DK171824B1 - Blodkoagulationsinhiberende hirudinderivater, fremgangsmåde til deres udvinding, deres anvendelse samt middel indeholdende dem - Google Patents

Description

DK 171824 B1

Den foreliggende opfindelse angår hirudinderivater samt deres fysiologisk acceptable salte og en fremgangsmåde til deres udvinding. Endvidere angår opfindelsen hirudin-derivaterne til anvendelse som lægemiddel og som blodkoagu-5 leringsinhibitor samt et middel indeholdende hirudinderi-vaterne.

Antikoagulerende midler tjener forebyggelsen og behandlingen af thromboemboliske processer? deres hovedanvendelsesområde er derved frem for alt venøse thrombo-10 embolier. Antikoagulerende midler er endvidere nødvendige ved fremstillingen af konserverede blodpræparater. Derivater af 4-hydroxycumarin eller 1,4-indandion, som eksempelvis anvendes til dette formål, har trods vidtgående optimering en række ulemper, jvf. Mutschler, Arzneimittel-15 wirkungen, 4. oplag, Stuttgart 1981, side 375 ff.

Det er i overensstemmelse hermed ønskeligt især inden for humanmedicinen at have blodkoagulationsinhibitorer til rådighed, som har en ringe toksicitet og få bivirkninger, og som ved deres metabolisme ikke udgør no- 2 0 gen belastning for den syge organisme.

Foruden kroppens egne plasmatiske inhibitorer såsom antithrombin III har også mange andre proteiner blod-koagulationsinhiberende virkning, såsom kunitzinhibitoren, der udvindes af sojabønner. Denne inhibitor blokerer blod-25 koagulationskaskaden ved inhibering af den aktiverede faktor Xa, men inhibitorens specificitet er så ringe, at der opstår mange bivirkninger: inhibering af plasmakallikrein, af plasmin og af trypsin, således at de terapeutiske anvendelser er udelukkede. Heller ikke andre aktive stoffer, 30 såsom ascaris- eller kazalsinhibitoren, kan opnå nogen betydning på grund af manglende specificitet.

Hirudin (The Merck Index, 9. oplag, Rahway 1976, s. 618; Pharmazie _36 [1981] , hæfte 10), som er et af Hirudo medicinalis udvundet polypeptid, besidder derimod en speci- 3 5 fik antithrombinvirkning, jvf. Markwardt, Blutgerinnungshem- 2 DK 171824 B1 mende Wirkstoffe aus blutsaugenden Tieren, Jena (1963). Den kostbare fremgangsmåde til dets isolering og rensning har hidtil været en ulempe for dets praktiske anvendelse.

I tidsskriftet "Die Pharmazie", Heft 10, okt. 1981, side 5 655, 2. spalte anføres det, at hirudin har en thrombinbin- dingsevne, der er ganske nær et 1:1 forhold. Imidlertid er angivelsen af strukturen, molekylvægten og dermed også aktiviteten blot spekulativt anført. Fig. 1 øverst på side 655 i nævnte litteratursted viser således en sekvens af et 10 hirudin, hvori positionerne 50-55 ikke blot ikke er bestemt, hvilket fremgår af at aminosyrerne er anført i parentes, men som også er forskellig fra strukturen af hirudinderivatet ifølge opfindelsen, se position 51-54 i nedenstående formlen II. Det fremgår endvidere af tabel 3 i det fremdragne lit-15 teratursted, at der er betragtelige forskelle med hensyn til de anførte molekylvægte. Det har derfor heller ikke været muligt for forfatterne at angive aktiviteten af rent hirudin. De anførte data er rent spekulation! Det fremdragne litteratursted repræsenterer derfor ikke reproducerbar kendt 20 teknik og kan derfor ikke betragtes som teknisk forudsætning for den foreliggende opfindelse.

Hirudinderivaterne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de har formlen 25 12 3 4 5 6 7 6 9 10111213m H-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-GIu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu- 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 -Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile- 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 30 -Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu- 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 -Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu- 57 58 S 9 60 61 62 63 64

-Glu-Ile-Pro-G3.u-Glu-Tyr(R)-Leu-Gln-0H

35 (II) 3 DK 171824 B1 hvori R betyder phenolisk hydrogen eller SO3H, og hvori 2 af de 6 Cys-grupper i positionerne 5, 13, 15, 21, 27, 38 er forbundet via disulfidbroer, samt deres fysiologisk 5 acceptable salte.

