-NH. Na 0,51 85
69 Am Ppd (CH2)2CO-OtBu Na 0,53 3,4
53 Am D-Pro-OtBu CH2CH(CH3)2 Na 0,56 55
57 Am Ppd(4-Me) 1 H Na 0,0016 0,06
26 Am iNip-OH 1 H Na 2,0 2,6
27 Am iNip-OMe 1 H Na 0,29 0,71
15 Am Sar-OH 1 H Na 5,9 6,5
16 Am Sar-OMe 1 H Na 0,19 0,9
21 Am D,L-Pip-0H 1 H Na 1,4 4,3
80 Ox Ppd(4-Me) 1 H Na 48 230
8 Am D,L-Pip-OH 0 - Na 5,8 34
83 Am Ppd(4-Me) 0 - Na 0,34 10,4
84 Am iNip-OH 0 - Na 170 160
85 Am iNip-OMe 0 - Na 3,2 3,1
89 Am Nip-OH 0 - Na 34 120
90 Am Nip-OMe 0 - Na 0,68 16
Tab. 1 (Fort . )
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Ki [μmol/1]
Ver- - - - - - - - - - - - - - - - - bindung R1 R2 n R3 R4 Thrombin Trypsin
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
113 AMe Ppd(4-Me) 0 Na 2,5 11
106 AMe iNip-OH 0 Na 140 62
107 AMe iNip-OMe 0 Na 33 2,2
100 AMe Nip-OH 0 Na 50 41
101 AMe Nip-OMe 0 Na 3,9 30
65 AMe D,L-Pip-OH 0 Na 47 160
66 AMe D,L-Pip-OMe 0 Na 1,3 82
09 AMe D,L-Tic-OMe 0 Na 42 140
10 AMe D,L-Tic-OH 0 Na 90 41
98 0x Ppd(4-Me) 0 Na 2,5 180
96 0x iNip-OH 0 Na 410 350
97 0x iNip-OMe 0 Na 4,8 530
92 0x Nip-OH 0 Na 190 430
93 0x Nip-OMe 0 Na 28 400
94 0x D,L-Pip-OH 0 Na 19 340
95 0x D,L-Pip-OMe 0 Na 2,2 330
62 0x D,L-Tic-OH 0 Na 3,2 200
63 0x D,L-Tic-OMe 0 Na 22 97
In Tabelle 2 sind für einige repräsentative, erfindungsgemässe Verbindungen auch ihre Hemmwirkung gegenüber
Faktor Xa und Faktor XIIa, Protein Ca, Plasmin, Plasma-kallikrein, tPA und glandularem Kallikrein dargestellt.
Gewöhnlich werden die anderen Enzyme wesentlich schwächer gehemmt, so Protein Ca, Plasmin, Plasmakallikrein und
Faktor Xa (Ki 2 Grössenordnungen grösser). Praktisch unwirksam sind die Derivate gegenüber Faktor XIIa, tPA und glandularem Kallikrein. Für die Mehrzahl der Verbindungen kann man daher von selektiven Thrombinhemmstoffen sprechen.
Tabelle 2
Hemmung von Thrombin, Trypsin, Plasmin, Faktor Xa, Faktor XlIa, Protein Ca, tPA, Plasma und glanduläres Kallikrein- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Ki [μmol/l]
VerFaktor Faktor Protein gland, Plasma bindung R1 R2 n R3 R4 Thrombin Trypsin Plasmin Xa XIIa Ca tPA Kallikrein- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
NAPAP Am Ppd Na 0,006 0,69 30 7,9 500 4,8 70 93 5,6
36 Am Ppd 1 CH2CO-OH Na 0,45 7,5 260 4,8 25 270 6,6 >1000 47
37 Am Ppd 1 CH2CO-OMe Na 0,24 5,9 170 2.2 34 39 13 1000 33
35 Am Ppd 1 CH2CO-OtBu Na 0,47 12 190 105 >1000 210 670 200 90
44 Am OMe 1 CH2CO-OtBu Na 3,8 46 110 85 330 310 180 69 5,0
57 Am Ppd(4-Me) H Na 0,0016 0,06 25 22 >1000 5,1 530 170 14
26 Am iNip-OH H Na 2.0 2,6 240 61 >1000 87 630 >1000 51
27 Am iNip-OMe H Na 0,29 0,71 16 67 >1000 7,0 500 130 20
15 Am Sar-OH H Na 5,9 6,5 87 31 700 620 29 730 12
16 Am Sar-OMe H Na 0,19 0.9 15 13 40 6,8 26 200 37
83 Am Ppd(4-Me) 0 - Na 0,34 10,4 70 31 .1000 310 >1000 130 190
90 Am N1p-0Me 0 - Na 0,68 16 180 26 >1000 890 >1000 19 160
Tab. 2 (Fort. )
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Ki [μmol/l ]
VerFaktor Faktor Protein gland. Plasma bindung R R Thrombin Trypsin Plasmin Xa Xlla Ca tPA Kallikrein- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
113 AMe Ppd(4-Me) 0 Na 2.5 11 75 47 >1000 930 >1000 500 400
101 AMe Nip-OMe 0 Na 3,9 30 13 80 >1000 >1000 >1000 400 >1000
66 AMe D,L-Pip-OMe 0 Na 1.3 82 234 17 >1000 290 >1000 240 >1000
