DD296960A5 - Therapreutisches mittel - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Chymopapain zur Herstellung verbesserter pharmazeutischer Zusammensetzungen. Das Reinigungsverfahren ist beispielsweise durch a) Inkubieren einer wässrigen Lösung von Rohchymopapain mit einer auf das Aktivzentrum gerichteten Affinitätschromatographiematrix, die eine Trägermatrix umfasst, die - wahlweise über einen Spacerarm - kovalent gekoppelt ist an das N-Ende eines reversiblen Chymopapain inhibierenden Peptids, so dass sich das Pptid an das aktive Zentrum eines Chymopapainmoleküls bindet; und b) Eluieren des Chymopapains mit einem geeigneten Elutionsmittel gekennzeichnet.{Verfahren; Reinigung; Chymopapain; Inkubation; Rohchymopapain; Repid; Elution}

Description

i) Säurefällung eines wäßrigen Gemisches mit Gehalt an Rohchymopapain; ii) Trennen einer wäßrigen Lösung von Rohchymopapain von dem Gemisch; iii) Neutralisieren und wahlweise Entsalzen der Rohchymopapainlösung; iv) Inkubieren der in Schritt (iii) gewonnenen Lösung mit einer auf das aktive Zentrum gerichteten Affinitätschromatographiematrix, die eine Trägermatrix umfaßt, die - wahlweise über einen Spacerarm - kovalent gekoppelt ist an das N-Ende eines reversiblen Chymopapain inhibierenden Peptids, so daß sich das Peptid an das aktive Zentrum eines Chymopapainmoleküls bindet; und

v) Eluieren des Chymopapains mit einem geeigneten Elutionsmittel.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Säurefällung bei einem pH von 1,2 bis 1,8 ausgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen Kationenaustauschchromatographieschritt einschließt.

Die Erfindung betrifft Chymopapain, verbesserte pharmazeutische Zusammensetzungen mit Chymopapaingehalt und Methoden zur Behandlung von Bandscheibenschäden, Bandscheibenvorfall oder anderweitigen Bandscheibenabnormitäten bei Säugern, die das Injizieren einer Lösung der verbesserten Zusammensetzung in die Bandscheiben umfassen. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Chymopapains, Peptide und Affinitätschromatographiematrizen zur Verwendung in solchen Verfahren und monospezifische Antikörperpräparate, die gegen Chymopapain gebildet werden.

Chymopapain ist eine Cysteinproteinase, die im Latex, des Melonenbaums (Carica papaya) vorhanden ist. Es hat sich als klinisch einsetzbar erwiesen, insbesondere für die Behandlung von Bandscheibenprolaps oder -Vorfall oder Ischialgie in einem Verfahren, das als „Chemonukleolyse", Smith, L. (1964), J. Amer. Med. Assoc. 187,137-140, bekannt ist. Reinigung und Charakterisierung von Chymopapain wurden zuerst von Jansen und Balls (1941), J. Biol. Chem., 137,405-417, versucht, die Säurefällung und Aussalzverfahren zur Herstellung des Enzyms anwandten. In neuerer Zeit wurden Reinigungsverfahren auf der Basis von lonenaustauschchromatographie eingesetzt. So beschreiben beispielsweise GB 2098997 (Smith Laboratories Inc.) und GB 2156821 (Simmons) beide die Verwendung von Kationenaustauschharzen zur Trennung von Chymopapain von anderen bekannten Proteinasen, und beide Verfahren wurden im industriellen Maßstab zur Chymopapainherstellung benutzt. Das entstehende Material wird jedoch als eine Substanz von relativ geringer spezifischer Aktivität befunden, wenn man sie mit dem Chymopapain vergleicht, das von Buttle und Barrett (1984), Biochem. J., 223,81-88, unter Einsatz eines Mehrstufenverfahrens im kleinen Maßstab mit, unter anderem, einem Kationenaustauschchromatographieschritt hergestellt wurde. Dieses Material ist zwar von hoher spezifischer Aktivität, wurde allerdings in nur sehr niedrigen Ausbeuten gewonnen, und das Verfahren ist für den technischen Einsatz nicht geeignet. Buttle et al., Biochem. J. (Juli 1989) 261,469-476, haben nun festgestellt, daß diese Substanz mit einer Proteinase verunreinigt ist, die vor kurzem isoliert und charakterisiert wurde. Es handelt sich dabei um Papayaproteinase IV, die aus Kationenaustauschharzen gemeinsam mit Chymopapain eluiert. Durch Kationenaustauschchromatographie ist es nicht möglich, Chymopapain in einem Maße von Papayaproteinase IV zu trennen, wie es für die Herstellung von Chymopapain, das im wesentlichen frei von Verunreinigung mit Papayaproteinase IV ist, brauchbar wäre.

Die Literatur enthält auch Verweise auf Methoden unter Anwendung von Affinitätschromatographieschritten. Polgar (1981), Biochim. Biophys. Acta, 658,262-269, beschreibt die Reinigung von Chymopapain, bei der neben einer Reihe anderer Techniken Affinitätschromatographie auf einer Agarose-Quecksilbersäule zum Einsatz kommt, und Dubois et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler (1988), 369,733-740 haben über die Abtrennung von Cysteinproteinasen aus Carica-papaya-Latex mit ähnlichen Techniken berichtet. Diese Art der Affinitätschromatographie beruht auf der Wechselwirkung zwischen an eine inerte Matrix gebundenen Quecksilberliganden und den Thiolgruppen der Proteine, die diesem ausgesetzt sind. Somit können sich andere Proteine als Chymopapain, insbesondere andere Cysteinproteinasen wie z.B. Papayaproteinase IV, an solche Säulen binden und anschließend mit Chymopapain co-eluiert werden.

Vor kurzem haben wissenschaftliche Abhandlungen die Anwendung der Affinitätschromatographie unter Einsatz immobilisierter Peptidderivate zur Reinigung spezifischer Proteinasen wie z. B. humanem Kathepsin B (Rieh et al., 1986, Biochem. J. 235, 731 bis 734) und Histolysin aus Entamoeba histolytica (Luaces & Barrett, 1988, Biochem. J. 250,903-909) beschrieben. Dieser Weg war bis dahin noch nicht für Verfahren zur Reinigung von Chymopapain beschritten worden, und der Bedarf an einem verbesserten Verfahren zur Reinigung von Chymopapain, das zum Einsatz im großtechnischen Maßstab geeignet ist, bleibt einleuchtend.

Die Erfinder haben nun ein neuartiges Verfahren zur Reinigung und Isolierung von hochaktivem Chymopapain, das frei von Verunreinigungen und insbesondere frei von den anderen im Papayalatex vorhandenen Cysteinproteinasen einschließlich Papayaproteinase IV ist, entdeckt.

Die Erfindung betrifft Chymopapain, das im wesentlichen rein ist und einen hohen Anteil der aktiven Form des Enzyms enthält. Das erfindungsgemäße Chymopapain ist im wesentlichen frei von den immunologisch verschiedenen Proteinasen, die im Papayalatex gefunden wurden, nämlich Papain, Papayaproteinase III (PPIII), die beide von Buttle & Barrett (1984), Biochem. J., 223,81-88, beschrieben werden und insbesondere die vor kurzem entdeckte Papayaproeinase IV (PPIV). Der Begriff „im wesentlichen rein", wie er hier verwendet wird, kann daher weiter definiert werden als „im wesentlichen immunologisch rein" und bezieht sich auf die Abwesenheit jeglicher wesentlicher Kreuzreaktion zwischen erfindungsgemäßem Chymopapain und spezifischen Antikörpern, die gegen reine PPIV gebildet werden, die von Buttle et al., Biochem. J. (Juli 1989) 261,469-476, isoliert und charakterisiert wurde und nachstehend kurz beschrieben wird, sowie auf die Abwesenheit jeglicher wesentlicher Kreuzreaktion mit spezifischen Antikörpern, die gegen Papain und PPIII, wie vorher von Buttle und Barrett (1984) am oben angeführten Ort beschrieben, gebildet werden. Zu beachten ist besonders die Feststellung, daß das nach dem Verfahren von Buttle und Barrett hergestellte sogenannte „reine" Chymopapain wesentliche Mengen (etwa 14%) PPIV enthält, und daher besitzt die ursprünglich von ihnen hervorgebrachte Anti-Chymopapain-Antikörperpräparation Spezifität sowohl für gereinigtes Chymopapain gemäß der Erfindung als auch für geeignetes PPIV. Erfindungsgemäßes Chymopapain enthält vorzugsweise weniger als 1 Ma.-%, besser weniger als 0,2%, am besten nicht mehr als jeweils 0,1 % PPIV, PPIII und Papain. Monospezifische Antikörperpräparate, die gegen erfindungsgemäßes Chymopapain gebildet werden, stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.

Die Kreuzreaktion zwischen Antigen und Antikörper kann durch im Fachgebiet bekannte herkömmliche Techniken bestimmt werden. Solche Techniken schließen beispielsweise „fused rockef-lmmunoelektrophorese und doppelte Immunodiffusion (von Buttle und Barrett [1984] am oben angeführten Ort beschrieben), einfachen radialen Immunoassay, Radioimmunoassay (RIA) und enzymverbundene Immunoadsorptionsbestimmung (ELISA-enzyme-linked immunosorbent assay) ein. Die in einem Enzympräparat vorhandene Menge an aktivem Enzym wird im allgemeinen als ihre spezifische Aktivität gegen ein spezifiziertes Substrat unter spezifizierten Analysebedingungen angegeben. Der Ausdruck „spezifische Aktivität gegen BAPNA" bezeichnet hier die Proteinaseaktivität in Picomol von pro Sekunde pro mg Trockenmasse des Produktes gebildetem p-Nitroanilin (pmol/s/mg), wenn die Analyse mit dem synthetischen Substrat N-a-Benzoyl-DL-arginin-p-nitro-anilid (BAPNA) unter Standardanalysebedingungen erfolgt. Die für bekannte pharmazeutische Präparate von Chymopapain angewendeten Standardanalysebedingungen werden nachstehend ausführlich als „BAPNA-Analysemethode Nr. 1" oder „Smith-Analyse" beschrieben, und auf die davon abgeleitete spezifische Aktivität wird Bezug genommen als spezifische Aktivität gegen BAPNA (1 mM) bei 37°C und pH 6,0. Für erfindungsgemäßes Chymopapain ist eine spezifische Aktivität gegen BAPNA (1 mMj bei 37⁰C und pH 6,0 von mindestens 750 Einheiten pro mg definiert. Im allgemeinen hat erfindungsgemäßes Chymopapain eine spezifische Aktivität gegen BAPNA (1mM) zwischen 800 und 1700 Einheiten pro mg, vorzugsweise zwischen 1000 und 1700 Einheiten pro mg, beispielsweise 1200 bis 1500 Einheiten pro mg, wenn es bei 37°C und pH 6,0 analysiert wird. Nach einem bevorzugten Aspekt wird durch die Erfindung Chymopapain zur Verfügung gestellt, das eine spezifische Aktivität gegen BAPNA (1 mM) bei 37°C und pH 6,0 von mindestens 1300 Einheiten pro mg aufweist.

Zwar ist die Proteinaseaktivität in der gesamten umfangreichen Literatur bezüglich Chymopapain und anderen Cysteinproteinasen sehr breit definiert als die Freisetzung von p- Nitroanilin aus dem synthetischen Substrat BAPNA, aber Probleme können auftreten, wenn ein direkter Vergleich zwischen angegebenen spezifischen Aktivitätszahlen angestellt wird. Die erzielten genauen Werte sind von einer Reihe von Faktoren abhängig, die sich insbesondere auf die genauen Bedingungen, beispielsweise pH, Temperatur, Pufferzusammensetzung und Substratkonzentration bei der Analyse beziehen. Das von Buttle und Barrett (1984), siehe oben angeführte Literaturstelle, hergestellte Chymopapain weist laut Angaben der Autoren in ihrer Abhandlung eine spezifische Aktivität gegen BAPNA in Höhe von 0,154pmol/min/mg auf, was 2567 pmol/s/mg entspricht. Allerdings unterschieden sich die von Buttle und Barrett angewendeten Analysebedingungen von den für bekannte pharmazeutische Qualitäten von Chymopapain angewendeten, und die spezifische Aktivität kann nicht direkt verglichen werden. Da angenommen wurde, daß das von Buttle und Barrett hergestellte Material das Chymopapainpräparat mit der höchsten spezifischen Wirksamkeit war, über die bislang berichtet wurde, erfolgte die anfängliche Arbeit mit Bezug auf die vorliegende Erfindung unter Analysebedingungen, die in der Abhandlung deroben genannten Autoren spezifiziert waren. Auf diese Methode wird hier Bezug genommen unter der Bezeichnung BAPNA-Analysemethode Nr. 2, und die davon abgeleitete spezifische Aktivität wird als spezifische Aktivität gegen BAPNA (2,5 mM) bei 40⁰C und pH 6,8 angegeben, um klar zu machen, daß sich die Analysebedingungen von denen unterscheiden, die für pharmazeutische Präparate von Chymopapain angewendet werden. Es hat sich gezeigt, daß die mit dieser Analyse erzielten Resultate zwei- bis dreimal höher liegen als die mit der herkömmlichen pharmazeutischen BAPNA-Analysemethode Nr. 1 erzielten, obwohl es wissenschaftlich inkorrekt wäre, einen einfachen Umrechnungsfaktor anzuwenden, um die mit einer Analysemethode erzielten Ergebnisse in die einer anderen umzuwandeln. Trotzdem hat die frühe Arbeit zu dieser Erfindung gezeigt, daß die spezifische Aktivität gegen BAPNA (2,5mM) bei 40⁰C und pH 6,8 von reinem erfindungsgemäßen Chymopapain als mindestens 2500 Einheiten pro mg, zum Beispiel 3500 bis 4 500 Einheiten pro mg, definiert werden kann. Nach einem bevorzugten Aspekt wird durch die Erfindung Chymopapain mit einer spezifischen Aktivität gegen BAPNA (2,5mM) bei 40⁰C und pH 6,8 von mindestens 3000 Einheiten pro mg bereitgestellt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben in einer Untersuchungsarbeit, die vor kurzem veröffentlicht wurde (Juli 1989, am oben angeführten Ort) und die nachstehend kurz beschrieben wird, eine vorher unbekannte Verunreinigungssubstanz von nach Methoden des bekannten Standes der Technik hergestelltem Chymopapain, und zwar Papayaproteinase IV (PPIV), gereinigt und charakterisiert. Zwar ist PPIV inaktiv gegen BAPNA, weist aber Proteinaseaktivität gegen Azocasein auf. Ferner wurde

festgestellt, daß die PPIV-Aktivität gegen Azocasein durch Konzentrationen von Hühnercystatin bis zu 1 μΜ nicht wesentlich inhibiert wird. Die Aktivität von erfindungsgemäßem Chymopapain gegen Azocasein wird durch diese Konzentrationen von Hühnercystatin zu mindestens 95% inhibiert. Der Ausdruck „Aktivität gegen Azocasein" bezeichnet hier die Proteinaseaktivität als die Menge Trichloressigsäure-Iöslicher Peptide, die pro Zeiteinheit pro Einheit Produkttrockenmasse gebildet werden, wenn die Untersuchung mit dem derivatisierten Proteinsubstrat Azocasein unter den nachfolgend beschriebenen Standardanalysebedingungen durchgeführt wird. Vorzugsweise besitzt das erfindungsgemäße Chymopapain eine Aktivität gegen Azocasein, die zu mindestens 97%, spezieller zu 98 bis 100% durch Konzentrationen von Hühnercystatin bis zu 1 μΜ inhibiert wird.

Die Anmelder sind der Meinung, daß es sich bei dem erfindungsgemäßen Chymopapain um im wesentlichen reines Chymopapain handelt, das erstmalig ohne verunreinigende Proteine hergestellt wurde und einen hohen Anteil der aktiven Form des Enzyms enthält. Dieser Durchbruch konnte nur auf der Grundlage der Entdeckung erzielt werden, daß bislang ein verunreinigendes Protein beispielsweise über Innenaustauschsäulen und bekannte Affinitätssäulen mit Chymopapain mitgereinigt (co-purified) wurde. Die weitere Arbeit führte zur Isolierung und Charakterisierung der Verunreinigungssubstanz als PPIV. Das zur Herstellung von PPIV angewendete Verfahren war für die Herstellung von reinem Chymopapain nicht anwendbar, aber die Herstellung von PPIV lieferte zwei wichtige Parameter, durch die reines Chymopapain charakterisiert werden konnte, und zwar 1) die Abwesenheit von Kreuzreaktivität von reinem Chymopapain mit PPIV-spezifischen Antikörpern und 2) die differentielle Aktivität von reinem Chymopapain und PPfV gegen Azocasein in Anwesenheit von Hühnercystatin. Diese beiden Merkmale waren wichtige und notwendige Faktoren für die Entwicklung von Verfahren, die für die Reinigung von Chymopapain geeignet sind.

Es ist leicht zu erkennen, daß erfindungsgemäßes Chymopapain das Chymopapain der Wahl auf fast allen in Betracht gezogenen Aktivitätsgebieten sein wird. Reine Enzympräparate sind von entscheidender Bedeutung für jene, die den Versuch unternehmen, Enzyme vollständig zu charakterisieren, zum Beispiel hinsichtlich ihrer katalytischer) Spezifität und Struktur. Dementsprechend wird nach einem weiteren Aspekt der Erfindung eine Zusammensetzung bereitgestellt, die erfindungsgemäßes Chymopapain umfaßt und die im wesentlichen frei von PPIV ist. Vorzugsweise hat das Chymopapain eine spezifische Aktivität gegen BAPNA (1 mM) bei 37⁰C und pH 6,0 von mindestens 750 Einheiten pro mg. Zusammensetzungen können in Form diskreter Einheiten einer geeigneten Masse vorliegen, zum Beispiel in Form aliquoter Teile von Chymopapain, verschlossen unter wasserfreien Bedingungen, wie zum Beispiel in evakuierten Phiolen oder Ampullen. Solche Zusammensetzungen können des weiteren ein Reduktionsmittel wie Dithiothreitol, cysteinfreie Base oder ein Säureadditionssalz davon enthalten, um im wesentlichen die Inaktivierung des Enzyms durch Oxydation zu verhindern. Als Alternative können Zusammensetzungen ferner einen reversiblen Cysteinproteinaseinhibitor umfassen, der in Form eines Salzes wie z.B. Natriumtetrathionat oder Quecksilberdichlorid bereitgestellt wird. Diese reversiblen Inhibitoren blockieren das aktive Zentrum des Enzyms, wodurch sie seine Inaktivierung durch Oxydation verhindern, bis Verdrängung durch zum Beispiel ein Reduktionsmittel, welches das Enzym reaktiviert, erfolgt ist. Andere herkömmliche Zusatzstoffe, zum Beispiel Konservierungsmittel wie Natriumhydrogensulfit, Chelatbildner wie EDTA und Trägermittel wie Natriumchlorid können auf Wunsch zugesetzt werden.

Der Einsatz eines reinen Enzympräparats ist besonders wichtig bei klinischen Anwendungen von Chymopapain, zum Beispiel bei Chemonukleolyse, wo laut Berichten allergische Reaktionen gegenüber einer solchen Behandlung bei 3% der behandelten Patienten auftreten können. In der Lebensmittelindustrie ist die Verwendung von pulverisiertem Papayaextrakt weit verbreitet, und es wird angenommen, daß viele der allergischen Reaktionen auf Chemonukleolyse auf Vorsensibilisierung mit solchen Präparaten zurückzuführen sind. Es ist jedoch bekannt, daß die Injektion von Fremdproteinantigenen bei Säugern immer die Gefahr eines anaphylaktischen Schocks in sich birgt. Es entspricht einer guten medizinischen Praxis, die reinste und aktivste Form eines solchen Proteins einzusetzen, die zur Verfügung steht, um optimalen Nutzen des Verfahrens zu erreichen sowie die Gefahr immunogener Reaktionen zu minimieren.

