DE19951824A1 - Humanes zirkulierendes Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3 Fragment und seine Verwendung - Google Patents
Humanes zirkulierendes Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3 Fragment und seine VerwendungInfo
- Publication number
- DE19951824A1 DE19951824A1 DE1999151824 DE19951824A DE19951824A1 DE 19951824 A1 DE19951824 A1 DE 19951824A1 DE 1999151824 DE1999151824 DE 1999151824 DE 19951824 A DE19951824 A DE 19951824A DE 19951824 A1 DE19951824 A1 DE 19951824A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- igfbp
- complexes
- derivatives
- dna
- igf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid(Eiweißstoff) mit zellproliferativen und zellprotektiven Eigenschaften: Humanes zirkulierendes N-IGFBP-3 (N-terminales Fragment des Insulin-like growth factor binding protein-3) und seine Verwendung. DOLLAR A Die Erfindung umfaßt weiterhin von dem N-IGFBP-3 abgeleitete Fragmente und/oder Derivate sowie die Kombination dieser Peptidwirkstoffe mit IGF-I oder IGF-II (Insulin-like growth factor) schließlich ein Arzneimittel, enthaltend die natürlichen, rekombinanten und synthetischen Peptide zur Verwendung für medizinische Indikationen und zur Verwendung als ein Diagnosemittel. Des weiteren eine Nukleinsäuresonde hybridisierend für N-IGFBP-3 oder eines seiner Fragmente und Antikörper bzw. Antagonisten gerichtet gegen N-IGFBP-3 oder eines seiner Fragmente zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken.
Description
Das N-IGFBP-3 konnte mit Hilfe eines biologischen Assays und mit Hilfe
eines Immunoassays aus humanem Hämofiltrat isoliert werden. Das N-IGFBP-3
besitzt eine hohe Identität zu den N-terminalen Aminosäuren des Insulin-like
Growth Factor Binding Protein-3 und besitzt je nach Grad der Glykosilierung
eine Molekularmasse von 10, 12 oder von 15 kDa. Die gefundene
Aminosäuresequenz N-IGFBP-3 weicht überraschenderweise von der bislang
bekannten Sequenz des humanen IGFBP-3 ab. Das IGFBP-3 wurde bisher als ein
40 kDa großes Bindungsprotein beschrieben, seine vollständige Sequenzanalyse
erfolgte durch Sequenzanalyse der dazugehörigen cDNA (Wood W.I. et al.,
1988, Mol. Endocrinol., Vol. 2, Seiten 1176-1185). IGFBP-3 stellt das
wichtigste Bindeprotein für IGF-I und auch IGF-II und somit ein Reservoir für
diese wichtigen Wachstumsfaktoren im Plasma dar. IGF-I und auch IGF-II
wurden in ihrer Struktur auf Protein- und DNA-Sequenzebene schon
umfangreich beschrieben (als Review siehe: Rechler, M. M., & Nissley, S. P.
(1990) Insulin-like growth factors. In: Peptide growth factors and their receptors
(Spori, M. B., Roberts, A. B. eds.), pp. 263-367, Springer-Verlag, Berlin). Die
vorliegende Erfindung beschreibt erstmalig die Isolierung und exakte Analyse
eines in der Zirkulation vorkommenden IGFBP-3 Peptid-Fagmentes aus einer
Körperflüssigkeit wie dem Blut. Das erfindungsgemäße N-IGFBP-3 besitz im
Unterschied zum gesamten IGFBP-3 eine spezielle Bindungskapazität für IGF-I
und auch IGF-II und beeinflußt besonders die Plasmahalbwertszeit von IGF-I und
IGF-II, was für die Therapie mit diesen Wachstumsfaktoren von
außerordentlichem Vorteil ist. Aufgrund der im Vergleich zum gesamten IGFBP-
3 geringeren Größe vermag das N-IGFBP-3 auch zusammen mit den IGF-
Wachstumsfaktoren das Blutgefäßsystem zu verlassen um daraufhin
wachstumsmodulierende Funktionen in Organen und Geweben auszuüben.