98 0x Ppd(4-Me) 0 Na 2.5 180 >1000 140 >1000 >1000 >1000 320 150
97 0x iNip-OMe 0 Na 4,8 530 >1000 270 >1000 >1000 >1000 530 >1000
95 0x D,L-Pip-OMe 0 Na 2.2 330 540 39 >1000 >1000 >1000 890 >1000
62 0x D,L-Tic-OH 0 Na 3.2 200 >1000 120 >1000 >1000 >1000 470 >1000- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Im Vergleich zu früher geprüften Derivaten von Benza- midin-enthaltenden Aminosäuren (LD 10 - 50 mg/kg nach i.v.-Applikation) ist die Toxizität bei den erfindungsmässigen Verbindungen deutlich geringer. So wurde beispielsweise für Verbindung 26 ein LD50-Wert von 210 mg/kg nach intravenöser Applikation gefunden.
In Tabelle 3 sind die Ergebnisse der Untersuchungen zur Pharmakokinetik von zwei erfindungsgemässen Verbindungen und als Vergleich dazu die Werte mit NAPAP zusammengestellt. Die Verbindungen wurden subcutan bzw. peroral an Ratten verabreicht. Nach der Verabreichung wurde den Versuchstieren in Zeitabständen von 2 bis maximal 360 Minuten Blutproben entnommen, in welchen der Blutspiegel der zu prüfenden Verbindungen mittels HPLC bestimmt wurde.
Tabelle 3
Konzentration (ng/ml) der ausgewählten Verbindungen im Plasma von Ratten nach subkutaner (5 mg/kg) bzw. peroraler (100 mg/kg) Verabreichung (siehe auch Abbildung 2)
In vitro sind eine Reihe von repräsentativen erfindungsgemässen Verbindungen gerinnungshemmend wirksam. In allen Fällen wurde die Thrombinzeit (TT) am effektivsten verlängert. Dies entspricht der Selektivität dieser Inhibitoren, die unter den Gerinnungsfaktoren Thrombin am stärksten hemmen. Eine Verlängerung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT), bei der neben Thrombin auch die an der Frühphase der Gerinnung beteiligten Enzyme zum Tragen kommen, wird durch höhere Konzentrationen der Inhibitoren erreicht. Das gilt auch für die Beeinflussung der Prothrombinzeit (PT), die den extrinsischen Gerinnungsweg repräsentiert. Beispielhaft ist das für Verbindung 57 in Abb. 1 gezeigt.
Zweckmässig werden die nach einer der erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Phenylalanin-Derivate als solche oder als Salze mit einer physiologisch verträglichen anorganischen oder organischen Säure unter Verwendung geeigneter pharmazeutischer Hilfstoffe in geeignete Applikationsformen überführt. Entsprechend dem pharmakokinetischen Verhalten sind das insbesondere transdermale Therapie-Systeme wie Pflaster, aber auch Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien, Lösungen usf.
Die Dosierung hängt ab von der Antithrombinaktivität, der Toxizität, den möglichen Blutspiegelwerten, der Bioverfügbarkeit und der Applikationsart der verwendeten erfindungsgemässen Verbindung sowie ganz allgemein von den Blutwerten, dem Gewicht und dem Allgemeinzustand des Patienten, so dass die Dosierung letztlich vom praktizierenden Arzt bestimmt werden muss. Im Prinzip entspricht die Dosierung derjenigen bekannter thrombinhemmender
Verbindungen und liegt zwischen ungefähr 0,2 mg/kg und ungefähr 20 mg/kg Körpergewicht, wobei gegebenenfalls auch höhere Dosen verabreicht werden können. Bei einem erwachsenen Patienten ergeben sich somit tägliche Dosierungen einer erfindungsgemässen Verbindung von ungefähr 50 mg bis ungefähr 1600 mg oder mehr.
