DE3601032A1 - Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel - Google Patents

Description

Antikoagulantien dienen der Prophylaxe und Therapie thrombo-embolischer Prozesse; ihr Haupteinsatzgebiet liegt dabei vor allem bei venösen Thromboembolien. Antikoagulantien werden ferner bei der Herstellung von Blutkonserven benötigt. Derivate des 4-Hydroxycumarins oder des 1,4-Indandions, die beispielsweise für diesen Zweck angewendet werden, weisen trotz weitgehender Optimierung eine Reihe von Nachteilen auf.

Es ist daher wünschenswert, besonders in der Humanmedizin Blutgerinnungshemmer zur Verfügung zu haben, die eine geringe Toxizität und wenig Nebenwirkungen aufweisen und die durch ihren Metabolismus keine Belastung des erkrankten Organismus darstellen.

Außer den körpereigenen plasmatischen Hemmstoffen wie Antithrombin III besitzen auch viele andere Proteine blutgerinnungshemmende Wirkung, wie z. B. der Kunitz- Inhibitor, der aus Sojabohnen gewonnen wird. Dieser Hemmstoff blockt die Blutgerinnungskaskade durch Inhibition des aktivierten Faktors X, aber die Spezifität des Inhibitors ist so gering, daß viele Nebenwirkungen entstehen: Hemmung des Plasmakallikreins, des Plasmins, des Trypsins, so daß die therapeutischen Anwendungen ausgeschlossen sind. Auch andere Wirkstoffe, wie der Ascaris- oder der Kazals-Inhibitor, konnten wegen mangelnder Spezifität keine Bedeutung erlangen.

Hirudin ein aus Hirudo medicinalis gewonnenes Polypeptid, zeigt dagegen eine spezifische Antithrombin-Aktivität Das aufwendige Verfahren zu seiner Isolierung und Reinigung hat sich bisher nachteilig auf seine praktische Anwendung ausgewirkt.

Es wurde nun gefunden, daß sich aus Blutegeln hochaktive Polypeptide der Formel I isolieren lassen.

Die Erfindung betrifft daher Polypeptide der Formel I in welcher
m = 0-50,
n = 0-100 und
R phenolischen Wasserstoff oder eine Phenolestergruppe bedeuten,
X für gleiche oder verschiedene Reste natürlich vorkommende α-Aminosäuren steht,
Z für gleiche oder verschiedene Reste natürlich vorkommender α-Aminosäuren steht und
A für Ile oder die Abwesenheit von Aminosäure steht
B für Ile oder Thr oder die Abwesenheit von Aminosäure steht
C Thr, Val, Ile, Leu oder Phe bedeutet
D Glu oder die Abwesenheit von Aminosäure
E Glu oder Pro,
F Thr oder Ile bedeuten,
G Lys oder Lys-Asp bedeutet,
H falls G=Lys bedeutet, für Ala, andernfalls für Ala oder Leu steht und
J Gln oder Lys, vorzugsweise Lys bedeutet,
in der die 6 Cys-Reste paarweise über Disulfid-Brücken verknüpft sind, sowie deren physiologisch verträgliche Salze. Die drei Disulfid-Brücken befinden sich vorzugsweise zwischen den Cys-Resten in den Positionen 7 und 15, 17 und 29 sowie 23 und 40.

Natürlich vorkommende α-Aminosäuren sind insbesondere Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit, Tyr, Phe, Trp, His, Pro und Hyp.

R bedeutet vorzugsweise Wasserstoff, SO₃H oder PO₃H₂; besonders bevorzugt ist Wasserstoff.

Als Salze kommen insbesondere Alkali- und Erdalkalisalze, Salze mit physiologisch verträglichen Aminen sowie Salze mit physiologisch verträglichen Säuren, wie HCl, H₂SO₄, Maleinsäure oder Essigsäure in Frage.