Darüberhinaus besitzt das erfindungsgemäße N-IGFBP-3 auch IGF-unabhängige
Wirkungen auf das Wachstum von Zellen und Geweben.
Das erfindungsgemäße Peptid ist durch ein Reinigungsverfahren ausgehend von
humanem Hämofiltrat erhältlich. Hämofiltrat fällt bei der Ultrafiltration des Blutes
von Nierenkranken in großen Mengen an.
Für die Präparation von Peptiden wird das humane Hämofiltrat dabei mit Wasser
verdünnt und angesäuert. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 1.5 bis 3.5,
insbesondere 2.5 bis 3.0. Danach wird das Hämofiltrat über einen
Kationenaustauscher geleitet, beispielsweise einem mit Sulfonsäuregruppen
modifizierenden Trägermaterial (Fraktogel SP - 650 (M), Merck, Darmstadt).
Die an den Kationenaustauscher gebundenen Peptide werden mit einer relativ
hoch konzentrierten Salzlösung eluiert. Die Ionenstärke der Elutionslösung
entspricht dabei ungefähr einer 0.5 bis 1 molaren Ammoniumacetatlösung.
Das aufgefangene Eluat wird einer weiteren Kationenaustauscher-
Chromatographie unterzogen. Diese Chromatographie ist vorzugsweise eine
Stufenelution mit Puffern von ansteigenden pH-Werten.
Die das erfindungsgemäße Peptid enthaltenen Fraktionen werden mittels
präparativer Umkehrphasen-Chromatographie und nachfolgender
semipräparativer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18
modifizierten Trägermaterialien weitergereinigt. Der Aufreinigungsgrad wird
vorzugsweise mittels analytischer Umkehrphasen-Chromatographie
beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien überprüft.
Die durch die chromatographische Reinigung erhaltene Substanz wurde der
Strukturaufklärung zugeführt. Die Bestimmung der Molekülmassen des nativen
Peptids sowie seiner deglykosilierten Formen und chemisch modifizierten
Derivate erfolgte mittels eines ESI-Massenspektrometers. Die Sequenzanalyse
erfolgte über einen Edman-Abbau der Peptide sowie von chemisch modifizierten
Derivaten mit einem ABI 473 A Sequenzer.
Neben der gentechnischen Herstellung des Peptids ist auch die aufbauende
Totalsynthese an üblichen Festphasen im Sinne der Merrifield-Synthese oder einer
Flüssigphasensynthese möglich. Die Synthesestrategie und der Aufbau des
Peptids und von ihm abgeleiteten Derivaten mit den entsprechend geschützten
Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.
Der erfindungsgemäße N-IGFBP-3 allein, sowie seine cDNA, sein Gen und
Analoga, Fragmente und Derivate zu dem Peptid, der cDNA und dem Gen sowie
Antikörper, welche die Wirkung von N-IGFBP-3 aufheben, können als
Arzneimittel Verwendung finden. Seine biologische Aktivität entspricht der
zellproliferativen Substanzen, ähnlich der bekannter Insulin-ähnlicher
Wachstumsfaktoren. Das N-IGFBP-3 reguliert die Freisetzung von IGF-I und
IGF-II an ihrem Wirkort. Die Co-Administration von N-IGFBP-3 mit IGF-I oder
IGF-II verlängert die biologische Halbwertszeit und damit Verfügbarkeit der
letztgenannten. Die durch eine Injektion von freiem IGF-I oder IGF-II induzierte
Hypoglykämie wird durch die Co-Administration von N-IGFBP-3 verhindert.
