JPH04502907A - 抗トロンビン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗トロンビン 本発明は、新規な抗トロンビン、そして特に、ヒル（ｌｅｅ　ｃｈ）組織及びヒ ル分泌由来の抗トロンビンに関する。

ヒルジンは、良く知られそして十分に特性の分かったポリペプチドであり、トロ ンビンに対し特異的であることが分かっており、ヒルド　メジシナリス（旧ｒｕ ｄ。

ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）の一種のヒル由来の抽出物である。このポリペプチド は、やや低分子量（約７０００）であり、６５アミノ酸で構成されている。ヒル ジンの第１のアイソホーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の配列は、ドツト、ミュラー、シ ーミュラー、及びチャン（Ｄｏｄｔ、　Ｍｕｌｌｅｒ、ｓｅｅｍｕｌｌｅｒ、　 ａｎｄ　Ｃｈａｎｇ）　［ヒルジン、「トロンビン−特異的阻害剤の完全アミノ 酸配列」　（“Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅ ｎｃｅｏｆ　ｈｉｒｕｄｉｎ、ａ抽ｒｏｍｂｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　１ｎｈｉ ｂｉｔｏｒ”）、ＦＥＢＳ　１６５　（１９８４）：ｐｐ１８０−１８４）によ って、次のとおり決定された。

２０　２５　３Ｇ ２つのヒルジンの変種も又特性が決定され、アミノ酸配列が決定された。第１の 変種は、ドツト、マチレイト、シーミュラー、マシェラー、及びフリッブ（Ｄｏ ｄｔ。

Ｍａｃｈｌｅｉｄｔ、Ｓｅｅｍｕｌｌｅｒ、Ｍａｓｃｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｆｒ１ ｔｚ）　［ｒヒルジン、アイソインヒビターの単離及び特性並にヒルジンＰＡの 配列分析Ｊ　（”ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ｈｉｒｕｄｉｎ　１ｓｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ａｎｄｓｅｑｕｅｎ ｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｈｉｒｕｄｉｎ　ＰＡ″）、バイオワ１ケミ・ ホッペザイラ−Ｒｉａ１．　ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ）、３６７（ １９８６）ｐｐ８０３−８１１コに述べられている。

この変種は、上記のものと次の点で異なる：ｌ１位置位置−ｖａｌ−に替えて、 −１１ｅ−２、位置２の−ｖａｌ−に替えて、−ｔｈｒ−３、位置２４の−ｇｌ ｎ−に替えて、−１ｙｓ−４、位置３３の−ａｓｐ−に替えて、−ａｓｎ−５、 位置３５の−ｇｌｕ−に替えて、−１７ｓ−６、位置３６の一１７ｓ−に替えて 、−ｇｌｙ−７、位置４７の一１ｙｓ−に替えて、−ａｓｎ−８、位置４９の− ｇｌｎ−に替えて、−ｇｌｕ−９、位置５３の−ａｓｐ−に替えて、−ａｓｎ− 第２の変種は、ハーベイ、デグリセ、ステファ二、ジャンパー等（Ｈａｒｖｅｙ 、　Ｄｅｇｒｙｓｅ、　５ｔｅｆａｎｉ、　Ｓｃｈａｍｂｅｒ等、［［吸血ヒル 、ヒルド　メジシナリスからの抗凝固ヒルジンをコードするｃＤＮＡのクローニ ング及び発現」（“Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ 　ｃ　ＤＮＡ　ｃｏｄｉｎｇｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ−ｃｏａｇｕｌａｎｔ　 ｈｉｒｕｄｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅｂｌｏｏｄｓｕｃｋｊｎｇ　１ｅｅｃｈ、　 Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ″）、プロ、ナショ、アカデ、サイエン （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、）Ｕ、Ｓ。

Ａ、（２９８６）、ｐｐ１０８４−１０８８３に述べられている。これは、位置 ｌから３２までは、最初に述べた変種と同一であり、最初に述べたヒルジンとは 、次の相違がある。