Fysiologisk acceptable salte er især alkalimetal- og jordalkalimetalsalte, salte med fysiologisk acceptable aminer samt salte med fysiologisk acceptable syrer, såsom HC1, H2SO4, maleinsyre eller eddikesyre.

10 Det har nu overraskende vist sig, at dette højaktive hirudinderivat med formlen (II) , hvori R er hydrogen eller SO3H, kan isoleres fra blodigler.

Hirudinderivatet med formlen (II) ifølge opfindelsen er farveløst, opløseligt i vand og i vandige puffere, viser 15 sig som homogent ved polyacrylamid-elektroforese og har et isoelektrisk punkt på 3,9 (bestemt ved isoelektrisk fokusering) . Bestemmer man aminosyresammensætningen ved fremgangsmåden ifølge Moore og Stein (Methods of Enzymology, bind VI, 819-831, udgivet af Rolovick og Kaplan, Academic Press, New 20 York, London, 1963), finder man følgende værdier: 9 aspara-ginsyre, 5 threonin, 4 serin, 13 glutaminsyre, 3 prolin, 9 glycin, 2 valin, 6 cystein, 2 isoleucin, 4 leucin, 2 tyrosin, 1 phenylalanin, 3 lysin og 1 histidin, hvor OH-gruppen i en af tyrosingrupperne kan være forestret med svovlsyre.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til udvinding af et renset hirudinderivat med formlen II er ejendommelig ved, at man isolerer derivatet fra orme af Gnathobdellida-ordenen ved hjælp af en kombination af ekstraktionsmetoder, fældningsmetoder, membranfiltrering og/eller chromatografiske 30 fremgangsmåder og eventuelt overfører det tilvejebragte derivat i dets fysiologisk acceptable salte.

Hirudinderivatet udvindes fortrinsvis fra halskirtlerne hos orme af Gnathobdellida-ordenen. Slægerne Hirudo og Haemodipsa foretrækkes. Især foretrækkes slægten Hirudo, 35 deriblandt især Hirudo medicinalis. Foruden blodiglens hals-kirtler kan også dets forreste kropsregion eller hele blodig- 4 DK 171824 B1 len finde anvendelse.

I Enzymology, bind 5, "Hirudin as an Inhibitor of Thrombin", er der beskrevet en fremgangsmåde til udvinding af et råekstrakt af blodigler. En fremgangsmåde til rens-5 ning af hirudin er kendt fra Bull. Soc. Chim. Biol. 45^

[1963] 55.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen har især en kombination af fældningsmetoder og af gelchromatografi el ler ultrafiltrering og af højopløsende fordelingschromato- 10 grafi på "Reverse-Phase"-materiale og chromatografi på si-licagel eller aluminiumoxid vist sig som nyttig. Alt efter råekstraktens beskaffenhed kan man imidlertid også med fordel tage andre chromatografifremgangsmåder i brug (eventuelt også i kombination med ovennævnte fremgangsmåde), såsom kation- eller anionbytter-chromatografi og chromatografi på uspecificerede absorptionsmaterialer, især hydroxylapa-tit.

For eksempelvis at udvinde et til chromatografi egnet råekstrakt kan man findele blodiglens hoveddele i 20 frossen tilstand,og der kan ekstraheres ved hjælp af en vandig pufferopløsning (f.eks. phosphatpuffer). Det uopløselige materiale skilles fra, f.eks. ved kortvarig centrifugering eller ved filtrering over gaze, og hirudinderivatet fra den således tilvejebragte ekstrakt skilles fra og isoleres. Det er fordelagtigt hurtigt at opvarme denne ekstrakt til 70-90°C, for derved kan hovedparten af de pro-teolytiske enzymer denaturere og fælde ud, og derpå kan deres fraskillelse f.eks. ske ved centrifugering. Fra eks-trakten isolerer man den proteinfraktion, som indeholder derivatet ifølge opfindelsen, f.eks. ved fældning på den måde, at man hælder ekstrakten i et organisk opløsningsmiddel, der er blandbart med vand. F.eks. kan man anvende acetone i en mængde, der er flere gange større end ekstraktvolumenet, fortrinsvis ca. 10 gange større, idet 3 5 DK 171824 Bl 5

O

fældningen foretages i kulden, sædvanligvis fra 0 til -40°C, fortrinsvis ved ca. -20°C.