Bevorzugt sind Polypeptide der Formel I, in denen C für Thr steht; ferner solche, bei denen C für Thr und A für Ile steht. Speziell geeignete Peptide sind solche mit
- A= Ile, B= direkte Bindung, C= Thr, D= direkte Bindung, E= Glu, F= Ile, G= Lys-Asp, H= Ala, m = null, n = null, R=SO₃H;
- A= Ile, B= direkte Bindung, C= Thr, D= direkte Bindung, E= Glu, F= Ile, G= Lys-Asp, H= Ala, m = null, n = null, R= Wasserstoff.

Die Erfindung betrifft auch die neuen biologisch aktiven peptidischen Spaltprodukte, die durch chemische oder enzymatische Spaltung dieser Polypeptide erhalten werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten Polypeptids der obengenannten Formel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Polypeptid aus Würmern des Stammes Annelida mit Hilfe einer Kombination von Extraktionsmethoden, Fällungsmethoden, Membranfiltration und/oder chromatographischen Verfahren isoliert, eine gegebenenfalls vorhandene Phenolestergruppe R gewünschtenfalls hydrolytisch unter Bildung der phenolischen Hydroxlgruppe abspaltet und das erhaltene Peptid gegebenenfalls in seine physiologisch verträglichen Salze überführt.

Das Polypeptid wird vorzugsweise aus den Halsdrüsen von Würmern der Klasse Hirudinea, insbesondere aus solchen der Ordnung Gnathobdellida gewonnen. Bevorzugt sind die Gattungen Hirudo, Gnathobdella, Haemadispa und Philaemon. Besonders bevorzugt ist Hirudo medicinalis. Neben den Halsdrüsen des Blutegels kann auch dessen vordere Körperregion oder der ganze Blutegel Verwendung finden.

Ein Verfahren zur Gewinnung eines Rohextraktes aus Blutegeln ist in Enzymology, Band 5 "Hirudin as an Inhibitor of Thrombin" beschrieben. Ein Reinigungsverfahren für Hirudin ist aus Bull. Soc. Chim. Biol. 45 (1963) 55 bekannt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren hat sich insbesondere eine Kombination von Fällungsmethoden und von Gel-Permeations- Chromatographie oder Ultrafiltration, Affinitätschromatographie und von hoch auflösender Verteilungschromatographie an "Reverse-Phase"-Material und Chromatographie an Kieselgel oder Aluminiumoxid als nützlich erwiesen. Je nach Beschaffenheit des Rohextraktes können aber auch andere Chromatographie-Verfahren vorteilhaft angesetzt werden (evtl. auch in Kombination mit dem obengenannten Verfahren), wie z. B. Kationen- oder Anionen- Austausch-Chromatographie, Chromatographie an unspezifischen Absorbentien, insbesondere Hydroxylapatit.

Um beispielsweise einen für die Chromatographie geeigneten Rohextrakt zu gewinnen, können die Kopfteile des Blutegels in gefrorenem Zustand zerkleinert und mittels einer wäßrigen Puffer-Lösung (z. B. Phosphatpuffer) extrahiert werden. Das unlösliche Material wird z. B. durch kurzes Zentrifugieren oder durch Filtration über Gaze abgetrennt und das Polypeptid aus dem so erhaltenen Extrakt abgetrennt und isoliert. Es ist vorteilhaft, diesen Extrakt schnell auf 70°C bis 90°C zu erhitzen, weil dadurch die Hauptmenge der proteolytischen Enzyme denaturiert und ausfällt, deren Abtrennung dann z. B. durch Zentrifugation erfolgen kann. Man isoliert aus dem Extrakt die Proteinfraktion, die das erfindungsgemäße Peptid enthält, z. B. durch Fällung in der Weise, daß man den Extrakt in ein wassermischbares organisches Lösungsmittel gibt. Z. B. kann Aceton in einer mehrfachen Menge des Extraktvolumen, vorzugsweise der etwa 10-fachen Menge eingesetzt werden, wobei die Fällung in der Kälte, üblicherweise bei 0 bis -40°C, vorzugsweise bei etwa -20°C, vorgenommen wird.

