BG60916B1

BG60916B1 - Химопапаин и метод за пречистването му

Info

Publication number: BG60916B1
Application number: BG95362A
Authority: BG
Inventors: Alan J Barrett; David J Buttle; Daniel H Rich
Original assignee: Boots Co Plc
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1991-10-24
Publication date: 1996-06-28
Also published as: HU903342D0; FI914995A0; ATE107660T1; HU211746A9; LT3827B; GR900100315A; PL166810B1; HUT58345A; YU87090A; CA2056402C; DE69010199T2; US5468480A; IL94227A0; ES2055427T3; LV10200B; LTIP1645A; WO1990013561A1; DE69010199D1; IE64351B1; NO914206D0

Abstract

Химопапаинът намира приложение в медицината за лечение на херния на междупрешленния диск. Той е практически свободен от имунологично различни протеинази, които са намерени в латекс от папайя. Химопапаинът има специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ (1 mM) при 37°С и pH 6,0, която се определя в границите от 800 до 1700 единици за Mg, и съдържа по-малко от 0,2% от папайя протеиназа III, папаин и папайя протеиназа IV. Методът включва инкубиране на воден разтвор на суров химопапаин с матрица за афинитетна хроматография с насочен център, обхващащ носеща матрица, ковалентно свързана по избор чрез пространствена връзка към N-края на пептид, обратимо инхибиращ химопапаина така, че пептидът се свързва с активната част на молекулата му, след което химопапаинът се елуира с подходящ елуент.

Description

Изобретението се отнася до химопапаин, фармацевтични състави, съдържащи химопапаин и методи за лечение на увредени, с херния или по друг начин ненормални междугръбначни дискове от гръбнака на бозайници, съгласно които в тези дискове се инжектира разтвор на предлагания състав. Изобретението се отнася и до методи за получаване на химопапаина съгласно изобретението, до пептидите и матриците за афинитетна хроматография, които се използват при такива методи, както и до моноспецифични препарати с антитела, развити срещу химопапаин.

Химопапаинът е цистеинпротеиназа, съдържаща се в латекса от растението папайя (Carica papaya). Намира клинично приложение специално за лечение на дискове с пролапс или херния или невралгия на седалищния нерв, при метод известен като „хемонуклеолиза“ Smith L., J. Am. Med. Assoc., 187, 137-140 (1964).

Пречистването и охарактеризирането на химопапаина е извършено за първи път от Jansen u Balls (J. Biol. Chem., 137, 405-417 (1941), които използват киселинно утаяване и метод за изсолване за получаване на ензима. По-късно са използвани методи за пречистване на база йонообменна хроматография.

Така например в двата патента GB N 2098997 и GB N2156821 се описва употребата на катийонобменни смоли за разделяне на химопапаина от други познати цистеинпротеинази. И двата метода са използвани за получаване на химопапаин в индустриален мащаб. Все пак полученият в резултат продукт, както е установено, е с относително ниска специфична активност сравнен с химопапаина, получен от Buttle и Barrett (Biochem. J., 223, 81-88, 1984) при използване на многостадиен метод в малък мащаб, включващ между другото и етап на катийонобменна хроматография. При все че този продукт е с висока специфична активност, той е получен само в твърде ниски добиви и методът е неподходящ за приложение в търговски мащаб. Buttle и сътр, (Biochem. J. (юли 1989), 261, 469-476) са установили сега, че този продукт е онечистен с изолираната и охарактеризирана напоследък протеиназа, папайапротеиназа IV, която се елуи ра заедно с химопапаина от катийонобменните смоли. С катийонобменната хроматография е невъзможно да се раздели химопапаина от папайяпротеиназата IV до степен, която да бъде от полза при получаването на химопапаин, по същество свободен от онечиствания с папайяпротеиназа IV.

Литературата съдържа също източници за методи, при които се използва афинитетна хроматография. Polgar (Biochem. Biophys. Acta, 658, 262-269,1981) описва пречистване на химопапаин, при което се използва между няколкото други техники афинитетна хроматография върху живак-агарозна колона, а Dubois и сътр. (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1988, 369, 733-740) съобщават за разделянето на цистеинпротеинази от латекса на Carica papaya като се използва подобна техника. Този тип афинитетна хроматография се основава на взаимодействието между живачни лигандни връзки от инертна матрица и тиоловите групи на протеините, подложени на него. Така протеини различни от химопапаина, по специално други цистеинпротеинази като папайяпротеиназа IV, могат да се свързват при използване на такива колони и впоследствие да бъдат елуирани заедно с химопапаина.

Напоследък научни статии описват използването на афинитетна хроматография при употребата на имобилизирани пептидни производни за пречистване на специфични протеинази като човешки катепсин в Rich et al., Biochem. J., 235, 731-748, 1986 и хистолизин от Cutamoeba, histolytica Zuaches and Barrett, Biochem. J. 250, 903-409, 1988.Този подход до сега не е прилаган към методи за пречистване на химопапаин, а нуждата от подробен метод за пречистване на химопапаин, подходящ за използване в индустриален мащаб остава очевидна.

Някои синтетични пептидни производни, които са инхибитори на серинпротеиназата химотрипсин са описани в WO 84/00365.

Съгласно изобретението е създаден нов метод за пречистване и изолиране на високоактивен химопапаин, свободен от онечиствания и в частност, свободен от други цистеинпротеинази, съдържащи се в латекса на папайя, включително папайяпротеиназа IV.

Настоящото изобретение осигурява химопапаин, който е по същество чист и който съдържа във висока степен активната форма на ензима.

Химопапаинът съгласно настоящото изобретение е по същество свободен от имунологично различни протеинази, намерени в латекс от папайя, а именно папаин, папайяпротеиназа III /РРШ/ и двете описани от Buttle и Barrett, (Biochem. J., 223, 81-88, 1984) и в частност откритата напоследък папайяпротеиназа IV /PPIV/. „По същество чист“ както се използва тук може още да се дефинира като „по същество имунологично чист“ и се отнася до отсъствие на всякаква съществена кръстосана реакция между химопапаина от настоящото изобретение и специфични антитела, развити срещу чиста PPIV, изолирана и охарактеризирана от Buttle и сътр. (Biochem. J. (юли 1989), 261, 469-476), както и на отсъствие на всяка съществена реакция със специфични антитела, развити срещу папаин и РРШ, както е описано по-рано от Buttle и Barrett (Biochem. J., 223, 81-88, 1984). Трябва да се отбележи специално, че така нареченият „чист“ химопапаин, получен по метода на Buttle и Barret, съдържа съществени количества /около 14%/ от PPIV и следователно полученият от тях оригинален препарат с антихимопапаин антитела има специфичност и за пречистения химопапаин съобразно изобретението и за пречистена PPIV. Химопапаинът съгласно изобретението съдържа по-малко от 0,2, за предпочитане не повече от 0,1% за всеки от PPIV, РРШ и папаин.

Кръстосана реакция между антиген и антитяло може да бъде определена чрез конвенционални техники добре познати на специалистите. Такива техники включват например ракетна имуноелектрофореза и двойна имунодифузия /описани от Buttle и Barrelt loc. cit./ прост радиален имуноанализ, радиоимуноанализ /RTA/ и ензимносвързан имуносорбентен анализ /ELISA/.

Количествто на активен ензим, намиращ се в един ензимен препарат най-общо се изразява с неговата специфична активност спрямо специфичен субстрат при специфичните условия на опита. Изразът „специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ“ както е използван тук означава протеиназната активност в пикомолове р-нитроанилин, образуван за секунда от mg сухо тегло от продукта (pmol/sec/mg), когато се анализира със синтетичен субстрат N-a-6eH3ona-DL-aprHHHH р-нитроанилин /ΒΑΡΝΑ/ при стандартни условия на анализа. Стандартните условия на анализа, използвани за известни фарма цевтични препарати с химопапаинса описани подробно по-нататък като „ΒΑΡΝΑ анализ метод N 1“ или „Анализ на Smith“ и специфичните активности, получени при тях са изразени с понятието специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ /1тМ/ при 37С и pH 6,0. Химопапаинът съгласно изобретението е дефиниран като притежаващ специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ /1тМ/ при 37С и pH 6,0 между 800 и 1700 единици за mg, за предпочитане между 1000 и 1700 единици за mg, например 1200 до 1500 единици за mg, когато се анализира при 37С и pH 6,0. В предпочитан аспект изобретението осигурява химопапаин със специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ /1 mM/при 37^UC pH 6,0 поне 1300 единици за mg.

Докато протеиназната активност е твърде широко определена в обширната литература относно химопапаин и други цистеин протенази от гледна точка на освобождаването на р-нитроанилин от синтетичния субстрат ΒΑΡΝΑ, когато се направи директно сравнение между цифрите за определената специфична активност, могат да се срещнат проблеми. Точните стойности, които са достигнати, зависят от много фактори, особено точните условия, например pH-то, температурата, буферния състав и концентрацията на субстрата, използвани при анализа. Химопапаинът, получен от Buttle и Barrelt /1984/, loc. cit., е определен в тяхната статия със специфична активност спрямо BARNA 0,154 pmol/min/mg, което се равнява на 2567 pmol/ sec/mg. Все пак условията на анализа, използвани от Buttle и Barrett се различават от тези, използвани за известни фармацевтични качества на химопапаин и специфичните активности не могат директно да бъдат сравнявани.

Тъй като се приема, че материалът, приготвен от Buttle и Barrett е химопапаиновият препарат, притежаващ най-високата специфична активност, съобщавана досега, първоначалната работа относно настоящото изобретение е извършена като се използват условията на анализа, определени в тяхната статия. Този метод е посочен тук като ΒΑΡΝΑ Анализ Метод N2 и специфичните активности, произлизащи от него са дадени посредством специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ /2,5тМ/ при 40С и pH 6,8, за да се изясни, че условията на анализа се различават от тези, използвани за фармацевтични препарати с химопапаин. Резултатите, получени като се използва този анализ, са два до три пъти по-високи от тези, получени като се използват конвенционалния фармацевтичен ΒΑΡΝΑ анализ Метод N1, въпреки че ще бъде некоректно да се прилага прост конверсионен фактор за превръщане на резултати, получени по един анализен метод към тези от друг. Въпреки това в началото на работата във връзка с настоящото изобретение показа, че специфичната активност спрямо ΒΑΡΝΑ /2,5тМ/ при 40С и pH 6,8 на чистия химопапаин съгласно изобретението може да бъде определена между 3000 и 4500 единици за mg, например 3500 до 4500 единици за mg.

В публикация Buttle и сътр. Biochem. J. (юли 1989), 261, 469-476 е описано пречистване и охарактеризиране на неизвестен досега контаминант на химопапаина, получаван по досега известните методи, а именно папайяпротеиназа IV /PPIV/. Докато PPIV е неактивна спрямо ΒΑΡΝΑ, тя има протеиназна активност спрямо азоказеин. Нещо повече, намерено е, че активността на PPIV спрямо азоказеина по същество не се инхибира от концентрации от пилешки цистатин до 1 μΜ. Активността на химопапаина съгласно изобретението спрямо азоказеин е поне 95% инхибирана от тези концентрации на пилешки цистатин. Изразът „активност спрямо азоказеин“, както е използван тук означава протеиназна активност от гледище на количеството пептиди, разтворими в трихлороцетна киселина, образувани за единица сухо тегло от продукта, когато се анализира с дериватизиран протеинов субстрат азоказеин при стандартни условия на анализа, описани тук по-нататък. За предпочитане химопапаинът съгласно изобретението има активност спрямо азоказеин, която е поне 97%, по-специално 98 до 100% инхибирана от концентрации от пилешки цистатин до 1 μΜ.

Химопапаинът съгласно изобретението е по същество чист химопапаин, получен за първи път без онечистващи протеини и съдържа във висока степен активна форма на ензима. До този момент заедно с химопапаина е извличан и онечистващ протеин, например при йонообменна афинитетна хроматографическа колона. По-късно е осъществено изолирането и охарактеризирането на онечистването като PPIV. Методът за полу чаване на PPIV е неприложим за получаването на чист химопапаин, но получаването на PPIV осигурява два важни параметъра,чрез които чистият химопапаин може да бъде охарактеризиран, а именно 1/ отсъствието на кръстосани реакции на чистия химопапаин с PPIV - специфични антитела и 2/ различната активност на чистия химопапаин и PPIV спрямо азоказеин в присъствието на пилешки цистатин. Тези две характеристики са съществени условия, необходими за създаването на подходящ метод за пречистване на химопапаин.

Видно е, че химопапаинът съгласно изобретението е предпочитаният химопапаин в почти всички възможни области на действие. Чисти ензимни препарати са от жизненоважно значение за тези, които се опитват пълно да характеризират ензими, например от гледище на тяхната каталитична специфичност и структура.

Съгласно друг аспект настоящото изобретение осигурява състав, съдържащ химопапаин съгласно изобретението. Съставът е по същество свободен от PPIV. Химопапаинът има специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ /1тМ/ при 37*’С и pH 6,0 между 800 и 1700 единици за mg. Съставите могат да бъдат под формата на дискретни единици в подходящо тегло, например под формата на аликвотни части от химопапаина, запечатани в безводни условия, във вакуумирани стъкла или ампули. Такива състави могат да съдържат още редуциращ агент като дитиотреитол, свободна от цистеин основа или присъединителна с киселина сол на същата, за да се предотврати по същество инактивиране на ензима поради окисление. Алтернативно съставите могат да съдържат още обратим инхибитор на цистеинпротеиназата, прибавен под формата на сол, например натриев тетратионат или меркурихлорид. Тези обратими инхибитори блокират активната част на ензима, като с това предотвратяват инактивирането му чрез окисление, докато бъдат изместени например от редуциращ агент, който реактивира ензима. Ако се желае, могат да се прибавят и други общоприети добавки като консерванти, например натриев бисулфат, хелатообразуващи агенти като ЕДТА и носители като натриев хлорид.

Използването на чисти ензимни препарати е особено важно при клиничното при лагане на химопапаина, например при хемонуклеолиза, където е известно, че могат да настъпят алергични реакции у най-малко 3% от третираните пациенти. В хранителната промишленост широко се използва разпратен екстракт от папайя и се счита, че много от алергичните реакции към хемонуклеолизата се дължат на предварително сенсибилизиране с такива препарати. Все пак е добре известно, че инжектирането на чужди протеинни антигени на бозайници винаги е съпроводено от риск за анафилактичен шок. Здравата медицинска практика изисква да се използва най-чистата и най-активната форма на всеки такъв протеин, който е достъпен, за да се постигне оптималната полза от процедурата, както и да се намали рискът от алергични реакции.

Така предпочитан аспект от изобретението осигурява фармацевтичен състав, който съдържа химопапаин съгласно изобретението. Съставът е по същество свободен от PPIV. Химопапаинът има специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ /1тМ/ при 37С и pH 6,0 между 800 и 1700 единици за mg. Фармацевтичните състави за предпочитане съдържат още фармацевтично допустим нетоксичен редуциращ агент като свободна от цистеин основа или присъединителна с киселина сол на същата, например L - цистеин хидрохлоридмонохидрат. Най-общо редуциращият агент се съдържа в количество от около 0,5 до 3 mg за 4000 единици химопапаин, като образува например 15 до 90% от теглото на химопапаина. Все пак фармацевтични състави съгласно изобретението могат още да съдържат всеки конвенционален фармацевтично допустим разредител, ексципиент или носител, например консерванти като натриев бисулфит, хелатообразуващи агенти като ЕДТА и носители като натриев хлорид, които се прибавят при желание.

Фармацевтични състави, съдържащи химопапаин съгласно изобретението могат да се използват в офтамологията, например при лечението на очни увреждания или за отстраняване на некротизирали тъкани от например изгаряния, язви, пресорни некрози, декубитуси и други рани, при които са налице девитализирани тъкани. Такива състави се произвеждат най-общо във форма, подходяща за местно прилагане, например стерилни разтвори, гелове, суспензии или мази, които могат да се прилагат директно върху раната или могат да бъдат приложени посредством превръзка на раната, импрегнирана със състава.

За предпочитане е химопапаинът съгласно изобретението да бъде приготвен във форми за ортопедична употреба. Такива фармацевтични състави могат да бъдат удобно приготвяни във формата на единични дози за парентерално приложение, например под формата на стерилен свободен от пирогени разтвор или суспензия в подходящ носител или в концентрирана форма, подходяща за разреждане преди употреба. Формите на единични дози, подходящи за употреба при разтваряне или лечение на нуклеус пулпозус при ненормален или увреден междупрешленен диск чрез инжектиране в него, могат да съдържат между 500 и 5000 ΒΑΡΝΑ единици /анализирани с 1 тМ ΒΑΡΝΑ при 37С и pH 6,0 /химопапаин съгласно изобретението и редуциращ агент като натриев цистеинат хидрохлорид, опаковани във вакуумирано стъкло. Предпочитаните форми на единични дози съдържат номинално 2000 или 4000 ΒΑΡΝΑ единици /1 тМ ΒΑΡΝΑ, 37С, pH 6,0/ химопапаин. Една дозирана форма може най-общо да съдържа например 2 до 5 mg, за предпочитане 2,5 до 3,5 mg химопапаин и 0,2 до 3 mg, за предпочитане 1,0 до 2,0 mg натриев цистеинат хидрохлорид, поставени във вакуумиран контейнер, по избор в смес с подходящ носител като натриев хлорид.

В експерименти, описани тук по-нататък, в 26 индивидуални серумни проби е установено наличие на естествено придобити IgE антитела срещу търговскодостьпния химопапаинов препарат Химодиактин, произведен съгласно методът, описан в Zucker et all, Biochim. Biophys. Acta, 828, 1985. Тук експериментално е показано, че тези серуми съдържат IgE антитела към химопапаина съгласно изобретението и към три други цистеинпротеинази, намерени в латекса на папайя, а именно папаин, РРШ и PP1V. Все пак усреднените IgE нива за химопапаин, РРШ и PP1V показват, че РРШ и PPIV заедно наброяват приблизително 75% от откритите IgE. Тези резултати ясно сочат, че тези протеини имат съществен имуногенен характер и могат да представляват главна част в антигенните детерминанти, съдържащи се в досега достъпните форми на химопапаин и представляват изненадващо голям потенциал за антигенна случайност. Фармацевтичните състави съгласно изобретението по такъв начин имат съществени предимства пред досега известните състави.