Anhand von Verbindung 26 soll beispielhaft die Überführung in 4 pharmazeutische Darreichungsformen gezeigt werden.
Beispiel 1
Tabletten mit 100 mg der Verbindung 26 als Wirkstoff
Zusammensetzung:
1 Tablette enthält 100 mg Wirkstoff, 60 mg Milchzucker, 30 mg Weizenstärke und 1 mg Magnesiumstearat.
Herstellungsverfahren
Der mit Milchzucker und Weizenstärke vermischte Wirkstoff wird mit einer 20%igen ethanolischen Lösung von Polyvi- nylpyrrolidon gleichmässig durchfeuchtet, durch ein Sieb der Maschenweite 1,5 mm gedrückt und bei 40°C getrocknet.
Das so erhaltene Granulat wird mit Magnesiumstearat vermischt und zu Tabletten verpresst.
Beispiel 2
Dragees mit 50 mg der Verbindung 26 als Wirkstoff
Zusammensetzung:
1 Dragee enthält 50 mg Wirkstoff, 30 mg Milchzucker und 15 mg Weizenstärke.
Herstellungsverfahren
Der mit Milchzucker und Weizenstärke vermischte Wirkstoff wird in der unter Beispiel 1 beschriebenen Weise granuliert und zu ovalen Tablettenkernen verpresst, die anschliessend dragiert werden. Für den Dragiervorgang wird eine Zuckermischung, bestehend aus 48 g Puderzucker, 18 g Gummi arabicum, 48 g Weizenstärke und 4 g Magnesiumstearat sowie als Bindemittel eine Mischung aus gleichen Teilen Mucilago Gummi arabici und Wasser verwendet.
Beispiel 3
Suppositorien (Zäpfchen) mit 100 mg der Verbindung 26 als Wirkstoff
Zusammensetzung:
1 Zäpfchen enthält 100 mg Wirkstoff und 0,9 g Zetylphthalat als Grundlage.
Herstellungsverfahren
1,0 g des feinst gepulverten Wirkstoffs werden mit der doppelten Menge der verflüssigten Grundlage verrieben. Die Verreibung wird mit dem Rest der verflüssigten Grundlage anteilweise gemischt und bis zur gleichmässigen Beschaffenheit bearbeitet. Nahe der Grenze der Giessbarkeit wird die Mischung in eine geeignete Form gegossen und bis zum Erkalten stehengelassen.
Beispiel 4
Injektions- bzw. Infusionslösung mit 10 mg/ml der Verbindung 26 als Wirkstoff
Herstellungsverfahren
1,0 g Wirkstoff werden in 100 ml Aqua ad injectionem gelöst, die Lösung filtriert und gegebenenfalls in Ampullen zu je 2 ml abgefüllt. Die mit der Wirkstofflösung gefüllten und verschlossenen Gefässe (Infusionsflaschen, Ampullen) werden der Dampfsterilisation bei 121 bis 124°C unterzogen.
Claims
PATENTANSPRÜCHE
1. D,L-, L- und D-Phenylalanin-Derivate der Formel
in welcher
R1 eine basische Gruppe der Formel
Amidino Guanidino
(c)
Oxamidino
(d) - CH2 - NH2 oder (e) - NH2
Aminomethyl Amino darstellt, wobei R5 und R6 in den Formeln (a) und (b) je Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest bezeichnen,
R2 (f) OH, O-Alkyl, O-Cycloalkyl, O-Aralkyl ist,
(g) eine Gruppe der Formel
darstellt, in welcher R7 Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest und R8 einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkylrest, einen 1- oder 2-Hydroxyethylrest, einen Methylmercaptoethylrest, einen Aminobutylrest, einen Guanidinopropylrest, einen Carboxy(niedrigen)alkylrest, einen Carboxamido(niedrigen) alkylrest, einen Phenyl (niedrigen)alkylrest, dessen Ring gegebenenfalls mit OH, Halogen, niedrig-Alkyl oder Methoxy substituiert ist, einen Cyclohexyl- oder Cyclohexylmethylrest, dessen Ring gegebenenfalls mit OH, Halogen, niedrig-Alkyl oder Methoxy substituiert ist, oder einen N-Heteroaryl(niedrigen)alkylrest mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen im Heteroaryl, z.B. Imidazolylmethyl oder Indolylmethyl, bezeichnen, wobei die Gruppe (g) racemisch oder D- bzw. L-konfiguriert ist,
(h) eine Gruppe der Formel
