EP0896584A2 - BIOLOGISCH AKTIVER EIWEISSSTOFF - KOLLAGENFRAGMENT HF-COLL-18/514cf - ZUR HEMMUNG DES WACHSTUMS VON TUMOREN UND VON GEFÄSSWUCHERUNGEN - Google Patents
BIOLOGISCH AKTIVER EIWEISSSTOFF - KOLLAGENFRAGMENT HF-COLL-18/514cf - ZUR HEMMUNG DES WACHSTUMS VON TUMOREN UND VON GEFÄSSWUCHERUNGENInfo
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Definitions
- the present invention relates to a peptide (protein) with the ability to influence the growth of cells.
- the collagen fragment HF-C0LL-18 / 514cf, as well as fragments and / or derivatives derived from it, and a medicinal product containing the natural and synthetic peptides can be used for diagnostic or therapeutic purposes.
- the invention relates to a method for obtaining a protein in pure or partially purified form from human body fluids, which has the ability to influence the growth of cells in a surprising manner and thus to inhibit vascular and tumor growth.
- a similar substance has recently been detected in the mouse (O'Reilly et al., 1997, Cell Vol.88, page 277).
- This substance is characterized in that it can be obtained in particular from hemofiltrate or hemodialysate, which is filtered off from human blood.
- the substance is referred to as HF-COLL-18 / 514cf and can be used for the purpose of (1) the analysis of diseases, (2) for medical and commercial use as a drug.
- the substance HF-COLL-18 / 514cf was first obtained from the hemofiltrate of kidney patients after ultrafiltration on the hemodialysis machine and was classified according to its molecular mass and 60 amino acids. the N-terminus.
- a patented process (Forssmann, 1988; published application DE 36 33 707 AI) was refined, which was previously invented for the extraction of proteins from hemofiltrate.
- the fractions containing the HF-COLL-18 / 514cf can surprisingly be recognized by mass spectrometry from the molecules of a molecular weight below 20 kilodaltons obtained by this method, which are filtered off in the case of veno-venous or arterio-venous shunt connections.
- this substance could surprisingly be purified in such a way until a uniform protein substance was finally identified and its structure was clarified.
- the substance is a fragment of a protein, the protein being hitherto known only at the cDNA level (Oh et al., 1994, Genomics Vol. 19, page 494).
- the value of this invention is characterized by the fact that this substance can be purified from the hemofiltrate previously considered worthless in order to be used as an economically usable substance.
- the substance HF-COLL-18 / 514cf mentioned can be obtained by chemical synthesis and by genetic engineering production and can be used for numerous other purposes, including analysis in human blood as a pathognomonic diagnostic feature of diseases of vascular growth and growth of tumors and metastases.
- the present invention thus relates to a new peptide, the HF-COLL-18 / 514cf, its production, medicaments containing it, and preparations containing it and its use therefor, and also its natural and pharmacologically contractual 1 -
- a mean molecular weight of 18494 u daltons could be determined by mass spectrometry.
- the blood peptide HF-COLL-18 / 514cf has the amino acid sequence: Val -Ala -Leu -Asn -Ser -Pro-Leu- Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile -Arg -Gly- Ala-Asp-Phe -Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala -Val -Gly-Leu-Ala-Gly- Thr- Phe- Arg- Ala- Phe - Leu - Ser -Ser- Ar Q- Leu-Gin - Asr> -Leu-Tyr- Ser -Ile - Val -Arg -Arg -Ala -Asp- Arg- Ala- Ala - Val - Pro- II e- Val -Asn-Leu-L ⁇ s -Asp- Glu-Leu-Leu- Phe-Pro-Ser-
- HF-COLL-18 / 514cf The peptide provided by the present invention, HF-COLL-18 / 514cf, is now an easily accessible drug with biological and therapeutic activity of a natural analogue of the substance found in the blood.
- the present invention provides a production method for this HF-COLL-18 / 514cf and the use of the HF-COLL-18 / 514cf as a medicament for various therapeutic and diagnostic indications.
- the HF-COLL-18 / 514cf can be used as a highly pure substance or - if sufficient for the particular use - within a partially purified peptide mixture.
- the peptide according to the invention, its derivatives and fragments can be produced by various methods, for example by prokaryotic or eukaryotic expression and, if appropriate, chromatographic purification. Furthermore, it can be isolated from human blood, for example by means of chromatographic methods known per se Finally, are HF-COLL-18 / 514cf or its derivatives or fragments can be prepared by conventional solid-phase and liquid-phase synthesis methods from the protected amino acids contained in the sequence given. After the protective groups have been removed, it can be purified using standard chromatography procedures.
- the pharmaceutical preparation according to the invention contains HF-COLL-18 / 514cf or a physiologically tolerable salt of HF-COLL-18 / 514cf.
- the form and composition of the medicinal product containing the HF-COLL-18 / 514cf depends on the mode of administration.
- the human HF-COLL-18 / 514cf can be administered parenterally, intranasally, orally, intravenously, intramuscularly, intracutaneously, intra-thecally, locally-topically and transpulmonally.
- HF-COLL-18 / '514cf is preferably made up into an injection preparation, either as a solution or as a lyophilisate for dissolution immediately before use.
- the pharmaceutical preparation can also contain auxiliaries that are due to filling technology, contribute to the solubility, stability or sterility of the drug or increase the efficiency of absorption into the body.
- auxiliaries that are due to filling technology, contribute to the solubility, stability or sterility of the drug or increase the efficiency of absorption into the body.