Somit wird nach einem bevorzugten Aspekt der Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die erfindungsgemäßes Chymopapain umfaßt, wobei die Zusammensetzung im wesentlichen frei von PPIV ist. Das Chymopapain hat vorzugsweise eine spezifische Aktivität gegen BAPNA (1 mM) bei 37°C und pH 6,0 von mindestens 750 Einheiten pro mg. Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen ferner vorzugsweise ein pharmazeutisch annehmbares nichttoxisches Reduktionsmittel₍wie z. B. eine cysteinfreie Base oder ein Säureadditionssalz davon, zum Beispiel L-Cysteinhydrochloridmonohydrat. Im allgemeinen ist das Reduktionsmittel in einer Menge von etwa 0,5 bis 3mg pro 4000 Einheiten Chymopapain vorhanden, was zum Beispiel 15 bis 90Ma.-% Chymopapain ausmacht. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können jedoch ferner jedes herkömmliche pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel, Bindemittel oder Trägermittel umfassen, zum Beispiel können Konservierungsmittel wie Natriumhydrogensulfit, Chelatbildner wie EDTA und Trägermittel wie Natriumchlorid auf Wunsch zugesetzt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die erfindungsgemäßes Chymopapain enthalten, können in der Opthalmologie von Nutzen sein, zum Beispiel bei der Behandlung von Augenläsionen oder für das Debridement von verkrustetem Gewebe^. B. bei Brandwunden, Geschwüren, Drucknekrosen, Druckgeschwüren und anderen Wunden, bei denen devitalisierte Gewebe vorhanden sind. Solche Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einer für die topische Anwendung geeigneten Form bereitgestellt, zum Beispiel als sterile Lösungen, Gele, Suspensionen oder Salben, die direkt auf die Wunde aufgetragen werden können oder über einen mit den Zusammensetzungen getränkten Wundverband aufgebracht werden können. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Chymopapain für die Verwendung in der Orthopädie formuliert. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können zweckdienlicherweise in Dosiseinheitsform für die parenterale Verabreichung zubereitet werden, beispielsweise in Form einer sterilen, pyrogenfreien Lösung oder Suspension in einem geeigneten Trägermittel oder in einer zur Rekonstitution vor der Verwendung geeigneten konzentrierten Form. Dosiseinheitsformen, die sich zum Einsatz bei der Auflösung oder Behandlung des Nucleus pulposus einer abnormen oder geschädigten Zwischenwirbelscheibe durch Injektion an dieser Stelle eignen, können bestehen aus 500 bis 5000 ΒΑΡΝΑ-Einheiten (analysiert mit 1 mM BAPNA bei 37°C und pH 6,0) von erfindungsgemäßem Chymopapain und einem Reduktionsmittel wie Natriumcysteinathydrochlorid, abgefüllt in einer evakuierten Phiole. Eine bevorzugte Dosiseinheitsform umfaßt namentlich

2000 oder 4000 ΒΑΡΝΑ-Einheiten (1 mM ΒΑΡΝΑ, 37°C, pH 6,0) Chymopapain. Eine Dosiseinheitsform kann allgemein bestehen aus z. B. 2 bis 5mg, vorzugsweise 2,5 bis 3,5mg Chymopapain und 0,2 bis 3mg, vorzugsweise 1,0 bis 2,0 mg Natriumcysteinathydrochlorid, abgefüllt in einem evakuierten Behälter, wahlweise in Mischung mit einem geeigneten Trägermittel wie Natriumchlorid.

Bei den nachstehend beschriebenen Experimenten wurde bei 26 einzelnen Serumproben festgestellt, daß sie natürlich erworbene IgE-Antikörper gegen ein im Handel verfügbares Chymopapainpräparat, Chymodiactin®, hergestellt nach dem in GB 2098997 beschriebenen Verfahren, aufweisen. Es ist hier experimentell bewiesen worden, daß diese Seren IgE-Antikörper gegenüber erfindungsgemäßem Chymopapain und drei anderen im Papayalatex gefundenen Cysteinproteinasen, nämlich Papain, PP III und PPIV, enthalten. Die durchschnittlichen IgE-Werte für Chymopapain, PP III und PPIV haben jedoch gezeigt, daß PPIII und PPIV zusammen für etwa 75% des festgestellten IgE verantwortlich sind. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß diese Proteine einen starken immunogenen Charakter haben und einen Hauptanteil der antigenen Determinanten darstellen können, die in bislang verfügbaren Chymopapainformen enthalten waren, und eine überraschend große potentielle antigene Gefahr bedeuten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung weisen somit wesentliche Vorteile gegenüber Zusammensetzungen des bisherigen Standes der Technik auf.

Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Behandlung eines Bandscheibenschadens, Bandscheibenvorfalls oder anderweitigen Bandscheibenabnormitäten bei Säugern durch Chemonucleolyse, die das Injizieren einer pharmazeutisch annehmbaren Lösung von erfindungsgemäßem Chymopapain in einer zur selektiven Auflösung von Teilen der Bandscheibe ausreichenden Menge in die Bandscheibe umfaßt

Die Erfindung betrifft ferner eine Methode zur Behandlung einer abnormen Bandscheibe bei einem Säuger, die umfaßt:

i) Einsetzen einer Nadel in die Bandscheibe;

ii) Bestätigung der Plazierung der Nadel durch Röntgen und

iii) Injizieren einer pharmazeutisch annehmbaren Lösung von erfindungsgemäßem Chymopapain in einer für die selektive Auflösung von Teilen der Bandscheibe ausreichenden Menge in die Bandscheibe.

Durch die Erfindung wird auch ein Verfahren zum Reinigen von Chymopapain zur Verfügung gestellt, welches umfaßt:

a) Inkubieren einer wäßrigen Lösung von Rohchymopapain mit einer auf das aktive Zentrum gerichteten Affinitätschromatographiematrix, die eine Trägermatrix umfaßt, die-wahlweise über einen Spacerarm - kovalent gekoppelt ist an das N-Ende eines reversiblen Chymopapain inhibierenden Peptids, so daß sich das Peptid an das aktive Zentrum eines Chymopapainmoleküls bindet, und

b) Eluieren des Chymopapains mit einem geeigneten Elutionsmittel.

Das als Ausgangsmaterial für die Reinigung des erfindungsgemäßen Chymopapains verwendete Rohchymopapain kann ein Extrakt von frischem Papayalatex, eine aus einem im Handel verfügbaren Präparat von im Sprühverfahren getrocknetem Latex gewonnene Lösung, Papainkonzentrat oderteilweise gereinigtes Chymopapain sein, oder es kann sich um eine Lösung eines im Handel erhältlichen Präparats von sogenanntem „reinen" Chymopapain handeln. Fachleute werden jedoch erkennen, daß relativ vollständige Extrakte von Papaya wie Papayalatex sehr beträchtliche Mengen anderer natürlich vorkommender Komponenten enthalten, die es zu entfernen gilt. Vorzugsweise wird ein wesentlicher Teil solcher Komponenten entfernt, bevor die Rohchymopapainlösung mit der Affinitätschromatografimatrix inkubiert wird, zum Beispiel durch Filtration oder Zentrifugation zur Entfernung unlöslichen Materials. Es wurde jedoch festgestellt, daß ein Säurefällungsschritt, bei dem ein beträchtlicher Teil Verunreinigungen ausgefällt wird, von besonderem Vorteil ist.

Säurefällungsverfahren, bei denen der pH einer wäßrigen Lösung von Rohchymopapain auf pH 2 gesenkt wird, sie stehengelassen wird und die Chymopapainlösung dann abgetrennt wird, werden seit fast 50 Jahren zur Reinigung von Chymopapain eingesetzt. Überraschenderweise hat der Anmelder nun nachgewiesen, daß der genaue pH-Wert bei solchen Verfahren die Verunreinigung der entstehenden Chymopapainlösung mit PPIV entscheidend beeinflußt. Sorgfältige Überwachung und Steuerung dieses Verfahrens, von dem bisher angenommen wurde, daß es sich um einen reinen einleitenden Schritt bei der Chymopapainreinigung handelt, reduzieren erwiesenermaßen die Verunreinigung mit PPIV, dem Protein, von dem nun festgestellt wurde, daß es bei Anwendung herkömmlicher Techniken mit Chymopapain mitgereinigt wird. Dementsprechend wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Chymopapain bereitgestellt, welches umfaßt:

1. Ausfällen eines wäßrigen Gemisches mit Gehalt an Rohchymopapain bei einem pH-Wert unter 2,0;

2. Trennen einer wäßrigen Lösung von Rohchymopapain von dem Gemisch; und

3. Neutralisieren und wahlweise Entsalzen der Rohchymopapainlösung.

Es wird bevorzugt, alle verbleibenden Proteinverunreinigungen aus dem Präparat zu entfernen, indem mindestens ein herkömmlicher Kationenaustauschchromatographieschritt in das Reinigungsverfahren eingeschlossen wird, beispielsweise, wie es von Buttle und Barrett, 1984, am oben angeführten Ort beschrieben wird. Es wird insbesondere vorgezogen, Hochleistungschromatographie, beispielsweise FPLC⁹ auf einem Kationenaustauscherharz, wie sie z. B. unter den Handelsnamen Mono-S oder S-Sepharose® HP (Pharmacia) verkauft werden, als letzten Schritt einzusetzen. Nach einem besonderen bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung von Chymopapain zur Verfugung gestellt, welches umfaßt:

i) Säurefällung eines wäßrigen Gemisches mit Gehalt an Rohchymopapain, vorzugsweise bei einem pH unter 2,0; ii) Trennen einer wäßrigen Lösung von Rohchymopapain von dem Gemisch; iii) Neutralisieren und wahlweise Entsalzen der Rohchymopapainlösung;

iv) Inkubieren der in Schritt (Ni) gewonnenen Lösung mit einer auf das aktive Zentrum gerichteten Affinitätschromatographiematrix, die eine Trägermatrix umfaßt, die-wahlweise über einen Spacerarm- kovalent gekoppelt ist an das N-Ende eines reversiblen Chymopapain-inhibierenden Peptide, so daß sich das Peptid an das aktive Zentrum eines Chymopapainmoleküls bindet; und

v) Eliminieren des Chymopapains mit einem geeigneten Elutionsmittel.

Fachleuten wird klar sein, daß der bevorzugte Kationenaustauschchromatographieschritt wahlweise oder zusätzlich auf Wunsch unmittelbar vor oder nach dem Affinitätschromatographieschritt angewendet werden kann. Das Rohchymopapain enthaltende wäßrige Gemisch kann beispielsweise frischen Papayalatex, im Sprühverfahren getrockneten Papayalatex oder Papainkonzentrat (z.B. im Handel erhältlichen, im Sprühverfahren getrockneten Latex von Powell & Scholefield, Großbritannien, oder von Siebeis, USA) als Suspension in Wasser oder in einem wäßrigen Puffer wie Phosphat- oder Acetatpuffer umfassen. Vorzugsweise wird unlösliches Material auf herkömmliche Weise entfernt, z. B. durch Filtration oder Zentrifugation, bevor das Gemisch der Säurefällung unterzogen wird. Das Gemisch kann angesäuert werden durch den allmählichen Zusatz von organischer oder anorganischer Säure, vorzugsweise einer wäßrigen anorganischen Säure wie Chlorwasserstoffsäure, zur Reduzierung des pH-Wertes des Gemisches auf einen Wert zwischen 1,0 und 2,0, vorzugsweise 1,2 bis 1,8, spezieller auf einen pH von etwa 1,5. Ausgefälltes Material kann auf herkömmliche Art und Weise entfernt werden, zum Beispiel durch Filtration oder Zentrifugation. Es wurde festgestellt, daß die entstehende saure Rohchymopapainlösung in PPIV, Papain und, in einem geringeren Maße, PP III erschöpft wird.

Fachleute werden die Notwendigkeit erkennen, daß, bevor die saure Rohchymopapainlösung irgendwelchen weiteren Chromatographieschritten unterzogen wird, die Lösung mit einem alkalischen Reagens wie z.B. wäßrigem Natriumhydroxid neutralisiert wird und vorzugsweise überschüssige Salze auf herkömmliche Weise, z. B. durch Gelfiltration oder Dialyse, aus der Lösung entfernt werden. Jegliches weitere ausgefällte Material kann durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Auf dem Fachgebiet der Cysteinproteinasen ist es bekannt, daß die Aktivität solcher Enzyme durch Aktivierung mit einem Reduktionsmittel wie Dithiothreitol oder Cystein und durch die Entfernung von Spuren von Schwermetallen wie Quecksilber mit einem Chelatbildner wie EDTA oder einem chelatbildenden Harz wie dem unter dem Handelsnamen Chelex (Bio-Rad, Großbritannien) verkauften beträchtlich gesteigert werden kann. Solche Maßnahmen optimieren die Anwesenheit von freien Thiolgruppen, die bekanntlich wesentliche Merkmale der aktiven Zentren von Cysteinproteinasen darstellen und für die Aktivität erforderlich sind. Vorzugsweise wird die Entfernung von Schwermetallen durch Dialyse mittels eines EDTA-haltigen Puffers erzielt. Wo ein Kationenaustauschchromatographieschritt zum Einsatz kommt, können Schwermetalle als Alternative entfernt werden, indem das Chymopapain mit einem Reduktionsmittel aktiviert wird, während es an die Kationenaustauschsäule gebunden wird, und die Säule anschließend gewaschen wird.

Vorzugsweise wird die nach der Neutralisation gewonnene Rohchymopapainlösung mit einem Reduktionsmittel wie Cystein behandelt, um die maximale Exponierung aktiver Zentren sicherzustellen, und auf einen geeigneten Proteingehalt, zum Beispiel 30 mg/ml, verdünnt. Die neutralisierte Rohchymopapainlösung wird dann mit einer auf das aktive Zentrum gerichteten Affinitätschromatographiematrix inkubiert, so daß Chymopapain über das aktive Zentrum spezifisch an ein daran gebundenes inhibierendes Peptid gebunden wird. Chymopapainlösung kann mit einer Geschwindigkeit von beispielsweise 35 bis 40ml/h/ cm²aufeine Affinitätschromatographiematrixsäule gegeben werden. Pro Liter Affinitätschromatographiematrix können ungefähr 1 bis 4g Chymopapain gebunden werden.

Die Affinitätschromatographiematrix umfaßt eine Trägermatrix wie z. B. eine Gel- oder Membranmatrix, an die ein inhibierendes Peptid kovalent gekoppelt und dadurch immobilisiert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei der Trägermatrix um ein Agarosegel wie das unter dem Handelsnamen Sepharose® (Pharmacia) verkaufte, wenngleich derivatisierte Cellulosemembranmatrizen wie die unter dem Handelsnamen Zeta (Anachem) verkauften ebenfalls verwendet werden können. Das N-Ende des Peptids kann entweder direkt oder indirekt über einen Spacerarm, zum Beispiel einen neun Kohlenstoffatome umfassenden Spacerarm wie z. B. den durch eine bevorzugte, unter dem Handelsnamen ECH Sepharose^e4B (Pharmacia) verkaufte Gelmatrix bereitgestellten an die Trägermatrix gebunden werden. Die Kopplung zwischen den freien Carboxygruppen dieser Gelmatrix und den freien Aminogruppen des inhibierenden Peptids, die die Bildung von Peptidbindungen zur Folge hat, kann auf herkömmliche Weise erzielt werden, beispielsweise durch säurekatalysierte Kondensation, gefördert durch ein wasserlösliches Carbodiimid wie zum Beispiel N-Ethyl-N'-tö-dimethylammopropylicarbodiimidhydrochlorid (EDC). Im allgemeinen wird die Kopplung durch sanftes gemeinsames Rühren der Gelmatrix und einer Lösung des inhibierenden Peptids in Anwesenheit von EDC, zum Beispiel bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 24 Stunden, erreicht. Ein geeignetes Kopplungsverhältnis von Peptid zu Gelmatrix ist zum Beispiel 3 bis 4 g Peptid pro Liter Gel.

Die Affinitätschromatographiematrix kann vor der Verwendung in eine Säule vorgepackt werden. Wo es sich bei der verwendeten Chromatographiematrix jedoch um eine Gelmatrix handelt, ist es auch möglich, einen chargenweisen Inkubationsschritt anzuwenden und dann auf Wunsch die Matrix in eine Säule zur anschließenden Elution des Enzyms zu packen.

Vorzugsweise wird die Matrix vor dem Einsatz zur Entfernung von Spuren ungebundenen Peptids und Kondensationskatalysators gut mit wäßrigem Puffer gewaschen. Zum Einsatz in der Produktion sollte eine Affinitätschromatographiematrixsäule vorzugsweise Sanitation in situ, beispielsweise mit wäßrigem Ethanol, aushalten und somit wiederverwendbar sein.

Reversible Chymopapain inhibierende Peptide sind Peptide, die bei Immobilisierung auf einer Trägermatrix in der Lage sind, sich stärker an das aktive Zentrum von Chymopapain als an die aktiven Zentren anderer, in Rohchymopapainpräparaten gefundener Cysteinproteinasen, insbesondere PPIV, zu binden, die aber anschließend daraus verdrängt werden können. Bei einer bevorzugten Gruppe inhibierender Peptide umfaßt die C-terminale Aminosäure ein Aldehydderivat wie Semicarbazon, Methoxyimin oder Oxim von Phenylalanin oder ein Phenylalaninanalogon. Insbesondere kann die C-terminale Aminosäure ein Phenylanalinderivat wie D- oder L-Phenylalaninsemicarbazon (PheSc), -methoxyimin (PheMo) oder -oxim (PheOx) oder ein Phenylalaninanalogonderivat wie D- oder L-Alaninsemicarbazon (AIaSc), D- oder L-Cyclohexylalaninsemicarbazon (ChaSc) oder D- oder L-Leucinsemicarbazon (LeuSc) sein. Folgende C-terminale Dipeptide haben sich als vorteilhafte Chymopapain inhibierende Peptide erwiesen, und zwar: L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc und L-Ala-L-LeuSc. Das Dipeptid L-Phe-L-PheSc ist von Luaces und Barrett (1988),

250,903-909, beschrieben worden. Besonders bevorzugte Peptide sind Dipeptide, speziell L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc und L-Phe-O-PheSc. Die neuartigen inhibierenden Peptide an sich und neuartige Affinitätschromatographiematrizen, die diese Peptide enthalten, bilden weitere Aspekte der Erfindung.

Vor der Elution von Chymopapain aus der Affinitätschromatographiematrix wird die Matrix vorzugsweise gewaschen, um nichtspezifisch gebundenes Material zu entfernen, beispielsweise mit einem wäßrigen Puffer wie Citrat- oder Acetatpuffer von pH4 bis 5. Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, dem Waschpuffer und dem Elutionspuffer Reagenzien zuzusetzen, die hydrophobe Wechselwirkungen und andere nichtspezifische Bindungsreaktionen zwischen der Matrix und den Rohchymopapainkomponenten reduzieren. Zu solchen Reagenzien zählen beispielsweise EDTA, Isopropanol und Ethandiol. Das Chymopapain kann dann mit einem geeigneten Elutionsmittel aus der Matrix eluiert werden. Geeignete Elutionsmittel zerstören die Bindung zwischen dem immobilisierten inhibierenden Peptid und dem daran gebundenen Chymopapain, und zwar entweder durch Reduzierung der Affinität des aktiven Zentrums für das inhibierende Peptid oder durch selektive Verdrängung des Peptide vom aktiven Zentrum. Die Affinität von Chymopapain für das inhibierende Peptid kann reduziert werden, indem zum Beispiel die Charakteristika des aktiven Zentrums mit einem Denaturierungsmittel wie Isopropanol oder mit einem Elutionsmittel mit einem pH-Wert über oder unter dem aktiven pH-Bereich von Chymopapain verändert werden. Fachleuten wird jedoch klar sein, daß solche Elutionsmittel so beschaffen sein müssen, daß keine irreversible Inaktivierung des eluierten Enzyms erfolgt. Alternativ kann Chymopapain durch ein Elutionsmittel, das einen Überschuß einer Komponente umfaßt, die sich fest an das inhibierende Peptid bindet, beispielsweise eine weitere Cysteinproteinase, selektiv von dem immobilisierten inhibierenden Peptid verdrängt werden.

