DE69614392T2

DE69614392T2 - Thrombin inhibitor

Info

Publication number: DE69614392T2
Application number: DE69614392T
Authority: DE
Inventors: F. Bone; R. Illig; Tianbao Lu; M. Soll; L. Subasinghe
Original assignee: 3 Dimensional Pharmaceuticals Inc
Current assignee: 3 Dimensional Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2002-05-08
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: CA2223500A1; DE69614392D1; GR3036750T3; JPH11507366A; WO1996040118A1; EP0841918A1; EP0841918B1; AU6108196A; US5612369A; EP0841918A4; ES2161365T3; ATE203905T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, bei denen es sich um Inhibitoren der Thrombinwirkung handelt, deren pharmazeutisch verträgliche Salze und Arzneimittel davon. Die Verbindungen sind für die Behandlung von arteriellen und venösen thrombotischen Verschlussstörungen, Entzündungen, Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen geeignet.

Verwandtes Fachgebiet

Das Serinproteasethrombin spielt eine zentrale Rolle bei Hämostase und Thrombose (Tapparelli et al., Trends in Pharmacological Sciences 14: 366-376 (1993); Lefkovits und Topol; Circulation 90(3): 1522-1536 (1994); Harker, Blood Coagulation and Fibrinolysis 5 (Suppl. 1): S47-S58 (1994)). Die Aktivierung der Coagulationskaskade entweder durch den intrinsischen Weg (Kontaktaktivierung) oder extrinsischen Weg (Aktivierung dadurch, dass das Plasma einer nicht-endothelialen Oberfläche ausgesetzt ist, Aktivierung durch Zerstörung der Gefäßwände oder Ausschüttung von Gewebefaktor) führt zu einer Reihe von biochemischen Ereignissen, die zu Thrombin führen. Thrombin spaltet Fibrinogen, was letztlich zur einem hämostatischen Pfropfen (Gerinnselbildung) führt, aktiviert wirksam die Blutplättchen durch eine einzelne proteolytische Spaltung des Thrombinrezeptors an der Zelloberfläche (Coughlin, Seminars in Hematology 31 (4): 270-277(1994)) und verstärkt über einen Feedbackmechanismus seine eigene Herstellung.
Als ein multifunktionales Protein, führt Thrombin eine Anzahl von Wirkungen auf Blutplättchen, Endothelzellen, Zellen der glatten Muskulatur, Leukocyten, das Herz und Neuronen herbei (Tapparelli et al., Trends in Pharmacological Sciences 14: 366-376 (1993); Church and Hoffman, Trends in Cardiovascular Medicin 4(39): 140-146 (1993)). Die Aktivierung der Blutplättchen führt sowohl zu Formveränderung und Aggregation als auch zu der Synthese, Ausschüttung und Ausscheidung von vasoaktiven Substanzen und lysosomalen Enzymen. Die Aktivierung der Endothelzellen hat die Ausscheidung von Stimulationsmitteln zur Folge, die zu einer gesteigerten vaskularen Permeabilität und Anhaftungsfähigkeit für mononukleare Zellen führt, eine Folge davon ist an der Stelle der Thrombinerzeugung ein Austritt von Leukocyten in das Gewebe. Thrombin ruft die Proliferation von Fibroblasten und glatten Muskelzellen hervor, was nahelegt, dass Tbrombin eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von Läsionen spielt, die auf vaskuläre Schädigungen folgen. Bei Herzmuskelzellen, die eine Empfindlichkeit gegen Thrombin zeigen, wurde eine verstärkte Automatizität und Verlängerung der Repolarisation beobachtet. Ebenso wurde gezeigt, das durch Thrombin die normale neuronale Entwicklung beeinflusst wird. Somit haben Inhibitoren der Thrombinfunktion ein therapeutisches Potential bei Patienten mit cardiovaskulären und nicht-cardiovaskulären Erkrankungen, einschließlich: Myokardinfarkt; instabiler Angina pectoris; Schlafanfall; Restenose; Tiefvenenthrombose; durch Trauma, Sepsis oder Metastasen verursachter, versprengter intravaskulärer Coagulation; Hämodialyse; pneumokardialer Bypassoperation; Schocklunge; endotoxischem Schock; rheumatoider Arthritis; ulceraiver Colitis; Induration; Metastasen; Hypercoaguabilität während der Chemotherapie; Alzheimer-Erkrankung und Down- Syndrom.
Bis heute sind nur drei Klassen von Verbindungen (Heparine, Heparine mit niedrigem Molekulargewicht und Kumarine, wie Warfarin) bei der Anticoagulanttherapie verwendet worden. Jede Klasse hat starke Beschränkungen und Nachteile (Weitz und Hirsh, Journal of Laboratory Medicine 122: 364-373 (1993); Raj et al., The American Journal of Medical Sciences 307(2): 128 (1994)). Alle drei Klassen inhibieren Thrombin indirekt. Heparin und Heparine mit niedrigem Molekulargewicht steigern die Antithrombin III- und/oder Heparin-Cofaktor II- Hemmung von Thrombin, wohingegen die Kumarine die Vitamin K abhängige post-translationale Modifizierung hemmen. Aufgrund der Variabilität des Patienten ist bei der Anwendung dieser Mittel eine genaue Überwachung und Titration der therapeutischen Dosen erforderlich. Hämorraghische Komplikationen aufgrund von Blutungen sind Nebenwirkungen, die angetroffen werden. Tatsächlich verbleibt Bluten als häufigste Nebenwirkung einer oralen Langzeitanticoagulanttherapie. Das Fehlen einer Wirkung bei arterieller Thrombose im Falle von Heparin ist auf dessen Unfähigkeit zurückzuführen, das an Gerinnsel gebundene Thrombin zu hemmen. Das Fehlen einer oralen Wirkung im Falle von Heparinen und Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht schließen deren Verwendung für eine chronische Verabreichung aus.
Kürzlich wurden direkte Thrombininhibitoren verschiedener Strukturklassen identifiziert (Tapparelli et al., Trends in Pharmacological Sciences 14: 366-376 (19%); Cleason, Blood Coagulation and Fibrinolysis 5: 411436 (1994); Lefkovits und Topol; Circulation 90(3): 1522- 1536 (1994)). Zu beispielhaften Verbindungen, die durch Hemmung der wirksamen Stelle (active site) des Thrombins wirken, gehören das α-Chlorketon D-Phenylalanyl-L-prolyl-L- arginyl-chlormethylketon (PPACK), das Boroarginin DUP714, das Peptid Arginal- GYK114766, die cyclischen Peptide Cyclotheonamide A und B, die Benzamidine NAPAP und das Arylsulfonylarginin Argatroban. Die Thrombin hemmenden Peptide Hirudin und Hiruloge erstrecken sich zusätzlich auf die wirksamen und außenliegenden Thrombindomänen. Die Peptide Hirugen und Einfachstrang-DNA-aptamere hemmen Thrombin über eine außenliegende Inanspruchname.