- the use of the lyophilized form taken with mannitol in sterile ampoules for dissolution in physiological saline and / or infusion solutions for repeated single injection and / or continuous infusion in amounts of 30 micrograms to 30 milligrams of pure HF-COLL-18 / 514cf pro Therapy unit is beneficial.
- the daily dose to be administered for HF-COLL-18 / 514cf depends on the indication and use of certain derivatives. At i.v./i.m. Injection is in the range from 100 to 1200 units ( ⁇ g) / day, with daily subcutaneous injection preferably at 300 to 2400 units ( ⁇ g) / day.
- the peptide HF-COLL-18 / 514cf according to the invention is characterized in that it is also particularly suitable for long-term JPherapy for tumor diseases or other diseases which are characterized by uncontrolled vascular growth, and does not trigger an immune reaction in the case of long-term treatment. That invented
- the preparation according to the invention is particularly suitable for combination therapy with chemotherapy or radiation therapy or in connection with chemotherapy or radiation therapy for cancer.
- the preparation according to the invention can also be used as a means of therapy and diagnosis for vascular diseases of the supporting and connective tissue, the respiratory tract, the cardiovascular system and urogenital system, the nervous system and the eye, since it can be used for the production of human-compatible antibodies are suitable for determining or influencing changes in the vascular growth in these organs.
- Such antibodies can in principle be obtained by immunizing animals with the peptide according to the invention and / or its fragments or by using hybridoma technology.
- the present invention also relates to a method for treating patients who need HF-COLL-18 / 514cf or its derivatives or fragments by administering therapeutic amounts of HF-COLL-18 / 514cf.
- Patients who suffer from excessive production of HF-COLL-18 / 514cf or its derivatives or fragments require the administration of therapeutic amounts of an antagonist / inhibitor of HF-COLL-18 / 514cf.
- the medicament according to the invention is suitable for the treatment of diseases of the human organism, in particular in connection with vascular growths, cancer diseases, diseases involving the cardiovascular and nervous systems, diseases involving the intugement and the sensory organs, in particular the eye.
- the medicament according to the invention is suitable for the treatment of acute diseases of the type mentioned above, in that it is used in a corresponding form for the treatment in the intensive care of these diseases.
- a further use of the peptide according to the invention, its fragments or the antibody according to the invention is used to diagnose diseases by producing specific antibodies against synthetic parts or the entire peptide or its derivatives and its fragments and e.g. the blood concentration of the HF-COLL-18 / 514cf is measured by immunoassays.
- a diagnostic agent containing the peptide according to the invention, its fragments or antibodies according to the invention for test systems for checking tissue, plasma, urine and cerebrospinal fluid levels of this substance are thus also the subject of the invention.
- the diagnostic agent according to the invention is particularly suitable as a marker for certain cancers and for functional disorders of blood vessels, bone marrow, lymph organs, the gastrointestinal tract, the immune system and inflammatory and neoplastic processes.
- Example 1 Isolation and characterization of circulating HF-COLL-18 / 514cf from human hemofiltrate
- Hemofiltrate which is obtained in large quantities in the treatment of kidney insufficient patients and all plasma components up to a molecular size of about 20, was used as the starting material. Contains 000 daltons.
- the hemofiltrate was obtained by means of a Sartorius hemofiltration system using cellulose triacetate filters with an exclusion size of 20,000 daltons (type SM 40042, Sartoriu ⁇ , Göttingen, FRG).
- the filtrate came from kidney insufficiency patients who were in a stable metabolic state due to long-term hemofiltration and was protected against proteolytic degradation by acidification and cooling to 4 ° C immediately after it was obtained.
- TSK SP 650 (M) Merck, Darmstadt, DE
- 2860 l of hemofiltrate were processed. 93% of the pooled extracts were successively eluted on the column material mentioned above using different buffers with different pH values. The crude fractions were then freeze-dried.
- Eluent A water with 10MM HC1
- Eluent B methanol with 10 mM HC1 gradient: 0 - 50% eluent B 28.57 min 50 - 95% eluent B 61.43 min 95% eluent B 5.71 min flow rate: 35 ml / min fractions: 50 ml or 1 , 43 min detection: 230 nm and 280 nm
- a mass spectrum was additionally measured from fraction 25 of step V using an electrospray mass spectrometer (Sciex API III, Perkin-Elmer, Langen, DE). Peaks of the eight to eleven times protonated molecule are shown.
- the average molecular mass of HF-COLL-18 / 514cf is determined here at 18494 u + 3 u, the theoretical value is 18496 u (see VIII).
- the first 60 amino acids were determined by means of automated Edman sequencing with an ABI 494 gas-phase amino acid sequencer (Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Rothstadt, DE). No amino acid was detected at the 21st position (Xxx), as is customary for cysteine.
- Example 2 Using the method shown in Example 1, a larger amount of material of more than 0.1 mg HF-COLL-18 / 514cf was isolated from human hemofiltrate. The high-purity HF-COLL-18 / 514cf was used to determine the biological function in endothelial cell proliferation assays. For this assay, bovine capillary endothelial cells from the adrenal cortex of freshly slaughtered calves were cultured as described in the literature (Folkman et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 76, page 5217).
- the proliferation assay was carried out as described in the literature (O'Reilly et al., 1997, Cell Vol.88, page 277).
- the bovine capillary endothelial cells were washed with PBS (phosphate buffer with sodium chloride, pH 7.4) and suspended in a 0.05% trypsin solution.
- the medium was replaced by 0.5 ml DMEM medium containing 5% FCS and 1% GPS as well as different concentrations (from 0 to 1000 ng / ml final concentration) of the isolated, high-purity HF-COLL-18 / 514cf , replaced.