Nach einem bevorzugten Aspekt der Erfindung umfaßt das Elutionsmittel jedoch einen reversiblen Cysteinproteinaseinhibitor, der sich kompetitiv an das aktive Zentrum von Chymopapain bindet und es so von dem immobilisierten inhibierenden Peptid verdrängt. Herkömmliche Inhibitoren schließen zum Beispiel Disulfide von geringer relativer Molekülmasse, wie zum Beispiel 2,2'-Dipyridyldisulfid, Hydroxyethyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid und Natriumtetrathionat, und Quecksilberreagenzien, wie zum Beispiel Quecksilberdichlorid, p-Chlormercuribenzoat und Mersalyl, ein. Fachleute werden erkennen, daß die Affinität zwischen Chymopapain und dem immobilisierten inhibierenden Peptid je nach dem verwendeten speziellen Peptid, dem pH, der lonenstärke und der Zusammensetzung des Elutionspuffers und der angewendeten Temperatur differieren wird. Dementsprechend werden auch die genaue Beschaffenheit und Konzentration des zur Elution von Chymopapain erforderlichen Proteinaseinhibitors variieren. Außerdem equilibrieren Quecksilberreagenzien im allgemeinen schneller mit dem gebundenen Chymopapain als Disulfidreagenzien, und mit solchen Inhibitoren läßt sich die Elution kontinuierlich durchführen. Inhibitoren, die mit dem gebundenen Chymopapain nur langsam equilibrieren, können Inkubation der Matrix mit dem Inhibitor erfordern, z. B. über einen Zeitraum von 1 bis 2 Stunden oder mehr, vor der Elution des Chymopapains. Proteingehalt und Proteinaseaktivität der eluierten Fraktionen können aber routinemäßig überwacht werden, und die lonenstärke oder Beschaffenheit des Elutionsmittels und die Inkubationszeit der Matrix mit dem Inhibitor können variiert werden, um Chymopapain wirksam und selektiv aus der Matrix zu verdrängen. Eluierte Fraktionen, die niedrige Proteinmengen oder geringe Chymopapainaktivität besitzen, können dann verworfen werden.

Der pH-Wert des Elutionsmittels ist vorzugsweise ausreichend niedrig, um die Wechselwirkung zwischen Chymopapain und dem inhibierenden Peptid zu schwächen, zum Beispiel pH4 bis 5, spezieller pH4,5, Zu geeigneten Elutionsmitteln zählen erwiesenermaßen beispielsweise Hydroxyethyldisulfid (10OmM) in wäßrigem Ethandiol (33%ig) mit Gehalt an Natriumeitrat (5OmM) und EDTAd mM),pH4,5; Dipyridyldisulfid (3OmM) in wäßrigem Ethandiol (33%ig) mit Gehalt an Natriumeitrat (5OmM) und EDTA (1 mM), pH4,5; Mersalylsäure (1OmM) in wäßrigem Ethandiol (33%ig) mit Gehalt an Natriumhydroxid (5OmM) und EDTA (25mM), eingestellt auf pH4,5 mit Essigsäure; und Quecksilberdichlorid (1OmM) in wäßrigem Ethandiol (33%ig) mit Gehalt an Natriumacetat (5OmM), pH4,5. Quecksilberdichlorid ist ein besonders bevorzugter reversibler Cysteinproteinaseinhibitor.

Der Affinitätschromatographieschritt bei dem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren erhöht die spezifische Aktivität des dadurch gereinigten Chymopapains beträchtlich, und zwar gemessen als Aktivität gegen BAPNA oder durch Aktivzentrum-Titration mit E-64 oder lodessigsäure. Die aktive Form von Chymopapain ist vorzugsweise gebunden und eluiert und unterscheidet sich somit von inaktiven Formen von Chymopapain und von anderen im Rohpräparat vorhandenen Cysteinproteinasen. Frisch hergestelltes, durch Affinitätschromatographie gereinigtes erfindungsgemäßes Chymopapain enthält im allgemeinen mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, spezieller mindestens 90% aktives Enzym. Im allgemeinen wird gereinigtes Chymopapain vor der Lagerung oder Verwendung aus dem Eluat rückgewonnen. Vorzugsweise wird das eluierte Chymopapain weiter gereinigt, um den Cysteinproteinaseinhibitor aus dem aktiven Zentrum des Enzyms zu verdrängen. Der Inhibitor kann durch den Zusatz eines Überschusses an Reduktionsmittel wie Cystein und wahlweise, wenn gewünscht, Entfernen des verdrängten Inhibitors mit herkömmlichen Techniken wie Gelfiltration oder Dialyse verdrängt werden. Alternativ kann der Inhibitor durch Adsorption an ein spezifisches Harz entfernt werden, beispielsweise können Disulfide mit geringer relativer Molekülmasse an eine Glutathionaffinitätssäule adsorbiert werden, und Quecksilberreagenzien können an ein chelatbildendes Harz adsorbiert werden. Vorzugsweise wird der Inhibitor durch Akktivierung des Enzyms mit einem Reduktionsmittel wie Cystein während seiner Bindung an eine Kationenaustauschsäule und anschließendes Auswaschen des Inhibitors aus der Säule entfernt. Rückgewonnenes gereinigtes Chymopapain wird vorzugsweise vor der Lagerung, beispielsweise durch Gefriertrocknen, lyophilisiert.

Erfindungsgemäßes Chymopapain kann ferner durch in Fachkreisen bekannte Verfahren charakterisiert werden. Solche Verfahren schließen zum Beispiel Analyse mit N-terminaler Aminosäure, Aktivzentrum-Titration mit E-64 oder lodessigsäure und Inaktivierungsgeschwindigkeiten damit, Natriumdodecylsulfat- oder Mehrzonen-Kathoden-Polyacrylamidgelelektrophorese und Aktivität gegen verschiedene Proteinasesubstrate ein.

Die neuartigen erfindungsgemäßen inhibierenden Peptide können auf eine Weise hergestellt werden, die im Fachgebiet bekannten Verfahren analog ist. Beispielsweise können die Dipeptidderivate in einer Reihe von Stufen wie folgt synthetisiert werden:

a) Das C-Ende der Aminosäure, welches das C-Ende des inhibierenden Peptids (erste Aminosäure) bilden soll, kann geschützt werden, beispielsweise durch Reaktion mit Ο,Ν-Dimethylhydroxylaminhydrochlorid in Anwesenheit von Isobutylchlorameisensäureester und N-Methylmorpholin zur Bildung eines Dimethylhydroxyamidderivats. Vorzugsweise wird das N-Ende der ersten Aminosäure anfänglich mit z. B. tertiärem Butoxycarbonyl geschützt.

b) Die geschützte erste Aminosäure, ζ. B. ein Dimethylhydroxyamidderivat, kann dann mit einer starken Säure, zum Beispiel Trifluoressigsäure, umgesetzt werden, um ein quaternäres Ammoniumsalz zu bilden.

c) Das quaternäre Ammoniumsalz der geschützten ersten Aminosäure kann dann mit einem zweiten Aminosäurederivat, zum Beispiel einem N-Carbobenzoxyderivat, umgesetzt werden, um ein Dipeptidderivat zu bilden.

d) Das oben gebildete Dipeptidderivat kann mit einem milden Reduktionsmittel, zum Beispiel Diisobutylaluminiumhydrid oder Lithiumaluminiumhydrid reduziert werden, um am C-Ende des Dipeptids eine freie Aldehydgruppe zu erzeugen.

e) Das oben gebildete Aldehyd kann derivatisiert werden, zum Beispiel zu einem Semicarbazon durch Umsetzung mit Semicarbazid, zu einem Methoxyimin durch Umsetzung mit Methoxyaminhydrochlorid oder zu einem Oxim durch Umsetzung mit Hydroxylamin.

f) Schließlich kann von dem geschützten N-Ende der Schutz entfernt werden (deprotected), beispielsweise kann eine N-Carbobenzoxygruppe durch katalytische Reduktion unter Verwendung von 10% Palladium auf Holzkohle entfernt werden.

Beschreibung analytischer Verfahren Proteinbestimmung

Wo möglich, wurde die Proteinkonzentration durch A₂₈₀ unter Einsatz von A₂eo, 1% = 20,0 für Papayalatexpräparate und A28o,i% = 18,3 für gereinigte oder teilweise gereinigte Chymopräparate bestimmt (Robinson, 1975, Biochemistry 14,3695-3700). Bestimmte thiohaltige Reagenzien und Disulfide neigen zu Absorption bei 280nm. Waren diese anwesend, wurde der Bio-Rad-Farbbindungsassay (Bio-Rad Laboratories, Großbritannien) zur Bestimmung der Proteinkonzentration angewendet. Filtrierte, im Sprühverfahren getrocknete Papayalatexlösungen (A₂₈o,i% = 20,0) wurden als Standards benutzt. Diese Methode ist weniger empfänglich für Interferenz als A₂₈₀. In gereinigten Enzympräparaten wurde Protein anhand der Gesamttrockenmasse des Produktes eingeschätzt.

Bestimmung der Chymopapainaktivität

a) Aktivität gegen BAPNA (Analysemethode Nr. 1) - Smith-Assay

Jede Probe wurde in „Puffer 1", wäßrigem Natriumphosphatpuffer (0,1 M), pH6,0, mit Gehalt an EDTA (1 mM) und Cysteinhydrochloridmonohydrat (1OmM) bis zu einem Endvolumen von 1,0 ml hinzugegeben. Man ließ dem Enzym (wenn in der Probe vorhanden) 5 Minuten Zeit zur Aktivierung bei 37⁰C, bevor die Reaktion durch den Zusatz von 4 ml Substratlösung von N-a-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) (1,25mM), die vorher auf 37°C vorgewärmt worden war, gestartet wurde. Anmerkung: Substratlösung wurde hergestellt durch Lösen von 300mg BAPNA in warmem Dimethylsulfoxid, langsames Zusetzen der Lösung zu 450 ml auf 37^CC vorgewärmter Puffer 1 und anschließendes Auffüllen auf 500 ml mit weiterem Puffer 1. Die Substratlösung wurde zur Verhinderung der BAPNA-Ausfällung bei über 30⁰C gehalten.

Die Inkubation bei 37°C wurde 30 Minuten lang fortgesetzt und die Reaktion dann durch Zusatz von 1 ml Essigsäure (4N) gestoppt. Freigesetztes 4-Nitroanilin wurde durch Messung von AA₄₁₀ bestimmt. Eine Einheit Aktivität entsprach unter diesen Bedingungen der Freisetzung von 1 Picomol 4-Nitroanilin (ε = 8800M"¹ · cm"¹) pro Sekunde.

Diese Analysebedingungen entsprechen denen, auf die in GB 2098997 bezug genommen wird, das im Namen der Smith Laboratories Inc. angemeldet wurde, und sie werden angewendet, um pharmazeutische Chymopapainpräparate, die in der ganzen Welt gehandelt werden, zu analysieren, zum Beispiel handelt es sich dabei um Chymopapain, das von der The Boots Company PLC, Großbritannien, unter dem Handelsnamen Chymodiactin verkauft wird, und um Chymopapain, das unter dem Handelsnamen Disken von Sinpoong in Südkorea verkauft wird. Diese Aktivitätseinheiten sind international anerkannt und werden gewöhnlich als „Smith BAPNA Assay Units" (Smith-BAPNA-Analyseeinheiten) bezeichnet.

b) Aktivität gegen BAPNA (Analysemethode Nr. 2)

Jede Probe wurde zu wäßrigem Natriumphosphatpuffer (0,10 M), pH 6,8, mit Gehalt an EDTA(I mM) und entweder Dithiothreitol (2 mM) oder Cystein (4 mM) bis zu einem Endvolumen von 0,975ml zugesetzt. Man ließ dem Enzym (wo in der Probe vorhanden) 5 Minuten Zeit zur Aktivierung bei 40⁰C, bevor die Reaktion durch den Zusatz von 25μΙ Ν-α-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid (ΒΑΡΝΑ) (10OmM) in Dimethylsulfoxid gestartet wurde. Die Inkubation bei 40°C wurde 10 Minuten fortgesetzt, und danach wurde die Reaktion durch Zusatz von 1 ml wäßrigem Natriumchloracetat (0,10M)/Natriumacetat (O,2OM)-Puffer, pH4,3, gestoppt. Freigesetztes 4-Nitroanilin wurde durch Messung von AA₄₁₀ bestimmt. Eine Einheit Aktivität entsprach unter diesen Bedingungen der Freisetzung von 1 Picomol 4-Nitroanilin (ε = 8800M"¹ cm"¹) pro Sekunde.

Diese Analysebedingungen entsprechen exakt den von Buttle & Barrett (1984) am oben angeführten Ort beschriebenen und wurden bei Vorversuchen angewendet, die in den Beispielen 21,23 und 26 beschrieben sind.

Die mit den BAPNA-Analysemethoden 1 und 2 für die Chymopapainaktivität gewonnenen absoluten Werte differieren, und zwar sind die mit Methode Nr. 2 gewonnenen Werte ungefähr zwei- bis dreimal höher als die mit Methode Nr. 1 erhaltenen Werte (siehe Beispiel 31).

c) Aktivzentrum-Titration mit lodessigsiure

Die Aktivzentrum-Titration von Chymopapain mit lodessigsäure wurde auf eine der von Zucker et al. in Biochem. Biophys. Act a 828 (1985), 196-204), beschriebenen Aktivzentrum-Titration mit E-64 analoge Weise durchgeführt. Die Chymopapainlösung wurde in Puffer 1 gemäß der Beschreibung in (a) oben verdünnt, so daß eine Lösung mit einem Gehalt von 60 μΜ Protein entstand (ε₂₈₀ = 4,3284 · 10⁴M^-1Cm"¹, berechnet aus A₂₈o.i% = 18/3, Robinson [1975], am oben angeführten Ort, und MW [relative Molekülmasse] = 23656, berechnet aus der Aminosäuresequenz von Jaquet et al. (Mai 1989], Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 370,425-434). 20^I-Aliquoten Chymopapainlösung wurden in Titrationsröhrchen gebracht und 5 Minuten bei 37°C mit 20μΙ Puffer 1 (40 μΙ in der Kontrolle) inkubiert.

20 μΙ wäßrige lodessigsäure (10,20,30,40,50 bzw. 60 μΜ) wurden in jedes Titrationsröhrchen gegeben, und das Gemisch wurde 10 bis 20 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 4ml BAPNA-Substratlösung, wie oben in (a) beschrieben, die auf 37°C vorgewärmt worden war, gestartet. Die Inkubation wurde bei 37°C fortgesetzt und die Reaktion nach

30 Minuten, wie oben in (a) beschrieben, gestoppt, und freigesetztes 4-Nitroanilin wurde durch AA₄₁₀ bestimmt. Die Molarität von so gewonnenem aktivem Chymopapain wurde mit der Molarität von Protein auf der Basis eines molaren Extinktionskoeffizienten von 4,3284 10⁴M-¹Cm¹ für Chymopapain verglichen. Die Menge an aktivem Protein wurde dann als Prozentsatz des Gesamtproteins ausgedrückt.

d) Aktivität gegen Azocasein

Die Aktivität gegen Azocasein wurde durch die vorher von Rowan et al., (1988), Arch. Biochem. Biophys. 267,262-270 beschriebene Methode unter Verwendung von weniger als 1 μΜ Enzym (auf der Basis einer relativen Molekülmasse von 24000) und, wo gewünscht, 1 μΜ Hühnercystatin bestimmt. Alle Konzentrationen von Enzymen und Inhibitor beziehen sich auf die Konzentration aktiver Moleküle.

Immunologische Untersuchung durch einfache radiale Immunodiffusion

Einfache radiale Immunodiffusionsassays wurden auf der Basis der Methode von Mancini et al., 1965, Immunochem. 2,235-254, wie folgt ausgeführt. Agarose (1 % Masse/Vol.) in wäßrigem Natriumphosphat (1OmM) mit NaCI-Gehalt (0,14M), pH 7,3, mit Gehalt an einem monospezifischen IgG-Präparat wurde auf Gel Bond⁰ (FMC Corporation, Maine, USA) gegossen, und ein rechteckiges Muster von Vertiefungen (r = 1 mm) mit einem Abstand von 1,5cm wurde geschnitten. Die Bezugsprobe und unbekannte Proben wurden willkürlich auf die Vertiefungen verteilt, um Fehler aufgrund von Kanteneffekten zu vermeiden. Nach dem Aufbringen des Antigens auf die Vertiefungen wurden die Platten 24 Stunden stehen gelassen, damit sich die Präzipitinringe entwickeln konnten. Sie wurden dann gewaschen, getrocknet und angefärbt. Reines, schonend carboxymethyliertes Antigen wurde zur Erzeugung von Standardkurven verwendet, wobei das Antigen als Funktion des Quadrates des Ringdurchmessers dargestellt wurde. Der brauchbare Bereich des Assays war 25 bis 300 ng Antigen pro Vertiefung.

Präparation von PPIV und Antikörpern dazu

a) Herstellung der Affinitätssäule

Butyloxycarbonyl-L-Phe-p-nitrophenylester (10 mmol) wurde zu einem gerührten Gemisch aus Ci-NHiCH₂CN · HCI (20 mmol) und Diisopropylethylamin (20 mmol) in Dimethylformamid (20ml) gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 20⁰C gerührt und dann mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt, mit Wasser (2x), wäßrigem Triethylamin (5x), Wasser (3x), wäßrigem Natriumhydrogensulfat (2x), Wasser (3x) gewaschen, getrocknet und eingedampft.

Der Rückstand wurde aus Ethylacetat:Hexan auskristallisiert, wobei sich Boc-L-Phe-NHCH₂CN, Schmelzpunkt 134,5-135°C ergab.

Eiskalte wäßrige Trifluoressigsäure (10 ml) wurde zu einer Lösung von BoC-L-NHCH₂CN (5 mmol) in Dichlormethan (10ml) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 20°C inkubiert, und dann wurde das Lösungsmittel durch Verdampfen bei 40⁰C entfernt. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst, eingedampft, und die Verfahrensweise zweimal wiederholt. Das entstandene rohe Trifluoracetatsalz wurde in einer Lösung von Diisopropylethylamin (7,5 mmol) in Dimethylformamid (10ml)gelöst,undBoc-p-nitrophenylester(6,25 mmol)und N-Hydroxybenzotriazolmonohydrat(6,25 mmol) wurden zugesetzt. Anschließend wurde genügend Diisopropylethylamin tropfenweise zugegeben, um p-Nitrophenol (goldfarben) zu erzeugen, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurden N,N-Diethylethylendiamin (1,5 ml) und nach 15 Minuten Ethylacetat (60ml) zugesetzt, und das Gemisch wurde mit Wasser, wäßrigem Triethylamin, Wasser, wäßrigem Kaliumhydrogensulfat, Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf Silicamaterial, das mit Ethylacetat:Hexan (20:1) eluiert wurde, gereinigt, wobei Boc-Gly-L-Phe-NHCH₂CN in Form eines Schaumes entstand.

BoC-GIy-L-PrIe-NHCH₂CN (30mg) wurde in Trifluoressigsäure:Dichlormethan:Anisol (25:65:10,1 ml) gelöst und 30 Minuten bei 0°C inkubiert. Das Gemisch wurde durch Rotationsverdampfung bei 34°C getrocknet, und der Rückstand wurde in Methanol (1,5 ml) und wäßrigem NaHCO₃ (0,1 M, pH 8,0,1,5 ml) gelöst, wobei die Ligandenlösung entstand.

Aktivierte CH-Sepharose®4B (Pharmacia; 3 g Trockenmasse) wurde über Nacht in wäßriger Chlorwasserstoffsäure (1 mM,75ml) bei 4°C hydratisiert und dann mit Chlorwasserstoffsäure (1 mM, 600ml) und anschließend mit wäßrigem NaHCO₃ (0,1 M, pH 8,0, 300 ml) gewaschen. Das Gel wurde in wäßrigem NaHCO₃ (0,1 M, pH 8,0,30 ml) suspendiert, die Ligandenlösung (oben) wurde zugesetzt und das Gemisch über Nacht bei 2O⁰C schonend gerührt. Das Gel wurde auf einem Glasfilter gesammelt, mit wäßrigem Methanol (50% Vol./Vol., 180ml) und dann mitWasser (180ml)gewaschen und in wäßrigem Ethanolamin (0,1 M, 30ml), das mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 9,0 eingestellt war, suspendiert. Die Suspension wurde 4 Stunden lang bei 2O⁰C geschüttelt und das Gel anschließend gesammelt, mit Wasser (500ml) gewaschen und in „Applikations"-Puffer (Natriumphosphat [5OmM]; EDTA Ц mM]; Ethandiol [33%], ρ 6,8) bei 4°C aufbewahrt.

b) Reinigung von PPIV

Eine Säule (Bettvolumen 4ml) aus Sepharose^e-Ahx-Gly-L-Phe-NCH₂CN wurde mit „Elutions"-Puffer (Natriumeitrat [5OmMl; Ethandiol [33%], pH 4,5; 12 ml) und anschließend Applikationspuffer (siehe oben, 12 ml) gewaschen.