Insbesondere für die Therapie von Insulin-resistenten Diabetikern ist die Gabe
von N-IGFBP-3 zusammen mit IGF-I oder IGF-II erfolgversprechend. Das
erfindungsgemäße Peptid N-IGFBP-3 ist daher geeignet, als Arzneimittel bei den
in Anspruch 24 bis 25 genannten Indikationen eingesetzt zu werden.
Für das N-IGFBP-3 allein ist desweiteren von einer wachstumsförderndern
Wirkung auf Körperzellen und von einer Verstärkung oder Modulation der
Wirkung von Wachstumshormon (Growth Hormone, GH, Somatotropin)
auszugehen.
Das erfindungsgemäße Peptid kann dabei in für Peptide üblicher Weise
parenteral, intravenös, intramuskulär, intranasal, lokal-topisch oder bukal
verabreicht werden. Dabei kann es sinnvoll sein, das erfindungsgemäße Peptid
gebunden an einen geeigneten Carner zu verabreichen. Die Menge an zu
verabreichendem Peptid beträgt 1g bis 1 g pro Darreichungseinheit pro Tag.
Die Wirkung des erfindungsgemäßen Peptids kann durch Gabe geeigneter
Inhibitoren/Antagonisten gehemmt werden.
Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly- oder monoklonale
Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid gegebenenfalls in fluoreszenz-
oder radioaktiv-markierter Form, um in einem an sich bekannten ELISA oder
RIA eingesetzt zu werden. Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält DNA,
RNA und/oder PNA gegebenenfalls in modifizierter und/oder markierter Form
zum Einsatz in dem Fachmann bekannten Testsystemen wie PCR oder
Fingerprinting.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben:
800 bis 1.000 L Hämofiltrat werden mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2.7
eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5.5 mS/cm verdünnt und mit
einer Flußrate von 3 L/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: 3 L/min
Detektion: 280 nm,
Auftrag: Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm
Elutions-Puffer: 0.5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems)
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: 3 L/min
Detektion: 280 nm,
Auftrag: Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm
Elutions-Puffer: 0.5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems)
Nach Auftrag der insgesamt 1.000 L Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren
Säulenvolumina 5 mM HCl gespült. Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt
als Batch-Elution mit 0.5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette
Elution der Peptide über steigenden pH-Wert (6.8-7.2) und steigende
Leitfähigkeit (56 mS/cm) in etwa 5 L Eluat erreicht.
Die Ammoniumacetat-Eluate der Batch-Extraktion werden in Mengen von 5.000
bis 10.000 L Hämofiltrat-Peptid vereinigt. Nach pH-Einstellung auf 2.7 wird das
Peptidextrakt unter Zumischung von deionisiertem Wasser mit einer Leitfähigkeit
von 5.5 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage 250 VA
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: bis zu 3 L/min während des Auftrages
0.5 bis 1 L während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems)
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage 250 VA
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: bis zu 3 L/min während des Auftrages
0.5 bis 1 L während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems)
Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Säule mit 0.01 M HCl
gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in
mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern
Die Eluate 1-7 werden als ph-Pool I-VII bezeichnet. Die Elution erfolgt bis zum
Erreichen einer neuen Basislinie, wobei für die einzelnen pH-Pools I bis VII
Elutionsvolumina von 10 bis 25 L erreicht werden.
Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleichzeitigen Entsalzung
über eine Reversed Phase Chromatographie getrennt.
Chromatographiebedingungen:
Säule: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Säulenmaterial: Source RPC, 15 µm
10 × 12.5 cm
Fluß: 150 ml/min
Detektion: 280 nm, 214 nm
Puffer A: 10 mM HCl
Puffer B: 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 0-60% Puffer B in 5 Säulenvolumen
Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems
Chromatographiebedingungen:
Säule: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Säulenmaterial: Source RPC, 15 µm
10 × 12.5 cm
Fluß: 150 ml/min
Detektion: 280 nm, 214 nm
Puffer A: 10 mM HCl
Puffer B: 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 0-60% Puffer B in 5 Säulenvolumen
Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems
Nach Auftrag der pH-Pools wird die Säule mit Puffer A gespült. Während der
Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Die Fraktionen werden
gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert. Aliquots der Fraktionen werden im
Bioassay und Immunoassay getestet. Die Fraktion 25 aus dem pH-Pool Eluat 2
erhielten die erfindungsgemäße Substanz.