- bFGF basic fibroblast growth factor
- HF-COLL-18 / 514cf added to the bovine capillary endothelial cells inhibited the proliferation of these cells stimulated with bFGF in a concentration-dependent manner.
- Half-maximal inhibition of proliferation in this assay was achieved at a concentration of 200 ng / ml HF-COLL-18 / 514cf.
- HF-COLL-18 / 514cf In order to investigate the specificity of the spectrum of activity of HF-COLL-18 / 514cf and thus other possible biological functions, proliferation assays were carried out with non-endothelial cells. In tests with fibroblast cell lines, namely NIH 3T3 cells and LMTK cells, HF-COLL-18 / 514cf showed no significant activity and therefore no antiproliferative activity.
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Peptid aus menschlichem Blut, das HF-COLL-18/514cf, das zum Zwecke der diagnostischen, medizinischen und gewerblichen Verwendung als Arzneimittel in seiner Struktur aufgeklärt wurde. Die Isolierung dieses neuartigen Peptides HF-COLL-18/514cf beweist die Existenz des HF-COLL-18/514cf. Die Molekülform des HF-COLL-18/514cf wurde durch Massenspektrometrie und aminoterminale Sequenzierung bewiesen, und daß HF-COLL-18/514cf ein natürliches Peptid darstellt, welches zur Behandlung von zahlreichen Erkrankungen, die mit Störungen des Wachstums von Zellen, insbesondere von Endothelzellen und Gefäßen einhergehen und z.B. bei Krebs benutzt werden sollte. Weiter kann das HF-COLL-18/514cf in reiner Form oder als natürliches Rohextrakt für gewerbliche Zwecke in der Erforschung neuer Zellfunktionen benutzt werden.
Description
Biologisch aktiver Eiweißstoff - Kollagenfragment HF-COLL- 18/514cf - zur Hemmung des Wachstums von Tumoren und von Gefä߬ wucherungen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid (Eiwei߬ stoff) mit der Fähigkeit, das Wachstum von Zellen zu beeinflus¬ sen. Das Kollagenfragment HF-C0LL-18/514cf, sowie von ihm abgeleitete Fragmente und/oder Derivate sowie ein Arzneimittel das die natürlichen und synthetischen Peptide enthält kann zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eineε Eiwei߬ stoffes in reiner oder partiell aufgereinigter Form aus mensch¬ lichen Körperflüssigkeiten, der die Fähigkeit besitzt, das Wachstum von Zellen erstaunlich zu beeinflussen und damit Gefäß- und Tumorwachstum zu hemmen. Ein ähnlicher Stoff konnte vor kurzem in der Maus nachgewiesen werden (O'Reilly et al . , 1997, Cell Vol.88, Seite 277) . Dieser Stoff ist dagegen dadurch gekennzeichnet, daß er insbesondere aus Hämofiltrat oder Hämo- dialysat, das aus menschlichem Blut abfiltriert wird, gewonnen werden kann. Der Stoff ist als HF-COLL-18/514cf bezeichnet und kann zum Zwecke (1) der Analyse von Erkrankungen, (2) zur medizinischen und gewerblichen Verwendung als Medikament benutzt werden.
Der Stoff HF-COLL-18/514cf wurde erstmals aus dem Hämofiltrat Nierenkranker nach Ultrafiltration am Hämodialyseapparat gewon¬ nen und wurde nach seiner molekularen Masse und den 60 Aminosäu-
ren des N-Terminus charakterisiert. Zur Darstellung des HF-COLL- l8/514cf wurde ein patentiertes Verfahren (Forssmann, 1988; Offenlegungsschrift DE 36 33 707 AI) verfeinert, welches zuvor für Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hemofiltrat erfunden wurde. Aus den mit diesem Verfahren gewonnenen Molekülen von einem Molukulargewicht unter 20 Kilodalton, die bei veno-venöser oder arterio-venöser Shuntverbindung abfiltriert werden, können die das HF-COLL-18/514cf enthaltende Fraktionen überraschenderweise durch Massenspektrometrie erkannt werden. Es wurde weiter fest¬ gestellt, daß bei speziellen weiteren Verfahren diese Substanz erstaunlicherweise derart aufgereinigt werden konnte, bis schließlich ein einheitlicher Eiweißstoff identifiziert und in seiner Struktur aufgeklärt wurde. Der Stoff iεt überraschender¬ weise ein Fragment von einem Protein, wobei das Protein bisher lediglich auf cDNA-Ebene bekannt ist (Oh et al . , 1994, Genomics Vol. 19, Seite 494) . Der Wert dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß dieser Stoff aus dem bisher als wertlos betrachteten Hemofiltrat aufgereinigt werden kann, um als wirtschaftlich verwertbare Substanz benutzt zu werden.
Damit wurde eine Verbindung isoliert, deren Struktur bisher un¬ bekannt war und deren Bildungsstätte im Körper noch ungeklärt ist . Die therapeutische und wirtschaftliche Verwendung wurde geprüft und das HF-COLL-18/514cf wurde überraschenderweise als wichtiges zirkulierendes Peptid des menschlichen Blutes erkannt.
Der genannte Stoff HF-COLL-18/514cf kann durch chemische Syn¬ these und durch gentechnologische Produktion gewonnen werden und ist für zahlreiche weitere Belange nutzbar, unter anderem für die Analyse im menschlichen Blut als pathognomonisches Diagnosemerkmal von Erkrankungen des Gefäßwachstums, des Wachs¬ tums von Tumoren und von Metastasen.