Im Sprühverfahren getrockneter Papayalatex (0,5g) wurde in Applikationspuffer (10ml) gelöst und filtriert (0,22-μιη-ΡθΓβη). Die Proteinkonzentration des Filtrats wurde mit dem Bio-Rad Farbbindungsassay (Bio-Rad Laboratories, Großbritannien) bestimmt. Dem Gemisch wurde Dithiothreitol bis zu einer Endkonzentration von 2mM zugesetzt, und das Gemisch wurde 20 Minuten bei O⁰C inkubiert. 80 mg des Latexproteins wurden auf die Säule (38ml/Stunde/cm²) bei einer Temperatur von 20°C gebracht, danach Applikationspuffer (8ml) und anschließend Elutionspuffer (8ml). Dann wurde Elutionspuffer (4ml) mit Hydroxyethyldisulfidgehalt (5OmM) angewendet, der Durchfluß gestoppt und die Säule über Nacht bei 20⁰C stehen gelassen. Die Elution mit hydroxyethyldisulfidhaltigem Elutionspuffer wurde danach wieder aufgenommen (10 ml), und die eluierten Fraktionen (1 ml) wurden gesammelt. Fraktionen mit Aktivität gegen BAPNA wurden gepoolt und direkt auf eine Menge S HR ⁵/5®-(Kationenaustausch)-Säule gebracht, die mit wäßrigem Natriumacetat/Essigsäure (5OmM), pH 5,0, mit EDTA-Gehalt (1 mM) voräquilibriert worden war, dann wurde die Säule mit dem gleichen Puffer (1 ml/min) gewaschen, bis A₂₈onm auf Null zurückging. Ein Gradient (21,5mM NaVmI) bis 1M Natriumacetat wurde dann auf die Säule (Buttle und Barrett, 1984, am

angeführten Ort) angewendet, und Fraktionen (1 ml) wurden gesammelt. Zwei Hauptpeaks wurden eluiert, wobei der erste Peak mit Elution bei etwa 0,17 M Na⁺ dem Papain entsprach und der zweite Peak mit Elution bei etwa 0.38M Na⁺ PPIV entsprach. Die PPIV-Peakfraktionen wurden gepoolt, mittels wäßrigem EDTA (1 mM) dialysiert, gefriergetrocknet und bei -20⁰C gelagert. Reines PPIV hatte keine nachweisbare Aktivität gegen BAPNA, war aber mit Azocasein digerierender Aktivität assoziiert, die nicht durch Hühnercystatin bei einer Konzentration von 1 μΜ inhibiert wurde.

c) Herstellung von PPIV-spezifischen Antikörpern

Reines PPIV-Antigen wurde vor der Verwendung nach der von Zucker et al., 1985, Biochim. Biophys. Acta, 828,196-204, beschriebenen Methode schonend carboxymethyliert. Das Antiserum gegenüber PPIV wurde dann in einem Kaninchen durch intramuskuläre Injektion von 360 цд carboxymethyliertem Protein in komplettem Freundschen Adjuvans, worauf sich nach 14 Tagen eine subkulante Injektion von 100 цд in inkomplettem Adjuvans anschloß, gebildet. IgG wurde aus den Antiseren teilgereinigt durch Ammoniumsulfatfraktionierung gemäß der Beschreibung von Heide und Schwick (1978) im Handbook of Experimental Immunology (Handbuch der Experimentellen Immunologie) (Weir, D. M., Hrsg.), Bd. 1,7.1-7.11, Blackwell,Oxford, woran sich Dialyse in wäßrigen Natriumphosphat (1OmM) mit NaCI-Gehalt (0,14M), pH 7,3, anschloß.

Das PPIV-spezifische IgG-Präparat wurde zur Untersuchung von PPIV durch einfache radiale Immunodiffusion gemäß vorstehender Beschreibung verwendet.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele sollen die Aspekte der Erfindung lediglich deutlicher veranschaulichen und sollten in keiner Weise als Einschränkung des Geltungsbereiches der Erfindung angesehen werden.

Zu den hier verwendeten Abkürzungen zählen: ABTS, 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure); Ahx, 6-Aminohexanoyl; AIa, Alanin; BAPNA, N-a-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid; Boc, Butyloxycarbonyl; CBZ, Carbobenzoxy; Cha, Cyclohexalalanin; DMF, Ν,Ν-Dimethylformamid; E-64, L-3-Carboxy-2,3-trans-epoxyproprionylleucylamido-(4-guanidino) butan; EDC, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyDcarbodiimidhydrochlorid; EDTA, Ethylendiamintetraessigsäure (Dinatriumsalz); GIy, Glycin; Leu, Leucin; Mo, Methoxyimin; OBZ Oxybenzyl; Ox, Oxim; Phe, Phenylalanin; S, Semicarbazon; THF, Tetrahydrofuran; und Tyr, Tyrosin.

Bio-Rad, Chelx, Chymodiactin, Ch-Sepharose 48, Chymofast, Disken, ECH-Sepharose, Enzfitter, FPLC, Gel Bond, Mono S HR, S-Sepharose HP, Tween, Zeta und Zetaffinity sind Handelsnamen.

Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1 - L-Alanyl-L-phenylanylsemicarbazon

Stufe a

A) Ο,Ν-Dimethylhydroxylamin-HCL (10,23g) wurde unter Rühren zu trockenem N,N-Dimethylformamid (DMF) (100 ml) bei Raumtemperatur hinzugegeben. N-Methylmorpholin (10,6g) wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur unter 30°C gehalten wurde. Es bildete sich ein weißes Präzipitat, und das Gemisch wurde auf 0⁰C abgekühlt.

B) N-t-Boc-L-Phe (26,5g) wurde introckenem Tetrahydrofuran (THF) (200ml) gelöst und auf -1O⁰C abgekühlt. Isobutylchlorameisensäureester (14,38g) wurde der Lösung im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur bei -10"C gehalten wurde. N-Methylmorpholin (10,6g) wurde über einen Zeitraum von 10 Minuten zugesetzt, während die Temperatur bei -10°C gehalten wurde, und das Rühren weitere 10 Minuten fortgesetzt.

C) Suspension A wurde im Verlaufe von 15 Minuten bei -1O⁰C zu Suspension B gegeben. Man ließ das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen, und dann wurde es 3 Stunden gerührt. Das entstandene Gemisch wurde dann auf O⁰C abgekühlt, und 3-Dimethylaminopropylamin (10,2g) wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten zugesetzt. Wasser (200ml) und Ethylacetat (200 ml) wurden zugesetzt, und die organische Oberschicht wurde abgetrennt und nacheinander gewaschen mit (a) Wasser (200ml), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 200ml), (c) wäßriger HCI (0,5N, 200ml) und (d) Wasser (3 χ 200ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30°C gehalten wurde, so daß N-t-Boc-L-Phe-0,N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe b

N-t-Boc-L-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat (2,9g) und Trifluoressigsäure (8ml) wurden zusammen bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt. Überschüssige Trifluoressigsäure wurde dann durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30°C gehalten wurde. Diethylether (30 ml) wurde zu dem Rückstand gegeben, um eine Lösung herzustellen, und danach wurde der Ether unter Vakuum entfernt. Die Etherbehandlung wurde wiederholt, bis Kristallisation erfolgte. Der Feststoff wurde durch Filtration entfernt, mit Ether gewaschen und dann über P₂Os vakuumgetrocknet, wobei das Trifluoracetatsalz von L-Phe-0,N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe с

A) Trifluoracetatsalz von L-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat (7,15g) wurde unter Rühren bei Raumtemperatur in trockenem DMF (30ml) gelöst. N-Methylmorpholin (2,35g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur unter 3O⁰C gehalten wurde, und das entstehende Gemisch wurde auf O⁰C abgekühlt.

B) CBZ-L-AIa (4,96g) wurde unter Rühren in trockenem THF (55ml) gelöst, und das Gemisch wurde auf -10⁰C abgekühlt. Isobutylchlorameisenäsureester (3,05g) wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten bei— 10⁰C zugesetzt, N-Methylmorpholin (2,35g) über einen Zeitraum von 10 Minuten zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde bei -10⁰C weitere 10 Minuten lang gerührt.

C) Lösung A wurde Lösung B über einen 15minütigen Zeitraum bei -1O⁰C zugesetzt, und dann ließ man die Temperatur des Gemisches auf Raumtemperatur ansteigen, und es wu rde3 Minuten lang weitergeführt. Das Gemisch wurde auf 0⁰C abgekühlt, 3-Dimethylaminopropylamin (2,27g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt und das Rühren weitere 5 Minuten fortgesetzt. Wasser (50ml) und Ethylacetat (50ml) wurden dann zugegeben, die obere organische Phase wurde abgetrennt und nacheinander gewaschen mit (a) Wasser (50ml) und gesättigtem wäßrigem NaCI (5ml), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 50ml), (c) wäßriger HCI (0,5N, 50ml) und (d) Wasser (3 x 50ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 3O⁰Cgehalten wurde. Frisches Ethylacetat (50ml) wurde zugesetzt und dann durch Verdampfung entfernt, wobei CBZ-L-Ala-L-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe d

CBZ-L-Ala-L-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat (27,8g) wurde in trockenem THF (280ml) gelöst und unter N₂ auf -70⁰C abgekühlt. Diisobutylaluminiumhydrid in THF (1M, 372 ml) wurde unter N₂ über einen Zeitraum von 60 Minuten bei -70⁰C zugesetzt, und es wurde über einen Zeitraum von weiteren 60 Minuten bei —70"C weitergerührt. Die Reaktion wurde unter Rühren bei OX unter N₂ in gesättigtem wäßrigem NaCI (400ml) und Rochellsalzlösung (600ml) abgeschreckt, und anschließend ließ man das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen. Ethylacetat (600 ml) wurde zugesetzt, das Gemisch filtriert, und die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und mit Ethylacetat (200 ml) extrahiert. Die zusammengenommenen organischen Phasen wurden mit Wasser (600ml)/gesättigtem wäßrigem NaCI (400 ml) (x3) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde. Der Rückstand wurde aus Toluen wieder auskristallisiert, und der Feststoff wurde über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei CBZ-L-Ala-L-Phe-Aldehyd entstand.

Stufe e

A) CBZ-L-Ala-L-Phe-Aldehyd (3g) wurde in vergälltem Industriealkohol (industrial methylated spirit) (20ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 50°C erhitzt und zur Entfernung von unlöslichen Substanzen filtriert.

B) Eine Lösung von Semicarbazid-HCI (1,3g) in Wasser (10 ml) wurde zu einer Lösung von KHCO₃ (1,1 g) in Wasser (10ml) gegeben.

C) Lösung B wurde zu Lösung A gegeben, und das entstandene Gemisch wurde 2 Stunden bei 50°C gerührt. Ethylacetat (50 ml) und Wasser (100 ml) wurden zugesetzt, die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und mit Ethylacetat (2 χ 20 ml) extrahiert, und die zusammengenommenen organischen Phasen wurden nacheinander mit (a) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 50ml); (b) wäßriger HCI (0,5N, 50ml) und (c) Wasser/gesättigtes wäßriges NaCI (50ml/20ml χ 3) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30"C gehalten wurde, so daß CBZ-L-Ala-L-PheSc entstand.

Stufe f

CBZ-L-Ala-L-PheSc (680mg) wurde in Methanol (90ml) gelöst, und die unlöslichen Substanzen wurden durch Filtration entfernt. Die die methanolische Lösung von CBZ-L-Ala-L-PheSc enthaltende Apparatur wurde mit N₂ gespült, und der Katalysator, 10% Palladium auf Holzkohle (100mg), wurde zugesetzt. H₂ wurde 75 Minuten lang in das geschlossene System geleitet. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt, und das Methanol wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30°C gehalten wurde. Der Rückstand kristallisierte beim Stehen aus, und der Feststoff wurde über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei L-Alanyl-L-phenylalanylsemicarbazon entstand (L-Ala-L-PheSc).

Beispiel 2- L-Phenylalanyl-L-phenylalanylsemicarbazon

Stufen a und b

Das Trifluoracetatsalz von L-Phe-0,N-Dimethylhydroxamat wurde in Übereinstimmung mit den Stufend und b von Beispiel 1 hergestellt.

Stufe с

A) Trifluoracetatsalz von L-Phe-O,N-Dimethylhydroxamat (1,932g) wurde in trockenem DMF (8ml) unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst.

N-Methylmorpholin (0,606g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde, und das entstehende Gemisch wurde auf O⁰C abgekühlt.

B) CBZ-L-Phe (1,794g) wurde in trockenem THF (15ml) unter Rühren gelöst, und das Gemisch wurde auf -10⁰C abgekühlt Isobutylchlorameisensäureester (0,822g) wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten bei -10°C zugesetzt, N-Methylmorpholin (0,606g) wurde über einen Zeitraum von 10 Minuten zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde weitere 10 Minuten bei -10°C gerührt.

C) Lösung A wurde im Verlaufe von 15 Minuten bei -1O⁰C zu Lösung B gegeben, und anschließend ließ man die Temperatur des Gemisches auf Raumtemperatur ansteigen, und es wurde weitere 3 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde auf 0⁰C abgekühlt, 3-Dimethylaminopropylamin (0,612g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, und es wurde weitere 5 Minuten lang gerührt. Wasser (20 ml) und Ethylacetat (30 ml) wurden anschließend zugegeben, die organische Phase wurde abgetrennt und nacheinander gewaschen mit (a) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 20 ml), (b) wäßriger HCI (0,5 N, 20 ml) und (c) Wasser (2 x 30 ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 35⁰C gehalten wurde, und der Rückstand wurde aus Isopropylalkohol wieder auskristallisiert, wobei CBZ-L-Phe-L-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe d

CBZ-L-Phe-L-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat (4,89g) wurde in trockenem THF (40ml) gelöst. Ein trockener Kolben wurde mit Lithiumaluminiumhydrid (0,493g) gefüllt, trockenes THF (20 ml) wurde unter N₂ zugesetzt, und es wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, bevor auf -50⁰C abgekühlt wurde. Die Lösung von Hydroxamat in trockenem THF wurde dann im Verlaufe von 10 Minuten bei -5O⁰C unter N₂ zugesetzt, und es wurde weitere 20 Minuten bei 0-5⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf -50⁰C abgekühlt, und gesättigte Rochellsalzlösung (60ml) wurde unter N₂ zugesetzt. Man ließ das Gemisch sich auf Raumtemperaturerwärmen, HCI (konz., 10ml) wurde zugesetzt, um die wäßrige Phase auf pH 3zu bringen, und die unlöslichen Substanzen wurden durch Filtration entfernt. Ethylacetat (50ml) wurde zugesetzt, und die organische Phase wurde abgetrennt und nacheinander gewaschen mit (a) Wasser (50 ml), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 50 ml), (c) wäßriger HCI (0,5N, 50ml) und (d) Wasser (3 x 50ml). Das Ethylacetat wurde dann durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 3O⁰C gehalten wurde. Der Rückstand wurde über Nacht stehen gelassen, über P₂O₅ vakuumgetrocknet und schließlich aus Toluen auskristallisiert, wobei CBZ-L-Phe-L-Phe-Aldehyd entstand.

Stufe e

A) CBZ-L-Phe-L-Phe-Aldehyd (0,645g) wurde in vergälltem Industriealkohol (10ml) bei 70°C gelöst.

B) Natriumacetattrihydrat (0,224g) wurde zu einer Lösung von Semicarbazid-HCI (0,183g) in Wasser (3ml) hinzugegeben, vergällter Industriealkohol (2 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch auf 60⁰C erwärmt.

C) Lösung A wurde zu Lösung B gegeben, und der A enthaltende Kolben wurde mit weiterem vergälltem Industriealkohol (3ml) gewaschen, und die Waschflüssigkeit wurde zu dem Gemisch gegeben, das 30 Minuten bei 60 bis 70 °C gerührt wurde. Man ließ das Gemisch im Verlaufe von 1 Stunde langsam abkühlen, eine weitere Stunde auf Eis und schließlich über Nacht bei 4°C stehen. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit vergälltem lndustriealkohol:Wasser (4:1,3ml) gewaschen und über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei CBZ-L-Phe-L-PheSc entstand.

Stufe f

CBZ-L-Phe-L-PheSc (2,1 g) wurde in Methanol (315ml) bei 30⁰C gelöst und die unlöslichen Substanzen durch Filtration entfernt. Die die methanolische Lösung des Semicarbazone enthaltende Apparatur wurde mit N2 gespült, der Katalysator, 10% Palladium auf Holzkohle (0,35g), wurde zugesetzt, und H₂ wurde 30 Minuten lang in das geschlossene System geleitet. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt, und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30°C gehalten wurde. Der Rückstand wurde über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei L-Phenylalanyl-L-phenylalanylsemicarbazon (L-Phe-L-PheSc) entstand.

Beispiel 3 - L-Phenylalanyl-L-phenylalanylmethoxyimin

Stufen a-d

CBZ-L-Phe-L-Phe-Aldehyd wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 2, Stufen a bis d, hergestellt.

Stufe e

A) CBZ-L-Phe-L-Phe-Aldehyd (0,645g) wurde in vergälltem Industriealkohol (35ml) bei 60-65⁰C gelöst und filtriert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen.

B) Natriumacetattrihydrat (0,224g) wurde einer Lösung von Methoxylamin-HCI (0,138g) in Wasser (25 ml) bei 60°C zugesetzt.

C) Lösung B wurde zu Lösung A gegeben, der B enthaltende Kolben wurde mit Wasser (10 ml) bei 60°C gewaschen, die Waschflüssigkeit wurde mit dem Gemisch vereinigt und eine halbe Stunde bei 60° gehalten, dann bei Raumtemperatur

2 Stunden abkühlen gelassen. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit vergälltem Industriealkohol: Wasser (1:1, 6ml) gewaschen und über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei CBZ-L-Phe-L-Phe-Methoxyimin entstand.

Stufe f

CBZ-L-Phe-L-Phe-methoxylmin (550mg) wurde in Methanol (300ml) gelöst, und die unlöslichen Substanzen wurden durch Filtration entfernt. Die das methanolische Methoxyimin enthaltende Apparatur wurde mit N₂ gespült, und der Katalysator, 10% Palladium auf Holzkohle (100mg), wurde dann zugesetzt. H₂ wurde in den abgeschlossenen Behälter geleitet und, falls erforderlich, 4Ѵг Stunden lang regeneriert. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt, und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 3O⁰C gehalten wurde, so daß L-Phenylalanyl-L-phenylalanyl-methoxyimin (L-Phe-L-PheMo) entstand.

Beispiel 4- L-PhenylalanylD-phenylalanylsemicarbazon

Stufe a

A) Ο,Ν-Dimethylhydroxylamin-HCI (3,891 g) wurde in trockenem DMF (40ml) bei Raumtemperatur suspendiert. N-Methylmorpholin (4,032g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde, und das Gemisch wurde dann unter Rühren auf O⁰C abgekühlt.

B) N-t-Boc-D-Phe (10,08g) wurde in trockenem THF (80ml) gelöst und auf —10°C abgekühlt. Isobutylchlorameisensäureester (5,47g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zu der Lösung hinzugegeben, während die Temperatur bei —10°C gehalten wurde, N-Methylmorpholin (4,032g) wurde im Verlaufe von 10 Minuten zugesetzt, während die Temperatur bei -10⁰C gehalten wurde, und es wurde weitere 10 Minuten gerührt.

C) Suspension A wurde im Verlaufe von 15 Minuten bei -10⁰C 2u Suspension B gegeben, man ließ das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen, und es wurde 3 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde dann auf 0⁰C abgekühlt, 3-Dimethylaminopropylamin (3,88 g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, und es wurde weitere 5 Minuten lang gerührt. Wasser (60ml) und Ethylacetat (60ml) wurden zugesetzt, die organische Schicht wurde entfernt und nacheinander gewaschen mit(a) Wasser (60ml), (b) wäßrigem KHCO₃, (5%ig, 60ml), (c) wäßriger HCI (0,5M, 60 ml) und (d) Wasser (3 χ 60ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, während die Temperatur unter 30°C gehalten wurde, wobei N-t-Boc-D-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe b

N-t-Boc-D-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat (11,3g) wurde auf Eis gekühlt, Trifluoressigsäure (30ml) zugesetzt, und das Gemisch

3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssige Trifluoressigsäure wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 3O⁰C gehalten wurde, und Diethylether (100 ml) wurde zu dem Rückstand hinzugegeben, um eine Lösung zu bilden. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und das Verfahren wurde wiederholt, bis Kristallisation erfolgte. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit Diethylether gewaschen und über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei das Trifluoracetatsalz von D-Phe-O.N-Dimethylhdroxamat entstand.

