DK173509B1 - Polypeptider med blodkoaguleringshæmmende virkning, deres fremstilling eller udvinding samt midler med indhold deraf - Google Patents
Polypeptider med blodkoaguleringshæmmende virkning, deres fremstilling eller udvinding samt midler med indhold deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK173509B1 DK173509B1 DK198603384A DK338486A DK173509B1 DK 173509 B1 DK173509 B1 DK 173509B1 DK 198603384 A DK198603384 A DK 198603384A DK 338486 A DK338486 A DK 338486A DK 173509 B1 DK173509 B1 DK 173509B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- gly
- glu
- thr
- ile
- lys
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/141—Feedstock
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
i DK 173509 B1
Antikoagulanser tjener til profylakse og terapi af thrombo-emboliske processer. Det største anvendelsesområde for disse forbindelser er først og fremmest til venøse thromboembolier. Antikoagulanser er desuden nød-5 vendige ved fremstillingen af konserverede blodpræparater. Derivater af 4-hydroxycumarin eller 1,4-indandion, der eksempelvis anvendes til dette formål, udviser trods vidtrækkende optimering en række ulemper.
Det er derfor ønskeligt, især inden for humanmedi-10 cinen at have blodkoaguleringshæmmende midler til rådighed, som udviser ringe toksicitet og få bivirkninger, og som ikke repræsenterer nogen belastning for den syge organisme på grund af deres metabolisme.
' Foruden kroppens egne plasmatiske hæmningsstoffer, 15 såsom antithrombin III, har også mange andre proteiner blodkoaguleringshæmmende virkning, såsom Kunitz-inhibitoren, der udvindes af sojabønner. Dette hæmmende stof blokerer blodkoaguleringskaskaden ved at inhibere den aktive faktor X, men inhibitorens specificitet er så ringe, at der 20 opstår mange bivirkninger: hæmning af plasmakallikrein, plasmin og trypsin, således at en terapeutisk anvendelse er udelukket. Også andre aktive forbindelser, såsom Ascariseller Kazals-inhibitoren, kan ikke opnå betydning på grund af manglende specificitet.
2 5 Hirudin, der er et ud fra Hirudo medicinalis udvun det polypeptid, udviser derimod en specifik antithrombin--virkning. Den kostbare fremgangsmåde til isolering og rensning deraf, har hidtil været en ulempe for en praktisk anvendelse deraf.
30 Primærstrukturen af hirudin er anført i DE 3 342 139 som følger: 10 2 DK 173509 B1 H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly- 20 -Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asrx- 30 -Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu- 5 -Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val- 50 -Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser- 60 -His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-
f°3H
10 -Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH
Dette skrift omhandler i øvrigt kun to konkrete hirudinderivater, som begge adskiller sig fra hirudin ved ikke at indeholde en sulfatestergruppe ved Tyr63, og hvoraf det 15 ene yderligere adskiller sig fra hirudin ved ikke at indeholde de to C-terminale aminosyrer Leu og Glu.
I DK 1739/85 beskrives hirudinderivater, som kun adskiller sig fra hirudin ved, at de indeholder aminosyren Tyr, Ile, Val, Leu eller Phe i stedet for Val-Val ved N-20 terminalen, og eventuelt ikke indeholder en sulfatestergruppe ved Tyr. Disse hirudinderivater kan udvindes fra blodigler.
Ifølge den foreliggende opfindelse har det overraskende vist sig, at der findes en hel række af andre hirudiner (hirudinvarianter), som kan isoleres fra blodigler. Disse 25 hirudinvarianter er højaktive og kan anvendes til medicinske formål som alternativ til de kendte hirudiner. En sådan tilvejebringelse af alternativer udgør et oplagt teknisk fremskridt.
Opfindelsen angår således polypeptider med formlen 30 DK 173509 B1 3 123¼ S 6 7 8 9 10 11 12 13 1¼ H-(X) — A-B-C-Tyr-Thr-Asp-Cys-F-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-
D
15 16 17 18 19 20 21 22 23 2*» 25 26 27 -Cys-leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly- J -Gly-Asn- 28 29 30 31 32 33 3H 35 36 37 38 **9 <t0 5 -Lya-Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly- D - G -Asn-Gln-Cys-
Wl ** 2 «*3 «»44 1*5 <»6 1*7 1*8 «*9 50 51 52 53 -Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-lys-Pro-Gln-Ser-Hie-Asn- 5 ·* 53 56 57 58 59 60 61 62 63 6«* 65 -Asp-Gly-Asp-Phe-Glu- S -Ile-Pro-Glu-$lu-Tyr(R)- H - 66
10 -Gln-(Z) -OH
n (I) hvor m = 0-50, n = 0-100, og R betyder et phenolisk hy-15 drogen eller en phenolestergruppe, X er ens eller forskellige grupper af naturligt forekommende α-aminosyrer, Z betyder ens eller forskellige grupper af naturligt forekommende α-aminosyrer, og A betyder Ile eller fravær af en aminosyre, B betyder Ile eller Thr eller fravær af 20 en aminosyre, C betyder Thr, Val, Ile, Leu eller Phe, D betyder Glu eller fravær af en aminosyre, E betyder Glu eller Pro, F betyder Thr eller Ile, G betyder Lys eller Lys-Asp, H betyder Ala eller Leu, I betyder Gin eller Lys, og hvor de seks Cys-grupper parvis er forbundet via disul-25 fid-broer, samt fysiologisk acceptable salte deraf, hvorved, når J = Gin, G Lys eller H ± Leu eller R £ hydrogen, og hvis A og B er fraværende, C £ Val.
De tre disulfid-broer forekommer fortrinsvis mellem Cys-resterne i. positionerne 7 og 15, 17 og 29 samt 23 og 40.
Naturligt forekommende α-aminosyrer er især Gly,
Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys,
Met, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit, Tyr, Phe, Trp, His, Pro og Hyp.
R betyder fortrinsvis hydrogen, SO-^H eller PO2H2, især hydrogen.
DK 173509 B1 4 På tale som salte kommer især alkali- og jordalka-lisalte, salte med fysiologisk acceptable aminersamt salte med fysiologisk acceptable syrer, såsom HC1, I^SO^, ma-leinsyre eller eddikesyre.