Proteiner med højere molekylvægt kan skilles fra denne råekstrakt ved f.eks. ultrafiltrering eller ved 5 gelchromatografi. Ved større udgangsblandinger kan ultra filtreringen f.eks. ske i to trin: i det første trin arbejder man med en kapillarmembran med en udelukkelsesgrænse på 500.000 Dalton og derpå i det andet trin med en flademembran med en udelukkelsesgrænse på 10.000 Dalton. Ved 10 hjælp af kapillarmembranen opnår man en hurtig fraskillel-se af højeremolekylært materiale, som ville forhindre gennemstrømningen af den selektivt arbejdende flademembran.

Ved små mængder kan man også give afkald på det første trin af ultrafiltreringen.

15 En anden mulighed for at gennemføre fældningen er tilsætningen af salte, såsom ammoniumsulfat. Ved styring af pH-værdien opnår fældningen en vis selektivitet. Derivatet ifølge opfindelsen, som har et isoelektrisk punkt på 3,9, kan udfældes i et pH-værdiområde mellem 3 og 5, for-20 trinsvis ca. 4, ved tilsætning af ammoniumsulfat indtil en koncentration på ca. 50%, idet adskillige ledsageproteiner derved forbliver i opløsningen. Også denne fældning gennemføres under afkøling ved fra -5 til +15°C, fortrinsvis mellem 0 og 4°C.

25 Det således tilvejebragte materiale består på grund af den hidtil anvendte fremgangsmåde stadigvæk af en blanding af polypeptider. En foretrukken fremgangsmåde til udvinding af inhibitoren med formlen (II), hvor R = H eller SO^H, består i, at råekstrakten bliver fraktioneret ved hjælp af 30 ét eller flere højtopløsende chromatografisysterner. Denne fraktion kan igen ved et andet høj topløsende chromatogra-fisk system opløses i enkelte komponenter for følgelig at isolere inhibitoren med formlen II.

Som første chromatografiske trin ved udvindingen af disse inhibitorer har fremgangsmåder, som de er kendt fra EP-offentliggørelsesskrift nr. 82.359, vist sig for- 6 DK 171824 B1 delagtige. Derved adskiller man proteinblandingerne på traditionel silicagel med egnet kornstørrelse eller på silicagel-færdigkolonner (såsom Lobar'*'-kolonnen) ved hjælp af et puffersystem.

5 Anbringelsen af prøven på kolonnen kan gennemfø res på en forud ækvilibreret kolonne. Man kan imidlertid også uden ulempe anbringe substansblandingen på den tørre kolonne.

Et forhold mellem proteinblandingen og de absorbe-10 rende materialer mellem 1 til 50 og 1 til 200 har vist som fordelagtigt.

Elueringen kan ske med en puffer af chloroform, methanol, iseddike, vand og triethylamin. Man kan også anvende andre pufferopløsninger dertil, såsom en blanding 15 af 70% ethanol og 30% tris-puffer (0,05 M, pH-værdi = 8,0).

Det sidste trin i rensningen består af en chroma-tografisk adskillelse på "Reverse-Phase"-materiale. På grund af HPLC-teknologiens høje opløsningsevne, jvf. f.eks. "High Performance Liquid Chromatography Advances 20 and Perspectives", bind 3, Csaba Horvath, Academic Press, 1983, s. 50-83 eller "Methods of Enzymology", bind 91, s. 137-190 og 352-359, 1983, er det muligt at skille inhibitorerne med formlen (II) fra ledsageproteiner og at fremstille dem i ren form.