Настоящото изобретение също се отнася до метод за лечение чрез хемонуклеолиза на увредени, с херния или по друг начин ненормални междупрешленни гръбначни дискове у бозайници, който обхваща инжектиране в споменатия диск на фармацевтично приемлив разтвор на химопапаин съгласно изобретението в количество, достатъчно селективно да разтвори части от споменатия диск.

Изобретението се отнася още до метод за третиране на ненормален гръбначен диск в бозайников субект, който се състои в:

I/ вкарване на игла в посочения диск;

II/ потвърждаване местоположението на иглата посредством рентгенови лъчи;

II/ инжектиране в посочения диск фармацевтично приемлив разтвор на химопапаин съгласно изобретението, в количество достатъчно селективно да разтвори части от споменатия диск.

Настоящото изобретение също осигурява метод за пречистване на химопапаин, който се състои в:

а/ инкубиране на воден разтвор от суров химопапаин с матрица за афинитетна хроматография с насочена активна част, представляваща поддържаща матрица ковалентно свързана по избор чрез „пространствена ръка“ към N-края на обратим пептиден инхибитор на химопапаина, така че споменатият пептид се свързва с активната част на химопапаиновата молекула;

б/ елуиране на химопапаина с подходящ елуент.

Суровият химопапаин, използван като изходен материал за пречистването на химопапаина съгласно изобретението може да бъде екстракт от свеж латекс от папайя, разтвор, получен от търговско достъпен препарат от изсушен чрез разпрашаване латекс, папаинов концентрат или частично пречистен химопапаин, или може да бъде разтвор от търговски препарат от т. н. „чист“ химопапаин. Обаче специалистите ще преценят, че относително цялостни екстракти от папайя като латекс от папайя съдържат значителни количества от други природно разпространени компоненти, които е желателно да бъдат отстранени. За предпочитане е съществените части от такива компоненти да бъдат отстранени преди суровият химопапаинов разтвор да се инкубира с матрицата за афинитетна хроматография, например чрез филтриране или центрофугиране, за да се премахне неразтворимият материал. Все пак съгласно изобретението преимущество е етап на киселинно утаяване, при което се утаява съществена част на онечистванията.

Процедури на киселинно утаяване, при което pH на водния разтвор на суровия химопапаин се намалява до pH 2, оставя се да стои и след това се отделя химопапаиновия разтвор, са използвани за пречистване на химопапаин от почти 50 години. Неочаквано съгласно изобретението е установено, че точното pH използвано при такива процедури критично повлиява онечистването на получения в резултат химопапаинов разтвор с PPIV. Грижливото измерване и контрол на тази процедура, досега считана, че е суров предварителен етап в пречистването на химопапаина, силно намалява онечистването с PPIV, протеинът, който както е установено сега, се пречиства заедно с химопапаина при използването на конвенционалните техники. Съгласно изобретението се осигурява метод за пречистване на химопапаин, който се състои в:

1. Утаяване на водна смес, съдържаща суров химопапаин при pH от 1,2 до 1,8.

2. Разделяне на водния разтвор на суровия химопапаин от споменатата смес и

3. Неутрализиране и по избор изсолване на споменатия разтвор на суровия химопапаин.

Предпочита се да се отстранява всяко оставащо протеиново онечистване от препарата, като се включи поне един етап на конвенционална катийонообменна хроматография през време на процеса на пречистване, например, както е описано от Buttle и Barrett 1984, loc. cit. Особено се предпочита да се използва високоефективна хроматография, например FPLC® върху катийонообменна смола, като тези продавани под търговските наименования мопо S или Sepharose® HP Pharmacia, в крайния етап.

Особено предпочитан аспект на настоящото изобретение е метод за пречистване на химопапаин, който се състои в:

I/ утаяване на водна смес, съдържаща суров химопапаин при РН по-ниско от 2,0;

II/ разделяне на водния разтвор на суров химопапаин от споменатата смес;

III/ неутрализиране и по избор изселване на споменатия разтвор на суров химопапаин;

IV/ инкубиране на разтвора, получен при етап III с матрица за афинитетна хроматография с насочена активна страна, състояща се от поддържаща матрица ковалентно свързана, по избор чрез пространствена ръка към N-края на обратим пептиден инхибитор на химопапаина, така че споменатия пептид свързва активната страна на химопапаиновата молекула;

V. елуиране на химопапаина с подходящ елуент

За специалистите е очевидно, че предпочитаният етап на катийонообменна хроматография може алтернативно или допълнително да бъде използван непосредствено или след стадия на афинитетна хроматография, ако това се желае.

Водната смес, съдържаща суров химопапаин може да бъде например пресен латекс от папайя, изсушен чрез разпрашително сушене латекс от папайя, или папаинов концентрат /например разпрашително сушен латекс търговско достъпен от Powell и Scholefield, UK, или от Siebels, САЩ/ суспендиран във вода или във воден буфер като фосфатен или ацетатен буфер. За предпочитане е неразтворимият материал да се отстрани по конвенционален начин, например чрез филтриране или центрофугиране, преди киселинното утаяване на сместа. Сместа може да бъде подкислена чрез градиентно прибавяне на органична или неорганична киселина, за предпочитане с водна неорганична киселина, като солна киселина, за да се намали стойността на pH на сместа до между 1,0 и 2,0, за предпочитане 1,2 до 1,8, поспециално до pH от около 1,5. Утаеният материал може да се отстрани по конвенционален начин, например чрез филтриране или центрофугиране. Полученият в резултат кисел разтвор на суров химопапаин е установено, че не съдържа PPIV, папаин и в по-малка степен РРШ.

Преди да бъде подложен на някой от покъсните стадии на хроматография, киселият химопапаинов разтвор, се неутрализира с алкален реагент, като воден натриев хидроксид и за предпочитане да се отстранят излишните соли от разтвора по конвенционален начин, например чрез гелна филтрация или диализа. Всеки по-късен утаен материал може да бъде отстранен чрез филтриране или центрофугиране.

Добре известно е на специалистите по цистеинпротеиназина, че активността на такива ензими може забележимо да бъде увеличена чрез активиране с редуциращ агент като дитиотреитол или цистеин и чрез премахване на следите от тежки метали като живак посредством хелатообразуващи агенти като EDTA или хелатообразуваща смола като тази продавана под търговското наименование Chelex (Bio Rad, UK). Такива мерки оптимизират присъствието на свободни тиолови групи, които известно е, са съществен елемент на активните части на цистеинпротеиназите и се изискват за активност. За предпочитане отстраняването на тежки метали се постига чрез диализа спрямо буфер, съдържащ ЕДТА. Алтернативно, когато се използва катийонообменна хроматография тежките метали могат да бъдат отстранени чрез активиране на химопапаина с редуциращ агент, тъй като той се свързва с катиойонообменната колона и последващо промиване на колоната.

Изгодно е суровият химопапаинов разтвор, получен след неутрализацията да се обработи с редуциращ агент като цистеин, за да се осигури максимално излагане на активните части и да се разреди до подходящо протеиново съдържание, например 30 mg/ml. Неутрализираният суров химопапаинов разтвор след това се инкубира с матрица за афинитетна хроматография с насочена активна страна, така че химопапаинът се свързва специфично посредством активната част за пептидния инхибитор, свързан също там. Химопапаиновият разтвор може да бъде приложен към колона с матрица за афинитетна хроматография със скорост например 35-40 ml/h/cm². Приблизително 1-4 g химопапаин могат да бъдат свързани за литър матрица за афинитетна хроматография.

Матрицата за афинитетна хроматография се състои от поддържаща матрица като гелна или мембранна матрица, към която ковалентно е свързан инхибиращ пептид и по такъв начин е имобилизиран. За предпочитане носещата матрица е агарозен гел като този, продаван под търговското наименование Sepharose® /Pharmacia/ или пък дериватизирани целулозни мембранни матрици като тези, продавани под търговско име Zeta /Anachen/ също могат да се използват. N краят на пептида може да бъде свързан към носещата матрица било директно, било индиректно посредством пространствена ръка, например деветатомна пространствена ръка, като тази осигурявана с предпочитаната гелна матрица, продавана с търговско име ЕСН Sepharose® 4В /Pharmacia/. Свързване между свободните карбокси групи от тази гелна матрица и свободните аминогрупи от инхибиращия пептид, получено в резултат на образуване на пептидни връзки, може да се постигне по конвенционален начин, например чрез катализирана с киселина кондензация подпомогната с водноразтворим карбодиимид като М-етил-М’-/3-диметиламинопропил/карбодиимид-хидрохлорид/ЕДС/. Найобщо, свързването се постига с внимателно разбъркване на гелната матрица и разтвор на инхибиращия пептид заедно, в присъствието на EDC, например при стайна температура в продължение на 24 часа. Подходящо отношение на свързване на пептида към гелната матрица и, например 3-4 g пептид за литър гел.

Матрицата за афинитетна хроматография може да бъде прехвърлена в колона непосредствено преди употреба. Все пак, когато използваната хроматографска матрица е гелна матрица, възможно е също да се използва етап на периодично инкубиране и след това, ако се желае, да се прехвърли матрицата в колона за последващо елуиране на ензима. За предпочитане матрицата се промива добре с воден буфер преди употреба, за да се отстранят следи от несвързан пептид и катализатор на кондензацията. За производствена употреба матрицата за афинитетна хроматография за предпочитане се подлага на санация in situ, например с воден етанол и след това става повторно използваема.

Обратими пептидни инхибитори на химопапаина са пептиди, които когато са имобилизирани върху носещата матрица са способни да се свързват с активната част на химопапаина по-силно, отколкото с активните части на други цистеинпротеинази, намиращи се в сурови химопапаинови препарати, по-специално PPIV, но които могат впоследствие да бъдат изместени от там. В предпочитана група пептидни инхибитори С-крайната аминокиселина се състои от алдехидно производно като семикарбазон, метоксиимин или оксим на фенилаланина или фени лаланинов аналог. По-специално С-крайната аминокиселина може да бъде фенилаланиново производно като D или L-фенилаланин семикарбазон /PheSc/, метокси5 имин /PheMo/ или оксим /PheOx/ или производно на фенилаланинов аналог като D или L-аланин семикарбазон /AlaSc/, D или Lциклохексилаланин семиркарбазон /ChaSc/ или D или L-левцин семикарбазон /LeuSc/. 10 Следните С-крайни дипептиди са намерени като изгодни пептидни инхибитори на химопапаин, а именно

L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-DPheSc,

L-Phe-L-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-PheL-PheOx,

L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc и L-AlaL-LeuSc.

Дипептидът L-Phe-Phe-PheSc е описан в 20 Robinson, Biochemistry, 14, 3695, 3700 (1975).

Специално предпочитани пептиди са дипептидите специално L-Ala-L-PheSc, L-AlaD-PheSc и L-Phe-D-PheSc. Новите инхибиращи пептиди пер се и новите матрици за 25 афинитетна хроматография, съдържащи тези пептиди са друг аспект на настоящото изобретение.

Непосредствено преди елуирането на химопапаина от матрицата за афинитетна хро30 матография се предпочита да се промие матрицата за отстраняване на неспецифично свързан материал, например с воден буфер като цитратен или ацетатен буфер с pH 4 до 5. Намерено е, че е особено изгодно да се прибавят към промиващия буфер и към елуиращия буфер реагенти, които намаляват хидрофобните взаимодействия и други неспецифични свързващи реакции между матрицата и компонентите на суровия химопа40 паин. Такива реагенти включват например ЕДТА, изопропанол и етандиол.

Химопапаинът след това може да се елуира от матрицата с подходящ елуент. Подходящите елуенти разкъсват връзките меж45 ду имобилизирания инхибиращ пептид и химопапаина, свързан с него, било чрез намаляване на афинитета на активното място към инхибиращия пептид или чрез селективно изместване на пептида от активното 50 място. Афинитетът на химопапаина към инхибиращия пептид може да бъде намален, например чрез изменяне характеристиките на активните места с денатуриращ агент като изопропанол или с елуент имащ pH над или под активната pH област на химопапаина. Обаче специалистите знаят, че такива елуенти трябва да бъдат такива, че да не настъпи необратимо инактивиране на елуирания ензим. Алтернативно, химопапаинът може да бъде селективно изместен от имобилизирания инхибиращ пептид посредством елуент, съдържащ излишък от компонент, който свързва здраво инхибиращия пептид, например друга цистеинпротеиназа.

Все пак в предпочитан аспект на настоящото изобретение елуентът съдържа обратим инхибитор на цистеинпротеиназата, който конкурентно се свързва с активните места на химопапаина и по такъв начин го измества от имобилизирания инхибиращ пептид. Конвенционалните инхибитори включват например дисулфиди с ниско молекулно тегло като 2,2'-дипиридилдисулфид, хидроксиетилсулфид, метил-2-пиридилсулфид и натриев тетратионат и живачни реактиви като живачен хлорид, р-хлормеркурибензоат и мерсалил. За специалистите е ясно, че афинитетът между химопапаин и имобилизирания инхибиращ пептид ще се различава съобразно кой специфичен пептид е използван, стойността на pH, йонната сила и състава на елуиращия буфер и използваната температура. В съгласие с това, точната природа и концентрацията на протеиназния инхибитор изискван за елуиране на химопапаина също ще варира. Освен това, живачните реагенти най-общо се уравновесяват със свързания химопапаин по-бързо,отколкото дисулфидните реагенти и продължително елуиране може да бъде използвано с такива инхибатори. Инхибитори, които се уравновесяват само бавно със свързания химопапаин могат да изискват инкубиране на матрицата с инхибатора, например за период от 1-2 часа или повече, преди елуирането на химопапаина. Все пак протеиновото съдържание и протеиназната активност на елуираните фракции могат да бъдат рутинно измервани и йонната сила или природата на елуента и инкубационното време на матрицата с инхибитора могат да варират с оглед ефективно и селективно да бъде изместен химопапаинът от матрицата. Елуираните фракции, съдържащи ниски количества протеин или ниски количества химопапаинова активност могат тогава да се отстраняват.

За предпочитане стойността на pH на елуента е достатъчно ниска, за да отслаби взаимодействието между химопапаина и инхибиращия пептид, например pH 4 до 5, поспециално pH 4,5. Намерено е, че подходящите елуенти включват например хидроксиетилдисулфид /100тМ/ във воден етандиол /33%/, съдържащ натрев цитрат /50 тМ/ и EDTA /1 тМ/,рН 4,5; дипиридилдисулфид / 30 тМ/ във воден етандиол /33%/, съдържащ натриев цитрат /50 тМ/ и EDTA /1тМ/, pH 4,5; метилпиридилдисулфид /30 тМ/ във воден етандиол /33%/, съдържащ натриев цитрат /50 тМ/ и EDTA /1тМ/, pH 4,5; мерсалилова киселина /10 тМ/ във воден етандиол /33%/, съдържащ натриев хидроксид /50 тМ/ и EDTA /25 тМ/, доведено до pH 4,5 с оцетна киселина; и меркурихлорид /10 тМ/ във воден етандиол /33%/, съдържащ натриев ацетат /50 тМ/. pH 4,5. Меркурихлоридът е особено предпочитан обратим инхибитор на цистеинпротеиназата.

Стадият на афинитетна хроматография в предпочитания метод съгласно изобретението значително увеличава специфичната активност на химопапаина, пречистван с него, както е измерено като активност спрямо ΒΑΡΝΑ или чрез титруване на активните центрове с Е-64 иили йодоцетна киселина. Активната форма на химопапаина е преференциално свързана и елуирана и по такъв начин се различава от неактивните форми на химопапаина и от някои други цистеинпротеинази, намиращи се в суровия препарат. Прясно приготвен химопапаин съгласно изобретението, пречистен чрез афинитетна хроматография най-общо съдържа поне 70%, за предпочитане поне 80%, по-специално най-малко 90% активен ензим.

Най-общо, пречистеният химопапаин се събира от елуата непосредствено преди съхранение или употреба. За предпочитане, елуираният химопапаин се пречиства по-нататък, за да измести цистеинпротеиназният инхибитор от активните центрове на ензима. Инхибиторът може да бъде изместен чрез прибавяне на излишък от редуциращ агент като цистеин или по избор, ако се желае, отстраняване на изместения инхибитор като се използва конвенционална техника като гелна филтрация или диализа. Алтернативно инхибиторът може да бъде отстранен чрез адсорбция върху специфична смола, например дисулфидите с ниско молекулно тегло могат да бъдат адсорбирани върху глутатионова афинитетна колона, а живачни реагенти могат да бъдат адсорбирани върху хелатообразуваща смола. За предпочитане инхибиторът се отстранява чрез активиране на ензима с редуциращ агент като цистеин, докато той е свързан с катийонообменната колона и след това измиване на инхибитора от колоната. Полученият пречистен химопапаин за предпочитане се лиофилизира преди съхранение, например чрез сушене чрез замразяване.

Химопапаинът съгласно настоящото изобретение може да бъде характеризиран по-нататък по методи, известни на специалистите. Тези методи включват например анализ на N-крайните аминокиселини, титруване на активните центрове с Е-64 или йодооцетна киселина и скорост на инактивиране с нея, гелна електрофореза на натриев додецилсулфат или многозонен катоден полиакриламиден гел, и активност спрямо различни протеиназни субстрати.

Новите инхибиращи пептиди съгласно изобретението могат да се получат по начин аналогичен на методите, известни на специалистите. Например дипептидни производни могат да се синтезират в серия от етапи, както следва:

а/ С-краят на аминокиселината, която трябва да образува С-края на инхибиращия пептид /първата аминокиселина/ може да бъде защитена например чрез реакция с Ο,Ν-диметилхидроксиламин хидрохлорид в присъствие на изобутилхлороформиат и Nметилморфолин като се получава диметилхидроксиамидно производно. За предпочитане N-краят на първата аминокиселина първоначално се защитава с например бутоксикарбонил.

б/ Защитената аминокиселина, например диметилхидроксиамидно производно, може след това да взаимодейства със силна киселина, например трифлуороцетна киселина, като се образува кватернерна амониева сол.

в/ Кватерноамониевата сол на защитената аминокиселина след това може да взаимодейства с второ аминокиселинно производно, например N-карбобензокси производно, като се образува дипептидно производно.

г/ Дипептидното производно, получено по-горе може да бъде редуцирано с мек редуциращ агент, например диизобутилалуминиев хидрид, като се получава свободна алдехидна група при С-края на дипептида.

д/ Алдехидът, образуван по-горе, може да бъде дериватизиран например до семикарбазон чрез реакция със семикарбазид, до метоксиимин чрез реакция с метоксиамин хидрохлорид или до оксим чрез реакция с хидроксиламин.