Eine andere Möglichkeit, die Füllung durchzuführen, ist die Zugabe von Salzen, wie z. B. Ammoniumsulfat. Durch pH-Steuerung erreicht die Fällung eine gewisse Selektivität. Die erfindungsgemäßen Peptide, die isoelektrische Punkte von 3,5-4 haben, können im pH-Bereich zwischen 3 und 5, vorzugsweise etwa 4, durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von etwa 50% ausgefällt werden, wobei eine Vielzahl von Begleitproteinen dabei in der Lösung bleibt. Auch diese Fällung wird unter Kühlung bei etwa -5 bis +15°C vorzugsweise zwischen 0 und+4°C durchgeführt.

Aus diesem Rohextrakt können Proteine mit höherem Molekulargewicht z. B. durch Ultrafiltration oder durch Gel- Permeations-Chromatographie abgetrennt werden. Bei größeren Ansätzen kann die Ultrafiltation z. B. in zwei Stufen erfolgen: In der ersten Stufe arbeitet man mit einer Kapillarmembran mit einer Ausschlußgrenze von 50 000 Dalton und dann in der zweiten Stufe mit einer Flachmembran mit einer Ausschlußgrenze von 10 000 Dalton. Mit Hilfe der Kapillarmembran erreicht man eine schnelle Abtrennung von höhermolekularem Material, welches den Durchfluß durch die selektiv arbeitende Flachmembran verhindern würde. Bei kleinen Mengen kann man auch auf die erste Stufe der Ultrafiltation verzichten.

Das so erhaltene Material besteht aus einer Mischung der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren und anderen Polypeptiden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung der Inhibitoren der Formel I mit R= H bzw. SO₃H besteht darin, daß die Thrombininhibitoren aufgrund der Eigenschaften der Komplexbildung mit am Träger gebundenen Thrombin von Produkten, die keine Komplexe mit Thrombin bilden, getrennt werden. Die Fraktionen, die aufgrund ihrer Thrombinaffinität gewonnen worden sind, können wiederum durch ein zweites hochauflösendes chromatographisches System in einzelne Komponenten aufgelöst werden. So werden die Inhibitoren der Formel I isoliert. Für die Affinitätschromatographie hat sich die Benützung von Thrombin- Sepharose besonders bewährt. Thrombin-Sepharose wurde nach dem Verfahren von Brosstad (Thrombos Res. II, 119, 1977) hergestellt.

Für die Trennung schüttet man Thrombin-Sepharose in eine Säule mit einem geeigneten Puffer, wie z. B. 0,1 M N-Methylmorpholinacetatpuffer pH 8,0 oder Tris/HCl 0,1 M pH 8,5). Nach Equilibrierung der Säule wird das Gemisch aus der Fällung in gleichem Puffer gelöst und auf die Säule aufgebracht. Die Peptide, die keine Thrombinaffinität haben, werden durch Spülung mit dem Puffer entfernt. Danach wird der Komplex Thrombin/Thrombin-Inhibitor durch Spülung der Säule mit einem Puffer aus 0,5-2 M Benzamidin oder 4-Amino-Benzamidin in 0,1 M N-Methylmorpholinacetat pH 8,0 aufgelöst. Die verschiedenen aktiven Fraktionen werden zusammen gepoolt und durch übliche Gel-Permeations- Chromatographie auf Sephadex G 25 mit 0,05 N-Methylmorpholinacetat pH 8,0 entsalzt.

Die Trennung der verschiedenen Thrombin-Inhibitoren voneinander wird durch hoch auflösende chromatographische Verfahren besorgt. Dafür hat sich besonders die HPLC bewährt.

Durch das hohe Auflösungsvermögen der HPLC-Technologie ist es möglich, die Inhibitoren der Formel I voneinander und von geringfügigen Mengen von Begleitprotein zu trennen und rein darzustellen.

