EP1056857A2 - Transporterprotein für saccharid-gekoppelte arzneimittel - Google Patents

Transporterprotein für saccharid-gekoppelte arzneimittel

Info

Publication number
EP1056857A2
EP1056857A2 EP99915493A EP99915493A EP1056857A2 EP 1056857 A2 EP1056857 A2 EP 1056857A2 EP 99915493 A EP99915493 A EP 99915493A EP 99915493 A EP99915493 A EP 99915493A EP 1056857 A2 EP1056857 A2 EP 1056857A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
cells
transporter
saccharide
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99915493A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hermann Julius-Maximilians-Universitàt KOEPSELL
Manfred Wiessler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Publication of EP1056857A2 publication Critical patent/EP1056857A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs

Definitions

  • the present invention relates to a transporter for saccharide-coupled drugs in cells.
  • the invention further relates to a nucleic acid coding for the transporter, antibodies directed against the transporter and means for detecting the transporter in (tumor) cells and means for introducing the transporter into cells.
  • saccharide-coupled cytostatics have advantages for tumor chemotherapy. These are more water-soluble and often more effective than uncoupled ones because they have a more specific effect and fewer side effects. In contrast to conventional cytostatics, saccharide-coupled cytostatics cannot pass through cell membranes because of their water solubility. You need transport proteins or channels to enter cells. Saccharide Coupled cytostatics are described, for example, in European Patent EP-B-0 369 1 82.
  • the object of the present invention is to provide a possibility with which diseased cells, in particular tumor cells, can be identified, which are accessible for saccharide-coupled drugs, in particular cytostatics.
  • Another object of the present invention is to provide cells with a transporter so that they are able to transport saccharide-coupled drugs, in particular cytostatics.
  • saccharide-coupled drugs are to be understood to mean all drugs which are linked to a saccharide, preferably ⁇ -glycosidic with D-glucose or D-galactose.
  • this should be understood to mean saccharide-coupled cytotatic agents which are suitable for chemotherapy of tumors and which are linked to a saccharide, preferably ⁇ -glycosidically with glucose or galactose.
  • ⁇ -D-glycosylisophosphoramide mustard (D-1 9575) is very preferably to be understood by this.
  • This compound has the following formula:
  • the invention makes it possible to identify tissues and organs in which saccharide-coupled drugs can be taken up via a transporter.
  • the invention also enables side effects to be predicted in the treatment with saccharide-coupled drugs, in particular cytostatics. Side effects are possible in all organs that contain the transporter. Protective measures can be carried out for these organs.
  • the present invention relates to a nucleic acid which codes for a protein with the biological activity of a transporter for saccharide-coupled drugs.
  • This nucleic acid can be an RNA or a DNA.
  • the latter can e.g. be a genomic DNA or a cDNA.
  • this is a nucleic acid, preferably a DNA, which comprises the following:
  • nucleic acid molecules defined under (a) and (c) comprise nucleic acid molecules which differ from the sequence given in FIG. 1 by deletion (s), insertion (s), exchange (s) or other modifications known in the prior art differentiate.
  • nucleic acid fragment is intended to include a section or segment of the original nucleic acid molecule, the protein encoded by this nucleic acid fragment still having transporter activity. This also includes allele variants.
  • hybridizing DNA indicates a DNA which hybridizes with a DNA of (a) under customary conditions, in particular at 20 ° C. below the melting point of the DNA.
  • hybridize refers to conventional hybridization conditions, preferably to hybridization conditions in which ⁇ xSSPE, 1% SDS, I xDenhardts solution is used and the hybridization temperatures between 35 ° C. and 70 ° C., preferably at 65 ° C.
  • washing is preferably carried out first with 2xSSC, 1% SDS and then with 0.2xSSC at temperatures between 35 ° C and 70 ° C, preferably at 65 ° C (for the definition of SSPE, SSC and Denhardts solution see Sambrook et al ., supra).
  • Stringent hybridization conditions as described for example in Sambrook et al., Supra, are particularly preferred.
  • the nuclein according to the invention originates from acid molecule from a mammal, preferably from a human. Screening methods based on nucleic acid hybridization allow the nucleic acid molecules according to the invention to be isolated from any organism or derived cDNA libraries, using probes which contain the nucleic acid sequence shown in FIG. 1 or a part thereof.
  • the nucleic acids according to the invention can also be inserted into a vector or expression vector.
  • the present invention also encompasses vectors containing these nucleic acid molecules. Examples of such are known to the person skilled in the art.
  • vectors containing these nucleic acid molecules are known to the person skilled in the art.
  • these are e.g. pGEMEX, pUC derivatives, pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b and pQE-8.
  • yeast e.g. to call pY1 00 and Ycpad l
  • animal cells e.g. pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 must be specified.
  • the baculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable for expression in insect cells.
  • the nucleic acid molecule according to the invention is functionally linked in the vector to regulatory elements which allow its expression in prokaryotic or eukaryotic host cells.
  • regulatory elements for example a promoter
  • such vectors typically contain an origin of replication and specific genes which allow the phenotypic selection of a transformed host cell.
  • the regulatory elements for expression in prokaryotes for example E.