Die in den Assays aktive Fraktion 25 aus pH-Pool 2 wurde über eine
semipräparative Reverse-Phase Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 15-27
enthielten die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 4,7 cm × 30 cm, Kartuschensystem
Füllmaterial: YMC ODS AQ, RP-C18, 15-20 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA/20% MeOH
Puffer B: 0,1% TFA, 100% MeOH
Gradient: 35-60% B in 41.7 min
Fluß: 50 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems
Fraktionen: à 50 ml ab Start des Gradienten
Chromatographiebedingungen:
Säule: 4,7 cm × 30 cm, Kartuschensystem
Füllmaterial: YMC ODS AQ, RP-C18, 15-20 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA/20% MeOH
Puffer B: 0,1% TFA, 100% MeOH
Gradient: 35-60% B in 41.7 min
Fluß: 50 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems
Fraktionen: à 50 ml ab Start des Gradienten
Die aktiven Fraktionen 15-27 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden
über eine Gelfiltrations-Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 32-35 enthielten die
erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 14 × 76 cm Kunststoffsäule (11 L)
Füllmaterial: Superdex 75 prep grade, Pharmacia
Puffer: 200 mM Ammoniumformiat pH 7.4
Gradient: isokratisch
Fluß: 100 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems
Fraktionen: à 1 min ab 35 min nach Start
Chromatographiebedingungen:
Säule: 14 × 76 cm Kunststoffsäule (11 L)
Füllmaterial: Superdex 75 prep grade, Pharmacia
Puffer: 200 mM Ammoniumformiat pH 7.4
Gradient: isokratisch
Fluß: 100 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems
Fraktionen: à 1 min ab 35 min nach Start
Die aktiven Fraktionen 32-35 aus der vorhergehenden Chromatographie wurde
über eine semipräparative Kationen-Austausch Chromatographie-Säule
aufgetrennt. Die Fraktion 12 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 3 cm × 15 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Merck Fractogel TSK SP 650 S
Puffer A: 20 mM NaH2PO4 pH 5.0
Puffer B: 20 mM NaH2PO4 pH 5.0 + 1 M NaCl
Gradient: 0-50% B in 40 min
Fluß: 10 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: BioCAD Sprint, Perseptive Biosystems
Fraktionen à 7 ml
Chromatographiebedingungen:
Säule: 3 cm × 15 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Merck Fractogel TSK SP 650 S
Puffer A: 20 mM NaH2PO4 pH 5.0
Puffer B: 20 mM NaH2PO4 pH 5.0 + 1 M NaCl
Gradient: 0-50% B in 40 min
Fluß: 10 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: BioCAD Sprint, Perseptive Biosystems
Fraktionen à 7 ml
Die aktive Fraktion 12 aus der vorhergehenden Chromatographie wurde über
eine analytische Reverse Phase - Säule aufgetrennt. Die Fraktion 15 enthielt die
erfindungsgemäße Substanz in hochreiner Form.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,4 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: YMC ODS AQ; RP-C18, 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 30-50% B in 60 min
Fluß: 0,7 ml/min
Detektion: 214/280 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionierung: Sammlung einzelner Peaks
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,4 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: YMC ODS AQ; RP-C18, 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 30-50% B in 60 min
Fluß: 0,7 ml/min
Detektion: 214/280 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionierung: Sammlung einzelner Peaks
Das aus der aktiven Fraktion 15 des letzten Aufreinigungsschrittes in Beispiel 1
erhaltene Peptid wurde mit Glykosidasen (Neuraminidasen und N-Glykosidasen)
behandelt, um so die Molekularmasse des nicht-glykosilierten Peptids bestimmen
zu können. Aus dieser Masse des vollständig deglykosilierten Peptids und der
ermittelten Sequenz ließ sich dann aus dem Vergleich mit den aus der cDNA
hergeleiteten Sequenzen des humanen IGFBP-3 die C-terminale Aminosäure des
erfindungsgemäßen N-IGFBP-3 Fragments bestimmen.