Für die stationäre Phase haben sich derivatisierte Kieselgele mit geeigneter Korngröße (z. B. zwischen 3 und 20 µm vorteilhaft erwiesen. Für die Derivatisierung des Kieselgels eignen sich neben den verbreiteten Octadecylsilanresten auch eine Vielzahl anderer Silanreste oder deren Mischungen, wie Silanreste mit niedrigem Alkyl, Phenylalkyl- oder amino-substituiertem Alkyl, wobei letztere eine gewisse Kombination von Ionenaustausch- und "Reverse- Phase" Chromatographie bieten. Es können beispielsweise Trennsäulen von 5 bis 25 cm Länge und einem Durchmesser von 3 bis 10 mm verwendet werden. Als gepuffertes Elutionsmittel kommen alle sekundären oder tertiären Mischungen zwischen Wasser, organischen Lösungsmitteln geeigneter Lipophilie in Frage, wie z. B. niedrige Alkohole, Ketone, Nitrile, Ether, Säure, Amine, Glykolether, Amide und deren Derivate. Als Puffersubstanz können organische und anorganische Salze oder andersartige Zusätze verwendet werden. Die Elution erfolgt vorteilhaft bei einem pH- Wert zwischen 2 und 8.

Die Benutzung von flüchtigen Puffersubstanzen, wie Ammoniumacetat oder Ammoniumhydrogencarbonat, erlaubt die Gewinnung der Inhibitoren aus dem Eluat durch einfache Gefriertrocknung.

Die Anspaltung einer Sulfatmonoestergruppe R in Position 64 kann in Analogie zu der in DE-A-33 42 139 beschriebenen Weise sauer katalysiert oder enzymatisch mit Hilfe einer Arylsulfatase erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide der Formel I sind farblos, in Wasser und in wäßrigen Puffern löslich, zeigen sich homogen in der Polyacrylamid-Elektrophorese und besitzen isoelektrische Fokussierung). Bestimmt man die Aminosäurezusammensetzung nach der Methode von Moore und Stein (Methods of Enzymology Band VI, 819-831, herausgegeben von Rolovick und Kaplan, Academic Press, New York, London, 1963), findet man die in Tabelle 1 angegebenen Werte:

Tabelle 1

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der obengenannten Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• a) es in an sich bekannter Weise mittels Festphasensynthese herstellt oder
• b) zur Herstellung eines Polypeptids, in welchem m = 0 ist,
  • I. Hirudin einem zweifachen Edman-Abbau unterwirft,
  • II. das so erhalten Peptid mit einem Aktivester einer Aminosäure oder eines Peptids der Formel U-(X) _m -A-B-C-OH,in welcher m, X und A, B, C wie oben definiert sind und U für eine säuren- oder basenlabile Urethanschutzgruppe steht, umsetzt,
  • III. die Phenylthiocarbamoyl-Gruppe an der ε-Amino-Funktion von Lys mittels Hydrazin
  • IV. und die Urethan-Schutzgruppe U mit Hilfe einer Säure oder Base abspaltet und

das a) oder b) erhaltene Polypeptid gegebenenfalls in sein physiologisch verträgliches Salz überführt.

Bei der Festphasensynthese (vgl. hierzu Atherton, Sheppard, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel 1981, Seiten 101-117) kann in der Regel auf eine OH-Schutzgruppe für Thr verzichtet werden.

Die Synthese des Polypeptids der Formel I erfolgt z. B. schrittweise an hydroxymethyliertem Polystyrol-Harz. Das Polystyrol ist mit beispielsweise 1% Divinylbezol quervernetzt. Es liegt gewöhnlich in Form kleiner Kügelchen vor.

Die Aminosären werden N-terminal geschützt eingesetzt. Die erste N-geschützte Aminosäure wird per Esterbildung am Träger angebracht. Nach Beseitigung der Aminoschutzgruppe wird die nächste N-geschützte Aminosäure unter Verwendung eines Kupplungsreagenzes wie Dicyclohexylcarbodiimid angeknüpft. Entschützen und Zufügen weiterer Aminosäuren wird fortgesetzt, bis die gewünschte Sequenz erreicht ist.

Die Auswahl der Schutzgruppen richtet sich nach den Aminosäuren und Kupplungsmethoden.