ｌ、位置３３の−ａｓｐ−に替えて、−ｇｌｎ−２、位置３５の−ｇｌｕ−に替 えて、−１ｙｓ−３、位置３６の一１ｙｓ−に替えて、−ａｓｐ−４、位置５３ の−ａｓｐ−に替えて、−ｇｌｎ−５、位置５８の−ｇｌｕ−に替えて、−ｐｒ ｏ−６、位ｒｌＬ６２の−ｇ　ｌ　Ｕ−に替えて、−ａｓｐ−７、位１ｔ６４の 一１ｅｕ−に替えて、−ａｓｐ−８、位置６５の−ｇｌｎ−に替えて、−ｇｌｕ −上記したように、ヒルジンは、ヒルド　メジシナリスＨｉｒｕｄｅ　ｍｅｄｉ ｃｉｎａｌｉｓ）種のヒル由来であった。ヒルディ哺乳網の血液で育つことがで きる点において類似している。しかし、ヒルディナリアは、ヒルド　メジシナリ スよりも進化論的により進んでいる。ヒルの最初の種の分泌、物中に存在する活 性物質が、他の種で見出されそうかどうか、又、（もし類似の活性の物質が見つ かったとしたら）、それらが、実質的に同一のアミノ酸配列を持つか又は、極立 った異なるアミノ酸配列を持つかということをある確率で予測することはできな い。

我々は、ここに、次のアミノ酸配列を存する抗トロンビｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ ）由来の新規抗トロンビンを単離した。

ここで、Ｘ、Ｙ及びＺの各々は、どのようなアミノ配残基を示し、Ｄは、ｃｙｓ 又はｐ　ｒ’ｏを示し、Ｅは、ｇｌｕ又はａｓｐ又はｈｉｓを示し、Ｆは、ａｓ ｐ、ｔｒｐ又はｌｙｓを示し、そして★は、前記した第１のヒルジン変種のもの と異なる抗トロンビン分子中の位置を示す）。

ヒルジン配列と比較して約６２％ホモロジーを示しく即ち、３８％相違）、これ は驚くべき実質的な相違である。

特に、重要なＣ−末端において非常に相違し、そして次の明らかな相違がある。

位置１３（−１ｅｕ−に替えて−ｔ　ｙ　ｒ　−）位置１７（−ｇｌｕ−に替え て−ｖａｎ−）位１！２４（−ｇｌｎ−に替えて−ｇｌｕ−）位１！２６　（− ａｓｎ−に替えて−ａｓｐ−）位！２７（−１ｙｓ−に替えて−ａｓｎ−）位１ ２９（−ｉｌｅ−に替えて−ａｓｎ−）位８３０（−１ｅｕ−に替えて−ｐｒｏ −又は−ｃｙｓ−） 位置３１（−ｇｌｙ−に替えて−ｇｉｎ−）位（ｔ３２（−ｓｅｒ−に替えて一 １ｅｕ−）位置３３（−ａｓｐ−に替えて一５ｅｒ−）位置３４（−ｇｌ）’− に替えて一５ｅｒ−）位！３５（−ｇｌｔＪ−に替えて−ｓ　ｅ　ｒ　−）位置 ３６（−Ｉｙｓ−に替えて−ｆｌｙ−）位置４１（−ｔｈｒ−に替えて−ｇｌｕ −又は−ａｓｐ−又は、−ｈｉｓ−） 位置４７（−ｐｒｏ−に替えて、−ａｓｐ−１−Ｉｙｓ−又は−ｔｒｐ−） 位置５１（−ｈｉｓ−に替えて−ｇｉｎ−）位置５２（−ａｓｐ−に替えて−ｔ 　ｈ　ｒ　−）位置５３（−ａｓｐ−に替えて−ｇｉｕ−）位置６１（−ｇｌｕ −に替えて−ａ’５ｐ−）位置６４（−１ｅｕ−に替えて一１１ｅ−）及び位１ ６５（−ｇｌｎ−に替えて−１ｙ　ｓ　−）位置６１　（グルタメートに替えて アスパルテート）、６４（ロイシンに替えてイソロイシン）、及び６５（グルタ ミンに替えてリジン）での相違は、特に重要であると考えられている。即ち、５ ５−６４配列が、ヒルジンの阻害活性の重要なドメインであると考えられる［オ ーエン（Ｏｗｅｎ）等、「ヒルジンに基ずく小ペプチド抗凝固剤のＮ−末端変換 」　（“Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｏｆｓｍａｌｌ　ｐ ｅｐｔｉｄｏ　ａｎｔｉ−ｃｏａｇｕｌａｎｔｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｈｉｒｕ ｄｉｎ”　。