5 Der foretrækkes polypeptider med formlen (I), hvori C betyder Thr, desuden sådanne, hvor C betyder Thr, og A betyder Ile. Særligt egnede peptider er sådanne, hvor - A= Ile, B= Thr, C= Thr, D= Glu, E= Glu, F= Thr, G= Lys, H= Leu, J- Gin, m= nul, n= nul, R= SO3H; 10 - m= nul, n= nul, R= SO3H, A= Ile, B= direkte binding, C= Thr, D= Glu, E= Glu, F= Thr, G= Lys, H= Leu, J= Gin; - m= nul; n= nul? R= SO3H; A= Ile, B= direkte binding, C= Thr, D= Glu, E= Glu, F= Ile, G= Lys, H= Leu, 15 J= Gin; - m= nul, n= nul, R= SO3H, A= Ile, B= direkte binding, C= Thr, D= Glu, E= Pro, F= Thr, G= Lys, H= Leu, J= Gin; - m= nul, n= nul, R= SO^H, A= Ile, B= direkte binding, 20 C= Thr, D= Glu, E= Pro, F= Ile, G= Lys, H= Leu, G- Gin; - m= nul, n= nul, R= SO3H, A= direkte binding, B= direkte binding, C= Thr, 0= direkte binding, E= Glu, F= Thr, G= Lys, H= Leu, J= Gin; 25 - A= Ile, B= direkte binding, C= Thr, D= direkte binding, E= Glu, F= Ile, G= Lys-Asp, H= Ala, J= Lys, m= nul, n= nul, R= SO^H; - a= Ile, B= direkte binding, C= Thr, D= direkte binding, E= Glu, F= Ile, G= Lys-Asp, H= Ala, J= Lys, m= nul, 30 n= nul, R= hydrogen.
Opfindelsen angår også et peptidisk spaltningsprodukt af et polypeptid ifølge opfindelsen, hvilket spaltningsprodukt har antithrombinaktivitet.
Opfindelsen angår yderligere en fremgangsmåde til 35 udvinding af et rent polypeptid ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at polypeptidet isoleres DK 173509 B1 5 fra igler af ordenen Gnathobdellida, fortrinsvis fra igler af slægten Hirudo, ved hjælp af en kombination af ekstraktionsmetoder, fældningsmetoder, membranfiltrering og/eller chromatografiske fremgangsmåder, en eventuelt tilstedeværende 5 phenolestergruppe R om ønsket fraspaltes hydrolytisk under dannelse af en phenolisk hydroxylgruppe, og peptidet eventuelt spaltes kemisk eller enzymatisk, og det således fremstillede peptid eventuelt overføres i fysiologisk acceptable salte deraf.
10 Polypeptidet udvindes fortrinsvis af halskirtler fra igler af klassen Hirudinea, især fra sådanne af ordenen Gnathobdellida. Foretrukne er slægterne Hirudo, Gnathobdella, Haemadipsa og Philaemon. Særligt foretrukket er Hirudo medicinalis. Foruden blodigelens halskirtler kan man også anvende 15 den første del af kroppen eller hele blodigelen.
En fremgangsmåde til udvinding af en råekstrakt af blodigler er beskrevet i Enzymology, bind 5 "Hirudin as an Inhibitor of Thrombin". En rensningsmetode for Hirudin er kendt fra Bull. Soc. Chim. Biol. 45 (1963) 55.
Ved den her omhandlede fremgangsmåde har det især vist sig nyttigt at anvende en kombination af fældningsmetoder og af gelpermeationschromatografi eller ultrafiltrering, affinitetschromatografi og af højt opløsende fordelingschromatografi på "Reverse-Phase"-materiale og chromatografi på silicagel eller aluminiumoxid. Afhængig af råekstraktens beskaffenhed kan der også med fordel anvendes andre chromatografimetoder (eventuelt også sammen med den ovenfor anførte fremgangsmåde) såsom kation- eller anionbytterchromatografi, chromatografi på uspecifikke absorbenter, især hydroxylapatit.
Til udvinding af en til chromatografi egnet råekstrakt kan blodigelen oparbejdes på den af Bagdy et al. i Methods of Enzymology 45 [1976] 669-678 beskrevne måde.
Man kan imidlertid også f.eks. pulverisere biodigelens hoveddele i frosset tilstand og gennemføre en ekstrahe- DK 173509 B1 6 ring ved hjælp af en vandig pufferopløsning (f.eks. phos-phatpuffer). Det uopløselige materiale skilles eksempelvis fra ved kort centrifugering eller ved filtrering over gaze, og polypeptidet fraskilles og isoleres fra den således fremkomne ekstrakt. Det er en fordel at opvarme denne ekstrakt hurtigt til 70-90°C, fordi størsteparten af de proteolytiske enzymer derved denatureres og udfælder, hvorpå deres fraskillelse f.eks. kan ske ved centrifugering. Proteinfraktionen, som indeholder det her omhandlede peptid, isoleres fra ekstrakten f.eks. ved fældning på den måde, at ekstrakten sættes til et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel. Således kan der f.eks. anvendes acetone i mange gange mængden af ekstraktrumfanget, fortrinsvis i ca. en ti gange så stor mængde, hvorved fældningen sker i kulde, sædvanligvis ved O til -40°C, fortrinsvis ved ca. -20°C.
En anden mulighed for at gennemføre fældningen er at tilsætte salte, såsom ammoniumsulfat. Ved at styre pH-værdien opnås en fældning med en vis selektivitet.
De her omhandlede peptider, der har isoelektriske punkter på 3,5-4, kan udfældes i et pH-område mellem 3 og 5, fortrinsvis ved ca. 4, ved tilsætning af ammoniumsulfat indtil en koncentration på ca. 50%, hvorved et stort antal ledsageproteiner derved forbliver i opløsningen. Også denne fældning gennemføres under afkøling ved ca. -5°C til 15°C, fortrinsvis ved temperaturer mellem O og 4°C.
Pra denne råekstrakt kan der fraskilles proteiner med højere molekylvægt, f.eks. ved ultrafiltrering eller ved gelpermeationschromatografi. Ved større udgangsblandinger kan ultrafiltreringen f.eks. ske i to trin: i et første trin arbejdes der med en kapillarmembran med en udelukkelsesgrænse på 50000 dalton og derpå i et andet trin med en flad membran med en udelukkelsesgrænse på 10000 dalton. Med kapillarmembranen opnås der en hurtig fraskillelse af højere molekylært materiale, som ville DK 173509 B1 7 hindre gennemstrømningen gennem den selektivt arbejdende flademembran. Ved små mængder kan man udelade det første trin af ultrafiltreringen.
En rensning af råekstrakten kan også ske ved hjælp af ionbytterchromatografi, f.eks. på DEAE "Sephadex" som beskrevet af Markwardt, Walsmann, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 348 [1967] 1381-1386.