  • coli include the lac, trp promoter or T7 promoter, and for expression in eukaryotes the AOX1 or GAL1 promoter in yeast, and the CMV , SV40, RVS-40 promoter, CMV or SV40 enhancer for expression in animal cells.
  • suitable promoters are the metallothionein I and the polyhedrin promoter.
  • the vector containing the nucleic acid molecules according to the invention is a virus, for example an adenovirus or vaccinia virus, which is useful in gene therapy.
  • Retroviruses are particularly preferred. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV.
  • suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV.
  • appropriate nucleic acid molecules can also be transported to the target cells in the form of colloidal dispersions. These include, for example, lipososms or lipoplexes (Mannino et al., Biotechniques 6 (1 988), 682).
  • transporter By introducing the transporter into cells that do not otherwise have this gene therapy, these are made susceptible to saccharide-coupled drugs and can be treated efficiently in drug therapy. In the case of tumor cells, treatment is carried out with saccharide-coupled cytostatics, which are efficiently destroyed as part of chemotherapy.
  • the present invention also relates to host cells containing the vectors described above.
  • host cells include bacteria, yeast, insect and animal cells, preferably mammalian cells.
  • the E. coli strains HB101, DH1, x1 776, JM 101, JM 109, BL21 and SG 1 3009, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa are preferred as well as the insect cells sf9.
  • Methods of transforming these host cells, of phenotypically selecting transformants and Expres ⁇ sion of the nucleic acid molecules according to the invention using the above described vectors are known in the art.
  • the inventors a preferred human transporter for Sac ⁇ CharID coupled with drug SAAT1 was called, and a clone of a contains partial cDNA sequence of SAAT1 from the human cerebral cortex, was on 1 1. February 1 998 deposited with the DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 381 24 Braunschweig, under the deposit number DSM 1 1 991.
  • the present invention also relates to a method for producing a protein with the biological activity of a transporter for saccharide-coupled drugs, comprising culturing the host cells described above under conditions which allow expression of the protein (preferably stable expression), and obtaining the protein from the culture.
  • a transporter for saccharide-coupled drugs comprising culturing the host cells described above under conditions which allow expression of the protein (preferably stable expression), and obtaining the protein from the culture.
  • the person skilled in the art knows conditions for culturing transformed or transfected cells. Suitable methods for the recombinant production of the protein are generally known (see for example Holmgren, Annu.Rev.Biochem. 54 (1 985), 237, LaVallie et al., Bio / Technology 1 1 (1 993), 1 87, Wong, Curr Opin. B-iotech. 6 (1,995), 51 7, Romanos, Curr.Opin. Biotech.
  • the present invention relates to a protein encoded by the nucleic acid molecule according to the invention or obtained by the above method with activity for the transport of saccharide-coupled drugs.
  • a protein is shown in FIG. 2 and FIG. 2A.
  • the Invention ⁇ proper protein according to conventional methods may be modified, wherein the protein may also be present as a fusion protein .. These modifications include substitutions, insertions or deletions of amino acids that modify the structure of the protein, wherein its biological activity is essentially preserved.
  • the exchanges include, for example, "conservative" exchanges of amino acid residues, ie exchanges for biologically similar residues, e.g. the substitution of a hydrophobic residue (e.g.
  • a polar residue e.g. arginine for lysine, glutamic acid for Aspartic acid etc.
  • Deletions can lead to the generation of molecules which are significantly smaller in size, ie which lack amino acids at the N or C terminus, for example.
  • the antibodies can be monoclonal, polyclonal or synthetic antibodies or fragments thereof, for example Fab, Fv or scFv fragments. It is preferably a monoclonal antibody.
  • the polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals.
  • the antibodies according to the invention can be produced according to standard methods, the protein encoded by the nucleic acid molecules according to the invention or a synthetic fragment thereof serving as an immunogen.
  • Monoclonal antibodies can be produced, for example, by the method described by Köhler and Milstein (Nature 256 (1 975), 495) and Galfre, Meth. Enzymol.73 (1 981), 3, whereby mouse myeloma cells with spleen cells derived from immunized mammals be merged. These antibodies can be used, for example, for immunoprecipitation of the proteins with transporter activity discussed above or for the isolation of related proteins from cDNA expression banks.
  • the antibodies can be bound, for example, in liquid phase immunoassays or to a solid support.
  • the antibodies can be labeled in different ways. Suitable markers and labeling methods are known in the art. Examples of immunoassays are ELISA and RIA.
  • the present invention further relates to the use of the nucleic acids, vectors, proteins and / or antibodies described above as medicaments. These drugs may also contain a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carriers and the formulation of such medicaments are known to the person skilled in the art. Suitable carriers include, for example, phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions, etc. The medicaments can be administered orally or parenterally.
  • Methods for parenteral administration include topical, intra-arterial (eg, directly to the tumor), intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, or intranasal administration.
  • the appropriate dosage is determined by the attending physician and depends on various factors, for example the age, gender, weight of the patient, the stage of a disease (for example a tumor), the type of administration, etc.
  • the drug can be used in gene therapy, and the methods or vectors described above can be used to introduce the nucleic acids according to the invention.
  • the protein encoded by the nucleic acid molecules according to the invention can be administered directly, so as to induce transporter activity in cells which do not have functional copies of the genes coding for the transporter.