е/ Накрая, защитеният N-край може да бъде освободен, например N-карбобензокси група може да бъде отстранена чрез каталитична редукция като се използва 10% паладий върху въглен.

Определяне на протеин

Където е възможно, протеиновите концентрации се определят чрез A_2g|| като се използва А_28(|, 1 %=20,0 за препарат от латекс на папайя и A_2g|1, 1 %=18,3 за пречистени или частично пречистени химопапаинови препарати. Zucker et al., Biochim. Biophis. Acta 828 (1985). Някои тиолсъдържащи реагенти и дисулфиди са склонни да абсорбират при 280 nm. Когато има такива се използва Bio-Rad багрилосвързващ анализ /BioRad лаборатории, Обединено кралство/ за определяне протеиновата концентрация. Филтрирани разтвори от разпрашително сушен латекс от папайя /А_28п, 1 %=20,0/ се използват за стандарти. Този метод е помалко разположен към интерференция, отколкото е A_2gl). В пречистени ензимни препарати протеинът се определя по общото сухо тегло на продукта.

Определяне на химопапаинова активност а/ Активност спрямо ΒΑΡΝΑ /Анализен метод N 1/- Анализ на Smith

Всяка проба се прибавя към „Буфер 1“, воден натриевофосфатен буфер /0,1М/, pH 6,0, съдържащ EDTA /1 тМ/ и цистеин хидрохлорид монохидрат /10 тМ/, до краен обем 1,0т1. Ензимът /ако има такъв в пробата/ се активира в продължение на 5 минути при 37С преди да започне реакцията, чрез прибавяне на 4 ml N-a-6eH3OH.n-DL-aprnHH р-нитроанилин /ΒΑΡΝΑ/ /1,25тМ/ субстратен разтвор, който предварително е затоплен до 37С.

Ν.Β. Субстратният разтвор се приготвя като се разтвори 300mg ΒΑΡΝΑ в топъл диметилсулфооксид, разтворът се прибавя бавно към 450 ml Буфер 1, предварително затоплен до 37С, и след това се довежда до 500ml с още Буфер 1. Субстратният разтвор се държи при температура над 30С, за да се избегне утаяване на ΒΑΡΝΑ.

Инкубацията при 37С продължава 30 минути и след това реакцията се спира чрез прибавяне на 1ml оцетна киселина /4N/. Освободеният 4-нитроанилин се определя чрез измерване на ΔΑ_4|(|. Една единица активност отговаря на освобождаването на 1 пикомол 4-нитроанилин /ε=88ΟΟ M'.cm¹/ за секунда при тези условия.

Тези условия на анализа съответстват на съобщените в GB 2098997, патент на името на Smith Laboratories Inc. и са използвани за анализ на фармацевтични препарати с химопапаин, продавани в света например химопапаин, продаван под търговското наименование chymodiactin от Boots Company PLC, Обед, кралство и химопапаин, продаван с търговско име Disken от Sinpoong в Южна Корея. Тези единици активност са международно признати и обикновено се цитират като „Единици при Smith ΒΑΡΝΑ анализ“.

б/ Активност спрямо ΒΑΡΝΑ /Анализен Метод N2/

Всяка проба се прибавя към воден натриевофосфатен буфер /0,10М/, рН 6,8, съдържащ EDTA /1 тМ/ и/или дитиотреитол /2тМ/ или цистеин /4 тМ/ до краен обем 0,975т1. Ензимът /ако има в пробата/ се активира за 5 минути при 4О¹’С, преди да започне реакцията, чрез прибавяне на 25 pL ^а-бензоил-ОЬ-аргинин р-нитроанилин /ΒΑΡΝΑ/ /100 тМ/ в диметилсулфооксид. Инкубирането при 40С продължава 10 минути и след това реакцията се спира чрез прибавяне на 1 ml воден натриев хлорацетат /0,10 М/ натриев ацетатен /0,20М/ буфер, рН 4,3. Освободеният 4-нитроанилин ее определя чрез измерване на ΔΑ_<|(|. Една единица активност отговаря на освобождаването на 1 пкомол 4-нитроанилин /ε=88ΟΟ М.спг¹/ за секунда при тези условия.

Тези условия на анализа съответстват точно на описаните от Buttle и Barret /1984/ /Biochem. J. 223, 81-88 (1984) и са използвани в предварителните опити, описани в примерите 21, 23 и 26.

Абсолютните стойности, получени за химопапаиновата активност, като се използва ΒΑΡΝΑ Анализен метод №1 и №2 се различават, като стойностите, получени при използване на Метод №2 са приблизително два до три пъти по-високи от стойностите, получени като се ползва Метод №1 /Виж Пример 31/.

в/ Титруване на активните центрове с йодоцетна киселина

Титруването с йодоцетна киселина на активните центрове на химопапаина се извършва по начин, аналогичен на титруването на активни центрове с Е-64, описано от Zucker et al., Biochim. Biophys. Acta, 828 (1985). Химопапаиновия разтвор се разрежда с Буфер 1, както е описано в а/ по-горе, като се получава разтвор, съдържащ 60 μΜ протеин /ε_28ιι=4,3284 х 10⁴М‘' cm¹, изчислено от А_28|), 1 %=18,3, Robinson Biochemistry, 14, 36953700, 1975, 1196-204 и Мол. тегло=23656. изчислено по аминокиселинната последователност по Jacket et al. (May 1989). Biol. Chem. Hoppe. Seyler, 370, 425-434. 20 μΐ аликвотни части химопапаинов разтвор се поставят в титрационни епруветки и се инкубират за 5 минути при 37С с 20 pL Буфер 1 /40 μι контролата /20 μι водна йодоцетна киселина /10, 20, 30, 40, 50 и 60 μΜ, респективно/ се прибавя към всяка епруветка за титруване и сместа се подлага на предварително инкубиране за 10-20 минути при 37С. Реакцията се стартира чрез прибавяне на 4 ml ΒΑΡΝΑ субстратен разтвор, както е описано в /а/ по-горе, който също е затоплен предварително до 37°С. Инкубирането продължава при 37°С и реакцията се спира след 30 минути, както е описано в /а/ по-горе, а освободеният 4-нитронилин се определя по ΔΑ_41(|. Молната концентрация на активен химопапаин, получена по този начин се сравнява с молната концентрация на протеин на база моларния екстинкционен коефициент 4.3284 х 10⁴М' за химопапаина. Количеството на активен протеин след това се изразява като процент от общия протеин.

г/ Активност спрямо азоказеин

Активното вещество азоказеин се определя по метода по-рано описан от Rowan et al., (1988) Arch. Biochem. Biophys, 267, 262270, като се използва по-малко от 1 μΜ ензим /на база молекулно тегло 24,000/ и, ако е необходимо, 1 μΜ пилешки цистатин. Всички концентрации на ензима и инхибитора отговарят на концентрацията на активните молекули.

Имунологичен анализ чрез проста радиална имунодифузия

Анализът с проста радиална имунодифузия се основава на метода на Manchini et al., Immunochem., 2, 235-254 (1965), както следва. Агароза /1% т/об/ във воден натриев фосфат /10 тМ/, съдържащ натриев хло рид /0,14М/, pH 7,3, съдържащ моно-специфичен IgG препарат се излива върху GelBond® /FMC Corporation Maine USA/ и се изрязват правоъгълни ямки /г=1тт/ отделени на 1,5 ст. Свидетелите и непознатите проби се разпределят произволно между ямките, за да се избегнат грешки, дължащи се на ефекти на ръба. След прилагането на антиген в ямките, плаките се оставят за 24 часа да се образуват преципитинови пръстени. След това те се промиват, сушат се и се оцветяват. За приготвяне на стандартни криви се използва чист, карбоксиметилиран при меки условия антиген, които се начертават като антиген спрямо· квадрата на диаметъра на пръстена. Използваемият порядък при анализа е 25-300 ng антиген за ямка.

Получаване на PPIV и антитела от нея а/ Приготвяне на афинитетната колона Към разбъркваната смес от а NH₂CH₂CN.HCI /20 mmol/ и диизопропилетиламин /20тто1/ в диметилформамид /20 ml/ се прибавя бутилоксикарбонил - L - Phe -р-нитрофенилов естер /lOmmol/, Сместа се разбърква при 20С в продължение на 2 часа и след това се разрежда с етилацетат /100 ml/, промива се с вода /2х/, с воден триетиламин /5х/, с вода /Зх/, с воден калиев бисулфат /2х/, с вода /Зх/, суши се и се изпарява.

Остатъкът се прекристализира из етилацетат: хексан, като се получава Boc-L-PheNHCH₂CN, к т. т. 134,5-135С.

Охладена в лед трифлуороцетната киселина /10 ml/ се прибавя към разтвор на ВосL-Phe-NHCH₂CN /5 mmol/ в дихлорметан /10 ml/. Реакционната смес се инкубира при 20С в продължение на 30 минути и след това разтворителят се отстранява чрез изпаряване при 40С. Остатъкът се разтваря в хлороформ, изпарява се и процедурата се повтаря два пъти. Получената в резултат сурова трифлуороцетна сол се разтваря в разтвор на диизопропилетиламин /7,5 mmol/ в диметилформамид /10 ml/ и се прибавят Boc-GIy-р-нитрофенилов естер /6,25 mmol/ и N-хидроксибензотриазол монохидрат /6,25 mmol/. След това на капки се прибавя достатъчно количество диизопропилетиламин, за да се образува р-нитрофенил /златистожълт цвят/ и сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 2 часа. Прибавя се Ν,Ν-диетилетилендиамин /1,5т1/ и след 15 минути се прибавя етилацетат /60ш1/ и сместа се промива с вода, воден триетиламин, вода, воден разтвор на калиев бисулфат, вода, суши се и се изпарява. Остатъкът се пречиства чрез хроматография върху силикагел при елуиране с етилацетат: хексан /20:1/ като се получава Boc-Gly-LPhe-NHCH₂CN под формата на пяна.

Boc-Gly-L-Phe-NHCH₂CN /30 mg/ се разтваря в трифлуороцетна киселина : дихлорметан: анизол /25:65:10,1 ml/ и се инкубира при 0С в продължение на 30 минути. Сместа се изсушава чрез ротационно изпарение при 34С и остатъкът се разтваря в метанол /1,5 ml/ и воден разтвор на NaHCO₃/ 0,1 М, pH 8,0,1,5т1/ като се получава лигандния разтвор.

Активирана CH-Sepharose® 4В /Pharmacia 3 g сухо тегло/ се хидратира в продължение на една нощ във водна солна киселина /1тМ, 75 ml/ при 4С и след това се промива със солна киселина /1 mM, 600т1/ и воден разтвор на натриев бикарбонат /0,1 М, pH 8,0, 300 ml/. Гелът се суспендира във воден разтвор на натриев бикарбонат /0,1 М, pH 8,0, 30 ml/, прибавя се лигандния разтвор /от по-горе/ и сместа се разбърква внимателно в продължение на една нощ при 20С. Гелът се събира върху филтър от синтеровано стъкло, промива се с воден метанол /50% об/об/, 180 ml/ и след това с вода /180 ml/ и се суспендира във воден етаноламин /0,1М, 30т1/, доведен до pH 9,0 със солна киселина. Суспензията се разклаща в продължение на 4 часа при 20С и след това гелът се събира, промива се с вода /500 ml/ и се съхранява в буфер за приложение / натриев фосфат/ /50 mM/; EDTA /I тМ/; етандиол /33%, pH 6,8/ при 4С.

б/ Пречистване на PPIV

Колона /общ обем 4 ml/ от Sepharose® Ahx-Gly-L-Phe-NHCH₂CN се промива с „елуиращ“ буфер /натриев цитрат/ /50тМ/; етандиол /33%/, pH 4,5; 12т1/ и след това с буфер „за приложение“ /виж по-горе, 12 ml/.

Латекс от папайя, сушен чрез разпрашаване /0,5 g/ се разтваря в буфер за приложение /10ш1/ и се филтрира /пори 0,22μτη/. Концентрацията на протеина във филтрата се определя като се използва Bio-Rad багрилосвързващ анализ /Bio-Rad Laboratories, UK/. Към сместа се прибавя дитиотреитол до крайна концентрация 2 тМ и сместа се инкубира при 0С в продължение на 20 минути. 80 mg от латексния протеин се на нася на колоната /38 ml/h/cm²/ при 20С, след това се нанася буфер /8 ml/ и след това елуиращ буфер /8 ml/. След това се нанася елуиращ буфер /4 ml/, съдържащ хидроксиетилдисулфид /50 тМ/, изтичането се спира и колоната се оставя в продължение на една нощ при 20С. След това елуирането се възобновява с елуиращ буфер, съдържащ хидроксиетилдисулфид /10 ml/ и се събират елуираните фракции /по 1 ml/. Фракциите, показващи активност спрямо ΒΑΡΝΑ се обединяват и се нанасят директно на катийонообменна колона с Mono S HR 5/5®, която е предварително еквилибрирана с воден разтвор на натриев ацетат/оцетна киселина / 50 тМ/, рН 5,0, съдържащ EDTA /1тМ/ и след това колоната се промива със същия буфер /1 ml/мин/, докато А_28П nm стане равна на нула. След това в колоната се пуска градиент от натриев ацетат /21,5 тМ Na+/ml/ до 1 М и се събират фракции /по 1 ml/. Елуират се два главни пика, като първият пик се елуира при около 0,17 М Na+, отговарящ на папаин и втория пик, елуиращ се при около 0,38 М Na+, отговарящ на PP1V. Фракциите от пика с PP1V се обединяват, диализират се спрямо воден EDTA /1тМ/, сушат се чрез замразяване и се съхраняват при -20С. Чистата PPIV няма доказуема активност спрямо ΒΑΡΝΑ, но е свързана с активност за смилане на азоказеин, която не се инхибира от пилешки цистатин при концентрация 1цМ.

в/ Приготвяне на PPIV-специфични антитела

Чист PPIV антиген се карбоксиметилира при меки условия преди употреба по метода, описан от Zucker et al. Biochem. Biophys, Acta, 828 (1985), създава антисерум към PPIV у заек чрез интрамускулно инжектиране на 360 mg от карбоксиметилирания протеин в комплектна прибавка на Freund, и след две седмици от подкожно инжектиране на 100 pg в непълна прибавка. IgG се пречиства частично от антисеруми чрез фракциониране с амониев сулфат, както е описано от Heyde and Schwick, Handbook of Experimental Immunology (Weir D. M. OOR.) T.l, 7.1-7.11, Blackwall, последвано от диализа спрямо натриев фосфат /10 тМ/, съдържащ натриев хлорид /0,14М/, рН 7,3.

PPIV-специфичния IgG препарат се използва за анализ на PPIV чрез проста радиална имунодифузия, както е описано по-горе.

Следващите прмери илюстрират изобретението по-пълно посредством примери, които по никакъв начин не трябва да се считат като ограничаващи обхвата на изобретението.

Съкращенията, използвани тук включват:

ABTS 2,2'-азинобис/3-етилбензтиазолин сулфонова киселина/

Ahx 6-аминохексаноил

Ala аланин

ΒΑΡΝΑ N-a-6eH3OHa-DL-aprHHHH р-нитроанилид

Вос бутилоксикарбонил

CBZ карбобензокси

Cha циклохексилаланин

DMF Ν,Ν-диметилформамид

Е-64 Ь-3-карбокси-2,3-транс-епокси-проприониллеуциламидо-/4-гуанидино/бутан

EDC Н-етил-Н’-/3-диметиламинопропил/карбодиимид хидрохлорид

EDTA етилендиаминтетраоцетна киселина/динатриева сол/

Gly-глицин; Leu лейцин; Мо метоксиимин; OBZ оксибензил;

Ох оксим; Phe фенилаланин; Sc семикарбазон;

THF тетрахидрофуран; и Туг тирозин.

Bio-Rad, Chelex, Chymodiactin Sepharose 4B, Chymofast Disken, ECH-Sepharose Enzfitter, FPLC, Gel-Bond, Mono S HR, S-Sepharose, Tween, Zeta и Zetaffinity са всичките търговски наименования.

Всички етапи са извършени при стайна температура, освен ако не е посочено друго.

Пример 1

L-ала н ил-L-фе н илала н ил семикарбазон Стадий а

А/ Ο,Ν-диметилхидроксиламин HCI /10,23 g/ се прибавя при разбъркване към сух Ν,Ν-диметилформамид /100 ml/ при стайна температура. Прибавя се N-метлморфолин /10,6g/ в продължение на период от 5 минути, като температурата се поддържа по-ниска от 30С. Образува се бяла утайка и сместа се охлажда до 0С.

В/ N-t-Boc-L-Phe /26,5g/ се разтваря в сух тетрахидрофуран /THF/ /200 ml/ и се охлажда до -10С. Към разтвора се прибавя за период от 5 минути изобутилхлороформиат /14,38 g/ като температурата се поддържа при -10С. В течение на период от 5 минути се добавя N-метилморфолин /10.6 g/ като температурата се поддържа на -10С и разбъркването продължава още 10 минути.

С/ Суспензията А се прибавя към суспензията В за период от 15 минути при 10С. Сместа се оставя да се затопли до стайна температура и след това се разбърква в продължение на 3 часа. След това получената в резултат смес се охлажда до 0С и в продължение на 5 минути се прибавя 3диметиламинопропиламин /10,2 g/. Прибавят се вода /200 ml/ и етилацетат /200 ml/ и органичният горен слой се отделя и последователно се промива с а/ вода /200 ml; б/ воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 200 ml/, с/ солна киселина /0,5 N, 200 ml/ и д/ вода /3x200 ml/. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30С като се получава N-t-Boc-L-Phe-O.N-диметилхидроксамат.

Стадий б

N-t-Boc-L-Phe-O.N-диметилхидроксамат /2,9 g/ и трифлуороцетна киселина /8т1/ се разбъркват заедно при стайна температура 4 часа. След това излишъка от трифлуороцетна киселина се отстранява чрез изпарение на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30С. Към остатъка се прибавя диетилов етер /30 ml/, за да се образува разтвор и след това етерът се отстранява под вакуум. Третирането с етер се повтаря докато настъпи кристализация. Твърдото вещество се събира чрез филтриране, промива се с етер и след това се суши под вакуум над двуфосфорен петооксид, като се получава трифлуорацетатната сол на 1.-Р11е-0,М-диметилхидроксамат.