Det således fremstillede materiale består af en blanding af de her omhandlede thrombininhibitorer og andre polypeptider. En foretrukken fremgangsmåde til udvinding af inhibitorerne med formlen (I) med R i betydningen H eller SO^H består i, at thrombininhibitorerne på grund af deres evne til at danne et kompleks med til bæreren bundet thrombin skilles fra produkter, der ikke danner nogen komplekser med thrombin. De fraktioner, der er udvundet på grund af deres thrombinaffinitet, kan i-gen opløses i de enkelte komponenter ved hjælp af et andet højtopløsende chromatografisk system. Således isoleres inhibitorerne med formlen (I). Til affinitetschroma-tografi har det især vist sig fordelagtigt at anvende thrombin-"Sepharose" . Thrombin-"Sepharose" fremstilles som beskrevet af Brosstad (Thrombos Res. II, 1Γ9, 1977).
Ti'1 adskillelsen hældes thrombin-"Sepharose" på en søjle med en passende puffer, såsom 0,1 M N-methyl-morpholinacetatpuffer med en pH-værdi på 8,0 eller tris/-HC1, 0,1 M pH 8,5. Efter ligevægtsindstilling af søjlen opløses blandingen fra fældningen i den samme puffer og hældes på søjlen. De peptider, der ikke besidder nogen thrombinaffinitet, fjernes ved skylning med pufferen.
Derpå opløses komplekset thrombin/thrombin-inhibitor ved skylning af søjlen med en puffer ud fra 0,5-2 M benzami-din eller 4-aminobenzamidin i 0,1 M N-methylmorpholinace-tat med en pH-værdi på 8,0. De forskellige aktive fraktioner indsamles og afsaltes ved gængs gelpermeations-chromatografi på "Sephadex" G 25 med 0,05 M N-methylmor- DK 173509 B1 8 pholinacetat med en pH-værdi på 8,0.
Adskillelsen af de forskellige thrombin-inhibi-torer fra hinanden sker ved højtopløsende chromatogra-fiske fremgangsmåder. Hertil egner sig især HPLC.
På grund af HPLC-teknologiens høje opløsningsevne er det muligt at adskille inhibitorerne med formlen (I) fra hinanden og fra ubetydelige mængder ledsageprotein og at fremstille disse i ren form.
Som stationær fase har det vist sig fordelagtigt at anvendes derivatiserede silicageler med egnet kornstørrelse (f.eks. mellem 3 og 20 ^om). Til derivatiseringen af silicagelerne egner sig foruden de i vid udstrækning anvendte octadecylsilanrester også et stort antal andre si-lanrester, eller blandinger deraf, såsom silanrester med lavere alkyl, phenylalkyl- eller amino-substitueret al-kyl, hvorhos sidstnævnte er en vis kombination af ionbytter- og "Reverse-Phase" chromatografi. Der kan eksempelvis anvendes skillesøjler med en længde på 5-25 cm og en diameter på 3-10 mm. På tale som pufret elueringsmid-del kommer alle sekundære eller tertiære blandinger af vand og organiske opløsningsmidler med hensigtsmæssig lipophili, såsom lavere alkoholer, ketoner, nitriler, ethere, syrer, aminer, glycolethere, amider og derivater deraf. Som puffer kan der anvendes organiske og uorganiske salte eller forskellige tilsætninger. Elueringen sker fordelagtigt ved en pH-værdi på mellem 2 og 8.
Anvendelsen af flygtige puffere, såsom ammonium-acetat eller ammoniumhydrogencarbonat, gør det muligt at udvinde inhibitorerne fra eluatet ved en simpel frysetørring.
Fraspaltningen af en sulfatmonoestergruppe R i position 64 kan ske analogt med den i DE-A-3.342.139 beskrevne metode surt katalyseret eller enzymatisk ved hjælp af en arylsulfatase.
De her omhandlede polypeptider med formlen (I) DK 173509 B1 9 er farveløse, er opløselige i vand og i vandige puffere, viser sig homogene ved polyacrylamidelektroforese og har isoelektriske punkter på 3,5-4 bestemt ved isoelektrisk fokusering. Såfremt aminosyresammensætningen bestemmes 5 ved fremgangsmåden ifølge Moore og Stein (Methods of Enzymology, bind VI, 819-831, udgivet af Rolovick og Kaplan, Academic Press, New York, London, 1963, fås de i tabel I anførte værdier.
10 Tabel I
II III IV V VI VII VIII IX Asparaginsyre 9 9999 9 10 10
Threonin 6 5454 5 44
Serin 4 4444 4 44 15 Glutaminsyre 13 13 13 12 12 12 11 11
Prolin 3 3344 3 33
Glycin 9 9999 9 99
Valin 2 2222 2 22
Cystein 6 6666 6 66 20 Isoleucin 3 3434 2 44
Leucin 4 4444 4 33
Tyrosin 2 2222 2 22
Phenylalanin 1 1111 1 11
Lysin 3 3333 3 44 25 Histidin 111111 11
Alanin 0 0000 0 11 IX fås ved desulfatisering af VIII.
30 Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til frem stilling af et polypeptid ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at a) peptidet fremstilles på i og for sig kendt måde ved hjælp af fastfasesyntese eller 35 DK 173509 B1 10 b) til fremstilling af et polypeptid, hvori m = 0, I. hirudin underkastes Edman-nedbrydning to gange, II. det således fremkomne peptid omsættes med en aktiv ester af en aminosyre eller et peptid med formlen 5 .. U—(X)m-A-B-C-0H, hvor m, X og A, B og C har de ovenfor anførte betydninger, og U betyder en urethanbeskyttelsesgruppe, 10 III. phenylthiocarbamoylgruppen ved e-aminofunktionen i Lys fraspaltes ved hjælp af hydrazin, og IV. urethan-beskyttelsesgruppen U frapspaltes ved hjælp af en syre eller base, og det ifølge a) eller b) fremstillede polypeptid eventuelt 15 spaltes kemisk eller enzymatisk og eventuelt overføres i et fysiologisk acceptabelt salt deraf.
Ved fastfasesyntesen (jfr. i denne forbindelse Atherton, Sheppard, Perspectives in Peptide Chemistry,
Karger Basel 1981, side 101-117) kan man som regel undlade en OH-beskyttelsesgruppe til Thr.
Syntesen af polypeptidet med formlen (I) sker f.eks. trinvis til hydroxymethyleret polystyren-harpiks. Polystyren er tværbundet f.eks. med 1% divinylbenzen. Den foreligger sædvanligvis i form af små kugler.
Aminosyrerne anvendes beskyttet N-terminalt. Den første N-beskyttede aminosyre anbringes på bæreren ved esterdannelse. Efter fjernelsen af aminobeskyttelsesgrup-pen tilknyttes den næste N-beskyttede aminosyre under anvendelse af et koblingsreagens, såsom dicyclohexylcarbo-diimid. Fjernelse af beskyttelsesgrupper og tilføjelse af yderligere aminosyrer fortsættes, indtil man har opnået den ønskede sekvens.