  • the medicinal product is preferably used when the methods described below provide evidence that biologically active transporters are not formed or are produced in too small amounts in the patient's tissue concerned.
  • the subject matter of the present invention is also suitable for a method for detecting the expression of a transporter encoded by the above nucleic acid molecule by determining the presence of the mRNA encoding this transporter, the method comprising: (a) obtaining mRNA from tissue,
  • This method is particularly suitable for detection in tumor tissue.
  • Suitable methods for carrying out this method are known to the person skilled in the art and the person skilled in the art can also use suitable methods for extracting suitable samples, for carrying out suitable extraction methods and hybridization methods and for detecting specific mRNAs according to the methods described in the examples given below.
  • RNA is isolated from suitable cells and subjected to a reverse transcriptase-polymerase chain reaction.
  • the person skilled in the art is familiar with carrying out an RT-PCR and there are now also kits available for this purpose.
  • 5'-GGA CTT CCC CAG TAA TGT-3 '(forward) and 5'-CTT CTC GGT AAA GCT CTC-3' (reverse) can be used as primers for human SAAT1 and in the form of a kit together with the other conventional ones Reagents for RT-PCR are provided.
  • PCR products are then separated, for example on a 1% agarose gel, blotted and hybridized at 48 ° C. to the 32 P-labeled internal oligonucleotides 5'-CAT CTG TGT GGT TTT GTT (forward).
  • a transporter encoded by the nucleic acid molecules according to the invention can also be detected at the protein level. This procedure includes the steps: (a) obtaining a sample from tissue,
  • This detection can also be performed using standard techniques known to those skilled in the art. These are also known cell disruption methods which allow the isolation of the protein in such a way that it can be brought into contact with the antibody.
  • the detection of the bound antibody is preferably carried out by immunassays, for example ELISA or RIA.
  • a sample of (tumor) tissue or (tumor) cells is understood to mean, for example, a biopsy (e.g. fine needle or punch biopsy), serum sample (preferably in the case of blood cell tumors), CSF sample or surgical material.
  • the objects of the present invention are furthermore suitable for identifying tumors and metastases which express this SAAT1 transporter.
  • This can be done by administering a saccharide-coupled cytostatic agent, for example radioactively labeled with iodine 125 , to the patient and then scanning the distribution of the reactivity in the patient's body with the aid of a scintigraphy.
  • the second method is NMR with 19 F-labeled cytostatics.
  • the objects of the present invention are also suitable for developing new saccharide-coupled drugs, in particular cytostatics, which are taken up into cells via the SAAT1 transporter.
  • the SAAT1 transporter must be expressed in oocytes of the clawed frog Xenopus laevis or in other expression systems and the uptake of new ones Saccharide-coupled drugs are measured (see FIG. 3).
  • Fig. 3 Evidence that [ 1 C] -ß-D-Glc-IPM is only transported by SAAT1 and no other subtype of the SGLT family.
  • Fig. 4 Evidence that a saccharide-coupled drug (ß-D-
  • RNAs and a control without RNA were treated with DNase (2U DNase / ⁇ g RNA) for 10 min at 37 ° C. in order to remove residues of genomic DNA. They were then subjected to a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the RT-PCR was subjected to the Titan ⁇ ⁇ M One Tube RT-PCR system (Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's information. 1 ⁇ RNA was used in each case and the primers used were 5'-GGA CTT CCC CAG TAA TGT-3 '(forward) and 5'-CTT CTC GGT AAA GCT CTC-3' (reverse).
  • PCR products and a size marker were separated on a 1% agarose gel. Part of the gel was stained with ethidium bromide (Fig. 6, upper column). The other part of the gel was blotted and hybridized at 48 ° C. to the 32 P-labeled oligonucleotide 5'-CAT CTG TGT GGT TTT GTT-3 '(forward). The membrane was washed at 48 ° C. with 6xSSC containing 0.05% (w / v) sodium pyrophosphate and a film was placed for autoradiography.
  • Genomic DNA was used as the control experiment, with which any cDNA amplification was excluded from genomic DNA.
  • the human SAAT1 fragment is in carcinomas of the kidney, intestine and ovaries, in colon cancer cells T84 and in two renal carcinoma cell lines detectable.
  • RNA "master blot" (Clontech Laboratories, Palo Alto, California, USA; catalog no. 7770), on which mRNA samples from many human tissues are applied, was carried out according to the manufacturer's instructions (protocol no. PT3004- 1) hybridized with a radioactively labeled cDNA fragment of human SAAT1 (see FIG. 1, nucleotides 1 730-2032) and washed. The result is shown in FIG. 5. It can be seen there that small amounts of SAAT1 are transcribed in many organs. SAAT1 is most pronounced in the skeletal muscles (Fig. 5 A3), in the prostate (Fig. 5 A7), in the small intestine (Fig. 5 C3), in the lungs (Fig. 5 D2) and in the fetal liver (Fig. 5 E4) transcribed.
  • SGLT1 type of a saccharide transporter from rabbits
  • Hu 14 type of another saccharide transporter from humans
  • SMIT type of another Saccharide transporters from dogs
  • SAAT1 pigs
  • the expression of the respective transporter was measured by measuring the phlorizin-inhibitable uptake after 30 minutes of incubation with 50 ⁇ M [ 14 C] AMG (SGLT1, SAAT1), 1, 25 mM [ 1 C] AMG (Hu14) and 1 ⁇ M [ 3 H] myo-inositol measured.