Стадий с

А/ Трифлуорацетатната сол на L-PheΟ,Ν-диметилхидроксамат /7,15 g се разтваря в сух DMF /30 ml/ при разбъркване при стайна температура. В продължение на период от 5 минути се прибавя N-метил-морфолин /2.35 g/, като температурата се поддържа по-ниска от 30С и получената в резултат смес се охлажда до 0С.

В/ CBZ-L-Ala /4,96g/ се разтваря в сух THF /55 ml/ с разбъркване и сместа се охлажда до -10С. За период от 5 минути се прибавя изобутилхлороформиат /3,05 g/ при -10С, N-метилморфолин /2,35 g/ се прибавя в течение на 10 минути и реакционната смес се разбърква при -10°С за още 10 минути.

С/ Разтворът А се прибавя към разтвор

В за период от 15 минути при -10С и след това се оставя температурата на сместа да се повиши до стайна температура и разбъркването продължава 3 часа. Сместа се охлажда до 0С. прибавя се в течение на 5 минути 3диметиламинопропиламин /2,27 g/ и разбъркването продължава още 5 минути. След това се прибавят вода /50 ml/ и етилацетат /50т1/, горната органична фаза се отделя и се промива последователно с а/ вода /50 ml/ и наситен воден разтвор на натриев хлорид /5 ml/, б/ воден калиев бикарбонат /5%, 50 ml/, с/ воден HCI /0,5 N, 50 ml/ и д/ вода /3x50 ml/. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се държи пониска от ЗО‘'С. Прибавя се пресен етилацетат /50 ml/ и след това се отстранява чрез изпарение като се получава CBZ-L-Ala-LPhe-O.N-диметилхидроксамат.

Стадий д

CBZ-L-Phe-O.N-ди метил хидрокса мат /27,8 g/ се разтваря в сух THF /280 ml/ и се охлажда до -70С под N,. Диизобутилалуминиев хидрид в THF /1 М, 372 ml/ се прибавя под азот, в течение на 60 минути при -70С и разбъркването продължава за още 60 минути при -70С. Реакцията се спира с наситен воден разтвор на натриев хлорид /400 ml/ и разтвор на сол на Rochell /600 ml/ при разбъркване при 0°С под азот и сместа след това се оставя да се затопли до стайна температура. Прибавя се етилацетат /600 ml/, сместа се филтрира и водният слой се отделя и се екстрахира с етилацетат /200 ml/. Обединените органични фази се промиват с вода /600 ml/ наситен воден разтвор на натриев хлорид /400 ml/ х 3/. Разтворителят се отстранява чрез изпарение под вакуум на ротационен изпарител, като температурата се държи по-ниска от 30С. Остатъкът се прекристализира из толуен и твърдото вещество се суши под вакуум над двуфосфорен петооксид като се получава CBz-LAla-L-Phe-алдехид.

Стадия е

CBz-L-Ala-L-Phe-алдехид /3 g/ се разтваря в промишлен метилиран спирт /20 ml/. Разтворът се нагрява до 50С и се филтрира, за да се отстранят неразтворимите вещества.

В/ Разтвор на семикарбазид HCI /1,3 g/ във вода /10 ml/ се прибавя към разтвор на калиев бикарбонат /1,1 g/ във вода/10 ml/.

С/ Разтворът В се прибавя към разтвора А и получената в резултат смес се разбърква при 50С в продължение на 2 часа. Прибавят се етилацетат /50 ml/ и вода /100 ml/, водният слой се отделя и се екстрахира с етилацетат /2x20 ml/ и обединените органични фази се промиват последователно с а/ воден разтвор на калиев бикарбонат/5%, 50 ml/: б/ водна HCI /0,5 N. 50 ml/ и с/ вода/ наситен воден разтвор на натриев хлорид /50 ml/ 20 ml χ 3/. Разтворителят се отстранява чрез изпарение на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30С, при което се получава CBZ-L-Ala-L-Phe Sc.

Стадий f

CBZ-L-Ala-L-Phe Sc /680 mg/ се разтваря в метанол /90 ml/ и неразтворимите вещества се отделят чез филтриране. Апаратът, съдържащ метанолния разтвор на CBZL-Ala-L-Phe Sc се продухва с N₂ и се прибавя катализатор 10% паладий върху въглен. През затворената система се прокарва Н₂ в продължение на 75 минути. Катализаторът се отстранява чрез филтриране и метанолът се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30^иС. Остатъкът кристализира при стоене и твърдото вещество се изсушава на вакуум над двуфосфорен петооксид като се получава Lаланил-ифенилаланил семикарбазон /L-AIaL-Phe Sc/.

Пример 2

L-фенилаланил-Ь-фенилаланил семикарбазон

Стадий а и б

Трифлуорацетатната сол на L-Phe-0,Nдиметилхидроксамат се получава съгласно стадиите а и б от пример 1.

Стадий с

А/ Трифлуорацетатната сол на L-PheΟ,Ν-диметилхидроксамат /1,932 g/ се разтваря в сух DMF /8 ml/ при разбъркване при стайна температура. N-метил-морфолин / 0,606 g/ се прибавя в течение на период от 5 минути, като температурата се държи пониска от 30”С и получената в резултат смес се охлажда до 0С.

В/ CBZ-L-Phe /1,794 g/ се разтваря в сух THF /15 ml/ при разбъркване и сместа се охлажда до -10С. Прибавя се изобутилхлороформиат /0,822 g/ в течение на 5 минути при -10С, добавя се за период от 10 минути N-метилморфолин /0.606 g/ и реакционната смес се разбърква при -10С в продължение на още 10 минути.

С/ Разтворът А се прибавя към разтвора В в течение на период от 15 минути при 10С и след това температурата на сместа се оставя да се повиши до стайна температура и разбъркването продължава в продължение на 3 часа. Сместа се охлажда до 0С, прибавя се 3-диметиламинопропиламин /0,612 g/ в течение на 5 минути и се разбърква още 5 минути. След това се прибавят вода /20 ml/ и етилацетат /30 ml/, органичната фаза се отделя и се промива последователно с а/ воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 20 ml/, б/ воден разтвор на HCI /0,5 N, 20 ml/ и с/ вода /2х30т1/. Разтворителят се отстранява под вакуум на ротационен изпарител, като температурата се поддържа пониска от 35“С. Остатъкът се прекристализира из изопропилов алкохол, като се получава CBZ-L-Phe-L-Phe-O.N-диметилхидроксамат.

Стадий д

СВг-Е-РЬе-Ь-РЬе-О^-диметилхидроксамат /4,89 g/ се разтваря в сух THF /40 ml/. Сух стъклен съд се зарежда с литиевоалуминиев хидрид /0,493 g/ и се прибавя сух THF /20 ml/ под азот и се разбърква при стайна температура в продължение на 10 минути, преди да се охлади до -50С. След това се прибавя разтворът на хидроксамат в сух THF в продължение на период от 10 минути при -50*’С под N₂ и разбъркването продължава за още 20 минути при 0-5“С.

Реакционната смес се охлажда до -50“С и се прибавя наситен разтвор на сол на Rochell /60 ml/ под азот. Сместа се оставя да се затопли до стайна температура, прибавя се HCI /конц., 10 ml/ като се довежда водната фаза до pH 3 и неразтворимите вещества се отстраняват чрез филтриране. Прибавя се етилацетат /50 ml/ и органичната фаза се отделя и се промива последователно с а/ вода /50 ml/, б/ воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 50 ml/, с/ воден разтвор на HCI /0,5 N, 50 ml/ и д/ вода /3x50 ml/. След това етилацетатът се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа пониска от ЗО'’С. Остатъкът се оставя да престои една нощ, изсушава се под вакуум над двуфосфорен петоокис и накрая се прекристализира из толуен, като се получава CBZ-LPhe-L-Phe алдехид.

Стадий е

А/ CBZ-L-Phe-L-Phe-алдехид /0,645 g/ се разтваря в промишлен метилиран спирт / 10 ml/ при 70°С.

В/ Натриев ацетат трихидрат /0,224 g/ се прибавя към разтвор на семикарбазид хидрохлорид /0,183 g/ във вода /3 ml/, прибавя се промишлен метилиран спирт /2 ml/ и сместа се нагрява до 60С.

С/ Разтворът А се прибавя към разтвора В и стъклото, съдържащо А се промива с още промишлен метилиран спирт /3 ml/ и промивката се прибавя към сместа, която се разбърква при 60-70С в продължение на 30 минути. Сместа се оставя да се охлажда бавно в продължение на един час, оставя се да престои в лед в продължение на още един час, и накрая се оставя за една нощ при 40С. Твърдото вещество се събира чрез филтриране, промива се с промишлен метилиран спирт: вода /4:1, 3 ml/ и се изсушава под вакуум над двуфосфорен петооксид, като се получава CBZ-L-Phe-L-Phe Sc.

Стадий F

CBZ-L-Phe-L-Phe Sc /2,1 g/ се разтваря в метанол /315 ml/ при 30С и неразтворимите вещества се отделят чрез филтриране. Апаратът, съдържащ метанолов разтвор на семикарбазон се продухва с азот, прибавя се катализатора 10 % паладий върху въглен /0,35 g/ и се пропуска Н₂ през затворената система в продължение на 30 минути. Катализаторът се отстранява чрез филтриране, а разтворителят се отделя чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се държи по-ниска от 30С. Остатъкът се изсушава под вакуум над двуфосфорен петооксид, като се получава Lфенилаланил-Б-фенилаланил семикарбазон /L-Phe-L-Phe Sc/.

Пример 3

Б-фенилаланил-Б-фенилаланил метоксиимин

Стадий а-д

CBZ-L-Phe-L-Phe алдехид се получава както е описано в пример 2, стадий а-д.

Стадий е

А/ CBZ-L-Phe-L-Phe алдехид /0,645 g/ се разтваря в промишлен метилиран спирт / 35 ml/ при 60-65С и се филтрира, за да се отстранят неразтворимите вещества.

В/ Натриев ацетат трихидрат /0,224 g/ се прибавя към разтвор на метоксиламин хидрохлорид /0,138 g/ във вода /25 ml/ при

60С.

С/ Разтворът В се прибавя към разтвор А, стъклото, съдържащо В се промива с вода /10 ml/ при 60С, промивните води се обедняват със сместа и се нагрява при 60С в продължение на половин час, след това се оставя да се охлади при стайна температура в продължение на два часа. Твърдото вещество се събира посредством филтриране, промива се с промишлен метилиран спирт /1:1, 6 ml/ и се суши под вакуум над двуфосфорен петооксид като се получава CBZ-L-PheL-Phe-метоксиимин.

Стадий F

CBZ-L-Phe-L-Phe-метоксиимин /550 mg/ се разтваря в метанол /300 ml/ и неразтворимите вещества се отделят чрез филтриране. Апаратът, съдържащ метанолов разтвор на метоксиимин се продухва с азот и след това се прибавя катализатор 10% паладий върху въглен. През запечатания съд се пропуска Н₂ и се подава по необходимост в продължение на четири часа и половина. Катализаторът се отделя посредством филтриране, а разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа пониска от 30С като се получава L-фенилаланил-Е-фенилаланил-метоксиимин /L-PheL-Phe-L-PheMo/.

Пример 4

Е-Фенилаланил-О-фенилаланил семикарбазон

Стадий а

А/ Ο,Ν-диметилхидроксиламин хидрохлорид /3,891 g/ се суспендира в сух DMF /40 ml/ при стайна температура. Прибавя се N-метилморфолин /4,032 g / в продължение на период от 5 минути, като температурата се поддържа по-ниска от 30С и след това сместа се охлажда при разбъркване до 0С.

В/ N-t-Boc-D-Phe /10,08 g/ се разтваря в сух THF /80 ml/ и се охлажда до -10С. Прибавя се изобутилхлороформиат /5,47 g/ към разтвора през време на период от 5 минути, като температурата се поддържа на -10С. В течение на 10 минути се прибавя Nметил-морфолин /4.032 g/, като температурата се поддържа на -10С и разбъркването се продължава за още 10 минути.

С/ Суспензията А се прибавя към суспензията В в течение на 15 минути при -10С, сместа се оставя да се затопли до стайна температура и се разбърква в продължение на три часа. След това сместа се охлажда до 0С, прибавя се в продължение на 5 минути

3-диметиламинопропиламин /3,88 g/ и разбъркването продължава още 5 минути. Прибавят се вода /60 ml/ и етилацетат /60 ml/, органичният слой се отделя и се промива последователно с а/ вода /60 ml/, б/ воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 60 ml/, с/ воден разтвор на НС1 /0,5 М, 60т1/ и д/ 3x60 ml/. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа пониска от 30“С като се получава N-t-Boc-DPhe-0, N -диметилхидроксамат.

Стадий б

ЬМ-Вос-О-РЬе-О^-диметилхидроксамат /11,3 g/ се охлажда в лед, прибавя се трифлуороцетна киселина /30 ml/ и сместа се разбърква при стайна температура в продължение на три часа. Излишъкът от трифлуороцетна киселина се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител, под вакуум, като температурата се поддържа пониска от 30°С и се прибавя диетилов етер /100 ml/ към остатъка, за да се получи разтвор. Разтворителят се отстранява под вакуум и процесът се повтаря, докато настъпи кристализация. Твърдото вещество се събира чрез филтриране, промива се с диетилов етер и се суши под вакуум над двуфосфорен петооксид, като се получава трифлуорацетатна сол на О-Р11е-0,М-диметилхидроксамат.

Стадий с

А/ Трифлуорацетатната сол на D-PheΟ,Ν-диметилхидроксамата /10,1 g/ се разтварят в сух DMF /41 ml/ при разбъркване при стайна температура. В продължение на период от 5 минути се прибавя N-метилморфолин /3,155 g/, като температурата се държи по-ниска от 30С и получената в резултат смес се охлажда до 0С.

В/ CBZ-L-Phe /9,4 g/ се разтварят в сух THF /80 ml/ при разбъркване и сместа се охлажда до -10С. В течение на 5 минути се прибавя изобутилхлороформиат /4,307 g/, при температура -10С, за период от 10 минути се прибавя N-метилморфолин /3,155 g/ и реакционната смес се разбърква при 10С в продължение на още 10 минути.

С/ Разтворът А се прибавя към разтвора В в течение на 15 минути при -10С и след това се оставя температурата на сместа да се повиши до стайна температура и разбъркването продължава още 3 часа. Сместа се охлажда до 0С, приибавя се в течение на 5 минути 3-диметил-аминопропиламин /3,20 g/ и разбъркването продължава още 5 минути. След това се прибавят вода /60 ml/ и етилацетат /60 ml/, органичната фаза се отделя и се промива последователно с а/ вода /60 ml/ и наситен воден разтвор на натриев хлорид /60 ml/, б/ воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 60 ml/, с/ воден разтвор на HCI /0,5 N, 60 ml/ и д/ вода /3x60 ml/. Разтворителят се отстранява под вакуум чрез изпарение на вакуум изпарител, като температурата се поддържа по-ниска ст 30С. Прибавя се пресен етилацетат и след това се отстранява чрез изпаряване. Остатъкът се прекристализира от изопропанол като се получава CBZ-L-Phe-D-Phe-Ο,Νдиметилхидроксамат.

Стадий д

Диизобутилалуминиев хидрид в дихлорметан /1М, 10 ml/ се поставя в продухан с N₂ стъклен съд. Съдът се нагрява до 50“С, докато цялото количество дихлорметан се изпари и системата отново се продухва с N . Прибавя се сух THF /10 ml/ и сместа се охлажда до -70С. В сух THF /10 ml/ се разтваря CBZ-L-Phe-D-Phe-Ο,Ν-диметилхидроксамат /0,978 g/ и се прибавя в течение на 10 минути при -70“С към разтвора от диизобутилалуминиев хидрид и разбъркването продължава още 10 минути при -70С. Реакционната смес се излива в разтвор на метанол /30 ml/ и наситен разтвор на сол на Rochell /30 ml/ при -60С и сместа се оставя да се затопли до стайна температура. Прибавят се вода /50 ml/ и етилацетат /50 ml/, органичната фаза се отделя и водната фаза се екстрахира с етилацетат /50 ml/. Обединените органични фази се промиват с вода /2x200 ml/ и се филтрират. Органичната фаза се отделя и разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител, под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30*'С. След това се прибавя пресен етилацетат и отново се отстранява като се получава CBZ-L-Phe-D-Phe алдехид.

Стадий е

А/ CBZ-L-Phe-D-Phe алдехид /400 mg/ се разтваря в промишлен метилиран спирт /10 ml/ при 60С.

В/ Натриев ацетат трихидрат /0,298 g/ във вода /3 ml/ при 60С се прибавя към разтвор от семикарбазид хидрохлорид /0,244 g/ във вода /3 ml/ при 60С.

С/ Разтворите А и В се обединяват и получената в резултат смес се разбърква при 60С в продължение на 5 часа преди да се остави да стои една нощ при 4С. Твърдото вещество се събира чрез филтриране и се суши под вакуум над двуфосфорен петооксид, като се получава CBZ-L-Phe-D-Phe Sc.

Стадий F

CBZ-L-Phe-D-Phe Sc /600 mg/ се разтваря в метанол /90 ml/ и неразтворимите вещества се отстраняват чрез филтриране. Апаратът, съдържащ метаноловия семикарбазонов разтвор се продухва с азот и се прибавя катализаторът 10% паладий върху въглен /100 mg/. Затвореният съд се зарежда с водород в продължение на два часа. Катализаторът се отстранява посредством филтриране, а метанолът се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа пониска от 30С и се получава L-фенил-аланил-О-фенилаланил семикарбазон /L-PheD-Phe Sc/.

Пример 5

Ь-фенилаланил-Ь-фенилаланил оксим Стадий а-д

CBZ-L-Phe-L-Phe алдехид се получава както при пример 2, стадии а-д.

Стадий е

А/ CBZ-L-Phe-L-Phe алдехид, получен както е описано по-горе /0,645g/ се разтваря в промишлен метилиран спирт /35 ml/ при 60-65^иС и разтворът се филтрира, за да се отстранят неразтворимите вещества.

В/ Натриев ацетат трихидрат /0,224 g/ се прибавя към разтвор от хидроксиламин НС1 /0,114 g/ във вода /25 ml/ при 60С.