Stufe с

A) Trifluoracetatsalz von O-Phe-CsN-Dimethylhydroxamat (10,1 g) wurde in trockenem DMF (41 ml) unter Rühren bei Raumtemperatur gelost. N-Methylmorpholin (3,155 g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur unter 30°C gehalten wurde, und das entstehende Gemisch wurde auf 0°C gekühlt.

B) CBZ-L-Phe (9,4g) wurde in trockenem THF (80ml) unter Rühren gelöst, und das Gemisch wurde auf -10°C abgekühlt. Isobutylchlorameisensäureester (4,307g) wurde über einen Zeitraum von 10 Minuten bei -10°C zugesetzt, N-Methylmorpholin (3,155g) wurde im Verlaufe von 10 Minuten zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde bei -10⁰C weitere 10 Minuten lang gerührt.

C) Lösung A wurde über einen 15minütigen Zeitraum bei -10⁰C zu Lösung B gegeben, danach ließ man die Temperatur des Gemisches auf Raumtemperatur ansteigen, und es wurde 3 Stunden weitergerührt. Das Gemisch wurde auf 0⁰C gekühlt, 3-Dimethylaminopropylamin (3,20 g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, und es wurde weitere 5 Minuten lang gerührt. Wasser (60ml) und Ethylacetat (60ml) wurden dann zugesetzt, die organische Phase wurde abgetrennt und nacheinander gewaschen mit (a) Wasser (60ml) und gesättigtem wäßrigen NaCt (60 ml), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 60 ml), (c) wäßriger HCI (0,5 N, 60ml) und (d) Wasser (3 χ 60ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, während die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde. Frisches Ethylacetat wurde zugesetzt und anschließend durch Verdampfung entfernt. Der Rückstand wurde aus Isopropanol wieder auskristallisiert, wobei CBZ-L-Phe-D-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe d

Diisobutylaluminiumhydrid in Dichlormethan (1M, 10 ml) wurde in einen mit N2 gespülten Kolben gegeben. Der Kolben wurde auf 50⁰C erwärmt, bis alles Dichlormethan verdampft war, und das System wurde erneut mit N2 gespült, trockenes THF (10 ml) wurde zugesetzt, und das Gemisch auf -70°C abgekühlt. CBZ-L-Phe-D-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat (0,978g) wurde in trockenem THF (10 ml) gelöst und über einen Zeitraum von 10 Minuten bei —70°C zu der Diisobutylaluminiumhydridlösung gegeben, und es wurde 10 Minuten lang bei -7O⁰C wettergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Methanol (30 ml) abgeschreckt, und gesättigte Rochellsalzlösung (30ml) wurde bei -6O⁰C zugesetzt, und man ließ das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen. Wasser (50 ml) und Ethylacetat (50 ml) wurden hinzugegeben, und die organische Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Phase mit Ethylacetat (50ml) extrahiert. Die zusammengenommenen organischen Phasen wurden mit Wasser (2 x 200ml) gewaschen und filtriert. Die organische Phase wurde abgetrennt und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, während die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde. Frisches Ethylacetat wurde zugesetzt und dann entfernt, wobei CBZ-L-Phe-D-Phe-Aldehyd entstand.

Stufe e

A) CBZ-L-Phe-D-Phe-Aldehyd (400mg) wurde in vergälltem Industriealkohol (10ml) bei 6O⁰C gelöst.

B) Natriumacetattrihydrat (0,298g) in Wasser (3ml) bei 6O⁰C wurde zu einer Lösung von Semicarbazid-HCI (0,244g) in Wasser (3ml) bei 6O⁰C gegeben.

C) Die Lösungen A und B wurden vereinigt, und das entstandene Gemisch wurde 5 Stunden bei 6O⁰C gerührt, bevor man es über Nacht bei 4°C stehen ließ. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum über P2O5 getrocknet, wobei CBZ-L-Phe-D-PheSc entstand.

Stufe f

CBZ-L-Phe-D-PheSc (600mg) wurde in Methanol (90ml) gelöst, und die unlöslichen Substanzen wurden durch Filtration entfernt. Die die methanolische Semicarbazonlösung enthaltende Apparatur wurde mit N₂ gespült, und der Katalysator, 10% Palladium auf Holzkohle (100 mg), wurde zugesetzt. H₂ wurde für 2 Stunden in den geschlossenen Behälter eingespeist. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Methanol durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, während die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde, wobei L-Phenylalanyl-D-phenylalanylsemicarbazon (L-Phe-D-PheSc) entstand.

Beispiel 5- L-Phenylalanyl-phenylalanyloxlm

Stufen a-d

CBZ-L-Phe-L-Phe-Aldehyd wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 2, Stufen a bis d, hergestellt.

Stufe e

A) CBZ-L-Phe-L-Phe-Aldehyd, das gemäß obiger Beschreibung (0,645 g) hergestellt war, wurde in vergälltem tndustriealkohol (35ml) bei 60-65⁰C gelöst und die Lösung zur Entfernung der unlöslichen Substanzen filtriert.

B) Natriumacetattrihydrat (0,224g) wurde zu einer Lösung von Hydroxylamin HCI (0,114g) in Wasser (25ml) bei 6O⁰C hinzugegeben.

C) Lösung B wurde zu Lösung A gegeben, und der Lösung B enthaltende Kolben wurde mit Wasser (10ml) gewaschen, die Waschflüssigkeit zu dem Gemisch hinzugegeben, welches dann eine ³A Stunde bei 60-65⁰C gerührt und anschließend 2 bis 3 Stunden lang bei 4°C gekühlt wurde. Der Feststoff wurde abfiltriert, mit vergälltem Industriealkohol/Wasser (1:1,5ml) gewaschen und über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei CBZ-L-Phe-L-PheOx als Gemisch von syn- und anti-Isomeren entstand.

Stufe f

CBZ-L-Phe-L-PheOx (500mg) wurde in Methanol (130ml) gelöst, und die unlöslichen Substanzen wurden durch Filtration entfernt. Die das methanolische Oxim enthaltende Apparatur wurde mit N₂ gespült, und der Katalysator, 10% Palladium auf Holzkohle (83mg), wurde zugesetzt. H₂ wurde dann 30 Minuten lang in den abgedichteten Behälter eingespeist. Der Katalysator wurde durch Filtration und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde. Weiteres Lösungsmittel wurde unter Einsatz einer Hochvakuumpumpe entfernt und der Rückstand über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei L-Phenylalanyl-L-phenylalanyloxim (L-Phe-L-PheOx) entstand.

Beispiel 6- L-Alanyl-D-phenylalanylsemicarbazon

Stufen a und b

Das Trifluoracetatsalz von D-Phe-CN-Dimethylhydroxamat wurde entsprechend den Stufen a und b von Beispiel 4 hergestellt.

Stufe с

A) Das Trifluoracetatsalz von D-Phe-O,N-Dimethylhydroxamat (5,000g) wurde in trockenem THF (20ml) gelöst. N-Methylmorpholin (1,578g) wurde langsam zugesetzt, während die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde, und das entstehende Gemisch wurde auf 0°C gekühlt.

B) CBZ-L-AIa (3,463g) wurde in trockenem THF (40ml) unter Rühren gelöst, und das Gemisch wurde auf -10°C abgekühlt, Isobutylchlorameisensäureester (2,158g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten bei-10°C, N-Methylmorpholin (1,578g) im Verlaufe von 10 Minuten zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde weitere 10 Minuten lang bei -1O⁰C gerührt.

C) Die beiden Lösungen A und B wurden bei -1O⁰C über einen lOminütigen Zeitraum gemischt, dann ließ man die Temperatur des Gemisches auf Raumtemperatur ansteigen, und es wurde 3 Stunden lang weitergerührt. Das Gemisch wurde auf 0⁰C gekühlt, 3-Dimethylaminopropylamin (1,585g) wurde zugesetzt und die Reaktion mit Wasser (50ml) abgeschreckt. Ethylacetat (50ml) wurde hinzugegeben, die organische Phase wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht mit Ethylacetat (2 χ 30 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden zusammengenommen und nacheinander gewaschen mit (a) Wasser (50 ml), und gesättigtem wäßrigen NaCI (10ml), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 50ml), (c) wäßriger HCI (0,5N, 50ml) und (d) Wasser (3 χ 50 ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde. Der Feststoff wurde aus Ethylacetat wieder auskristallisiert, wobei CBZ-L-Ala-D-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe d

CBZ-L-Ala-D-Phe-OiN-Dimethylhydroxamat (2,9 g) wurde in trockenem THF (25 ml) gelöst. Die Lösung wurde unter Stickstoff auf -7O⁰C abgekühlt. Diisobutylaluminiumhydrid in THF (1M, 37 ml) wurde im Verlaufe von 10 Minuten bei -70⁰C zugesetzt, und weitere 10 Minuten wurde gerührt.

Die Reaktion wurde in gesättigter Rochellsalzlösung (125ml) und THF (125ml) unter Rühren bei -30"C bei einer Spülung mit Stickstoff abgeschreckt, und dann ließ man das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen. Ethylacetat (100ml) wurde zugesetzt und die organische Phase abgetrennt. Die wäßrige Schicht wurde mit Ethylacetat (2 χ 30ml) extrahiert, und die organischen Schichten wurden zusammengenommen und mit Wasser gewaschen (3 χ 100ml). Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 3O⁰C gehalten wurde. Frisches Ethylacetat wurde zugesetzt und dann entfernt, wobei CBZ-L-Ala-D-Phe-Aldehyd entstand.

Stufe e

A) CBZ-L-Ala-D-Phe-Aldehyd (1,2g) wurde in THF (20ml) und vergälltem Industriealkohol (20 ml) gelöst und auf 5OX erhitzt.

B) Eine heiße Lösung von Semicarbazid-HCI (1,8g) in Wasser (15ml) wurdezu einer heißen Lösung von KHCO₃ (1,5g) in Wasser gegeben (15ml).

C) Lösung B wurde zu Lösung A gegeben, und das entstandene Gemisch wurde 4 Stunden bei 50°C gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30°C gehalten wurde. Wasser (50 ml) wurdezu dem Rückstand gegeben, der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser: vergälltem Industriealkohol (1:1) gewaschen und über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei CBZ-L-Ala-D-PheSc entstand.

Stufe f

CBZ-L-Ala-D-PheSc (750mg) wurde in Methanol (50ml) gelöst, und unlösliche Substanzen wurden durch Filtration entfernt. Die die Methanollösung enthaltende Apparatur wurde mit N₂ gespült, und der Katalysator, 10% Palladium auf Holzkohle (100mg), wurde zugesetzt. H₂ wurde 90 Minuten lang in das geschlossene System eingeleitet. Der Katalysator wurde durch Filtration und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde, und über P₂O₆ vakuumgetrocknet, wobei L-Alanyl-D-phenylalanylsemicarbazon (L-Ala-D-PheSc) entstand.

Beispiel 7 - L-Tyrosinyl-L-phenylalanylsemicarbazon

Stufen a und b

Das Trifluoracetatsalz von L-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat wurde gemäß den Stufen a und b von Beispiel 4 hergestellt.

Stufe с

A) Das Trifluoracetatsalz von L-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat (7,95g) wurde in trockenem DMF (30ml) unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. N-Methylmorpholin (2,49 g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde, und das entstehende Gemisch wurde auf O⁰C abgekühlt.

B) CBZ-OBZ-L-Tyr (10g) wurde in trockenem DMF (60ml) unter Rühren gelöst und das Gemisch auf -10⁰C abgekühlt. Isobutylchlorameisensäureester (3,39g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten bei -10⁰C zugesetzt. N-Dimethylmorpholin (2,49g) wurde im Verlaufe von 10 Minuten zugesetzt und das Reaktionsgemisch weitere 10 Minuten bei -10⁰C gerührt.

C) Lösung A wurde im Verlaufe von 15 Minuten zu Lösung B gegeben, anschließend ließ man die Temperatur des Gemischs auf Raumtemperatur ansteigen, und es wurde 3 Stunden lang weitergerührt. Das Gemisch wurde auf O⁰C abgekühlt und 3-Dimethylaminopropylamin (2,52g) im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt. Wasser (50ml) und Ethylacetat (50ml) wurden dann zugesetzt, die obere organische Phase wurde abgetrennt und nacheinander gewaschen mit (a) Wasser (50ml), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 50ml), (c) wäßriger HCI (0,5M, 50ml) und (d) Wasser (3 χ 50 ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei dieTemperatur unter 30 ⁰C gehalten wurde, und der Rückstand wurde aus Isopropylalkohol wieder auskristallisiert, wobei CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe d

CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-O.N-Dimethylhydroxamat (1,012g) wurde in trockenem THF (10 ml) gelöst. Diisobutylaluminiumhydrid in THF (1M, 8,5 ml) wurde unter N₂ im Verlaufe von 10 Minuten bei -70⁰C zugesetzt, und es wu rde weitere 10 Minuten lang gerührt. Die Reaktion wurde in Methanol (20ml) und Rochellsalzlösung (30ml) unter Rühren bei -6O⁰C unter N₂ abgeschreckt, und man ließ das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen. Wasser (50ml) und Ethylacetat (50ml) wurden zugesetzt, und die organische Phase wurde abgetrennt und mit Wasser (200ml) gewaschen. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung unter Vakuum aus dem Filtrat entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde. Frisches Ethylacetat wurde dann zugesetzt und durch Rotationsverdampfung entfernt. Der entstehende Feststoff wurde über P₂O₆ vakuumgetrocknet, wobei CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-Aldehyd entstand.

Stufe e

A) CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-Aldehyd (400mg) wurde in vergälltem Industriealkohol (20ml) gelöst und auf 60°C erhitzt.

B) Eine heiße Lösung von Semicarbazid-HCI (600mg) in Wasser (5ml) wurde zu einer heißen Lösung von KHCO₃ (500mg) in Wasser (5 ml) gegeben.

C) Lösung B wurde zu Lösung A gegeben, und das entstehende Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 6O⁰C gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde, und der Rückstand wurde mit Wasser abgeschreckt. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser und vergälltem Industviealkohol gewaschen und über P₂Oe vakuumgetrocknet, wobei CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc entstand.

Stufe f

CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc (770mg) wurde in trockenem THF (70ml) gelöst, filtriert, dann wurde dem Filtrat Methanol (20ml) zugesetzt. Die die Semicarbazonlösung enthaltende Apparatur wurde mit N₂ gespült, und der Katalysator, 10% Palladium auf Holzkohle (100mg), wurde zugesetzt. H₂ wurde mehrere Stunden lang in das geschlossene System eingeleitet. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt, und das Lösungsmittel wurde durch Verdampfung entfernt, wobei L-Tyrosinyl-L-phenylalanylsemicarbazon (L-Tyr-L-PheSc) entstand.

Beispiel 8 - L-Alanyl-L-cyclohexylalanylsemicarbazon

Stufe a

A) Ο,Ν-Dimethylhydroxylamin-HCI (8,51 g) wurde unter Rühren zu trockenem DMF (75 ml) gegeben und N-Methylmorpholin (8,8g) im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde. Ein weißes Präzipitat bildete sich, und das Gemisch wurde auf 0°C abgekühlt.

B) N-t-Boc-L-Cha (22,5g) wurde in trockenem THF (200 ml) gelöst und auf - 10⁰C abgekühlt. Isobutylchlorameisensäureester (11,94g) wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur bei -1O⁰C gehalten wurde. N-Methylmorpholin (8,8g) wurde im Verlaufe von 10 Minuten zugesetzt, während die Temperatur bei -10⁰C gehalten wurde, und es wurde weitere 10 Minuten lang gerührt.

C) Suspension A wurde über einen Zeitraum von 15 Minuten bei — 1O⁰C zu Suspension B gegeben, dann ließ man das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen, und es wurde 4 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde auf O⁰C abgekühlt, 3-Dimethylaminopropylamin (8,6g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, und es wurde 5 Minuten lang weitergerührt. Wasser (200ml) und Ethylacetat (100ml) wurden hinzugegeben, und die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und mit Ethylacetat (2 x 100ml) extrahiert. Die zusammengenommenen organischen Phasen wurden nacheinander gewaschen mit(a) Wasser (100ml) und gesättigtem wäßrigem NaCI (20ml), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 100ml), (c) wäßriger HCI (0,5N, 100ml) und

(d) Wasser (3 χ 100ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 3O⁰C gehalten wurde, so daß N-t-Boc-L-ChaAN-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe b

N-t-Boc-L-Cha-O.N-Dimethylhydroxamat (26g) und Trifluoressigsäure (65ml) wurden bei 0°C 5 Minuten lang gerührt, danach ließ man die Temperatur des Gemisches auf Raumtemperatur ansteigen, und es wurde 3 Stunden lang weitergerührt. Die überschüssige Trifluoressigsäure wurde dann durch Rotationsverdampfung unter Vakuum entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde. Diethylether wurde zu dem Rückstand gegeben, um eine Lösung zu bilden, und dann wurde der Ether unter Vakuum entfernt. Die Etherbehandlung wurde wiederholt, wobei ein gelbes Öl des Trifluoracetatsalzes von L-Cha-O,N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe с

A) Trifluoracetatsalz von L-Cha-O,N-Dimethylhydroxamat (17g) wurde in trockenem THF (50ml) gelöst. N-Methylmorpholin (3,95g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur unter 30"C gehalten wurde, und das Gemisch wurde dann auf 0⁰C abgekühlt.

B) CBZ-L-AIa (9,25g) wurde in trockenem THF (100ml) unter Rühren gelöst und das Gemisch auf -10⁰C abgekühlt. Isobutylchlorameisensäureester (5,35g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten bei -1O⁰C, N-Methylmorpholin (3,95g) im Verlaufe von 10 Minuten zugesetzt und das Reaktionsgemisch weitere 10 Minuten lang bei -10⁰C gerührt.

C) Lösung A wurde im Verlaufe von 15 Minuten bei -10°Czu Lösung B gegeben, dann ließ man die Temperatur des Gemisches auf Raumtemperatur ansteigen, und es wurde 3 Stunden weitergerührt. Das Gemisch wurde auf 0⁰C abgekühlt, 3-Dimethylaminopropylamin (3,98g) im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, und es wurde weitere 5 Minuten lang gerührt, Wasser (150ml) und Ethylacetat (150ml) wurden dann hinzugegeben, und die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit Ethylacetat (2 χ 75 ml) extrahiert. Die zusammengenommenen organischen Phasen wurden nacheinander gewaschen mit (a) Wasser (125ml), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 125ml), (c) wäßriger HCI (0,5N, 125ml) und (d) Wasser (3 x 125ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde. Frisches Ethylacetat wurde zugesetzt und durch Verdampfung entfernt, wobei CBZ-L-Ala-O.N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe d

CBZ-L-Ala-L-Cha-O.N-Dimethylhydroxamat (7,22 g) wurden in trockenem THF (160ml) gelöst und unter N₂ auf -70⁰C abgekühlt. Diisobutylaluminiumhydrid in THF (1M, 86ml) wurde unter N₂ im Verlaufe von 20 Minuten bei — 70°C zugesetzt, und es wurde weitere 20 Minuten lang gerührt.

Die Reaktion wurde in Rochellsalzlösung (400ml) unter Rühren bei 0°C unter N₂ abgeschreckt, und man ließ das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen. Ethylacetat (150ml) wurde zugesetzt und das Gemisch 5 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, die organische Phase abgetrennt und die wäßrige Phase mit Ethylacetat (2 χ 50 ml) extrahiert. Die zusammengenommenen organischen Phasen wurden mit Wasser (3 χ 200ml) gewaschen, wobei zu den Endwäschen gesättigtes wäßriges NaCI gegeben wurde. Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde, so daß ein Öl von CBZ-L-Ala-L-Cha-Aldehyd entstand.

Stufe e

A) CBZ-L-Ala-L-Cha-Aldehyd (8g) wurde in vergälltem Industriealkohol (50ml) gelöst und auf 50⁰C erhitzt.

B) Eine heiße Lösung von Semicarbazid-HCI (3,0g) in Wasser (25 ml) wurde zu einer heißen Lösung von KHCO₃ (2,67 g) in Wasser (25ml) gegeben.