  • the phioricin concentrations used were 100 ⁇ M (SGLT1 from rabbits), 200 ⁇ M (SGLT1 from humans, Hu 1 4, SAAT1) or 500 ⁇ M (SMIT).
  • the expressed phlorizin-inhibitable accrura ⁇ te of AMG and myo-inositol were 274 ⁇ 22 (AMG, SGLT1, rabbits), 48 ⁇ 5 (AMG, SGLT1, human), 25 ⁇ 1 (AMG, Hu 1 4), 6.5 ⁇ 0.7 (myo-inositol, SMIT) or 1 8 ⁇ 2 (AMG, SAAT1) pmol x oocyte ' 1 xh 1 .
  • the same batches of injected oocytes were tested for the phlorizin-inhibitable uptake of 1 00 ⁇ M [ 14 C] -ß-D-Glc-IPM.
  • Methyl gentisate is an antioxidant which can be used, for example, in Parkinson's disease.
  • the structural formula of ß-D-glycosylgenetic acid methyl ester (ß-D-Glc-GME) is shown in the upper part of FIG. 4. 50 nl water with or without 10 ng cRNA from SAAT1 (pig) or SGLT1 (human) was injected into Xenopus laevis oocytes. After 3 days of incubation, the transport of ß-D-glycosylgentisic acid methyl ester mediated by SAAT1 was measured electrically.
  • the SAAT1 transporter is a so-called Na + cotransporter, which always transports its substrates, that is to say AMG or methyl ⁇ -D-glycosylgentisate, together with sodium ions.
  • AMG or methyl ⁇ -D-glycosylgentisate both with sodium ions.
  • either 1 mM AMG or 1 mM ⁇ -D-Glc-GME was passed over the oocytes and the sodium current directed into the oocytes was measured.
  • the voltage across the membrane to -50 mV "ge ⁇ clamped" (SOF was Busch. Voltage-clamp method, s. Et al., J. of Biologicial chemi- stry, Vol. 271, No. 51, pp 32599 -32604, 1,996).
  • oocytes injected with water showed no current after overflow with AMG or ⁇ -D-GIc-GME
  • ß-D-GIc-GME induced a current in the oocytes that expressed SAAT1.
  • AMG was able to induce currents measured both in the SGLT1 expressing ⁇ and in the SAAT1 expressing oocytes. The result is shown in Fig. 4, ie that the saccharide-coupled therapeutically active substance ⁇ -D-Glc-GME from SAAT1, but not from SGLT1 is transported.
  • Example 5 [ 14 C] -ß-D-Glc IPM uptake in human. Carcinoma cells
  • T84 cells (ECACC No. 88021 101), which were obtained from EACC (Salisbury, GB), were added at 37 ° C. in a 1: 1 mixture of Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's T1 2 medium (from Sigma) 5% CO 2 cultivated on Greiner commercial culture dishes. The mixture further contained 10% fetal bovine serum, 4 mM L-glutamine, 10 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin. After the cells had been confluent, they were incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • PBS Mg 2 + - Ca 2 + -free phosphate-buffered saline
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the suspended cells were incubated for 30 seconds with PBS containing various concentrations of D- [ 14 C] ß-D-Glc-IPM.
  • the incubations were stopped with ice-cold PBS containing 1 mM phlorizin (known as an inhibitor for glucose transporters).
  • the cells were washed twice with this stop solution, solubilized with 4M guanidine thiocyanate and examined for radioactivity.
  • the rabbit's serum was tested in the immunoblot.
  • a fusion protein according to the invention was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 1 0, (1 984), 203-209).
  • Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1 994), 21 5-229.
  • the nitrocellulose filter was incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody was rabbit serum (1: 10000 in PBS).
  • the nitrocellulose filter was incubated with a second antibody.
  • This antibody was a goat anti-rabbit IgG (Dianova) monoclonal antibody coupled to alkaline phosphatase (1: 5000) in PBS. After 30 minutes of incubation at 37 ° C, several washing steps with PBS followed and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 1 00mM Tris-HCl, pH 9.5 , 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ) at room temperature until bands were visible.
  • developer solution 36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 1 00mM Tris-HCl, pH 9.5 , 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2
  • Antibodies were extracted from egg yolk and tested in a Western blot. Polyclonal antibodies according to the invention have been detected.
  • microorganism referred to under I was received by this international depository on (date of first filing) and an application for conversion of this first deposit into a deposit under the Budapest Treaty was received on (date of receipt of the request for conversion)
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Abstract

Beschrieben wird ein Nukleinsäuremolekül aus einer Zuckertransporterfamilie, wobei die Nukleinsäure für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines Transporters für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel kodiert. Ferner werden diese Nukleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren beschrieben, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform diese Vektoren zur Expression des Transporters in Prokaryonten oder Eukaryonten sowie zur Gentherapie geeignet sind. Ausserdem werden davon codierte Proteine und Antikörper beansprucht, welche diese Proteine spezifisch erkennen. Mit diesen erfindungsgemässen Gegenständen können Zellen, vorzugsweise Tumorzellen, auf das Vorhandensein eines solchen Transporters untersucht werden. Bei Fehlen des beschriebenen Transporters in Zellen kann dieser auf gentherapeutischem Weg eingebracht werden. Tumorzellen können auf diesem Weg wirkungsvoller als bisher möglich einer Chemotherapie zugänglich gemacht werden.