１９８８、ジャーナルメディカルケミストリー（Ｊ、Ｍｅｄ。

Ｃｈｅｍ、３１　：ｐｐｌＯ０９−１０１１）コ。本発明による抗トロンビン中 のアスパラテート（−ａｓｐ−）、イソロイシン（−ｉｌｅ−）及びリジン（− １ｙｓ−）の存在は、新規なトロンビン阻害領域をもたらし、配列５４−６５の みが、それ自体で新規であると考えられ、新規な抗トロンビン特性を存するもの と考えられる。従って、本発明は、上記したアミノ酸配列５４−６５を有する小 ペプチドを含む。

位置６３のアミノ酸（上記式においてＺで表わされる）は、通常硫酸塩化された チロシン（ｔｙｒ）であっても良い（反対に、組換えヒルジンは一般的には、こ の位置では硫酸塩化されていない）。

本発明に基ずくヒル由来抗トロンビン（及びそれから推測されつる対応ＤＮＡ配 列）は、メジシナルリーチヒルド　メジシナリス　中に存在することが分かって いる公知のエラスターゼ／キモトリプシン阻害剤であり、シーミュラー（ｓｅｅ ｍｕｌＩｅｒ）等、「ニグリン：リーチ由来エラスターゼーカテプシンＧ阻害剤 」、Ｉ　９８１　、　Ｍｅｔｈ。

ｉ：ｎＺｙｍｏｌ、　８０　：　ｐ　ｐ　８０４−８１６記述のニグリンとは非 同種（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）である。

本発明に基ず（抗トロンビンは、通常、溶媒抽出及びそれに引き続くクロマトグ ラフ−法による分画を含む方法によって、ヒルシナリア　マニレンシス種の組織 からか又は類似のものから単離する。又はヒルシナリア　マ単離しても良い。

本発明の別の面によれば、従って、ヒルシナリア　マニレンシス種のヒルの組織 又は分泌物由来の抗トロンビンが与えられる。この抗トロンビンはトロンビンに 特異活性的である。

本発明は、更に上記した式のポリペプチドに対するリコンビナント又は蛋白工学 的同等物を含む。

本発明の抗トロンビンは、藁学上容認しうるキャリア又は賦形剤を有する薬剤に おいて使用しうる。このような薬剤は、普通静脈投与する（この場合、キャリア は、一般的には、許容しうる純度の殺菌食塩水又は水である）。

本発明の抗トロンビンは、血栓塞栓、例えば血液の凝固の処置に適している。本 発明の一例では、抗トロンビンは、組織プラスミノーゲンアクチベーターのよう なプラスミノゲーンアクチベーターとともに投与する。本発明の抗トロンビンは 、後者とコンパチブルであることが分かった。

ヒル組織からの本発明の抗トロンビンの単離方法の例を、以下の詳細な実施例で 述べる。

実施例１ ステップ−アセトン抽出 ６００ｇのヒルシナリア　マニレンシス　リーチを約２リツターの９６％エタノ ール中で２４時間脱水した。

動物の前部を体部から切断し、更に約２００ｍ１の９６％エタノール中で更に２ ４時間脱水した。

脱水したヒル頭部を微小片に切断し、４０ｍ１のアセトンと６０ｍ１の水の混合 物を添加した。

混合物を室温で３０分間攪拌し、２．７０Ｏｒｐｍで１５分間スピンし、上澄液 をデカントした。

ペレットを更に１００ｍ１の４０：６０アセトン：水混合物に再懸濁し、室温で ３０分間攪拌した。

混合液を２．　７０　Ｏｒ　ｐｍで１５分間スピンし、上澄液をデカントし、最 初の上澄液でプールした。

８０ｍ１アセトン及び２０ｍ１水を、プールした上澄液に添加し、氷酢酸により ｐＨを４．４に低げた。

混合物を２．７０Ｏｒｐｍで１５分間スピンし、上澄液をデカントした。溶液の ｐＨを３０％アンモニアを用いて６．０に調節した。３５℃でロータリーエバポ レーションにより容量を約３０ｍ１に低下させた。

結晶トリクロロ酢酸を加え、溶液のｐＨを１．８に低げ、その後遠心分離して沈 殿物を除去した。原料抗トロンビンを９倍量のアセトンを用いて溶液から沈殿さ せた。

混合物を２．７０Ｏｒｐｍで１５分間スピンし、上澄液を捨てた。ペレットを５ ０ｍ１アセトン中で再懸濁し、２．７０Ｏｒｐｍで１０分間スピンした。洗液を 捨て、沈殿物を真空デシケータ中で１時間乾燥した。原料抗トロンビンを４．０ ｍｌの水で再構成した。