Alle Massenbestimmungen des glycosilierten, und der deglycosilierten und
cystein-modifizierten Peptide wurden auf einem ESI-Massenspektrometer
durchgeführt. Cysteine lassen sich nach vorheriger chemischer Derivatisierung,
zum Beispiel nach Reduktion mit β-Mercaptoethanol und
Carboxamidomethylierung mit Iodacetamid, in der Peptid-Sequenzierung
nachweisen. Nach der Derivatisierung schließt sich eine Entsalzung vorzugsweise
über eine analytische Reverse-Phase Chromatographie mit einer Vydac RP-C18
Säule (4,6 mm × 25 cm) an. Ein Teil der so modifizierten Peptide werden der
Sequenzanalyse zugeführt, mit dem anderen Teil ergeben die
Massenbestimmungen ein entsprechendes Molekulargewicht. Aus der
Massendifferenz zum nativen Peptid wurde geschlossen, daß das N-IGFBP-3 aus
Hämofiltrat zwölf Cysteine enthält, welche zudem mit sechs Disulfidbrücken
untereinder verbunden sind. Die Molekülmassen von N-IGFBP-3 wurden
entsprechend hier aufgelisteten Massenzahlen (MW) bestimmt.
N-IGFBP-3 - natives, einfach N-glykosiliertes Peptid - Kettenlänge 98 Aminosäuren: 12,266 Da
N-IGFBP-3 - deglykosiliertes Peptid - Kettenlänge 98 Aminosäuren: 9,916 Da
N-IGFBP-3 - carboxymethyliertes und deglycosiliertes Peptid - Kettenlänge 98 Aminosäuren: 10,606 Da
N-IGFBP-3 - natives, einfach N-glykosiliertes Peptid - Kettenlänge 98 Aminosäuren: 12,266 Da
N-IGFBP-3 - deglykosiliertes Peptid - Kettenlänge 98 Aminosäuren: 9,916 Da
N-IGFBP-3 - carboxymethyliertes und deglycosiliertes Peptid - Kettenlänge 98 Aminosäuren: 10,606 Da
Sowohl die aufgereinigten nativen als auch die deglycosilierten Peptide werden
mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des
Standard-Programms analysiert. Die Proben werden auf eine Polybyrene-
Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. In
Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Massenbestimmungen ergab sich
folgende N-terminale Sequenz:
N-IGFBP-3
Aminosäuren
GASSAGLGPVVRXEPXDARALAQ...
N-IGFBP-3
Aminosäuren
GASSAGLGPVVRXEPXDARALAQ...
Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an den
SwissProt und EMBL-Nukleinsäure Datenbanken durchgeführt. Die
Peptidsequenzen besitzt eine hohe Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten
Aminosäuren des humanen IGFBP-3.
Die Isolierung des IGF/IBP-2-13 erfolgte anhand seiner biologischen Aktivität,
nämlich des Bindungsvermögens für IGF-I. Dazu wurden jeweils Aliquots der
unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen
gefriergetrocknet und anschließend dem IGF-Bindungs-Assay zugeführt. Der
Assay mißt die spezifische Bindung bzw. die Verdrängung von radioaktiv
markiertem IGF-I an das N-IGFBP-3 bzw an Fraktionen, die N-IGFBP-3
enthalten. Die gebundene Radioaktivität wird in einem gamma-Counter
gemessen.