Experimentelle Untersuchungen mit direkten Thrombininhibitoren haben effektive antithrombotische Wirkungen in verschiedenen Tiermodellen gezeigt (Lefkovits und Topol; Circulation 90(3): 1522-1536 (1994)). Direkte Thrombininhibitoren können eine wichtige beigeordnete Rolle bei der Thrombolyse einnehmen und können eine vorteilhafte Rolle im Bereich der Koronareingriffe anbieten. Klinische Untersuchungen mit direkten Thrombininhibitoren zur Behandlung von akutem Myokardinfarkt, zur Behandlung instabiler Angina pectoris und für Patienten, die sich einer diagnostischen Koronarangiographie unterziehen, haben ermutigende Ergebnisse geliefert. Dennoch leiden diese Klassen von antithrombotischen Mitteln noch an einem oder mehreren der folgenden Nachteile: (1) schlechte orale Bioverfügbarkeit aufgrund der peptidischen oder oligonukleotidischen Natur dieser Mittel oder aufgrund des hohen Molekulargewichts oder der geladenen Natur der Mittel; (2) Potential für Blutungskomplikationen; (3) schlechte Selektivität bezüglich Thrombin gegenüber anderen Serinproteasen (was zu ernster und manchmal tödlicher Hypotonie und Atemdepression in Tiermodellen führen kann); (4) Lebertoxizität oder (5) Kosten-Nutzen-Gründe.
Es besteht weiterhin der Bedarf an nicht-peptidischen Verbindungen, die hochwirksame und selektive Inhibitoren für Thrombin sind und die eine größere Bioverfügbarkeit und weniger Nebenwirkungen als die zur Zeit erhältlichen direkten Thrombininhibitoren aufweisen.
Das US-Patent Nr. 5,248,673, erteilt am 28. September 1993, offenbart Bisamidinderivate als Thrombininhibitoren. Das Patent offenbart, dass diese Verbindungen bei der Behandlung von Thrombose, Ischämie und Schlaganfall verwendet werden können.
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 93/15756, veröffentlicht am 19. August 1993, offenbart Peptidaldehydanaloga, die eine Thrombin inhibierende Wirkung aufweisen.
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 94/20526, veröffentlicht am 115. September 1994, offenbart Peptidderivate mit einer C-terminalen Borsäuregruppe. Die veröffentlichte Anmeldung offenbart, dass diese eine Proteaseinhibitorwirkung aufweisen.
Nelson et al., NIDA Res. Monogr. 69: 204-230 (1986) offenbart Analoga von Morphiceptin, einem opioidem Peptid, und deren Untersuchung als u-Rezeptoragonisten und - antagonisten. Das Peptidanalogon L-Tyrosyl-N-12-(4-nitrophenyl)ethyl]-L-prolinamid wird offenbart.
Bajusz, Symp. Biol. Hung. 25: 277-298 (1984) gibt eine Übersicht der strukturellen und inhibierenden Eigenschaften von Peptidinhibitoren Trypsin ähnlicher Enzyme, wie Thrombin, Plasmin, Kallikrein und Trypsin. Die Verbindung D-Phenylalanyl-N-[2-[4-[(aminoiminomethyl)amino]phenyl]ethyl]-L-prolinamid wird offenbart.
Das US-Patent Nr. 4,713,369 beschreibt Thrombininhibitoren auf der Basis von Phenylalanin-prolin-dipeptiden, die an einen eine Guanidinogruppe enthaltenden Aminoalkohol gebunden sind. Diese Verbindungen stehen in keiner strukurellen Beziehung zu denen der vorliegenden Erfindung.
Das US-Patent Nr. 4,767,744 lehrt verschiedene Verbindungen, die zwar strukturell näher zu den erfindungsgemäßen Verbindung gegenüber denjenigen des US-Patents Nr. 4,713,369 sind, und von denen beschrieben wird, dass sie eine analgetische Wirkung haben. Eine analgetische Wirkung steht nicht in Beziehung zu der Thrombin inhibierenden Wirkung.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen der Formel I (nachstehend). Ebenso wird ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I bereitgestellt. Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen weisen über direkte Hemmung des Thrombins eine antithrombotische Wirkung auf oder sind Zwischenverbindungen, die geeignet sind, um Verbindungen mit antithrombotischer Wirkung zu erzeugen. Ebenso wird ein Verfahren zur Behandlung von Thrombose, Ischämie, Schlaganfall, Restenose oder Entzündungen bei einem Säuger, der eine solche Behandlung benötigt, bereitgestellt, umfassend die Verabreichung einer wirksame Menge einer Verbindung der Formel I an diesen Säuger. Ferner wird ein Arzneimittel bereitgestellt, umfassend eine Verbindung der Formel I und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel I:
und pharmazeutisch verträgliche Salze davon;
wobei
R¹ ein Wasserstoffatom, einen Rest -SO&sub2;R&sup8;, -CONHR&sup8; oder -CO&sub2;R&sup8; darstellt, in denen R&sup8; ein Wasserstoffatom, einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Arylalkylrest bedeutet;
R² eine Hydroxygruppe oder einen Rest -NR&sup6;R&sup7; darstellt;
R³ und R&sup4; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, einen Rest -NR&sup6;R&sup7;, einen Alkyl-, Aryl-, Arylalkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Halogenalkyl-, Aminoalkyl- oder Hydroxyalkylrest darstellen;
R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Alkyl-, Aryl- oder Arylalkylrest darstellen;
n einen Wert von 2 bis 4 hat; und
m einen Wert von 1 bis 6 hat.
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind diejenigen der Formel I, in denen
R¹ ein Wasserstoffatom oder einen Rest -CO&sub2;R&sup8; darstellt, wobei R&sup8; wie vorstehend definiert ist und vorzugsweise eine Benzylgruppe bedeutet; R² eine Hydroxygruppe oder einen Rest -NR&sup6;R&sup7; darstellt, wobei R&sup6; und R&sup7; wie vorstehend definiert sind, und vorzugsweise unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest darstellen; R³ und R&sup4; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl- oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxyrest darstellen; R&sup5; ein Wasserstoffatom darstellt; n vorzugsweise einen Wert von 2, 3 oder 4 hat und stärker bevorzugt 3 ist; und m einen Wert von 1 bis 6, vorzugsweise von 1 bis 4 hat und am meisten bevorzugt 1 oder 2 ist.
Stärker bevorzugt sind die Verbindungen der Formel I, in denen R¹ ein Wasserstoffatom oder einen Rest -CO&sub2;-benzyl darstellt, R² eine Hydroxygruppe oder einen Rest -NH&sub2; oder -N(CH&sub3;)&sub2; darstellt; R³ und R&sup4; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy- oder Methoxygruppe darstellen; R&sup5; ein Wasserstoffatom darstellt; n einen Wert von 3 hat und m einen Wert von 1 oder 2 hat.