C) Lösung B wurde zu Lösung A gegeben, und das entstandene Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 50°C gerührt. Man ließ das Gemisch abkühlen und über Nacht bei 4°C stehen. Der größte Teil des vergällten Industriealkohols wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde, und zu dem Rückstand wurde Ethylacetat (50ml) gegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und nacheinander gewaschen mit (a) Wasser (30ml), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 30ml), (c) wäßriger HCI (0,5 N, 30ml) und (d) Wasser (2 χ 50ml), wobei gesättigtes wäßriges NaCI erforderlichenfalls zur Unterstützung der Abtrennung zugesetzt wurde. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die Temperatur unter 3O⁰C gehalten wurde, und der Feststoff wurde aus Isopropanol und Ether auskristallisiert, wobei CBZ-L-Ala-L-ChaSc entstand.

Stufe f

CBZ-L-Ala-L-ChaSc (900mg) wurde in Methanol (30ml) gelöst, und der Katalysator, 10% Palladium auf Holzkohle (100mg), wurde unter N₂ zugesetzt, H₂ wurde 6 Stunden lang in das geschlossene System geleitet und der Katalysator dann durch Filtration entfernt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten und der Feststoff mit Ether gewaschen und über P₂O₆ vakuumgetrocknet wurde, wobei L-Alanyl-L-Cyclohexylalaninsemicarbazon (L-Ala-L-ChaSc) entstand.

Beispiel 9 - L-Alanyl-L-Leucinylsemicarbazon

Stufe a

A) Ο,Ν-Dimethylhydroxylamin-HCI (9,17g) wurde unter Rühren zu trockenem DMF (110ml) bei Raumtemperatur hinzugegeben. N-Methylmorpholin (9,51 g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur unter 10⁰C gehalten wurde. Es bildete sich ein Präzipitat, und das Gemisch wurde auf 0⁰C abgekühlt.

B) N-t-Boc-L-Leu (23,3g) wurde in trockenem THF (220ml) gelöst und auf -10°C abgekühlt. Isobutylchlorameisensäureester (12,90g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, während die Temperatur bei -10⁰C gehalten wurde. N-Methylmorpholin (9,51 g) wurde im Verlaufe von 10 Minuten zugesetzt, während die Temperatur bei -10⁰C gehalten wurde, und es wurde weitere 10 Minuten lang gerührt.

C) Suspension A wurde im Verlaufe von 15 Minuten bei -10°Czu Suspension B gegeben. Man ließ das Gemisch Raumtemperatur annehmen, und es wurde 3 Stunden lang gerührt. Dann wurde das Gemisch auf 0°C abgekühlt, 3-Dimethylaminopropylamin (9,13g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt, und es wurde weitere 5 Minuten lang gerührt. Ethylacetat (110ml) und Wasser (110ml) wurden zugesetzt, und die organische Schicht wurde abgetrennt und nacheinander gewaschen mit (a) Wasser (2 χ 100ml), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 100ml), (c) wäßriger HCI (0,5N, 100ml) und (d) Wasser (3 x 100 ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die Temperatur unter 3O⁰C gehalten wurde, so daß N-t-Boc-L-Leu-0,N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe b

N-t-Boc-L-Leu-0,N-Dimethylhydroxamat (23,4g) und Trifluoressigsäure (165ml, auf O⁰C gekühlt) wurden zusammen 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die überschüssige Trifluoressigsäure wurde dann durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die Temperatur unter 3O⁰C gehalten wurde. Diethylether wurde zur Bildung einer Lösung zu dem Rückstand zugegeben, dann wurde der Ether unter Vakuum entfernt. Das wurde wiederholt, bis bei 4°C Kristallisation erfolgte, wobei das Trifluoracetatsalz von L-Leu-O,N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe с

A) Trifluoracetatsalz von L-Leu-0,N-Dimethylhydroxamat (1,8g) wurde unter Rühren bei Raumtemperatur in trockenem THF (10ml) gelöst. Das Gemisch wurde auf 0⁰C abgekühlt, und N-Methylmorpholin (0,635g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten zugesetzt.

B) CBZ-L-AIa (1,40 g) wurde in trockenem THF (20 ml) gelöst und auf -10⁰C abgekühlt. Isobutylchlorameisensäureester (0,869g) wurde im Verlaufe von 5 Minuten bei -10° hinzugegeben, N-Methylmorpholin (0,635g) im Verlaufe von 10 Minuten zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde weitere 10 Minuten lang bei -10⁰C gerührt.

C) Lösung A wurde im Verlaufe von 15 Minuten bei—10°Czu Lösung B gegeben, dann ließ man dieTemperatur des Gemisches auf Raumtemperatur ansteigen, und es wurde weitere 18 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde auf 0°C gekühlt, 3-Dimethylaminopropylamin (0,64g) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch dann mit Wasser (25ml) und Ethylacetat (25ml) abgeschreckt. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit Ethylacetat (2 x 25ml) extrahiert. Die zusammengenommenen organischen Phasen wurden nacheinander gewaschen mit (a) Wasser (50ml) und gesättigtem wäßrigen NaCI (zur Unterstützung der

Abtrennung), (b) wäßrigem KHCO₃ (5%ig, 30ml), (c) wäßriger HCI (0,5N, 30ml) und (d) Wasser (3 χ 30ml). Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die Temperatur unter 30°C gehalten und der Feststoff über P₂Os vakuumgetrocknet wurde, so daß CBZ-L-Ala-L-Leu-O,N-Dimethylhydroxamat entstand.

Stufe d

CBZ-L-Ala-L-Leu-O^-Dimethylhydroxamat (1,9g) wurde in trockenem THF (40ml) gelöst und unter N₂ auf -70⁰C abgekühlt. Diisobutylaluminiumhydrid in THF (1M, 29,5ml) wurde unter N₂ im Verlaufe von 10 Minuten bei -70⁰C zugesetzt, und es wurde weitere 10 Minuten lang gerührt.

Die Reaktion wurde in Methanol (50ml) und Rochellsalzlösung (50ml) unter Rühren bei -60⁰C unter N₂ abgeschreckt, und man ließ das Gemisch dann Raumtemperatur annehmen. Wasser (50ml) und Ethylacetat (50ml) wurden zugesetzt, das Gemisch wurde filtriert und die wäßrige Schicht abgetrennt und mit Ethylacetat (2 χ 50ml) extrahiert. Die zusammengenommenen organischen Phasen wurden mit Wasser (3 χ 100ml) und gesättigtem wäßrigen NaCI zur Unterstützung der Abtrennung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die Temperatur unter 30°C gehalten wurde, frisches Ethylacetat wurde zugesetzt und dann durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei CBZ-L-Ala-L-Leu-Aldehyd entstand.

Stufe e

A) CBZ-L-Ala-L-Leu-Aldehyd (6,7g) wurde in vergälltem Industriealkohol (50ml) gelöst und auf 50⁰C erwärmt.

B) Eine heiße Lösung von KHCO₃ (9g) in Wasser (30ml) wurde zu einer heißen Lösung von Semicarbazid-HCI (10,8g) in Wasser (30ml) hinzugegeben.

C) Lösung B wurde zu Lösung A gegeben, und das Gemisch wurde bei 50⁰C 3 Stunden lang gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Feststoff wurde abfiltriert, mit vergälltem Industriealkohol: Wasser (1:1,20ml) gewaschen und über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei CBZ-L-Ala-L-LeuSc entstand.

Stufe f

CBZ-L-Ala-L-LeuSc (950mg) wurden in Methanol (100 ml) gelöst und die unlöslichen Substanzen durch Filtration abgetrennt. Weiteres Methanol (50ml) wurde zugesetzt und die Apparatur mit N₂ gespült. Der Katalysator, 10% Palladium auf Holzkohle (100mg), wurde unter N₂ zugesetzt, und dann wurde H₂135 Minuten lang in das geschlossene System geleitet. Der Katalysator wurde durch Filtration und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei die Temperatur unter 30⁰C gehalten wurde. Der Feststoff wurde über P₂O₅ vakuumgetrocknet, wobei L-Alanyl-L-Leucinylsemicarbazon (L-Ala-L-LeuSc) entstand.

Beispiel 10 - Herstellung von auf das aktive Zentrum gerichtetem Affinitätschromatografiematrix-ECH-Sepharose 4B-L-Ala-L-PheSc

ECH-Sepharose® 4B (3g Feuchtgutmasse) wurde auf einem Glasfilter mit wäßrigem NaCI (0,5M, 240ml) und anschließend mit Wasser (120ml) gewaschen. N-Ethyl-NMS-dimethylaminopropyDcarbodiimidhydrochlorid (EDC) wurde in Wasser gelöst, wobei eine 0,1 M EDC-Lösung entstand, und der pH der EDC-Lösung wurde durch Zusatz von Chlorwasserstoffsäure oderfestem Natriumacetat auf pH 4,5 stabilisiert. L-Ala-L-PheSc (10mg), hergestellt gemäß Beschreibung in Beispiel 1, wurde in Methanol (400μΙ) gelöst und zusammen mit wäßrigem EDC (0,1 M, 2,4ml) zu dem gewaschenen Gel gegeben. Das Gemisch wurde bei 20⁰C eine Stunde lang vorsichtig gerührt, der pH wurde, falls erforderlich, wieder auf pH 4,5 eingestellt, und es wurde 23 Stunden lang bei 20°C weitergerührt. L-Glycin wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 1M zugesetzt, und es wurde weitere 3 Stunden bei 20⁰C gerührt. Das Affinitätschromatografiegel wurde nacheinander mit wäßrigem Methanol (50%ig, 60ml), Wasser (60ml) und Applikationspuffer (60ml) gewaschen und bei 4°C aufbewahrt, bis es benötigt wurde.

Beispiele 11 bis 18 - Herstellung von Affinitätschromatografiematrizen

Jedes der gemäß der Beschreibung in den Beispielen 2 bis 9 hergestellten Dipeptidderivate wurde an eine Gelmatrix gekoppelt, und zwar auf eine zu der in Beispiel 10 beschriebenen analogen Weise, um die jeweiligen Affinitätschromatografiegele der Beispiele 11 bis 18 zu erhalten.

Beispiel 19 - Affinitätschromatografie

Im Sprühverfahren getrockneter Papayalatex (0,03g Protein), bezogen von Powell & Scholefield, Großbritannien, in „Applikations" Puffer (Natriumphosphat |50mM); EDTA [1 mM); Ethandiol [33%], pH 6,8) plus Dithiothreitol (2mM) oder Cystein (4mM) (1,5ml) wurde auf eine 1 -ml-Säule von jeder der Äff initätschromatografiematrizen der Beispiele 10 bis 18 gegeben. Mindestens eines von fünf verschiedenen Elutionsmitteln wurde verwendet, und zwar;

Elutionsmittel A = Hydroxyethyldisulfid (100 mM) in wäßrigem Ethandiol (33%ig) mit Gehalt an Natriumeitrat (50 mM) und

EDTA (1 mM), pH 4,5; Säule über Nacht vor der Elution äquilibriert. Elutionsmittel B = 2,2'-Dipyridyldisulfid (3OmM) in wäßrigem Ethandiol (33%ig) mit Gehalt an Natriumeitrat (50 mM) und

EDTA(I mM),pH4,5; Säule über Nacht vor der Elution äquilibriert. Elutionsmittel C = Methylpyridyldisulfit (30 mM) in wäßrigem Ethandiol (33%ig) mit Gehalt an Natriumeitrat (50 mM) und

EDTA (1 mM), pH 4,5; Säule über Nacht vor der Elution äquilibriert. Elutionsmittel D = Mersalylsäure (10 mM) in wäßrigem Ethandiol (33%ig) mit Gehalt an Natriumhydroxid (50 mM) und EDTA

(25 mM), eingestellt auf pH 4,5 mit Essigsäure; kontinuierliche Elution. Elutionsmittel E = HgCI₂ (10 mM) in wäßrigem Ethandiol (33%ig) mit Natriumacetatgehalt (50 mM), pH 4,5; kontinuierliche Elution.

Die Elution mit jedem Elutionsmittel wurde durch Prüfung der A₂₈₀-Spur des eluierten Materials nach Standard-Mono-S-(Pharmacia)-Chromatografie eingeschätzt. Die Resultate sind in nachstehender Tabelle 1 zusammengefaßt:

Tabelle 1

Bindung und Elution von Chymopapain

Inhibierendes Peptid

Matrix (Beispiel Nr.)

Elutionsmittel C

L-A1a-L-PheSc	10
L-Phe-L-PheSc	11
L-Phe-L-PheMo	12
L-Phe-D-PheSc	13
L-Phe-L-PheOx	14
L-Ala-D-PheSc	15
L-Tyr-L-PheSc	16
L-Ala-L-ChaSc	17
L-Ala-L-LeuSc	18

ND

ND

+	ND	ND	ND
ND	ND	+	ND
ND	ND	+	ND
ND	ND	ND	+
ND	ND	ND

+ Chymopapain gebunden und eluiert

- Chymopapain nicht gebunden und/oder nicht eluiert

ND Nicht ermittelt

Beispiel 20 - Reinigung von Chymopapain

i) Handelsüblicher, im Sprühverfahren getrockneter Latex von Carica papaya (1 g), bezogen von Powell & Scholefield, Großbritannien, wurde eine Stunde lang mit destilliertem Wasser (5ml) gerührt, und ungelöstes Material wurde durch 30minütige Zentrifugation bei 9000 χ g bei 4°C entfernt. Das Pellet wurde verworfen, und der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde mit Chlorwasserstoffsäure (1 M) im Verlaufe von 20 Minuten auf pH 1,8 eingestellt. Es wurde 60 Minuten bei 4°C gerührt, und der pH-Wert

wurde, wenn nötig, erneut auf pHi,8 eingestellt.

ii) Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 4°C bei 9000 χ g zentrifugiert, und das Pellet wurde verworfen.

iii) a) Der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde durch tropfenweisen Zusatz von NaOH (5 M) über einen Zeitraum von 10 Minuten auf 6,8 eingestellt. Es wurde das Auftreten einer purpur-blauen Färbung in der Lösung festgestellt.

b) Die entstandene purpur-blaue Lösung wurde extensiv mittels 10 Volumen „Applikations"-Puffer (Natriumphosphat [5OmM]; EDTAfImMJ; Ethandiol [33%1, pH 6,8) bei drei Pufferwechseln dialysiert. Der Dialysant wurde 10 Minuten bei 4000 χ g zentrifugiert, und der Proteingehalt der dekantierten chymopapainhaltigen überstehenden Flüssigkeit wurde auf ungefähr 30mg/ml eingestellt.

Die Chymopapainlösung wurde durch Zusatz von Cystein bis zu einer Endkonzentration von 4mM aktiviert und 15 Minuten bei 0°C

stehen gelassen.

iv) Die aktivierte Chymopapainlösung wurde auf eine 8-ml-Säule von ECH-Sepharose®, gekoppelt an L-Ala-L-PheSc (hergestellt gemäß Beschreibung in Beispiel 10), die vorher mit Applikationspuffer äquilibriert worden war, mit einer Fließgeschwindigkeit von 36ml/cm²/Stunde gebracht. Die Säule wurde nacheinander mit Applikationspuffer (2 Bettvolumen), wäßrigem Natriumeitrat (5OmM) in Ethandiol (33%), pH4,5 (2 Bettvolumen) und wäßrigem Natriumacetat (5OmM); EDTA (25mM); Mersalyl (1OmM) in Ethandiol (33%), pH4,5 (2 Bettvolumen) gewaschen und dann bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert.

v) Chymopapain wurde mit wäßrigem Natriumacetat (5OmM) mit Mersalylgehalt (1OmM) (3 Bettvolumen) eluiert, und es wurden Fraktionen (4ml) gesammelt. Die Enzymaktivität der eluierten Fraktionen wurde auf spezifische Aktivität gegen BAPNA gemäß

vorstehender Beschreibung analysiert.

Aktive Fraktionen wurden gepoolt und durch Kationenaustauschchromatografie auf einer Säule aus Mono-S HR* 10/10 (Pharmacia) mit einem „Ausgangs"-Phosphatpuffer von Na⁺ (5OmM); EDTA (1 mM); NaN₃ (0,01 %), pH7,2 und einem „Grenz"-Phosphatpuffer von Na⁺ (80OmM); EDTA (1 mM); NaN₃ (0,01 %), pH7,2, weiter gereinigt. Die Elution erfolgte mit einem Salzgradienten von 2,7mM/ml und einer Fließgeschwindigkeit von 2ml/min. Fraktionen (4ml) wurden gesammelt, die Proteinkonzentrationen durch Messung der Absorbanz bei 280nm eingeschätzt und die Enzymaktivität durch ΒΑΡΝΑ-Hydrolyse analysiert.

Die chymopapainhaltigen Fraktionen wurden gepoolt und extensiv mittels destilliertem und deionisiertem Wasser oder wäßrigem EDTA (1 mM) dialysiert und für die Lagerung gefriergetrocknet.

Beispiel 21 - Reinigung von Chymopapain - BAPNA-Analyseergebnisse

i) Handelsüblicher, im Sprühverfahren getrockneter Latex von Carica papaya (1 g), bezogen von Powell & Scholefield, Großbritannien, wurde in Wasser (5ml) 60 Minuten bei 20°C gerührt. Unlösliches Material wurde durch 30minütige Zentrifugation bei 9000 χ g bei 4°C entfernt. Oas Pellet wurde verworfen, und der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde durch tropfenweisen Zusatz von Chlorwasserstoffsäure (1 M) über einen Zeitraum von 20 Minuten auf pH1,8 eingestellt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 4°C gerührt, und nach 5 Minuten wurde der pH kontrolliert und, falls erforderlich, eingestellt.

ii) Das Präzipitat wurde durch 30minütige Zentrifugation bei 9000 χ g bei 4°C entfernt.

iii) a) Die überstehende Flüssigkeit wurde durch tropfenweisen Zusatz von wäßrigem Natriumhydroxid (5M) unter Rühren pH7,0 eingestellt. Das Präzipitat wurde durch 30minütige Zentrifugation bei 9000 χ g bei 4°C entfernt.

b) Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Kationenaustauschsäule aus MonoSHRIO/10 (Pharmacia), die mit wäßrigem Na₂HP(VNaHjPO₄ (5OmM Na⁺) mit EDTA-Gehalt (1 mM), pH7,2 (Puffer A), voräquilibriert worden war, gebracht. Nach der Probenapplikation wurde die Säule mit Puffer A gewaschen (2 ml/min), bis A₂₈₀ auf Null zurückkehrte. Dann wurde ein Gradient (2,7mM NaVmI) bis Na₂HP(VNaH₂PO* (0,8OM Na⁺) auf die Säule angewendet, und 4-ml-Fraktionen wurden gesammelt Die Fraktionen wurden auf Aktivität gegen BAPNA untersucht. Der große Chymopapain-Peak, immunologisch bestimmt, eluierte zwischen 0,17 und 0.28M Na⁺. Fraktionen, mit Aktivität gegen BAPNA in dieser Region wurden gepoolt und Ethandiol bis zu 33% (VoITVoI.) zugesetzt. Alle anderen Fraktionen, einschließlich diejenigen, die im später eluierenden (0,47-0,59M Na⁺) Papaya-Proteinase-Ill-Peak gegen BAPNA aktiv sind, wurden verworfen.

iv) Eine Säule (15ml Bettvolumen) von ECH-Sepharose·, gekoppelt an L-Ala-L-PheSc (hergestellt gemäß Beschreibung in Beispiel 10) wurde mit wäßrigem NaH₂PO₄ZNa₂HPO₄ (5OmM Na⁺) mit EDTA-Gehalt (1 mM) in Ethandiol (33%Vol./Vol.), pH6,8 (Applikationspuffer) gewaschen. Der Chymopapainpool (oben) wurde durch Zusatz von Cysteinbase (4mM Endkonzentration) aktiviert und 15 Minuten bei OX stehen gelassen. Dann wurde er auf die Säule gebracht, anschließend 60 ml Applikationspuffer.

v) Natriumacetat-(50mM)-Puffer, pH4,5, mit HgCI₂ Gehalt (1OmM, 45ml) wurde danach angewendet. 5-ml-Fraktionen wurden durchgehend gesammelt. Die Fraktionen wurden auf Aktivität gegen BAPNA untersucht.