Der Bindungs-Assay wurde routinegemäß durchgeführt, wie in der Literatur
beschrieben (Mark, S. et al., 1999 J. Chrom. A 852, 197-205.). Parallel zum
Bindungs-Assay wurde mit Hilfe von spezifischen IGFBP-3 Antikörpern ein
Western-Immuno-blot durchgeführt, wie in der Literatur beschrieben
(Hossenlopp, P. et al. 1986, Anal. Biochem. 154, 138-143). In den Hämofiltrat
Fraktionen konnten so die verschiedenen immmunreaktiven Formen des N-
IGFBP-3 detektiert werden. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal
ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen.
Das N-IGFBP-3 besitzt in dosisabhängigerweise eine spezifische IGF-
Bindekapazität, sowohl für IGF-I als auch für IGF-II.
Claims (24)
1. Das Peptid N-IGFBP-3 mit nachfolgender Aminosäuresequenz:
sowie deren biologisch aktive Fragmente, Analoga und/oder Derivate, insbesondere Formen mit dem Austausch einzelner Aminosäuren sowie glykosylierte, amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide,
dabei stellt Z eine Anzahl von 0-5 Aminosäureresten dar,
und die Komplexe von N-IGFBP-3 mit hIGF-I (humaner Insulin-like growth factor -I) sowie dessen biologisch aktive Fragmente und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate, sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide,
und die Komplexe von N-IGFBP-3 mit hIGF-II (humaner Insulin-like growth factor -II) sowie deren biologisch aktive Fragmente und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate, sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide.
sowie deren biologisch aktive Fragmente, Analoga und/oder Derivate, insbesondere Formen mit dem Austausch einzelner Aminosäuren sowie glykosylierte, amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide,
dabei stellt Z eine Anzahl von 0-5 Aminosäureresten dar,
und die Komplexe von N-IGFBP-3 mit hIGF-I (humaner Insulin-like growth factor -I) sowie dessen biologisch aktive Fragmente und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate, sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide,
und die Komplexe von N-IGFBP-3 mit hIGF-II (humaner Insulin-like growth factor -II) sowie deren biologisch aktive Fragmente und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate, sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide.
2. Isoliertes Polynukleotide kodierend N-IGFBP-3 nach Anspruch 1 und/oder
dessen Fragmente, Derivate und Analoga.
3. Polynukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid
aus DNA aufgebaut ist.
4. Polynukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid
aus RNA aufgebaut ist.
5. Polynukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid
aus genomischer DNA aufgebaut ist.
6. Polynukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid
aus PNA aufgebaut ist.
7. Polynukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid
für die Peptide aus Anspruch 1 kodiert.
8. Ein Vektor enthaltend die DNA aus Anspruch 3.
9. Eine gentechnisch manipulierte Wirtszelle enthaltend den Vektor nach Anspruch 8.
10. DNA hybridisierend mit der DNA aus Anspruch 2, die für ein Polypeptid mit N-
IGFBP-3-Aktivität kodiert.
11. Antikörper gerichtet gegen die Polypeptide und Polypeptid-Komplexe aus
Anspruch 1.
12. Antagonist/Inhibitor gerichtet gegen die Polypeptide und Polypeptid-Komplexe
aus Anspruch 1.
13. Ein Behandlungsschema zur Behandlung von Patienten, die N-IGFBP-3 oder
deren Komplexe mit IGF-I oder mit IGF-II benötigen durch Gabe therapeutischer
Mengen der Polypeptide aus Anspruch 1.
14. Ein Behandlungsschema zur Behandlung von Patienten, die eine Inhibition des
N-IGFBP-3 oder derer Komplexe mit IGF-I oder mit IGF-II benötigen durch
Gabe therapeutischer Mengen eines Antagonisten/Inhibitors.
15. Eine galenische Formulierung bestehend aus Polypeptiden nach Anspruch 1 und
einem verträglichen Carrier.