Zu den am meisten bevorzugten Verbindungen gehören
N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)]-L-prolinamid,
D-Phenylalanyl-N-[2-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)]-L-prolinamid,
N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-dimethylaminobenzyl)]-L-prolinamid,
D-Phenylalanyl-N-[2-(4- dimethylaminobenzyl)]-L-prolinamid,
N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(3,4-dihydroxyphenethyl)]-L-prolinamid,
N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-hydroxyphenethyl)]-L-prolinamid,
N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminobenzyl)]-L-prolinamid,
D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminobenzyl)]-L-prolinamid,
N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminophenethyl)]-L-prolinamid,
N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenethyl)]-L-prolinamid und
N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(3-methoxy4-hydroxyphenethyl)]-L-prolinamid.
Ebenso versteht es sich, dass die vorliegende Erfindung sowohl die Stereoisomere als auch die optischen Isomere, z. B. Enantiomerengemische, ebenso wie einzelne Enantiomere und Diastereomere, die als eine Folge von strukturellen Asymmetrien in ausgewählten Verbindungen der vorliegenden Serie auftreten, einschließt.
Für die medizinische Verwendung werden die pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze, diejenigen Salze, in denen die Anionen nicht signifikant zu der Toxizität oder pharmakologischen Wirkung des organischen Kations beitragen, bevorzugt. Die Säureadditionssalze werden entweder durch Umsetzung einer organischen Base der Formel I mit einer organischen oder anorganischen Säure, vorzugsweise durch Kontakt in Lösung, oder durch jedes der Standardverfahren, die in der jedem Fachmann zugänglichen Literatur ausführlich beschrieben sind, erhalten. Beispiele für geeignete organische Säuren sind Carbonsäuren, wie Maleinsäure, Essigsäure, Weinsäure, Propionsäure, Fumarsäure, Isethionsäure, Bernsteinsäure, Pamoasäure, Cyclamsäure, Pivalinsäure und dergleichen; geeignete anorganischen Säuren sind die Halogenwasserstoffsäuren, wie HCl, HBr, HI; Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
Die wie hier verwendetete Bezeichung "Alkyl" bezieht sich sowohl auf geradkettige als auch verzweigte Kettenreste mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1-8 Kohlenstoffatomen, wie die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, t-Butyl-, Isobutyl-, Pentyl-, Hexyl-, Isohexyl-, Heptyl-, 4,4-Dimethylpentyl-, Octyl-, 2,2,4-Trimethylpentyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecylgruppe und verschiedene verzweigte Isomere davon.
Die wie hier verwendetete Bezeichung "Aryl" an sich oder als Teil einer anderen Gruppe bezieht sich auf monocyclische oder bicyclische aromatische Reste mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen im Ringteil, vorzugsweise 6-10 Kohlenstoffatomen im Ringteil, wie eine Phenyl-, Naphtyl- oder Tetrahydronaphthylgruppe.
Die wie hier verwendetete Bezeichung "Aralkyl" oder "Arylalkyl" an sich oder als Teil einer anderen Gruppe bezieht sich auf einen wie vorstehend diskutierten C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest mit einem Arylsubstituenten, wie eine Benzyl-, Phenethyl- oder 2-Naphthylmethylgruppe.
Die Bezeichungen "Alkoxy" oder "Aralkoxy" schließen jeden der vorstehenden an ein Sauerstoffatom gebundenen Alkyl- oder Aralkylrest ein.
Die wie hier verwendetete Bezeichung "Halogen" oder "Halo" an sich oder als Teil einer anderen Gruppe bezieht sich auf Chlor, Brom, Fluor oder Iod, wobei Chlor bevorzugt ist.
Die wie hier verwendetete Bezeichnung "Alkenyl" an sich oder als Teil einer anderen Gruppe schließt eine Kohlenstoffkette an sich oder als Teil einer anderen Gruppe von bis zu 16 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, mit einer Doppelbindung ein, wie die Propenyl-, 2-Butenyl-, 3-Butenyl-, 2-Pentenyl-, 4-Pentenylgruppe und dergleichen, und kann einen Halogensubstituenten, wie I, Cl oder F enthalten.
Die wie hier verwendetete Bezeichnung "Alkinyl" an sich oder als Teil einer anderen Gruppe schließt eine Kohlenstoffkette von bis zu 16 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, mit einer Dreifachbindung ein, wie die Propinyl-, 2-Butinyl-, 3-Butinylgruppe und dergleichen.
Die wie hier verwendetete Bezeichung "Halogenalkyl" bezieht sich auf jeden der vorstehenden durch ein oder mehrere Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodatome substituierten Alkylrest, z. B. die Fluormethyl-, Difluormethyl-, Trifluormethyl- und Chlormethylgruppe.
Die wie hier verwendetete Bezeichung "Aminoalkyl" bezieht sich auf jeden der vorstehenden durch -NH&sub2; substituierten Alkylrest.
Die wie hier verwendetete Bezeichung "Hydroxyalkyl" bezieht sich auf jeden der vorstehenden durch eine oder mehrere Hydroxygruppen substituierten Alkylrest.
Die wie hier verwendetete Bezeichung "BOP" bezieht sich auf Benzotriazol-1-yloxytris- (dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat (Castro's Reagenz).
Die wie hier verwendetete Bezeichung "CBZ" bezieht sich auf die Aminoschutzgruppe Benzyloxycarbonyl.
Die Bezeichnung "Phe" bezieht sich auf die Aminosäure Phenylalanin.
Die Bezeichnung "Pro" bezieht sich auf die Aminosäure Prolin.
Bei den Aminosäure Phe und Pro handelt es sich um α-Aminosäuren, die aus den in Proteinen natürlich vorkommenden L-Aminosäuren oder den entsprechenden enantiomeren D- Aminosäuren ausgewählt sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen schließen vorzugsweise D-Phe und L-Pro ein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den in den Schemata 1 und 2 aufgezeigten allgemeinen Verfahren hergestellt werden. Schema 1
wobei R², R³, R&sup4;, n und m wie vorstehend definiert sind.
Die Dipeptidausgangsmaterialien (1), die verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Verbindungen zu synthetisieren, körnen unter Verwendung von bekannten Festphasen- oder Lösungsverfahren zur Kondensation eines aminogeschützten Phenylalanins mit Prolin erhalten werden. Andere cyclische Aminosäuren, wie Azetidincarbonsäure oder Pipecolinsäure können anstelle von Prolin eingesetzt werden, um erfindungsgemäße Verbindungen, in denen m den Wert 3 beziehungsweise 5 hat, zu erzeugen. Diese cyclischen Aminosäuren sind im Handel erhältlich. Geeignete Aminoschutzgruppen zur Erzeugung des Ausgangsmaterials (1) schließen die Benzyloxycarbonyl- (CBZ) oder t-Butoxycarbonylgruppe (BOC) ein.