Als Aminoschutzgruppen kommen z. B. die bekannten urethanischen Schutzgruppen wie Benzyloxycarbonyl(Z), p-Methoxycarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy, t-Butyloxycarbonyl(Boc), Fmoc und ähnliche in Frage.

Die Boc-Gruppe wird bevorzugt, da sie unter relativ milden Bedingungen (z. B. mit Trifluoressigsäure oder HCl in organischen Lösungsmittel) abspaltbar ist.

Threonin kann als Benzylether blockert werden und die ε-Aminofunktion des Lysins als Z-Derivat. Diese beiden Schutzgruppen sind gegen die Abspaltungsreagenzien für die Boc-Gruppe weitestgehend resistend und können hydrogenolytisch mit einem Hydrierkatalysator (Pd/Aktivkohle) oder z. B. mit Natrium in flüssigem Ammoniak entfernt werden. Das geschützte Peptid kann z. B. mit Hydrazin vom Harz genommen werden. Dabei entsteht das Hydrazid, welches z. B. mit N-Bromsuccinimid nach Int. J. Pept. Prot. Research 17 (1981) 6-11 in die freie Carbonsäure überführt werden kann. Falls erforderlich, müssen die Disulfid- Brücken oxidativ geschlossen werden (vgl. König, Geiger, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel Seiten 31-44).

Bei der Verfahrensvariante b) unterwirft man Hirudin einem zweifachen Edman-Abbau, indem man dieses Polypeptid in einer geeigneten Pufferlösung, wie Pyridin/ Wasser oder Dioxan/Wasser gegebenenfalls unter Zusatz einer Base wie Dimethylbenzylamin (DMBA), Dimethylallylamin (DMAA) oder Triethylamin, vorzugsweise bei etwa 50°C und einem pH-Wert von 8-9 mit einem Isothiocyanat, vorzugsweise Phenylisothiocyanat umsetzt. Nach Entfernung des überschüssigen Puffers und des überschüssigen Phenylisothiocyanats wird das N-terminale Valin durch Behandeln mit einer Säure (Heptafluorbuttersäure oder Trifluoressigsäure) während 10 Minuten bei 50°C als Phenylthiazolinon abgespalten. Man wiederholt diese Reaktionsfolge zur Spaltung des zweiten Valins am N- Terminus.

Das auf diese Weise erhaltene Des-(Val)₂-Hirudin-Derivat wird mit einem Aktivester einer Aminosäure oder eines Peptids der Formel U-(X) _m -A-B-C-OH, umgesetzt. Geeignete Urethanschutzgruppen U sind solche, die sauer oder alkalisch abspaltbar sind, wie z. B. Boc oder Msc. Falls erforderlich, so können auch evtl. vorhandene Funktionen in den Seitenketten von B und C durch geeignete Schutzgruppen vorübergehend geschützt werden.

Die auf diese Weise erhaltene geschützte Vorstufe des Polypeptids der Formel I (m=0) wird zur Abspaltung der Phenylthiocarbamoyl-Gruppe am Lysin in einem geeignetem Lösungsmittel, wie einem niedrigen Alkohol oder dessen Gemisch mit Wasser mit Hydrazin-Hydrat behandelt.

Man spaltet aus diesem Polypeptid nun noch die restliche(n) Schutzgruppe(n) in geeigneter Weise ab (Boc z. B. mit Trifluoressigsäure, Msc mit einer Base) und erhält so das erfindungsgemäße Polypeptid der Formel I.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind spezifische stöchiometrische Hemmer des Thrombins. Die quantitative Messung der Thrombin-Hemmung durch die erfindungsgemäßen Inhibitioren zeigte, daß der Komplex Thrombin-Inhibitor/Thrombin praktisch nicht dissoziiert. Mit Hilfe dieser Meßmethode kann während der Aufarbeitung und Reinigung die Aktivität und damit der Reinheitsgrad der erfindungsgemäßen Polypeptide bestimmt werden. Die so gereinigten Polypeptide der obengenannten Formel I können dabei eine Thrombinhemmung von über 10 000 antithrombine units/mg aufweisen und damit die des herkömmlichen Hirudins übertreffen. Dabei sind in vivo die Verbindungen der Formel I mit freiem phenolischem Wasserstoff in Position 64 in der Regel noch aktiver.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von Polypeptiden der Formel I, in welcher m, n, R, X, Z, A, B, C, D, E, F, G und H die oben genannte Bedeutung haben als Blutgerinnungshemmer zur Anwendung bei der Therapie thromboembolischer Prozesse sowie deren Anwendung als Diagnostika und Reagentien.