蛋白質は、２８０ｍｍでの吸収により、７８ｍｇ／ｍｌと評価した。活性は、ト ロンビン／フィブリノーゲンクロットの阻止により２４００抗トロンビン単位／ ｍｌ（又は、約１０．０００抗トロンビン単位／２００ｇの頭片）と評価した。

トータル活性は９６００抗トロンビン単位であった。特異的活性は、３０．７抗 トロンビン単位／ｍｇ蛋白と計算された。

ステップ２　エタノール抽出 原料抗トロンビン溶液を冷却して３　”Ｃとした。水冷９６％エタノールの１． ２ｍｌアリコートを６回５分間隔で添加した。混合物をそれから３℃１０分間放 置し、２゜４００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液をデカントして保持し た。

ペレットを４ｍｌ水冷蒸留水中に再懸濁し、７．２ｍｌ水冷９６％エタノールで 混合した。これを３°Ｃ３０分間静置し、その後２．４０Ｏｒｐｍで１０分間遠 心分離した。

上澄液をデカントして除き、最初の上澄液でプールした。

ペレットを４ｍｌの水冷９６％エタノールの混合物中で再懸濁し、３０分間３° Ｃに静置した。これを、その後２゜４００ｒｐｍで１０分間スピンし、上澄液を デカントし、プールした。

プールを氷で０℃に冷やし、その後−１０℃で、０．５％酢酸アンモニウムを含 む５０．７ｍｌのエタノールを加えた。これを３０分間放置し、その後２．４０ Ｏｒｐｍで１０分間スピンした。

上澄液を捨て、沈殿物を５０ｍ１の水冷エタノールで洗條した。上澄液をその後 真空デシケータで１時間乾燥した。

これをその後、水で再構成し、抗トロンビン活性、蛋白量を試験し、バイアルし 、凍結乾燥した。結果の容量は、１．５ｍｌであった。

蛋白は、２８０ｎｍでの吸収を用いて１９ｍｇ／ｍｌで評価した。

活性は、トロンビン／フィブリノーゲンクロッティングアッシーによって、１０ ００抗トロンビン単位と評価した。特異的活性を５２．６ＡＴＵ／ｎ＋ｇ蛋白で 計算した。

実施例２ 実施例１のステップ１を反覆し、その後、ステップ２及び３を以下のとおり行な った。

ステップ２−陽イオン交換クロマトグラフィー原料抗トロンビンを１０ｍＭ酢酸 アンモニウム−酢酸ｐＨ４，０中で再構成し、ろ過して、不溶物を除去した。

商業的に商標名ＣＭセアアデックスＣ５０として入手しつる、カルボキシメチル セルロースをバッファー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム−酢酸；ｐＨ４，０）中で 事前膨潤し、２．６ｃｍ径の３０ｃ＋ｎ長カラムにパックした。サンプルをカラ ムにロードした。

１００ｍ１バツフアーをカラムに通し、廃棄物として収集した。バッファーをそ の後１０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４，２に変えた。１０ｍ１フラクシヨンをそ の後集め、抗トロンビン活性及び蛋白量を試験した。各フラクションの特異的活 性を計算し、特異的活性の閾値以上のフラクションをプールし、凍結し、そして 凍結乾燥した。

ステップ３　陰イオン交換クロマトグラフィーエタノール抽出又はＣＭセファデ ックス抽出のいずれかにより作られた凍結乾燥粗抽出物を１０ｍＭＴｒｉｓ／Ｍ ＣＩバッファー、ｐＨ７，５で再構成し、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５カ ラム（０，９Ｘ７ａｍ）上でクロマトグラフし、同バッファーで、事前平衡した 。流出液の２３４ｎｍでの吸収が０．１５より小さくなるまで流速１５ｍ１／時 間でカラムをディベロップした。結合物質をそれから平衡バッファー（各リザー バー中６０ｍ１）中で直線勾配０−ＩＭ　ＮａＣ１で溶出した。

溶出液を２ｍｌフラクションに集め、吸収及び阻害活性測定用とした。溶出プロ フィールをエタノール抽出物質（図１）及びＣＭセファデックス抽出物質（図２ ）で示す。

抗トロンビン活性を育するフラクションをプールし、濃縮しそして、その後の精 製の前にセファデックスＧ−２５上で脱塩した。部分的精製サンプルをトロンビ ンセファロース上のアフィニティクロマトグラフィーで更に分画した。カラムを 平衡バッファー（０，１ＭＴｒ　ｉ　ｓ／ＨＣＬ　ｐＨ８，０）で洗條し、そし てその結合した抗−トロンビンを１Ｍベンズアミジンで溶出した。