С/ Разтворът В се прибавя към разтвор А и съдът, съдържащ разтвор В се промива с вода /10 ml/ и промивните води се прибавят към сместа, която след това се разбърква при 60-65С в продължение на 3/4 час и след това се охлажда в продължение на 2-3 часа при 4С. Твърдото вещество се филтрира, промива се с промишлен метилиран спирт/ вода /1:1, 5 ml/ и се суши под вакуум над двуфосфорен петооксид, като се получава CBZ-L-Phe-L-PheOx като смес от син- и анти-изомери.

Стадий F

CBZ-L-Phe-L-PheOx /500 mg/ се разтваря в метанол /130 ml/ и неразтворимите вещества се отстраняват чрез филтриране. Апаратът, съдържащ метаноловия оксим се продухва с N₂ и се прибавя катализатор 10% паладий върху въглен /83 mg/. След това в затворения съд се зарежда Н₂ в продължение на 30 минути. Катализаторът се отстранява чрез филтриране и разтворителят се отделя чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30С. Понататък разтворителят се отстранява като се използва помпа с висок вакуум, а остатъкът се суши над двуфосфорен петооксид под вакуум като се получава Ь-фенилаланил-Ьфенилаланил оксим /CBZ-L-Phe-L-PheOx/.

Пример 6

Ь-аланил-О-фенилаланил семикарбазон Стадий а и б

Трифлуорацетатната сол на D-Phe-0,Nдиметилхидроксамата се получава съгласно стадиите а и б от пример 4.

Стадий с

А/ Трифлуорацетатната сол на D-PheΟ,Ν-диметилхидроксамата /5,000 g/ се разтваря в сух THF /20 ml/. Прибавя се бавно N-метилморфолин /1,578 g/, като температурата се поддържа по-ниска от 30С и получената в резултат смес се охлажда до 0С.

В/ CBZ-L-Ala /3,463 g/ се разтварят в сух тетрахидрофуран /40 ml/ при разбъркване и сместа се охлажда до -10°С. Прибавя се изобутилформиат /2,158 g/ в течение на период от 5 минути при -10С, в течение на 10 минути се прибавя N-метилморфолин /1,578 g/ и реакционната смес се разбърква при -10С в продължение на още 10 минути.

С/ Двата разтвора, А и В, се смесват при -10С в течение на 10 минути и след това температурата на сместа се оставя да се повиши до стайна температура и разбъркването продължава три часа. Сместа се охлажда до 0С, прибавя се 3-диметиламинопропиламин /1,585 g/ и реакционната смес се залива с вода /50 ml/. Прибавя се етилацетат, органичната фаза се отделя и водният слой се екстрахира с етилацетат /2x30 ml/. Органичните слоеве се обединяват и се промиват последователно с а/ вода /50 ml/ и наситен воден разтвор на натриев хлорид / 10 ml/, б/ воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 50 ml/, с/ воден разтвор на HCI /0,5 N, 50 ml/ и д/ вода /3x50 ml/. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30С. Твърдото вещество се прекристализира от етилацетат, като се получава CBZ-L-Ala-DPhe-Ο,Ν-диметилхидроксамат.

Стадий д

СВ2-Ь-А1а-0-Р11е-0,ГЧ-диметилхидроксамат /2,9 g/ се разтваря в сух тетрахидрофуран /25 ml/. Разтворът се охлажда до -70С под азот. Прибавя се диизобутилалуминиев хидрид в тетрахидрофуран /1М, 37 ml/ в продължение на 10 минути при -70С и разбъркването продължава още 10 минути.

Реакцията се спира с наситен разтвор на сол на Rochell /125 ml/ и тетрахидрофуран /125 ml/ при разбъркване при -30С под ток от азот и след това сместа се оставя да се затопли до стайна температура. Прибавя се етилацетат /100 ml/ и органичната фаза се отделя. Водният слой се екстрахира с етилацетат /2x30 ml/, органичните слоеве се обединяват и се промиват с вода /3x100ml/. Реакционната смес се филтрира и разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител, под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30С. Прибавя се пресен етилацетат и след това се отстранява, като се получава CBZ-L-Ala-DPhe алдехид.

Стадий е

А/ CBZ-L-Ala-D-Phe алдехид /1,2 g/ce разтваря в THF /20 ml/ и промишлен метилиран спирт /20 ml/ и се нагрява до 50С.

В/ Горещ разтвор на семикарбазид хидрохлорид /1,8 g/ във вода /15 ml/ се прибавя към горещ разтвор на калиев бикарбонат /1,5 g/ във вода /15 ml/.

С/ Разтворът В се прибавя към разтвора А и получената в резултат смес се разбърква при 50С в продължение на 4 часа. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30С. Към остатъка се прибавя вода /50 ml/, твърдото вещество се събира чрез филтриране, промива се с вода: промишлен метилиран спирт /1:1/ и се суши под вакуум, над двуфосфорен петооксид, като се получава CBZ-L-Ala-D-Phe Sc.

Стадий f

CBZ-L-Ala-D-Phe Sc /750 g/ се разтваря в метанол /50 ml/ и неразтворените вещества се отстраняват чрез филтриране. Апаратът, съдържащ метанолния разтвор се продухва с N₂ и се прибавя катализатор 10% паладий върху въглен /100 mg/. През системата се прокарва водород в продължение на минути. Катализаторът се отстранява посредством филтриране, а разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се държи по-ниска от 30С и се суши под вакуум над двуфосфорен петооксид, като се получава Ь-аланил-О-фенилаланил семикарбазон /L-Ala-D-Phe Sc/.

Пример 7

Ь-тирозинил-Ь-фенилаланил семикарбазон

Стадий а и б

Трифлуорацетатната сол на L-Phe-0,Nдиметил хидроксамат се получава съобразно стадиите а и б от пример 4.

Стадий с

А/ Трифлуорацетатната сол на L-PheΟ,Ν-диметил хидроксамат /7,95 g/ се разтваря в сух диметилформамид /30 ml/ с разбъркване при стайна температура. Н течение на 5 минути се прибавя N-метилморфолин /2,49 g/, като температурата се поддържа по-ниска от 30С и получената в резултат смес се охлажда до 0''С.

В/ CBZ-OBZ-L-Tyr /10 g/ се разтваря в сух диметилформамид /60 ml/ с разбъркване и сместа се охлажда до -10С. Прибавя се изобутилхлороформиат /3,39 g/ в продължение на 5 минути при -10°С. За период от 10 минути се прибавя N-диметилморфолин /2,49 g/ и реакционната смес се разбърква при -10С в продължение на още 10 минути.

С/ Разтворът А се прибавя към разтворът В за период от 15 минути при -10С и след това температурата на сместа се оставя да се повиши до стайна температура и разбъркването продължава три часа. Сместа се охлажда до 0С и в продължение на 5 минути се прибавя 3-диметиламинопропиламин /2,52 g/. След това се прибавят вода /50 ml/ и етилацетат /50 ml/, горната органична фаза се отделя и се промива последователно с а/ вода /50 ml/, б/ воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 50 ml/, с/ воден разтвор на HCI /0,5М, 50 ml/ и д/ вода /3x50 ml/. Разтворителят се отстранява на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30С и остатъкът се прекристализира из изопропилов алкохол като се получава CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-0,Nдиметилхидроксамат.

Стадий д

CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-0,N-nHMeTHaxHaроксамат /1,012 g/ се разтваря в сух тетра хидрофуран /10 ml/. За период от 10 минути, под ток от N₂, при -70С, се прибавя диизобутил-алуминиев хидрид в сух тетрахидрофуран /1М, 8,5 ml/ и разбъркването продължава още 10 минути.

Реакцията се спира с метанол /20 ml/ и разтвор на сол на Rochell /30 ml/ при разбъркване при -60С под азот и след това сместа се оставя да се затопли до стайна температура. Прибавят се вода /50 ml/ и етилацетат /50 ml/ и органичната фаза се отделя и се промива с вода /200 ml/. Реакционната смес се филтрира и разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като се поддържа температурата по-ниска от 30С. След това се прибавя пресен етилацетат и се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител. Полученото в резултат твърдо вещество се суши под вакуум над двуфосфорен петооксид, като се получава CBZ-OBZ-L-Tyr-LPhe алдехид.

Стадий е

А/ CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe алдехид /400 mg/ се разтваря в промишлен метилиран спирт /20 ml/ и тетрахидрофуран /10 ml/ и се нагрява до 60⁰С.

В/ Горещ разтвор на семикарбазид хидрохлорид /600 mg/ във вода /5 ml/ се прибавя към горещ разтвор от калиев бикарбонат /500 ml/ във вода /5 ml/.

С/ Разтворът В се прибавя към разтвора А и получената в резултат смес се разбърква при 60С в продължение на два часа. Разтворителят се отстранява посредством изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа пониска от 30С и остатъка се залива с вода. Твърдото вещество се събира чрез филтриране, промива се с вода и промишлен метилиран спирт и се суши под вакуум над двуфосфорен петооксид, като се получава CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe Sc.

Стадий f

CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe Sc /770 mg/ се разтваря в сух тетрахидрофуран /70 ml/, филтрира се и след това към филтрата се прибавя метанол /20 ml/. Апаратът, съдържащ семикарбазоновия разтвор се продухва с азот и се прибавя катализатор 10% паладий върху въглен /100 mg/. През затворената система се прокарва водород в продължение на няколко часа. Катализаторът се отстранява чрез филтриране, а разтворите лят се отделя чрез изпаряване като се получава Ь-тирозинил-Ь-фенилаланил семикарбазон /L-Tyr-L-Phe Sc/.

Пример 8

Е-аланил-Г-циклохексилаланил семикарбазон

Стадий а

А/ Ο,Ν-диметилхидроксиламин HCI /8,51 g/ се прибавя с разбъркване към сух диметилформамид /75 ml/ и се прибавя в продължение на 5 минути N-метилморфолин /8,8 g/, като температурата се поддържа по-ниска от 30С. ООбразува се бяла утайка и сместа се охлажда до 0°С.

В/ N-t-Boc-L-Cha /22,5 g/ се разтварят в сух тетрахидрофуран /200 ml/ и се охлажда до -10С. За период от 5 минути се прибавя изобутилхлороформиат /11,94 g/ като температурата се поддържа на -10С. В продължение на 10 минути се прибавя N-метилморфолин /8,8 g/, като температурата се държи на -10С и разбъркването се продължава за още 10 минути.

С/ Суспензията А се прибавя към суспензията В за период от 15 минути, при 10°С и след това сместа се оставя да се затопли до стайна температура и се разбърква в продължение на четири часа. Сместа се охлажда до 0С и за период от 5 минути се прибавя 3-диметиламинопропиламин /8,6 g/ и разбъркването продължава още 5 минути. Прибавят се вода /200 ml/ и етилацетат /100 ml/ и водният слой се отделя и се екстрахира с етилацетат /2x100 ml/. Обединените органични фази се промиват последователно с а/ вода /100 ml/ и наситен воден разтвор на натриев хлорид /20 ml/, б/ с воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 100 ml/, с/ воден разтвор на HCI /0,5 N, 100 ml/ и д/ вода /ЗхЮО ml/. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като температурата се поддържа по-ниска от 30С като се получава N-t-Boc-L-Cha-0,N-anMeTnaxHapoKcaMaT.

Стадий б

N-t-Boc-L-Cha-0, N-диметилхидроксамат /26 g/ и трифлуороцетна киселина /65 ml/ се разбъркват при 0С в продължение на пет минути и след това температурата на сместа се оставя да се повиши до стайна температура и разбъркването продължава три часа. Излишъкът от оцетна киселина се отстранява след това посредством изпаряване на ротационен изпарител под вакуум, като тем пературата се поддържа по-ниска от ЗОС. Към остатъка се прибавя диетилов етер да се образува разтвор и след това етерът се отстранява под вакуум. Третирането с етер се повтаря като се получава жълто масло от трифлуорацетатната сол на L-Cha-O.N-диметилхидроксамата.

Стадий с

А/ Трифлуорацетатната сол на L-ChaΟ,Ν-диметилхидроксамата /17 g/ се разтваря в сух тетрахидрофуран /50 ml/. За период от 5 минути се прибавя N-метил-морфолин /3,95 g/, като температурата се поддържа по-ниска от 30С и сместа след това се охлажда до 0С.

В/ CBZ-L-Ala /9,25 g/ се разтваря в сух тетрахидрофуран /100 ml/ с разбъркване и сместа се охлажда до -10“С. В продължение на 5 минути се прибавя изобутилхлороформиат /5,35 g/ при -10^иС, за период от 10 минути се добавя N-метилморфолин /3,95 g/ и реакционната смес се разбърква още 10 минути при -10*'С.

С/ Разтворът А се прибавя към разтвора В за период от 15 минути, при -10^(,С и след това температурата на сместа се оставя да се повиши до стайна температура и разбъркването продължава три часа. Сместа се охлажда до 0С, за период от 5 минути се прибавя 3-диметиламинопропиламин /3,98 g/ и разбъркването продължава още пет минути. След това се прибавят вода /150 ml/ и етилацетат /150 ml/ и водната фаза се отделя и се екстрахира с етилацетат /2x75 ml/. Обединените органични фази се промиват последователно с а/ вода /125 ml/, б/ воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 125 ml/, с/ воден разтвор на HCI /0,5 N, 125 ml/ и д/ вода /3x125 ml/. Разтворителят се отстранява посредством из паряванена ротационен изпарител, като температурата се поддържа по-ниска от 30С. Прибавя се пресен етилацетат и се отстранява чрез изпаряване, като се получава трифлуороцетната сол на CBZ-L-Ala-L-Cha-0,N-AHMeTHaxHapoKсамат.

Стадий д

СВг-Е-А1а-Е-СЬа-0,М-диметилхидроксамат /7,22 g/ се разтваря в сух тетрахидрофуран /160 ml/ и се охлажда до -70С под азот. Под азот се добавя в продължение на 20 минути диизобутилалуминиев хидрид в тетрахидрофуран /1М, 86 ml/, при -7О''С и разбъркването продължава още 20 минути.

Реакцията се спира с разтвор от сол на Rochell /400 ml/ при разбъркване при 0°С под азот и след това сместа се оставя да се стопли до стайна температура. Прибавя се етилацетат /150 ml/ и сместа се разбърква в продължение на 5 минути. Реакционната смес се филтрира, органичният слой се отделя и водната фаза се екстрахира с етилацетат /2x50 ml/. Обединените органични фази се промиват с вода /3x200 ml/, като към последните промивни води се прибавя наситен воден разтвор на натриев хлорид. Разтворителят се отстранява посредством изпаряване на ротационен изпарител, като температурата се поддържа по-ниска от 30С като се получава масло от CBZ-L-Ala-L-Cha алдехид.

Стадий е

А/ CBZ-L-Ala-L-Cha-алдехид /8 g/ се разтваря в промишлен метилиран спирт /50 ml/ и се загрява до 50С.

В/ Горещ разтвор от семикарбазид хидрохлорид /3,0 g/ във вода /25 ml/ се прибавя към горещ разтвор от калиев бикарбонат /2,67 g/ във вода /25 ml/.

С/ Разтворът В се прибавя към разтвора А и получената в резултат смес се разбърква при 50С в продължение на три часа. Сместа се оставя да се охлади и стои една нощ при 4С. По-голямата част от промишления метилиран спирт се отстранява посредством ротационен изпарител като температурата се държи по-ниска от 30С и към остатъка се прибавя етилацетат /50 ml/. Органичната фаза се отделя и се промива последователно с а/ вода /30 ml/, б/ воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 30 ml/, с/ воден разтвор на HCI /0,5 N, 30 ml/ и д/ вода /2x50 ml/ като се прибавя наситен воден разтвор на натриев хлорид, което се изисква за подпомагане на разделянето. Разтворителят се отстранява чрез ротационен изпарител, при поддържане на температурата пониско от 30^1,С и твърдият остатък се прекристализира от изопропанол и етер като се получава CBZ-L-Ala-L-ChaSc.

Стадий f

CBZ-L-Ala-L-ChaSc /900 mg/ се разтваря в метанол /30 ml/ и под азот се прибавя катализатора 10% паладий върху въглен /100 mg/. През затворената система се пропуска Н₂ в продължение на 6 часа и след това катализаторът се отстранява чрез филтриране. Разтворителят се отстранява посредством изпаряване на ротационен изпа21 рител, като температурата се поддържа пониска от ЗОС, твърдото вещество се промива с етер и се суши под вакуум над двуфосфорен петоокис, като се получава L-аланилL-циклохексилаланиин семикарбазон /L-AlaL-ChaSc/.

Пример 9

L-аланил-Е-левцинил семикарбазон Стадий а

А/ Ο,Ν-диметилхидроксиламин хидрохлорид /9,17 g/ се прибавя с разбъркване към сух диметилформамид /110 ml/ при стайна температура. В течение на 5 минути се добавя N-метилморфолин /9,51 g/ като температурата се поддържа по-ниска от 30С. Образува се утайка и сместа се охлажда до 0С.

В/ N-t-Boc-L-Leu /23,3 g/ се разтваря в сух тетрахидрофуран /220 ml/ и се охлажда до -10С. За период от 5 минути се прибавя изобутилхлороформиат /12,90 g/ като температурата се държи на -10°С. В продължение на 10 минути се прибавя N-метилморфолин /9,51 g/ като се поддържа температурата на -10”С и разбъркването продължава още 10 минути.

С/ Суспензията А се прибавя към суспензията В в течение на 15 минути при -10С. Сместа се отставя да се затопли до стайна температура и се разбърква в продължение на три часа. След това сместа се охлажда до 0С и за период от 5 минути се добавя 3диметиламинопропиламин /9,13 g/ и разбъркването продължава още 5 минути. Прибавят се етилацетат /110 ml/ и вода /110 ml/ и органичният слой се отделя и се промива последователно с а/ вода /2x100 ml/, б/ воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 100 ml/, с/ воден разтвор на НС1 /0,5 N, 100 ml/ и д/ вода /3x100 ml/. Разтворителят се отстранява чрез изпарение на ротационен изпарител, като температурата се поддържа по-ниска от 30С, като се получава N-t-BocЕ-Ьеи-0,М-диметилхидроксамат.

Стадий б

1Ч-1-Вос-Е-Ьеи-0,М-диметилхидроксамат /23,4 g/ и трифлуороцетна киселина /165 ml, охладена до 0С/ се разбъркват заедно при стайна температура в продължение на 18 часа. След това излишъкът от трифлуороцетна киселина се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител, като температурата се пази по-нииска от 30С. Към остатъка се прибавя диетилов етер, да се получи разтвор и след това етерът се отстранява под вакуум. Това се повтаря докато настъпи кристализация при 4С, като се получава трифлуорацетатната сол на L-LeuΟ,Ν-диметилхидроксамат.

Стадий с

А/ Трифлуорацетатната сол на L-LeuΟ,Ν-диметилхидроксамата /1,8 g/ се разтваря в сух тетрахидрофуран /10 ml/ с разбъркване при стайна температура. Сместа се охлажда до 0С и се прибавя за период от 5 минути N-метилморфолин /0,635 g/.

В/ CBZ-L-Ala /1,40 g/ се разтваря в сух тетрахидрофуран /20 ml/ и се охлажда до -10С. В продължение на 5 минути се прибавя зобутилхлороформиат /0,869 g/ при -10С, за период от 10 минути се добавя N-метилморфолин /0,653 g/ и реакционната смес се разбърква при -10С още 10 минути.

С/ Разтворът А се прибавя към разтвора В в продължение на 15 минути при -10С и след това температурата на сместа се оставя да се повиши до стайна температура и разбъркването продължава 18 часа. Сместа се охлажда до 0С, прибавя се 3-диметиламинопропиламин /0,64 g/ и след това реакционната смес се обработва с вода /25 ml/ и етилацетат /25 ml/. Водната фаза се отделя и се екстрахира с етилацетат /2x25 ml/. Обединените органични фази се промиват последователно с а/ вода /50 ml/ и наситен воден разтвор на натриев хлорид /да се помогне на разделянето/, б/ с воден разтвор на калиев бикарбонат /5%, 30 ml/, с/ с воден разтвор на НС1 /0,5 N, 30 ml/ и д/ вода/ЗхЗО ml/. Разтворителят се отстранява посредством изпаряване на ротационен изпарител, като температурата се поддържа по-ниска от 30С и твърдото вещество се суши под вакуум над двуфосфорен петооксид, като се получава CBZ-L-Ala-L-Leu-0,N-aHMeTnaxnaроксамат.

Стадий d

СВг-Ь-А1а-Ь-Ееи-0^-диметилхидроксамат /1,9 g/ се разтваря в сух тетрахидрофуран /40 ml/ и се охлажда до -70С под азот. За период от 10 минути под азот се прибавя диизобутилалуминиев хидрид в тетрахидрофуран /1М, 29,5 ml/ при -70С и разбъркването продължава още 10 минути.

Реакцията се спира с метанол /50 ml/ и разтвор на сол на Rochell /50 ml/ с разбъркване при -60С под азот и след това сместа се оставя да се затопли до стайна температура. Прибавят се вода /50 ml/ и етилацетат /50 ml/, сместа се филтрира и водният слой се отделя и се екстрахира с етилацетат /2х 50 ml/. Обединените органични фази се промиват с вода /3x100 ml/ и наситен воден разтвор на натриев хлорид, за да се подпомогне разделянето. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване на ротационен изпарител, като температурата се поддържа пониска от 30С. Прибавя се пресен етилацетат и след това се отстранява посредством ротационен изпарител като се получава CBZL-Ala-L-Leu-алдехид.

Стадий е

А/ CBZ-L-Ala-L-Leu-алдехид /6,7 g/ се разтваря в промишлен метилиран спирт /50 ml/ и се нагрява до 50С.

В/ Горещ разтвор от КНСО₃ /9g/ във вода /30 ml/ се прибавя към горещ разтвор от семикарбазид HCI /10,8 g/ във вода /30 ml/.

С/ Разтворът В се прибавя към разтвор А и сместа се разбърква при 50С в продължение на три часа и се оставя да стои при стайна температура. Твърдото вещество се филтрира, промива се с промишлен метилиран спирт: вода /1:1/, /20 ml/ и се суши под вакуум над двуфосфорен петоокис като се получава CBZ-L-Ala-L-LeuSc.

Стадий f

CBZ-L-Ala-L-LeuSc /950 mg/ се разтваря в метанол /100 ml/ и неразтворените вещества се отстраняват чрез филтриране. Прибавя се допълнително количество метанол / 50 ml/ и апаратът се продухва с азот. Под азот се прибавя катализаторът 20% паладий върху въглен /100 mg/ и след това през затворената система се прокарва Н₂ в продължение на 135 минути. Катализаторът се отстранява чрез филтриране и разтворителят се отстра-нява чрез изпаряване на ротационен изпарител като температурата се поддържа под 30С. Твърдото вещество се суши над двуфосфорен петооксид като се получава Ь-аланил-Ь-левцинил семикарбазон /L-Ala-L-LeuSc/.

Пример 10

Приготвяне на насочена с активната страна матрица за афинитетна хроматография ECH-Sepharose 4B-L-Ala-L-PheSc.

ECH-Sepharose® 4В /3 g мокро тегло/ се промива върху филтър от синтеровано стъкло с воден разтвор на натриев хлорид /0,5

М, 240 ml/ и след това с вода /120 ml/. Nетил-N’- /3-диметиламинопропил/карбодиимид хидрохлорид /EDC/ се разтваря във вода като се получава 0,1 М EDC разтвор и pH на EDC разтвора се стабилизира до pH 4,5 чрез прибавяне на солна киселина или твърд натриев ацетат. L-Ala-L-PheSc /10 mg/, получен както е описано в пример 1, се разтваря в метанол /400 ml/ и се прибавя към промития гел заедно с воден разтвор на EDC /0,1 М, 2,4 ml/. Сместа се разбърква внимателно при 20С в продължение на 1 час, pH-то се наглася отново на pH 4,5, ако е необходимо, и разбъркването продължава при 20С в продължение на 23 часа. След това се прибавя L-глицин до крайна концентрация 1 М и разбъркването продължава още 3 часа. Гелът за афинитетна хроматография се промива последователно с воден метанол /50%, 60 ml/, вода /60 ml/ и буфер за прилагане /60 ml/ и се съхранява при 4С, докато е необходимо.

Примери 11-18

Приготвяне на матрици за афинитетна хроматография

Всяко от дипептидните производни, получени, както е описано в примерите 2 до 9, се свързва с гелна матрица по начин, аналогичен на този, описан в пример 10, като се получават теловете за афинитетна хроматография в примерите 11 до 18, респективно.

Пример 19

Афинитетна хроматография

Разпрашително сушен латекс от папайя /0,03 g протеин/, получен от Powell и Scholefield UK в „буфер за нанасяне“ /Натриев фосфат /50 mM/; EDTA /1тМ/; етандиол /33%/, pH 6,8 /плюс дитиотреитол /2 тМ/ или цистеин /4 тМ/ /1,5 ml/ се нанася на 1 ml колона от всяка една от матриците за афинитетна хроматография от примерите 10-18. Използва се един от петте различни елуенти, както следва:

Елуент А=Хидроксиетилдисулфид /100 тМ/ във воден разтвор на етандиол /33%/, съдържащ натриев цитрат /50 тМ/ и EDTA /тМ/, pH 4,5; колоната се еквилибрира една нощ преди елуирането.

Елуент В=2,2'-дипиридилсулфид /30 тМ/ във воден разтвор на етандиол /33%/, съдържащ натриев цитрат /50 тМ/ и EDTA /1 тМ/, pH 4,5; колоната се еквилибрира една нощ преди елуирането.

Елуент С=Метилпиридилдисулфид /30 шМ/ във воден разтвор на етандиол/3,3%/, съдържащ натриев цитрат /50 тМ/ и EDTA /1 тМ/, pH 4,5: колоната се еквилибрира една нощ преди елуирането.

Елуент О=Мерсалилова киселина /10 тМ/ във воден разтвор на етандиол /33%/, съдържащ натриев хидроокис /50 тМ/ и EDTA /25 тМ/, нагласен на pH 4,5 с оцетна киселина; продължително елуиране.

Таблица 1

Елунт Е= HgCI₂ /10 тМ/ във воден разтвор на етандиол /33 %/, съдържащ натриев ацетат /50 тМ/, pH 4,5; продължително елуиране.

Елуирането се контролира чрез следене на А_28|) на следите от елуирания материал спрямо стандартна хроматография на Mono S (Pharmacia). Резултатите са сумирани на Таблица 1, по-надолу.

Свързване и елуиране на химопапаин

Инхибиращ пептид	Матрица /пример №/	A	Елуент	D	E
В	C
L-Ala-L-PheSc	10		ND	+	+	+
L-Phe-L-PheSc	11	-	+	+	+	+
L-Phe-L-PheMo	12	-	+	ND	ND	ND
L-Phe-D-PheSc	13	-	ND	+	+	+
L-Phe-L-PheOx	14	+	+	ND	ND	ND
L-Ala-D-PheSc	15	+	ND	ND	+	ND
L-Tyr-L-PheSc	16	+	ND	ND	+	ND
L-AIa-L-ChaSc	17	+	ND	ND	ND	+
L-Ala-L-LeuSc	18	+	ND	ND	ND	+

+ Химопапаин, свързан и елуиран

- Химопапаин, несвързан и неелуиран ND Не е определен

Пример 20

Пречистване на химопапаин /I/ Търговско достъпен разпрашително сушен латекс от Carica papaya /1 g/, получен от Powell и Scholefield, се разбърква в продължение на 1 час с дестилирана вода /5 ml/ и неразтвореният материал се отстранява чрез центрофугиране при 9000 х g в продължение на 30 минути при 4^ПС. Утайката се отстранява и pH на супернатантата се довежда до pH 1,8 със солна киселина /1М/ в течение на период от 20 минути. Разбъркването продължава при 4С 60 минути и pH се довежда до pH 1,8, ако се изисква.

/11/ Сместа се центрофугира при 9000 х g в продължение на 30 минути при 4С и утайката се отстранява.

/III/ /а/ pH на супернатантата се наглася на pH 6,8 чрез прибавяне на капки NaOH /5М/ в продължение на период от 10 минути. Отбелязва се поява на пурпурно-синьо оцветяване на разтвора.

/б/ Полученият пурпурносин разтвор се диализира екстензивно спрямо 10 ml буфер 35 „за нанасяне“ /натриев фосфат/ /50 ml/; EDTA /1тМ/; етандиол /33%, pH 6,8/ с три смени на буфера.Диализантата се центрофугира при 4000 х g в продължение на 10 минути и протеиновото съдържание на де40 кантираната супернатанта, съдържаща химопапаин се наглася на приблизително 30 mg/ml. Химопапаиновият разтвор се активира чрез прибавка на цистеин до крайна концентрация 4 тМ и се оставя да стои в 45 продължение на 15 минути при 0С.

/IV/ Активираният химопапаинов разтвор се нанася на 8 ml колона от ЕСНSepharose®, свързан с L-Ala-L-PheSc /получен, както е описано в пример 10/, предва5θ рително еквилибрирана с буфер „за нанасяне“, със скорост на елуиране 36 ml/cm²/. Колоната се промива последователно с буфер на нанасяне /2 пълни обема/, воден разтвор на натриев цитрат /50 тМ/ в етан диол /33 %/, pH 4,5 /2 пълни обема/ и воден натриев ацетат /50 mM/; EDTA /25 тМ/; мерсалил /10 тМ/ в етандиол /33%/, pH 4,5 /2 пълни обема/ и след това се инкубира при стайна температура в продължение на 2 часа.

V/ Химопапаинът се елуира с воден разтвор на натриев ацетат /50 тМ/, съдържащ мерсалил /10 тМ/ /3 пълни обема/ и се събират фракции по 4 ml. Ензимната активност на елуираните фракции се анализира за специфична актиивност спрямо ΒΑΡΝΑ, както е описано по-нагоре.

Активните фракции се обединяват и се пречистват по-нататък чрез катийонообменна хроматография върху Mono-S-HR® 10/10 /Pharmacia/ колона със „стартиращ“ фосфатен буфер от Na+ /50 mM/; EDTA /1тМ/; NaN₃ /0,01%/, pH 7,2 и „ограничаващ“ фосфатен буфер от Na+ /800тМ/; EDTA /1тМ/; NaN₃ /0,01%/, pH 7,2. Елуирането се извършва с градиент от сол 2,7 mM/ml и скорост на изтичане 2 ml/min. Събират се фракции /по 4 ml/, съдържанието на протеин се измерва чрез отчитане абсорбцията при 280 nm и ензимната активност се анализира посредством ΒΑΡΝΑ хидролиза.

Фракциите съдържащи химопапаин се обединяват и се диализират екстензивно спрямо дестилирана и дейонизирана вода или воден разтвор на EDTA /1 тМ/ и се лиофилизират при съхранение.

Пример 21

Пречистване на химопапаин - резултати от ΒΑΡΝΑ анализ /I/ Търговско достъпен разпрашително сушен латекс от Carica papaya /1 g/, доставен от Powell и Scholefield, UK се разбърква във вода /5 ml/ в продължение на 60 минути при 20°С. Нерозтвореният материал се отстранява чрез центрофугиране при 9000 х g в продължение на 30 минути при 4С. Утайката се отстранява и pH -то на супернатантата се довежда до pH 1,8 чрез прибавяне на капки от хлороводородна киселина /1М/ за период от 20 минути. Сместа се разбърква в продължение на 15 минути при 4^ИС и след 5 минути се порверява pH и се коригира, ако е необходимо.

/II/ Преципитатът се отстранява чрез центрофугиране при 9000 х g в продължение на 30 минути при 4С.

/III/ /а/ Супернатантата се довежда до pH 7,0 чрез прибавяне на капки, с разбърк ване, на воден разтвор на натриев хидроокис /5М/. Утайката се отстранява чрез центрофугиране при 9000 х g в продължение на 30 минути при 4С.

/б/ Получената в резултат супернатанта се нанася на катийонообменяща колона с Mono S HR 10/10 /Pharmacia/, която предварително е еквилибрирана с воден разтвор на Na₂HPO₄/NaH₂PO₄/50mM Na*/, съдържащ EDTA /1тМ/, pH 7,2 /буфер А/. След нанасянето на пробата, колоната се промива с буфер А /2 ml/min/, докато A_2g|) стигне до нула. След това колоната се елуира с градиент /2,7 mM Na*/ml/ от Na₂HPO₄/ NaH₂P0₄/0,80 М Na*/ и се събират фракции по 4 ml. Фракциите се изследват за активност спрямо ΒΑΡΝΑ. Големият химопапаинов пик, определен имунологично, се елуира между 0,17-0,28 М Na*. Фракциите от тази област, активни спрямо ΒΑΡΝΑ се обединяват и се прибавя етандиол до 33% /об/об/. Всички други фракции, включително тези, активни спрямо ΒΑΡΝΑ от последния елуиран /0,47-0,53 М Na'/ пик с папайя протеиназа III се отстраняват.

/IV/ Колона /15 ml пълен обем/ с ЕСНSepharose®, свързана с L-Ala-L-PheSc /получена, както е описано в пример 10/ се промива /39 ml/h/cm²/ с воден разтвор на NaH₂PO₄/Na₂HPO₄/50 mM Na*/, съдържащ EDTA /1тМ/ в етандиол /33%/ об/об/, рН6,8 /буфер за нанасяне/. Обединените химопапаинови фракции /по-горе/ се активират чрез прибавяне на цистеин основа /4 шМ крайна концентрация/ и се оставят при 0С за 15 минути. След това се нанасят на колоната, пооследвани от 60 ml буфер за нанасяне.

/V/ След това се нанася натриевоацетатен буфер /50 тМ/, pH 4,5, съдържащ HgCl₂/10 тМ, 45 ml/. Събират се фракции по 5 ml. Фракциите се изследват за активност спрямо ΒΑΡΝΑ.

Фракциите, съдържащи пика с активност, който се забавя от колоната и се елуира с буфера, съдържащ живачен двухлорид, се обединяват и се нанасят отново на колоната с Mono S. Колоната се промива с буфер А и след това със 7 пълни обема буфер А, съдържащ цистеин основа /4 тМ/. Елуирането се спира след 30 минути, за да се остави живакът да бъде изместен от ензима. Изтичането след това се възстановява и колоната отново се промива с буфер А преди да се нанесе градиент до NaH₂P0₄/Na₂HP0₄/0,80 М Na*/, както е описано по-горе. Фракциите, активни спрямо ΒΑΡΝΑ се обединяват, прибавя се цистеин база /4 тМ крайна концентрация/ и след това обединените ко- 5 личества се оставят за 15 минути при 0С.

Колона се зарежда със смола Chelex BioRad, UK; 0,5 g и се промива с буфер А.

Обединените фракции, съдържащи химопапаин се прекарват през колоната с Chelex, след това се диализират екстензивно спрямо воден разтвор на EDTA /1 тМ/ и се лиофилизират.

Получените резултати в пречистването на химопапаина е сумиран на таблица 2.

Таблица 2

Пречистване на химопапаин

	Протеин (mg)	ΒΑΡΝΑ Активност* /единици/	ΒΑΡΝΑ специфична активност /единици mg/	Добив + (%)	Пречистване (fold)
Разпрашително сушен латекс	441	493,712	1,120	100	1
Тритеране с киселина	361	238,636	661	48	0,59
Катийонообменна хроматография	58	133,748	2,306	27	2.06
Sepharose-LAla-L-PheSc	27.5	112,475	4,090	23	3,65
Катийонообменна хроматография	11	44,687	4,062	9	3.63
Chelex	10.5	43,301	4,124	9	3.68

+ Посоченият добив е добив на активност спрямо ΒΑΡΝΑ (също субстрат за папаин и папайя протеиназа III) * ΒΑΡΝΑ анализ метода N2

Пример 22

Пречистване на химопапаин - развитие 35 на специфични IgG антитела у питомни зайци

Чист химопапаин, получен, както е описано в пример 21, се карбоксиметилира внимателно преди да се използва за метода, 40 описан от Zucker et al., Biochem. Biophys. Acta, 828 (1985). Антисерум към химопапаин се развива у зайци чрез мускулно инжектиране на 360 mg карбоксиметилиран протеин в пълна добавка на Freund, последвано след 45 четиринадесет дни от подкожно инжектиране на 100 pg в непълна добавка. IgG се пречиства частично от антисеруми чрез фракциониране с амониев сулфат, както е описано от Heide и Schwick, loc.cit, после- 50 двано от диализа във воден разтвор на натриев фосфат /10 тМ/, съдържащ NaCl /0,14 М/, рН 7,3.

Пример 23

Пречистване на химопапаин и имунологична количествена оценка на химопапаин и PPIV /1-111/ Търговскодостъпен сушен разпрашително латекс от Carica papaya /1 g/, произведен от Powell и Scholefield, UK, се приготвя и се подлага на обработка до рН 1,8, както е описано в пример 21 /1-Ша/.

/IV/ Колона /15 ml пълен обем/ с ЕСНSepharose®, свързана с L-Ala-L-PheSc /получен, както е описано в пример 10/ се промива, както е описано в пример 21 /IV/. Крайната супернатанта от третирането до рН 1,8 се диализира във воден разтвор на NaH₂PO₄/Na₂HPO₄/50 mM NaV, съдържащ EDTA /1 тМ/ в етандиол /33% об/об/ рН 6,8 /буфер за нанасяне/, центрофугира се при 4000 х g в продължение на 10 минути и супернатантата се активира чрез прибавяне на дитиотреитол /2 тМ крайна концентрация/ за 15 минути при 20С. След това се нанася на афинитетна колона /39 ml/h/cm²/ и пропуска 60 ml буфер за нанасяне. След това се пропуска натриево-цитратен буфер /50 тМ/, рН 4.5, съдържащ EDTA /1 тМ/ и метилпиридилдисулфид/30 тМ/; 15 ml/ синтезиран, както е описано от Salih et al., Biochem. J. (1987), 247, 181-1937. Изтичането се спира и дисулфид-съдържащия буфер се оставя в колоната една нощ /18 часа/ при 20С.

/V/ Елуирането се възстановява с прибавянето на 45 ml от същия буфер, съдържащ метилпиридилдисулфид, последван от 30 ml буфер за нанасяне. Събират се фракции по 5 ml.

Фракциите се анализират за актвност спрямо ΒΑΡΝΑ. Фракциите, които съдържат пика с активност, който се забавя от колоната и се елуира с метилпиридилдисулфидсъдържащия буфер се обединяват и се нанасят /40 ml/h/cm²/ на колона /80 ml пълен обем/ със Sephadex LH-20 /Phamacia/, която е еквилибрирана предварително с воден разтвор на EDTA /1 тМ/ в етандиол /33% об/ об/. Хроматографията продължава с прилагане на 300 ml от този буфер. Фракциите /8 ml/ се анализират при А_27| и се анализират за активност спрямо ΒΑΡΝΑ.

Фракциите, съдържащи пика на активност спрямо ΒΑΡΝΑ /който е последван от 5 друг пик с А_27|/ се обединяват и се нанасят на катийон-обменна колона с Mono S HR 10/10 и се елуира, както е описано в пример 21 /1Иб/. Фракциите, активни спрямо ΒΑΡΝΑ, се обединяват.

Разпрашително-сушен латекс и материалът, получен от обработката до рН 1,8, афинитетната хроматография и катийонобменната хроматография се анализират за наличие на PPIV с проста радиална имуно15 дифузия, както е описано по-рано. Същият метод е използван за количествена оценка на химопапаина, с химопапаин моноспецифични антитела, развити у зайци, получени както е описано в пример 22. Стандартната 20 права за химопапаин се получава като се използва химопапаин, пречистен по методите, описани тук и за които е установено чрез проста радална имунодифузия, че не съдържа и PPIV ΡΡΙΙ1. Резултатите са показани на 25 Таблица 3.

Таблица 3

Пречистване на химопапаин и имунологична количествена оценка на химопапаин и PPIV

	Протеин (mg)	ΒΑΡΝΑ Специфична активност /единици mg¹/	Химопапаин (mg)	PPIV /% тотален протеин/
Разпрашително сушен латекс	468	1,000	144	18,7
Третиране с киселина	157	1,433	92	< 0,1
Sepharose-L-Ala-L-PheSc	24	4,000	28	+
Катийо-обменна хроматография	15	3,533	14	+

+ = не е измерено ++ = ΒΑΡΝΑ анализен метод N2

Пример 24

Изследване на алергия спрямо химопапаин

Четирийсет проби с човешки серум се 50 доставят от 3 М Diagnostic Systems, USA. Тези образци са преминали търговско достъпен тест, известен с названието Chymofast, за IgE спрямо търговско достъпна форма на химопапаин, Chymodiactin®. Двадесет от образците са означени като Chymofast-позитивни и двадесет са негативни. Четирийсетте образци се приемат като „слепи“ и се изпитват по-нататък за естествено придобити IgE антитела спрямо Chymodiactin®, PPIII, PPIV и спрямо пречистен химопапаин/, пречистен по методите, описани тук, и доказан, че не съдържа и двете PPIV и PPIII посредством проста радиална имунодифузия като се използва модифициран твърдофазов ензимосвързващ имуносорбентен анализ /EL ISA/, употребявайки биотинавидиновата система. както е резюмирано по-долу:

Микротитърни плаки, покрити с:

Тест антиген

Тест серум

Моноклонални античовешки IgE Биотинирани заешки антимиши Ig Авидин-пероксидазен комплекс Субстрат /ABTS/

Спира се и се измерва А_41П

Chymodiactin® се използва в рамките на срока за годност, PPIV се пречиства, както е описано тук, a PPIII се пречиства съгласно Buttle and Barrett, Biochem. J. 223, 81-88 (1984). Всички антигени се инактивират посредством меко карбоксиметилиране с 20 йодоцетна киселина /ЮтМ/, както е описано от Buttle и Barrett, loc. cit преди да се използват.

Ямките на микротитърната плака се покриват с тестовия антиген чрез инкубиране на всяка ямка със 100 μΙ тестов антиген /10 pg/ ml/ в натриевокарбонатен буфер /0,05 М, pH 9,6/. След това се използва донорен конски серум /4%/, за да се намали неспицифичното свързване през време на следва- 30 щите етапи. Инкубиране с тест-серум /1/20 разреждане/ в PBS/ 0,1% Tween, 2% конски серум, 10 mM EDTA 50 pg/ml хепарин; pH 7,2 πιΐ/ΐθθμΐ/ямка/ при 37С в продължение на 4 часа, след това следва моноклонални IgE /приготвени, както е описано от Kemey & Richards, J. Immunol., Methods (1988, 108, 105), - I pg/ml, 100 μΙ/ямка при 37°C за три часа и след това биотинилиран заешки антимиши имуноглобулин /достъпен от 40

Dakopatts, Дания - 1 pg/ml, 100 μΙ/ямка /при стайна температура в продължение на една нощ. Ямките се инкубират в продължение на 30 минути при 37С с авидин-перок5 сидаза/ 10 μΙ/ml, 100 μΙ/ямка/, прибавя се субстрат /2,2'-азинобис/3-етилбензтиазолин сулфонова киселина/, ABTS, 0,5 mg/ml в буфер /100 тМ лимонена киселина, 200 тМ Na₂HPO₄, pH 4,2, активиран с 1 μΐ/ml Н₂О₂/ 10 и ямките се инкубират при стайна температура в продължение на 30 минути. Реакцията се спира чрез прибавяне на 100 μΙ/ямка 100 тМ лимонена киселина, 0,01% NaN₃ и се определя абсорбцията при 410 nm за 15 всяка ямка, като се използва микро ELISA детектор /Dynatech/. IgE стандартите се анализират в порядъка 0,075 до 4,8 mg/ml 2,4 mg IgE =1 Международна Единица IgE/. За изчисляване на концентрациите на IgE, насочен срещу всеки от четирите антигенови препарати Chymodiactin®, PPIII, PPIV и химопапаин, получени както е описано в пример 23 се използва Enzfitter програма Leatherbarrow R. Y. (1985), Enzfitter for 25 IBMPC, Elsevier-Biosoft, 68 Hills Road, Cambridge CB₂1LA, UK.

от 40 серумни образци, които са анализирани, показват съдържание на IgE антитела срещу Chymodiactin® и стойностите, получени за PPIII, PPIV и химопапаина от дванадесетте най-реактивни срещу Chymodiactin® са показани на таблица 4 по-надолу. Стойностите на средната и стандартната грешка се получават от девет определяния.

Може да се види, че от тези 12 серумни образци, съдържащи анти-Chymodiactin антитела, в само два антихимопапаинът представлява главният IgE отговор и антителата срещу PPIII и PPIV наброяват приблизително 75% от съответните установени IgE.

Таблица 4

Специфични IgE, концентрации (IU/ml) в серумни проби, съдържащи IgE антитела срещу Chymodiactin®

Проба

PPIV PPIII Химопапаин

Средно Станд. Средно Станд. Средно Станд.

Общо% Химопапаин грешка грешка грешка

1	19,9	1,7	18,8	1,7	8,2	1,3	46,9	18
2	5,1	0,3	4,0	0,1	3,2	0,4	12,3	26
3	5,9	0,4	2,7	0,3	1,2	0,3	9,8	12

Проба	PPIV	РР1П	Химопапаин	Общо”_о Химопапаин
Средно	Станд. грешка	Средно	Станд. грешка	Средно	Станд. грешка
4	1,8	0,1	2,3	0,2	1.7	0,1	5,8	29
5	3,4	0,2	2,0	0,2	1,6	0,3	7,0	23
6	3,1	0,2	0,3	0,01	0,3	0,03	3,7	8
7	2,6	0,2	1,6	0,2	0,9	0,2	5,1	18
8	2,0	0,1	1.1	0,1	1,3	0,2	4,4	30
9	1,5	0,2	0,3	0,07	1,7	0,2	3,5	49
10	1,0	0,1	0,3	0,09	0,5	0,1	1,8	28
11	3,6	0,4	1,4	0,2	0,7	0,07	5,7	12
12	0,6	0,1	0,4	0,09	2,3	0,2	3,3	70
Общо	50,5		35,2		23,6		109,3	Средно 22

Пример 25

Инхибиране на смеси от химопапаин и 20 PPIV от пилешки цистатин

Химопапаин се пречиства, както е описано в пример 23 и стандартизиран чрез титруване на активната част с Е-64 като се използва ΒΑΡΝΑ като субстрат Zucker et al., 25 1985, Biochem. Biophys. Acta, 828, 196-204. PPIV, пречистена както е описано по-горе, също се титрира с Е-64, като се адаптира този метод за използване на азоказеин за субстрат. 30

Пилешки цистатин форма 2 се пречиства, както е описано в Anastasi et al., 1983, Biochem. J. 211, 129-138 и се стандартизира чрез титруване с папаин, който предварително е титриран с Е-64. ³³

Анализът за азоказеинова хидролиза се извършва по метода на Rowan et al., 1988. loc. cit c изключение на това, че преди прибавянето на субстрата се включва преи нкубация 15 минути при 40С на ензима и инхибитора.

Две серии от 9 епруветки се вземат и във всяка епруветка се поставят 125 ml 0,40 М натриево фосфатен буфер, съдържащ 4 тМ EDTA и 16 тМ цистеин база, pH 6,8. Прибавят се химопапаин и PPIV, като съотношението се варира до крайна концентрация на протеиназа 100 пМ. Към едната серия от епруветки се добавя пилешки цистатин до крайна концентрация 1 шМ и същият обем вода към другата серия. След това епруветките се инкубират преди да се анализират за азоказеиова хидролизна активност.

Ефектът на пилешкия цистатин върху хидролизата на азоказеин от ензимните смеси се изразява като процент на инхибиране на активността, получена от същите ензимни смеси в отсъствие на цистатин, както е показано на таблица 5.

Таблица 5

Процент на инхибиране от пилешки цистатин на смеси от химопапаин и PPIV

PP1V /пМ/	Химопапаин /пМ/	А 366 -цистатин	^А366 +цистатин	% на инхибиране
100	0	0,092	0,094	0
80	20	0,158	0,102	35,4
70	30	0,191	0,088	54,0
60	40	0,316	0,06	80,0
50	50	0,347	0,058	83,3
40	60	0,428	0,066	84,5
30	70	0,543	0,028	94,8
20	80	0,588	0,033	94,4
0	100	0,733	0,008	98,9

Може да се види, че степента на инхибиране от пилешки цистатин е обратно свързана с концентрацията на PPIV.

Пример 26

Пречистване на химопапаин чрез утаяване с киселина при pH 2,2 -1,2

I/ Търговскодостъпен, сушен чрез разпрашително сушене латекс от Carica papaya, доставен от Powell Scholefield, UK се довежда до 20% /т/об/ с дестилирана вода и се разбърква в продължение на 1 час. Неразтвореният материал се отстранява посредством центрофугиране при 9000 х g в продължение на 30 минути при 4С. Утайката се отстранява и pH на супернатантата се намалява чрез прибавяне на хлороводородна киселина /1М/ на капки, с разбъркване, при 4С и със скорост 40 μΐ/min/ml. pH-то на сместа се контролира непрекъснато, като се използва комбиниран с радиометър електрод /Тип GK 2401С/ калибриран с pH 4,01 и pH 1,09 буферни стандарти /Радиометър, 25С/. При pH 2,2 и на интервали от 0,2 pH единици, като се слиза надолу до 1,2 pH, прибавянето на киселина се спира и pH се запазва постоянно, като разбъркването при 4С продължава. След това се взема алик вотна част /еквивалентна на 10 ml от изходния разтвор/ и се съхранява. Прибавянето на киселина към останалия разтвор продължава, докато се достигне следващия pH ин5 тервал.

II/ Всички проби се центрофугират при 9000 х g за 30 минути при 4С и утайките се отстраняват.

III/ pH-то на всяка супернатанта се 10 довежда до pH 6,8 чрез прибавяне на капки /400 μΙ/min/NaOH/1М/. Всяка проба се центрофугира отново при 9000 х g в продължение на 30 минути за отстраняване на допълнителна утайка.

В по-нататъшните експерименти утаяването с киселина при pH 1,8 се извършва при 25С.

Всяка от крайните супернатанти се анализира за активност спрямо ΒΑΡΝΑ и за 20 присъствие на PPIV и химопапаин съгласно изобретението посредством проста радиална имунодифузия, както е описано по-горе. Резултатите са показани на таблица 6 и сочат, че отстраняването на PPIV до ниво от <0,1 % 25 тотален протеин се достига чрез киселинно утаяване при 4С при pH 1,8 и по-ниско и до <0,5% чрез утаяване при 25С при pH 1,8.

Таблица 6

Условия	Темп. (°C)	Протеин (mg)	ΒΑΡΝΑ Активист* единици χ 10⁵	ΒΑΡΝΑ Специфична активност единици mg^-1	Химопапаин (mg)	PPIV (%общ протеин)
Изходен разтвор		946	15,8	1670	208	20,30
pH 2,2	4	848	9,5	1120	231	7,56
pH 2,0	4	865	9,1	1052	230	1,20
pH 1,8	4	796	9,0	1131	199	0,09
pH 1,6	4	828	7,7	930	224	0,06
pH 1,4	4	869	7,8	898	225	0,05
pH 1,2	4	784	7,1	906	166	0,03
pH 1,8	20	925	8,3	897	269	0,43

♦ΒΑΡΝΑ Анализ метод №2

Пример 27

Приготвяне на моноспецифични IgG антитела, развити у овца

Чист химопапаин, получен както е описано в пример 21 се карбоксиметилира внимателно преди употреба по метода, описан от Zucker et al., юс. cit и се диализира спрямо воден разтвор на натриев фосфат /10 тМ/, pH 7.3, съдържащ натриев хлорид /0,14М/. Антисерумът към химопапаин се образува в овца посредством мускулно инжектиране на 100 pg карбоксиметилиран протеин в комплектна добавка на Freund, последвано от 50 pg след един месец, приложен по същия начин. IgG се пречистват частично от антисерум посредством фракциониране с амониев сулфат, както е описано от Heide и Schwick (1978) loc. cit., последвано след това от диализа във воден разтвор на натриев фосфат /ЮтМ/, съдържащ натриев хлорид /0,14М/ pH 7,3.

IgG препарати от антитела спрямо папаин. папайя протеиназа III и папайя протеиназа IV се получават по подобен начин.

Индивидуалните карбоксиметилирани антигени поотделно се свързват съгласно инструкциите на производителя, с колони, доставяни с търговското название Zetaffinity Anachem, еквилибрирани във воден разтвор на натриев фосфат /10 шМ/, pH 7,3, съдържащ натриев хлорид /0,14 М/. Потенциални онечиствания или кръстосано-реагиращи антитела се абсорбират из IgG препаратите чрез прекарване през тези колони така, че крайните IgG препарати да дават преципитинови реакции с техните респективни антигени, но да не дават преципитиращи кръстосани реакции с разлчни антигени. Колоните, свързани с антиген се регенерират за повторна употреба с воден разтвор на диетиламин /0,05 М/, pH 11.5 и бързо се рееквилибрират във фосфатен буфер.

По такъв начин се приготвят моноспецифични препарати от IgG антитела срещу химопапаин, PPIII, PPIV и папаин, които могат да се използват за количествен анализ на всеки антиген посредством проста радиална имунодифузия, както'бе описано по-преди.

Пример 28

Пречистване на химопапаин — утаяване с киселина при pH 1,5

I/ Търговско достъпен сушен чрез разпрашително сушене латекс от Carica papaya /20 g/, доставен от Siebels, USA се разбърк ва в дейонизирана и дестилирана вода /предвартелно охладена до 4С, 250 ml/ в пордължение на 60 минути при 0С. рН-то на сместа се довежда до pH 1,5 чрез прибавяне на HCI /IN/ със скорост 10 μΐ/min/ ml, като непрекъснато се измерва pH при използване на Радиометер комбиниран електрод /Тип GK 2401С/, калибриран с pH 4,01 и 1,09 буферни стандарти /Радиометер, 25С/. Когато се достигне pH 1,5 се изчаква за период от 10 минути да се стабилизира pH, през което време ако е необходимо, допълнително се донаглася рН-то.

II/ Смесите се центрофугират при 12000 х g в продължение на 30 минути при 4С и утайките се отстраняват.

III/ /а/ pH-то на супернатантите се наглася на 7,0 чрез прибавяне на NaOH /1М/ със скорост 10 μΐ/min/ml при непрекъснато следене на pH, като се използва Радиометер електрод, калибриран с pH 7,01 буферен стандарт /Радиометер, 25С/. Когато се достигне pH 7,0, се оставя за 10 мнути да се стабилизира pH, като през това време ако се налага се донаглася pH-то. Смесите се центрофугират при 12000 х g в продължение на 30 минути при 4С и утайките се отстраняват.

б/ Супернатантата се диализира екстензивно при 4С спрямо 30 обема дейонизирана и дестилирана вода с две смени, извършени през интервал от 12 часа.

Диализираният разтвор се пречиства понататък чрез катийонобменна хроматография върху колона за високоефективна хроматография със S-Sepharose 35/100 /Pharmacia/. За всяко зареждане се използват максимум 3 g протеин /определен с A_2g(|/. Колоната се еквилибрира предварително с воден разтвор на EDTA /1тМ/ при 4С. След нанасянето на пробата, колоната се промива с воден разтвор на EDTA /1 тМ/ при lOml/min, докато А достигне до нула.

В колоната се пуска градиент /0,175 тМ/ К⁺ /т1/ до 0,5 М К⁺и се събират фракции по 25 ml. Пиковите фракции се изследват за активност спрямо ΒΑΡΝΑ.

Фракциите, съдържащи химопапаин с най-висока специфчна активност спрямо ΒΑΡΝΑ /елуирани между 0,17 и 0,22 М KV се обединяват. Обединеният химопапаин се диализира екстензивно при 4С спрямо 30 обема дейонизирана и дестилирана вода с пет смени, направени през интервал от 12 часа. Диализатът се лиофилизира и се съх ранява при -2ОС.

Цялата процедура на пречистване се повтаря при много случаи. Наличието на химопапаин съгласно изобретението, папоин, PPIII и PPIV се установява като се използва проста радиална имунодифузия, както бе описано по-преди и антителата се образуват в овца, както е описано в пример 27. Активността спрямо ΒΑΡΝΑ и титруването на активните центрове с йодоцетна киселна се анализират като се използва ΒΑΡΝΑ Метод 5 N1, описан по-рано. Напредъкът в пречистването е сумиран в средни стойности, показани в таблица 7.

Таблица 7

	Общ протеин (mg)	ΒΑΡΝΑ Специфична активност единци mg^-’	Активни центрове (%>	Химопапаин (% общ протеин)	PPIV (% Общ протеин)	PPI1I (% Общ протеин)	Папаин (% Общ протеин)
Изходен материл	10203	572	30	25	22	14	5
pH 1,5	8168	461	28	30	0,1	14	<0,1
Анализа	4351	674	42	59	0,1	24	<0,1
Катийонообменна хроматография	948	1079	72	100	0.1	<0,1	<0,1
Анализа	767	1098	89	100	0,1	<0,1	0,1
Лиофилизиран	ND	905+	ND	ND	ND	ND	ND

ND Не е определен + Протеин, определен по общо сухо тегло

Пример 29

Пречистване на химопапаин — утаяване с киселина при pH 1,5 и афинитетна хроматография

Ι-III Търговскодостъпен, сушен чрез разпрашително сушене латекс от Carica papaya /50 g/, доставен от Siebels, USA се приготвя и се утаява с киселина при pH 1,5, както е описано в пример 28 /I-Ша/. Супернатантата се диализира екстензивно при 4С спрямо 30 обема дейонизирана и дестилирана вода, с две смени, направени през 12 часови интервали.

IV/ Колона /350 ml пълен обем/ с ЕСНSepharose, свързана с L-Ala-L-PheSc /получен както е описано в пример 10/ се еквилибрира с воден разтвор на етандиол /33% об/об/, съдържащ натриев ацетат /50 тМ/, pH 4,5 в продължение на една нощ и след това се еквилибрира с воден разтвор на NaH₂PO₄/Na₂HPO₄/50mM Na’/, съдържащ EDTA /1тМ/ в етандиол /33% об/об/, pH 6,8 /буфер за нанасяне/.

Диализираната супернатанта /по-горе/ се филтрира, като се използва филтър с размер на порите 0,2 цт и се прибавя етандиол до 33% /об/об/. Проверява се рН-то на разтвора и, ако е необходимо, се довежда 35 до pH 7,0. Прибавя се прясно приготвен воден разтвор на L-цистеин /200 тМ/ до концентрация 4тМ, разтворът се размесва добре и се оставя да стои 15 минути при 4С. След това се нанася на афинитетна колона 40 при 4С със скорост на изтичане до 40 ml/h/ cm². Колоната се промива с 10 пълни обема буфер за нанасяне.

V/ Химопапаинът се елуира с 3 пълни обема воден разтвор на живачен двухлорид 45 /10 тМ/ в етандиол /33% об/об/, съдържащ натриев ацетат /50 тМ/, pH 4,5 и се събират фракции по 25 ml. Фракциите, показващи активност спрямо ΒΑΡΝΑ се обединяват и се пречистват допълнително чрез 50 катийонообменна хроматография върху колона със S-Sepharose Високоактивна 35/100/ Pharmacia/.

Колоната се еквилибрира предварително с воден разтвор на EDTA /1 тМ/ при 4С.

След нанасянето на пробата, колоната се промива с воден разтвор на EDTA /1тМ/ със скорост 10 ml/min, докато А се върне до нула. На колоната се нанасят трии пълни обема воден разтвор на К₂НРО₄/КН₂РО₄/50 mM К*/. pH 7,2, съдържащ EDTA /1 тМ/ и L-цистеин /500 тМ/ и изтичането се спира за 30 минути. Още три пълни обема прясно приготвен цистеинов буфер се нанасят на колоната и елуирането се спира за 30 минути. Колоната се промива с още шест пълни обема цистеинов буфер и след това се еквилибрира наново с воден разтвор на К₂НРО₄/ КН₂РО₄/50 тМ К⁺/, съдържащ EDTA /1тМ/ pH 7,2.

През колоната се пропуска градиент /0,175 тМ К⁺/т1/ до 0,5 М К⁺ и се събират фракции по 25 ml. Пиковите фракции се анализират за активност спрямо ΒΑΡΝΑ. Първият пик, елуиран между 0,2 до 0,25 М К⁺ химопапаин. Вторият пек, елуиран при около 0,45 М К⁺ е папайя протеиназа НЕ

Фракциите, съдържащи химопапаин с най-висока специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ се обединяват. Обединеният химопапаин се диализира екстензивно при 4С спрямо 30 обема дейонизирана и дестилирана вода с пет смени на водата, направени през 12 часови интервали.

Химопапаинът, елуиран от катийонооб5 менната колона, се активира с цистеинов буфер и така стават чувствтелни към инактивиране чрез окисление. С оглед да се предотврати по същество или да се намали инактивирането на активния ензим от окис10 ление, фракциите се събират в епруветки, съдържащи суспензия от натриев тетратионат /200 тМ/, като дават крайна концентрация от 5 mM NaS₄O₆ във всяка фракция. Алтернативно, обединеният химопапаин се 15 диализира под азот спрямо вода, която е продухана от кислорода, посредством барботиране на азот със скорост 0,1 Ι/min в продължение на 30 минути в контейнер, запечатан под азот.

Накрая диализатът се лиофилизира и се съхранява при -20С.

Цялата процедура по пречистването се повтаря няколко пъти и резултатите от пречистването /при анализиране, както е опи25 сано в пример 28/ са сумирани в средни стойности, показани на таблица 8.

Таблица 8

	Общ протеин (mg)	ΒΑΡΝΑ Специфична активност единци mg ¹	Активни центрове (7о)	Химопапаин (% общ протеин)	PPIV (% Общ протеин)	ΡΡΠΙ (% Общ протеин)	Папаин (% Общ протеин)
Изходен материл	25508	572	30	25	22	14	5
pH 1,5	20421	401	28	30	<0,1	14	<0,1
Диализа	10877	674	42	59	<0,1	24	<0,1
SepharoseL-Ala-LPheSc	1673	1446	86	66	<0.1	13	<0.1
Катионообменна хроматография	951	1625	100	100	<0.1	<0.1	<0.1
Диализа	828	1743	100	ND	ND	ND	ND
Лиофилизиран	ND	1320+	ND	ND	ND	ND	ND

Пример 30

Пречистване на химопапаин - утаяване с киселина при pH 1,5 и афинитетна хроматография

1-111/ Търговскодостъпен, сушен чрез разпрашително сушене латекс от Carica papaya, доставен от Siebels, USA се приготвя и се подлага на третиране при pH 1,5, диализа и катийонобменна хроматография върху SSepharose®, както е описано в пример 28.

IV/ Фракциите, съдържащи химопапаин с най-висока специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ се обединяват и се прибавя етандиол до 33% /об/об/. Прибавя се прясно приготвен воден разтвор на L-цистеин /200 шМ/ до концентрация 4 тМ и разтворът се нанася на колона с ECH-Sepharose®, свър зана с L-Ala-L-Phe Sc, както е описано в пример 29 /IV/.

V/ Химопапаинът се елуира с 3 пълни обема воден разтвор на живачен двухлорид 5 /10 тМ/ в етандиол /33% об/об/, съдържащ натрев ацетат /50 тМ/, pH 4,5 и се събират фракции по 25 ml. Фракциите, имащи активност спрямо ΒΑΡΝΑ се обединяват и се диализират екстензивно при 4С спрямо 10 30 обема дейонизирана и дестилирана вода при пет смени, направени през 12 часови интервали. Диализатът се лиофилизира и се съхранява при -20С.

Данните от пречистването /при анализ, 15 както е описан в пример 28/ са резюмирани в таблица 9.

Таблица 9

	Общ протеин (mg)	ΒΑΡΝΑ Специфична активност eaHHUMmg'¹	Активни центрове (%)	Химопапаин (% общ протеин)	PPIV (% Общ протеин)	РРШ (% Общ протеин)	Папаин (% Общ протеин)
Изходен материал	28795	632	31	27	25	16	6
pH 1,5	23257	458	24	28	<0.1	13	<0,1
Диализа	8319	916	57	75	0,2	25	<0,1
Катийонообменна хроматография	3102	1103	72	91	<0,1	<0,2	<0,1
SepharoseL-Ala-LPheSc	947	1245	89	ND	ND	ND	ND
Диализа	858	1587	88	100	ND	<0,1	<0,1
Лиофилизиран	972	1265+	69	ND	<0,1	ND	ND

Пример 31

Два препарата от химопапаин съгласно изобретението се анализират като се използват ΒΑΡΝΑ Анализ Метод N1 и 2 в един и същ ден. Протеина се изчислява по тотално сухо тегло. Химопапаинът препарат А произхожда от процедурата на пречистване, как то е описано в пример 28. Химопапаинът 45 препарат В е получен по процедурата за пречистване, както е описано в пример 29 /крайните фракции, събрани в натриев тетратионат/. Резултатите от анализа, извършен трикратно, са показани на таблица 10.

Таблица 10

Химопапаинов препарат	Специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ /Единици mg '/
Анализен метод N»1	Анализен метод №2
А	855	2227
В	1 261	3591

Пример 32

Химопапаин, пречистен както е описано в пример 29 и диализиран под азот, както е описано там, се лиофилизира и се съхранява при -20С. Лиофилизираният химопапаин има специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ /1тМ/ при 37С т и pH 6,0 1345 единици за mg.

За да се приготвят 100 фиолки със състав, съдържащ пречистен химопапаин се приготвя 43,75 g общ разтвор, както е описано по-долу. Общият разтвор се държи при 4 до 12С през време на преработването.

L-/+/ цистеин хидрохлорид монохидрат /166 mg/ се прибавя към около 30 g вода за инжекции, за да се получи концентрация 22 тМ в крайния обем. pH-то на разтвора се довежда до 5,0-5,5 с NaOH /1М/ или НС1 /0,1М/. Цистеиновият разтвор се прибавя към пречистен химопапаин /358 mg/, за да се получи концентрация от 11000 единици/ ml в крайния обем. pH-то на разбърквания разтвор се довежда до pH 5,9-6,1 с NaOH / 1М/ или НС1 /0,1М/ и се довежда до 43,75 g с вода за инжекции. Разтворът се стерилизира, като се прекарва през серии филтри с размер на порите 0,2 микрона. 0,4 g аликвотни части от разтвора се напълват в 100 х 5 ml стъклени фиолки. Фиолките се застопоряват, водата се отстранява чрез лиофилизация под намалено налягане и фиолките, съдържащи лиофилизираният продукт се запечатват под вакуум.

Всяка фиолка съдържа бял аморфен прах, съдържащ 3,27 mg химопапаин и 1,52 mg натриев цистеинат хидрохлорид /номинално 4000 единици и 8 gmol, респективно допускащо 10% престаряване/. Най-общо съставите се реконструират непосредствено преди употреба чрез прибавяне на 2 ml вода за инжекции, като се получава разтвор за инжекции, наминално съдържащ 4000 единици химопапаин и 4 тпМ L-цистеин.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Химопапаин, притежаващ специфич на активност спрямо ΒΑΡΝΑ (1 m.M) при 37С и pH 6,0, която се определя в границите от 800 до 1700 единици за mg и съдържащ по-малко от 0,2% от: папайя протеиназа III (PPIII), папаин и папайя протеиназа IV (PPIV).
2. Химопапаин съгласно претенция 1, притежаващ специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ (1 mM) при 37С и pH 6,0, която се определя в границите от 1000 до 1700 единици за mg.

20
3. Химопапаин, притежаващ специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) при 40°С и pH 6,8, която се определя в границите от 3000 до 4500 единици за mg и съдържащ по-малко от 0,2% от: папайя протеиназа III

25 (PPIII), папаин и папайя протеиназа IV (PPIV).
4. Химопапаин съгласно претенция 3, притежаващ специфична активност спрямо ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) при 40С и pH 6,0, която се

30 определя в границите от 3500 до 4500 единици за mg.
5. Химопапаин съгласно всяка една от предходните претенции, притежаващ специфична активност спрямо азоказеин, който ³³ се инхибират в степен най-малко 95% от пилешки цисатин в концентрации до 1 μΜ.
6. Химопапаин съгласно всяка една от предходните претенции, съдържащ най-малко 70% активнодействащ ензим.

40
7, Състав, характеризиращ се с това, че съдържа химопапаин съгласно всяка една от предходните претенции.
8. Състав съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че съдържа и носител.

45
9. Състав съгласно една от претенциите 7 или 8. характеризиращ се с това, че е херметизиран при условията на безводна среда във вакуумирани фиолки или ампули.
10. Състав съгласно претенция 9, харак-

50 теризиращ се с това, че съдържа и редуктор.
11. Състав съгласно всяка една от претенциите от 7 до 10, характеризиращ се с това, че съдържа и реверсивен инхибитор на цистеин протеиназа.
12. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че съдържа химопапаин съгласно всяка една от претенциите от 1 до 6.
13. Фармацевтичен състав съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че съдържа и фармацевтично приемливи разредител, добавка или носител.
14. Фармацевтичен състав съгласно претенция 12 или 13, характеризиращ се с това, че е херметизиран при условията на безводна среда във вакуумирани фиолки или ампули.
15. Фармацевтичен състав съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че съдържа и фармацевтично приемлив редуктор.
16. Фармацевтичен състав съгласно всяка една от предходните претенции от 12 до 15, характеризиращ се с това, че се прилага парентерално в единични дозирани форми.
17. Приложение на химопапаина съгласно всяка една от претенциите от 1 до 6 за хемонуклеолиза.
18. Приложение на химопапаин съгласно всяка една от претенциите от 1 до 6 за производство на лекарствено средство за хемонуклеолиза.
19. Метод за лечение чрез хемонуклеолиза на увредени с херния или по друг начин анормални междупрешленни дискове на бозайници, характеризиращ се с това, че в увредения диск се инжектира фармацевтично приемлив разтвор на химопапаин съгласно всяка една от претенциите от 1 до 6 в количество, което е достатъчно да може селективно да разтвори част от този диск.
20. Метод за лечение на анормални гръбначни дискове на бозайници, характеризиращ се с това, че допълнително в увредения диск се вкарва игла на инжекция, местоположението на която се потвърждава с рентгенови лъчи, след което в диска се инжектира фармацевтично приемлив разтвор на химопапаин съгласно всяка една от претенциите от 1 до 6 в количество, което е достатъчно за селективно разтваряне на част от този диск.
21. Метод за пречистване на химопапаин, характеризиращ се с това, че се инкубира воден разтвор на суров химопапаин с матрица за афинитетна хроматография с насочен активен център, обхващаща носеща матрица, ковалентно свързана по избор чрез пространствена връзка към N-края на пептид, обратимо инхибиращ химопапаина та ка, че споменатият пептид се свързва с активната част на молекулата на химопапаина и елуиране на химопапаина с подходящ елуент.

5
22. Метод за пречистване на химопапаин, характеризиращ се с това, че се утаява водна смес, съдържаща суров химопапаин при pH в границите от 1,2 до 1,8, разделя се водният разтвор на химопапаина от споменатата смес 10 и се неутрализира и по избор изсолва споменатият разтвор на суров химопапаин.
23. Метод за пречистване на химопапаин, характеризиращ се с това, че се утаява водна смес, съдържаща суров химопапа-

15 ин при стойност на pH по-ниска от 2,0, разделя се водният разтвор на суровия химопапаин от споменатата смес, неутрализира се и по избор се изсолва споменатият разтвор на суров химопапаин, инкубира се 20 разтворът, получен в горния стадий с матрица за афинитетна хроматография с насочена активна част, обхващаща носеща матрица, ковалентно свързана по избор чрез пространствена връзка към N-края на пептид, 25 обратимо инхибиращ химопапаин така, че споменатият пептид се свързва с активната част на молекулата на химопапаина и се елуира химопапаинът с подходящ елуент.
24. Метод съгласно претенция 23, харак30 теризиращ се с това, че утаяването се извършва при стайност на pH в границите от 1,2 до 1,8.
25. Метод съгласно всяка една от претенциите от 21 до 24, характеризиращ се с това, че включва най-малко един етап на катиионообменна хроматография.
26. Обратими пептидни инхибитори на химопапаина, избрани от L-Ala-L-PheSc, LAla-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-

40 PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, LAla-L-ChaSc и L-Ala-L-LeuSc.
27. Дипептид, избран измежду L-Ala-LPheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, LPhe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-

45 PheSc, L-Ala-L-ChaSc и L-Ala-L-LeuSc.
28. Активна химопапаинова сайт-насочена матрица за афинитетна хроматография, включваща „биорна“ матрица, ковалентно свързана по избор чрез пространствена връз-

50 ка към N-края на обратимия пептиден инхибитор на химопапаина, притежаващ С-крайно фенилаланиново производно или аналог на фенилаланиново производно, при условие че споменатият инхибиторен пептид не е

Е-фенилаланил-Ь-фенлаланин семикарбазон.
29. Активна химопапаинова сайт-насочена матрица за афинитетна хроматография съгласно претенция 28, в която пептидният инхибитор е L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-LPheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-ChaSc и LAla-L-LeuSc,