darstellt, in welcher m die Zahl 1 oder 2 bezeichnet, und in welcher eine der Methylengruppen gegebenenfalls mit einem Hydroxyl-, Carboxyl-, niederen Alkyl- oder Aralkyl-rest substituiert ist, wobei die Gruppe (h) racemisch oder D- bzw. L-konfiguriert ist,
(i) eine Gruppe der Formel
darstellt, in welcher p = r = 1, p = 1 und r = 2 oder p = 2 und r = 1 sind und in welcher eine der Methylengruppen gegebenenfalls mit einem Hydroxyl-, Carboxyl-, niederen Alkyl- oder Aralkyl-rest substituiert ist,
(k) eine Piperidylgruppe darstellt, die gegebenenfalls in einer der Stellungen 2, 3 und 4 mit einem niederen Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Hydroxyl-rest substituiert ist, wobei an die heterocycloaliphatischen Ringe der Formeln (h), (i), (k) gegebenenfalls ein weiterer aromatischer oder cycloaliphatischer Ring,, vorzugsweise Phenyl oder Cyclohexyl, in 2,3 oder 3,4 Stellung, bezogen auf das Heteroatoin, ankondensiert ist,
(1) eine Piperazylgruppe darstellt, die gegebenenfalls in p-Stellung mit einem niederen Alkylrest, einem Arylrest oder einem Alkoxycarbonylrest substituiert ist,
(m) eine Gruppe der Formel
darstellt, in welcher n' die Zahlen 1 bis 6 und R10 Wasserstoff oder den Methyl- oder Cyclohexylrest bezeichnen und R1 = (b) bis (e) ist,
(n) eine Gruppe der Formel
darstellt, wobei R9 in den Formeln (g), (h), (i), (l), (m) und (n) eine Hydroxyl-, geradkettige oder verzweigte niedrige Alkoxy-, Cycloalkoxy- oder Aralkoxy-Gruppe bezeichnet.
oder
(o) eine Kombination von 2 bis 20, vorzugsweise 2 bis 5, insbesondere 2 oder 3, der von den unter (g), (h), (i), (k), (l), (m) und (n) definierten Gruppen abgeleiteten, durch Amidbindungen verknüpften Resten (R9 = Einfachbindung) darstellt, wobei der C-terminale Rest gegebenenfalls mit einem Rest R9 verknüpft ist,
R3 Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten niedrigen Alkyl-, Aralkyl-, Carboxyalkyl-, Alkoxycarbonylalkyl-, Carboxamido-alkyl-, Keteroarylalkyl- oder einen 1-oder 2-KydroxyethyI-Rest darstellt, wobei n die Zahl 0 oder 1 bezeichnet und die gegebenenfalls eingeschobene Aminosäure racemisch oder D- bzw. L-konfiguriert ist,
und
R4 einen Arylrest, z.B. Phenyl, Methylphenyl, α- oder ß-Naphthyl oder 5-(Dimethylamino)-naphthyl, oder einen Heteroarylrest, z.B. Chinolyl, darstellt,
wobei niedrig 1-4 Kohlenstoffatome bedeutet, und deren Salze mit Mineralsäuren oder organischen Säuren.
Phenylalanin-Derivate nach Patentanspruch 1, in welchen
R2 O-Alkyl, O-Cycloalkyl oder Aralkyl, falls n=0 ist, oder einen heterocycloaliphatischen Rest der Formeln (h), (i), (k) und (l), darstellt,
R4 ß-Naphthyl bezeichnet, und n die Zahl 1 bedeutet, falls R2 verschieden von O-Alkyl, O-Cycloalkyl oder Aralkyl ist.
3. Verwendung der Phenylalanin-Derivate nach Patentanspruch 1 oder 2 zur Herstellung von oral, anal, subkutan, oder intravenös verabreichbaren antithrombotisch wirksamen Arzneimitteln.
4. Oral, anal, subkutan oder intravenös verabreichbares antithrombotisches Arzneimittel, gekennzeichnet durch eine wirksame Menge mindestens eines Phenylalanin-Derivates nach Patentanspruch 1 oder 2 und geeignete pharmazeutische Hilfsstoffe.
5. Antithrombotisch wirksames Arzneimittel nach Patentanspruch 4, in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Pellets, Suppositorien, Lösungen oder transdermalen Systemen, wie Pflaster.
6. Verfahren zur Blutgerinnungs- resp. Thrombinhemmung bei Lebewesen, insbesondere bei Menschen, durch Verabreichung einer wirksamen Menge mindestens einer Verbindung nach einem der Patentansprüche 1 oder 2 resp. eines Arzneimittels nach einem der Patentansprüche 4 oder 5.
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