溶出した物質を凍結乾燥し、前と同様に脱塩した。この物質をその後高速液体ク ロマトグラフィーで精製した。

５０マイクロリツターの濃縮サンプルを、室温で０．　１％ＴＦＡで事前平衡し たマイクロポアＲＰ−３００Ｃ−８カラムに適用した。結合した物質は、３５分 間、流速０．２５ｍｆ／分で、０．０９％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリルの ０−１００％直線勾配で溶出した。

溶出液の吸収を２１５ｎｍでモニターした。各ピーク、又は部分的にリゾルブし たピークを、阻害活性の測定用に別々のフラクションとして集めた。得られた溶 出プロフィールを図３に示す。そして抗トロンビン活性を含むピーク（ピーク５ ．６．７）が、他のピークとは別れていることを示している。

配列化 抗トロンビン活性を含む主なピーク（図３のピーク５．６及び７に等しい）を真 空乾燥し、ＰＴＨアミノ酸同定用自動アブライドバイオシステムズ気相シーケン サ−（モデル４７０Ａ）、オン−ライン分析器（モデルＩ２０）とリンク、によ りＮ−末端アミノ酸配列を分析した。

精製抗トロンビンサンプルをシーケンス用フィルターに直接負荷した。配列中の システィン残基は、精製サンプルをジチオスレイトール及び４−ビニルピリジン に反応させてピリジルエチルシスティンに誘導化後決定した。

還元及びピリジルエチル化抗トロンビンのトリブティクダイジェスト（ｔｒｙｐ ｔｉｃ　ｄｉｇｅｓｔｓ）をＴＰＣＫ−トリプシンで得た。この反応は、３７° Ｃ１４時間、０．０５Ｍ二炭酸アンモニウム塩バッファー中で行ない、凍結乾燥 により反応を停止させ、モしてＯ，Ｉ％ＴＦＡ中で再懸濁した。以下の実施例３ 、ステップ５に述べたのと類似の条件下で逆相ＨＰＬＣによりフラグメントを分 離した。

Ｃ−末端配列を、チャン（Ｃｈａｎｇ）　Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　１ｅｔｔｓ（１９８ ３）、１６４　ｐｐ３０７−３１３に記述されたカルボキシペプチダーゼＹダイ ジェスチタン及びＤＡＢＳ−ＣＩ法の組合せにより実施した。決定された配列は 前記のとおりであった。

実施例３ 実施例２のステップｌ及び２を反覆し、その後ステップ３及び４を以下のとおり 行なった。

ステップ３　陰イオン交換クロマトグラフィーステップ２からの溶液を、０．１ Ｍ　ＮａＯＨでｐＨ７，０に調整し、２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ７， ０バツフアーで平衡化された。商標名Ｑ−セファロースで商業的に利用できる陰 イオンクロマトグラフィーを含むカラムにかけた。未結合蛋白（２８０１ｍの吸 収で検出）が除去される迄バッファーをカラムにポンプし、その後場（同じバッ ファー中のＮａＣ１）の勾配を、直線状または段階状にかけて、結合した抗トロ ンビンを溶出した。典型的なりロマトグラフィープロフィールを図４に示す。

抗トロンビン活性を含むフラクションをプールし、ウルトラフィルトレージョン により濃縮して容量を２５２５−５Ｏとした。この段階で、抗トロンビンプレバ レージョンは、１００−４００抗トロンビン単位／ｍｇ蛋白の特異的活性を存し ていた。

ステップ４　ゲル濾過 ステップ３からの溶液をスーパーデックス２００として商業的に入手できるゲル 濾過カラムにかけ、平衡化し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、０．ＩＭ　ＮａＣ １、ｐＨ７，５で溶出した。典型的なりロマトグラフプロフィールを図５に示す 。

抗トロンビン活性を含むフラクションを集め、プールし、凍結乾燥した。この時 点で、抗トロンビンブレバレージョンは、普通１０００−４０００抗トロンビン 単位／ｍｇ蛋白の範囲で特異的活性を育していた。