25 Til den stationære fase har derivatiserede silicageler med egnet kornstørrelse (f.eks. mellem 3 og 20 μηι) vist sig fordelagtige. Til derivatiseringen af silicagel egner sig foruden de udbredt anvendte octadecylsilangrupper også adskillige andre silangrupper eller blandinger deaf, såsom 30 silangruppermed lavere alkyl, phenylalkyl eller aminosub-stitueret alkyl, idet sidstnævnte frembyder en vis kombination af ionbytter- og "Reverse-Phase"-chromatografi. Man kan f.eks. anvende separationskolonner med en længde fra 5 til 25 cm og en diameter fra 3 til 10 mm. På tale som pufret 35 elueringsmiddel kommer alle sekundære eller tertiære blandinger mellem vand og organiske opløsningsmidler med egnet 7 DK 171824 B1 lipophili, såsom lavere alkoholer, ketoner, nitriler, ethere, syrer, aminer, glycolethere, amider og deres derivater. Som puffersubstans kan man anvende organiske og uorganiske salte eller forskellige tilsætninger. Elueringen sker fordelagtigt 5 ved en pH-værdi mellem 2 og 8.

Anvendelsen af flygtige puffersubstanser, såsom ammoniumacetat eller ammoniumbicarbonat, muliggør udvindingen af inhibitorerne fra eluatet ved simpel frysetørring.

10 Hirudinderivatet med ovenstående formel (II) kan a) fremstilles på i og for sig kendt måde ved hjælp af fast-fasesyntese, eller ved at man b) I. underkaster hirudin en Edman-nedbrydning to gange, II. omsætter det således tilvejebragte peptid med en 15 aktiv ester af en aminosyre eller et peptid med form len U-Y-OH, hvor Y er som ovenfor defineret, og U er en syre- eller baselabil urethanbeskyttelsesgruppe, III. fraspalter phenylthiocarbamoylgruppen (fra Edman- nedbrydningen) ved e-aminofunktionen af Lys ved hjælp 20 af hydrazin og IV. urethan-beskyttelsesgruppen U ved hjælp af en syre eller base og eventuelt overfører det ved a) eller b) tilvejebragte hirudinderivat i et fysiologisk acceptabelt salt.

25

Ved fastfasesyntesen, jvf. også Atherton, Sheppard, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel 1981, s.

101-117, kan man i reglen give afkald på en OH-beskyttel-sesgruppe for Thr.

30 Syntesen af hirudinderivatet med formlen (II) sker f.eks.

trinvis på hydroxymethyleret polystyrenharpiks. Polystyrenet er eksempelvis tværbundet med 1% divinylbenzen. Det foreligger sædvanligvis i form af små kugler.

Aminosyrerne anvendes N-terminalt beskyttede. Den 35 første N-beskyttede aminosyre anbringes på bæreren ved esterdannelse. Efter fjernelse af aminobeskyttelsesgrup- 8 DK 171824 B1

O

pen tilknyttes den næste N-beskyttede aminosyre under anvendelse af et koblingsreagens, såsom dicyclohexylcar-bodiimid. Fjernelse af beskyttelse og tilføjelser af yderligere aminosyrer fortsættes, indtil den ønskede se-5 kvens er opnået.

Valget af beskyttelsesgrupperne retter sig efter aminosyrerne og koblingsmetoderne.

På tale som aminobeskyttelsesgrupper kommer f.eks. de kendte urethaniske beskyttelsesgrupper, såsom benzyloxy-10 carbonyl(Z), p-methoxycarbobenzoxy, p-nitrocarbobenzoxy, t-butyloxycarbonyl(Boc) og Fmoc.

Boc-gruppen foretrækkes, da den kan fraspaltes ved hjælp af relativt milde syrer (f.eks. trifluoreddike-syre eller HC1 i organiske opløsningsmidler).

15 Threonin kan blokeres som benzylether og e-amino- funktionen af lysin som Z-derivat. Disse to beskyttelsesgrupper er i videste udstrækning resistente mod fraspalt-ningsreagenserne for Boc-gruppen og kan fjernes hydroge-nolytisk med en hydrogeneringskatalysator (Pd/aktivt kul) 20 eller f.eks. med natrium i flydende ammoniak.

Det beskyttede peptid kan f.eks. fjernes fra harpiksen med hydrazin. Derved dannes hydrazidet, som f.eks. med N-bromsuccinimid ifølge Int. J. Pept. Prot. Research 17 [1981] 6-11, kan omdannes til den frie carboxylsyre.