Das Dipeptid (1) wird mit einem passenden substituierten Phenylalkylamin (2) unter Verwendung von bekannten Peptidkupplungsverfahren gekuppelt. Reagenzien für den Kupplungsschritt schließen am meisten bevorzugt Castro's Reagenz (BOP)/Diisopropylethylamin oder alternativ Hydroxybenzotriazol (HOBT), Hydroxysuccinimid, 1,3-Dicyclocarbodiimid (DCC), Carbonyldiimidazol (CDI), Isobutylchlorformiat/NEt&sub3; oder Diphenylphosphorylazid (DPPA)/NEt&sub3; ein. Das gekuppelte Produkt bildet nach der üblichen Aufarbeitung das Hauptprodukt.
Wie in Schema 2 aufgeführt kann die Aminoschutzgruppe in einer nachfolgenden Stufe entfernt werden. So werden Verbindungen, in den R¹ ein Wasserstoffatom darstellt, durch Hydrierung von 3 hergestellt. Die Hydrierung kann unter Standardbedingungen, zum Beispiel unter Verwendung eines Pd/C-Katalysators, durchgeführt werden. Schema 2
wobei R², R³, R&sup4;, n und m wie vorstehend definiert sind.
Verbindungen, in den R¹ einen Rest -SO&sub2;-R&sup8; darstellt, können erzeugt werden, indem ein nichtgeschütztes Dipeptid, wie D-Phe-Pro, unter Standardbedingungen mit einem passenden Sulfonylchlorid behandelt wird, wobei ein N-sulfonyliertes Derivat erhalten wird. Die N- sulfonylierten Derviate können dann anstelle von (1) in Schema 1 verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Kombination mit thrombolytischen Mitteln, wie Gewebeplasminogenaktivator, Streptokinase und Urokinase, verwendet werden. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit anderen antithrombotischen oder anticoagulanten Arzneimitteln, wie, jedoch nicht darauf beschränkt, Fibrinogenantagonisten und Thromboxanrezeptorantagonisten verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einer wirksamen Menge innerhalb eines Dosierungsbereichs von etwa 0,1 bis etwa 500 mg/kg, vorzugsweise 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht bei einem Dosierungsschema in Einfach- oder 2-4fach geteilten täglichen Dosen verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können jedem Lebewesen, das die nützlichen Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindung erfahren kann, verabreicht werden. An erster Stelle unter solchen Lebewesen sind Menschen, obwohl die Erfindung nicht so eingeschränkt werden soll.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auf jedem Weg verabreicht werden, der den beabsichtigten Zweck erfüllt. Zum Beispiel kann die Verabreichung auf parenteralern, subkutanen, intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen, transdermalen, bukkalen oder okularen Wegen erfolgen. Alternativ oder gleichzeitig kann die Verabreichung auf oralem Weg erfolgen. Die verareichte Dosierung hängt von dem Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, der Art der begleitenden Behandlung, falls überhaupt, der Häufigkeit der Behandlung und der Natur der gewünschten Wirkung ab.
Zusätzlich zu den pharmazeutisch wirksamen Verbindungen können die neuen Arzneimittel geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger, einschließlich Excipienten und Hilfmittel, enthalten, die die Verarbeitung des Wirkstoffs zu Arzneimitteln, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden auf eine Art und Weise hergestellt, die an sich bekannt ist, zum Beispiel mittels herkömmlicher Misch-, Granulier-, Drageeherstellungs-, Lösungs- und Lyophylisierungsverfahren. So können Arzneimittel für die orale Anwendung erhalten werden, indem die Wirkstoffe mit festen Excipienten kombiniert werden, gegebenfalls Vermahlen des erhaltenen Gemischs und Verarbeiten des Granulatgemischs, nachdem, falls gewünscht oder notwendig, geeignete Hilfsmittel zugegeben wurden, wobei Tabletten oder Drageekerne erhalten werden.
Geeignete Excipienten sind insbesondere Füllmittel, wie Saccharide, zum Beispiel Lactose oder Saccharose, Mannit oder Sorbit, Cellulosezubereitungen und/oder Calciumphosphate, zum Beispiel Tricalciumphosphat oder Calciumhydrogenphosphat, ebenso wie Bindemittel, wie Stärkepaste unter Verwendung von Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragacanth, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon. Falls gewünscht können Sprengmittel, wie die vorstehend erwähnten Stärken und ebenso Carboxymethylstärke, quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat, zugegeben werden. Hilfsmittel sind vorallem die Fließeigenschaften regulierende Mittel und Gleitmittel, zum Beispiel Siliciumdioxid, Talkum, Stearinsäure oder deren Salze, wie Magnesiumstearat oder Calciumstearat, und/oder Polyethylenglykol. Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen bereitgestellt, die, falls gewünscht, gegen Magensäfte resistent sind. Zu diesem Zweck können konzentrierte Saccharidlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten. Um Überzüge herzustellen, die gegen Magensäfte resistent sind, werden geeignete Cellulosezubereitungen, wie Acetylcellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, verwendet. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageeüberzügen gegeben werden, zum Beispiel zur Identifizierung oder um Kombinationen von Wirkstoffdosen zu charakterisieren.
Andere Arzneimittel, die oral angewendet werden können, schließen aus Gelatine hergestellte Push-fit-Kapseln ebenso wie weiche, versiegelte Kapseln, die aus Gelatine und Weichmachern, wie Glycerin oder Sorbit, hergestellt werden, ein. Die Push-fit-Kapseln können den Wirkstoff in Form von Granulat enthalten, das mit Füllstoffen, wie Lactose, Bindemitteln, wie Stärken, und/oder Gleitmitteln, wie Talkum oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren gemischt sein kann. In weichen Kapseln werden die Wirkstoffe vorzugsweise in geeigneten Flüssigkeiten, wie Fettölen oder flüssigem Paraffin, gelöst oder suspendiert. Zusätzlich können Stabilisatoren zugesetzt werden.