Valg af beskyttelsesgrupper afhænger af aminosyrerne og koblingsraetoderne.
På tale som aminobeskyttelsesgrupper kommer f.eks.
DK 173509 B1 11 de kendte urethaniske beskyttelsesgrupper som benzyloxy-carbonyl(Z), p-methoxycarbobenzoxy, p-nitrocarbobenzoxy, tert.butyloxycarbonyl(Boc), Fmoc og lignende.
Boc-gruppen foretrækkes, da den kan fraspaltes under relativt milde .betingelser (f.eks. med trifluoreddike-syre eller HC1 i organiske opløsningsmidler).
Threonin kan blokeres som benzylether og S-amino-funktionen i lysin som Z-derivat. Begge disse beskyttelsesgrupper er de mest resistente over for fraspaltnings-reagenser for Boc-gruppen og kan fjernes hydrogenolytisk med en hydrogeneringskatalysator (Pd/aktivt kul) eller f.eks. med natrium i flydende ammoniak.
Det beskyttede peptid kan fjernes fra harpiksen f.eks. med hydrazin. Herved fås hydrazidet, som kan overføres i den frie carboxylsyre f.eks. med N-bromsuccinimid ifølge Int. J. Pept. Prot. Research 17 (1981), 6-11. Om nødvendigt, lukkes disulfid-broerne oxidativt (jfr. Konig,
Geiger, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel, side 31-44).
Ved fremgangsmådevariant b) underkastes hirudin en to gange Edman-nedbrydning, idet dette polypeptid omsættes med et isothiocyanat, fortrinsvis phenylisothio-cyanat, i en egnet pufferopløsning, såsom pyridin/vand eller dioxan/vand, eventuelt under tilsætning af en base, såsom dimethylbenzylamin (DMBA), dimethylallylamin (DMAA) eller triethylamin, fortrinsvis ved ca. 50°C og en pH-værdi på 8-9. Efter fjernelsen af overskud af puffer og overskud af phenylisothiocyanat fraspaltes den N-terminale valin ved behandling med en syre (heptafluor-smørsyre eller trifluoreddikesyre) i 10 minutter ved 50°C som phenylthiazolinon. Denne reaktionsrækkefølge gentages til fraspaltning af den anden valin ved N-ter-minusen.
Det på denne måde fremstillede Des-(Val)2"hirudin--derivat omsættes med en aktiv ester af en aminosyre el- DK 173509 B1 12 ler et peptid med formlen U-(X)m-A-B-C-OH. Egnet er f.eks. p-nitrophenyl-, cyanomethyl-, n-hydroxyphthalimid- eller især N-hydroxysuccinimid-estere. Egnede urethanbeskyttel-sesgrupper U er sådanne, der kan fraspaltes surt eller al-5 kalisk, såsom Boc eller Msc. Om nødvendigt, kan eventuelt også forekommende funktioner i sidekæderne hos B og C beskyttes forbigående med egnede beskyttelsesgrupper.
De på denne måde fremstillede beskyttede forstadier til polypeptidet med formlen (I) (m * 0) behandles med 10 hydrazin-hydrat til fraspaltning af phenylthiocarbamoyl--gruppen ved lysinen i et egnet opløsningsmiddel såsom en lavere alkohol eller en blanding deraf med vand.
Fra dette polypeptid fraspaltes der yderligere de resterende beskyttelsesgrupper på egnet måde (Boc f.eks.
15 med trifluoreddikesyre, Msc med en base), hvorved der fås det her omhandlede polypeptid med formlen (I).
De her omhandlede polypeptider er specifikke støkiometriske hammere af thranbin. Den kvantitative måling af thrombin-hæmningen med de her omhandlede inhibitorer viser, at komplek-20 set thrombin-inhibitor/thrombin praktisk taget ikke dissocierer. Ved hjælp af denne målemetode kan aktiviteten og dermed renhedsgraden af de her omhandlede polypeptider bestemmes under oparbejdningen og rensningen. De således rensede polypeptider med den ovenfor anførte formel (I) 25 kan i denne forbindelse udvise en thrombinhæmning på over 10000 antithrombinenheder/mg og dermed overgå den traditionelle hirudins thrombinhæmning. X denne forbindelse er forbindelserne med formlen (I) med frit phenolisk hydrogen i position 64 som regel endnu mere aktive in vivo.
30 Opfindelsen angår desuden et lægemiddel, som inde holder et polypeptid ifølge opfindelsen og en farmaceutisk acceptabel bærer.
DK 173509 B1 13
De her omhandlede forbindelser kan indgives paren-teralt eller topisk i egnede farmaceutiske præparater.
Til subkutan eller intravenøs applikation bringes de aktive forbindelser eller deres fysiologisk acceptable salte i opløsning, suspension eller emulsion, om Ønsket med de hertil gængse stoffer som opløsningsformidlere, emulgatorer, isotonimidler, konserveringsmidler eller yderligere hjælpestoffer. På tale som opløsningsmidler til de her omhandlede aktive forbindelser og de tilsvarende fysiologisk acceptable salte kommer f.eks. vand, fysiologi- . ske kogsaltopløsninger eller alkoholer, såsom ethanol, propandiol eller glycerol, desuden også sukkeropløsninger, såsom glucose-eller mannitolopløsninger, eller også en blanding af de forskellige nævnte opløsninger. Ved subkutan anvendelse udviser forbindelserne med formlen (I) (R » phenolisk hydrogen) som regel den fordel, at de har en langsommere resorption og dermed en retarderet virkning .
De topiske bærestoffer kan være organiske eller uorganiske forbindelser. Typiske farmaceutisk anvendelige bærestoffer er vandige opløsninger, såsom puffersystemer eller isotoniske blandinger af vand og med vand blandbare opløsningsmidler, såsom alkoholer eller aryl-alkoholer, olier, polyalkylenglycoler, ethylcellulose, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidon eller iso-propylmyristat. Egnede puffermidler er f.eks. natrium-borat, natriumphosphat, natriumacetat eller gluconat-puffere. Den topiske anvendelsesform kan også indeholde ikke-toksiske hjælpestoffer, såsom emulgerende konserveringsmidler, t'værbindere, såsom polyethylenglyco-ler, og antibakterielle forbindelser.