Description

Transporter für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Transporter für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel in Zellen. Weiter betrifft die Erfindung eine für den Transporter kodierende Nukleinsäure, gegen den Transporter gerichtete Antikörper und Mittel zum Nachweis des Transporters in (Tumor)zellen sowie Mittel zum Einbringen des Transporters in Zellen.
Allgemein stellt eine schlechte zelluläre Aufnahme von Arzneimitteln häufig eine Begrenzung von Therapien dar. So gelangen viele Therapeutika nicht in die Zellen, weil sie wasserlöslich sind und die Zellmembran nicht durchdringen können oder sie gelangen in alle Zellen, wenn sie lipidlöslich sind. Bei Tumorerkrankungen unterschiedlichster Art, wo die Chemotherapie mit Zytostatika eine wichtige Säule der Therapie darstellt, ist die Auswahl der Zytostatika ein besonderes Problem. Hier muß der behandelnde Arzt die wichtige Entscheidung treffen, welches Zytostatikum aus der Vielzahl möglicher Zytostatika eingesetzt werden soll. Diese Entscheidung muß allerdings oft rividiert werden, da nach einiger Behandlungszeit festgestellt wird, daß das Zytostatikum nicht die gewünschte Wirkung entfaltet. Dies kann beispielsweise daran liegen, daß keine nennenswerte Aufnahme der Wirksubstanz im Tumor stattgefunden hat und das Zytostatikum schnell wieder ausgeschieden wird. In einem solchen Fall ist kostbare Behandlungszeit verloren gegangen und die Tumorerkrankung häufig weiter fortgeschritten. Man hat nun vor einiger Zeit herausgefunden, daß Saccharid-gekoppelte Zytostatika Vorteile für die Tumor-Chemotherapie bringen. Diese sind besser wasserlöslich und häufig wirkungsvoller als ungekoppelte, da sie spezifischer wirken und weniger Nebenwirkungen haben. Saccharid-gekoppelte Zytostatika können im Gegensatz zu den herkömmlichen Zytostatika wegen ihrer Wasserlöslichkeit nicht passiv durch Zellmembranen gelangen. Sie benötigen für den Eintritt in Zellen Transportproteine oder Kanäle. Saccharid- gekoppelte Zytostatika sind beispielsweise im europäischen Patent EP-B-0 369 1 82 beschrieben. Man wußte aber bisher nicht, über welche Transportmechanismen diese Zytostatika in die Tumorzellen gelangen und hatte deshalb keine Möglichkeit, die zelluläre Aufnahme der Saccharid-gekoppelten Zytostatika zu modulieren und vorauszusagen. Was vorstehend für Zytostatika zum Eintritt in Tumorzellen beschrieben worden ist, gilt sinngemäß auch für andere Arzneimittel, die in erkranktes Normalgewebe oder erkrankte Normalzellen gelangen müssen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt nun darin, eine Möglichkeit bereitzustellen, mit dem erkrankte Zellen, insbesondere Tumorzellen, identifiziert werden können, die für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel, insbesondere Zytostatika, zugänglich sind. Weiter besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, Zellen mit einem Transporter auszustatten, damit diese befähigt werden, Saccharid-gekoppelte Arzneimittel, insbesondere Zytostatika, zu transportieren.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die in den Patentansprüchen definierten Gegenstände.
Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß bestimmte menschliche Zellen einen Transporter aufweisen, mit dem Saccharid-gekoppelte Arzneimittel, insbesondere Zytostatika, leicht in die Zelle transportiert werden können. Bei diesem Transporter handelt es sich um eine Subtype von natriumabhängigen Zuckertransportern der sog. SGLT-Familie, die als SAAT1 bezeichnet wird. Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß diese Transportersubtypen im Gegen¬ satz zu den anderen Subtypen dieser Familie in der Lage ist, Saccharid-gekoppel¬ te Arzneimittel zu transportieren. Unter Saccharid-gekoppelten Arzneimitteln sollen erfindungsgemäß alle Medikamente verstanden werden, die mit einem Saccharid verbunden sind, vorzugsweise ß-glykosidisch mit D-Glucose oder D- Galactose. Insbesondere sollen darunter Saccharid-gekoppelte Zytotstatika verstanden werden, die sich für eine Chemotherapie von Tumoren eignen und mit einem Saccharid verbunden ist, vorzugsweise ß-glykosidisch mit Glucose oder Galactose verbunden ist. Ganz bevorzugt ist darunter ß-D-Glycosyliso- phosphoramid-Mustard (D-1 9575) zu verstehen. Diese Verbindung hat die folgende Formel:
Außerdem sind weitere bevorzugte Saccharid-gekoppelte Zytostatika in EP-B-0 369 1 82 zu finden.