16. Die Methode aus Anspruch 7, wobei eine therapeutische Wirkung des Polypeptids
durch die Gabe von DNA kodierend für das Polypeptid und seine Expression in
vivo beim Patienten erreicht wird.
17. Verfahren zur Herstellung von N-IGFBP-3 gemäß Anspruch 1 durch Extraktion
von Hämofiltrat durch Kationenaustauscher-Extraktion mit nachfolgender Elution
der adsorbierten Substanzen, eine erneute Kationenaustauscher-Chromatographie
des die Peptide enthaltenden Extraktes sowie mehrstufige Umkehrphasen-
Chromatographie.
18. Verfahren zur Herstellung von N-IGFBP-3 gemäß Anspruch 1 durch
Festphasensynthese im Sinne der Merrifield-Synthese sowie
Flüssigphasensynthese nach dem Fachmann bekannten Methoden mit geschützten
Aminosäuren und dessen Aufreinigung.
19. Verfahren zur Herstellung von N-IGFBP-3 gemäß Anspruch 1 durch dem
Fachmann bekannte Verfahren der heterologen Expression mittels gängiger
biotechnologischer Vektoren.
20. Diagnostikmittel der Stoffe nach Anspruch 1 enthaltend poly- oder monoklonale
Antikörper gegen N-IGFBP-3 oder deren Komplexe nach Anspruch 1 oder mit
der für N-IGFBP-3 kodierenden Nukleinsäure oder mRNA.
21. Diagnostikmittel enthaltend die Stoffe nach Anspruch 1 für Testsysteme zur
Kontrolle von Gewebe-, Plasma-, Urin- und Liquor cerebrospinalis-Spiegeln
dieser Substanz.
22. Diagnostikmittel enthaltend die Stoffe nach Anspruch 1 als Marker für
Funktionsstörungen des Knochens, der Muskeln, des Nervensystems, der
Lymphorgane, des Magen-Darmtraktes, des Immunsystems und von Diabetes
sowie inflammatorischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei
Krebs.
23. Arzneimittel enthaltend die Stoffe nach Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil
von galenischen Formen und in Verbindung mit einem geeigneten Carner zur
oralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, intrathekalen Anwendung
sowie als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.
24. Verwendung der Stoffe aus Anspruch 1 bis 12 sowie 17 bis 19 zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung bei Muskelschwund, Osteoporose,
Knochenbrüchen dabei insbesondere Brüchen der Hüfte, Diabetes dabei
insbesondere Diabetes Typ 1 und Diabetes Typ 2, amyloidaler lateraler Sklerose,
entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen peripheren und zentralen
Neuropathien, entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen,
Tumorerkrankungen, Erkrankungen des Herzens, zur Behandlung von schweren
Verbrennungen, zur Behandlung von Erkrankungen der Muskulatur und des
Knochenapparates, sowie zur Wund- und Knochenheilung.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1999151824 DE19951824A1 (de) | 1999-10-27 | 1999-10-27 | Humanes zirkulierendes Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3 Fragment und seine Verwendung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1999151824 DE19951824A1 (de) | 1999-10-27 | 1999-10-27 | Humanes zirkulierendes Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3 Fragment und seine Verwendung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19951824A1 true DE19951824A1 (de) | 2001-05-03 |
Family
ID=7927098
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1999151824 Withdrawn DE19951824A1 (de) | 1999-10-27 | 1999-10-27 | Humanes zirkulierendes Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3 Fragment und seine Verwendung |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19951824A1 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002024216A2 (en) * | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Bioexpertise, Llc | Method for use of igf-binding protein for selective sensitization of target cells in vivo |