Die Erfindung betrifft weiterhin Mittel, die ein Polypeptid der Formel I in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthalten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können parenteral oder topisch in entsprechender pharmazeutischer Zubereitung verabreicht werden.

Zur subkutanen oder intravenösen Applikation werden die aktiven Verbindungen oder deren physiologisch verträgliche Salze, gewünschtenfalls mit den dafür üblichen Substanzen wie Lösungsvermittler, Emulgatoren, Isotoniemittel, Konservierungsstoffe oder weitere Hilfsstoffe in Lösung, Suspension oder Emulsion gebracht. Als Lösungsmittel für die neuen aktiven Verbindungen und die entsprechenden physiologisch verträglichen Salze kommen z. B. in Frage: Wasser, physiologische Kochsalzlösungen oder Alkohole, z. B. Ethanol, Propandiol, oder Glycerin, daneben auch Zuckerlösungen wie Glucose- oder Mannitlösungen, oder auch eine Mischung aus den verschiedenen genannten Lösungen. Bei subkutaner Anwendung weisen Verbindungen der Formel I (R= phenolischer Wasserstoff) in der Regel den Vorteil einer langsameren Resorption und damit einer retardierten Wirkung auf.

Die topischen Trägerstoffe können organische oder anorganische Verbindungen sein. Typische pharmazeutisch gebrauchte Trägerstoffe sind wäßrige Lösungen, die z. B. Puffersysteme oder isotonische Mischungen von Wasser und wassermischbaren Lösungsmitteln sind, wie z. B. Alkohole oder Arylalkohole, Öle, Polyalkylenglykole, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon oder Isopropylmyristat. Geeignete Puffersubstanzen sind z. B. Natriumborat, Natriumphosphat, Natriumacetat oder auch Gluconatpuffer. Die topische Anwendungsform kann auch nicht toxische Hilfsstoffe enthalten wie z. B. emulgierende Konservierungsstoffe, Vernetzer, wie z. B. Polyethylenglykole und antibakterielle Verbindungen.

Beispiel 1 Bestimmung der Inhibitor-Konzentration durch Thrombin- Titration

10 bis 100 µl der Inhibitor-Lösung mit einem vorher bestimmten Proteingehalt werden mit 200 µl Natriumhydrogencarbonat- Lösung (pH= 7,0; 0,5 M) versetzt. Man addiert 0,1 ml Fibrinogen-Lösung (0,5 bis 1%) oder verdünntes Citrat-Plasma; in regelmäßigem Abstand, unter Rühren, bei Zimmertemperatur, wird ein aliquoter Teil (50-100 µl) der Thrombin-Lösung zugefügt (ca. 100 NIH Einheiten pro ml). Als Umschlagpunkt kann beim halbquantitativen Arbeiten das Gerinnen der Flüssigkeit innerhalb des gewählten Zeitabstandes dienen, oder, für quantitative Bestimmungen, die Turbimetrie-Messung bei 546 nm.

Beispiel 2

Es werden freilebende Blutegel (keine Zuchttiere) der Art Hirudo medicinalis verwendet, die in Deutschland gesammelt worden sind.