Die vorliegende Erfindung betrifft also ein neues Peptid, das HF-COLL-18/514cf, seine Herstellung, dieses enthaltende Arznei¬ mittel sowie dieses enthaltende Aufbereitungen und seine Verwen¬ dung dafür, sowie seine natürlichen und pharmakologisch vertrag-
1 -
liehen Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphory- lierte und glycosylierte HF-COLL-18/514cf-Derivate und Fragmente des Peptides. Durch Massenspektrometrie konnte ein mittlereε Molekulargewicht von 18494 u Dalton festgestellt werden.
Das Blutpeptid HF-COLL-18/514cf hat die Aminosäuresequenz: Val -Ala -Leu -Asn -Ser -Pro-Leu- Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly- Ile -Arg -Gly- Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala -Val -Gly-Leu-Ala-Gly- Thr- Phe- Arg- Ala- Phe - Leu - Ser -Ser- Ar Q- Leu-Gin -Asr>-Leu-Tyr- Ser -Ile - Val -Arg -Arg -Ala -Asp- Arg- Ala- Ala - Val - Pro- II e- Val -Asn-Leu-Lγs -Asp- Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trv-Glu-Ala -Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu -Glv- Pro-Leu -Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asv-Val- Leu-Arg-His-Pro-Thr-Try-Pro-Gln-Lys-Ser-Val -TriD-His-Gly-Ser-Asp- Pro-Asn-Glv-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Ser-Tyr-Cvε-Glu -Thr-Try-Arg- Thr- Glu-Ala -Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu -Leu -Gly-Gl y-Arg- Leu-Leu-Glv-Gln-Ser-Ala-Ala -Ser-Cys-His-His-Ala - Tyr-Ile-Val -Leu - Cys -Il e -Gl u -Asn - Ser - Phe-Me t- Thr -AI a- Ser
Das durch die vorliegende Erfindung bereifgestellte Peptid, das HF-COLL-18/514cf, ist nunmehr ein gut zugängliches Arzneimittel mit biologischer und therapeutischer Aktivität eines natürlichen Analogons des im Blut vorkommenden Stoffes .
Die vorliegende Erfindung stellt ein Herstellungsverfahren für dieses HF-COLL-18/514cf sowie die Anwendung des HF-COLL-18/514cf als Arzneimittel für verschiedene therapeutische und diagnosti¬ sche Indikationen zur Verfügung. Dazu kann das HF-COLL-l8/514cf als hochreiner Stoff oder - wenn für die bestimmte Verwendung ausreichend - innerhalb eines teilweise aufgereinigten Peptid- gemischeε verwandt werden.
Das erfindungsgemäße Peptid, seine Derivate und Fragmente können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, z.B. über eine prokaryontische oder eine eukaryontische Expression und" gegebe¬ nenfalls chromatographische Reinigung. Des weiteren läßt es sich aus menschlichem Blut z.B. über an sich bekannte Chromatogra¬ phie-Verfahren isolieren. Schließlich sind HF-COLL-18/514cf oder
seine Derivate oder Fragmente durch übliche Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der angegebenen Sequenz enthalten sind, herstellbar. Nach Entfernung der Schutzgruppen kann es mit den gängigen Chromatographie-Verfahren gereinigt werden.
Die erfindungsgemäße Arzneimittelzubereitung enthält HF-COLL- 18/514cf oder ein physiologisch verträgliches Salz des HF-COLL- l8/514cf. Die Form und Zusammensetzung des Arzneimittels, welches das HF-COLL-18/514cf enthält, richtet sich nach der Art der Verabreichung. Das humane HF-COLL-18/514cf kann parenteral, intranasal, oral, intravenös, intramuskulär, intracutan, intra- thekal, lokal-topisch sowie transpulmonal verabreicht werden. Vorzugsweise wird HF-COLL-18/'514cf zu einem Injektionspräparat, entweder als Lösung oder als Lyophilisat zur Auflösung unmittel¬ bar vor Gebrauch, konfektioniert. Die Arzneimittelzubereitung kann außerdem Hilfsstoffe enthalten, die abfülltechnisch bedingt sind, einen Beitrag zur Löslichkeit, Stabilität oder Sterilität des Arzneimittels leisten oder den Wirkungsgrad der Aufnahme in den Körper erhöhen. Insbesondere die Verwendung der lyophili- sierten, mit Mannit aufgenommenen Form in sterilen Ampullen zur Auflösung in physiologischer Kochsalzlösung und/oder Infusions- lösungen zur wiederholten Einzelinjektion und/oder Dauerinfusion in Mengen von 30 Mikrogramm bis 30 Milligramm reines HF-COLL- 18/514cf pro Therapie-Einheit, ist vorteilhaft.
Die zu verabreichende Tagesdosis für HF-COLL-18/514cf hängt von der Indikation und der Anwendung bestimmter Derivate ab. Bei i.v./i.m. Injektion liegt sie im Bereich von 100 bis 1200 Einheiten (μg) /Tag, bei täglicher subcutaner Injektion vor¬ zugsweise bei 300 bis 2400 Einheiten (μg)/Tag.
Das erfindungsgemäße Peptid HF-COLL-18/514cf ist dadurch gekenn¬ zeichnet, daß es sich besonders auch für die Langzeit-JPherapie bei Tumorerkrankungen oder anderen Erkrankungen die durch ein unkontrolliertes Gefäßwachstum gekennzeichnet sind, eignet und bei Dauerbehandlung keine Immunreaktion auslöst. Das erfin-
dungsgemäße Präparat ist insbesondere für die Kombinationsthera- pie mit Chemo- oder Strahlentherapie oder in Anschluß an Chemo- oder Strahlentherapie bei Krebs geeignet.