ステップ５　最終精製 ステップ４からの物質を、Ｏ，ＩＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ、ｐＨ８，０中に平衡化さ れたトロンビン−セファ０−スのアフィニティカラムにかけた。そして未結合物 質を同じバッファーで溶出した。結合した抗トロンビンを０．１Ｍベンズアミジ ンでカラムから溶出し、凍結乾燥し、その後セファデックス０２５カラムを用い て脱塩した。

アフィニティクロマトグラフィーにより精製された物質を更に、逆相カラム（Ｒ Ｐ−３００Ｃ−８）を用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精 製した。典型的な例では（図６）、室温で、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ ）で平衡化されたカラムに、サンプルをかけた。そして結合した抗トロンビンを ０．９％（Ｔ　Ｆ　Ａ）を含む６０％アセトニトリルの直線勾配で溶出した。蛋 白のピーク（２１５／２８０ｎｍの吸収により検出）を集め、抗トロンビンを含 むものを真空下乾燥した。

抗トロンビン活性のアッセイ 本質的にマークワーツ（Ｍａｒｋｗａｒｄｔ）がメソッド　インエンザイモロジ −（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｊｎ　Ｅｎｚｙ＋ｎｏｌｏｇｙ　：　Ｘ　Ｉ　Ｘ。

１）Ｉ）９２４．ｒトロンビンの阻害剤ヒルジンＪ“旧ｒｕｄｉｎ　ａｓ　ａｎ 　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ″　（１９７０）で述べたと同 様のフィブリノーゲン上のトロンビンのクロッティング活性の阻害を測定するこ とによるか、又は、特異的パラ−ニトロフェノール由来クロモジェニック物質、 例えばＳ−２３８（カビ社から商業的に入手可）のトロンビン開裂の阻害を測定 することによって、抗トロンビン活性を決定した。

本発明による抗−トロンビンの活性は、ヒルジンに特異的な中和モノクローナル 抗体の高い濃度によっては中和しなかった（このことは、本発明の抗トロンビン とヒルジンが非類似であることの免疫学的な確認である）。

本発明の抗トロンビン及びヒルジンは、しかしながら、同等の投与量で、類似の 部分トロンボプラスチック時間を持つ。このことは、それらは、ヒト血液に対す る類似の抗凝固特徴を有することを示唆している。

浄書（内拍こズ更なし） ＦＩＧ、Ｉ ＤＥＡＥ　−Ａ２５　ＩＩＩヒル抽出物のりＯマドグラフィーＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ 部分精製抗トロンビンのＨＰＬＣブｂフィール手続補正−書（自発） 手続補正書坊式） ＡＩ：Ｐつ日１交口ｒ＝〒コ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．次のアミノ酸配列： 【配列があります】 ここで、Ｘは、いかなるアミノ酸残基でも良く；Ｙは、いかなるアミノ酸残基で も良く；Ｚは、いかなるアミノ酸残基でも良く；Ｄは、ｃｙｓ又はｐｒｏを示し ；そしてＥは、ｇｌｕ又はａｓｐ又はｈｉｓを示し；Ｆは、ａｓｐ、ｌｙｓ又は ｔｒｐを示す、を有するポリペプチド又は、薬学的に容認しうるその塩、誘導体 又はバイオプレカーサー。
2. ２．Ｘが、ｖａｌを表わす請求項１のポリペプチド。
3. ３．Ｙが、ｓｅｒを表わす請求項１又は２のポリペプチド。
4. ４．トロンビンを特異的に阻害しかつアミノ酸配列【配列があります】 ここで、Ｚは、いかなるアミノ酸残基でも良い、を含むポリペプチド；又は薬学 的に許容しうるその塩、誘導体又はバイオプレカーサー。
5. ５．Ｚがｔｙｒ又は、その硫酸塩化された誘導体を表わす請求項１乃至４のいず れかのポリペプチド。
6. ６．薬学的に許容しうるキャリア又は賦形剤とともに、請求項１乃至５のいずれ かのポリペプチドを含む薬剤。
7. ７．血栓塞栓プロセスの処置用医薬を製造するための請求項１乃至５のいずれか のポリペプチドの使用。
8. ８．プラスミノーゲンアクチベーターとともに患者に投与する医薬を製造するた めの請求項１乃至５のいずれかのポリペプチドの使用。
9. ９．ヒルジナリアマニレンシス種のヒルの組織又は分泌物から由来することを特 徴とするヒル由来特異的抗トロンビン。