DK 173509 B1 14
Eksempel 1
Bestemmelse af inhibitor-koncentrationen ved thrombin--titrering_ 10-100 ^lliter inhibitoropløsning med et i forvejen bestemt proteinindhold tilsættes 200 ^iliter natrium-hydrogencarbonatopløsning (pH = 7,0, 0,5 M) . Der tilsættes 0,1 ml fibrinogenopløsning (0,5-1%) eller fortyndet citratplasma. Med regelmæssige intervaller under omrøring tilsættes der ved stuetemperatur en aliquot del (50-100 ^iiliter) af thrombinopløsningen (ca. 100 NIH enheder pr. ml). Som omslagspunkt kan der ved den halvkvantitative analyse anvendes væskens koagulering inden for det valgte tidsinterval, eller til kvantitative bestemmelser, turbimetrimåling ved 546 nm.
Eksempel 2
Der anvendes fritlevende blodigler (ikke opdrættede dyr) af arten Hirudo medicinalis, der er indsamlet i Vesttyskland.
Ca. 150-200 g frosne blodigleforender homogeniseres i en blander med 2 liter iskold 0,09%'s vandig na-triumchloridopløsning og 10 ml octanol i løbet af 3 minutter. Efter 30 minutters centrifugering ved 0°C og 10000 omdr./minut klares supernatanten yderligere ved hjælp af filtrering gennem to lag gaze og opvarmes derpå under omrøring inden for 15 minutter til 80°C. Det fremkomne bundfald skilles fra ved filtrering gennem fire lag gaze. Filtratet afkøles hurtigt til 4°C ved omrøring i et isbad og sættes til 7,5 liter forkølet acetone (-20°C). Der .fremkommer igen et bundfald, som efter 5 minutter skilles fra ved filtrering på en glasfil ter tragt og eftervaskes med 1 liter kold acetone (-20°C) . Efter tørring under formindsket tryk fås der 520 mg let gullig pulver med et proteinindhold på 62% (bestemt ved metoden ifølge Lowry). Antithrombinaktivite- DK 173509 B1 15 ten andrager ca. 400 enheder pr. mg.
Eksempel 3 520 mg pulver ifølge eksempel 2 opløses i 75 ml vand, hvorpå der indstilles til en pH-værdi på 8,0 med 5 N ammoniak omrøres i 1 time ved 0-4°C. Den uopløselige andel centrifugeres fra i løbet af 30 minutter med en bægercentrifuge ved 5000 omdr./minut. Efter indstilling af proteinindholdet ved vandtilsætning til 25 mg/ml (Lowry), tilsættes opløsningen 35 ml mættet ammoniumsul-fatopløsning og omrøres i 1 time ved 4°C. Det første bundfald skilles hurtigt fra ved centrifugering (5000 orodr./-min./30 minutter). Der tilsættes yderligere ca. 26 g ammoniumsulfat, og pH-værdien indstilles til 4 med iseddike.
Efter 5 timers henstand centrifugeres den samlede suspension, og det fremkomne fugtige bundfald videreforarbejdes på følgende måde.
Eksempel 4
Det ifølge eksempel 3 fremstillede fugtige bundfald opløses i 200 ml 0,1 M ammoniumhydrogenearbonatopløsning med en pH-værdi på 8 og ultrafiltreres i et 250 ml "Amicon"-element med en 5PM 10-fladmembran (udelukkelsesgrænse 10000 dalton). Herved koncentreres opløsningen til ca. 40 ml, hvorved der mod slutningen efterfyldes to gange med 150 ml 0,1 M ammoniumhydrogencarbonatopløsning med en pH-værdi på 8,0. Frysetørring af remanensen giver ca. 350 mg materiale med et proteinindhold på 89%.
Eksempel 5 På en søjle (0,9 x 15 cm) hældes der thrombin-"Se-pharose" i 0,1 M trispuffer (HC1) med en pH-værdi på 8.
Materialet fra eksempel 3 opløses i den samme puffer, og denne prøve overføres til søjlen. Ved skylning af søjlen med ekvilibreringspufferen fjernes inaktive ledsagestof- DK 173509 B1 16 fer. Derpå kan hirudin fortrænges af komplekset thrombin--hirudin med en opløsning af benzamidin <1,5 M trispuffer, pH = 7) eller med 4-aminobenzamidin (0,2 M trispuffer, pH = 7) og elueres portionsvis. Til afprøvning af antithrom-binaktiviteten skal den kompetitive inhibitor først skilles fra hirudin ved gelfiltrering på "Sephadex" G 20. Vægtudbytte: 55%. Aktivitet: 6000-12000 ATU/mg.
Eksempel 6 20 mg inhibitor ifølge eksempel 3 opløses i 200 filter vand med en pH-værdi på 2,16 (indstillet med trifluor-eddikesyre plus 5% acetonitril) og indsprøjtes på én med octadecylsilansilicagel (5 ^lmeter) fyldt stålsøjle ("Shan-don" ODS). Søjlen elueres ved en gradient på maksimalt 2%/-minut mellem startpufferen (vand, pH = 2,16 + 5% acetonitril) og acetonitril. Fraktionerne opsamles enkeltvis. Efter tørring har de her omhandlede inhibitorer med formlen (I) (R = H eller SO^H) en specifik aktivitet, der svarer til støkiometrien af et l:l-kompleks med thrombin.
Eksempel 7 a) Det ifølge eksempel 4 fremstillede materiale renses på DEAE-"Sephadex" A-25 som beskrevet af Markwardt,
Walsmann, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 348 [19671 1381--1386.
b) 1,1 mg af den således fremstillede proteinfraktion deles ved HPLC på en 25 cm x 4,6 mm "Bio-Rad" (Richmond, CA) "Hi-pore"-søjle, der er fyldt med C-18 "Reverse-Phase "-silicagel med en partikelstørrelse på 5 ^xm og en porebredde på 330 Å. Som mobil fase anvendes der 10% acetonitril i vand med 0,1% trifluoreddikesyre (A) / 10% vand i acetonitril med 0,1% trifluoreddikesyre (B) med en gradienthastighed A:B på 1%/min. Det tidslige forløb af chromatografien overvåges ved detektion ved 216 nm (jfr. fig. 1). De i fig. 1 skraverede fraktioner 1-5 re- DK 173509 B1 17 chromatograferes endnu en gang, hvorved der benyttes det samme HPLC-system.
c) Rechromatografering af fraktion 1 (fig. 2) giver ca. 200 ^ig af et protein, hvis struktur bestemmes ved sekvensanalyse. Det tildeles den følgende struktur: ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCI-LGSDGEKN QCVTGEGTPKP. QSHNDGDFEE-I P E E Y L Q.
d) Rechromatografering af fraktion 2 (fig. 3) giver ca. 300 ^ag af et protein, hvis struktur bestemmes ved sekvensanalyse. Det tildeles følgende struktur: ITTYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKC -ILGSDGEKN QCVTGEGTPKPQSHNDGDFE -EIPEEYLQ.
d) Rechromatografering af fraktion 3 (fig. 4) giver ca. 150 ^ig af et protein, hvis struktur bestemmes ved sekvensanalyse. Det tildeles den følgende struktur: TYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCIL -GSDGEKN QCVTGEGTPKPQSHNDGDFEE -I P E E Y L Q.
f) Rechromatografering af fraktion 4 (fig. 5) giver ca. 80 yag af et protein, hvis struktur bestemmes ved sekvensanalyse. Det tildeles den følgende struktur: ITYTDC IESGQNLCLCEGSNVCGQGNKC-ILG.SDGEKN QCVTGEGTPKPQSHNDGDF-EEIPEEYLQ.
g) Rechromatografering af fraktion 5 (fig. 6) giver ca. 40 ^ig af et protein, hvis struktur endnu ikke er bestemt.