Das erfindungsgemäße Präparat ist weiter als Mittel zur Therapie und Diagnose bei Gefäßerkrankungen des Stütz- und Bindegewebes, der Atemwege, des Herz-KreislaufSystems und Urogenitalapparates, des Nervensystems und des Auges einzusetzen, da es zur Herstel¬ lung von human verträglichen Antikörpern verwandt werden kann die geeignet sind, Änderungen des Gefäßwachstums in diesen Organen festzustellen oder zu beeinflussen.
Solche Antikörper sind grundsätzlich erhältlich durch Immunisie¬ rung von Tieren mit dem erfindungsgemäßen Peptid und/oder seinen Fragmenten oder durch Anwendung der Hybridoma-Technologie.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Behandlung von Patienten, die HF-COLL-18/514cf oder seine Derivate oder Fragmente benötigen, durch Gabe therapeutischer Mengen von HF-COLL-18/514cf. Patienten, die unter einer überhöh¬ ten Produktion von HF-COLL-18/514cf oder seiner Derivate oder Fragmente leiden, benötigen die Gabe therapeutischer' Mengen eines Antagonisten/Inhibitorε des HF-COLL-18/514cf .
Das erfindungsgemäße Arzneimittel ist zur Behandlung von Erkran¬ kungen des menschlichen Organismus, insbesondere in Verbindung mit Gefäßwucherungen, Krebserkrankungen, Erkrankungen mit Beteiligung des Herzkreislauf- und Nervensystems, Erkrankungen mit Beteiligung des Intugementes und der Sinnesorgane, insbeson¬ dere des Auges, geeignet.
Erfindungsgemäß wird die Verwendung des Peptids oder seiner Derivate, der Fragmente oder des erfindungsgemaßen Antikörpers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Störungen bei entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Proliferations- und Reifungsstörungen des blutbildenden Systems, von Systemerkrankungen bei Überproduktion oder Mangel von HF-
COLL-18/514cf, insbesondere bei z.B. durch Anwendung gegen dieses gebildete Antikörper oder zur Verwendung von HF-COLL- 18/514cf zur Substitutionstherapie, chronischen Erkrankungen, teils vergesellschaftet mit den genannten Erkrankungen, indem es in geeigneter Form für die Behandlung für die Elektrolyt- Wirkung bei Tumor- und Gefäßerkrankungen benutzt wird, bean¬ sprucht .
Daε erfindungsgemäße Arzneimittel ist zur Behandlung von akuten Erkrankungen oben genannter Art geeignet, indem es in entspre¬ chender Form für die Behandlung in der Intensivpflege dieser Erkrankungen benutzt wird.
Eine weitere Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids, seiner Fragmente oder des erfindungsgemäßen Antikörpers erfolgt zur Diagnose von Erkrankungen, indem spezifische Antikörper gegen synthetische Teilstücke oder das gesamte Peptid oder seiner Derivate und seiner Fragmente hergestellt werden und z.B. die Blutkonzentration des HF-COLL-18/514cf über Immuntests gemessen wird.
Ein Diagnostikmittel enthaltend das erfindungsgemäße Peptid, seine Fragmente oder erfindungsgemaße Antikörper für Testsysteme zur Kontrolle von Gewebe-, Plasma-, Urin- und Liquor cerebrospi- nalis-Spiegeln dieser Substanz sind somit auch Gegenstand der Erfindung. Das erfindungsgemaße Diagnostikmittel ist insbesonde¬ re als Marker für bestimmte Krebserkrankungen sowie für Funk¬ tionsstörungen von Blutgefäßen, Knochenmark, Lymphorganen, deε Magen-Darmtraktes, des Immunsystems und von inflammatorischen sowie neoplastischen Prozesεen, geeignet.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher er¬ läutert .
Beispiel 1 : Isolierung und Charakterisierung von zirkulierendem HF- COLL- 18 /514cf aus humanem Hämofiltrat
Als Ausgangsmaterial wurde Hemofiltrat verwendet , das in großen Mengen bei der Behandlung niereninsuf f izienter Patienten anfällt und alle Plasmabestandteile bis zu einer Molekülgröße von etwa 20 . 000 Dalton enthält .
I. Gewinnung des Rohpeptidmaterials
Das Hemofiltrat wurde mittels einer Hemofiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung von Cellulosetriacetat-Filtern mit einer Auεschlußgröße von 20.000 Dalton (Typ SM 40042, Sartoriuε, Göttingen, BRD) gewonnen. Das Filtrat stammte von niereninsuffizienten Patienten, die sich durch Langzeit-Hemofil- tration in einer stabilen Stoffwechsellage befanden, und wurde unmittelbar nach der Gewinnung mittels Ansäuern und Abkühlung auf 4°C gegen proteolytischen Abbau geschützt. In vier Extrak¬ tionen mit einer Kationenaustauschersäule (TSK SP 650 (M) , Merck, Darmstadt, DE) wurden 2860 1 Hämofiltrat verarbeitet. 93% der gepoolten Extrakte wurden auf dem obengenannten Säulenmaterial nacheinander durch verschiedene Puffer mit unterschiedlichen pH-Werten eluiert. Die Rohfraktionen wurden anschließend ge¬ friergetrocknet .