Fraktionen, die den Peak der Aktivität, verzögert durch die Säule und eluiert durch den HgCI₂-haltigen Puffer, enthalten, wurden gepoolt und erneut auf die Mon-S-Säule gebracht. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen, und dann wurden 7 Bettvolumen Puffer A mit Cysteinbasegehalt (4mM) auf die Säule gebracht. Der Fluß wurde für 30 Minuten gestoppt, um zu gestatten, daß Quecksilber aus dem Enzym verdrängt wurde. Dann wurde der Fluß wieder aufgenommen und die Säule wieder mit Puffer A gewaschen, bevor die Anwendung eines Gradienten bis NaH₂PO₄(Na₂HPO₄ [0,8OM Na⁺)) gemäß obiger Beschreibung erfolgte.

Gegen BAPNA aktive Fraktionen wurden zusammengenommen, Cysteinbase zugesetzt (4mM Endkonzentration) und der Pool dann 15 Minuten bei OX stehen gelassen.

Chelexharz (Bio-Rad, Großbritannien; 0,5g) wurde in eine Säule gepackt und mit Puffer A gewaschen. Der Pool mit Chymopapaingehalt wurde durch die Chelex-Säule geleitet, dann extensiv in wäßriges EDTA (1 mM) dialysiert und gefriergetrocknet.

Der Ablauf der Chymopapainreinigung wird in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2 Reinigung von Chymopapain

	Protein	BAPNA	BAPNA	Ausbeute*	Reinigung
	(mg)	Aktivität·	Spezifische	(%)	(-fach)
		(Einheiten)	Aktivität*
	441		(Einheiten mg"1)	100	1
Im Sprühverfahren		493,712	1,120
getrockneter Latex	361			48	0,59
Säurebehandlung		238,636	661
Kationenaustausch-	58			27	2,06
chromatografie	27,5	133,748	2,306	23	3,65
Sepharose-L-Al a-L-PheSc		112,475	4,090
Kationenaustausch-	11			9	3,63
chromatografie	10,5	44,687	4,062	9	3,68
Chelex	43,301	4,124

⁺ Die gegebene Ausbeute ist die Ausbeute an Aktivität gegen BAPNA (auch ein Substrat für Papain und Papaya Proteinase III). ^# BAPNA-AnalysemethodeNr.2

Beispiel 22 - Präparation von Chymopapain-spezif ischen im Kaninchen gebildeten TgG-Antikörpern Nach der Beschreibung in Beispiel 21 hergestelltes reines Chymopapain wurde vor der Verwendung nach dem von Zucker et al. (1985), am oben angeführten Ort beschriebenen Verfahren schonend carboxymethyliert. Das Antiserum gegenüber Chymopapain wurde in einem Kaninchen durch intramuskuläre Injektion von 360 цд des carboxymethylierten Proteins in komplettem Freundschen Adjuvans, der nach 14 Tagen eine subkutane Injektion von 100\ig in inkomplettem Adjuvans folgte, gebildet. IgG wurde teilgereinigt aus den Antiseren durch Ammoniumsulfatfraktionierung gemäß der Beschreibung von Heide und Schwick (1978), am oben angeführten Ort, woran sich Dialyse in wäßrigem Natriumphosphat (1OmM) mit NaCI-Gehalt (0,14M), pH7,3, anschloß.

Beispiel 23 - Reinigung von Chymopapain und immunologische Mengenbestimmung von Chymopapain und PPIV i-iii) Handelsüblicher, im Sprühverfahren getrockneter Latex von Carica papaya (1 g), bezogen von Powell & Scholefield, Großbritannien, wurde präpariert und der pH-1,8-Behandlung gemäß Beschreibung in Beispiel 21 (i-iii a) unterzogen, iv) Eine Säule (15ml Bettvolumen) von ECH-Sepharose*, gekoppelt an L-Ala-L-PheSc (hergestellt gemäß Beschreibung in Beispiel 10) wurde, wie in Beispiel 21 (iv) beschrieben, gewaschen. Die endgültige überstehende Flüssigkeit von der pH-1,8-Behandlung wurde in wäßriges NaH₂PO*/Na₂HPO₄ (5OmM Na⁺) mit EDTA-Gehalt (1 mM) in Ethandiol (33% Vol./Vol.), pH6,8, (Applikationspuffer) dialysiert, 10 Minuten bei 4000 χ g zentrifugiert, und der Übstand wurde durch Zusatz von Dithiothreitol (2mM Endkonzentration) 15 Minuten lang bei 20⁰C aktiviert. Er wurde dann auf die Affinitätssäule (39ml/h/cm²) gebracht, woran sich 60 ml Applikationspuffer anschlossen. Natriumcitratpuffer (5OmM), pH4,5 mit Gehalt an EDTA1 mM) und Methylpyridyldisulfid (3OmM; 15ml) (synthetisiert gemäß der Beschreibung von Salih et al., Biochem. J. (1987), 247,181-193] wurde auf die Säule gebracht. Der Fluß wurde gestoppt, und der disulfidhaltige Puffer wurde über Nacht (18 Stunden) bei 20X auf der Säule gelassen.

v) Der Fluß wurde wieder aufgenommen mit dem Zusatz von 45 ml des gleichen Puffers mit Methylpyridylsulfidgehalt, gefolgt von 30ml Applikationspuffer. Fraktionen (5ml) wurden durchgehend gesammelt.

Die Fraktionen wurden auf Aktivität gegen BAPNA untersucht. Fraktionen, die den Peak der Aktivität, verzögert durch die Säule und eluiert in dem Methylpyridyldisulfid enthaltenden Puffer, enthalten, wurden gepoolt und auf eine Säule (80ml Bettvolumen) von Sephadex* LH-20 (Pharmacia) gebracht (40 ml/h/cm²), die mit wäßrigem EDTA (1 mM) in Ethandiol (33% Vol./Vol.) äquHibriert worden war. Die Chromatografie wurde durch Anwendung von 300 ml dieses Puffers fortgesetzt. Fraktionen (8 ml) wurden durch AA₂₇₁ kontrolliert und auf Aktivität gegen BAPNA analysiert.

Die Fraktionen mit dem Peak der Aktivität gegen ΒΑΡΝΑ (dem ein weiterer Peak von A271 folgte) wurden gepoolt und auf eine Kationenaustauschsäule von MonoSHR10/10 gebracht und, wie in Beispiel 21 (iii) beschrieben, behandelt. Fraktionen, die gegen BAPNA aktiv waren, wurden vereinigt.

Im Sprühverfahren getrockneter Latex und das aus der pH-1,8-Behandlung, Affinitätschromatografie und Kationenaustauschchromatografie rückgewonnene Material wurden auf die Anwesenheit von PPIV durch einfache radiale Immunodiffusion gemäß vorstehender Beschreibung analysiert. Die gleiche Methode wurde für die Chymopapainmengenbestimmung angewendet, wobei ein im Kaninchen gebildeter chymopapain-monospezifischer Antikörper gemäß Beschreibung in Beispiel 22 präpariert wurde. Die Standardkurve für Chymopapain wurde durch den Einsatz von Chymopapain erzeugt, das durch hierin beschriebene Verfahren gereinigt worden war und sich durch einfache radiale Immunodiffusion als frei von PPIV und PPIII erwiesen hatte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 enthalten.

Tabelle 3

Reinigung von Chymopapain und immunologische Mengenbestimmung von Chymopapain und PPiV

	Protein	BAPNA	Chymopapain	PPIV (%
	(mg)	spezifische	(mg)	von Gesamt
		Aktivität·		protein)
		(Einheiten
		mg"1)
Im Sprühverfahren
getrockneter Latex	468	1.000	144	18,7
Säurebehandlung	157	1.433	92	0,1
Sepharose-L-Ala-L-
PheSc	24	4.000	28	+
Kationenaustausch-
chromatografie	15	3.533	14	+

+ = nicht festgestellt

* BAPNA-AnalysemethodeNr.2

Beispiel 24 - Chymopapainallergieuntersuchung

Vierzig Humanserumproben wurden von 3M Diagnostic Systems, USA, gekauft. Diese Proben hatten bereits einen unter dem Handelsnamen Chymofast bekannten handelsüblichen Test auf IgE gegen eine im Handel erhältliche Form von Chymopapain, nämlich Chymodiactin®, durchlaufen. Zwanzig Proben davon waren als Chymofast positiv und zwanzig als Chymofast negativ gekennzeichnet. Die 40 Proben wurden „blind" in Empfang genommen und wurden auf natürlich erworbene IgE-Antikörper gegen Chymodiactin®, PPIII, PPIV und gegen gereinigtes Chymopapain (gereinigt durch hierin beschriebene Methoden und als frei von PPIV und PPIII erwiesen) durch einfache radiale Immunodiffusion unter Anwendung einer modifizierten Festphasen-ELISA (ELISA = enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung) unter Einsatz des Biotin-Avidin-Systems weiter getestet wie nachfolgend zusammengefaßt: Mikrotiterplatten beschichtet mit:

Testantigen

i Testserum

Monoklonales-Anti-Human-lgE

BiotinyliertesKaninchen-Anti-Maus-lg

Avidin-Peroxidase-Komplex

Ϊ Substrat (ABTS)

Stopp und Messung A₄₁₀

Chymodiactin® wurde innerhalb des Verfalldatums verwendet, PPIV wurde entsprechend der hier gegebenen Beschreibung gereinigt, und PPIII wurde in Übereinstimmung mit Buttle und Barrett (1984), am oben angeführten Ort, gereinigt. Alle Antigene wurden durch schonende Carboxymethylierung mit lodessigsäure (1OmM) gemäß der Beschreibung von Buttle und Barren (1984), am oben angeführten Ort, vor der Verwendung inaktiviert.

Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit Testantigen beschichtet, indem jede Vertiefung mit 100 μΙ Testantigen dOpg/ml) in Natriumcarbonatpuffer (0,05M, pH9,6) inkubiert wurde. Spenderpferdeserum (4%) wurde dann verwendet, um nichtspezifische Bindung während der nachfolgenden Schritte zu reduzieren. Inkubation mit Testserum (Verdünnung 1 /20) in PBS (0,1 %Tween, 2% Pferdeserum, 1OmM EDTA, 50μg/m\ Heparin; pH7,2 (ΙΟΟμΙ/Vertiefung) bei 37⁰C für 4 Stunden wurde abgelöst durch monoklonales Anti-Human-lgE (hergestellt gemäß Beschreibung von Kemeny & Richards in J. Immunol. Methods [1988] 108,105-1 μg/ml, ΙΟΟμΙ/Vertiefung) für 3 Stunden bei 37°C und danach biotinyliertesKaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin (erhältlich von Dakopatts, Dänemark,-1 μg/ml, 100μg/Vertiefung) über Nacht bei Raumtemperatur. Die Vertiefungen wurden 30 Minuten bei 37^CC mit Avidin-Peroxidase (ΙΟμΙ/ml, ΙΟΟμΙ/Vertiefung) inkubiert. Substrat (2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure), ABTS,0,5mg/ml] in Puffer (10OmM Citronensäure, 20OmM Na₁HPO₄,pH4,2, aktiviert mit 1 μΙ/ml H₂O₂) wurde zugesetzt, und die Vertiefungen wurden bei Raumtemperatur30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von ΙΟΟμΙ/Vertiefung 10OmM Citronensäure, 0,01 % NaN₃ gestoppt und die Absorbanz bei

41 Опт fur jede Vertiefung mittels eines Micro ELlSA Readers (Dynatech) bestimmt. IgE-Standards wurden über den Bereich von 0,075 bis 4,8ng/ml (2,4ng IgE = 11nternationale Einheit IgE) untersucht. Das Enzfitter-Programm (Leatherbarrow, R.J., 1985, Enzfitter fur IBM PC, Elsevier-Biosoft, 68 Hills Road, Cambridge CB 2 1 LA, Großbritannien) wurde zur Berechnung der gegen jedes der vier Antigenpraparate, nämlich Chymodiactin®, PPIII, PPIV und entsprechend der Beschreibung in Beispiel 23 hergestelltes Chymopapain, gerichteten IgE-Konzentrationen benutzt.

26 der 40 getesteten Serumproben enthielten IgE-Antikorper gegen Chymodiactin®, und die Werte, die fur PPIII, PPIV und Chymopapain von den 12 reaktivsten gegen Chymodiactin® gewonnen wurden, sind in nachstehender Tabelle 4 aufgeführt. Die mittleren und Standard-Fehlerwerte wurden von neun Bestimmungen abgeleitet.

Es ist ersichtlich, daß von diesen 12 Anti-Chymodiactin-Antikorper enthaltenden Serumproben nur bei zwei Proben Anti-Chymopapain die Haupt-lgE-Antwort darstellt und Antikörper gegen PPIII und PPIV fur ungefähr 75% des festgestellten relevanten IgE verantwortlich sind.

Tabelle 4

Spezifische IgE-Konzentrationen (IE/ml) in IgE-Antikörper gegen Chymodiactin¹⁸' enthaltenden Serumproben

Probe	PPIV	SEM	PPIII	SEM	Chymopapain	SEM	Gesamt	% Chymopapain
	Mittel	1,7	Mittet	1,7	Mittel	1,3
1	19,9	0,3	18,8	0,1	8,2	0,4	46,9	18
2	5,1	0,4	4,0	0,3	3,2	0,3	12,3	26
3	5,9	0,1	2,7	0,2	1,2	0,1	9,8	12
4	1,8	0,2	2,3	0,2	1,7	0,3	5,8	29
5	3,4	0,2	2,0	0,01	1,6	0,03	7,0	23
6	3,1	0,2	0,3	0,2	0,3	0,2	3,7	8
7	2,6	0,1	1,6	0,1	0,9	0,2	5,1	18
8	2,0	0,2	1,1	0,07	1,3	0,2	4,4	30
9	1.5	0,1	0,3	0,09	1,7	0,1	3,5	49
10	1,0	0,4	0,3	0,2	0,5	0,07	1,8	28
11	3,6	0,1	1,4	0,09	0,7	0,2	5,7	12
12	0,6		0,4		2,3		3,3	70
Gesamt	50,5	35,2	23,6	109,3	Schnitt 22

Beispiel 25 - Inhibierung von Gemischen aus Chymopapain und PPIV durch Hühnercystatin Chymopapain wurde gemäß Beschreibung in Beispiel 23 gereinigt und durch Aktivzentrum-Titration mit E-64 standardisiert, wobei BAPNA als Substrat eingesetzt wurde (Zucker et al, 1985, Biochem. Biophys. Acta828,196-204). Gemäß vorstehender Beschreibung gereinigtes PPIV wurde ebenfalls mit E-64 titriert, wobei eine Anpassung dieser Methode fur den Einsatz von Azocasein als Substrat angewendet wurde.

Hühnercystatin, Form 2, wurde gemäß Beschreibung von Anastasi et al, 1983, Biochem J.211,129-138, gereinigt und durch Titration mit Papain, das vorher mit E-64 titriert worden war, standardisiert.

Die Untersuchungen zur Azocaseinhydrolyse erfolgten nach der Methode von Rowan et al., 1988, am oben angeführten Ort, mit dem Unterschied, daß eine 1 Sminutige Vorinkubation von Enzymen und Inhibitor bei 40⁼C vordem Substratzusatz eingeschaltet wurde.

Es wurden zwei Sätze von 9 Rohrchen genommen, und in jedes Rohrchen wurden 125μΙ 0,4OM Natriumphosphatpuffer mit einem Gehalt von 4mM EDTA und 16mM Cysteinbase, pH6,8, gegeben. Chymopapain und PPIV wurden zugesetzt, und zwar in variierenden Verhaltnissen bis zu einer Endproteinasekonzentration von 10OnM. Zu einem Rohrchensatz wurde Hühnercystatin bis zu einer Endkonzentration von 1 μΜ gegeben, und zu dem anderen Satz wurde das gleiche Volumen Wasser gegeben. Die Rohrchen wurden dann vorinkubiert und auf Azocasein hydrolysierende Aktivität untersucht.

Die Wirkung von Hühnercystatin auf die Hydrolyse von Azocasein durch die Enzymgemische wurde als prozentuale Inkubieru ng der durch diegleichen Enzymgemische in Abwesenheit von Cystatin erzeugten Aktivität ausgedruckt, wie inTabelle 5 aufgeführt

Tabelle 5

Prozentuale Inhibierung von Gemischen aus Chymopapain und PPIV durch Hühnercystatin

PPIV	Chymopapain	Аз«	A366	%
(nM)	(nM)	-Cystatin	+Cystatin	Inhibierung
100	0	0,092	0,094	0
80	20	0,158	0,102	35,4
70	30	0,191	0,088	54,0
60	40	0,316	0,06	80,0
50	50	0,347	0,058	83,3
40	60	0,428	0,066	84,5
30	70	0,543	0,028	94,8
20	80	0,588	0,033	94,4
0	100	0,733	0,008	98,9

Es ist ersichtlich, daß der Grad der Inhibierung durch Hühnercystatin im umgekehrten Verhältnis zur PPIV-Konzentration stand.

Beispiel 26 - Reinigung von Chymopapain durch Säurefällung bei pH2,2-1,2

i) Handelsüblicher, im Sprühverfahren getrockneter Latex von Carica papaya, bezogen von Powell & Scholefield, Großbritannien, wurde mit destilliertem Wasser auf 20% (Masse/Vol.) aufgefüllt und eine Stunde lang gerührt. Das ungelöste Material wurde durch 30minütige Zentrifugation bei 9000 χ g bei 4⁰C entfernt. Das Pellet wurde verworfen, und der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wurde durch tropfenweisen Zusatz von Chlorwasserstoffsäure (1 %) unter Rühren bei 4°C bei einer Geschwindigkeit von 40pl/min/ml reduziert. Der pH-Wert des Gemisches wurde kontinuierlich überwacht, wofür ein Radiometer in Kombination mit einer Elektrode (Typ GK 2401 C), geeicht mit Pufferstandards von pH 4,01 und pH 1,09 (Radiometer, 25°C), eingesetzt wurde. Bei pH 2,2 und in Abständen von 0,2-pH-Einheiten bis hinunter zu pH 1,2 wurde der Säurezusatz gestoppt und der pH konstant gehalten, während bei 4⁰C weitergeführt wurde. Ein aliquoter Teil (10ml der Ausgangslösung äquivalent) wurde dann entnommen und aufbewahrt. Der Säurezusatz zu der verbleibenden Lösung wurde fortgesetzt, bis das nächste pH-Intervall erreicht wurde.

ii) Alle Proben wurden 30 Minuten lang bei 4^CC bei 9000 χ g zentrifugiert und die Pellets verworfen.

iii) Der pH jeder überstehenden Flüssigkeit wurde durch tropfenweisen (400 μΙ/min) Zusatz von NaOH (1 M) auf pH 6,8 eingestellt. Jede Probe wurde erneut 30 Minuten lang bei 9 000 χ g zentrifugiert, um jegliches zusätzliche Präzipitat zu entfernen.

Bei einem weiteren Experiment erfolgte die Säurefällung bei pH 1,8 bei 25°C.

Die schließliche überstehende Flüssigkeit wurde jeweils durch einfache radiale Immundiffusion gemäß vorstehender Beschreibung auf Aktivität gegen BAPNA und auf Anwesenheit von PPIV und erfindungsgemäßen Chymopapain analysiert. Die Resultate sind in Tabelle 6 angegeben und zeigen, daß Entfernung von PPIV auf Werte von 0,1 % des Gesamtproteins durch Säurefällung bei 4°C bei pH 1,8 und darunter und auf <0,5% durch Fällung bei 25°C bei pH 1,8 erzielt wurde.

Tabelle 6

Bedingungen	Temp.	Protein	BAPNA	ΒΑΡΝΑ	Chymopapain	PPIV (%
	(0C)	(mg)	Aktivität*	spezifische	(mg)	von Gesamt
			(Einheiten χ 10δ)	Aktivität*		protein)
				(Einheiten mg"1)
Ausgangslösung	-	946	15,8	1670	208	20,30
pH 2,2	4	848	9,5	1120	231	7,56
pH 2,0	4	865	9,1	1052	230	1,20
pH 1,8	4	796	9,0	1131	199	0,09
pH 1,6	4	828	7,7	930	224	0,06
pH 1,4	4	869	7,8	898	225	0,05
pH 1,2	4	784	7,1	906	166	0,03
pH 1,8	20	925	8,3	897	269	0,43

• BAPNA-AnalysemethodeNr.2

Beispiel 27 - Präparation von im Schaf gebildeten monospezifischen IgG-Antikörpern Gemäß Beschreibung in Beispiel 21 hergestelltes reines Chymopapain wurde vor der Verwendung nach der von Zucker et al. (1985), am oben angeführten Ort, beschriebenen Methode schonend carboxymethyliert und in wäßriges Natriumphosphat (1OmM), pH7,3, mit NaCI-Gehalt (0,14M) dialysiert.