Die Erfindung ermöglicht, Gewebe und Organe zu identifizieren, bei denen Saccharid-gekoppelte Arzneimittel über einen Transporter aufgenommen werden können. Die Erfindung ermöglicht auch eine Voraussage von Nebenwirkungen bei der Behandlung mit Saccharid-gekoppelten Arzneimitteln, insbesondere Zytostatika. Nebenwirkungen sind nämlich in allen Organen möglich, die den Transporter enthalten. Für diese Organe können schützende Maßnahmen durchgeführt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäure, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines Transporters für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel kodiert. Diese Nucleinsäure kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z.B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Erfindungsgemäß ist dies eine Nucleinsäure, bevorzugt eine DNA, die folgendes umfaßt:
(a) die Nucleinsäure von Fig. 1 bzw. Fig. 1 A, oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA bzw. ein Fragment davon,
(b) eine mit der Nukleinsäure von (a) hybridisierende DNA, oder
(c) eine mit der Nukleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA. Die unter (a) und (c) definierten Nucleinsäuremoleküle umfassen Nucleinsäure- moleküle, die sich gegenüber der in Figur 1 angegebenen Sequenz durch Dele- tion(en), lnsertion(en), Austausch(e) oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden. Der Begriff "Nucleinsäurefragment" soll einen Ausschnitt bzw. Segment des ursprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch dieses Nucleinsäurefragment codierte Protein noch Transporteraktivität aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY ( 1 989) . Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäuresequenz codiertes Protein noch über die biologische Aktivität eines Transporters verfügt. Dies geschieht beispielsweise dadurch, daß das Protein in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis exprimiert und die Eier danach bezüglich ihrer Transportaktivität untersucht werden (Busch et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 271 , No. 51 , S. 32599-32604, 1 996).
Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert. Der Begriff "hybridisieren" bezieht sich dabei auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungs- bedingungen, bei denen als Lösung δxSSPE, 1 % SDS, I xDenhardts-Lösung verwendet wird und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2xSSC, 1 % SDS und danach mit 0,2xSSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE,SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al.,supra) . Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt das erfindungsgemäße Nuclein- säuremolekül von einem Säuger, vorzugsweise von einem Menschen. Auf Nucleinsäurehybridisierung basierende Screening-Verfahren erlauben die Isolierung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle aus jedem Organismus bzw. abgeleiteten cDNA-Banken, wobei Sonden verwendet werden, die die in Figur 1 angebene Nucleinsäuresequenz oder einen Teil davon enthalten.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese Nucleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z.B. pY1 00 und Ycpad l zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculo- virus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktioneil verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-,trp-Promo- tor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOX1 - oder GAL1 -Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthaltene Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus oder Vaccinia-Virus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungs- gemäßen Nucleinsäuremoleküle auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 ( 1 988), 682) . Durch das gentherapeutische Einbringen des Transporters in Zellen, die diesen sonst nicht aufweisen, werden diese für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel empfänglich gemacht und können in einer medikamentösen Therapie effizient behandelt werden. Im Falle von Tumorzellen erfolgt die Behandlung mit Saccharid-gekoppelten Zytostatika, die im Rahmen einer Chemotherapie effizient vernichtet werden.
Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Der Fachmann weiß somit, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugt sind die E.coli-Stämme HB101 , DH1 , x1 776, JM 101 , JM 109, BL21 und SG 1 3009, der Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expres¬ sion der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Von den Erfindern wurde ein bevorzugter menschlicher Transporter für Sac¬ charid-gekoppelte Arzneimittel mit SAAT1 bezeichnet, und ein Clon, der eine cDNA-Teilsequenz von SAAT1 aus der Großhirnrinde des Menschen enthält, wurde am 1 1 . Februar 1 998 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 381 24 Braunschweig, unter der Hinterlegungsnummer DSM 1 1 991 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität eines Transporters für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel, umfassend die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und Gewinnung des Proteins aus der Kultur. Der Fachmann kennt dabei Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu.Rev.Biochem. 54 ( 1 985), 237, LaVallie et al., Bio/Technology 1 1 ( 1 993), 1 87, Wong, Curr. Opin. B- iotech.6 (1 995), 51 7, Romanos, Curr.Opin. Biotech.6 ( 1 995), 527, Williams et al., Curr. Opin. Biotech.6 ( 1 995), 538, und Davies, Curr. Opin. Biotech.6 ( 1 995), 543. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße Nucleinsäure exprimierte Protein zu isolieren und zu reinigen. Auch geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen von dem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül codiertes oder nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenes Protein mit Aktivität für den Transport von Saccharid-gekoppelten Arzneimittel. Ein solches Protein ist in Fig. 2 bzw. Fig. 2A gezeigt. In diesem Zusammenhang soll erwähnt werden, daß das erfindungs¬ gemäße Protein gemäß üblicher Verfahren modifiziert sein kann, wobei das Protein auch als Fusionsprotein vorliegen kann.. Zu diesen Modifikationen zählen Austausche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, die die Struktur des Proteins modifizieren, wobei seine biologische Aktivität im Wesentlichen erhalten bleibt. Zu den Austauschen zählen z.B. "konservative" Austausche von Amino- säureresten, d.h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z.B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z.B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z.B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc.). Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d.h., denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Die Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon, beispielsweise Fab-, Fv-oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen monoclonalen Antikörper. Für die Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklo- nale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekü- len codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Monoclonale Antikörper können beispielsweise durch das von Köhler und Milstein (Nature 256 (1 975), 495) und Galfre, Meth. Enzymol.73 ( 1 981 ), 3, beschriebene Verfahren hergestellt werden, wobei Maus-Myelomzellen mit von immunisierten Säugern stammenden Milzzellen fusioniert werden. Diese Antikörper können beispielsweise zur Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine mit Transporteraktivität oder zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunassays sind ELISA und RIA. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren, Vektoren, Proteine und/oder Antikörper als Arzneimittel. Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle (z.B. direkt zu dem Tumor), intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium einer Erkrankung (z.B. eines Tumors), der Art der Verabreichung etc. ab.