Eksempel 8 a) Der gås ud fra et materiale, der er udvundet ved oparbejdning af i handelen tilgængelige dyr som beskrevet i eksempel 5, og dette underkastes en forudgående rensning som beskrevet i eksempel 7a).
DK 173509 B1 18 b) 1 mg af den således fremstillede proteinfraktion opdeles ved hjælp af HPLC som beskrevet i eksempel 7b). Den i fig. 7 skraverede fraktion rechromatogra-feres, hvorved betingelserne forblev de samme bortset fra en gradienthastighed A:B på 0,8%/minut (fig. 8). Fig. 9 viser chromatogrammet af det således udvundne, analyserene protein, der ved sekvensanalyse tildeles den følgende struktur: ITYTDCIESGQNLCLCEGSNVCGKGNKC-ILGSDG KDNQCVTGEGTPKPQSHNDGD-FEEIPEEYAQ.
Tre- og et-bogstavssymboler for aminosyrer har følgende betydninger:
Aminosyre_Forkortelse_Aminosyre_Forkortelse
Alanin Ala (A) Phenylalanin Phe (F)
Arginin Arg (R) Prolin Pro (P)
Cystein Cys (C) Serin Ser (S)
Threonin Thr (T)
Thryptophan Trp (W)
Glycin Gly (G) Tyrosin Tyr (Y)
Histidin His (H) Valin Val (V)
Asparaginsyre Asp (D)
Isoleucin Ile (I) Asparagin Asn (N)
Glutaminsyre Glu (E)
Leucin Leu (L Glutamin Gin (Q)
Lysin Lys (K)
Methionin Met (M)
Claims (11)
1 -Lys-Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly- D - G -Asn-Gln-Cys- *♦1 **2 m |»I» U6 i*7 i* 8 «*9 50 51 52 S3 -Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn- 5«» 53 56 57 58 59 60 61 62 63 6·* 65 -Asp-Gly-Asp-Phe-Glu- 33 -Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(R)- H - 66
15 -Gln-(Z) -OH n (I) hvor m er 0-50, n er 0-100, og R betyder phenolisk hydrogen eller en phenolestergruppe, X er ens eller forskellige rester af naturligt forekommende a-aminosyrer, Z er ens eller forskellige rester af naturligt forekommende a-aminosyrer, og 25 A betyder Ile eller fravær af en aminosyre, B betyder Ile eller Thr eller fravær af en aminosyre, C betyder Thr, Val, Ile, Leu eller Phe, D betyder Glu eller fravær af en aminosyre, E betyder Glu eller Pro, F betyder Thr eller Ile, G betyder Lys eller Lys-Asp, H betyder Ala eller Leu, og J 30 betyder Gin eller Lys, hvorhos de seks Cys-rester er bundet parvis via disulfid-broer, samt fysiologisk acceptable salte deraf, hvorved, når J = Gin, G £ Lys eller H £ Leu eller R £ hydrogen, og hvis A og B er 35 fraværende, C £ Val. DK 173509 B1 20
2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at C betyder Thr.
3. Polypeptid ifølge krav 2, kendetegnet 5 ved, at A betyder Ile.
4. Forbindelse ifølge mindst et af kravene 1-3, kendetegnet ved, at R betyder hydrogen, SO3H eller PO3H2. 10
5. Forbindelse ifølge mindst et af kravene 1-4, kendetegnet ved, at R betyder SO3H.
6. Forbindelse ifølge ethvert af kravene 1-4, k e n-15 detegnet ved, at R betyder phenolisk hydrogen.
7. Peptidisk spaltningsprodukt af et polypeptid ifølge mindst et af kravene 1-6, hvilket spaltningsprodukt har antithrombinaktivitet, med undtagelse af spaltningsprodukter 20 af et peptid med formlen lie Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asr. Gly Lys Gly Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro Gin Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin 25
8. Fremgangsmåde til udvinding af et rent polypeptid ifølge mindst et af kravene 1-7, kendetegnet ved, at polypeptidet isoleres fra igler af ordenen Gnathob- 30 dellida, fortrinsvis fra igler af slægten Hirudo, ved hjælp af en kombination af ekstraktionsmetoder, fældningsmetoder, membranfiltrering og/eller chromatografiske fremgangsmåder, en eventuelt tilstedeværende phenolestergruppe R om ønsket fraspaltes hydrolytisk under dannelse af en phenolisk 35 hydroxylgruppe, og peptidet eventuelt spaltes kemisk eller enzymatisk, og det således fremstillede peptid eventuelt DK 173509 B1 21 overføres i fysiologisk acceptable salte deraf.
9. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid med formlen (I) eller et spaltningsprodukt deraf ifølge 5 mindst et af kravene 1-7, kendetegnet ved, at a) peptidet fremstilles på i og for sig kendt måde ved hjælp af fastfasesyntese eller b) til fremstilling af et polypeptid, hvor m er O, I. hirudin underkastes en Edman-nedbrydning to gange,
10 II. det således fremkomne peptid omsættes med en aktiv ester af en aminosyre eller et peptid med formlen U-Xm-A-B-C-0H, hvor m, X, A, B og C har de i krav 1 anførte betydninger, og U betyder en urethanbeskyttelsesgruppe. III. phenylthiocarbamoylgruppen ved e-aminofunktionen 15 spaltes fra Lys ved hjælp af hydrazin, og IV. urethanbeskyttelsesgruppen U spaltes fra ved hjælp af en syre eller base, og det ifølge a) eller b) fremstillede polypeptid eventuelt spaltes kemisk eller enzymatisk og eventuelt overføres i et fysiologisk acceptabelt salt 20 deraf.