Das Antiserum zu Chymopapain wurde in einem Schaf durch intramuskuläre Injektion von 10Opg des carboxymethylierten Proteins in komplettem Freundschem Adjuvans, woran sich nach einem Monat auf dem gleichen Wege verabreichte 50цд anschlossen, gebildet. IgG wurde teilgereinigt aus den Antiseren durch Ammoniumsulf atfraktionierung gemäß Beschreibung von Heide und Schwick (1978), am oben angeführten Ort, gefolgt von Dialyse in wäßriges Natriumphosphat (1OmM) mit NaCI-Gehalt (0,14M), pH7,3.

IgG-Präparate von Antikörpern gegen Papain, Papayaproteinase III und Papayaproteinase IV wurden auf ähnliche Weise präpariert.

Die einzelnen carboxymethylierten Antigene wurden separat, in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers, an unter dem Handelsnamen Zetaffinity (Anachem) gelieferte Säulen, die in wäßrigem Natriumphosphat (1OmM), pH7,3, mit NaCI-Gehalt (0,14M) äquilibriert worden waren, gekoppelt. Potentiell verunreinigende oder kreuzreagierende Antikörper wurden aus den IgG-Präparaten durch Hindurchleiten durch diese Säulen herausabsorbiert, so daß die fertigen IgG-Präparate Präzipitinreaktionen mit ihren entsprechenden Antigenen, aber keine präzipitierende Kreuzreaktion mit den unterschiedlichen Antigenen ergaben. Die antigenverbundenen Säulen wurden zur Wiederverwendung mit wäßrigem Diethylamin (0,05M), pH 11,5, regeneriert und sofort in Phosphatpuffer reäquilibriert.

Auf diese Weise wurden monospezifische Präparate von IgG-Antikörpern gegen Chymopapain, PPIII, PPIV und Papain hergestellt, die für quantitative Assays jedes Antigens durch einfache radiale Immunodiffusion gemäß vorstehender Beschreibung verwendet werden konnten.

Beispiel 28 - Reinigung von Chymopapain - Säurefällung bei pH 1,5

i) Handelsüblicher, im Sprühverfahren getrockneter Latex von Carica papaya (50 g), bezogen von Siebeis, USA, wurde bei 0°C 60 Minuten lang in deionisiertem und destilliertem Wasser (vorgekühlt auf 4°C, 250ml) gerührt. Der pH des Gemisches wurde auf pH 1,5 eingestellt, indem HCI (1 N) in einer Menge je Zeiteinheit von 10 μΙ/min/ml zugesetzt wurde, während der pH kontinuierlich unter Einsatz eines Radiometers in Kombination mit einer Elektrode (Typ GK2401 C), geeicht mit Pufferstandards von pH4,01 und 1,09 (Radiometer, 25°C), überwacht wurde. Bei Erreichen des pH-Wertes von 1,5 wurde eine lOminütige Periode zur pH-Stabilisierung eingeräumt, während der der pH, wenn erforderlich, weiter eingestellt wurde, ii) Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 12000 x g bei 4°C zentrifugiert, und das Pellet wurde verworfen, iii) a) Der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde durch Zusatz von NaOH (1M) in einer Menge je Zeiteinheit von ΙΟμΙ/min/ml unter kontinuierlicher pH-Überwachung mittels der mit pH-7,01-Pufferstandard geeichten Radiometer-Elektrode (Radiometer, 25°C) auf pH 7,0 eingestellt.

Bei Erreichen von pH7,0 wurde eine !Ominütige Periode zur pH-Stabilisierung eingeräumt, während der der pH, falls erforderlich, weiter eingestellt wurde. Das Gemisch wurde bei 12000 χ g 30 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, und das Pellet wurde verworfen.

b) Die überstehende Flüssigkeit wurde bei 4°C extensiv mittels 30 Volumen deionisierten und destillierten Wassers dialysiert, wobei zwei Wechsel in Abständen von 12 Stunden erfolgten.

Die dialysierte Lösung wurde durch Kationenaustauschchromatografie auf einer S-Sepharose-Hochleistungs-Sö/IOO-Säule (Pharmacia) weiter gereinigt. Für jeden Versuch wurden maximal 3g Protein (bestimmt durch A₂₈o) verwendet. Die Säule wurde mit wäßrigem EDTA(I mM) bei 4°C voräquilibriert. Nach der Probenapplikation wurde die Säule mit wäßrigem EDTA(I mM) bei 10ml/min gewaschen, bis A₂₈o auf Null zurückgekehrt war.

Ein Gradient (0,175mM K⁺/ml) bis 0,5M K⁺ wurde auf die Säule angewendet, und es wurden durchgehend 25-ml-Fraktionen gesammelt. Peak-Fraktionen wurden auf Aktivität gegen BAPNA analysiert.

Die Fraktionen mit Chymopapaingehalt mit der höchsten spezifischen Aktivität gegen BAPNA (eluiert zwischen 0,17 und 0,22M K⁺) wurden gepoolt. Das gepoolte Chymopapain wurde bei 4°C extensiv mit Hilfe von 30 Volumen deionisierten und destillierten Wassers dialysiert, wobei fünf Wechsel in 12-Stunden-lntervallen erfolgten. Das Dialysat wurde gefriergetrocknet und bei -20⁰C aufbewahrt.

Das gesamte Reinigungsverfahren wurde bei einer Reihe von Anlässen wiederholt. Die Anwesenheit von erfindungsgemäßem Chymopapain, Papain, PPIII und PPiV wurde unter Einsatz von einfacher radialer Immunodiffusion gemäß vorstehender Beschreibung und von im Schaf gebildeten Antikörpern, wie in Beispiel 27 beschrieben, untersucht. Die Aktivität gegen BAPNA und Aktivzentrum-Titration mit lodessigsäure wurden mit vorstehend beschriebener ΒΑΡΝΑ-Methode Nr. 1 eingeschätzt. Der Ablauf der Reinigungen wird durch die in Tabelle 7 aufgeführten Mittelwerte zusammengefaßt.

Tabelle 7

	Gesamt	BAPNA	Aktive	Chymo	PPIV	PPIII	Papain
	protein	spezifische	Zentren	papain	(%von	(%von	(%von
	(mg)	Aktivität	(%)	(%von	Gesamt	Gesamt	Gesamt
		(Einheiten		Gesamt	protein)	protein)	protein)
		mg"')		protein)
Ausgangsmaterial	10203	572	30	25	22	14	5
pH 1,5	8168	461	28	30	0,1	14	<0,1
Dialyse	4351	674	42	59	0,1	24	<0,1
Kationenaustausch-
chromatografie	948	1079	72	100	0,1	<0,1	<0,1
Dialyse	767	1098	89	100	0,1	<0,1	0,1
Gefriergetrocknet	ND	905	ND	ND	ND	ND	ND

ND = nicht ermittelt

+ = Protein eingeschätzt anhand der Gesamttrockenmasse

Beispiel 29 - Reinigung von Chymopapain - Säurefällung bei pH 1,5 und Affinitätschromatografie i-iii) Handelsüblicher, im Sprühverfahren getrockneter Latex von Carica papaya (50g), bezogen auf Siebeis, USA, wurde präpariert und einer pH-1,5-Behandlung gemäß Beschreibung in Beispiel 28 (i-iii a) unterzogen. Die überstehende Flüssigkeit wurde bei 4°C extensiv mittels 30 Volumen deionisierten und destillierten Wassers dialysiert, wobei zwei Wechsel in 12-Stunden-Intervallen erfolgten.

iv) Eine Säule (350ml Bettvolumen) von ECH-Sepharose®, gekoppelt an L-Ala-L-PheSc (hergestellt gemäß Beschreibung in Beispiel 10), wurde mit wäßrigem Ethandiol (33% Vol./Vol.) mit Natriumacetatgehalt (5OmM), pH4,5, über Nacht äquilibriert und anschließend mit wäßrigem NaH₂PO₄ZNa₂HPO₄ (5OmM Na~) mit EDTA-Gehalt (1 mM) in Ethandiol (33% Vol./Vol.), pH6,8 (Applikationspuffer) äquilibriert.

Die dialysierte überstehende Flüssigkeit (oben) wurde unter Verwendung eines Filters mit 0,2 pm Porengröße filtriert, und Ethandiol wurde bis zu 33% (Vol./Vol.) zugesetzt. Der pH der Lösung wurde kontrolliert und, falls erforderlich, auf pH 7,0 eingestellt. Frisch hergestelltes wäßriges L-Cystein (20OmM) wurde bis zu einer Konzentration von 4mM zugesetzt, die Lösung gut gemischt und 15 Minuten bei 4°C stehen gelassen. Sie wurde dann bei 4°C mit einer Fließgeschwindigkeit bis zu 40 ml/h/cm² (Beladung etwa 3mg Protein pro ml Bettvolumen) auf die Affinitätssäule gebracht. Die Säule wurde mit 10 Bettvolumen Applikationspuffer gewaschen.

v) Chymopapain wurde mit 3 Bettvolumen von wäßrigem HgCI₂ (1OmM) in Ethandiol (33% Vol./Vol.) mit Natriumacetatgehalt (5OmM), pH 4,5, eluiert, und es wurden 25-ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen mit Aktivität gegen BAPNA wurden gepoolt und durch Kationenaustauschchromatografie auf einer S-Sepharose-Hochleistungs-35/lOO-Säule (Pharmacia) weiter gereinigt. Maximal 3 g Protein (bestimmt durch A₂so) wurden für jeden Versuch verwendet. Die Säule wurde mit wäßrigem EDTA (1 mM) bei 4"C voräquilibriert. Nach der Probenapplikation wurde die Säule mit wäßrigem EDTA(I mM) bei 10ml/min gewaschen, bis A₂₈o auf Null zurückgegangen war. Drei Bettvolumen wäßriges K₂HPO₄/KH₂PO₄ (5OmM K⁺), pH 7,2, mit EDTA-Gehalt (1 mM) und L-Cysteingehalt (50OmM) wurden auf die Säule gebracht und der Fluß für 30 Minuten gestoppt. Weitere drei Bettvolumen frisch hergestellter Cysteinpuffer wurden auf die Säule gebracht und der Fluß für 30 Minuten unterbrochen. Die Säule wurde mit weiteren sechs Bettvolumen Cysteinpuffer gewaschen und dann mit wäßrigem K₂HPO₄/KH₂PO₄ (5OmM K*) mit EDTA-Gehalt (1 mM), pH7,2 erneut äquilibriert.

Ein Gradient (0,175mM K"7ml) bis 0,5M K⁺ wurde auf die Säule angewendet, und durchgehend wurden 25-ml-Fraktionen gesammelt. Peak-Fraktionen wurden auf Aktivität gegen BAPNA untersucht. Der erste Peak, eluiert zwischen 0,2 und 0,25 M K", war Chymopapain. Der zweite Peak, eluiert bei etwa 0,45M K", war Papayaproteinase III.

Es wurden die Fraktionen gepoolt, die Chymopapain mit der höchsten spezifischen Aktivität gegen ΒΑΡΝΑ enthielten. Das gepoolte Chymopapain wurde bei 4°C extensiv mittels 30 Volumen deionisierten und destillierten Wasser dialysiert, wobei fünf Wasserwechsel in 12-Stunden-lntervallen erfolgten.

Das aus der Kationenaustauschsäule eluierte Chymopapain war durch den Cysteinpuffer aktiviert worden und war daher für Inaktivierung durch Oxydation empfindlich. Um die Inaktivierung des aktiven Enzyms durch Oxydation im wesentlichen zu verhindern oder zu reduzieren, wurden Fraktionen in Röhrchen gesammelt, die eine Suspension von Natriumtetrathionat (20OmM) enthielten, um in jeder Fraktion eine Endkonzentration von 5mM NaS₄OeZU erhalten. Alternativ wurde das gepoolte Chymopapain unter Stickstoff mittels Wassers dialysiert, das in einem unter Stickstoff abgedichteten Behälter durch Hindurchperlen von Stickstoff mit einer Geschwindigkeit von 0,1 l/min von Sauerstoff befreit worden war. Schließlich wurde das Dialysat gefriergetrocknet und bei -20°C aufbewahrt.

Das gesamte Reinigungsverfahren wurde bei einer Reihe von Anlässen wiederholt, und der Ablauf der Reinigungen (Untersuchung wie in Beispiel 28 beschrieben) wird durch die in Tabelle 8 angeführten Mittelwerte zusammengefaßt.

Tabelle 8

	Gesamt	BAPNA	Aktive	Chymo	PPIV	PPIII	Papain
	protein	spezi	Zentren	papain	(%von	(% von	(% von
	(mg)	fische	(%)	(%von	Gesamt	Gesamt	Gesamt
		Aktivi		Gesamt	protein)	protein)	protein)
		tät		protein)
		(Einhei
		ten
		mg"1)
Ausgangs
material	25508	572	30	25	22	14	5
pH 1,5	20421	401	28	30	<0,1	14	<0,1
Dialyse	10877	674	42	59	<0,1	24	<0,1
Sepharose-
L-Ala-L-PheSc	1673	1446	86	66	<0,1	13	<0,1
Kationenaus-
tauschchroma-
tografie	951	1625	100	100	<0,1	<0,1	<0,1
Dialyse	828	1743	100	ND	ND	ND	ND
Gefriergetrock
net	ND	1320	ND	ND	ND	ND	ND

ND = nicht ermittelt

+ = Protein eingeschätzt anhand der Gesamttrockenmasse

Beispiel 30 - Reinigung von Chymopapain - Säurefällung bei pH 1,5 und Affinitätschromatograf ie i-iii) Handelsüblicher, im Sprühverfahren getrockneter Latex von Carica papaya, bezogen von Siebeis, USA, wurde präpariert und einer pH-1,5-Behandlung, Dialyse und Kationenaustauschchromatografie auf S-Sepharose® gemäß Beschreibung in Beispiel 28 unterzogen.

iv) Die Fraktionen, die Chymopapain mit der höchsten spezifischen Aktivität gegen BAPNA enthalten, wurden gepoolt, und Ethanol bis 33% (Vol./Vol.) zugesetzt. Frisch hergestelltes wäßriges L-Cystein (20OmM) wurde bis zu einer Konzentration von 4mM zugesetzt, und die Lösung wurde auf eine Säule von ECH-Sepharose^e, gekoppelt an L-Ala-L-PheSc-wie in Beispiel 29 (iv) beschrieben - gebracht.

v) Chymopapain wurde mit 3 Bettvolumen wäßrigem HgCI₂ (1OmM) in Ethandiol (33% Vot./Vol.) mit Natriumacetatgehalt (5OmM), pH4,5, eluiert, und 25-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Fraktionen mit Aktivität gegen BAPNA wurden gepoolt und extensiv bei 4 "C mittels 30 Volumen deionisierten destillierten Wassers dialysiert, wobei fünf Wechsel in 12-Stunden-lntervallen erfolgten. Das Dialysat wurde gefriergetrocknet und bei -20°C aufbewahrt.

Der Ablauf der Reinigung (Untersuchung wie in Beispiel 28 beschrieben) wird in Tabelle 9 zusammengefaßt.

	Gesamt	8APNA	Aktive	Chymo-	PPIV	-24-	PPIII	296 960
Tabelle 9	protein	spezifi	Zentren	papain	(%von		(% von
	(mg)	sche Akti	(%)	(%von	Gesamt	Gesamt	Papain
		vität		Gesamt	protein)	protein)	(%von
		(Einheiten		protein)			Gesamt
		mg"')					protein)
	28795	632	31	27	25	16
Ausgangs	23 257	458	24	28	<0,1	13
material	8319	916	57	75	0,2	25	6
pH 1,5							<0,1
Dialyse							<0,1
Kationen-
austausch-	3102	1 103	72	91	<0,1	<0,2
chromato-
grafie	947	1245	89	ND	ND	ND	<0,1
Sepharose-	858	1587	88	100	ND	<0,1
L-Ala-L-PheSc							ND
Dialyse	972	1265	69	ND	<0,1	ND	<0,1
Gefrier
getrocknet					ND

ND = nicht ermittelt

+ = Protein eingeschätzt anhand der Gesamttrockenmasse

Beispiel 31

Zwei Präparate von erfindungsgemäßem Chymopapain wurden unter Anwendung der BAPNA-Analysemethoden 1 und 2 am gleichen Tage untersucht. Protein wurde anhand der Gesamttrockenmasse eingeschätzt. Chymopapainpräparat A stammte von einem Reinigungsverfahren gemäß Beschreibung in Beispiel 28. Chymopapainpräparat B stammte von einem Reinigungsverfahren gemäß Beschreibung in Beispiel 29 (Endfraktionen in Natriumtetrathionat gesammelt). Die Resultate der dreifach ausgeführten Analysen sind in Tabelle 10 aufgeführt.

Tabelle 10

Chymopapainpräparat

BAPNA spezifische Aktivität (Einheiten mg"¹)

Analysemethode Nr. 1

Analysemethode Nr. 2

855 1261

2 227 3591

Beispiel 32

Gemäß Beschreibung in Beispiel 29 gereinigtes und unter Stickstoff, wie darin beschrieben, dialysiertes Chymopapain wurde gefriergetrocknet und bei -20⁰C aufbewahrt. Das gefriergetrocknete Chymopapain hatte bei 37⁰C und pH6,0 eine spezifische Aktivität gegen BAPNA (1 mM) von 1345 Einheiten pro mg.

Zur Hersteilung von 100 Phiolen einer Zusammensetzung, die gereinigtes Chymopapain umfaßt, werden 43,75 gFüllösung (bulk solution) bereitet. Die Füllösung wird während der ganzen Verarbeitung bei 4⁰C bis 12°C gehalten. L-(+)-Cysteinhydrochlondmonohydrat (166mg) wird zu etwa 30g Wasser zur Injektion gegeben, um im Endvolumen eine Konzentration von 22mM zu erhalten. Der pH der Lösung wird mit NaOH (1 M) oder HCI (0,1 M) auf pH5,0 bis 5,5 eingestellt. Die Cysteinlösung wird zu gereinigtem Chymopapain (358mg) gegeben, um eine Konzentration von 11000 Einheiten/ml Endvolumen zu schaffen. Der pH dergerührten Lösung wird mit NaOH (1 M) oder HCI (0,1 M) auf pH 5,9 bis 6,1 eingestellt, und es wird mit Wasser für Injektion auf 43,75g aufgefüllt. Die Lösung wird durch Hindurchleiten durch zwei Filter mit einer Porengröße von 0,2 Mikron in Reihe sterilisiert. 0,4-g-Aliquoten der Lösung werden in 100 5-ml-Glasphiolen gefüllt. Die Phiolen werden mit einem Stopfen verschlossen, das Wasser wird durch Gefriertrocknen unter red uziertem Druck entfernt, und die das lyophilisierte Produkt enthaltenden Phiolen werden unter Vakuum verschlossen.

Jede Phiole enthält ein weißes amorphes Pulver, das 3,27 mg Chymopapain und 1,52 mg Natriumcysteinathydrochtorid enthält (Nennwert 4000 Einheiten bzw. 8цтоІ, wobei ein Schwundzuschlag von 10% berücksichtigt wird). Die Zusammensetzungen werden im allgemeinen unmittelbar vor der Verwendung durch den Zusatz von 2ml Wasser für Injektion zur ursprünglichen Konzentration verdünnt, so daß eine injizierbare Lösung mit einem Nenngehalt von 4000 Einheiten Chymopapain und 4mM L-Cystein entsteht.

Claims (3)

1. Ausfällen eines wäßrigen Gemisches mit Gehalt an Rohchymopapain bei einem pH-Wert unter 2,0;

1. Verfahren zur Reinigung von Chymopapain, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt: A.

a) Inkubieren einer wäßrigen Lösung von Rohchymopapain mit einer auf das Aktivzentrum gerichteten Affinitätschromatographiematrix, die eine Trägermatrix umfaßt, die-wahlweise über einen Spacerarm - kovalent gekoppelt ist an das N-Ende eines reversiblen Chymopapain inhibierenden Peptids, so daß sich das Peptid an das aktive Zentrum eines Chymopapainmoleküls bindet; und

b) Eluieren des Chymopapains mit einem geeigneten Elutionsmittel; B.

2. Trennen einer wäßrigen Lösung von Rohchymopapain von dem Gemisch; und

3. Neutralisieren und wahlweise Entsalzen der Rohchymopapainlösung oder