Dabei kann das Arzneimittel in der Gentherapie Verwendung finden, wobei die vorstehend beschriebenen Verfahren bzw. Vektoren zur Einschleusung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren Anwendung finden können. Andererseits kann das von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codierte Protein direkt verabreicht werden, um so in Zellen, die keine funktionalen Kopien der für den Transporter codierenden Gene besitzen, Transporteraktivität herzusteilen. Das Arzneimittel kommt bevorzugt dann zur Anwendung, wenn die nachstehend beschriebenen Verfahren den Nachweis darüber liefern, daß in dem betreffenden Gewebe eines Patienten biologisch aktive Transporter nicht oder in zu geringen Mengen gebildet werden.
Außerdem eignen sich die Gegenstände die vorliegende Erfindung für ein Verfahren zum Nachweis der Expression eines von dem vorstehenden Nucleinsäure- molekül codierten Transporters durch Bestimmung der Anwesenheit der diesen Transporter codierenden mRNA, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Gewinnung von mRNA aus Gewebe,
(b) Inkontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit dem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül als Sonde unter Hybridisierungsbedingungen, und
(c) Nachweis der Anwesenheit der mit der Sonde hybridisierten mRNA, wodurch die Expression des Transporters in Gewebe nachgewiesen wird.
Dieses Verfahren eignet sich insbesondere für den Nachweis in Tumorgewebe.
Geeignete Methoden zur Durchführung dieses Verfahrens sind dem Fachmann bekannt und dieser kann auch zur Gewinnung geeigneter Proben, zur Durchführung geeigneter Extraktionsverfahren und Hybridisierungsverfahren und zum Nachweis spezifischer mRNAs nach den in den nachstehend angegebenen Beispielen genau beschriebenen Verfahren vorgehen.
Der vorstehende Nachweis kann auch über PCR durchgeführt werden. Dabei werden Primer verwendet, die die den Transporter codierende Sequenz flankieren. Insbesondere eignet sich eine RT-PCR. Dafür wird aus geeigneten Zellen RNA isoliert und einer reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion unterworfen. Die Durchführung einer RT-PCR ist dem Fachmann geläufig und es gibt inzwischen auch käuflich erhältliche Kits dafür. Als Primer für menschliches SAAT1 können beispielsweise 5'-GGA CTT CCC CAG TAA TGT-3' (forward) und 5'-CTT CTC GGT AAA GCT CTC-3' (reverse) verwendet werden und in Form eines Kits zusammen mit den anderen üblichen Reagenzien für RT-PCR zur Verfügung gestellt werden. Die PCR-Produkte werden dann beispielsweise auf einem 1 % Agarosegel aufgetrennt, geblottet und bei 48°C an die 32P-markierten internen Oligonukleotide 5'-CAT CTG TGT GGT TTT GTT (forward) hybridisiert.
Ein von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codierter Transporter kann auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte: (a) Gewinnen einer Probe aus Gewebe,
(b) Inkontaktbringen der so erhaltenen Probe mit dem vorstehend beschriebenen Antikörper als Sonde unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an den Transporter erlauben, und
(c) Nachweis des gebundenen Antikörpers, wodurch die Expression des Transporters in der Zelle nachgewiesen wird.
Dieser Nachweis kann ebenfalls unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschlußverfahren bekannt, die die Isolierung des Proteins auf eine solche Weise erlauben, daß dieses mit dem Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt vorzugsweise über Immunassays, beispielsweise ELISA oder RIA.
Bei den obigen Verfahren ist unter einer Probe aus (Tumor)gewebe bzw. unter (Tumor)zellen beispielsweise eine Biopsie (z.B. Feinnadel- oder Stanzbiopsie), Serumprobe (vorzugsweise bei Blutzelltumoren), Liquorprobe oder Operationsmaterial zu verstehen.
Desweiteren eignen sich die Gegenstände der vorliegenden Erfindung dazu, Tumore und Metastasen, welche diesen SAAT1 -Transporter exprimieren zu identifizieren. Dies kann geschehen, indem man dem Patienten ein z.B. mit Jod125 radioaktiv markiertes Saccharid-gekoppeltesZytostatikum verabreichtund dann die Verteilung der Reaktivität im Körper des Patienten mit Hilfe einer Szintigraphie abtastet. Als zweite Methode kommt NMR mit 19F-markierten Zytostatika in Frage.