II. Präparative RP-Chromatographie
500 mg von 2200 mg der letzten Rohfraktion wurden mittels präparativer RP-Chromatographie grob nach Hydrophobizität getrennt. Von einer PrepPak Cartridge mit den Dimensionen 47 x 300 mm der Firma Waters wurden Fraktionen abgesammelt. Die Fraktion 31, wurde für die weitere Aufreinigung benutzt.
Gerät: BioCad HPLC (Perseptive Biosystems, Freibύrg, DE)
Säule: Waters PrepPak Cartridge 47 x 300 mm
Material: Vydac, 300 Ä, 15 - 20 μm
Eluent A: Wasser mit lOmM HC1
Eluent B: Methanol mit lOmM HC1 Gradient: 0 - 50 % Eluent B 28,57 min 50 - 95 % Eluent B 61,43 min 95 % Eluent B 5,71 min Flußrate: 35 ml / min Fraktionen: 50 ml bzw. 1,43 min Detektion: 230 nm und 280 nm
III. Erste analytische RP-HPLC
UV-Absorption während der analytischen RP-Chromatographie der Fraktion 31, die aus der Auftrennung in Abbildung 1 gewonnen wurde. In einem Gradienten auf einer Vydac-Säule (10 x 250 mm Stahlmantel, Material: RP C18, 300 Ä, 5 μm) konnte eine weitere Auftrennung erzielt werden. Die Eluenten waren Wasser mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure und Acetonitril mit 0,1 Vol% Tri- fluoressigsäure .
Gerät : Kontron HPLC-Anlage Säule : Vydac, Stahlmantel 10 x 250 mm Material Vydac RP-C18, 300 Ä, 5 μm Eluent A Wasser mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure Eluent B Acetonitril mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure Gradient 0 - 60 % Eluent B 50 min
60 - 80 % Eluent B 5 min
80 - 0 % Eluent B 5 min
Flußrate : 2 ml / min Fraktionen 2 ml bzw. 1 min Detektion: 230 nm
IV. Entdeckung der molekularen Masse des HF-COLL-18/514cf mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie
Mit einem MALDI-Masenspekrometer RBT II (Vestec/Per-Septive, Houston, Texas, USA) wurden Massenspektren von dem nativen, gereinigten HF-COLL-18/514cf aus der Präparation im Schritt III mit alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure als Matrix gemessen. In den
Fraktionen 45 und 46 zeigten sich Peaks von dem einfach, zwei¬ fach und dreifach protoniertem Molekül, mit einer molekularen Masse von etwa 18500 u. Verschiedene Nebenbestandteile waren außerdem sichtbar.
V. Zweite analytische RP-HPLC
In einer abschließenden analytischen RP-Chromatographie von den gepoolten Fraktionen 45 und 46, die aus der Auftrennung in Schritt III gewonnen wurden, konnte in der Fraktion 25 hochauf- gereinigtes HF-COLL-18/514cf isoliert werden.
Gerät : Kontron HPLC (Kontron, München, DE) Säule : YMC, Stahlmantel 4,6 x 250 mm Material YMC RP-C18, 300 Ä, 5 μm Eluent A Wasser mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure Eluent B 80 % Acetonitril, 20 % Wasser
(V : V) mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure
Gradient 0 - 30 % Eluent B 5 min
30 - 80 % Eluent B 150 min
80 - 100 % Eluent B 5 min
100 % Eluent B 5 min
Flußrate: 0,6 ml / min Fraktionen: manuell abgesammelt Detektion: 230 nm und 280 nm
VI. Reinheitsbestimmung mittels Kapillar-Zonen-Elektrophorese
5 μl der Fraktion 25 wurden direkt zur Messung in der Kapillar- Zonen-Elektrophorese verwendet . Das Elektropherogramm zeigt lediglich einen Peak und keine weiteren Peaks von Nebenbes¬ tandteilen. Dieses Ergebnis zeigt, daß in der Endreinigungsεtufe ein hochreines HF-COLL-18/514cf vorlag.
Gerät: P/ACE System 2000, Beckman Instruments GmbH,
München, DE Kapillare: Uncoated Fuεed Silica, 500 mm x 75 μm ID
Puffer: 100 mM Natriumphosphat pH 2, 5
0,02 % Hydroxypropylmethylcellulose
Temperatur: 25°C
Injektion: 20 see entspricht 120 nl
Laufzeit: 25 Minuten
Strom: 80 μA, konstant
Detektion: 200 nm
VII. Bestimmung der molekularen Masse von HF-COLL-18/514cf
Mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie auf einem Vestec BT II des nativen, gereinigten HF-COLL-18/514cf aus Fraktion 25 im Schritt V konnten auf zwei Matrices (alpha-Cyano-4-hydroxy- zimtεäure und 2 , 5-Dihydroxybenzoesäure) Spektren erhalten werden. Eε zeigen sich Peaks von dem einfach, zweifach und dreifach protoniertem Molekül. Die molekulare Masse wird mit 18507 u ± 20 u bestimmt. Nebenbestandteile sind nicht sichtbar.
Für eine genauere Bestimmung der molekularen Masse des nativen, gereinigten HF-COLL-18/514cf wurde aus Fraktion 25 des Schrit¬ tes V zusätzlich ein Massenspektrum mit einem Elektrospray- Massenspektrometer (Sciex API III, Perkin-Elmer, Langen, DE) gemessen. Es zeigen sich Peaks von dem acht- bis elffach proto¬ niertem Molekül. Die mittlere molekulare Masse von HF-COLL- 18/514cf wird hier mit 18494 u + 3 u bestimmt, der theoretische Wert beträgt 18496 u (siehe VIII) .