25 Hvis det er nødvendigt, skal disulfid-broerne lukkes oxidativt, jvf. Konig, Geiger, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel, s. 31-44.

Ved fremgangsmådevarianten b) underkaster man hirudin en Edman-nedbrydning to gange, ved at man omsæt-30 ter hirudinet i en egnet pufferopløsning, såsom pyridin/vand eller dioxan/vand, eventuelt ved tilsætning af en base, såsom NaOH eller triethylamin, fortrinsvis ved ca. 40°C og en pH-værdi fra 8 til 9, med et isothio-cyanat, fortrinsvis phenylisothiocyanat. Ved behandling 35 med en syre (f.eks. 3N saltsyre ved stuetemperatur og derpå opvarmning til 40°C) fraspaltes det N-terminale 9 DK 171824 B1 valin som phenylthiazolinon. Man gentager denne reaktionssekvens til fraspaltning af det andet valin ved N--terminalen.

Det på denne måde tilvejebragte Des-(Val)2-hirudinde-5 rivat omsættes med en aktiv ester af en aminosyre eller peptid med formlen U-Y-OH. Egnet er f.eks. p-nitrophenyl-, cyanomethyl-, N-hydroxyphthalimid- eller især N-hydroxysuc-cinimid-ester. Egnede urethanbeskyttelsesgrupper U er sådanne, som kan fraspaltes surt eller alkalisk, såsom Boc eller 10 Msc. Såfremt det er nødvendigt, kan man således også forbigående beskytte eventuelt eksisterende funktioner i sidekæderne af X og Y med egnede beskyttelsesgrupper.

Det på denne måde tilvejebragte beskyttede forstadium af hirudinderivatet med formlen (II) behandles til fraspalt-15 ning af phenylthiocarbamoylgruppen på lysin med hydrazinhydrat i et egnet opløsningsmiddel, såsom en lavere alkohol eller en blanding deraf med vand.

Man fraspalter derpå desuden den resterende beskyttelsesgruppe (de resterende beskyttelsesgrupper) fra dette 20 derivat på egnet måde (Boc f.eks. med trifluoreddikesyre,

Msc med en base) og får således hirudinderivatet med formlen (II) ifølge opfindelsen.

Hirudinderivaterne ifølge opfindelsen er specifikke støkiometriske thrombininhibitorer. Den kvantitative måling 25 af thrombininhiberingen med inhibitorerne ifølge opfindelsen viser, at komplekset inhibitor-thrombin praktisk taget ikke dissocierer. Ved hjælp af denne målemetode kan man under oparbejdningen og rensningen bestemme aktiviteten og dermed renhedsgraden af hirudinderivaterne ifølge opfindelsen. Det 30 således rensede derivat med ovenstående formel (II) har i denne sammenhæng en thrombininhiberende virkning på over 10.000 ATU pr. mg og overgår dermed det traditionelle hiru-dins thrombininhiberende virkning.

Som nævnt angår opfindelsen anvendelsen af hirudin-35 derivater med formlen (II) som lægemiddel, fortrinsvis som blodkoaguleringsinhibitorer. De kan anvendes ved behandlingen 10 DK 171824 B1 af thromboetnboliske processer eller som diagnostika og reagenser .

Midlet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder et hirudinderivat med formlen (II) og et 5 farmaceutisk acceptabelt bærestof. Dette middel fremstilles ved, at man bringer hirudinderivaterne på en egnet indgivelsesform.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan indgives paren-teralt eller topisk i tilsvarende farmaceutisk tilberedning.

10 Til subkutan eller intravenøs indgift bringes de aktive forbindelser eller deres fysiologisk acceptable salte i opløsning, suspension eller emulsion, om ønsket med de dertil gængse substanser, såsom opløsningsformidlende stoffer, emulgatorer, isotoniske midler, konserveringsmidler 15 eller yderligere hjælpestoffer. På tale som opløsningsmidler for de hidtil ukendte, aktive forbindelser og de tilsvarende, fysiologisk acceptable salte kommer f.eks. vand, fysiologiske natriumchloridopløsninger eller alkoholer, såsom ethanol, propandiol eller glycerol, desuden også sukkeropløsninger, 20 såsom glucose- eller mannitolopløsninger, eller en blanding af de nævnte opløsningsmidler.