10. Peptid ifølge mindst et af kravene 1-7 til anvendelse som lægemiddel. 25
11. Lægemiddel, kendetegnet ved, at det indeholder et peptid ifølge mindst et af kravene 1-7 og en farmaceutisk acceptabel bærer.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19853525428 DE3525428A1 (de) | 1985-07-17 | 1985-07-17 | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
DE3525428 | 1985-07-17 | ||
DE3601032 | 1986-01-16 | ||
DE19863601032 DE3601032A1 (de) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK338486D0 DK338486D0 (da) | 1986-07-16 |
DK338486A DK338486A (da) | 1987-01-18 |
DK173509B1 true DK173509B1 (da) | 2001-01-15 |
Family
ID=25834067
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK198603384A DK173509B1 (da) | 1985-07-17 | 1986-07-16 | Polypeptider med blodkoaguleringshæmmende virkning, deres fremstilling eller udvinding samt midler med indhold deraf |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4791100A (da) |
EP (1) | EP0209061B1 (da) |
JP (1) | JPH0764875B2 (da) |
KR (1) | KR940000758B1 (da) |
AU (1) | AU593820B2 (da) |
CA (1) | CA1340102C (da) |
DE (1) | DE3689525D1 (da) |
DK (1) | DK173509B1 (da) |
ES (1) | ES2000216A6 (da) |
FI (1) | FI862950A (da) |
GR (1) | GR861837B (da) |
HU (1) | HUT41418A (da) |
IE (1) | IE61569B1 (da) |
IL (1) | IL79424A (da) |
NO (1) | NO862876L (da) |
PT (1) | PT82993B (da) |
Families Citing this family (56)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE64956T1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
FI96956C (fi) * | 1985-04-11 | 1996-09-25 | Hoechst Ag | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hirudiinijohdannaisen valmistamiseksi |
DE3738541A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
FR2607517B2 (fr) * | 1986-12-01 | 1989-12-22 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
US5192745A (en) * | 1987-05-21 | 1993-03-09 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Cyclic anticoagulant peptides |
US5236898A (en) * | 1987-05-21 | 1993-08-17 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Cyclic anticoagulant peptides |
US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
US5114921A (en) * | 1988-05-27 | 1992-05-19 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Amphiphilic peptides and use thereof |
WO1989011290A1 (en) * | 1988-05-27 | 1989-11-30 | Magainin Sciences, Inc. | Amphiphilic peptides and use thereof |
DE3819079A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung |
US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
EP0347376B1 (en) * | 1988-06-11 | 1994-03-23 | Ciba-Geigy Ag | Novel polypeptides with an anticoagulant activity |
IL86856A0 (en) * | 1988-06-24 | 1988-11-30 | Yissum Res Dev Co | Bovine xa factor and pharmaceutical compositions containing the same |
IL87004A (en) * | 1988-07-06 | 1992-08-18 | Technion Res & Dev Foundation | Method and apparatus for bioaffinity separation |
GB8817160D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Novel proteins |
DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
GB8826428D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Biopharm Ltd | Antithrombin |
US4861865A (en) * | 1989-01-23 | 1989-08-29 | Washington University | Novel antithrombin peptide |
US5254535A (en) * | 1989-04-17 | 1993-10-19 | The Children's Hospital Of Pennsylvania | Composition and treatment with biologically active peptides and antibiotic |
US5187155A (en) * | 1989-06-23 | 1993-02-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Anticoagulant peptides |
US5192747A (en) * | 1989-10-03 | 1993-03-09 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
ZA907743B (en) * | 1989-10-03 | 1991-07-31 | Merrell Dow Pharma | Radiolabeled anticoagulant peptides |
US5190919A (en) * | 1989-11-13 | 1993-03-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antihemostatic factor vii peptides |
DE3939801A1 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-06 | Basf Ag | Neue proteine und ihre herstellung |
DE4001238A1 (de) * | 1990-01-18 | 1991-07-25 | Basf Ag | Verfahren zur anreicherung bzw. reinigung von biomolekuelen |
US5792831A (en) * | 1990-02-08 | 1998-08-11 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Analogues of magainin peptides containing D-amino acids |
US5459237A (en) * | 1990-02-08 | 1995-10-17 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Peptide compositions and uses therefor |
WO1991012015A1 (en) * | 1990-02-08 | 1991-08-22 | Magainin Sciences Inc. | Biologically active amphiphilic peptides and method of inhibiting growth of target cells, virus or virally-infected cell |
AU641215B2 (en) * | 1990-02-13 | 1993-09-16 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Stabilized sulfonate, sulfate, phosphonate and phosphate derivatives of hirudin |
US5386009A (en) * | 1990-03-19 | 1995-01-31 | Merck & Co. Inc. | Lipopeptide derivatives |
US5330973A (en) * | 1990-03-19 | 1994-07-19 | Merck & Co., Inc. | Lipopeptide derivatives |
JPH05507273A (ja) * | 1990-05-14 | 1993-10-21 | マゲイニン サイエンセズ インコーポレーテッド | Dアミノ酸残基を有する生物活性ペプチドの組成物およびそれによる治療方法 |
IL98506A (en) * | 1990-06-18 | 1996-09-12 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Peptides, of antibiotics, processes for their preparation and pharmaceutical preparations containing them |
CA2045073A1 (en) * | 1990-06-27 | 1991-12-28 | Barry Berkowitz | Composition and treatment with biologically active peptides and antibiotics which inhibit dna gyrase |
US5208220A (en) * | 1990-06-27 | 1993-05-04 | Magainin Pharmaceuticals, Inc. | Composition and treatment with biologically active peptides and antibiotics which inhibit DNA gyrase |
US5428009A (en) * | 1990-07-16 | 1995-06-27 | Merck & Co., Inc. | Lipopeptide derivatives |
CA2047527A1 (en) * | 1990-07-24 | 1992-01-25 | Christopher Dunwiddie | Method for administering a therapeutic anticoagulant |
DE4031731A1 (de) * | 1990-10-06 | 1992-04-09 | Basf Ag | Protein aus hirudo medicinalis |
US5369093A (en) * | 1991-03-15 | 1994-11-29 | Merck & Co., Inc. | Lipopeptide derivatives |
US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
US5385884A (en) * | 1991-08-27 | 1995-01-31 | Merck & Co. Inc. | Lipopeptide derivatives |
AU2901692A (en) * | 1991-10-16 | 1993-05-21 | Children's Hospital Of Philadelphia, The | Composition and treatment with biologically active peptides and antibiotic |
DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
US5863534A (en) * | 1993-04-09 | 1999-01-26 | Bio-Technology General Corp. | Polypeptide having factor Xa inhibitory method of reducing blood coagulation with a novel polypeptide having factor Xa inhibitory activity |
DE69429858D1 (de) * | 1993-04-09 | 2002-03-21 | Bio Technology General Corp | Herstellung eines rekombinanten inhibitors des faktors xa des blutegels hirudo medicinalis |
GB9309509D0 (en) * | 1993-05-07 | 1993-06-23 | Merck Patent Gmbh | Thrombin inhibitors |
DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
DE19529997C1 (de) | 1995-08-16 | 1997-04-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur Inaktivierung von Carboxypeptidase Y in hirudinhaltigen Kulturbrühen |
DE19543737A1 (de) * | 1995-11-24 | 1997-05-28 | Hoechst Ag | Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices |
DE19544233A1 (de) * | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Hoechst Ag | Verfahren zur Nutzung des Hefe-ADH II-Promotorsystems zur biotechnologischen Produktion heterologer Proteine in hohen Ausbeuten |
EP0787569B1 (en) | 1996-01-31 | 2002-10-02 | Sumitomo Bakelite Company Limited | Method of producing epoxy resin-encapsulated semiconductor device |
EP1173193A4 (en) | 1999-04-02 | 2003-01-29 | Univ Princeton | DES-LEUCYL GLYCOPEPTIDE ANTIBIOTICS AND METHOD OF PREPARATION |
US6699836B2 (en) | 1999-04-02 | 2004-03-02 | The Trustees Of Princeton University | Vancomycin analogs |
KR20110089427A (ko) * | 2008-11-19 | 2011-08-08 | 아반토르 퍼포먼스 머티리얼스, 인크. | 페녹시 알킬 및 알콕시- 또는 페녹시-페닐 알킬 리간드에 기반한 새로운 크로마토그래피 매질 |
CN102373216B (zh) * | 2011-10-28 | 2013-06-05 | 元昊 | 一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺 |
CN113956339B (zh) * | 2021-10-28 | 2023-02-24 | 中国药科大学 | 宽体金线蛭抗凝血因子XIa多肽及其应用 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3342139A1 (de) * | 1983-11-22 | 1985-05-30 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
CA1341417C (fr) * | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
DE3445532A1 (de) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Hirudin-pa, desulfatohirudine-pa, verfahren zur herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
-
1986
- 1986-07-08 EP EP86109309A patent/EP0209061B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-08 DE DE86109309T patent/DE3689525D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-15 ES ES8600317A patent/ES2000216A6/es not_active Expired
- 1986-07-15 IL IL79424A patent/IL79424A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-07-15 HU HU862913A patent/HUT41418A/hu unknown
- 1986-07-15 GR GR861837A patent/GR861837B/el unknown
- 1986-07-15 US US06/885,821 patent/US4791100A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-15 FI FI862950A patent/FI862950A/fi not_active Application Discontinuation
- 1986-07-16 CA CA000513871A patent/CA1340102C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-07-16 KR KR1019860005761A patent/KR940000758B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-07-16 IE IE190286A patent/IE61569B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-07-16 DK DK198603384A patent/DK173509B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-07-16 NO NO862876A patent/NO862876L/no unknown
- 1986-07-16 AU AU60233/86A patent/AU593820B2/en not_active Expired
- 1986-07-16 PT PT82993A patent/PT82993B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-07-16 JP JP61165699A patent/JPH0764875B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PT82993A (de) | 1986-08-01 |
NO862876D0 (no) | 1986-07-16 |
GR861837B (en) | 1986-11-11 |
NO862876L (no) | 1987-01-19 |
ES2000216A6 (es) | 1988-01-16 |
JPS6222799A (ja) | 1987-01-30 |
KR940000758B1 (ko) | 1994-01-29 |
HUT41418A (en) | 1987-04-28 |
EP0209061A2 (de) | 1987-01-21 |
EP0209061B1 (de) | 1994-01-12 |
KR870001237A (ko) | 1987-03-12 |
EP0209061A3 (en) | 1989-03-15 |
CA1340102C (en) | 1998-10-27 |
IL79424A (en) | 1992-02-16 |
IE861902L (en) | 1987-01-17 |
AU6023386A (en) | 1987-01-22 |
DK338486A (da) | 1987-01-18 |
DE3689525D1 (de) | 1994-02-24 |
FI862950A0 (fi) | 1986-07-15 |
IE61569B1 (en) | 1994-11-16 |
IL79424A0 (en) | 1986-10-31 |
DK338486D0 (da) | 1986-07-16 |
US4791100A (en) | 1988-12-13 |
AU593820B2 (en) | 1990-02-22 |
FI862950A (fi) | 1987-01-18 |
JPH0764875B2 (ja) | 1995-07-12 |
PT82993B (pt) | 1989-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK173509B1 (da) | Polypeptider med blodkoaguleringshæmmende virkning, deres fremstilling eller udvinding samt midler med indhold deraf | |
DK171824B1 (da) | Blodkoagulationsinhiberende hirudinderivater, fremgangsmåde til deres udvinding, deres anvendelse samt middel indeholdende dem | |
US4636489A (en) | Modified protease inhibitors, process for their preparation, and pharmaceutical compositions prepared therefrom | |
CA1230591A (en) | PURIFIED TRANSFORMING GROWTH FACTOR-.beta. DERIVED FROM HUMAN PLATELETS AND PLACENTAS | |
RU2050160C1 (ru) | Полипептид, полученный из ткани или секрета пиявок hirudinaria manillensis, специфически ингибирующий тромбин | |
EP0155786B1 (en) | New peptide, and production and use thereof | |
PL111979B1 (en) | Process for preparing novel peptides | |
JP3460851B2 (ja) | 新規システインプロテアーゼインヒビター | |
JPH03255095A (ja) | カゼインペプチド | |
JP3893579B2 (ja) | 新規なテトラペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
JP2871031B2 (ja) | 新規なペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
JP2678180B2 (ja) | 新規なテトラペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素 阻害剤 | |
Fiedler | PIG PANCREATIC KALLIKREIN: STRUCTURE AND CATALYTIC PROPERTIES¹ | |
JP2990354B1 (ja) | 新規なペンタペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
JP2003267994A (ja) | 新規なペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
US6184346B1 (en) | Protease inhibitors derived from guamerin | |
JP3709425B2 (ja) | 新規なトリペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
JP3885214B2 (ja) | 新規なヘクサペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
JPH1036391A (ja) | 新規なペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 | |
IL93915A (en) | Peptides from hirudinaria manillensis having anti-thrombin activity and their use. | |
JPH04169598A (ja) | 新規ペプチド、その塩及びその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B1 | Patent granted (law 1993) | ||
PUP | Patent expired |