Geeignete Formulierungen für die parenterale Verabreichung schließen wässrige Lösungen der Wirkstoffe in wasserlöslicher Form, zum Beispiel wasserlösliche Salze oder alkalische Lösungen, ein. Besonders bevorzugte alkalische Salze sind die Ammoniumsalze, die zum Beispiel aus Tris, Cholinhydroxid, Bis-Trispropan, N-Methylglucamin oder Arginin hergestellt werden. Zusätzlich können Suspensionen der Wirkstoffe als ölige Injektionssuspensionen verabreicht werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Träger schließen Fettöle, zum Beispiel Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, zum Beispiel Ethyloleat, oder Triglyceride oder Polyethylenglykol-400 (die Verbindungen sind in PEG-400 löslich) ein. Wässrige Suspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Lösung erhöhen, zum Beispiel Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit und/oder Dextran. Gegebenfalls kann die Suspension auch Stabilisatoren enthalten.
Die folgenden Beispiele sind für die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung veranschaulichend, aber nicht einschränkend. Andere geeignete Modifikationen und Anpassungen der Vielzahl der Bedingungen und Parameter, die normalerweise angetroffen werden und für einen Fachmann offensichtlich sind, sind im Geist und Umfang der Erfindung eingeschlossen. Beispiel 1 N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)]-L-prolinamid (6)
Eine Lösung aus N-Carboxybenzoyl-D-phenylalanin-prolin (N-CBZ-D-Phe-Pro, 5) (0,20 g, 0,5 mmol), Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorphosphat (Castro's Reagenz) (0,23 g, 0,52 mmol) und Diisopropylethylamin (0,5 ml, 2,87 mmol) in DMF (1,5 ml) wurde mit 4-Hydroxy-3-methoxybenzylamin·HCl (0,098 g, 0,51 mmol) bei Raumtemperatur 1 Stunde behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (5 ml) abgeschreckt und mit Ethylacetat (15 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit gesättigter NaHCO-Lösung (2 · 5 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie über Silicagel (10 g) unter Verwendung von Ethylacetat als Elutionmittel gereinigt, wobei nach Eindampfen 0,216 g (82% Ausbeute) eines Feststoffs erhalten wurden.
¹H-NMR (CDCl&sub3;; 300 MHz) δ 2,19-2,26 (m, 2H), 2,56 (q, 2H), 3,62 (t, 2H), 3,87 (s, 3H), 4,17 (dd, 1H, J = 15,5 Hz), 4,83 (d, 1H, J = 12 Hz), 5,35 (d, 1H, J = 6,2 Hz), 5,53 (1H), 6,71 (s, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,81 (d, 1H), 7,19-7,36 (m, 10H). Beispiel 2 D-Phenylalanyl- N-[2-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)]-L-prolinamid (7)
Eine Lösung aus N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)]-L- prolinamid (6) (0,162 g, 0,3 mmol) in 4 : 1 Ethanol/THF (5 ml) wurde mit 10%igem Palladium auf Aktivkohle (40 mg) behandelt und bei Raumtemperatur unter einer Wasserstoffatmosphäre 5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch einen Celitefilterkuchen (Celite ist ein registrierter Handelsname der Johns-Manville Product Corporation für Kieselgur) filtriert und mit mit Methanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden unter Hochvakuum eingedampft, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde (0,122 g, 100%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;; 300 MHz) δ 3,42-3,49 (m, 2H), 3,73-3,8 (m, 2H), 4,25 (dd, 1H), 4,40 (dd, 1H), 4,47 (dd, 1H), 6,74 (dd, 1H, J = 1,8, 8 Hz), 6,80 (d, 1H, J = 1,8 Hz), 6,83 (d, 1H), 7,0- 7,3 (m, 5H). Massenspektrum (MALDI-TOF, m/z): Berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub7;N&sub3;O&sub4; 402,2 (M + Na&spplus;); Gefunden 419,9. Beispiel 3 N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-dimethylaminobenzyl)]-L-prolinamid (8)
Die Titelverbindung (265 mg) wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 1 und 4-(Dimethylamino)benzylainin·2 HCl (115 mg) als kuppelndes Amin hergestellt. ¹H-NMR (CDCl&sub3;; 300 MHz) δ 2,56 (q, 1H), 2,84 (s, 6H), 3,60 (t, 1H), 4,21 (dd, 1H), 4,38 (dd, 1H), 4,51 (q, 2H), 4,63 (d, 1H), 4,89 (d, 1H), 5,39 (d, 1H, J = 6 Hz), 6,7 (d, 2H), 7,1 (d, 2H) und 7,2-7,4 (m, 9H). Beispiel 4 D-Phenylalanyl-N-[2-(4-dimethylaminobenzyl)]-L-prolinamid (9)
Die Titelverbindung (265 mg) wurde aus dem entsprechenden CBZ-Derivat (8) (207 mg) unter Verwendung des in Beispiel 2 aufgezeigten Verfahrens erhalten: ¹H-NMR (CDCl&sub3;; 300 MHz) δ 2,92 (s, 6H), 3,45 (dt, J = 3,9 Hz), 3,74 (dd, 1H, J = 7,8 Hz), 4,22 (dd, 1H, J = 6,14 Hz), 4,36 (dd, 1H, J = 6,14 Hz), 4,49 (d, 1H, 2 Hz), 6,67 (d, 2H, J = 9 Hz), 7,02-7,32 (m, 7H). Massenspektrum (MALDI-TOF): Berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub0;N&sub4;O&sub2; 417,2 (M + Na); Gefunden 416,8. Beispiel 5 N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(3,4-dihydroxyphenethyl)]-L-prolinamid (12)
Die Titelverbindung wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 1 und 3,4-Dihydroxyphenethylamin·HCl als kuppelndes Amin hergestellt.
¹H-NMR (CDCl&sub3;; 300 MHz) δ 1,43-1,57 (m, 3H), 2,02-2,17 (m, 1H), 2,47-2,56 (m, 2H), 2,65-2,71 (m, 1H), 2,88-3,02 (m, 2H), 3,06-3,19 (m, 1H), 3,43-3,56 (m, 2H), 4,44-4,52 (m, 2H), 4,65 (d, 1H, J = 12,2 Hz), 4,91 (d, 1H, J = 12,2 Hz), 5,81 (d, 1H, J = 5,4 Hz), 6,5 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 6,70 (s, 1H), 6,72 (d, 18, J = 7,8 Hz), 7,00 (s, 1H), 7,17-7,28 (m, 10H). Massenspektrum (MALDI-TOF): Berechnet für C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub3;N&sub3;O&sub6; 554,6 (M + Na); Gefunden 554,1. Beispiel 6 N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-hydroxyphenethyl)]-L-prolinamid (11)
Die Titelverbindung wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 1 und 4-Hydroxyphenethylamin als kuppelndes Amin hergestellt.
¹H-NMR (CDCl&sub3;; 300 MHz) δ 1,43-1,56 (m, 3H), 2,42-2,50 (m, 1H), 2,61-2,70 (m, 2H), 2,93-3,04 (m, 2H), 3,22-3,30 (m, 1H), 3,37-3,50 (m, 3H), 4,41-4,51 (m, 2H), 5,00 (ABq, 2H, J = 12,3 Hz), 5,86 (d, 1H, J = 6,2 Hz), 6,72 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 6,95 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 6,96-7,00 (m, 1H), 7,02-7,33 (m, 10 H). Massenspektrum (MALDI-TOF): Berechnet für C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub3;N&sub3;O&sub5; 538,6 (M + Na); Gefunden 539,4. Beispiel 7 N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminobenzyl)]-L-prolinamid (12)