VIII. Bestimmung der aminoterminalen Aminosäurensequenz
Mittels automatisierter Edman-Sequenzierung mit einem Gasphaεen- Aminosäure-Sequenator ABI 494 (Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Weiterstadt, DE) wurden die ersten 60 Aminosäuren bestimmt. An 21. Stelle (Xxx) wurde keine Aminosäure detektiert, wie es für Cystein üblich iεt.
Val -Ala -Leu-Asn-Ser-Pro-Leu -Ser-Gl y-Gly-Met -Arg-Gl y- Ile-Arg-Gl y- Ala -Asp-Phe-Gln-Xxx-Phe-Gln-Gln-Ala -Arg-Ala -Val -Gl v-Leu -Al a -Gl y-
Thr- Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser- Arg- Leu-Gin- Asu-Leu -Tyr -Ser- Ile - Val -Arg-Arg-Ala -Asp-Arg-Ala -Ala -Val -Pro-Il e-Val Damit wurde festgestellt, daß es sich um ein Fragment von Kollagen alpha 1 (XVIII) handelt, wobei dieses Protein bisher lediglich auf cDNA-Ebene bekannt ist (Oh et al . , 1994, Genomics Vol. 19, Seite 494) . Das Fragment beginnt an der Position 514 des Protein-Precursors und die molekulare Masse zeigt, daß es an vorletzter Stelle des Precursors mit der Aminosäure Serin endet, also C-terminal um ein Lysin verkürzt ist.
Beispiel 2 : Untersuchung der biologischen Wirksamkeit von HF- COLL-18/514cf
Anhand des in Beispiel 1 dargestellten Verfahrens wurde eine größere Materialmenge von mehr als 0, 1 mg HF-COLL-18/514cf aus humanem Hämofiltrat isoliert. Das hochreine HF-COLL-18/514cf wurde zur Bestimmung der biologischen Funktion in Endothelzell- Proliferationsassays eingesetzt. Für diesen Assay wurden bovine Kapillarendothelzellen aus der Nebennierenrinde von frisch geschlachteten Kälbern, wie in der Literatur beschrieben (Folk- man et al . , 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. Vol. 76, Seite 5217) , in Kultur genommen.
Die Ausführung des Proliferationsassays wurde, wie in der Literatur beschrieben (O'Reilly et al. , 1997, Cell Vol.88, Seite 277) , durchgeführt. Die bovinen Kapillarendothelzellen wurden dazu mit PBS (Phosphatpuffer mit Kochsalz, pH 7.4) gewaεchen und in einer 0,05 %igen Trypsinlösung suspendiert. Eine Zell- suspension mit 25000 Zellen pro ml in DMEM-Medium, enthaltend 10 % FKS (Fötales Kälberserum) und 1 % GPS (Glutamin-Penicillin- Streptomycin) , wurde in gelatine-beschichteten 24-Loch-Platten (0,5 ml pro Loch) bei 37°C und 10 % C02 inkubiert.
Nach 24 h wurde das Medium ersetzt durch 0.5 ml DMEM-Medium, enthaltend 5% FKS und 1% GPS sowie unterschiedlichen Konzen¬ trationen (von 0 bis 1000 ng/ml Endkonzentration) des isolier¬ ten, hochreinen HF-COLL-18/514cf, ersetzt. Nach weiteren 30
Minuten Inkubation wurde den Ansätzen bFGF (basischer Fibrobla- sten-Wachεtumsfaktor) in einer Endkonzentration von 1 ng/ml zugegeben. Nach 72 h wurde die Zellzahl in den Anεätzen durch eine Kristallviolettfärbung der Zellen und Messung der Absorp¬ tion bei 600 nm bestimmt. Das den bovinen Kapillarendothelzellen zugegebene HF-COLL-18/514cf hemmte in konzentrationsabhängiger- weiεe die mit bFGF stimulierte Proliferation dieser Zellen. Eine halbmaximale Hemmung der Proliferation in diesem Assay wurde bei einer Konzentration von 200 ng/ml HF-COLL-18/514cf erreicht.
Um die Spezifität des Wirkungsspektrums von HF-COLL-18/514cf und damit mögliche andere biologische Funktionen zu untersuchen, wurden Proliferationsassays mit nicht-endothelialen Zellen durchgeführt. In Tests mit Fibroblasten-Zellinien, nämlich NIH 3T3-Zellen und LMTK-Zellen, zeigte HF-COLL-18/514cf keine signifikante Wirkung und damit auch keine antiproliferative Wirkung.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Wolf-Georg Forssmann
(B) STRASSE: Feodor-Lynen-Str. 31
(C) ORT: Hannover
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 30625
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Biologisch aktiver Eiweissstoff Kollagenfragment HF-COLL-l8/514cf - zur Hemmung des Wachstums von Tumoren und von Gefaesswucherungen liii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 170 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (Üi) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly 1 5 10 15
Ala Asp Phe Gin Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly 20 25 30
Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gin Asp Leu Tyr Ser Ile 35 40 45
Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp 50 55 60
Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly 65 70 75 80
Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val 85 90 95
Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gin Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp 100 105 110
Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr 115 120 125
Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg 130 135 140
Leu Leu Gly Gin Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu 145 150 155 160
Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser
165 170
Claims
Ansprüche
Peptid mit der Aminoεäureεequenz
Val -Ala - Leu- Asn- Ser -Pro-Leu- Ser-Glγ-Gly-Met- Arg-Gly-Ile- Arg-
Gly-Ala -Asv-Phe-Gln -Cvs-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val -Gly-Leu-
Ala-Gly- Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-
Tγr-Ser-Ile-Val -Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala -Val -Pro-Ile-Val -
Aεn-Leu-Lγs-Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-
Ser-Gl y-Ser-Glu-Glγ-Pro-Leu-Lvs-Pro-Glv-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-
Phe-Asp-Gly-Lγs-Asp-Val -Leu-Arg-His-Pro-Thr-TrO-Pro-Gln-Lvs-
Ser-Val - Trv-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-
Ser-Tyr-Cyε-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-
Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Gly-Glγ-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-
Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-Val -Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-
Phe -Met - Thr -Ala -Ser (HF-COLL-18/514cf) sowie εeine natürlichen und pharmakologiεch verträglichen
Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphory- lierte und glycosylierte Derivate.