Ca. 150-200 g gefrorene Blutegelvorderteile werden in einem Mixer mit 2 l eiskalter 0,09% Natriumchlorid-Lösung und 10 ml Octanol innerhalb von 3 Minuten homogenisiert. Nach 30 minütiger Zentrifugation bei 0°C und 10 000 Upm wird der Überstand mittels Filtration über 2 Lagen Gaze weitergeklärt und anschließend unter Rühren innerhalb von 15 Minuten auf 80°C erhitzt. Die entstandene Fällung wird durch Filtration über 4 Lagen Gaze getrennt. Das Filtrat wird durch Rühren in einem Eisbad schnell auf 4°C heruntergekühlt und in 7,5 l vorgekühltes Aceton (-20°C) gegeben. Es entsteht erneut eine Fällung, die nach 5 Minuten auf einer Glasfilternutsche abfiltriert und mit 1 l kaltem Aceton (-20°C) nachgewaschen wird. Nach Trocknung im Vakuum entsteht 520 mg leicht gelbliches Pulver mit einem Proteingehalt von 62% (bestimmt nach der Methode von Lowry). Die Antithrombinaktivität beträgt ca. 400 Einheiten pro mg.

Beispiel 3

520 mg Pulver gemäß Beispiel 2 werden in 75 ml Wasser gelöst, dann mit 5 N Ammoniak auf pH 8,0 eingestellt und 1 Stunde bei 0-4°C gerührt. Der unlösliche Anteil wird innerhalb von 30 Minuten mit einer Becher-Zentrifuge bei 5000 Upm abgeschleudert. Nach Einstellung des Proteingehaltes durch Wasserzugabe auf 25 mg/ml (Lowry), wird die Lösung mit 35 ml gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung versetzt und 1 Stunde bei 4°C gerührt. Der erste Niederschlag wird schnell durch Zentrifugation (5000 Upm/30 Minuten) abgetrennt. Man löst noch ca. 26 g Ammoniumsulfat dazu und stellt den pH-Wert mit Eisessig auf pH 4 ein. Nach 5 Stunden Stehen wird die gesamte Suspension zentrifugiert und der erhaltene Feuchtniederschlag wie folgt weiterverarbeitet.

Beispiel 4

Der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Feuchtniederschlag wird in 200 ml 0,1 M. Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung vom pH 8 gelöst und in einer 250 ml Amicon^R-Zelle mit einer 5PM 10-Flachmembran (Ausschlußgrenze 10 000 Dalton) ultrafiltriert. Dabei wird die Lösung auf ca. 40 ml eingeengt, wobei gegen Ende zweimal 150 ml 0,1 Ammoniumhydrogencarbonat- Lösung vom pH 8,0 nachgefüllt werden. Gefriertrocknung des Rückstandes ergibt ca. 350 mg Material mit einem Proteingehalt von 89%.

Beispiel 5

Man schüttet eine Säule (0.9 × 15 cm) mit Thrombin- Sepharose in 0.1 m Tris-Puffer (HCl) pH 8.

Die Substanz aus Beispiel 3 wird im gleichen Puffer gelöst, und die Säule wird mit dieser Probe beschickt. Durch Spülung der Säule mit dem Equilibrierungspuffer werden inaktive Begleitsubstanzen entfernt. Danach mit einer Lösung von Benzamidin (1,5 M Tris Puffer pH 7) oder mit 4- Aminobenzamidin (0,2 M Tris Puffer pH 7) läßt sich das Hirudin von dem Komplex Thrombin-Hirudin verdrängen und wird portionsweise eluiert. Zum Testen der Antithrombinaktivität muß zuerst der kompetitive Inhibitor durch Gel-Filtration Sephadex G 20 vom Hirudin getrennt werden. Gewicht-Ausbeute 55%;
Aktivität 6000 bis 12 000 ATU/mg.

Beispiel 6

20 mg Inhibitor gemäß Beispiel 3 werden in 20 µl Wasser von pH 2,16 (eingestellt mit Trifluoressigsäure + 5% Acetonitril) gelöst und auf eine mit Octadecylsilan- Kieselgel (5 µl) gefüllte Stahl-Säule eingespritzt (Shandon®ODS). Die Säule wird durch einen Gradienten von maximal 2%/Minute zwischen dem Startpuffer (Wasser-pH= 2,16 + 5% Acetonitril) und Acetonitril eluiert. Die Fraktionen werden einzeln gesammelt. Nach Trocknung haben die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Formel I (R= H bzw. SO₃H) eine spezifische Aktivität, die der Stöchiometrie eines 1 : 1-Komplexes mit Thrombin entspricht.