De topiske bærestoffer kan være organiske eller u-organiske forbindelser. Typiske, farmaceutisk anvendte bærestoffer er vandige opløsninger, som f.eks. er puffer-25 systemer eller isotoniske blandinger af vand og med vand blandbare opløsningsmidler, såsom alkoholer eller aryl-alkoholer, olier, polyalkylenglycoler, ethylcellulose, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidon eller isopro-pylmyristat. Egnede puffersubstanser er f.eks. natriumbo-30 rat, natriumphosphat, natriumacetat eller gluconat-puffere. Den topiske anvendelsesform kan også indeholde ikke-toksiske hjælpestoffer, såsom emulgerende konserveringsmidler, tværbindende midler, såsom polyethylengly- coler, og antibakterielle forbindelser.

35 11 DK 171824 B1

Eksempel 1

Bestemmelse af inhibitorkoncentration ved thrombintitrerina.

Til 10 til 100 μΐ af inhibitoropløsningen med et forudbestemt indhold af protein sættes 200 μΐ natriumhydro-5 gencarbonatopløsning (pH-værdi =7,0, 0,5 M). Man tilsætter 0,1 ml fibrinogenopløsning (fra 0,5 til 1,0%) eller fortyndet citratplasma; med regelmæssigt tidsmellemrum under omrøring ved stuetemperatur tilsættes en aliquotdel (50-100 μΐ) af thrombinopløsningen (ca. 100 NIH-enheder pr. ml). Ved semi-10 kvantitative arbejder kan koagulationen af væsken inden for den valgte tidsafstand tjene som omslagspunkt, ved kvantativ bestemmelser turbimetrimålingen ved 546 nm.

Eksempel 2 15 Der anvendes fritlevende blodigler (ingen labora- torieavlede dyr) af arten Hirudo medicinalis, som er blevet indsamlet i Tyskland.

Fra ca. 150 til ca. 200 g frosne blodigleforender homogeniseres i en mikser med 2 liter iskold 0,09%'s natrium-20 chloridopløsning og 10 ml octanol i løbet af 3 minutter.

Efter 30 minutters centrifugering ved 0°C og 10.000 opm klares den ovenstående væske igen ved hjælp af filtrering over to lag gaze, og der opvarmes derpå under omrøring i løbet af 15 minutter til 80°C. Den dannede ud-25 fældning skilles fra ved filtrering over fire lag gaze. Filtratet køles hurtigt ned i et isbad til 4°C ved omrøring og hældes i 7,5 liter forud afkølet acetone (-20°C).

Der dannes på ny en udfældning, som efter 5 minutters forløb filtreres fra på en glasfiltertragt og vaskes 30 efter med 1 liter kold acetone (-20°C). Efter tørring i vakuum fremkommer 520 g let gulligt pulver med et proteinindhold på 62% (bestemt ved fremgangsmåden ifølge Lowry). Antithrombinaktiviteten er ca. 400 enheder pr. mg.

35 12 DK 171824 B1

Eksempel 3 520 mg pulver ifølge eksempel 1 opløses i 75 ml vand, indstilles derpå med 5 N ammoniak til en pH-værdi 5 på 8,0 og omrøres i 1 time ved fra 0 til 4°C. Den uopløselige del centrifugeres fra i løbet af 30 minutter med en bægercentrifuge ved 5000 opm. Efter indstilling af proteinindholdet ved vandtilsætning til 25 mg pr. ml (Lowry) sættes der til opløsningen 35 ml mættet ammoniumsulfatopløs-10 ning, og der omrøres i 1 time ved 4°C. Den første udfældning skilles hurtigt fra ved centrifugering (5000 opm i 30 minutter). Man opløser endnu ca. 26 g ammoniumsulfat dertil og indstiller pH-værdien på 4 med iseddike. Efter 5 timers henstand centrifugeres hele suspensionen, og det 15 tilvejebragte fugtige bundfald forarbejdes yderligere som følger.