Fragmente des Peptids nach Anspruch 1, die pharmakologisch aktiv sind.
Verfahren zur Herstellung des Peptids nach Anspruch 1 und/oder seiner Fragmente nach Anspruch 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß dieses über eine prokaryontische oder eine eukaryontische Expression hergestellt wird.
Verfahren zur Herεtellung des Peptidε nach Anspruch 1 und/oder seiner Fragmente nach Anspruch 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß man es aus menschlichem Blut über Chromatogra¬ phie-Verfahren isoliert.
5. Verfahren zur Herstellung des Peptids oder seiner Derivate nach Anspruch 2 und seiner Fragmente nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid oder seine Derivate oder Fragmente durch übliche Verfahren der Festpha¬ sen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Amino¬ säuren, die in der ausgegebenen Sequenz enthalten sind, herstellt, deblockiert und es mit an sich bekannten Chroma¬ tographie-Verfahren reinigt.
6. Arzneimittel, die das Peptid nach Anspruch 1 oder seine Fragmente nach Ansprüche 2 als aktiven Wirkstoff neben übli¬ chen Hilfs- und Zusatzεtoffen enthalten.
7. Arzneimittel nach Anspruch 6 zur oralen, parenteralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, intrathekalen, intranasalen und lokal-topischen Anwendung sowie als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.
8. Antikörper erhältlich durch Immunisierung von Tieren mit einem Peptid nach Anspruch 1 und/oder Fragmenten nach Anspruch 2 udn/oder durch Anwendung der Hybridoma-Technolo¬ gie .
9. Verfahren zur Behandlung von Patienten, die HF-COLL-18/514cf oder seine Derivate oder Fragmente nach Anspruch 1 benöti¬ gen, durch Gabe therapeutischer Mengen von HF-COLL-18/514cf.
10. Verfahren zur Behandlung von Patienten, die eine Inhibition von HF-COLL-18/514cf oder seiner Derivate oder Fragmente nach Anspruch 1 oder 2 benötigen durch Gabe therapeutischer Mengen eines Antagonisten/Inhibitors des HF-COLL-18/514cf .
11. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere in Verbindung mit Gefäßwucherungen.
12. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere bei Krebserkrankungen.
13. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Herzkreislauf- und Ner¬ vensystems .
14. Verwendung der Arzneimittel nach Ansprüchen 6 oder 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Intugementeε und der Sinneεorgane, insbesondere des Auges.
15. Verwendung des Peptids oder seiner Derivate nach Anspruch 1, der Fragmente nach Anspruch 2 oder des Antikörpers nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behand¬ lung von Störungen bei entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Proliferations- und Reifungsstörungen des blutbildenden Systems.
16. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 oder des Antikörpers anch Anspruch 8 zur Behandlung von System- erkrankungen bei Überproduktion oder Mangel von HF-COLL- 18/514cf, insbesondere bei z.B. durch Anwendung gegen dieses gebildete Antikörper oder zur Verwendung von HF-COLL- 18/514cf zur Substitutionstherapie.
17. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 zur Behandlung von chronischen Erkrankungen, teils vergesell¬ schaftet mit den in den Ansprüchen 11 bis 16 genannten Erkrankungen, indem es in geeigneter Form für die Behandlung für die Elektrolytwirkung bei Tumor- und Gefäßerkrankungen benutzt wird.
18. Verwendung des Arzneimittels nach Anεprüchen 6 oder 7 oder des Antikörperε nach Anspruch 8 zur Behandlung von akuten
Erkrankungen, gemäß Ansprüchen 11 biε 16, indem es in geeigneter Form für die Behandlung in der Intensivpflege dieser Erkrankungen benutzt wird.
19. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 oder des Antikörpers nach Anspruch 8 zur Diagnose von Erkrankun¬ gen, insbeεondere nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 16, indem spezifische Antikörper gegen synthetische Teilstücke oder das gesamte Peptid oder seiner Derivate und seiner Fragmente hergestellt werden und die Blutkonzentration HF- COLL-18/514cf über Immuntests gemessen wird.
20. Diagnostikmittel enthaltend das Peptid nach Anspruch 1, Fragmente nach Anspruch 2 oder Antikörper nach Anspruch 8 für Testsyεteme zur Kontrolle von Gewebe-, Plaεma-, Urin- und Liquor cerebrospinaliε-Spiegeln dieser Substanz.
21. Diagnostikmittel nach Anspruch 20 als Marker für bestimmte Krebserkrankungen sowie für Funktionsstörungen von Blutgefä¬ ßen, Knochenmark, Lymphorganen, des Magen-Darmtraktes, des Immunsystems und von inflammatoriεchen sowie neoplastischen Prozessen.
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