Die Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind außerdem geeignet, um neue Saccharid-gekoppelte Arzneimittel, insbesondere Zytostatika, zu entwickeln, die über den SAAT1 -Transporter in Zellen aufgenommen werden. Dazu muß der SAAT1 -Transporter in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis oder in anderen Expressionssystemen exprimiert werden und die Aufnahme neuer Saccharid-gekoppelter Arzneimittel gemessen werden (vgl. Fig. 3) .
Die Erfindung wird anhand der Figuren weiter beschrieben, welche zeigen:
Fig. 1 : Nukleinsäuresequenz des SAAT1 -Transporters des Menschen (aus Großhirnrinde)
Fig. 1 a: Nukleinsäureteilsequenz des SAAT1 -Transportes des Menschen (Ausschnitt aus Fig. 1 von Nukleotid 251 bis Nukleotid 741 )
Fig. 2: Aminosäuresequenz des SAAT1 -Transporters des Menschen
(aus Großhirnrinde)
Fig. 2a: Aminosäureteilsequenz des SAAtl -Transportes des Menschen (Ausschnitt aus Fig. 2 von Aminosäure 79 bis 241 )
Fig. 3: Nachweis, daß [1 C]-ß-D-Glc-IPM nur von SAAT1 und keiner anderen Subtype der SGLT-Familie transportiert wird.
Fig. 4: Nachweis, daß ein Saccharid-gekoppeltes Arzneimeittel (ß-D-
Glycosyl-gentisinsäuremethylester) von SAAT1 , aber nicht vom Transporter SGLT1 transportiert wird.
Fig. 5: Verteilung von SAAT1 in menschlichen Organen und Gewe¬ ben
Fig. 6: Expression von SAAT1 in verschiedenen menschlichen Tu¬ morgeweben
Fig. 7: [1 C]-ß-D-Glc-IPM Aufnahme in suspendierte menschliche
Karzinoma T84-Zellen durch SAAT1 Die folgende Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben:
Beispiel 1 : Transkription von SAAT1 in menschlichen Tumorzellen
Gesamt-RNA wurde gemäß Standardverfahren (Chomczynski et al., Anal. Bio- chem. 162, S. 1 56-1 59, 1 987) aus verschiedenen renalen Karzinomen gewonnen (siehe Fig. 6; Nukleargrad 1 -Nierentumor: Spur c; Nukleargrad 2-Nierentu- mor: Spur d; Nukleargrad 3-Nierentumor: Spur e; menschl. Colonkarzinom aus Mäuse-Tumor-Xenografts: Spur f; menschl. Ovarkarzinom aus Mäuse-Tumor- Xenografts: Spur g; menschl. Karzinoma-Zeliinie KTCTL30: Spur h; renale menschl. Karzinoma-Zeliinie KTCTL1 04: Spur i; renale menschl. Karzinoma- Zeliinie T84: Spur k) . Die RNAs und eine Kontrolle ohne RNA (Spur b) wurden 10 Min. bei 37°C mit DNase (2U DNase/μg RNA) behandelt, um Reste genomischer DNA zu entfernen. Danach wurden sie einer reversen Transkriptase- Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) unterworfen. Die RT-PCR wurde mit Titanτ~ MOne Tube RT-PCR-System (Boehringer Mannheim) den Herstellerinformationen folgend unterworfen. Es wurde jeweils 1 μ_ RNA verwendet und die eingesetzten Primer waren 5'-GGA CTT CCC CAG TAA TGT-3' (forward) und 5'-CTT CTC GGT AAA GCT CTC-3' (reverse) . Die PCR-Produkte und ein Größenmarker (Spur a) wurden auf einem 1 % Agarosegel aufgetrennt. Ein Teil des Gels wurde mit Ethidiumbromid angefärbt (Fig. 6, obere Spalte) . Der andere Teil des Gels wurde geblottet und bei 48 °C an das 32P-markierte Oligonukleotid 5'-CAT CTG TGT GGT TTT GTT-3' (forward) hybridisiert. Die Membran wurde bei 48 °C mit 6xSSC enthaltend 0,05% (w/v) Natriumpyrophosphat gewaschen und zur Autoradiografie ein Film aufgelegt.
Als Kontrollexperiment wurde genomische DNA verwendet, mit der jede cDNA- Amplifikation aus genomischer DNA ausgeschlossen war.
Wie durch Fig. 6 verdeutlicht wird, ist das menschliche SAAT1 -Fragment in Carcinomas der Niere, Darm und Ovarien, in Darmkrebszellen T84 und in zwei renalen Carcinoma-Zellinien nachweisbar.
Beispiel 2: Transkription von SAAT1 in verschiedenen menschlichen
Organen und Geweben
Ein menschlicher RNA "Master-Blot" (Firma Clontech Laboratories, Palo Alto, Californien, USA; Katalog-Nr. 7770) auf dem mRNA-Proben aus vielen menschlichen Geweben aufgetragen sind, wurde nach den Angaben des Herstellers (Protokoll Nr. PT3004-1 ) mit einem radioaktiv markierten cDNA-Fragment des menschlichen SAAT1 (s. Fig. 1 , Nukleotide 1 730-2032) nach den Angaben des Herstellers hybridisiert und gewaschen. Das Ergebnis ist in Fig. 5 gezeigt. