PT93921B - Processo de purificacao de quimopapaina - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA DA PATENTE DE INVENÇÃO Nq 93 921

NOME: THE BOOTS COMPANY PLC EPÍGRAFE: "Processo de purificação de quimopapalna INVENTORES: Alan John Barrett, David John Buttle, Daniel Hulbert Rich

Reivindicação do direito de prioridade (ao abrigo do artigo 4q da Convenção de Paris de 20 de Março de 1683): Reino Unido em 28 de Abril de 1989 sob o NS 8909836.2 70 912 WAF/CRF/P/271 PATENTE N9 93 921

"Processo de purificação de quimopapaí^ na para que THE B00TS COMPANY PLC, pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO

Este invento refere-se ao processo de preparação de quimo-papaína adequada para a preparação de composiçães farmacêuticas melhoradas para uso em métodos de tratamento de discos espirais intervertebrais, de mamíferos, danificados, com hérnia ou anormais. 0 processo inclui um passo de precipitação ácida e preferi velmente um processo de cromatografia de afinidade usando uma matriz dirigida a sítios activos. 70 912 WAF/CRF/P/271

MEMÓRIA DESCRITIVA

Este invento refere-se ao processo de preparação de quimo-papaína, de melhores composições farmacêuticas contendo quimopapa^ na e a métodos para tratar discos espinais intervertebrais, de mamíferos, danificados, com hérnia ou anormais, os quais compreendem injectar, nos referidos discos, uma solução de composição melhorada. 0 invento refere-se ainda a péptidos e matrizes de cromatogra fia de afinidade para uso no processo de preparação da quimopapaf na do invento e a preparações de anticorpo monoespecifico desenvolvidas contra quimopapaina. A quimopapaina é uma cisteína-proteinase presente no látex da papaieira (Carica papaya). Verificou-se que a quimopapaina tem utilidade clinica, particularmente para o tratamento de discos pr^ lapsados ou com hérnia ou de ciática num processo conhecido por "quimionucléolise", Smith, L. (1964), 3. Amer. Med. Assoe. 187, 137-140. A purificação e caracterização da quimopapaina foi tentada em primeiro lugar por Jansen e Balis (1941), J. Biol. Chem., 137, 405-417, que usaram a precipitação ácida e um procedimento de "sal^ ting-out" para preparar a enzima. Mais recentemente, têm sido empregues métodos de purificação baseados em cromatografia de permuta iónica. Assim, por exemplo a GB2098997 (Smith Laboratories Inc.) e a GB2156821 (Simmons) descrevem ambas o uso de resinas de permuta catiónica para separar a quimopapaina de outras cisteina-prote^i nases conhecidas e ambos os processos têm sido usados para preparar quimopapaina à escala industrial. No entanto, verificou-se que o material resultante tem uma actividade especifica relativamente baixa quando comparada com a da quimopapaina preparada por Buttle e Barrett (1984), Biochem, J. 223, 81-88, usando um processo* de várias etapas em pequena escala, incorporando inter alia um passo de cromatografia de permuta catiónica. Embora este material tivesse uma elevada actividade específica, ele foi obtido apenas com rendimentos muito baixos e o processo não é adequado para aplicação a uma escala comercial. Buttle et al.Biochem. J. (July 1989) 261, 469-476, verificaram agora que este material está contaminado -3- 70 912 WAF/CRF/P/271 coiti uma proteinase recentemente isolada e caracterizada, a papaia proteinase IV, que ê elulda conjuntamente com a quimopapaina das resinas de permuta catiénica. A cromatografia de permuta catióni-ca é incapaz de separar a quimopapaina da papaia proteinase IV njj ma extensão que pudesse ser útil na preparação de quimopapaina ejs sencialmente isenta de contaminação com papaia proteinase IV. A literatura também contém referências a métodos que utilizam passos de cromatografia de afinidade. Polgar (1981), Bio-chim. Biophys. Acta, 638, 262-269, descreve a purificação de qui-mopapaína, usando, entre várias outras técnicas, cromatografia de afinidade numa coluna de agarose-mercurial e Dubois et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler (1988), 369, 733-740, relataram a separação de cisteina-proteinases a partir de latex de Carica papaya usando u-ma técnica similar. Este tipo de cromatografia de afinidade asser^ ta na interacção entre ligandos de mercúrio ligados a uma matriz inerte e os grupos tiol das proteínas aí expostos. Assim, as proteínas diferentes da quimopapaina, particularmente outras cisteí-na-proteinases, tal como a papaia proteinase IV, podem ligar-se a essas colunas e podem, subsequentemente, ser conjuntamente eluí^ das com a quimopapaina.

Recentemente, alguns documentos científicos descreveram o uso de cromatografia de afinidade usando derivados de péptidos i-mobilizados para purificar proteinases específicos, tal como a catepsina B humana (Rich et àl. ,1986, Biochem. J. 233, 731-4) e histolisina de Entamoeba histolytica (Luaces & Barrett, 1988, Bi£ chem. J. 230, 903-909). Esta abordagem não foi até agora aplicada a procedimentos para a purificação de quimopapaina e permanece evidente a necessidade de um melhor processo para a purificação de quimopapaina, adequado para uso à escala industrial.

Os inventores conseguiram agora um novo processo para purificar e isolar quimopapaina muito activa, isenta de contaminan-tes e, em particular, isenta de outras cisteína-proteinase presejn tes no latex da papaeira, incluindo, a papaia proteinase IV. 0 presente invento proporciona quimopapaina que é substari cialmente pura e que contém uma proporção elevada da forma activa da enzima. 70 912 WAF/CRF/P/-271 -4-

A quimopapalna de acordo com o presente invento está subjs tancialmente isenta das proteinases diferentes imunologicamente encontradas no latex de papaeira, nomeádamente, a papalna, a papaia proteinase III (PPIII), ambas descritas por Buttle & Barrett (1984 ), Biochem. J., 223, 81-88, e, em particular a papaia protei^ nase IV (PPIV) recentemente descoberta.0 termo "substancialmente pura" como usado aqui pode portanto, ser melhor definido por "substancialmente pura do ponto de vista imunológico" e refere-se à ausência de qualquer reacção cruzada substancial entre a quimo-papaína de acordo com o invento e anticorpos específicos desenvol_ vidos contra PPIV pura, isolada e caracterizada por Buttle e Barrett (1984), loc cit. Deve notar-se, particularmente, que se verificou que a assim chamada quimopapalna "pura" preparada pelo método de Buttle e Barrett, contém quantidades substanciais (cerca de 14¾) de PPIV e deste modo a preparação de anticorpos anti-quimopapaína original mente desenvolvida por elas tem especificidja de tanto para a quimopapaína purificada de acordo com o invento como para a PPIV purificada. De preferência, a quimopapaína de a-cordo com o invento contém menos do que 1¾ em peso, mais preferivelmente, menos do que 0,2¾ e, com a máxima preferência, não mais do que 0,1¾ de cada uma das proteinases PPIV, PPIII e papaína. As preparações de anticorpo monoespecifico desenvolvidas contra a quimopapalna de acordo com o invento formam um outro aspecto do invento. A reacção cruzada entre o antigénio e o anticorpo pode ser determinada por técnicas convencionais bem conhecidas na arte. Estas técnicas incluem, por exemplo, imunoelectroforese "fused rocket" e imunodifusão dupla (descritas por Buttle e Barrett(1984), loc. cit. ), imunoensaio radial simples, radio-imunoensaio (RIA) e ensaio de imunosorvente ligado a enzima (ELISA). A quantidade de enzima activa presente em qualquer preparação de enzimas é geralmente indicada em termos da sua activida-de específica contra um substrato específico sob condições de ensaio específicos. A expressão "actividade especifica contra ΒΑΡΝΑ" como aqui usada, significa actividade de proteinase em picomole de £-nitroanilina formada por segundo por mg de peso seco do pro- -5- 70 912 WAF/C.RF/P/271 duto (pmol/seg/mg) quando ensaiada com o substrato sintético N-«--benzoil-DL-arginina £-nitroanilida (ΒΑΡΝΑ) sob condições de ensaio Standard. As condições de ensaio Standard usadas para as pre parações farmacêuticas de quimopapaína conhecidas são aqui descr_i tas em detalhe, posteriormente, sob "Método de Ensaio com ΒΑΡΝΑ N91" ou "ensaio de Smith" e as actividades especificas daí resultantes são referidas em termos de actividade específica contra ΒΑΡΝΑ (1 mM) a 37°C e pH 6,0. A quimopapaína de acordo com o invento é definida como tendo uma actividade específica contra ΒΑΡΝΑ (1 mM) a 37°C e pH 6,0 de, pelo menos, 730 unidades por mg. Geralmente, a quimopapaína de acordo com o invento tem uma activ£ dade específica contra ΒΑΡΝΑ (1 mM) de entre 800 e 1700 unidades por mg, preferivelmente de entre 1000 e 1700 unidades por mg, por exemplo 1200 a 1500 unidades por mg, quando ensaiada a 37°C e a pH 6,0. Num aspecto preferido, o invento proporciona quimopapaína possuindo uma actividade específica contra ΒΑΡΝΑ (1 mM) a 37°C e pH 6,0 de, pelo menos, 1300 unidades por mg.

Embora a actividade das proteinases esteja largamente definida na extensa literatura relativa a quimopapaína e outras ci£ teína-proteinases, em termos da libertação de £-nitroanilina de substracto sintético ΒΑΡΝΑ, podem-se encontrar problemas quando se faz uma comparação directa entre os valores da actividade esp£ cífica mencionados. Os valores precisos a que se chega dependem > de vários factores relacionados, em particular, com as condições precisas, por exemplo o pH, temperatura, composição tampão e concentração do substrato, usadas no ensaio. A quimopapaína preparada por Buttle e Barrett (1984), 1 oc. cit., de acordo com o seu d£ cumento, tinha uma actividade específica contra ΒΑΡΝΑ de 0,154 yumol/mh/mg que equivale a 2567 pmol/seg/mg. Contudo, as condições de ensaio usadas por Buttle e Barrett diferiam das usadas para os tipos farmacêuticos da quimopapaína e as actividades específicas não podem ser comparadas directamente.

Uma vez que se pensou que o material preparado por Buttle e Barrett era a preparação de quimopapaína possuindo a mais eleva da actividade específica até agora relatada, o trabalho inicial relativo ao presente invento foi realizado usando as condições de -6- 70 912 WAF/CRF./P/271 ensaio especificadas no seu documento. Este método é aqui referido por Método de ensaio com ΒΑΡΝΑ N92 e as actividades especificas dai resultantes são referidas em termos de actividade^^con^na ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) a 40°C e a pH 6,8 para tornar claro que as condições de ensaio diferem das usadas para preparações farmacêuticas de quimopapaina. Os resultados obtidos usando este ensaio verifi-cou-se serem duas a três vezes maiores do que as obtidas usando o Método de ensaio com ΒΑΡΝΑ, farmacêutico convencional, N21, embora seja cientificamente incorrecto aplicar um simples factor de conversão para converter resultados obtidos num método de ensaio nos de outro. No entanto, trabalho anterior relativo a este inveji to mostrou que a actividade específica contra ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) a 40°C e a pH 6,8 de quimopapaina pura de acordo com o invento pode ser definida como, pelo menos, 2500 unidades por mg, preferivelmente entre 3000 e 4500 unidades por mg, por exemplo 3500 e 4500 unidades por mg. Num aspecto preferido, o invento proporciona qui_ mopapaina possuindo uma actividade específica contra ΒΑΡΝΑ (2,5 mM), a 40°C e a pH 6,8 de, pelo menos, 3000 unidades por mg.

Os inventores do presente invento, em trabalho que foi re centemente publicado (Julho 1989, loc. cit) e que é aqui descrito resumidamente adiante, purificaram e caracterizaram um contaminar^ te, anteriormente desconhecido, da quimopapaina preparada pelos métodos da arte anterior, nomeadamente a papaia proteinase IV (PPIV). Embora a PPIV seja inactiva contra ΒΑΡΝΑ tem actividade como proteinase contra azocaseína. Além disso, verificou-se que a actividade da PPIV contra azocaseína não é substancialmente inib_i da por concentrações de cistatina de galinha até 1 juM. A activid_a de contra azocaseína da quimopapaina de acordo com o invento é i-nibida em, pelo menos 95% por estas concentrações de cistatina de galinha. A expressão "actividade contra azocaseína", como aqui u-sada, refere-se à actividade da proteinase em termos da quantidade de peptidos, solúveis em ácido t ri cl oroacé t i co , formados por jj nidade de tempo por unidade de peso seco do produto quando ensaia do com o substrato proteico, azocaseína, derivado sob as condições de ensaio Standard aqui descritas adiante. Preferivelmente, a quimopapaina de acordo com o invento tem uma actividade contra -7- 70 912 WAF/CRF/P/.271 azocaseina que é inibida, pelo menos, 97% mais, particularmente 98 a 100?í, por concentrações de cistatina de galinha de até 1 ^a-M.

Os requerentes creem que a quimopapaina de acordo com o presente invento é quimopapaina substancialmente pura preparada pela primeira vez sem proteínas contaminantes e contendo uma proporção elevada da forma activa da enzima. Este "puro" sé pôde ser conseguido a seguir à descoberta de que até agora se tinha purifi^ cado, conjuntamente com quimopapaina, uma proteína contaminante, por exemplo por colunas de permuta iónica e de afinidade conhecidas. Trabalho posterior conduziu ao isolamento e caracterização do contaminante como PPIV. 0 processo usado para preparar PPIV não foi aplicável à preparação de quimopapaina pura mas a preparja ção de PPIV proporcionou dois parâmetros importantes através dos quais se pôde caracterizar a quimopapaina pura, nomeadamente 1) a ausência de reactividade cruzada da quimopapaina pura com anticor_ pos específicos para PPIV e 2) a actividade diferencial de quimo-papaína pura e PPIV contra azocaseina na presença de cistatina de galina. Estas duas caracteristicas foram ferramentas essenciais requeridas para o desenvolvimento dos processos adequados para a purificação de quimopapaina. E facilmente evidente que a quimopapaina de acordo com o invento será a quimopapaina de eleição em quase todos os campos de actividade considerados. As preparações de enzima pura são de importância vital para os que tentam caracterizar completamente enzimas, por exemplo, em termos da sua especificidade catalítica e estrutura.

De acordo com o outro aspecto do presente invento, propoj: ciona-se uma composição que compreende quimopapaina de acordo com o invento, composição que está essencialmente isenta de PPIV. Pr£ ferivelmente, a quimopapaina tem uma actividade específica cpntra ΒΑΡΝΑ (1 mM) a 37°C e a pH 6,0 de, pelo menos, 730 unidades por mg. As composições podem estar na forma de unidades discretas de peso apropriado, por exemplo, na forma de quantidades alíquotas de quimopapaina encerrados sob condições anidras, como por exemplo, em frascos ou âmpolas submetidas a vácuo. Estas composições WAF/XRF/P/271 -R- podem ainda compreender um agente redutor tal como ditiotreitol base isenta de cisteina ou um seu sal de adição de ácido, para evitar, substancialmente, a inactivação da enzima por oxidação. Alternativa^ mente, as composições podem ainda compreender um inibidor reversível da cisteína-proteinase, fornecido na forma de um sal, tal como por exemplo, tetrationato de sódio ou cloreto mercúrico. Estes ini-bidores reversíveis bloqueiam o sítio activo da enzima, evitando, assim, a sua inactivação por oxidação, até serem deslocados por,por exemplo, um agente redutor que reactiva a enzima. Podem também ser adicionados, se se desejar, outros aditivos convencionais, por exem pio, conservantes tais como bissulfito de sódio, agentes quelantes tais como EDTA e portadores tais como cloreto de sódio. 0 uso de uma preparação de enzima pura é particularmente importante nas aplicações clínicas de quimopapaína por exemplo, na quimionucleólise, relativamente à qual, se tem referido que podem surgir reacções alérgicas a esses tratamentos num número de pacientes tratados tão elevado quanto 3%. 0 extracto de papaia em pó é largamente usado na indústria alimentar e pensa-se que muitas das reacções alérgicas à quimionucleólise são devidas b pré-sensibil_i zação com esses preparações. Contudo, sabe-se que a injecção de an-tigénios de proteína estranhos em mamíferos traz sempre consigo o risco de choque anafilático. Estará de acordo com a prática médica correcta usar a forma mais pura e mais activa de qualquer destas proteínas que esteja disponível, de modo a obterem-se os maiores be nefícios do procedimento, bem como a minimizarem-se os riscos de re acções alérgicas.

Assim, um aspecto preferido do invento proporciona uma com posição farmacêutica que compreende quimopapaína de acordo com o in vento, composição que está substancialmente isenta de PPIV. Preferi velmente, a quimopapaína tem uma actividade especifica contra ΒΑΡΝΑ (1 mM) a 37°C e a pH 6,0 de, pelo menos, 750 unidades por mg. As composições farmacêuticas compreendem ainda, preferivelmente, um a-gente redutor não tóxico, farmaceuticamente aceitável, tal como uma base isenta de cisteina ou um seu sal de adição de ácido, por exemplo, mono-hidrato de hidrocloreto de L-cisteina. Geralmente, o ager» te redutor está presente numa quantidade de cerca de 0,5 a 3mg por 4000 unidades de quimopapaína, constituindo por exemplo 15 a 90¾ em 70 912 WAF/CRF/P/271

-9- peso de quimopapaína. Contudo, as composições farmacêuticas de aco_r do com o invento podem ainda compreender qualquer diluente, excipi-ente ou portador convencional, farmacêuticamente aceitável, por e-xemplo, se desejado, podem ser adicionados conservantes tal como bissulfito de sódio, agentes quelantes tais como EDTA e portadores tais como cloreto de sódio.

As composições farmacêuticas contendo quimopapaína de acor do com o invento podem ser usadas em oftalmologia, por exemplo, no tratamento de lesões dos olhos ou para o desbridamento de tecidos com escaras, de, por exemplo, queimaduras, úlceras, necroses de pressão, úlcera de decúbito e outras feridas em que estejam presen tes tecidos desvitalizados. Estas composições são, geralmente, proporcionadas numa forma adequada para aplicação tópica, por exemplo, soluções estéreis, geles, suspensões ou unguentos que podem ser _a plicados directamente na ferida ou que podem ser aplicados com uma compressa impregnada com a composição.

Preferivelmente, a quimopapaína de acordo com o invento é formulada para uso ortopédico. Estas composições farmacêuticas podem ser, convenientemente, preparadas na forma de dosagem unitária para administração parentérica, por exemplo na forma de uma solução ou suspensão estéril, isenta de pirogénios, num portador adequado ou numa forma concentrada adequada para reconstituição antes da uti^ lização. As formas de unidade de dosagem adequadas para uso na dissolução ou tratamento do núcleo polposo de um disco intervertebral anormal ou danificado, por injecção nesse local, pode consistir em entre 500 e 5000 unidades ΒΑΡΝΑ (ensaiado com ΒΑΡΝΑ 1 mM a 37°C e a pH 6,0) de quimopapaína de acordo com o invento e num agente redutor tal como hidrocloreto de cisteínato de sódio embalado num frasco submetido a vácuo. Uma forma de unidade de dosagem preferida com preende nominalmente 2000 ou 4000 unidades ΒΑΡΝΑ (ΒΑΡΝΑ 1 mM, 37°C, pH 6,0) de quimopapaína. Uma forma de unidade de dosagem pode consistir, mais alargadamente, em, por exemplo, 2 a 5 mg, preferivelmente 2,5 a 3,5 mg de quimopapaína e 0,2 a 3 mg, preferivelmente, 1,0 a 2,0 mg de hidrocloreto de cisteínato de sódio embalado num re cipiente submetido a vácuo, opcionalmente, em mistura com um portador adequado tal como cloreto de sódio. -10- 70 912 WAF/CRF/P/2.71

Em experiências aqui descritas adiante, verificou-se que 26 amostras de soro individual tinham anticorpos IgE adquiridos n_a turalmente contra uma preparação de quimopapaína disponível comer-

crito na GB 2098997 . Foi aqui demonstrado experimentalmente que e_s tes soros contêm anticorpos IgE contra quimopapaína de acordo com o invento e contra três outras cisteína-proteinases encontradas no látex da papaieira, nomeadamente, a papaína, PPIII e PPIV. Contudo, os níveis médios de IgE contra a quimopapaína, PPIII e PPIV mostrji ram que a PPIII e a PPIV, em conjunto, representavem quase 75% da IgE detectada. Estes resultados indicam claramente que estas proteínas têm um carácter substancialmente imunogénico e podem representar a proporção principal dos determinantes antigénicos contidos nas formas de quimopapaína até agora disponíveis e apresentam um risco de potencial antigénico surpreendentemente amplo. As composições farmacêuticas do invento têm^vantagens substanciais relativa-mente às composições da arte anterior. 0 presente invento refere-se também a um método de tratamento por, quimionucleólise, de um disco espinal intervertebral, de mamífero, danificado, com hérnia ou anormal, o qual compreende in-jectar no referido disco uma solução farmacêuticamente aceitável de quimopapaína de acordo com o invento, numa quantidade suficiente p£ ra dissolver, selectivamente, porções do referido disco. 0 invento refere-se ainda a um método de tratamento de um disco espinal de mamífero num sujeito mamífero, o qual compreende: i) inserir uma agulha no referido disco; ii) confirmar a colocação da referida agulha por meio de raios X; e iii) injectar no referido disco, uma solução farmacêuticamen te aceitável de quimopapaína de acordo com o invento, numa quantida de suficiente para dissolver, selectivamente, porções do referido disco. 0 presente invento proporciona também um processo para purificar quimopapaína, o qual compreende: a) incubação de uma solução aquosa de quimopapaína em bru-

70 912 WAF/CRF/P/2.71 -11- to com uma matriz de cromatografia de afinidade dirigida ao sítio activo, compreendendo uma matriz de suporte acoplada covalentemente, opcionalmente, por meio de um braço espaçador, ao terminal N de um péptido inibitório de quimopapaína, reversível, de tal modo que o referido péptido se ligue ao sítio activo de uma molécula de qui^ mopapaína; e b) eluição da quimopapaína com um eluente adequado. A quimopapaína em bruto usada como material de partida para a purificação da quimopapaína de acordo com o invento pode ser ) um extracto de látex fresco de papaieira, uma solução obtida a par» tir de uma preparação disponível comercialmente de látex seco por aspersão, concentrado de papaína ou quimopapaína parcialmente purifi^ cada ou pode ser uma solução de uma preparação comercial da assim chamada quimopapaína "pura". Contudo, os peritos na arte deverão ter em consideração que os extractos de papaieira relativamente completos tal como o látex de papaieira conterão quantidades muito substar» ciais de outros componentes de ocorrência natural que é desejável r^ mover. Preferivelmente, uma proporção substancial desses componentes é removida antes da solução de quimopapaína em bruto ser incubada com a matriz de cromatografia de afinidade, por exemplo, por filtração ou centrifugação, para remover o material insolúvel. Contudo, vjs rificámos que um passo de precipitação ácida, durante o qual uma fracção substancial das impurezas é precipitada, é particularmente vantajuso.

Os procedimentos de precipitação ácida, nos quais o pH de jj ma solução aquosa de quimopapaína em bruto é reduzido até um valor tão baixo quanto pH 2, deixada repousar e em seguida a solução de quimopapaína se separa, têm sido usados para purificar quimopapaína desde há cerca de 50 anos. Surpreendentemente, a requerente mostrou agora que o pH preciso usado nestes procedimentos influencia decisivamente a contaminação da solução de quimopapaína resultante com PPIV. Verificou-se que a monitorização e controlo deste procedimento, que até agora.se pensou ser um passo preliminar incipiente na purif_i cação da quimopapaína, reduz drasticamente a contaminação com PPIV, a proteína a qual se verificou, agora, ser purificada conjuntamente -12- 70 912 WAF/CR.F/P/271 com a quimopapalna, usando técnicas convencionais. Assim, o invento proporciona um processo para purificar quimopapaína, o qual compreende : 1. a precipitação de uma mistura aquosa contendo quimopa-paina em bruto a um pH inferior a 2,0; 2. separação de uma solução aquosa de quimopapalna em bruto, da referida mistura; e 3. neutralização e,opcionalmente, dessalificação da referida solução de quimopapalna em bruto.

Prefere-se remover da preparação quaisquer contaminantes proteicos remanescentes incluindo, pelo menos, um passo de cromato-grafia de permuta catiónica convencional durante o processo de p u r_i ficação, por exemplo, como descrito por Buttle e Barrett,1984, loc. ci t. E particularmente preferido empregar, como passo final, cromatc> grafia de elevada precisão, por exemplo FPLC numa resina de permuta catiónica tal como a vendida sob os nomes comerciais Mono-S ou S-Sepharose^ HP (Pharmacia).

Um aspecto particularmente preferido do invento proporciona um processo para purificar quimopapalna, o qual compreende: i) a precipitação ácida de uma mistura aquosa contendo quim£ papaína em bruto, preferivelmente a um pH inferior a 2,0; ii) a separação de uma solução aquosa de quimopapalna em bruto, a partir da referida mistura; iii) a neutralização e, opcionalmente, a dessalificação da ref£ rida solução de quimopapalna em bruto; iv) a incubação da solução obtida do passo (iii) com uma matriz de cromatografia de afinidade dirigida ao sitio acti-vo, compreendendo uma matriz de suporte acoplada covalent£ mente, opcionalmente por meio de um braço espaçador, ao terminal N de um péptido inibitório de quimopapalna, rever slvel, de tal modo que o referido péptido se ligue ao sitio activo de uma molécula de quimopapalna; e v) a eluição da quimopapalna com um eluente adequado. 70 912 WAF/CRF/P/271

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Será evidente para um perito que o passo de cromatografia de permuta catiónica, preferido, pode ser empregue, alternativa ou adicionalmente antes ou depois do passo de cromatografia de afinidade, como se desejar. A mistura aquosa contendo a quimopapalna em bruto pode compreender, por exemplo, látex fresco de papaieira, látex de pap_a ieira seco por aspersão ou concentrado de papaína (por exemplo látex seco por aspersão disponível comercialmente em Powell & Schole field, RU ou em Siebels, EUA) suspensos em água ou num tampão aqujD so tal como tampão de fosfato ou acetato. Preferivelmente, o material insolúvel é removido de uma maneira convencional, por exemplo, por filtração ou centrifugação, antes da precipitação ácida da miís tura. A mistura pode ser acidificada por adição gradual de ácido orgânico ou inorgânico, preferivelmente um ácido inorgânico aquoso tal como ácido clorídrico, para reduzir o pH da mistura até um valor entre 1,0 e 2,0, preferivelmente, entre 1,2 e 1,8, mais particularmente a um pH de cerca de 1,5. 0 material precipitado pode ser removido de uma maneira convencional, por exemplo, por filtração ou centrifugação. A solução ácida de quimopapaina em bruto,resultante, mostrou estar esgotada em PPIV, papaína e, em menor extensão, em PPI11 .

Antes de sujeitar a solução ácida de quimopapaina em bruto a mais quaisquer passos de cromatografia, os peritos na arte t^ rão em conta a necessidade de neutralizar a solução com um reagente alcalino tal como hidróxido de sódio aquoso e preferivelmente de remover, da solução os sais em excesso, de uma maneira convenc_i onal, por exemplo, por filtração em gel ou diálise. Qualquer outro material precipitado pode ser removido por filtração ou centrifug£ ção. E bem sabido, na arte das cisteína-proteinases, que a actividade destas enzimas pode ser consideravelmente aumentada por activação com um agente redutor tal como ditiotreitol ou cisteína e pela remoção de vestígios de metais pesados tais como de mercú rio, com um agente quelante tal como EDTA ou uma resina quelante tal como a vendida sob o nome comercial Chelex (Bio-Rad, RU). Estas medidas optimizam a presença de grupos tiol livres, os quais se sabe serem caracteristicas essenciais dos sítios activos das -14- -14- 70 912 WAF/CRF/P/271 - císteína-proteinases, e são necessárias para a actividade. Alternativamente, quando se emprega um passo de cromatografia de permuta catiónica, os metais pesados podem ser removidos por activação da quimopapaina com um agente redutor enquanto este está ligado à coljj na de permuta catiónica e subsequente lavagem da coluna.

Vantajosamente, a solução de quimopapaina em bruto obtida após neutralização é tratada com um agente redutor tal como cisteí-na, para assegurar a exposição máxima dos sítios activos, e diluída até um teor em proteína adequado, por exemplo 30 mg/ml. A solução de quimopapaina em bruto neutralizada é, então, incubada com uma rna triz de cromatografia de afinidade dirigida a sítios activos, de tal modo que a quimopapaina se ligue especi ficamente, através do sí^ tio activo, a um péptido inibitório ligado ã matriz. A solução de quimopapaina pode ser aplicada a uma coluna de matriz de cromatogrjj fia de afinidade a uma taxa de, por exemplo, 35-40 ml/h/cm . Podem ser ligados, aproximadamente 1-4 g de quimopapaina por litro de matriz de cromatografia de afinidade. A matriz de cromatografia de afinidade compreende uma matriz de suporte, tal como uma matriz de gel ou membrana, à qual um péptido inibitório é covalentemente acoplado e assim imobilizado. Preferivelmente, a matriz de suporte é um gel de agarose tal como os vendidos sob o nome comercial Sepharose (Pharmacia), embora tam bém se possam utilizar matrizes de membrana celulósica derivada tais como as vendidas sob o nome comercial Zeta (Anachem). 0 terminal N do péptido pode ser ligado ã matriz de suporte quer directa-mente quer indirectamente, através de um braço espaçador, por exejm pio um braço espaçador de nove átomos de carbono tal como o proporcionado por uma matriz de gel preferida, vendida sob o nome comerei al ECH Sepharose 4B (Pharmacia). 0 acoplamento entre os grupos car boxi livres desta matriz de gel e os grupos amino livres do péptido inibitório, resultando na formação da ligação do péptido pode ser conseguido de maneira convencional, por exemplo, por condensação ca talisada por ácido promovida com uma carbodiimida solúvel em água tal como hidrocloreto de N-etil-N ' -( 3-dimetilaminopropi 1 )carbodiitni da (EDC). Geralmente, o acoplamento é conseguido agitando suavemente em conjunto, a matriz de gel e uma solução de péptido inibitório, -15- -15- 70 912 WAF/CRF/P/2-71 ¢/- na presença de EDO, por exemplo, à temperatura ambiente durante 24 horas. Uma razão de acoplamento adequada entre péptido e matriz de gel é de, por exemplo, 3-4 g de péptido por litro de gel. A matriz de cromatografia de afinidade pode ser previamen te empacotada numa coluna antes da utilização. Contudo, quando a matriz de cromatografia usada é uma matriz de gel, também é possível utilizar um passo de incubação do tipo descontínuo e depois,se se desejar, empacotar a matriz numa coluna para eluiminação subsequente da enzima. Preferivelmente, a matriz é bem lavada com tampão aquoso antes da utilização, para remover vestígios do péptido não ligado e do catalisador de condensação. Para uso na produção, a coluna de matriz de cromatografia de afinidade deverá, preferivelmente, sofrer saneamento, ijn situ, por exemplo com etanol aquoso, para ser, assim, reutilizável.

Os péptidos inibitórios de quimopapaína, reversíveis, são péptidos que, quando imobilizados numa matriz de suporte, são capa^ zes de se ligar ao sítio activo da quimopapaína mais fortemente do que aos sítios activos de outras cisteína-proteinases em preparações de quimopapaína, particularmente, PPIV, mas que podem, subsequentemente, ser deslocados da matriz. Num grupo preferido de péptidos inibitórios, o aminoácido do terminal C compreende um derivado de aldeído tal como semicarbazona, metoxi-imina ou oxima de fje nilalanina ou um análogo de fenilalanina. Mais particularmente, o aminoácido do terminal C pode ser um derivado de fenilalanina tal como D ou L-fenilalanina semicarbazona (PheSc), metoxi-imina (PheMo) ou oxima (PheOx) ou um derivado de análogo de fenilalanina tal como D ou L-alanina semicarbazona (AlaSc), D ou L-ciclo-hexilalanina semicarbazona (ChaSc) ou D ou L-leucina semicarbazona (LeuSc). Verificou-se que os seguintes dipéptidos do terminal C são péptidos inibitórios de quimopapaína vantajosos, nomeadamente, L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L-Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-AIa-L-ChaSc e L-Ala-L-LeuSc. 0 dipéptido L-Phe-L-PheSc foi descrito por Luaces e Barrett (1988), 250, 903-909. Péptidos particularmente preferidos são dipéptidos, especialmente, L-Ala-L-PheSc, L-AIa-D-PheSc e L-Phe-D-PheSc. Os novos péptidos inibitórios per se e as novas ma- 70 912 WAF/CRF/P/271

-16- «* * trizes de cromatografia de afinidade contendo estes péptidos formam aspectos adicionais do presente invento.

Antes da eluição da quimopapalna, a partir da matriz de cromatografia de afinidade é preferível lavar a matriz para remover material não ligado especificamente, por exemplo, com um tampão aquoso tal como tampão de citrato ou de acetato de pH 4 a 5. Verif_i cou-se ser particularmente vantajoso adicionar reagentes ao tampão de lavagem e ao tampão de eluição que reduzem as interacções hidrofj5 bicas e outras reacções de ligação não específica entre a matriz e os componentes de quimopapalna em bruto. Estes, reagentes incluem, por exemplo, EDTA, isopropanol e etanodiol. A quimopapalna pode então ser eluida da matriz com um elu-ente adequado. Os eluentes adequados rompem a ligação entre o pé-ptido inibitório imobilizado e a quimopapalna ligada, quer por redjj ção da afinidade do sítio activo pelo péptido inibitório, quer por deslocação selectiva do péptido do sítio activo. A afinidade da qu_i mopapaína pelo péptido inibitório pode ser reduzida, por exemplo, por alteração das características do sítio activo com um agente dejs naturante, tal como isopropanol ou com um eluente possuindo um pH acima ou abaixo da gama de pH activo de quimopapalna. Contudo, os peritos na arte deverão ter em consideração que estes eluentes devem ser tais que a inactivação irreversível da enzima eluida não ocorra. Alternativamente, a quimopapalna pode ser deslocada, se-lectivamente do péptido inibitório imobilizado por um eluente compreendendo um excesso de um componente que se ligue fortemente ao péptido inibitório, por exemplo, outra cisteína-proteinase.

Contudo, num aspecto preferido do presente invento, o eluente compreende um inibidor reversível de cisteína-proteinases que se ligue competitivamente ao sítio activo da quimopapalna e assim a desloque do péptido inibitório imobilizado. Os inibidores convenci^ nais incluem, por exemplo, dissulfetos de peso molecular baixo, tal como 2,2'-dipiridildissulfet o, hidroxieti1dissulfeto, metil-2-piri-di1dissulfet o e tetrationato de sódio e reagentes mercuriais tal c£ mo cloreto mercúrico £-cloromercuribenzoato e mersalilo. Os peritos na arte deverão ter, em consideração que a afinidade entre quimopapalna e o péptido inibitório imobilizado diferirá de acordo com o -17- 70 912 WAF/CRF/P/271 péptido particular usado, o pH, a força iónica e a composição do tampão de eluição e a temperatura empregue. Assim, a natureza e concentração precisas do inibidor de proteinase requeridas para eluir a quimopapaína também variarão. Além disso, os reagentes mercuriais equilibram-se, geralmente, com a quimopapaína ligada, mais rapidamente do que os reagentes dissulfeto e pode-se empregar a eluição contínua com estes inibidores. Os inibidores que sd se equilibram lentamente com a quimopapaína ligada podem necessitar de incubação da matriz com o inibidor, por exemplo, durante um periodo de 1-2 horas ou mais, antes da eluição da quimc) papaína. Contudo, o teor em proteínas e actividade da proteinase das fracções eluídas podem ser monitorizadas, rotineiramente, e a força iónica ou natureza do eluente e o tempo de incubação da matriz com o inibidor podem ser variados, de modo a deslocarem, efectiva e selectivamente, a quimopapaína, da matriz. As fracções eluidas contendo pequenas quantidades de proteína e níveis baixos de actividade de quimopapaína podem ser rejeitadas.

Preferivelmente, o pH do eluente é suficientemente baixo para enfraquecer a interacção entre a quimopapaína e o pépti-do inibitório, por exemplo pH 4 a 5, mais particularmente pH 4,5. Tem-se verificado que os elementos adequados incluem, por exemplo, hidroxietildissulfeto (100 mM) em etanodiol aquoso (33%) contendo citrato de sódio (50 mM) e EOTA (1 mM), pH 4,5; dipir idildissul fe^ to (30 mM) em etanodiol aquoso (33%) contendo citrato de sódio (50 mM) e EDTA (1 mM), pH 4,5; meti 1 pi ridi1dissulfeto (30 mM) em etanodiol aquoso (33%) contendo citrato de sódio (50 mM) e EDTA (1 mM), pH 4,5; ácido mersalílico (10 mM) em etanodiol aquoso (33¾) contendo hidróxido de sódio (50 mM) e EDTA (25 mM), ajustado a pH 4,5 com ácido acético; e cloreto mercúrico (10 mM) em etá nodiol aquoso (33%) contendo acetato de sódio (50 mM), pH 4,5. 0 cJoreto mercúrico é um inibidor reversível das cisteína-protelna-ses, particularmente preferido. 0 passo de cromatografia de afinidade, no processo prefe^ rido de acordo com o invento, aumenta apreciavelmente a actividade específica da quimopapaína assim purificada, medida em termos de actividade contra ΒΑΡΝΑ ou por titulação de sítios activos com 70 912 WAF/CRF/P/271

E-64 ou ácido iodoacético. A forma activa da quimopapaina é, prefe^ rencialmente, ligada e eluida e é, assim, distinguida das formas inactivas da quimopapaina e de algumas outras cisteína-proteinases presentes na preparação em bruto. A quimopapaina preparada de fre_s co, de acordo com a invenção, purificada por cromatografia de afinidade contém, geralmente, pelo menos 70?í, preferivelmente, pelo menos, 80¾ mais particularmente pelo menos 90¾ de enzima activa.

Geralmente, a quimopapaina purificada é recuperada do e-luido, antes do armazenamento ou utilização. Preferivelmente, a quimopapaina eluida é ainda purificada para deslocar o inibidor de cisteína-proteinase do sitio activo da enzima. 0 inibidor pode ser deslocado por adição de um excesso de agente redutor, tal como cij> teina e, opcionalmente, se se desejar, pode-se remover o inibidor deslocado, usando técnicas convencionais, tais como filtração em gel ou diálise. Alternativamente, o inibidor pode ser removido por adsorção numa resina especifica, por exemplo, os dissulfetos de baixo peso molecular podem ser adsorvidos numa coluna de afinidade de glutationa e os reagentes mercuriais podem ser adsorvidos numa resina quelante. Preferivelmente, o inibidor é removido por activja ção da enzima com um agente redutor, tal como cisteina, quando ele está ligado a uma coluna de permuta catiónica, e subsequente lavagem do inibidor da coluna. A quimopapaina purificada recuperada é preferivelmente liofilizada antes do armazenamento, por exemplo, por criodessecação. A quimopapaina de acordo com o presente invento pode ser ainda caracterizada por métodos conhecidos dos peritos na arte. Ejs tes métodos incluem, por exemplo, análise de aminoácidos N-termi- nais, titulação de sítio activo com E-64 ou ácido iodoacético e ta com ~ xas de inactivação com eles, electroforese/dodecil sulfato de sódi^ o ou gel de poliacrilamidajcatódica multizonal e actividade contra diferentes substractos de proteinase.

Os novos péptidos inibitórios de acordo com o invento podem ser preparados de uma maneira análoga aos métodos conhecidas na arte. Por exemplo, os derivados dipéptido podem ser sintetizados numa série de etapas, como se segue: a) 0 terminal C do aminoácido que se pretende que forme o

70 912 WAF/CRF/P/2.71 -19- terminal C do péptido inibitório (o primeiro aminoácido) pode ser protegido, por exemplo, por reacção com hidrocloreto de 0,N-dime-ti1-hidroxilamina, na presença de cloroformato de isobutilo e N--metilmorfolina, para dar um derivado de dimetil-hidroxiamida.Pre ferivelmente, o terminal N do primeiro aminoácido é, inicialmente, protegido com, por exemplo, butoxicarboniloterciário. b) 0 primeiro aminoácido protegido, por exemplo, um der_i vado de dimetil-hidroxiamida pode então ser feito reagir com um & eido forte, por exemplo, ácido trifluoroacético, para formar um sal de amónio quaternário. c) 0 sal.de amónio quaternário do primeiro aminoácido protegido pode então ser feito reagir com um segundo derivado de aminoácido, por exemplo um derivado N-carbobenzoxi, para formar um derivado dipéptido. d) 0 derivado dipéptido formado acima pode ser reduzido com um agente redutor moderado, por exemplo, hidreto de di-isobu-tilalumlnio ou tetra-hidretoaluminato de lítio, para produzir um grupo aldeído livre na extremidade do terminal C do dipéptido. e) 0 aldeído formado acima pode produzir derivados, por exemplo, uma semicarbazona, por reacção com semicarbazida, uma m£ toxi-imina, por reacção com hidrocloreto de metoxiamina ou uma oxi^ ma, por reacção com hidroxilamina. f) Finalmente, o terminal N protegido pode ser desprotje gido, por exemplo, um grupo N-carbobenzoxi pode ser removido por redução catalítica usando 10¾ de paládio sobre carvão.

DESCRIÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS

Quando possível, a concentração das proteínas foi determinada por ^200 usar,d° ^280 1?' = para preparações de látex de papaieira e 1¾ = 1®»·* Para preparações de quimopapaína purificada ou parcialmente purificada (Robinson, 1975, Biochemis-try 1_4, 3695-3700). Alguns reagentes contendo tiol e dissulfetos -20- 70 912 WAF/CRF/P/271 têm tendência para absorver a 2Θ0 nm. Quando estes estavam presentes, usou-se o ensaio de ligação com corante Bio-Rad (Bio-Rad Lab£ ratories, R.U.) para determinar a concentração das proteínas. Usaram-se, como padrão, soluções de látex de papaieira seco por a s p e_r são, filtradas (Aoon . 0, = 20,0). Este método é menos propenso a L O U y 1/0 interferências do que o ^gg. Nas preparações de enzima purificadas, a proteína foi estimada por peso seco total do produto.

DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DA QUIM0PAPA1NA a) Actividade contra BPNA (Método de Ensaio N91 ) - Ensaio de Smith

Adicionou-se cada amostra a "Tampão 1", tampão aquoso de fosfato de sódio (0,1 M), pH 6,0 contendo EDTA (1 mM) e mono-hidrji to de hidrocloreto de cisteína (10 mM), até um volume final de 1,0 ml. A enzima (quando presente na amostra) foi deixada activar durante 5 minutos a 37°C, antes da reacção se ter iniciado pela adição de 4 ml de soliJ ção de substrato N-c*-benzoil-DL-arginina p-nitroanilida (ΒΑΡΝΑ) (1,25 mM) que tinha sido previamente aquecida a 37°C. N. B. A solução de substrato foi preparada dissolvendo 300 mg de ΒΑΡΝΑ em dimetilsulfóxido quente, adicionando a solução lentamente a 450 ml de tampão 1 previamente aquecido a 37°C e depois perfazendo 500 ml com mais tampão 1. A solução de substrato foi mantida a uma temperatura superior a 30°C para evitar a precipitação de ΒΑΡΝΑ. A incubação a 37°C foi continuada durante 30 minutos e d_e pois a reacção foi interrompida pela adição de 1 ml de ácido acéti_ co (4 N). A 4-rlitroanil ina libertada foi determinada por medição de ΔΑ.,_. Uma unidade de actividade corresponde à libertação*de 1 -1 -1 picomole de 4-nitroanilina (ε = 8B00 M .cm ) por segundo sob ej> tas condições.

Estas condições de ensaio correspondem às referidas na GB 2098997 depositada em nome de Smith Laboratories Inc. e são usji das para ensaiar preparações farmacêuticas de quimopapaína vendida -21- * 70 912 WAF/CRF/P/271 pelo mundo fora, por exemplo, a quimopapalna vendida sob o nome co mercial Chymodiactin pela The Boots Company PLC, R.U. e quimopapal^ na vendida sob o nome comercial Disken por Sinpoong na Coreia do Sul. Estas unidades de actividade são internacionalmente reconheci das e são comummente designadas por "Smith ΒΑΡΝΑ Assay Units" (U-nidades de ensaio ΒΑΡΝΑ de Smith). b) Actividade contra ΒΑΡΝΑ (Método de Ensaio N92)

Adicionou-se cada amostra a tampão aquoso de fosfato de sódio (0,10 M), pH 6,8, contendo EDTA (1 mM) e ditiotreitol (2 mM) ou cisteína (4 mM) até um volume final de 0,975 ml. A enzima (quari do presente na amostra) foi deixada activar durante 5 minutos a 40°C antes da reacção ter sido iniciada pela adição de 25 j* 1 de N--ctf-benzoil-DL-arginina £-nitroanilida (ΒΑΡΝΑ) (100 mM) em dimetil-sulfóxido. A incubação a 40°C foi continuada durante 10 minutos e depois a reacção foi interrompida pela adição de 1 ml de tampão a-quoso, cloroacetato de sódio (0,10 M)/acetato de sódio (0,20 M), pH 4,3. A 4-nitroanilina libertada foi determinada por medição de ^410' ^ma unidade de actividade corresponde à libertação de 1 pi-comole de 4-nitroanilina (é = 8800 M-^.cm-'1) por segundo, sob es tas condições.

Estas condições de ensaio correspondem exactamente às dejs critas por Buttle & Barrett (1984), loc. cit. e foram usadas em e^ periências preliminares descritas nos Exemplos 21, 23 e 26.

Os valores absolutos obtidos para a actividade de quimopa paina usando os Métodos de ensaio de ΒΑΡΝΑ N^s 1 e 2 diferem, sendo os valores obtidos usando o Método NS2, aproximadamente duas a três vezes mais elevados do que os valores obtidos usando o Método N91 (Ver Exemplo 31). c) Titulação de sitio activo com ácido iodoacético A titulação de sítio activo de quimopapaína com ácido iodoacético foi realizada de uma maneira análoga ò titulação de sítio activo com E-64 descrita por Zucker et ai em Biochem. Biophys. Acta 828

70 912 WAF/CRF/P/271 -22- (1985), 196-204. A solução de quimopapaína foi diluida em tampão 1 como descrito em (a), acima, para dar uma solução contendo 60 /*M / 4-1-1 de proteína (£280 = 4,3284 χ 10 M cm , calculado a partir de ^280 l°í = 1®»^» Robinson (1975 ), loc. cit e PM = 23656, calculado a partir da sequência de aminoácidos de Jacquet et al. (Maio 1989), Biol. Chem. Hoppe-Sey1er, 370, 425-434). Colocaram-se porções ali-quotas de 20 ji. 1 de solução de quimopapaína em tubos de titulação e incubaram-se durante 5 minutos a 37°C com 20 ^1 de tampão 1 (40 /Q em controlo). Adicionaram-se 20 >1 de ácido iodoacético aquoso (10, 20, 30, 40, 50 e 60 jaM , respectivamente) a cada tubo de titulação e a mistura foi pré incubada durante 10-20 minutos a 37°C. A reac-ção foi iniciada pela adição de 4 ml de solução de substrato ΒΑΡΝΑ como descrito em (a) acima, que tinha sido previamente aquecida a 37°C. A incubação foi continuada a 37°C e a reacção foi interrompida após 30 minutos como descrito em (a), acima, e a 4-ni-troanilina libertada foi determinada por ^A^g. A concentração molar de quimopapaína activa assim obtida foi comparada com a conceri tração molar de proteína, com base num coeficiente de extinção mo- 4 -1 -1 lar de 4,3284 x 10 M cm para quimopapaína. A quantidade de pr£ teína activa foi então expressa como percentagem da proteína total. d) Actividade contra azocaseína A actividade contra azocaseína foi determinada pelo método descrito anteriormente por Rowan et al., (1988), Arch. Biochem. Biophys. 267, 262-270 usando menos do que 1 p\A de enzima (com base num peso molecular de 24000) e, quando desejado, 1 aM de cistatina de galinha. Todas as concentrações de enzimas e inibidor referem--se à concentração das moléculas activas. ENSAIO IMUN0L0GIC0 POR IMUNODIFUSAO RADIAL SIMPLES.

Os ensaios da imunodifusão radial simples basearam-se no método de Mancini et al., 1965, Immunochem 2, 235-254, como se segue. Deitou-se agarose (l?ó p/v) em fosfato de sódio aquoso (10 mM) contendo NaCl (0,14 M), pH.7,3 contendo uma preparação de IgG mono

R -especifica, num Gel Bond (FMC Corporation, Maine, EUA) e cortou-

70 912 WAF/CRF/P/271 -23- -se um tabuleiro rectangular com alvéolos (r = 1 mm) distanciados de 1,5 cm. As amostras de referência e as desconhecidas foram di£ tribuidas aleatoriamente nos alvéolos, para minimizar erros devidos aos efeitos franja. Após a aplicação de antigénio aos alvéolos, as placas foram deixadas repousar durante 24 horas para que os a-néis de precipitina se desenvolvessem. Estes foram depois lavados, secos e corados. Usou-se antigénio puro, moderadamente carboxime-tilado, para gerar curvas padrão, as quais foram representadas sob a forma de antigénio versus quadrado do diâmetro do anel. A gama útil do ensaio foi de 25-300 ng de antigénio por alvéolo.

PREPARAÇÃO DE PPIV E DE SEUS ANTICORPOS a) Preparação da coluna de afinidade

Adicionou-se éster butiloxicarbonil-L-Phe-£-nitrofeníli-co (10 mmol ) a uma mistura agitada de «X-Nh^CH^CN .HC1 (20 mmol) e di-isopropiletilamina (20 mmol) em dimetil f ormamida (20 ml). A mi£ tura foi agitada a 20°C durante .2 horas e depois diluída com acet£ to de etilo (100 ml), lavada com água (2 x), trietilamina aquosa (5 x), água (3 x), bissulfato de potássio aquoso (2 x), água (3 x), seca e evaporada. 0 resíduo foi cristalizado em acetato de etilo: hexano para dar Boc-L-Phe-NHCh^CN, p.f. 134,5-135°C.

Adicionou-se ácido trifluoroacético aquoso, gelado, (10 ml) a uma solução de Boc-L-Phe-NHCh^CN (5 mmol) em diclorometano (10 ml). A mistura reaccional foi incubada a 20°C durante 30 min£ tos e depois o solvente foi removido por evaporação a 40°C. 0 resíduo foi dissolvido em clorofórmio evaporado e o procedimento foi repetido mais duas vezes. 0 sal de trifluoroacetato em bruto, resultante, foi dissolvido numa solução de di-isopropiletilamina (7,5 mmol) em dimetilformamida (100 ml) e adicionaram-se éstet Boc-Gly-£-nitrofenílico (6,25 mmol) e mono-hidrato de N-hidroxi-benzotriazolo (6,25 mmol). Adicionou-se então, gota a gota, di-isopropiletilamina suficiente para gerar £-nitrofenol (cor dourada) e a mistura foi agitada ã temperatura ambiente durante 2 horas. Adicionou-se N,N-dieti1eti1enodiamina (1,5 ml) seguida, após 15 minutos por acetato de etilo (60 ml) e a mistura foi lavada -24- -24- 70 912 WAF/CRF/P/271 — com água, trietilamina aquosa, água, bissulfato de potássio aquoso, água, seca e evaporada. 0 resíduo foi purificado por cromatografia em sílica e eluido com acetato de etilo: hexano (20:1) para originar Boc-Gly-L-Phe-NHC^CN na forma de uma espuma.

Dissolveu-se Boc-Gly-L-Phe-NHCh^CN (30 mg) em ácido tri-fluoroacético : diclorometano : anisolo (25:65:10, 1 ml) e incubou--se a 0°C durante 30 minutos. A mistura foi seca por evaporação rotativa a 34°C e o resíduo foi dissolvido em metanol (1,5 ml) e NaHCO^ aquoso (0,1 M, pH 8,0, 1,5 ml) para dar a solução de ligando .

D

Hidratou-se CH-Sepharose 4B activada (Pharmacia); peso se co de 3g), durante a noite, em ácido clorídrico aquoso (1 mM,75 ml) a 4°C e depois lavou-se com ácido clorídrico (1 mM, 600 ml), seguido por NaHCOj aquoso (0,1 M, pH 8,0, 300 ml). 0 gel foi suspendido em NaHCO^ aquoso (0,1 M, pH 8,0, 30 ml), adicionou-se a solução de ligando (anterior) e a mistura foi agitada suavemente durante a noite a 20°C. 0 gel foi recolhido num filtro de vidro sinterizado, lavado com metanol aquoso (50S v/v, 180 ml) e depois com água (180 ml) e suspendido em etanolamina aquosa (0,1 M, 30 ml) e o pH foi ji justado a 9,0 com ácido clorídrico. A suspensão foi sacudida dura£ te 4 horas a 20°C e em seguida o gel foi recolhido, lavado com á-gua (500 ml) e armazenado em tampão de "aplicação" (fosfato de sódio (50 mM); EDTA (1 mM); etanodiol (33«), pH 6,8) a 4°C.

b) Purificação de PPIV p

Lavou-se uma coluna (volume do leito 4 ml) de Sepharose --Ahx-Gly-L-Phe-NHCH2CN, com tampão de "eluição" (citrato de sódio (50 mM); etanodiol (33¾), pH 4,5; 12 ml) e depois com tampão de a-plicação (ver acima, 12 ml). •

Dissolveu-se látex de papaieira seco por aspersão (0,5 g) em tampão de aplicação (10 ml) e filtrou-se (poro de 0,22 y^m). A concentração da proteína do filtrado foi determinada usando o ensaio de ligação a corante Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, RU). Adicionou-se ditiotreitol à mistura, até uma concentração final de 2 mM e a mistura foi incubada a 0°C durante 20 minutos. 80 mg da

70 912 WAF/CRF/P/271 2 proteína do látex foram aplicados à coluna (38 ml/hora/crri ) a 20°C, seguidos de tampão de aplicação (8 ml) e depois de tampão de elui-ção (8 ml). Aplicou-se então tampão de eluição (4 ml) contendo hi-droxietildissulfeto (50 mM), o fluxo foi interrompido e a coluna foi deixada repousar durante a noite a 20°C. A eluição com tampão de eluição contendo hidroxietildissulfeto prosseguiu, em seguida, (10 ml) e as fracções eluídas (1 ml) foram recolhidas. As fracções apresentando actividade contra ΒΑΡΝΑ foram reunidas e aplicadas di rectamente a uma coluna Mono S HR 5/5 (permuta catiónica) que tinha sido previamente equilibrada com acetato de sódio aquoso/ácido acético (50 mM),pH 5,0 contendo EDTA (1 mM) e seguidamente a coluna foi lavada com o mesmo tampão (1 ml/min) até o Aonn voltar a zero. Aplicou-se então um gradiente (Na+ 21,5 mM/ml) a acetato de sódio 1 M (Buttle e Barrett, 1984, loc. cit.) e recolheram-se fra£ çoes (1 ml). Eluiram-se dois picos principais de proteína, eluin-do o primeiro pico a cerca de Na+0,17 M, correspondendo a papaína, e eluindo o segundo pico a cerca de Na+0,38 M correspondendo a PPIV. As fracções de pico de PPIV foram reunidas, dialisadas contra EDTA aquoso (1 mM), criodessecadas e armazenadas a -20°C. A PPIV pura não não apresentou actividade detectável contra ΒΑΡΝΑ mas estava associada ã actividade digestiva de azocaseína que não era inibida por cistatina de galinha a uma concentração de 1 M.

c) Preparação de anticorpos específicos para PPIV

Antigénio PPIV puro foi moderadamente carboximetilado antes da utilização, pelo método descrito por Zucker et al♦, 1985, Biochim. Biophys. Acta, 828, 196-204. 0 anti-soro para PPIV foi então desenvolvido num coelho, por injecção intramuscular de 360 g da proteína carboximetilada em adjuvante completo de Freund, s£ guida, após quinze dias, por uma injecção subcutânea de 100 y*g em adjuvante incompleto. A IgG foi parcialmente purificada a partir dos anti-soros, por fraccionamente com sulfato de amónio, como des crito por Heide e Schwick (1978) em Handbook of Experimental Immu-nology (Weir, D.M.,ed.) Vol. 1, 7.1-7.11, Blackwell, Oxford, segu_i do por diálise em fosfato de sódio aquoso (10 mM) contendo NaCl (0,14 M), pH 7,3.

70 912 WAF/CRF/P/271 -26- A preparação de IgG específica para PPIV foi usada para ensaiar PPIV por imunodifusão radial simples como aqui se descreveu anteriormente.

Os Exemplos que se seguem ilustram mais detalhadamente aspectos do invento apenas como exemplo, e não devem, de modo algum, ser considerados como limitativos do âmbito do invento.

As abreviaturas aqui usadas incluem ABTS, 2,2'-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazolina-sulfónico); Ahx, 6-amino-hexanoílo; jA la, alamina; ΒΑΡΝΑ, N-/-benzoil-DL-arginina £-nitroanilida; Boc, butiloxicarbonil; CBZ, carbobenzoxi; Cha, ciclo-hexilalanina;DMF, N-N-dimetilformamida ; E-64, L-3-carboxi-2,3-trans-epoxi-propini1--1eucilamido-(4-guanidino)butano; EDC, hidrocloreto de N-etil-N'-- ( 3-dimetil aminopropil ) carbodi-imida ; EDTA, ácido etileno-diamina--tetra-acético (sal dissédico); Gly, glicina; Leu, leucina, Mo,ine toxi-imina; OBZ, oxibenzilo; Ox, oxima; Phe, f enilalanina; Sc, se-micarbazona; THF, tetra-hidrofurano; e Tyr, tirosina.

Bio-Rad, Chelex, Chymodiactin, CH-Sepharose 4B, Chymo-fast, Disken, ECH-Sepharose, Enzfitter, FPLC, Gel Bond, Mono S HR, S-Sepharose HP, Tween, Zeta e Zetaffinity são todos nomes comerciais .

Todos os passos foram efectuados b temperatura ambiente, a não ser onde se indique de outro modo.

Exemplo 1 L-alanil-L-fenilalanil semicarbazona

Etapa a A) Adicionou-se, com agitação, 0,N-dimetil-hidroxilamina HC1 (10,23 g) a N, N^-dimetil f ormamida seca (DMF) (100 ml) à temperatura ambiente. Adicionou-se N-metilmorfoiina (10,6 g) durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida abaixo de 30°C. Formou-se um precipitado branco e a mistura foi arrefecida até 0°C. B) Dissolveu-se N-t-Boc-L-Phe (26,5 g) em tetra-hidrofu-rano seco (THF) (200 ml) e arrefeceu-se até -10°C. Adicionou-se â

70 912 WAF/CRF/P/271 -27- solução cloroformato de isobutilo (14,38 g), durante um período de 5 minutos, mantendo a temperatura a -10°C. Adicionou-se N-metilmo£ folina (10,6 g) durante um período de 10 minutos, mantendo a temp^ ratura a -10°C, e continuou-se a agitação durante mais 10 minutos. C) A suspensão A foi adicionada à suspensão B durante um período de 15 minutos a -10°C. A mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e depois foi, agitada durante 3 horas. A mistura resultante foi então arrefecida a 0°C e adicionou-se 3-dimeti^ 1aminopropilamina (10,2 g) durante um período de 5 minutos. Adici£ naram-se água (200 ml) e acetato de etilo (200 ml) e a camada sup_e rior orgânica foi separada e lavada sequencialmente com (a) água (200 ml), (b) KHCOj aquoso (52,200 ml), (c)HCl aquoso (0,5N,200ml) e (d) água (3x 200 ml). 0 solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30^C, para dar N-t-Boc-L-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato.

Etapa b

Agitaram-se em conjunto N-t-Boc-L-Phe-0 , N-dimet il-hidroxjj mato (2,9 g) e ácido trifluoroacético (8 ml), à temperatura ambieri te durante 4 horas. 0 ácido trifluoroacético em excesso foi então removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. Adicionou-se éter etílico (30 ml), ao resíduo, para formar uma solução e depois o éter foi removido sob vácuo. 0 tratamento com éter foi repetido até ocorrer cristalização. 0 sóli^ do foi recolhido por filtração, lavado com éter e seguidamente seco sob vácuo, sobre ^2^5’ Para dar o sal trifluoroacetato de L-Ph_e -0,N-dimetil-hidroxamato.

Etapa c • A) 0 sal trifluoroacetato de L-Phe-0,N-dimetil-hidroxama-to (7,15 g) foi dissolvido em DMF seco (30 ml), com agitação ò tem peratura ambiente. Adicionou-se N-metilmorfolina (2,35 g) durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida abaixo de 30°C, e a mistura resultante foi arrefecida até 0°C. B) CBZ-L-Ala (4,96 g) foi dissolvida em THF seco (55 ml) 70 912 WAF/CRF/P/271

-28- com agitação e a mistura foi arrefecida até -10°C. Adicionou-se cloroformato de isobutilo (3,05 g) durante um período de 5 minutos a -10°C, adicionou-se N-metilmorfolina (2,35 g) durante um p_e riodo de 10 minutos e a mistura reaccional foi agitada a -10°C di[ rante mais 10 minutos. C) A solução A foi adicionada ò solução B durante um pje riodo de 15 minutos, a -10°C, e em seguida a temperatura da mistura foi deixada subir até à temperatura ambiente e a agitação continuou durante 3 horas. A mistura foi arrefecida até 0°C, adicionou-se 3-dimetilaminopropilamina (2,27 g) durante um período de 5 minutos e a agitação continuou durante mais 5 minutos. Adic_i onaram-se então água (50 ml) e acetato de etilo (50 ml), a fase orgânica superior foi separada e lavada sequencialmente com (a) & gua (50 ml) e NaCl aquoso saturado (5 ml), (b) KHCOj aquoso (5% , 50 ml), (c) HC1 aquoso (0,5 N, 50 ml) e (d) água (3 x 50 ml).0 so_l vente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. Adicionou-se acetato de etilo fresco (50 ml) e depois removeu-se por evaporação para dar CBZ-L-Ala--Phe-0,N-Dimetil-hidroxamato.

Etapa d

Dissolveu-se CBZ-L-Ala-L-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato (27,8 g) em THF seco (280 ml) e arrefeceu-se até -70°C sob A- dicionou-se hidreto de di-isobutil-alumínio em THF (1M, 372 ml) sob durante um período de 60 minutos a -70°C e a agitação con tinuou durante mais 60 minutos a -70°C. A reacção foi interrompida em NaCl aquoso saturado (400 ml) e solução de sal de Rochell (600 ml), com agitação a 0°C sob N21 e a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente. Adicionou-se acetato de etilo (600 ml), filtrou-se a mistura e separou-se a camada aquosa e* ex-tractou-se com acetato de etilo (200 ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água (600 ml)/NaCl aquoso saturado (400 ml) (x3). 0 solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. 0 resíduo foi re-cristalizado em tolueno e o sólido foi seco sob vávuo sobre ^2^5 para dar CBZ-L-Ala-L-Phe aldeído. -29- 70 912 WAF/CRF/P/271

Etapa e A) CBZ-L-Ala-L-Phe aldeído (3g) foi dissolvido em álcool desnaturado com metanol (20 ml). A solução foi aquecida a 50°C e filtrada para remover insolúveis. B) Uma solução de semicarbazida HC1 (1,3 g) em água (10 ml) foi adicionada a uma solução de KHCO^ (1,1 g) em água (10 ml). C) A solução B foi adicionada à solução A e a mistura ve_ sultante foi agitada a 50°C durante 2 horas. Adicionaram-se acetja to de etilo (50 ml) e água (100 ml), a camada aquosa foi separada e extractada com acetato de etilo (2x 20 ml) e as fases orgânicas combinadas foram lavadas sequencialmente com (a) KHCOj aquoso (5%, 50 ml); (b) HC1 aquoso (0,5N, 50 ml) e (c) água/NaCl aquoso saturado (50 ml/20 mlx3). 0 solvente foi removido por evaporação rota tiva sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C para dar CBZ-L-Ala-L-PheSc.

Etapa f CBZ-L-Ala-L-PheSc (680 mg) foi dissolvido em metanol (90 ml) e os insolúveis foram removidos por filtração. 0 aparelho cori tendo a solução metanólica de CBZ-L-Ala-L-PheSc foi purgado com N£ e adicionou-se o catalisador, 10 % paládio em carvão (100 mg). Passou-se no sistema fechado, durante 75 minutos. 0 catalisador foi removido por filtração e o metanol foi removido por evapo ração rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. 0 resíduo cristalizou em repouso e o sólido foi seco sob vá cuo, sobre Para dar L-alanil-L-fenilalanil -semicarbazona (L-Ala-L-PheSc). «

Exemplo 2 L-feni1alanil-L-feni1alani1 semicarbazona

Etapas a e b 0 sal trifluoroacetato de L-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato -30- 70 912 WAF/CRF/P/271 foi preparado de acordo com as etapas a e b do Exemplo 1.

Etapa c A) Dissolveu-se sal trifluoroacetato de L-Phe-0,N-dimeti_l -hidroxamato (1,932 g) em DMF seca (8 ml), com agitação à temperatura ambiente. Adicionou-se N-metilmorfolina (0,606 g), durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida abaixo de 30°C, e a mistura resultante foi arrefecida até 0°C. B) CBZ-L-Phe (1,794 g) foi dissolvido em THF seco (15 ml) com agitação e a mistura foi arrefecida até -10°C. Adicionou-se cloroformato de isobutilo (0,822 g) durante um período de 5 minutos a -10°C, adicionou-se N-metilmorfolina (0,606 g) durante um p£ rlodo de 10 minutos e a mistura reaccional foi agitada a -10°C durante mais 10 minutos. C) A solução A foi adicionada à solução B durante um perí^ odo de 15 minutos a -10°C e depois deixou-se a temperatura da mistura subir até ã temperatura ambiente e continuou-se a agitação dui rante 3 horas. A mistura foi arrefecida até 0°C, adicionou-se 3-di^ metilaminopropilamina (0,612 g) durante um período de 5 minutos e a agitação continuou durante mais 5 minutos. Adicionaram-se então água (20 ml) e acetato de etilo (30 ml), a fase orgânica foi separada e lavada sequencialmente com (a) KHCO^ aquoso (5%, 20 ml),(b) HC1 aquoso (0,5N, 20 ml) e (c) água (2 x 30 ml). 0 solvente foi r£ movido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 35°C, e o resíduo foi recristalizado em álcool isopr£ pilico para dar CBZ-L-Phe-L-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato.

Etapa d CBZ-L-Phe-L-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato (4,89 g) foi’ dissolvido em THF seco (40 ml). Um frasco seco foi carregado com te-tra-hidretoaluminato de lltio (0,493 g) e adicionou-se THF seco (20 ml) sob N£ e agitou-se ã temperatura ambiente durante 10 minutos antes do arrefecimento até -50°C. A solução de hidroxamato em THF seco foi então adicionada durante um período de 10 minutos a -50°C sob e a agitação continuou durante mais 20 minutos a 0-5°C.

70 912 WAF/CRF/P/271 -31- A mistura reaccional foi arrefecida a -50°C e adicionou--se solução saturada de sal de Rochell (60 ml) sob Ng· Deixou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente, adicionou-se HC1 (conc., 10 ml), para levar a fase aquosa a pH3, e os insolúveis foram removidos por filtração. Adicionou-se acetato de etilo (50 ml) e a fase orgânica foi separada e lavada sequencialmente com (a) água (50 ml), (b) KHCO^ aquoso (5?ó, 50 ml), (c) HC1 aquoso (0,5N, 50 ml) e (d) água (3x50 ml). 0 acetato de etilo foi então removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a tempera tura abaixo de 30°C. 0 resíduo foi deixado repousar durante a no_i te, seco sob vácuo, sobre ^2^5’ e finalmente cristalizado em tolu^ eno para dar CBZ-L-Phe-L-Phe aldeído.

Etapa e A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldeído (0,645 g) foi dissolvido em álcool desnaturado com metanol (10 ml) a 70°C. B) Adicionou-se tri-hidrato de acetato de sádio (0,224 g) a uma solução de semicarbazida HC1 (0,183 g) em água (3 ml), adici^ onou-se álcool desnaturado com metanol (2 ml) e a mistura foi aquje cida até 60°C. C) A solução A foi adicionada à solução B e o balão contendo A foi lavado com mais álcool desnaturado com metanol (3 ml) e as lavagens foram adicionadas à mistura, a qual foi agitada a 6j) -70°C durante 30 minutos. A mistura foi deixada arrefecer lentameji te durante 1 hora, deixada repousar em gelo durante mais uma hora e finalmente deixada durante a noite a 4°C. 0 sólido foi recolhido por filtração, lavado com álcool desnaturado com metanol: água (4:1, 3 ml) e seco sob vácuo, sobre ^2^5’ Para dar CBZ-L-Phe-L--PheSc.

Etapa f CBZ-L-Phe-L-PheSc (2,1 g) foi dissolvida em metanol (315 ml) a 30°C e os insolúveis foram removidos por filtração. 0 aparelho contendo a solução metanólica da semicarbazona foi purgado com

70 912 WAF/CRF/P/271 -32- adicionou-se o catalisador de 10¾ de paládio sobre carvão (0,35g ) e passou-se no sistema fechado durante 30 minutos. 0 catalisador foi removido por filtração e o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. 0 resíduo foi seco sob vácuo, sobre ^2^5' Para dar L-fenilji lanil-L-fenilalanil semicarbazona (L-Phe-L-PheSc).

Exemplo 3 L-Fenilalanil-L-fenilalanil metoxi-imina

Etapas a - d 0 CBZ-L-Phe-L-Phe aldeído foi preparado como se descreveu no Exemplo 2, etapas a-d.

Etapa e A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldeído (0,645 g) foi dissolvido em ál_ cool desnaturado com metanol (35 ml) a 60-65°C e filtrado para remover os insolúveis. B) Adicionou-se tri-hidrato de acetato de sódio (0,224 g) a uma solução de metoxilamina HC1 (0,138 g) em água (25 ml) a 60°C. C) A solução B foi adicionada à solução A, o balão conteji do B foi lavado com água (10 ml) a 60°C, as lavagens foram combinjí das com a mistura e aquecidas até 60° durante 1/2 hora e em sçgui^ da deixadas arrefecer até à temperatura ambiente durante 2 horas. 0 sólido foi recolhido por filtração, lavado com álcool desnaturado com metanol: água (1:1, 6 ml) e seco sob vácuo, sobre P2^5> Pa~ ra dar CBZ-L-Phe-L-Phe-metoxi-imina .

Etapa f CBZ-L-Phe-L-Phe-metoxi-imina (550 mg) foi dissolvida em m£ tanol (300 ml) e os insolúveis foram removidos por filtração. 0 a-parelho . contendo a metoxi-imina metanólica foi purgado com ^ e adi_ cionou-se então o catalisador de 10¾ de paládio sobre carvão (100

70 912 WAF/CRF/P/271 -33- mg). Passou-se pelo vaso vedado e recarregou-se de acordo com as necessidades durante 4 1/2 horas. 0 catalisador foi removido por filtração e o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, para dar L--fenilalanil-L-fenilalanil-metoxirimina (L-Phe-L-PheMo).

Exemplo 4 L-Fenilalanil-D-fenilalanil semicarbazona

Etapa a A) Ο,Ν-dimetil-hidroxilamina HC1 (3,891 g) foi suspenso em DMF seca (40 ml) ã temperatura ambiente. Adicionou-se N-metil^ morfolina (4,032 g) durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida abaixo de 30°C, e a mistura foi então ajr refecida, com agitação, até 0°C. B) N-t-Boc-D-Phe (10,08 g) foi dissolvido em THF seco (80 ml) e arrefecido até -10°C. Adicionou-se ò solução clorofor-mato de isobutilo (3,47 g), durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida a -10°C. Adicionou-se N-metil-morfolina (4,032 g) durante um período de 10 minutos, enquanto a temperatura era mantida a -10°C, e continuou-se a agitação durart te mais 10 minutos. C) A suspensão A foi adicionada à suspensão B durante um período de 15 minutos a -10°C, a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante 3 horas. A mistura foi então arrefecida até 0°C, adicionou-se 3-dimetilaminopropila^ mina (3,88 g) durante um período de 5 minutos e continuou-se a a^ gitação durante mais 3 minutos. Adicionaram-se água (60 ml) e a-cetato de etilo (60 ml), a camada orgânica foi separada e lavada sequencialmente com (a) água (60 ml), (b) KHCOj aquoso (5?í, 60 ml), (c) HC1 aquoso (0,5M, 60 ml) e (d) água (3x60 ml). 0 solver^ te foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, enquanto a temperatura era mantida abaixo de 30°C, para dar N-t-Boc-D-Phe-0, N-dimetil-hidroxamato. 70 912 WAF/CRF/P/271

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Etapa b N-t-Boc-D-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato (11,3 g) foi arref£ eido em gelo, adicionou-se ácido trifluoroacético (30 ml) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. Removeu--se o ácido trifluoroacético em excesso, por evaporação rotativa sob vácuo mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, e adicionou-se éter etílico (100 ml) ao resíduo, para formar uma solução. 0 solvente foi removido sob vácuo e o processo foi repetido até a cristalização ocorrer. 0 sólido foi recolhido por filtração, lavado com éter etílico e seco sob vácuo, sobre ^2^5* Para dar 0 sa^ tri-fluoroacetato de D-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato.

Etapa c A) Sal trifluoroacetato de D-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato (10,1 g) foi dissolvido em DMF seca (41 ml), com agitação à temperatura ambiente. Adicionou-se N-metilmorfolina (3,155 g) durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida abaixo de 30°C e a mistura resultante foi arrefecida até 0°C. B) CBZ-L-Phe (9,4 g) foi dissolvido em THF seco (80 ml) com agitação e a mistura foi arrefecida até -10°C. Adicionou-se cloroformato de isobutilo (4,307 g) durante um período de 5 minutos a -10°C, adicionou-se N-metilmorfolina (3,155 g) durante um p£ ríodo de 10 minutos e a mistura reaccional foi agitada durante -10°C durante mais 10 minutos. C) A solução A foi adicionada à solução B durante um per_í odo de 15 minutos a -10°C e depois deixou-se a temperatura da mistura subir até b temperatura ambiente e a agitação continuou duran^ te 3 horas. A mistura foi arrefecida até 0°C, adicionou-se 3-dime-til-aminopropilamina (3,20 g) durante um período de 5 minutos e a agitação continuou durante mais 5 minutos. Adicionaram-se então á-gua (60 ml) e acetato de etilo (60 ml), a fase orgânica foi separ£ da e lavada sequencialmente com (a) água (60 ml) e NaCl aquoso saturado (60 ml), (b) KHCOj aquoso (5%, 60 ), (c) HC1 aquoso (0,5N, 60 ml) e (d) água (3x60 ml). 0 solvente foi removido por evaporação

70 912 WAF/CRF/P/271 -35- rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. Adi-cionou-se acetato de etilo fresco e depois removeu-se por evaporação. 0 resíduo foi recristalizado em isopropanol para dar CBZ-L--Phe-D-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato.

Etapa d

Hidreto de diisobutil-alumínio em diclorometano (lM,10ml) foi adicionado a um balão purgado com 0 balão foi aquecido até 50°C, até todo o diclorometano ter sido evaporado, e o sistema foi novamente purgado com Adicionou-se THF seco (10 ml) e a mistura foi arrefecida até -70°C. Oissolveu-se CBZ-L-Phe-D-Phe-0,N-dim£ til-hidroxamato (0,978 g) em THF seco (10 ml) e adicionou-se b solução de hidreto de di-isobutil-alumínio, durante um período de 10 minutos a -70°C, e a agitação continuou durante mais 10 minutos a -70°C. A mistura reaccional foi interrompida em metanol (30 ml) e solução saturada de sal de Rochell (30 ml) a -60°C e a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente. Adicionaram-se água (50 ml) e acetato de etilo (50 ml) e a fase orgânica foi separada e a fase aquosa foi extractada com acetato de etilo (50 ml). As fja ses orgânicas combinadas foram lavadas com água (2x200 ml) e filtradas. A fase orgânica foi separada e o solvente removido por eva poraçâo rotativa sob vácuo, mantendo a temperatura abaixo de 30°C. Adicionou-se acetato de etilo fresco e em seguida removeu-se para dar CBZ-L-Phe-D-Phe aldeído.

Etapa e A) CBZ-L-Phe-D-Phe aldeído (400 mg) foi dissolvido em álcool desnaturado com metanol (10 ml) a 60°C. B) Tri-hidrato de acetato de sódio (0,298 g) em água (3 ml) a 60°C foi adicionado a uma solução de semicarbazida HC1 (0,244 g) em água (3 ml) a 60°C. C) As soluçóes A e B foram combinadas e a mistura resultante foi agitada a 60°C durante 5 horas antes de se deixar'· repousar durante a noite a 4°C. 0 sólido foi recolhido por filtração

70 912 WAF/CRF/P/271 -36- e seco in vácuo sobre ^2^5 Para dar CBZ-L-Phe-D-PheSc.

Etapa F CBZ-L-Phe-D-PheSc (600 mg) foi dissolvida em metanol (90 ml) e os insolúveis foram removidos por filtração. 0 aparelho cori tendo a solução metanólica de semicarbazona foi purgado com ^ e adicionou-se o catalisador de 10% de paládio em carvão (100 mg). Carregou-se no vaso fechado, durante 2 horas. 0 catalisador foi removido por filtração e o metanol foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, enquanto a temperatura era mantida abaixo de 30°C, para dar L-fenilalanil-D-fenilalanil semicarbazona (L--Phe-D-PheSc).

Exemplo 5 - L-fenilalanil-L-fenilalanil oxima

Etapas a - d CBZ-L-Phe-L-Phe aldeído foi preparado como se descreveu no Exemplo 2, etapas a-d.

Etapa e A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldeído preparado como se descreveu £ cima (0,645 g) foi dissolvido em álcool desnaturado com metanol (35 ml) a 60-65°C e a solução foi filtrada para remover insolúveis. B) Adicionou-se tri-hidrato de acetato de sádio (0,224g) a uma solução de hidroxilamina HC1 (0,114 g) em água (25 ml) a 60°C. C) A solução B foi adicionada k solução A e 0 balão contendo B foi lavado com água (10 ml) e as lavagens foram adicionadas à mistura, a qual foi então agitada a 60-65°C durante 3/4 hora e depois arrefecida durante 2-3 horas a 4°C. 0 sólido foi ret£ rado por filtração, lavado com álcool desnaturado com metanol/água (1:1, 5 ml) e seco sob vácuo, sobre ^2^5» para dar CBZ-L-Phe-L-

70 912 WAF/CRF/P/271 -37- -PheOx como mistura de isómero sin- e anti-.

Etapa f

Dissolveu-se CBZ-L-Phe-L-PheOx (500 mg) em metanol (130 ml) e removeram-se os insolúveis por filtração. 0 aparelho contendo a oxima metanólica foi purgado com ^ e adicionou-se o catalisja dor de 10?í de paládio em carvão (83 mg). Carregou-se então H„ no vedado * vaso/durante 30 minutos. 0 catalisador foi removido por filtração e o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. Removeu-se mais solvente,u-sando uma bomba de alto vácuo, e o resíduo foi seco sob vácuo, sobre P2^5’ Para dar L-fenilalanil-L-fenilalanil oxima (L-Phe-L--PheOx ).

Exemplo 6 - L-alanil-D-fenilalanil semicarbazona

Etapas a e b 0 sal trifluoroacetato de D-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato foi preparado de acordo com as etapas a e b do Exemplo 4.

Etapa c A) 0 sal trif1uoroacetato de D-Phe-0,N-dimetil-hidroxama-to (5,000 g) foi dissolvido em THF seco (20 ml). Adicionou-se, leji tamente, N-metilmorfolina (1,578 g), enquanto se mantinha a temperatura abaixo de 30°C e a mistura resultante foi arrefecida até 0°C. B) CBZ-L-Ala (3,463 g) foi dissolvida em THF seco (40 ml) com agitação e a mistura foi arrefecida até -10°C. Adicionou-se cloroformato de isobutilo (2,158 g) durante um período de 5 minutos a -10°C, adicionou-se N-metilmorfolina (1,578 g) durante um p£ riodo de 10 minutos e a mistura reaccional foi agitada a -10°C durante mais 10 minutos. C) As duas soluções, A e B, foram misturadas a -10°C durante um período de 10 minutos e depois deixou-se a temperatura sij

70 912 WAF/CRF/P/271 -38- bir até b temperatura ambiente e a agitação continuou durante 3 h£ ras. A mistura foi arrefecida até 0°C, adicionou-se 3-dimetilamino propilamina (1,585 g) e a reacção foi interrompida com água (50 ml). Adicionou-se acetato de etilo (50 ml), a fase orgânica foi separada e a camada aquosa foi extractada com acetato de etilo (2x30 ml). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas sequencialmente com (a) água (50 ml) e NaCl aquoso saturado (10 ml), (b) KHCOj aquoso (5%, 50 ml), (c) HC1 aquoso (0,5N, 50 ml) e (d) água (3x50 ml). 0 solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo--se a temperatura abaixo de 30°C. 0 sólido foi recristalizado em ace tato de etilo para dar CBZ-L-Ala-D-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato.

Etapa d CBZ-L - Ala-D-Phe-0, N-dimetil-hidroxamato (2,9 g) foi disso_l vido em THF seco (25 ml). A solução foi arrefecida até -70°C sob a-zoto. Adicionou-se hidreto de di-isobutil-alumínio em THF (1M, 37 ml) durante um período de 10 minutos a -70°C e a agitação continuou durante mais 10 minutos. A reacção foi interrompida em solução saturada de sal de Rochell (125 ml) e THF (125 ml) com agitação a -30°C sob uma purga de N2 e deixou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente. Ad_i cionou-se acetato de etilo (100 ml) e a fase orgânica foi separada. A camada aquosa foi extractada com acetato de etilo (2x30 ml) e as camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água (3x100 ml). A mistura reaccional foi filtrada e o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. Adicionou-se acetato de etilo fresco e em seguida removeu-se, para dar CBZ-L-AIa-D-Phe aldeído.

Etapa e A) CBZ-L-Ala-O-Phe aldeído (1,2 g) foi dissolvido em THF (20 ml) e álcool desnaturado com metanol (20 ml) e aquecido até 50°C. B) Adicionou-se uma solução quente de semicarbazida HC1 (1,8 g) em água (15 ml) a uma solução quente de KHCOj (1,5 g) em já

70 912 WAF/CRF/P/271 -39- gua (15 ml). C) A solução B foi adicionada à solução A e a mistura resultante foi agitada a 50°C durante 4 horas. 0 solvente foi remov_i do por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura a-baixo de 30°C. Adicionou-se água (50 ml) ao resíduo, recolheu-se o sólido por filtração, lavou-se com água: álcool desnaturado com me tanol (1:1) e secou-se sob vácuo, sobre ^2^5’ Para dar CBZ-L-Ala--D-PheSc.

Etapa f

Dissolveu-se CBZ-L-Ala-D-PheSc (750 mg) em metanol (50ml) e removeram-se os insolúveis por filtração. 0 aparelho contendo a solução de metanol foi purgado com e adicionou-se o catalisador, 10¾ de paládio em carvão (100 mg). Fez-se passar no sistema fechado durante 90 minutos. 0 catalisador foi removido por filtração e o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, e seco sob vácuo, sobre P para dar L-alanil-D-fenilalanil semicarbazona (L-Ala-D-PheSc).

Exemplo 7 L-tirosinil-L-fenilalanil semicarbazona

Etapas a e b 0 sal trifluoroacetato de L-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato foi preparado de acordo com as etapas a e b do Exemplo 4.

Etapa c A) 0 sal tri fluoroacetato de L-Phe-□, N-dimetil-hidroxama^ to (7,95 g) foi dissolvido em DMF seca (30 ml) com agitação à tem peratura ambiente. Adicionou-se N-metilmorfolina (2,49 g) durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida abaixo de 30°C, e a mistura resultante foi arrefecida até 0°C. B) Dissolveu-se CBZ-OBZ-L-Tyr (10 g) em DMF seca (60 ml), com agitação, e a mistura foi arrefecida até -10°C. Adicionou-se 70 912 WAF/CRF/P/271

-40- cloroformato de isobutilo (3,39 g) durante um período de 5 minutos a -10°C. Adicionou-se N-dimetilmorfoiina (2,49 g) durante um período de 10 minutos e a mistura reaccional foi agitada a -10°C durari^ te mais 10 minutos. C) A solução A foi adicionada à solução B durante um perjÇ odo de 15 minutos a -10°C e em seguida deixou-se a temperatura subir até à temperatura ambiente e a agitação continuou durante 3 hu) ras. A mistura foi arrefecida até 0°C e adicionou-se 3-dimetilami-nopropilamina (2,52 g) durante um período de 5. minutos. Adicionaram-se, então, água (50 ml) e acetato de etilo (50 ml)} a fase orgâ^ nica superior foi separada e lavada sequencialmente com (a) água (50 ml), (b) KHC03 aquoso (5¾, 50 ml), (c) HC1 aquoso (0,5N,50 ml) e (d) água (3x50 ml). 0 solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, e o resí^ duo foi recristalizado em álcool isopropílico, para dar CBZ-0BZ-L--Tyr-L-Phe-0,N-dimetil-hidroxamato,

Etapa d CBZ-0BZ-L-Tyr-L-Phe-0,N-dimeti1-hidroxamato (1,012 g) foi dissolvido em THF seco (10 ml). Adicionou-se hidreto de di-isobuti_l -alumínio em THF (1M, 8,5 ml) sob ^ durante um período de 10 minij tos a -70°C e aagitação continuou durante mais 10 minutos. A reacção foi interrompida em metanol (20 ml) e solução de sal de Rochell (30 ml) com agitação a -60°C sob ^ e deixou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente. Adicionaram-se água (50 ml) e acetato de etilo (50 ml) e a fase orgânica foi separada e lavada com água (200 ml). A mistura reaccional foi filtrada e o solvente foi removido do filtrado por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. Adicionou-se então acetato de etilo fresco e removeu-se por evaporação rotativa. 0 só lido resultante foi seco sob vácuo, sobre ^2^5’ Para dar CBZ-0BZ--L-Tyr-L-Phe aldeído.

Etapa e A) CBZ-0BZ-L-Tyr-L-Phe aldeído (400 mg) foi dissolvido em -41- 70 912 WAF/CRF/P/271 álcool desnaturado com metanol (20 ml) e THF (10 ml) e aquecido a-té 60°C. B) Adicionou-se uma solução quente de semicarbazida HC1 (600 mg) em água (5 ml) e uma solução quente de KHCOj (500 mg) em água (5 ml ) . C) A solução B foi adicionada à solução A e a mistura ve_ sultante foi agitada a 60°C durante 2 horas. 0 solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C e o resíduo foi extinto· com água. 0 sólido foi recolhido por filtração, lavado com água e álcool desnaturado com metanol e seco sob vácuo, sobre ^2^5’ Para dar CBZ-0BZ-L-T y r-L --PheSc.

Etapa f CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc (770 mg) foi dissolvido em THF seco (70 ml), filtrado e em seguida adicionou-se metanol (20 ml) ao filtrado. 0 aparelho contendo a solução de semicarbazona foi purgada com N2 e adicionou-se 0 catalisador, 10% de paládio em carvão (100 mg). Fez-se passar no sistema fechado, durante várias horas. 0 catalisador foi removido por filtração e o solvente foi rj5 movido por evaporação, para dar L-tirosinil-L-fenilalanil semicar bazona (L - Tyr-L-PheSc ).

Exemplo 8 · L-alanil-L-ciclo-hexilalanil semicarbazona

Etapa a A) Adicionou-se 0,N-dimetil-hidroxilamina HC1 (8,51 g) com agitação a DMF seca (75 ml) e N-metilmorfolina (8,8 g) durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida a-baixo de 30°C. Formou-se um precipitado branco e a mistura foi ajr refecida até 0°C. B) Oissolveu-se N-t-Boc-L-Cha (22,5 g) em THF seco (200 ml) e arrefeceu-se até -10°C. Adicionou-se cloroformato de isobu-tilo (11,94 g) durante um período de 5 minutos, enquanto a tempe- -42- 70 912 WAF/CRF/P/271 ratura era mantida a -10°C. Adicionou-se N-metilmorfolina (8,8 g) durante um período de 10 minutos, enquanto a temperatura era mantida a -10°C e a agitação continuou durante mais 10 minutos. C) A suspensão A foi adicionada à suspensão B durante um período de 15 minutos a -10°C e em seguida deixou-se a mistura a-quecer até à temperatura ambiente, e agitou-se durante 4 horas. A mistura foi arrefecida até 0°C e adicionou-se 3-dimetilamino pro-pilamina (8,6 g) durante um período de 5 minutos e a agitação con tinuou durante mais 5 minutos. Adicionaram-se água ( 200 ml) e ac^e tato de etilo (100 ml) e a camada aquosa foi separada e extracta-da com acetato de etilo (2x100 ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas sequencialmente com (a) água (100 ml) e NaCl aquoso saturado (20 ml), (b) KHCO-j aquoso (5%, 100 ml), (c) HC1 aquoso (0,5N, 100 ml) e (d) água (3x100 ml). 0 solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, para dar N-t-Boc-L-Cha-0,N-dimetil-hidroxamato.

Etapa b N-t-Boc-L-Cha-0,N-dimetil-hidroxamato (26 g) e ácido trj^ fluoroacético (65 ml) foram agitados a 0°C durante 5 minutos e em seguida deixou-se a temperatura de mistura subir até à temperatura ambiente e a agitação continuou durante 3 horas. 0 ácido tri-fluoroacético em excesso foi então removido por evaporação rotati^ va sob vácuo, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. Adicionou^ -se éter etílico ao resíduo para formar uma solução e depois o é-ter foi removido sob vácuo. 0 tratamento com éter foi repetido pji ra dar um óleo amarelo do sal trifluoroacetato de L-Cha-0,N-dime-til-hidroxamato.

Etapa c A) 0 sal tri f luoroacetato de L-Cha-0 , N-dimetil-hidroxamjí to (17 g) foi dissolvido em THF seco (50 ml). Adicionou-se N-me-til-morfolina (3,95 g) durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida abaixo de 30°C, e a mistura foi arrefecida até 0°C. f

70 912 WAF/CRF/P/271 -43- B) Dissolveu-se CBZ-L-Ala (9,23 g) em THF seco (100 ml) com agitação e a mistura foi arrefecida até -10°C. Adicionou-se cloroformato de isobutilo (5,35 g) durante um período de 5 minutos a -10°C, adicionou-se N-metilmorfolina (3,95 g) durante um pjí riodo de 10 minutos e a mistura reaccional foi agitada a -10°C durante mais 10 minutos. C) A solução A foi adicionada b solução B durante um período de 15 minutos a -10°C e em seguida deixou-se a temperatura da mistura subir até b temperatura ambiente, e a agitação continuou durante 3 horas. A mistura foi arrefecida até 0°C, adiciono^j -se 3-dimetilaminopropilamina (3,98 g) durante um período de 5 mi^ nutos e a agitação continuou durante mais 5 minutos. Adicionaram--se entlo água (150 ml) e acetato de etilo (150 ml) e a fase aquo sa foi separada e extractada com acetato de etilo (2x 75 ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas sequencialmente com (a) água (125 ml), (b) KHCO^ aquoso (5?í, 125 ml), (c) HC1 aquoso (0,5 N, 125 ml) e (d) água (3x125 ml). 0 solvente foi removido por eva poração rotativa, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. Adic_i ona-se acetato de etilo fresco e removeu-se por evaporação para dar CBZ-L-Ala-L-Cha-0,N-dimetil-hidroxamato.

Etapa d

Dissolveu-se CBZ-L-Ala-L-Cha-0,N-dimetil-hidroxamato (7,22 g) em THF seco' (160 ml) e arrefeceu-se até -70°C sob Adicionou-se hidreto de di-isobutil-alumínio em THF (1M, 86 ml)sob durante um período de 20 minutos a -70°C, e a agitação continuou durante mais 20 minutos. A reacção foi interrompida em solução de sal de Rochell (400 ml), com agitação a 0°C sob ^ e deixou-se a mistura aquecer até b temperatura ambiente. Adicionou-se acetato de etilo (150 ml) e agitou-se a mistura durante 5 minutos. A mistura reaccional foi aquosa filtrada, a camada orgânica separada e a fase/foi extractada com acetato de etilo (2x50 ml). As fases orgânicas combinadas foram lja vadas com água (3x200 ml), sendo adicionado NaCl aquoso saturado às lavagens finais. 0 solvente foi removido por evaporação rotati-

70 912 WAF/CRF/P/271 -44- va, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, para dar um óleo* de CBZ-L-Ala-L-Cha aldeído.

Etapa e A) CBZ-L-Ala-L-Cha aldeído (8 g) foi dissolvido em álcool desnaturado com metanol (50 ml) e aquecido até 50°C. B) Adicionou-se uma solução quente de semicarbazida HC1 (3,0 g) em água (25 ml) a uma solução quente de KHCO^ (2,67 g) em água (25 ml). C) A solução B foi adicionada à solução A e a mistura re sultante foi agitada a 50°C durante 3 horas. Deixou-se a mistura arrefecer e repousar durante a noite a 4°C. Removeu-se a maior parte do álcool desnaturado com metanol por evaporação rotativa, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, e adicionou-se acetato de etilo (50 ml) ao resíduo. A fase orgânica foi separada e lavada sequencialmente com (a) água (30 ml), (b) KHCO^ aquoso (5%, 30 ml), (c) HC1 aquoso (0,5N, 30 ml) e (d) água (2x50 ml), sendo adi cionado o NaCl aquoso saturado necessário para auxiliar a separação. 0 solvente foi removido por evaporação rotativa, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, e o sólido foi recristalizado em i-sopropanol e éter para dar CBZ-L-Ala-L-ChaSc.

Etapa f CBZ-L-AIa-L-ChaSc (900 mg) foi dissolvida em metanol (30 ml) e adicionou-se o catalisador, 10?í de paládio em carvão (100 mg), sob Fez-se passar no sistema fechado durante 6 horas e depois o catalisador foi removido por filtração. 0 solvente foi removido por evaporação rotativa, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, e o sólido foi lavado com éter e seco sob vácuo, sobre ^2^5’ para dar L- àlanil-L-ciclo-hexi 1 a 1 anina semicarbazona (L_ -Ala-L-ChaSc).

Exemplo 9 - L-alanil-L-leucinil semicarbazona 45- 70 912 WAF/CRF/P/271

Etapa a A) Ο,Ν-dimetil-hidroxilamina HC1 (9,17 g) foi adicionado sob agitação a DMF seca (110 ml) à temperatura ambiente. Adicionou-se N-metilmorfolina (9,51 g) durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida abaixo de 30°C. Formou-se um precipitado e a mistura foi arrefecida até 0°C. B) N-t-Boc-L-Leu (23,3 g) foi dissolvida em THF seco (220 ml) e arrefecida até -10°C. Adicionou-se cloroformato de is£ butilo (12,90 g) durante um período de 5 minutos, enquanto a temperatura era mantida a -10°C. Adicionou-se N-metilmorfoiina (9,51 g) durante um período de 10 minutos, enquanto a temperatura era mantida a -10°C, e a agitação continuou durante mais 10 minutos. C) A suspensão A foi adicionada b suspensão B durante um período de 15 minutos a -10°C. Deixou-se a mistura aquecer até b temperatura ambiente e agitou-se durante 3 horas. A mistura foi então arrefecida até 0°C e adicionou-se 3-dimetilaminopropilamina (9,13 g) durante um período de 5 minutos e a agitação continuou durante mais 5 minutos. Adicionaram-se acetato de etilo (110 ml) e água (110 ml) e a camada orgânica foi separada e lavada sequencialmente com (a) água (2x100 ml), (b) KHCO^ aquoso (55S, 100 ml), (c) HC1 aquoso (0,5N, 100 ml) e (d) água (3x100 ml). 0 solvente foi removido por evaporação rotativa, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, para dar N-t-Boc-L-Leu-0,N-dimetil-hidroxamato.

Etapa b N-t-Boc-L-Leu-0,N-dimetil-hidroxamato (23,4 g) e ácido trifluoroacético ( 165 ml), arrefecido até 0°C0 foram agitadcs em conjunto, b temperatura ambiente durante 18 horas. 0 ácido trifljj oroacético em excesso foi então removido por evaporação rotativa, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. Adicionou-se éter etíM co ao resíduo para formar uma solução e em seguida o éter foi removido sob vácuo. Repetiu-se esta operação até ocorrer a cristal_i zação a 4°C, para dar o sal trifluoroacetato de L-Leu-0,N-dimetil -hidroxamato. 70 912 WAF/CRF/P/271

-46-

Etapa c A) 0 sal trifluoroacetato de L-Leu-0,N-dimetil-hidroxama-to (1,8 g) foi dissolvido em THF seco (10 ml) com agitação à temp_e ratura ambiente. Arrefeceu-se a mistura até 0°C e adicionou-se N--metilmorfoiina (0,635 q) durante um período de 5 minutos. B) CBZ-L-Ala (1,40 g) foi dissolvida em THF seco (20 ml) e arrefecido até -10°C. Adicionou-se cloroformato de isobutilo (0,869 g) durante um período de 5 minutos a -10°C, adicionou-se N--metilmorfolina (0,635 g) durante um período de 10 minutos e agitou-se a mistura reaccional a -10°C durante mais 10 minutos. C) A solução A foi adicionada à solução B durante um perí^ odo de 15 minutos a -10°C e em seguida, deixou-se a temperatura da mistura subir até à temperatura ambiente e continuou-se a agitação durante 18 horas. A mistura foi arrefecida até 0°C, adicionou-se 3-dimetilaminopropilamina (0,64 g) e depois interrompeu-se a mistjj ra reaccional com água (25 ml) e acetato de etilo (25 ml). Separoij -se a fase aquosa e extractou-se com acetato de etilo (2x25 ml).As fases orgânicas combinadas foram lavadas sequencialmente com (a) á^ gua (50 ml) e NaCl aquoso saturado (para auxiliar a separação) (b) KHCO^ aquoso (5?ó, 30 ml), (c) HC1 aquoso (0,5N, 30 ml) e (d) água (3x30 ml). 0 solvente foi removido por evaporação rotativa, manter^ do-se a temperatura abaixo de 30°C e o sólido foi seco sob vácuo, sobre P^0^, para dar CBZ-L-Ala-L-Leu-0,N-dimetil-hidroxamato.

Etapa d CBZ-L-AIa-L-Leu-0,N-dimetil-hidroxamato (1,9 g) foi dissolvido em THF seco (40 ml) e arrefecido até -70°C sob N£. Adicionou-se hidreto de dirisobutil-aluminio em THF (1M, 29,5 ml) sob N£ durante um período de 10 minutos a -70°C e continuou-se a agitação durante mais 10 minutos. A reacção foi interrompida em metanol (50 ml) e solução de sal de Rochell (50 ml) com agitação a -60°C sob N£ e deixou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente. Adicionaram-se água (50 ml) e acetato de etilo (50 ml) e a mistura foi filtrada e a cja mada aquosa separada e extractada com acetato de etilo (2x50 ml).

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As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água (3x100 ml) e NaCl aquoso saturado, para auxiliar a separação. 0 solvente foi removido por evaporação rotativa, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C, adicionou-se acetato de etilo fresco e depois removeu -se por evaporação rotativa, para dar C3Z-L-Ala-L-Leu aldeído.

Etapa e A) CBZ-L-Ala-L-Leu aldeído (6,7 g) foi dissolvido em álcool desnaturado com metanol (5 ml) e aquecido até 50°C. B) Adicionou-se uma solução quente de KHCO^ (9 g) em á-gua (30 ml) a uma solução quente de semicarbazida HC1 (10,8 g) em água (30 ml ). C) A solução B foi adicionada ã solução A e a mistura foi agitada a 50°C durante 3 horas e deixada repousar durante a noite ò temperatura ambiente. 0 sólido foi retirado por filtração, lavado com álcool desnaturado com metanol: água (1:1, 20 ml) e s£ co sob vácuo, sobre ^2^5» Para dar CBZ-L-Ala-L-LeuSc.

Etapa f CBZ-L-Ala-LeuSc (930 mg) foi dissolvida em metanol (100 ml) e os insolúveis foram removidos por filtração. Adicionou-se mais metanol (30 ml) e o aparelho foi purgado com Adicionou- -se o catalisador, 10¾ de paládio em carvão (100 mg) sob ^ e depois fez-se passar no sistema fechado durante 135 minutos. 0 catalisador foi removido por filtração e 0 solvente foi removido por evaporação rotativa, mantendo-se a temperatura abaixo de 30°C. 0 sólido foi seco sob vácuo, sobre ^2^5’ Para dar L-alanil-L-leu-cinil semicarbazona (L-Ala-L-LeuSc).

Exemplo 10 - Preparação da matriz de cromatoqrafia de a- finidade dirigida ao sitio activo de ECH-Sepharose 4B-L- -Ala-L-PheSc ECH-Sepharose

R 4B (3 g de peso húmido) foi lavada num

70 912 WAF/CRF/P/271 -48- filtro de vidro sinterizado com NaCl aquoso (0,5M, 240 ml) seguido de água (120 ml). Dissolveu-se hidrocloreto de N-etil-N'-(3-d_i metilaminopropil )carbodi-imida (EDC) em água para dar uma solução Q,1M em EDC, e o pH da solução de EDC foi estabilizado a pH 4,5 pela adição de ácido clorídrico ou de acetato de sódio sólido.Di£ solveu-se L-Ala-L-PheSc (10 mg), preparada como se descreveu no E xemplo 1, em metanol (400 ml) e adicionou-se ao gel lavado, em conjunto com EDC aquoso (0,1M, 2,4 ml). A mistura foi agitada sua vemente a 20°C durante 1 hora, o pH foi reajustado a pH 4,5, se necessário, e a agitação continuou a 20°C durante 23 horas. Adici^ onou-se de novo L-glicina até uma concentração final de 1M e a a-gitação a 20°C continuou durante mais 3 horas. 0 gel de cromato-grafia de afinidade foi lavado sequencialmente com metanol aquoso (50?í, 60 ml), água (60 ml) e tampão de aplicação (60 ml) e foi a£ mazenado a 4°C até ser necessário.

Exemplos 11-18 - Preparação de matrizes de cromatoqrafia de afinidade

Cada um dos derivados dipéptidos preparados como se descreveu nos Exemplos 2 a 9 foi acoplado a uma matriz de gel de uma maneira análoga à descrita no Exemplo 10 para dar os geles de cro matografia de afinidade dos Exemplos 11 a 18, respectivamente.

Exemplo 19 - Cromatoqrafia de afinidade

Aplicou-se látex de papaieira, seco por aspersão, (0,03g de proteína) obtido em Powell 4 Scholefield, Reino Unido, em tampão de "aplicação" (fosfato de sódio (50 mM); EDTA (1 mM); etano-diol (33%), pH 6,8) mais ditiotreitol (2 mM) ou cisteína (4 mM) (1,5 ml), a uma coluna de 1 ml de cada uma das matrizes de croma-tografia de afinidade dos Exemplos 10-18. Usou-se pelo menos um dos cinco elementos diferentes que se seguem:

Eluente A = Hidroxietildissulfeto (100 mM) em etanodiol aquoso (33%) contendo citrato de sódio (50 mM) e EDTA (1 mM), pH 4,5; coluna equilibrada 70 912 WAF/CRF/P/271 -49- jFr- durante a noite antes da ebulição.

Eluente B = 2,2’-Dipiridildissulfeto (30 mM) em etanodi-' ol aquoso (33¾) contendo citrato de sódio (50 mM) e EDTA (lmM), pH 4,5; coluna equilibrada durante a noite antes da eluição.

Eluente C = Metilpiridildissulfeto (30 mM) em etanodiol a quoso (33¾) contendo citrato de sódio (50 mM) e EDTA (1 mM), pH 4,5; coluna equilibrada durante a noite antes da eluição.

Eluente D = Acido mersalilo (10 mM) em etanodiol aquoso (33¾) contendo hidróxido de sódio (50 mM), e EDTA (25 mM), ajustado a pH 4,5 com ácido acé tico; eluição contínua.

Eluente E = HqC^ (10 mM) em etanodiol aquoso (33¾) contendo acetato de sódio (50 mM), pH 4,5; eluição contínua. A eluição com cada eluente foi avaliada por inspecção do traço A2qq do material eluído após cromatografia Mono S (Pharmacia) Standard. Os resultados estão sumarizados no Quadro 1 abaixo: WAF/CRF/P/271 -50

Ligação e Eluição da Quimopapafna

C0 D O O o + I 2 ca

"O o

ICO c <u ca Ό o> ca cn ca -μ "O r-l ca cn o •H KO o

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•H vi E ca ca c-i a. a. ω ca ca -u

0.0.0} o o "O ε e M -ri a

Ο Z3 ICO σ σ z

70 912 WAF/CRF/P/271 -51-

Exemplo 20 - Purificação da Quimopapaína (i) Latex, seco por aspersão, comercialjde Carica papaya (1 g) obtida em Powell & Scholefield, R.U., foi agitado durante 1 hora com água destilada (5 ml) e o material não dissolvido foi removido por centrifugação a 9000 x g durante 30 minutos a 4°C. 0 b£ lo foi rejeitado e o pH do sobrenadante foi ajustado a pH 1,8 com ácido clorídrico (1 M) durante um período de 20 minutos. A agitação continuou a 4°C durante 60 minutos e o pH foi reajustado a pH 1,8, se necessário. (ii) A mistura foi centrifugada a 9000 x g durante 30 nu nutos a 4°C e o bolo foi rejeitado. (iii) (a) 0 pH do sobrenadante foi ajustado a pH 6,8 por adição, gota a gota, de NaOH (5 M) durante um período de 10 minutos. Notou-se o aparecimento de uma coloração azul-púrpura na sol£ ção. (b) A solução azul-púrpura resultante foi dialisa-da extensivamente contra 10 volumes de tampão de "aplicação" (fosfato de sddio (50 mM>, EDTA (1 mM); etanodiol (33%), pH 6,8) com três mudanças de tampão. 0 dialisante foi centrifugado a 4000 x g durante 10 minutos e o teor em proteína do sobrenadante decantado contendo quimopapaína foi ajustado a aproximadamente 30 mg/ml. A solução de quimopapaína foi activada pela adição de cisteína até uma concentração final de 4 mM e deixada repousar durante 15 minutos a 0°C. (iv) A solução de quimopapaína activada foi aplicada a u ma coluna de 8 ml de ECH-Sepharose acoplada a L-Ala-L-PheSc (preparada como se descreveu no Exemplo 10), previamente equilibrada com tampão de aplicação, a um caudal de 36 ml/cm /hora. A coluna foi lavada sequencialmente com tampão de aplicação (2 vol. de leito), citrato de sddio aquoso (50 mM) em etanodiol (33%), pH 4,5 (2 vol. de leito) e acetato de sódio aquoso (50 mM); EDTA (25 mM); mersalilo (10 mM) em etanodiol (33?í), pH 4,5 (2 vol. de leito) e depois incubada à temperatura ambiente durante 2 horas. (v) A quimopapaína foi eluída com acetato de sódio aquo- -52- 70 912 WAF/CRF/P/271 so (50 mM) contendo mersalilo (10 mM) (3 vol. de leito) e recolheram-se fracções (4 ml). A actividade da enzima das fracções eluí-das foi analisada . reletivamente à actividade específica contra ΒΑΡΝΑ, como se descreveu anteriormente.

As fracções activas foram reunidas e depois purificadas p por cromatografia de permuta catidnica numa coluna Mono-S HR 10/ /10 (Pharmacia) com um tampão de fosfato "iniciador" de Na+ (50 mM); EDTA (1 mM); NaN^ (0,01?ó), pH 7,2 e um tampão de fosfato "limitador" de Na+ (800 mM); EDTA (1 mM); NaN^ (0,01Sí), pH 7,2. A e-luição foi realizada com um gradiente de sal de 2,7 mM/ml e um caudal de 2 ml/min.. As fracções (4 ml) foram recolhidas, as concentrações em proteína foram estimadas por medição da absorvância a 280 nm e a actividade da enzima foi analisada por hidrólise de ΒΑΡΝΑ.

As fracções contendo quimopapalna foram reunidas e dial_i sadas extensivamente contra água destilada e desionizada ou EDTA aquoso (1 mM) e criodessecado para armazenamento.

Exemplo 21 - Purificação de quimopapaína - Resultados do ensaio de ΒΑΡΝΑ (i) Látex de Carica papaya, seco por aspersão, comercial (1 g) obtido em Powell & Scholefield, U.K., foi agitado em água (5 ml) durante 60 minutos a 20°C. 0 material insolúvel foi removido por centrifugação a 9000 x g durante 30 minutos a 4°C. 0 bolo foi rejeitado e o pH do sobrenadante foi ajustado a pH 1,8 pela a-dição, gota a gota, de ácido clorídrico (1 M) durante um período de 20 minutos. A mistura foi agitada durante 15 minutos a 4°C e a-pós 5 minutos verificou-se o pH e ajustou-se, quando necessário. (ii) 0 precipitado foi removido por centrifugação a 9000 x g durante 30 minutos a 4°C. (iii) (a) 0 sobrenadante foi ajustado a pH 7,0 por adição, gota a gota, com agitação, de hidróxido de sódio aquoso (5 M). 0 precipitado foi removido por centrifugação a 9000 x g durante 30 minutos a 4°C. -53- y/ 4 J · 70 912 WAF/CRF/P/271 (b) O sobrenadante resultante foi aplicado a uma coluna de permuta catiónica Mono S HR 10/10 (Pharmacia), que tinha sido previamente equilibrada com Na2HP0^/NaH2P0^ (Na+ 50 mM) contendo EDTA (1 mM), pH 7,2 (tampão A). A seguir à aplicação da amos tra, a coluna foi lavada (2 ml/min.) com tampão A até a A2gg regressar a zero. Aplicou-se depois um gradiente (27 mM de Na+/ml ) a Na2HP0^/NaH2P0^ (Na+ 0,80 M) a uma coluna e recolheram-se fracções de 4 ml. As fracções foram analisadas quanto à actividade contra ΒΑΡΝΑ. 0 pico grande de quimopapaína, determinado imunologicamente, eluiu entre 0,17-0,28 M de Na+. As fracções activas entre ΒΑΡΝΑ nesta região foram reunidas e adicionou-se etanodiol a 33¾ (v/v). Todas as outras fracções, incluindo as activas contra ΒΑΡΝΑ no último pico de eluição (0,47-0,59 M de Na+) de papaia-proteínase III, foram rejeitados. (iv) Uma coluna (15 ml de vol. de leito) de ECH-Sepharo-

D se acoplado a L-Ala-L-PheSc (preparada como se descreveu no Exemplo 10) foi lavada (39 ml/h/cm^) com Naf^PO^/Na^PO^ aquoso (Na*50 mM) contendo EDTA (1 mM) em etanodiol (33¾) (v/v), pH 6,8 (tampão de aplicação). A quimopapaina reunida (anterior) foi activada pela adição de base cisteína (concentração final de 4 mM) e deixada durante 15 minutos a 0°C. Aplicou-se então ã coluna, seguindo-se 60 ml de tampão de aplicação. (v) Aplicou-se então tampão de acetato de sódio (50 mM), pH 4,5, contendo HgCl2 (10 mM, 45 ml). Recolheram-se fracções de 5 ml. As fracções foram analisadas relativamente à actividade contra ΒΑΡΝΑ.

As fracções contendo o pico de actividade que foi retardado pela coluna e eluído pelo tampão contendo HgCl2 foram reunidas e novamente aplicadas ò coluna Mono S. A coluna foi lavada com tampão A e em seguida aplicaram-se à coluna 7 vol. de leito de tarn pão A contendo base cisteína (4 mM). 0 fluxo foi interrompido durante 30 minutos para permitir que o mercúrio fosse deslocado da enzima. 0 fluxo foi então recomeçado e a coluna foi de novo lavada com tampão A antes da aplicação de um gradiente de até NaH2P0^/Na2 HP04(Na+ 0,80 M) como descrito anteriormente. As fracções activas

70 912 WAF/CRF/P/271 -54- contra ΒΑΡΝΑ foram combinadas, adicionou-se base cisteína (concentração final de 4 mM) e o conjunto foi deixado a 0°C durante 15 πΰ nutos.

Empacotou-se resina Chelex (Bio-Rad, U.K; 0,5 g) numa c£ luna e foi lavada com tampão A. 0 conjunto contendo quimopapaína foi passado através da coluna de Chelex, e depois foi extensivameri te dialisado em EOTA aquoso (1 mM) e criodessecado. 0 decurso da purificação de quimopapaína é sumarizado no

Quadro 2.

7l i 12 WAF/CRF/P/271 -55-

Purificação da Quimopapaína

0) X3 CO Ό O < 0) XJ CO T3 4J O < co o (4 KO CO CJ> Q. CO C0 u crv VO LTV Κι GO O •H CL ΙΛ o VO S3 SD 4J L- 3 ·. •k •k •k co Ή X) ·—i ο CM Kl Kv KV U 4-> 3 0) O. .D 3 CO H- E o D 4-> c E 0) Ό3 E '-' o co K\ a\ CJ\ J3 •H NO o CM CS E X) N-' r-H co c cu cc «t z CO Ql u H < 4-J 1 m c σ> o E CO α (4 * CD 4-> co «X 0) o rH VO α CS <t c o Z T3 CSI SO O σ\ SJ CM o O. CO H \£J Kl ο o i—1 α (4- «t T3 •k •k •k •H co •H CM <r 0) α c XI (U 3 co α -W XJ co •H (U > •Ή * 4-> < U z m Q_ CO CM vo GO ιΛ r-~ r—i <. (U H ΓΛ <r CD o 03 C0 x> S3 r- VO κι XI CO ·* *> ·* ·* *k •k <0 T3 ΡΛ cc ΓΛ CM <3· ΓΛ o t-í •H CJ\ ΓΛ Kl Η 4-> c <f CM H c c 3 03 o E o •H "O c co 03 c Í4 S-4 /*S 1“^ CD ιΛ ΙΛ ω cn <* sj ιΛ »k ·—1 •k □ ε Kl •-H C3 o CM i—1 NX3 u CL O x> CO +3 o 1 ο 1 c K0 3 cn 3 03 co E 03 E CD u o u d U 03 03 "O 03 CL 03 U Q. •H Q. CL CL CO C3 -J CO CO xo 03 03 XJ CO XJ Ω u E Ή 4-> o O CO < CO c α u •H CO 1 •H C0 03 L- C3 -J U- O E Ο □ C0 ·Η C0 ·Η •H ο 4J u c 03 t* c XJ 03 c CTO 0) CJ"0 c CO 03 O *H O O -H 03 E 4-> 4J u +3 4-> X X CO co co co co co 03 03 u E O JZ E C3 o -U co o CL O 03 CO C-I o 03 u CO .c -J »— C_> 4J lΛ O 4-> CJ 0) CO CO c "H 0) 4-> O u CL ) co H co CL CO Q. ai co c Ή co α co α Método de Ensaio ΒΑΡΝΑ NS2 * 70 912 WAF/CRF/P/271

Exemplo 22 - Preparação de anticorpos IqG específicos de quimopapaína desenvolvidos em coelho

Carboximetilou-se, moderadamente, quimopapaína pura, como a descrita no Exemplo 21, antes da utilização, pelo método descrito por Zucker et al (1985) 1oc. cit. 0 anti-soro para quimopapaína foi desenvolvido num coelho por injecção intramuscular de 360 da proteína carboximetilada um adjuvante completo de Freund, seguido após uma quinzena por uma injecção subcutânea de 100 Jfq em adjuvante incompleto. Purificou-se parcialmente IgG a partir de ajn ti-soros por fraccionamento com sulfato de amónio como descrito por Heide e Schwick (1978) loc. cit, seguindo-se diálise em fosfato de sódio aquoso (10 mM) contendo NaCl (0,14 M), pH 7,3.

Exemplo 23 - Purificação de quimopapaína e quantificação

imunolóqica de quimopapaína e PPIV (i-iii) Preparou-se látex de Carica papaya, seco por aspersão, comercial (1 g) obtido em Powell & Scholefield, U.K. sujeitou-se a um tratamento a pH 1,8 como se descreveu no Exemplo 21 (i-iiia). (iv) Lavou-se uma coluna (15 ml de vol. de leito) de ECH-Sepharose acoplada a L-Ala-L-PheSc (preparada como se descreveu no Exemplo 10) como se descreveu no Exemplo 21 (iv). 0 sobrenadante final do tratamento a pH 1,8 foi dialisado em NaH2P0^/Na2HP0^ (Na+ 50 mM) contendo EDTA (1 mM) em etanodiol (33% v/v) pH 6,8 (tampão de aplicação), centrifugado a 4000 x g durante 10 minutos e o sobr£ nadante foi activado pela adição de ditiotreitol (concentração final de 2mM) durante 15 minutos a 20°C. Aplicou-se então à coluna de afi nidade (39 ml/h/cm ) e em seguida por 60 ml de tampão de aplicação. Aplicou-se, á coluna, tampão de citrato de sódio (50 mM) pH 4,5, contendo EDTA (1 mM) e metilpiridildissu1fet o (30 mM; 15 ml) tizado como descrito por Salih et al., Biochem, J. (1987), 247, 181 — -1937. 0 fluxo foi interrompido e o tampão contendo dissulfeto foi deixado na coluna durante a noite (18 horas) a 20°C. (v) 0 fluxo recomeçou com a adição de 45 ml do mesmo tam- -57- 70 912 WAF/CRF/P/271 pão contendo metilpiridil dissulfeto seguida por 30 ml de tampão de aplicação. Recolheram-se fracções (5 ml).

As fracções foram analisadas relativamente à actividade contra ΒΑΡΝΑ. As fracções contendo o pico de actividade que foi retardado pela coluna e elúido no tampão contendo metilpiridildissul-feto foram reunidas e aplicadas (40 ml/h/cm ) a uma coluna (80 ml

D de vol. de leito) de Sephadex LH-20 (Pharmacia) que tinha sido e-quilibrada com EDTA aquoso (1 mM) em etanodiol (33% v/v). Continuoij -se a cromatografia pela aplicação de 300 ml deste tampão. As fracções (8 ml) foram monitorizadas por /^27^ e analisadas relativamente à actividade contra ΒΑΡΝΑ.

As fracções compreendendo o pico de actividade contra ΒΑΡΝΑ (que foi seguido por mais um pico de ^271^ foram reunidas e jí plicadas a uma coluna de permuta catiónica Mono S HR 10/10 e proces sadas como descrito no Exemplo 21 (iiib). As fracções activas contra ΒΑΡΝΑ foram combinadas. 0 látex seco por aspersão e 0 material recuperado do tratamento a pH 1,8, cromatografia de afinidade e cromatografia de pe£ muta catiénica, foram analisados relativamente à presença de PPIV por imunodifusão radial simples como se descreveu anteriormente. U-sou-se 0 mesmo método para a quantificação da quimopapalna, com um anticorpo mono-específico para quimopapaína desenvolvido em coelho, preparado como se descreveu no Exemplo 22. A curva padrão para quiino papaína foi gerada pela utilização de quimopapaína purificada pelos métodos aqui descritos e mostrou-se por imunodifusão radial simples isento tanto de PPIV como de PPIII. 0s resultados são apresentados no Quadro 3. -58- WAF/CRF/P/271

Quadro 3

Purificação de quimopapafna e quantificação _imunoléqica de quimopapafna e PPIV_

Proteína (mg) Actividade especifica contra ΒΑΡΝΑ (unidades mg-^) Quimopapaína (mg) PPIV (S da proteí_ na total ) Látex seco por aspersão 468 1,000 144 18,7 Tratamento com ác_i do 157 1,433 92 <0,1 Sepharose-L-Ala-L- -PheSC 24 4,000 28 t Cromatografia de permuta catiónica 15 3,533 14 t -j- = não detectado * Método de Ensaio ΒΑΡΝΑ N2 2

Exemplo 24 - Estudo sobre alergia a quimopapafna

Adquiriram-se quarenta amostras de soro humano em 3M Dia-gnostic Systems, EUA. Estas amostras já tinham sofrido um teste comercialmente disponível, conhecido pelo nome comercial Chymofast, relativamente a IgE contra uma forma de quimopapalna comercialmente p disponível, Chymodiactin . Vinte das amostras tinham sido designadas por Chymofast positivas e vinte eram negativas. Receberam-se as quarenta amostras como "cegas" e foram testadas relativamente aos

R anticorpos IgE adquiridos naturalmente, contra Chymodiactin , PPIII PPIV e contra quimopapaína purificada (purificada por métodos aqui descritos e isenta de PPIV e PPIII, como se observou por imunodifu- -59- 70 912 WAF/CRF/P/271 são radial simples) usando um ensaio de imuno-sorvente ligado a enzima, de fase sólida, modificado (ELISA) utilizando o sistema bioti na-avidina, sumarizado como se segue:

Placas de microtitulação revestidas com: Antigénio de teste l

Soro de teste i

IgE monoclonal anti-humana

Ig de coelho anti-ratinho biotinilada i

Complexo avidina-peroxidase i

Substrato (ABTS)

I

Paragem e medição A^g

D

Usou-se Chymodiactin dentro do prazo de validade, a PPIV foi purificada como se descreveu aqui e a PPIII foi purificada de acordo com Buttle e Barrett (1984), loc. cit. Antes da utilização, todos os antigénios foram inactivados por carboximetilaçâo moderada com ácido iodoacético (10 mM) como descrito por Buttle e Barrett (1984), loc . cit..

Os alvéolos de uma placa de microtitulação foram revestidos com antigénio de teste, incubando cada alvéolo com 100 jul de a£ tigénio de testé (10 /ig/ml) em tampão de carbonato de sódio (0,05M, pH 9,6). Usou-se, então, soro de cavalo dador (4¾) para reduzir a ligação não específica durante os passos subsequentes. A incubação com o soro de teste (diluição 1/20) em PBS (Tween 0,l?í, soro de cavalo 2%, EDTA 10 mM, 50 j<g/ml de heparina; pH 7,2 (100 y».l/alvéolo) a 37°C durante 4 horas foi seguida por IgE monoclonal anti-humana (preparada como descrito por Kemeny & Richards em J. Immunol . Me-thods (1988), 108, 105 - 1 jug/ml, 100 jUl/alvéolo) a 37°C durante 3 horas e em seguida por imunoglobulina biotinilada de coelho anti--ratinho (obtenível em Dakopatts, Dinamarca - 1 ^.g/ml, 100 >d/alvé-olo) à temperatura ambiente, durante a noite. Os alvéolos foram in- -60- -60- 70 912 WAF/CRF/P/271

Zr**' cubados durante 30 minutos a 37°C com avidina-peroxidase (10 Al/ml, 100 Λΐ/alvéolo), adicionou-se substrato /2,2-azinobis(ácido 3-etil-benzotiazolina-sulfónico), ABTS, 0,5 mg/ml7 em tampão (ácido cítrico 100 mM, Na2HP0^ 200 mM, pH 4,2, .activado com 1 xl/ml de H2O2) e incubaram-se os alvéolos à temperatura ambiente durante 30 minutos. A reacção foi interrompida por adição de 100 xl/alvéolo de ácido cl^ tricô 100 mM, NaN^ a 0,01¾ e a absorvância a 410 nm para cada alvéjo lo foi determinada usando um leitor Micro ELISA (Dynatech). Os padrões de IgE foram ensaiados na gama de 0,075 a 4,8 ng/ml (2,4 ng de IgE = 1 Unidade Internacional de IgE). Usou-se o programa Enz-fitter (Leatherbarrow, R.J. 1985, Enzfitter para IBM PC, Elsevier--Biosoft, 68 Hills Road, Cambridge CB2 1LA, UK para calcular as cojn centrações de IgE dirigidas contra cada uma das quatro preparações

D de antigénio, Chymodiactin , PPIII, PPIV e quimopapaína preparada como se descreveu no Exemplo 23.

Das 40 amostras de soro testadas 26 continham anticorpos p

IgE contra Chymodiactin e no Quadro 4, abaixo, apresentam-se os vji lores obtidas para PPIII, PPIV e quimopapaína, dos doze valores

R mais reactivos contra Chymodiactin . Os valores da média e do erro padrão foram obtidos a partir de nove determinações.

Pode ver-se que, de 12 amostras de soro contendo anticorpos anti-Chymodiactin, só em duas a resposta anti-quimopapaína representa a resposta IgE principal e que os anticorpos contra PPIII e PPIV são responsáveis por aproximadamente 75¾ da IgE relevante d£ tectada. 7 312 WAF/CRF/P/271 -61-

Quadro I I-Í 3 CD C cr CO CO \o CM ON fA CO CD 0 σ\ GD CM □ CL H CM <"4 CM CM »-4 ía <3* CM *-4 05 co TD a o S? E i—1 a\ ΓΑ CS co 0 a* H lA CO r- IA co o -P vo CM σ\ m r- fA LíN fA r4 iA ΓΑ u o <r i-4 a ►— W d) Ό 05 0C (Λ r* ca c co X ΙΛ ΓΑ H fA O CM CM CM t“4 0 CM p •H c a. 4-> 4J VH Ld <-4 0 0 0 0 O O O o 0 o 0 0) o ca o co a. ε •H co ca "Ό CL ◦ o ca E E E •H CM CSI CM VO ΓΑ 0\ IA r* lA ΓΑ 0) >s •H “O SL D ND CO fA c-4 <4 *"4 0 0 ^4 «-4 0 0 CM CJ cr 2: »4 E CO \ u 13 -M 1—4 c W o *-4 σ\ σ\ u 2: r* H fA CM CM 0 CM H 0 o CM 0 a- ca Ld UJ r—4 O o 0 0 0 0 0 0 0 0 o u σι •H 4—4 1-4 «4- 1—4 VH CO 1-4 u o a_ ai a- Q. a u 0) o co GO 0 fA 0 fA MJ i-H fA fA <3 <3 0) o •H •H X) CO <r CM CM CM 0 *-4 »-4 0 0 H 0 UI -P ND H σ> c X M4 co a> o TD TJ c co 05 0) -P X Γ- fA a- »"4 CM CM CM i-4 CM H i-4 IO c 0- o» □ Ld r—j 0 0 0 CD 0 0 0 0 0 □ 0

ca u 4Jc<υ υc□ CJ Q.O.

CO σ\ »-4 C5\ CS <r •-4 MJ 0 LA 0 MD MJ •H "D M) X 19 LA LA p-4 fA fA CM CM i-4 *—1 IA O ca -w moε<

^HCM^MfiAMJr^GOCJNO

CM

Total 50,5 35,2 23,6 109,3 Média 22 70 912 WAF/CRF/P/271

Exemplo 25 - A inibição das misturas de quimopapaína e PPIV por cistatina de galinha A quimopapaína foi purificada como se descreveu no Exemplo 23 e padronizada por titulação de sítio activo com E-64, usando ΒΑΡΝΑ como substrato (Zucker et al. , 1985, Biochem. Biophys. Acta 828, 196-204). Titulou-se também PPIV, purificada como se dejj creveu anteriormente, com E-64, por uma adaptação deste método para utilização de azocaselna como substrato. A cistatina de galinha, forma 2, foi purificada como desi crito por Anastasi et al . 1983, Biochem. J. 211, 129-138 e padronjt zada por titulação com papaína que tinha sido previamente titulada com E-64.

Os ensaios de hidrólise de azocaselna foram feitos pelo método de Rowan et al . , 1988, 1 oc. cit., com excepção de se ter ir» corporado uma pré-incubação, das enzimas e inibidor, de 15 minutos, a 40°C, antes da adição do substrato.

Tomaram-se dois conjuntos de 9 tubos e colocaram-se em cada tubo 125 /d de tampão de fosfato de sódio 0,40 M contendo EDTA 4 mM e base cistelna 16 mM, pH 6,8. Adicionaram-se a quimopapaína e a PPIV, em razões variáveis até uma concentração final de protei-nase de 100 nM. A um conjunto de tubos adicionou-se cistatina de galinha até uma concentração final de 1 /iM e ao outro conjunto adi-cionou-se o mesmo volume de água. Os tubos foram então pré-incuba-dos e analisados relativamente ã actividade hidrolisante de azocaselna. 0 efeito da cistatina de galinha na hidrólise de azocaseí na pelas misturas de enzimas foi expressa em percentagem de inibição da actividade produzida pelas mesmas misturas de enzimas na ausência de cistatina, como se mostra no Quadro 5. 70 912 WAF/CRF/P/271

-63- Quadro 5 A percentagem de inibição de misturas de quimopapaina e PPIV por cistatina de galinha PPIV (nM) Quimopapaina (nM) A366 -cistatina A366 +cistatina 0' /0 Inibição 100 0 0,092 0,094 0 80 20 0,158 0,102 35,4 70 30 0,191 0,088 54,0 60 40 0,316 0,06 80,0 50 50 0,347 0,058 83,3 40 60 0,428 0,066 84,5 30 70 0,543 0,028 94,8 20 80 0,588 0,033 94,4 0 100 0,733 0,008 98,9

Pode ver-se que o grau de inibição por cistatina de galinha está inversamente relacionado com a concentração de PPIV.

Exemplo 26 - Purificação de quimopapaina por precipitação ácida a pH 2,2 - 1,2 i) Látex de Carica papaya seco por aspersão^, comercial, obtido na Powell & Scholefield UK, foi ajustado até 2Q?í (p/v) com á-gua destilada e agitado durante 1 hora. 0 material não dissolvido foi removido por centrifugação a 9000 x g durante 30 minutos a 4°C. 0 bolo foi rejeitado e o pH do sobrenadante foi reduzido pela adição, gota a gota, de ácido clorídrico (1 M) com agitação a 4°C, a uma taxa de 40 ^l/min./ml. 0 pH da mistura foi continuamente monit£ rizado usando um eléctrodo combinado Radiometer (Tipo GK 2401C) calibrado com padrães tampão de pH 4,01 e pH 1,09 (Radiometer, 25°C). Parou-se a adição de ácido a pH 2,2 e a intervalos de 0,2 unidades 70 912 WAF/CRF/P/271

de pH abaixo deste valor, até pH 1,2, e manteve-se o pH constante enquanto a agitação a 4°C continuava. Removeu-se uma aliquota (equi^ valente a 10 ml da solução inicial) e armazenou-se. Continuou-se a adição de ácido à solução remanescente até se atingir o intervalo de pH seguinte. ii) Todas as amostras foram centrifugadas a 9000 x g durante 30 minutos a 4°C e os bolos foram rejeitados. iii) 0 pH de cada sobrenadante foi ajustado a pH 6,8 por adição, gota a gota, (400 /il/min) de NaQH (1 M). Cada amostra foi de novo centrifugada a 9000 x g durante 30 minutos para remover qualquer precipitado adicional.

Numa outra experiência realizou-se a precipitação ácida a pH 1,8 a 25°C.

Os sobrenadantes finais foram analisados relativamente à actividade contra ΒΑΡΝΑ e quanto à presença de PPIV e quimopapaína de acordo com o invento, por imunodifusão radial simples, como se descreveu anteriormente. Os resultados são apresentados no Quadro 6 e indicam que a remoção de PPIV a níveis <0,1% da proteína total foi conseguida por precipitação ácida a 4°C a pH 1,8 e inferior a níveis <0,5% por precipitação a 25°C a pH 1,8. -65-7 Γ ^12WAr /ÇRF/P/271 soο u 3 CD □ θ' co 3 ra c à? r*H 0) CD -U 4-J > O O hH u 4J Q_ CL Q_

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Exemplo 27 - Preparação de Anticorpos IqG mono-específi-cos desenvolvidos em carneiro

Quimopapaina pura, preparada como se descreveu no Exemplo 21, foi carboximetilada, moderadamente, antes da utilização, pelo método descrito por Zucker et al (1985 ) 1oc. cit. e dialisada em fosfato de sódio aquoso (10 mM), pH 7,3 contendo NaCl (0,14 M). 0 anti-soro contra quimopapaina foi desenvolvido num carneiro por in-jecção intramuscular de 100 ;*g de proteína carboximetilada em adjuvante completo de Freund, seguida, após um mês, por 50 uq administrados do mesmo modo. A IgG foi parcialmente purificada a partir de anti-soros por fraccionamento com sulfato de amónio como descrito por Heide e Schwick ( 1978) loc. cit. , seguido por diálise em fosfato de sódio aquoso (10 mM) contendo NaCl (0,14 M), pH 7,3.

As preparações de IgG de anticorpos contra papalna, pa-paia-proteinase III e papaia-proteinase IV foram preparadas de maneira idêntica.

Os antigénios carboximetilados individuais foram acoplados separadamente, de acordo com as instruções dos fabricantes, a colunas fornecidas sob o nome comercial Zetaffinity (Anachem) equilibradas em fosfato de sódio aquoso (10 mM), pH 7,3 contendo NaCl (0,14 M). Os anticorpos potencialmente contaminantes ou de reacção cruzada foram retirados das preparações de IgG, por absorção, fazeri do-os passar através daquelas colunas, de modo que as preparações de IgG finais deram reacções de precipitação com os seus antigénios correspondentes mas não deram reacções cruzadas de precipitação com os antigénios diferentes. As colunas com o antigénio ligado foram regeneradas para reutilização com dietilamina aquosa (0,05 M), pH 11,5 e prontamente reequilibradas em tampão de fosfato.

Prepararam-se deste modo preparações mono-específicas de anticorpos IgG contra quimopapaina, PPIII, PPIV e papalna que podem ser usadas em ensaios quantitativos para cada antigénio por imunodi_ fusão radial simples como se descreveu anteriormente.

Exemplo 28 - Purificação de quimopapaina-precipitação ácida a pH 1,5 70 912 WAF/CRF/P/271

i) Agitou-se em água desionizada e destilada (previamente arrefecida a 4°C, 250 ml), látex de Carica papaya seco por aspersão, comercial, (20 g) obtido em Siebels, USA, durante 60 minutos a 0°C. 0 pH da mistura foi ajustado a pH 1,5 pela adição de HC1 (1 N) a u-ma taxa de 10 A(l/min./ml durante monitorização contínua de pH usando um eléctrodo combinado Radiometer (Tipo GK 2401C) calibrado com padrões de tampão de pH 4,01 e 1,09 (Radiometer, 25°C). Quando se a tingiu pH 1,5, deixou-se estabilizar o pH durante um período de 10 minutos, tempo durante o qual o pH foi reajustado, se necessário. ii) A mistura foi centrifugada a 12000 x g durante 30 minutos a 4°C e o bolo foi rejeitado. iii) (a) 0 pH do sobrenadante foi ajustado a pH 7,0 pela adição de NaOH (1 M) a uma taxa de 10 jul/min./ml durante monitoriz_a ção contínua do pH usando o eléctrodo Radiometer calibrado com padrão tampão de pH 7,01 (Radiometer 25°C). Quando se atingiu pH 7,0, deixou-se o pH estabilizar durante um período de 10 minutos, tempo durante o qual o pH foi reajustado, se necessário. A mistura foi centrifugada a 12000 x g durante 30 minutos a 4°C e o bolo foi rejeitado. (b) 0 sobrenadante foi dialisado extensivamente a 4°C contra 30 volumes de água desionizada e destilada, sendo feitas duas mudanças a intervalos de 12 horas. A solução dialisada foi ainda purificada por cromatogra-fia de permuta catiónica numa coluna S-Sepharose Righ Performance 35/100 (Pharmacia). Em cada passagem usou-se um máximo de 3 g de proteína (determinado por ^gg). A coluna foi previamente equilibrji da com EDTA aquoso (1 mM) a 4°C. A seguir ò aplicação da amostra, a coluna foi lavada com EDTA aquoso (1 mM) a 10 ml/min. até a A2qq regressar a zero.

Aplicou-se à coluna um gradiente (0,175 mM K + /ml) a K+ 0,5 M e recolheram-se fracções de 25 ml. As fracções do pico foram analisadas relativamente ã actividade contra ΒΑΡΝΑ.

As fracções contendo quimopapaína com a actividade espec^ fica contra ΒΑΡΝΑ mals elevada (eluídas entre 0,17 e 0,22 M de K+) foram reunidas. A quimopapaína reunida foi extensivamente dialisada 'Ή . *

70 912 WAF/CRF/P/271 -68- e destilada, sendo feitas cinco mudanças a intervalos de 12 horas. 0 dialisado foi criodessecado e armazenado a -20°C. 0 procedimento de purificação completo foi repetido em várias ocasiões. A presença de quimopapaina de acordo com o invento, papaína, PPIII e PPIV foi analisada usando imunodifusão radial simples, como se descreveu anteriormente e anticorpos desenvolvidos em carneiro como se descreveu no Exemplo 27. A actividade contra ΒΑΡΝΑ e a titulação de sítio activo com ácido iodoacético foram determinadas usando o Método de ΒΑΡΝΑ N9 l descrito anterior-mente. A progressão das purificações é sumarizada pelos valores mé dios apresentados no Quadro 7.

J 69- 70 912 F/CRF/P/271 Γ' ο u Ό (0 3 σ

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Exemplo 29 - Purificação de quimopapaína-precipitação ácida a pH 1,5 e cromatoqrafia de afinidade i-iii) Preparou-se látex de Carica papaya seco por aspe_r são, comercial, (50 g), obtido de Siebels, USA e submeteu-se a um tratamento a pH 1,5 como descrito no Exemplo 28 (i-iiia). 0 sobre-nadante foi dialisado extensivamente a 4°C contra 30 volumes de á^ gua desionizada e destilada, sendo feitas duas mudanças a intervalos de 12 horas. iv) Equilibrou-se uma coluna (350 ml de volume de leito)

R de ECH-Sepharose acoplada a L-Ala-L-PheSc (preparada como se descreveu no Exemplo 10) com etanodiol aquoso (33¾ v/v) contendo acetato de sódio (50 mM), pH 4,5, durante a noite, e, em seguida equ_i librou-se com NaH2P0^/Na2HP0^ aquosos (Na+ 50 mM) contendo EDTA (1 mM) em etanodiol (33¾ v/v) pH 6,8 (tampão de aplicação). 0 sobrenadante dialisado (anterior) foi filtrado, usando um filtro de tamanho de poro de 0,2 jutn, e adicionou-se etanodiol até 33¾ (v/v). 0 pH da solução foi verificado e ajustado a pH 7,0, se necessário. Adicionou-se L-cisteína aquosa (200 mM), preparada de fresco, até uma concentração de 4 mM, a solução foi bem misturjj da e deixada repousar durante 15 minutos a 4°C. Aplicou-se então à coluna de afinidade a 4°C a um caudal de até 40 ml/h/cm^. A colu na foi lavada com 10 volumes de leito de tampão de aplicação. v) A quimopapaína foi elufda com 3 volumes de leito de HgCl2 aquoso (10 mM) em etanodiol (33¾ v/v) contendo acetato de s^5 dio (50 mM), pH 4,5 e recolheram-se fracçães de 25 ml. As fracções contendo actividade contra ΒΑΡΝΑ foram reunidas e ainda purificadas, por cromatografia de permuta catiónica numa coluna S-Sepharo-se High Performance 35/100 (Pharmacia). A coluna foi previamente equilibrada com EDTA aquoso (1 mM) a 4°C. A seguir à aplicação da amostra, a coluna foi lavada com EDTA aquoso (1 mM) a 10 ml/min. até a A2qq regressar a zero. Aplicaram-se à coluna três volumes de leito de I^HPO^/KI-^PO^ aquoso (K+ 50 mM) pH 7,2 contendo EDTA (1 mM) e L-cisteína (500 mM) e interrompeu-se fluxo durante 30 minutos. Aplicaram-se à coluna mais três volumes de leito de tampão de cisteína, preparado de fres 70 912 WAF/CRF/P/271 -71-

co, e interrompeu-se o fluxo durante 30 minutos. A coluna foi lava da com mais seis volumes de leito de tampão de cisteína e, em seguida, reequilibrada com I^HPO^/Kh^PO^ aquoso (K+ 50 mM) contendo EDTA (1 mM), pH 7,2.

Aplicou-se um gradiente (0,175 mM de K+/ml) a K+ 0,5 M ò coluna e recolheram-se fracções de 25 ml. As fracções de pico foram analisadas relativamente à actividade contra ΒΑΡΝΑ. 0 primeiro pico, que eluiu entre 0,2 e 0,25 M de K+, era de quimopapalna. 0 segundo pico, que eluiu a cerca de 0,45 M de K+, era de papaia-pro teinase III.

As fracções contendo quimopapalna com a actividade especifica contra ΒΑΡΝΑ mais elevada foram reunidas. A quimopapalna reunida foi extensivamente dialisada a 4°C contra 30 volumes de á-gua desionizada e destilada, sendo feitas cinco mudanças a intervja los de 12 horas. A quimopapalna eluída da coluna de permuta catiónica tinha sido activada pelo tampão de cisteína e estava, portanto, sus-ceptlvel à inactivação por oxidação. De modo a evitar ou reduzir substancialmente a inactivação da enzima activa, por oxidação, recolheram-se fracções em tubos contendo uma suspensão de tetrationjj to de sódio (200 ml) para dar uma concentração final de 5 mM de NaS^O^ em cada fracçlo. Alternativamente, a quimopapalna reunida foi dialisada sob azoto contra água que tinha sido purgada de oxigénio, fazendo borbulhar azoto a uma taxa de 0,1 1/min. durante 30 minutos num recipiente selado sob azoto.

Finalmente, o dialisado foi criodessecado e armazenado a -20°C. 0 procedimento de purificação completo foi repetido em várias ocasiões e a progressão das purificações (analisadas como se descreveu no Exemplo 28) é sumarizada pelos valores médios a p re sentados no Quadro 8. 72-70 912WA' ÇRF/P/271 cc□ u T3 CD D θ'

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Exemplo 30 - Purificação de quimopapaína-precipitação ácida a pH 1,5 e cromatoqrafia de afinidade i-iii) Preparou-se látex de Carica papaya seco por asper são, comercial, obtido de Siebels, EUA, e submeteu-se a um tratamento de pH 1,5, a diálise e cromatografia de permuta catidnica em p S-Sepharose como descrito no Exemplo 28. iv) As fracções contendo quimopapaína com a actividade específica mais elevada contra ΒΑΡΝΑ foram reunidas e adicionou-se etanodiol até 33?ó (v/v). Adicionou-se L-cisteina aquosa (200 mM), preparada de fresco, até uma concentração de 4 mM e a solução foi p aplicada a uma coluna de ECH-Sepharose acoplada a L-Ala-L-PheSc como se descreveu no Exemplo 29 (iv). v) Eluiu-se a quimopapaína com 3 volumes de leito de HgCl £ aquoso (10 mM) em etanodiol (33% v/v) contendo acetato de sj5 dio (50 mM), pH 4,5 e recolheram-se fracções de 25 ml. As fracções contendo actividade contra ΒΑΡΝΑ foram reunidas e dialisadas extern sivamente a 4°C contra 30 volumes de água desionizada e destilada, sendo feitas cinco mudanças a intervalos de 12 horas. 0 dialisado foi criodessecado e armazenado a -20°C. A progressão da purificação (analisada como se descreveu no Exemplo 28) é sumarizada no Quadro 9. -74-70- 912W* /CRF/P/271 cp

Quadro o| 1 CD h o c CL 44 H *“4 o i-H o V4 Ό •k •k z •k z CO 03 o o o o o CL Ό c <—«k V V V V α M •—1 cl à? 0) CO 44 44 o| U o 1—1 CL 44 »-4 VO ΙΛ lA CM a i-H o ►-4 a> o <H p-4 CM «k , z •k z CL •Ό c N O o CL M •H V V a? 0) CD 44 44 o| 1 u □ CL 4J > pH CM Ή H »-4 ω CS lA «k •k •k α o •k a. TJ c CM O O o z z O CL M H V V V a? 0) CS 44 44 a M| c 0) M 44 a o a. (4 pH a CL ca r» 00 lA H o o o a 44 CVI CM r" σ\ z o z □ 0) o E T) 44 •H 3 a? ca O V»/ c 03 CD o O •H > •H «σ CM ο CO σ' 44 H a? fA CM lA r- CD 00 Ό •H 44 CO o α (0 4-1o ) Ό > θ' CO •H «I £ "D <4_ z CM CS Ό fA lA •H •H CL m (Λ ΙΛ —4 O <f 00 > O C ω Ό θ' H CM lA •H 03 CD TJ H H ^4

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Exemplo 31

Duas preparações de quimopapaína de acordo com o invento foram ensaiadas usando os Métodos de Ensaio de ΒΑΡΝΑ 1 e 2, no mejs mo dia. A proteína foi estimada em peso seco total. A preparação de quimopapaína A provém de um procedimento de purificação como o descrito no Exemplo 28. A preparação de quimopapaína B provém de um procedimento de purificação como o descrito no Exemplo 29 (fra£ ções finais recolhidas em tetrationato de sddio). Os resultados dos ensaios, realizados em triplicado, são os apresentados no Quadro 10.

Quadro 10

Actividade Específica para ΒΑΡΝΑ (Unidades mg Preparação de Quimopapaína Método de Ensaio Método de Ensaio N2 l N9 2 A 855 2227 B 1261 3591

Exemplo 32 A quimopapaína purificada como se descreveu no Exemplo 29 e dialisada sob azoto como se descreveu aí foi criodessecada e armazenada a -20°C. A quimopapaína criodessecada tinha uma activi-dade específica contra ΒΑΡΝΑ (1 mM) a 37°C e pH 6,0 de 1345 unidades por mg.

Para preparar 100 frascos de uma composição compreendendo quimopapaína, perfaz-se 43,75 g de solução a granel, como se des creve abaixo. A solução a granel é mantida a 4-12°C ao longo do pro 70 912 WAF/CRF/P/271

-76- cessamento.

Adiciona-se mono-hidrato de hidrocloreto de L-(+) cisteí-na (166 mg) a cerca de 30 g de água para injecção de modo a proporcionar uma concentração de 22 mM no volume final. 0 pH da solução é ajustado a pH 5,0-3,5 com NaOH (1 M) ou HC1 (0,1 Μ). A solução de cisteína é adicionada à quimopapaína purificada (358 mg) para proporcionar uma concentração de 11000 unidades/ml no volume final. 0 pH da solução agitada é ajustado a pH 5,9-6,1 com NaOH (1 M) ou HC1 (0,1 M) e perfaz-se a 43,75 g com água para injecção. A solução é esterilizada, fazendo-a passar através de dois filtros, de tamanho de poro de 0,2 micron, em série. Enchem-se 100 frascos de vidro de 5 ml com alíquotas de 0,4 g. Os frascos são fechados, a água é remo vida por criodessecação sob pressão reduzida e os frascos contendo o produto liofilizado são selados sob vácuo.

Cada frasco contém um pó branco amorfo contendo 3,27 mg de quimopapaína e 1,52 mg de hidrocloreto de cisteínato de sódio (nominalmente 4000 unidades e 8 wmoles, respectivamente, permitindo 10¾ de excesso). As composições são, em geral, reconstituídas imed_i atamente antes da utilização, por adição de 2 ml de água para inje£ ção, para dar uma solução injectável contendo, nominalmente, 4000 unidades de quimopapaína e L-cisteína 4 mM.

Claims (3)

1. 70 912 WAF/CRF/P/271 -77- REIVINDICAÇÕES 1 - Processo de purificação de quimopapaína caracterizado por compreender: A. a) incubar uma solução aquosa de quimopapaína em bruto com uma matriz de cromatografia de afinidade dirigida a sítios activos, compreendendo uma matriz de suporte ligada covalentemente, opcionalmente através de um braço espaçador, ao terminal N de um péptido inibidor de quimopapaína reversível, de modo que o referido péptido se ligue ao sítio activo de uma molécula de quimopapaína; e b) eluir a quimopapaína com um eluente adequado; B. 1. precipitar uma mistura aquosa contendo quimopapaína em bruto a um pH inferior a 2,0; 2. separar, da referida mistura, uma solução aquosa de quimopapaína em bruto; e 3. neutralizar eropcionalmente,dessalificar a referida solução de quimopapaína em bruto; ou C. i) a precipitação ácida de uma mistura aquosa contendo quimopapaína em bruto; ii) separar, da referida mistura, uma solução aquosa de quimopapaína em bruto; iii )neutralizar e,opcionalmente,dessalificar a referida solução de quimopapaína em bruto; iv) incubar a solução obtida no passo (iii) com uma matriz de cromatografia de afinidade dirigida a sítios activos, compreendendo uma matriz de suporte ligada covalentemente, opcionalmente por intermédio de um braço -78- 70 912 WAF/CRF/P/271 espaçador ao terminal N de um péptido inibidor de qui-mopapaina reversível, de modo que o referido péptido se ligue ao sítio activo de uma molécula de quimopapaí^ na; e v) eluir a quimopapaína com um elemento adequado.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-do por a precipitação ácida ser realizada a um pH de 1,2 a 1,8.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindic_a ção 2, caracter izado por incluir, pelo menos, um passo de cromatc» grafia de permuta catiénica. Lisboa , 2Z A6fi. 19?0 Por THE B00TS COMPANY PLC - 0 AGENTE OFICIAL -