Claims (16)

1. Polypeptid der Formel I in welcher
m = 0-50,
n = 0-100 und
R phenolischen Wasserstoff oder eine Phenolestergruppe bedeuten,
X für gleiche oder verschiedene Reste natürlich vorkommende α-Aminosäuren steht,
Z für gleiche oder verschiedene Reste natürlich vorkommender α-Aminosäuren steht und
A fürIle oder die Abwesenheit von Aminosäure steht,
B für Ile oder Thr oder die Abwesenheit von Aminosäure steht,
C Thr, Val, Ile, Leu oder Phe bedeutet
D Glu oder die Abwesenheit von Aminosäure
E Glu oder Pro,
F Thr oder Ile bedeuten,
G Lys oder Lys-Asp bedeutet,
H falls G=Lys bedeutet, für Ala, andernfalls für Ala oder Leu steht und
J Gln oder Lys bedeutet,
in der die 6 Cys-Reste paarweise über Disulfid-Brücken verknüpft sind, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß C Thr ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, das A Ile ist.

4. Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-3, in welcher R Wasserstoff, SO₃H oder PO₃H₂ bedeuten.

5. Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-4, in welcher R für SO₃H steht.

6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß
A für Ile,
B für die Abwesenheit einer Aminosäure,
C für Thr,
D für die Abwesenheit einer Aminosäure,
E für Glu,
F für Ile,
G für Lys-Asp,
H für Ala,
J für Lys,
m für null,
n für null und
R für SO₃H steht.

7. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1-4, in welcher R für phenolischen Wasserstoff steht.

8. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß
A für Ile,
B für die Abwesenheit einer Aminosäure,
C für Thr,
D für die Abwesenheit einer Aminosäure,
E für Glu,
F für Ile,
G für Lys-Asp,
H für Ala,
J für Lys,
m für null,
n für phenolischer Wasserstoff steht.

9. Biologisch aktives peptisches Spaltprodukt eines Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-8.

10. Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten Polypeptides gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polypeptid aus Würmern der Ordnung Gnathobdellida, vorzugsweise aus Würmern der Gattung Hirudo mit Hilfe einer Kombination von Extraktionsmethoden, Fällungsmethoden, Membranfiltration und/oder chromatographischen Verfahren isoliert, eine gegebenenfalls vorhandene Phenolestergruppe R gewünschtenfalls hydrolytisch unter Bildung der phenolischen Hydroxylgruppe abspaltet und das erhaltene Peptid gegebenenfalls in seine physiologisch verträglichen Salze überführt.

11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Formel 1 gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-8 dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) es in an sich bekannter Weise mittels Festphasensynthese herstellt oder
• b) zur Herstellung eines Polypeptids, in welchem m = 0 ist,
  • I. Hirudin einem zweifachen Edman-Abbau unterwirft,
  • II. das so erhalten Peptid mit einem Aktivester einer Aminosäure oder eines Peptids der Formel U-X _m -A-B-C-OH in welcher m, X, A, B und C wie oben definiert sind und U für eine Urethanschutzgruppe steht, umsetzt,
  • III. die Phenylthiocarbamoyl-Gruppe an der ε-Amino-Funktion von Lys mittels Hydrazin
  • IV. und die Urethan-Schutzgruppe U mit Hilfe einer Säure oder Base abspaltet und das a) oder b) erhaltene

das a) oder b) erhaltene Polypeptid gegebenenfalls in sein physiologisch verträgliches Salz überführt.

12. Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-9 zur Anwendung als Heilmittel.

13. Verwendung eines Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-9 zur Anwendung als Antikoagulans,

14. Mittel enthaltend ein Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-9 und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger.

15. Verwendung eines Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-9 zur Herstellung eines Medikaments.