WO2006069029A1 (en) * | 2004-12-24 | 2006-06-29 | Insmed, Inc. | Purified rhigf-i/rhigfbp-3 complexes and their method of manufacture |
-
1999
- 1999-10-27 DE DE1999151824 patent/DE19951824A1/de not_active Withdrawn
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002024216A2 (en) * | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Bioexpertise, Llc | Method for use of igf-binding protein for selective sensitization of target cells in vivo |
WO2002024216A3 (en) * | 2000-09-19 | 2004-07-15 | Bioexpertise Llc | Method for use of igf-binding protein for selective sensitization of target cells in vivo |
US7371813B2 (en) | 2000-09-19 | 2008-05-13 | Bioexpertise Llc | Method for use of IGF-binding protein for selective sensitization of target cells in vivo |
WO2006069029A1 (en) * | 2004-12-24 | 2006-06-29 | Insmed, Inc. | Purified rhigf-i/rhigfbp-3 complexes and their method of manufacture |
US7968679B2 (en) | 2004-12-24 | 2011-06-28 | Insmed Incorporated | Purified rhIGF-I/rhIGFBP-3 complexes and their method of manufacture |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE19757250A1 (de) | Insulin-like growth factor binding protein und seine Verwendung | |
DE69936315T2 (de) | Fragmente des wachstumsfaktors für bindegewebe (ctgf) und verfahren und anwendungen davon | |
EP1027440B1 (de) | Inhibitor-protein des wnt-signalwegs | |
DE69732572T2 (de) | Verwendung von glp-1 peptiden | |
DE3852086T2 (de) | Therapeutische Peptide. | |
DE69734157T2 (de) | Parathyroidhormon-verwandthe peptidanaloge | |
DE3346953C2 (de) | ||
DE102007030904A1 (de) | Humanes zirkulierendes antivirales Albumin-Fragment (ALB-408) und seine Verwendung | |
DE69028101T2 (de) | Melaninkonzentrierende hormone und dns die diese expremieren | |
EP0736095B1 (de) | Humanes zirkulierendes cytokin cc-1 | |
DE68921665T2 (de) | Hemmer vom flüssigen kalziumerhöhenden Faktor. | |
EP1299541B1 (de) | Verfahren zur gewinnung und anwendung neuer humaner defensine als biologisch aktive eiweisstoffe zur behandlung von infektionen und anderen erkrankungen | |
EP1228203B1 (de) | Humanes zirkulierendes virus inhibierendes peptid (virip) und seine verwendung | |
DE19951824A1 (de) | Humanes zirkulierendes Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3 Fragment und seine Verwendung | |
EP1023445B1 (de) | Cadherin derived growth factor und seine verwendung | |
DE4427531A1 (de) | Humanes zirkulierendes beta-Defensin hBD-1 | |
EP0896584A2 (de) | BIOLOGISCH AKTIVER EIWEISSSTOFF - KOLLAGENFRAGMENT HF-COLL-18/514cf - ZUR HEMMUNG DES WACHSTUMS VON TUMOREN UND VON GEFÄSSWUCHERUNGEN | |
DE4344397A1 (de) | Humanes zirkulierendes Cytokin CC-1 | |
DE19730786C2 (de) | Humanes zirkulierendes hNLP (humanes Neutrophilen-Lymphocyten-Peptid) | |
EP1056857A2 (de) | Transporterprotein für saccharid-gekoppelte arzneimittel | |
DE4427395A1 (de) | Humanes zirkulierendes Cytokin CC-1 | |
DE19919148A1 (de) | Von Interleukin 12 abgeleitete Peptid-Homodimere und Peptid-Heterodimere | |
DE4445630A1 (de) | Humane zirkulierende Peptidfragmente 20-92 und 23-74 des Precursor des Osteoinduktiven Faktors kurz: OIF-20-92 und OIF 23-74 | |
DE19906921A1 (de) | Neuronal-cell-survival-factor (NCSF) und seine Verwendung | |
DE19953732A1 (de) | Humanes zirkulierendes Virus inhibierendes Peptid (VIRIP) und seine Verwendung |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8130 | Withdrawal |