Eksempel 4

Den ifølge eksempel 3 tilvejebragte fugtige bund-20 fald opløses i 200 ml 0,1 M ammoniumhydrogencarbonatopløs-ning med en pH-værdi på 8 og ultrafiltreres i en 250 ml Amicon®-celle med en 5PM 10-flademembran (udelukkelsesgrænse 10.000 Dalton). Hertil inddampes opløsningen til ca. 40 ml, idet der hen mod afslutningen to gange efter-25 fyldes med 150 ml 0,1 M ammoniumhydrogencarbonatopløsning med en pH-værdi på 8,0. Ved frysetørring af remanensen fås ca. 350 mg materiale med et proteinindhold på 89%.

Man fylder under omrystning (Vibroblandeapparat) en C-kolonne (Merck) med silicagel 50 Mm 100 A (Grace).

30 500 mg ekstrakt fra eksempel 4 påføres kolonnen opløst i 5 ml af en blanding af chloroform, methanol, iseddike, vand og triethylamin i volumenforholdet 1200:1200:4:400:12 med 0,2%'s ammoniumacetatopløsning. Man eluerer kolonnen med den samme blanding med en hastighed på ca. 4 ml pr. minut 35 og fraktionerer i fra 5 til 10 ml portioner. Efter tørring af eluatet opløses og forenes de inhibitorholdige fraktioner 13 DK 171824 B1 i natriumhydrogencarbonat (pH-værdi =7,0, 0,5 M). Udbyttet er ca. 50 mg, aktiviteten 4000 ATU pr. mg.

Eksempel 5 5 20 mg inhibitor ifølge eksempel 3 opløses i 200 μλ vand med en pH-værdi på 2,16 (indstillet med trifluoreddi-kesyre plus 5% acetonitril) og sprøjtes ind i en med octa-decylsilansilicagel (5 μιη) fyldt stålkolonne (Shandon ODS) . Kolonnen elueres med en gradient på maksimalt 2% pr. minut 10 mellem startpufferen (vand, pH-værdi 2,16, + 5% acetonitril) og slutpufferen (acetonitril/vand, pH-værdi =2,16, i forholdet 80:20). Fraktionerne opsamles enkeltvis. Efter tørring har inhibitoren ifølge opfindelsen med formlen (II) (R = H eller S03H) en specifik aktivitet, der modsvarer støkiometri-15 en i et kompleks med thrombin i forholdet 1:1.

20 25 30 35

Claims (6)

1. Hirudinderivat, kendetegnet ved, at det har formlen

2. Af blodigler udvundet hirudinderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har aminosyresammensæt-ningen (fremgangsmåde ifølge Moore og Stein): 9 asparagin-syre, 5 threonin, 4 serin, 13 glutaminsyre, 3 prolin, 9 25 glycin, 2 valin, 6 cystein, 2 isoleucin, 4 leucin, 2 tyrosin, 1 phenylalanin, 3 lysin og 1 histidin, hvori OH-gruppen i en af tyrosingrupperne kan være forestret med svovlsyre.

3. Fremgangsmåde til udvinding af et renset hirudinderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man 30 isolerer derivatet fra orme af Gnathobdellida-ordenen, fortrinsvis fra orme af Hirudo-slægten, ved hjælp af en kombination af ekstraktionsmetoder, fældningsmetoder, membranfiltrering og/eller chromatografiske fremgangsmåder og eventuelt overfører det tilvejebragte derivat i dets fysiologisk 35 acceptable salte.

4. Hirudinderivat ifølge krav 1 eller 2 til anven- 15 DK 171824 B1 delse som lægemiddel.

5. Hirudinderivat ifølge krav 1 eller 2 til anvendelse som blodkoaguleringsinhibitor.

5. L i L· “ 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 H-Thr-Tyr-Thi’-Asp-Cys-Thr-Giu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu- 1 5 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 -Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile- 29 30 3 1 32 33 3*. 35 36 37 38 39 40 41 42 -Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu- 1 Π * 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 -Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu- 57 58 59 60 61 62 63 64 -Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(R)-Leu-Gln-OH (II) hvori R betyder phenolisk hydrogen eller SO3H, og hvori 2 af de 6 Cys-grupper i positionerne 5, 13, 15, 21, 27 og 38 er forbundet via disulfidbroer, samt deres fysiolo-20 gisk acceptable salte.

6. Middel, kendetegnet ved, at det inde-5 holder et hirudinderivat ifølge krav 1 eller 2 og et farmaceutisk acceptabelt bærestof.