Eine Lösung aus N-CBZ-D-Phe-Pro (5) (0,793 g, 2,0 mmol), 4-Aminobenzylamin (0,366 g, 3,0 mmol), Diphenylphosphorylazid (0,55 g, 2,0 mmol) und Triethylamin (0,3 g, 3,0 mmol) in DMF (2 ml) wurde bei 0ºC 2 Stunden und bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Ethylacetat (150 ml) wurde zugegeben und die organische Schicht wurde mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (2 · 50 ml) und Wasser (2 · 50 ml) gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flashchromatographie über Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat als Elutionmittel gereinigt, wobei nach Eindampfen 0,92 g (92% Ausbeute) eines weißen Schaums erhalten wurden.
¹H-NMR (CDCl&sub3;; 300 MHz) δ 1,70 (m, 4H), 2,25 (d, 1H), 2,55 (q, 1H), 2,98 (d, 2H), 3,49 (s, 2H), 3,60 (t, 1H), 4,30 (m, 2H), 4,50 (d, 2H), 4,72 (d, 1H), 4,90 (d, 1H), 5,43 (d, 1H), 6,58 (d, 2H), 6,99 (d, 2H), 7,26 (m, 10H). Massenspektrum (MALDI-TOF, Sinapinsäure, m/z): Berechnet für C&sub2;&sub9;H&sub3;&sub2;N&sub4;O&sub4; 523,6 (M+ Na&spplus;); Gefunden 523,6. Beispiel 8 D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminobenzyl)]-L-prolinamid (13)
Eine Lösung aus N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminobenzyl)]-L-prolinamid (12) (0,5 g, 1,0 mmol) in Ethanol (15 ml) wurde mit 10%igem Palladium auf Aktivkohle (50 mg) behandelt und bei Raumtemperatur unter einer Wasserstoffatmosphäre (Ballon) 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celite filtriert und mit Methanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden unter Hochvakuum eingedampft und getrocknet, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde (0,32 g, 90%).
¹H-NMR (CD&sub3;OD; 300 MHz) δ 1,84 (m, 4H), 2,87 (t, 2H), 3,34 (d, 2H), 3,44 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 4,23 (d, 2H), 6,69 (d, 2H), 7,00 (d, 2H), 7,25 (m, 5H). Massenspektrum (MALDI- TOF, Sinapinsäure, m/z): Berechnet für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub6;N&sub4;O&sub2; 389,4 (M + Na&spplus;); Gefunden 389,6. Beispiel 9 N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminophenethyl)]-L-prolinamid (14)
Die Titelverbindung wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 7 und 4-Aminophenethylamin als kuppelndes Amin hergestellt.
¹H-NMR (CDCl&sub3;; 300 MHz) δ 1,28-1,51 (m, 2H), 2,15-2,21 (m, 1H), 2,47-2,55 (m, 1H), 2,57-2,73 (m, 2H), 2,88-3,00 (m, 2H), 3,23-3,28 (m, 1H), 3,30-3,51 (m, 3H), 4,41 (d, 1H, J = 7 Hz), 4,52 (dd, 1H, J = 7 und 15 Hz), 5,08 (ABq, 2H, J = 12,3 Hz), 5,45 (d, 1H, J = 7 Hz), 6,58 (d, 2H, J = 8 Hz), 6,90-6,92 (m, 1H), 6,94 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,18-7,39 (m, 10H). Massenspektrum (MALDI-TOF): Berechnet für C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub4;N&sub4;O&sub4; 537,5 (M + Na); Gefunden 537,2. Beispiel 10 N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenethyl)]-L- prolinamid (15)
Zu einer Lösung aus N-CBZ-D-Phe-Pro (5) (250 mg, 0,631 mmol), 3,5-Dimethoxy-4- hydroxyphenethylamin-hydrochlorid (162 mg, 0,694 mmol) und N,N-Diisopropylamin (0,329 ml, 1,89 mmol) in 1 ml DMF wurde Diphenylphosphorylazid (0,139 ml, 0,644 mmol) gegeben und das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach 1,5 Stunden wurden weitere 0,020 ml Diphenylphosphorylazid zugegeben. Nach weiterem 1stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch zwischen 35 ml 1,1,1-Trichlorethan und 35 ml 1 N HCl verteilt. Die wässrige Schicht wurde mit 25 ml Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Phasen wurden zu einer weißen halbfesten Substanz eingedampft. Dann wurde erneut in 40 ml Ethylacetat gelöst und mit Wasser (2 · 25 ml), 1 M HCl (2 · 25 ml) und Kochsalzlösung gewaschen. Die Lösung wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum konzentriert, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde. Umkristallisieren aus Ether lieferte 334 mg (92%) eines kristallinen Feststoffs.
¹H-NMR (CDCl&sub3;; 300 MHz) δ 1,50-1,74 (m, 3H), 2,16 (m, 1H), 2,54 (m, 1H), 2,70 (m, 1H), 2,99 (m, 1H), 3,28-3,53 (m, 3H), 3,82 (s, 3H), 4,43 (d, 1H, J = 6,0 Hz), 4,50 (dd, 2H), 5,07 (dd, 2H), 5,40 (br s, 3H), 5,47 (d, 1H, J = 6,5 Hz), 6,42 (s, 2H), 6,96 (br t, 1H) und 7,18- 7,38 (m, 10H). Massenspektrum (MALDI-TOF): Berechnet für C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub5;N&sub3;O&sub6; 598,3 (M + Na); Gefunden 598,1. Beispiel 11 N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(3-Methoxy-4-hydroxyphenethyl)]-L-prolinamid (14)
Zu einer Lösung aus N-CBZ-D-Phe-Pro (5) (250 mg, 0,631 mmol), 4-Hydroxy-3- methoxyphenethylamin-hydrochlorid (141 mg, 0,694 mmol) und N,N-Diisopropylamin (0,329 ml, 1,89 mmol) in 1 ml DMF wurde Diphenylphosphorylazid (0,139 ml, 0,644 mmol) gegeben und das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach 1,5 Stunden wurden weitere 0,020 ml Diphenylphosphorylazid zugegeben. Nach weiterem 1stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch zwischen 35 ml 1,1,1-Trichlorethan und 35 ml 1 N HCl verteilt. Die wässrige Schicht wurde mit 25 ml Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Phasen wurden zu einer weißen halbfesten Substanz eingedampft. Umkristallisieren aus Methanol-Ether lieferte 341 mg (99%) der Titelverbindung als ein weißes Pulver.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;; 300 MHz) (komplexes Rotamerengernisch) δ 1,53-1,78 (m, 2H), 1,88 und 2,16 (Rotamere, m, 1H), 2,53-2,68 (m, 2H), 2,70-2,97 (m, 2H), 3,08-3,18 (m, 1H), 3,20-3,29 (m, 1H), 3,53 und 4,08 (Rotamere, m, 1H), 3,71 (s, 3H), 4,17 (t, 1H), 4,94 und 5,01 (Rotamere, überlagernde dd, 2H), 6,56 (td, 1H, J = 7,9, 1,6 Hz), 6,67 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 6,72 (br s, 1H), 7,18-7,35 (m, 10H), 7,47 und 8,34 (Rotamere, br t, 1H, J = 5,5 Hz), 7,83 und 7,88 (Rotamere, d, 1H), 8,78 (d, 1H, J = 10,5 Hz). Massenspektrum (MALDI-TOF): Berechnet für C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub5;N&sub3;O&sub6; 568,2 (M + Na); Gefunden 568,1.

Beispiel 12

In vitro-Hemmung von gereinigten Enzymen

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen als Inhibitoren der katalytischen Wirkung von Thrombin, Faktor Xa und von Plasmin zu wirken, wurde bewertet, indem unter Verwendung von gereinigten menschlichen Enzymen die Konzentration, bei der die Enzymwirkung um 50% gehemmt wurde, bestimmt wurde. Die Konzentration an zugegebenem Inhibitor, die eine Verminderung der anfänglichen Hydrolyserate um 50% verursachte, wurde als der IC&sub5;&sub0;-Wert definiert.
Alle Tests beruhen auf der Fähigkeit der Testverbindungen die Hydrolyse eines Peptid- p-nitroanilidsubstrats zu hemmen. In einem typischen Experiment wird das passende Substrat in DMSO hergestellt und in einen Testpuffer, der aus 50 mM HEPES und 130 mM NaCl bei einem pH-Wert von 7,5 besteht, verdünnt. Die Endkonzentration für jedes Substrat ist nachstehend aufgeführt. Alle Substratkonzentrationen sind mindestens 10mal niedriger als Km, um sicherzustellen, dass die Hemmung kompetitiv ist. Die Testverbindungen werden als 1 mg/ml-Lösungen in DMSO hergestellt und es werden drei zusätzliche 10fach Verdünnungen in DMSO hergestellt. Die Enzymlösungen werden in den nachstehend aufgeführten Konzentrationen in Testpuffer hergestellt.
Bei einer typischen IC&sub5;&sub0;-Bestimmung werden in jede Vertiefung einer 96er-Platte 280 ul Substratlösung und 10 pl Inhibitorlösung pipettiert und man lässt die Platte bei 37ºC in einem Molecular Devices Plate Reader mindestens 10 Minuten thermisch äquilibrieren. Die Umsetzungen werden durch die Zugabe von 20 ul-Aliquoten Enzym in Gang gesetzt, und der Absorptionsanstieg bei 405 nm wird 15 Minuten lang aufgezeichnet. Für die Berechnungen werden die Daten verwendet, die weniger als 10% der gesamten Substrathydrolyse entsprechen. Das Verhältnis der Geschwindigkeit (Rate der Absorptionsänderung als eine Funktion der Zeit) für eine Probe, die keinen Inhibitor enthält, wird durch die Geschwindigkeit einer Probe, die Inhibitor enthält, dividiert und als eine Funktion der Inhibitorkonzentration aufgezeichnet. Der Kehrwert der Steigung stellt die Inhibitorkonzentration dar, die eine 50%ige Verminderung der Enzymwirkung hervorruft. Diese Konzentration wird als der IC&sub5;&sub0;-Wert bezeichnet.

Thrombin

Die Wirkung des Thrombins wurde als die Fähigkeit bewertet, das Substrat N-Benzoyl- Phe-Val-Arg-p-nitroanilid zu hydrolysieren, und es wurde von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten. Es wurden Substratlösungen in einer Konzentration von 60 uM (60 PM < < Km = 1,2 mM) in Testpuffer hergestellt. Die DMSO-Endkonzentration betrug 0,3%. Gereinigtes menschliches Thrombin wurde von Enzyme Research Laboratories, Inc. erhalten und in einen Testpuffer auf eine Konzentration von 1,2 uM verdünnt. Die Endkonzentrationen der Reagenzien betrugen: [Thrombin] = 36 nM, [Bz-Phe-Val-Arg-pNa] = 66 uM, [Inhibitor] = 60 bis 0,06 uM.

Faktor Xa

Die Wirkung des Faktors Xa wurde als die Fähigkeit bewertet, das Substrat Bz-Ile-Glu- Gly-Arg-pNa zu hydrolysieren, und es wurde von Sigma erhalten. Es wurden Substratlösungen in einer Konzentration von 26 uM (26 uM < < Km = 1,3 mM) in Testpuffer hergestellt. Die DMSO-Endkonzentration betrug 0,3%. Aktivierter Faktor Xa wurde von Enzyme Research Laboratories, Inc. erhalten und in einen Testpuffer auf eine Konzentration von 1,2 uM verdünnt. Die Endkonzentrationen der Reagenzien betrugen: [Faktor Xa] = 10 nM, [Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p- Na] = 26 uM, [Inhibitor] = 60 bis 0,06 uM.

Plasmin

Die Wirkung des Plasmins wurde als die Fähigkeit bewertet, das Substrat Tos-Gly-Pro- Lys-pNa zu hydrolysieren, und es wurde von Sigma erhalten. Es wurden Substratlösungen in einer Konzentration von 22 uM (22uM < < Km = 240 uM) in Testpuffer hergestellt. Die DMSO- Endkonzentration betrug 0,3%. Gereinigters menschliches Plasmin wurde von Enzyme Research Laboratories, Inc. erhalten und in einen Testpuffer auf eine Konzentration von 1,2 uM verdünnt. Die Endkonzentrationen der Reagenzien betrugen: [Plasmin] = 15 nM, [Tos-Gly-Pro-Lys-p-Na] = 26 uM, [Inhibitor] = 60 bis 0,06 uM.
Die unter der Verwendung der Verbindungen 13, 7 beziehungsweise 12 erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1
Die Ergebnisse lassen erkennen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen und insbesondere die Verbindungen der Beispiele 2, 7 und 8 hoch selektive und starke Thrombininhibitoren sind.
Nachdem diese Erfindung nun vollständig beschrieben ist, versteht es sich für Fachleute, dass dieselbe innerhalb eines breiten und äquivalenten Bereichs von Bedingungen, Formulierungen und anderer Parameter ausgeführt werden kann, ohne den Umfang der Erfindung oder jeder Ausführungsform davon zu beeinträchtigen.

Claims

1. Verbindung mit der Formel I:

oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon;

wobei

R¹ ein Wasserstoffatom, einen Rest -SO&sub2;R&sup8;, -CONHR&sup8; oder -CO&sub2;R&sup8; darstellt, in denen

R&sup8; ein Wasserstoffatom, einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Arylalkylrest bedeutet, wobei die Bezeichnung Aryl allein oder als ein Teil einer anderen Gruppe eine monocyclische oder bicyclische aromatische Gruppe aus 6-12 Kohlenstoffatomen im Teil des aromatischen Ringes bedeutet;

R² eine Hydroxygruppe oder einen Rest -NR&sup6;R&sup7; darstellt;

R³ und R&sup4; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, einen Rest -NR&sup6;R&sup7;, einen Alkyl-, Aryl-, Arylalkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Halogenalkyl-, Aminoalkyl- oder Hydroxyalkylrest darstellen;

R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Alkyl-, Aryl- oder Arylalkylrest darstellen;

n einen Wert von 2 bis 4 hat; und

m einen Wert von 1 bis 6 hat.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei

R¹ ein Wasserstoffatom oder einen Rest -CO&sub2;R&sup8; darstellt, wobei R&sup8; einen Alkyl-, Aryl- oder Arylalkylrest bedeutet;

R² eine Hydroxygruppe oder einen Rest -NR&sup6;R&sup7; darstellt;

R³ und R&sup4; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl- oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxyrest darstellen;

R&sup5; ein Wasserstoffatom darstellt;

R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Alkyl-, Aryl- oder Arylalkylrest darstellen; und

m einen Wert von 1 bis 6 hat.

3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei R¹ ein Wasserstoffatom darstellt.

4. Verbindung nach Anspruch 2, wobei R¹ einen Rest -CO&sub2;R&sup8; darstellt, wobei R&sup8; eine Benzylgruppe bedeutet.

5. Verbindung nach Anspruch 2, wobei R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest darstellen.

6. Verbindung nach Anspruch 2, wobei m einen Wert von 1 oder 2 hat.

7. Verbindung nach Anspruch 1, wobei

R¹ ein Wasserstoffatom oder einen Rest -CO&sub2;-benzyl darstellt

R² eine Hydroxygruppe oder einen Rest -NH&sub2; oder -N(CH&sub3;) darstellt;

R³ und R&sup4; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy- oder Methoxygruppe darstellen;

R&sup5; ein Wasserstoffatom darstellt; und

m einen Wett von 1 oder 2 hat.

8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei n den Wert 3 hat.

9. Verbindung nach Anspruch 1, bei der es sich um eine der folgenden handelt:

N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)]-L-prolinamid,

D-Phenylalanyl-N-[2-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)]-L-prolinamid,

N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-dimethylaminobenzyl)]-L-prolinamid,

D-Phenylalanyl-N-[2-(4-dimethylaminobenzyl)]-L-prolinamid,

N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(3,4-dihydroxyphenethyl)]-L-prolinamid,

N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-hydroxyphenethyl)]-L-prolinamid,

N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminobenzyl)]-L-prolinamid,

D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminobenzyl)]-L-prolinamid,

N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminophenethyl)]-L-prolinamid,

N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenethyl)]-L-prolinamid und

N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(3-methoxyl-hydroxyphenethyl)]-L-prolinamid.

10. Verbindung nach Ansprach 9, nämlich

D-Phenylalanyl-N-[2-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)]-L-prolinamid.

11. Verbindung nach Anspruch 9, nämlich

N-CBZ-D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminobenzyl)]-L-prolinamid.

12. Verbindung nach Anspruch 9, nämlich

D-Phenylalanyl-N-[2-(4-aminobenzyl)]-L-prolinamid.

13. Verbindung nach Anspruch 1, wobei

R¹ ein Wasserstoffatom, einen Rest -SO&sub2;R&sup8;, -CONHRB oder -CO&sub2;R&sup8; darstellt, wobei R&sup8; ein Wasserstoffatom, einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Arylalkylrest bedeutet;

R² eine Hydroxygruppe oder einen Rest -NR&sup6;R&sup7; darstellt;

n den Wert 3 hat; und

m einen Wert von 1 bis 6 hat;

unter der Voraussetzung, dass, wenn R² einen Rest -NR&sup6;R&sup7; darstellt, einer oder beide Reste R³ und R&sup4; einen anderen Rest darstellen als ein Wasserstoffatom, Fluoratom oder einen Alkylrest.

14. Verbindung nach Anspruch 13, wobei

R¹ ein Wasserstoffatom oder einen Rest -CO&sub2;R&sup8; darstellt, wobei R&sup8; einen C&sub1;&submin;&sub8;-Alkyl-, C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;-Aryl- der C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;-Aryl(C&sub1;&submin;&sub6;)alkylrest bedeutet;

R² eine Hydroxygruppe darstellt;

R³ und R&sup4; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl- oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxyrest darstellen; und

R&sup5; ein Wasserstoffatom darstellt.

15. Verbindung nach Anspruch 14, wobei m den Wert 1 oder 2 hat.

16. Verbindung nach Anspruch 13, wobei

R¹ ein Wasserstoffatom oder einen Rest -CO&sub2;-benzyl darstellt,

R² eine Hydroxygruppe darstellt;

R&sup5; ein Wasserstoffatom darstellt; und

m den Wert 1 oder 2 hat.

17. Arzneimittel, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16.

18. Arzneimittel nach Anspruch 17, das weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.

19. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Thrombose, Ischämie, Schlaganfall, Restenose oder Entzündung.

20. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 9 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Thrombose, Ischämie, Schlaganfall, Restenose oder Entzündung.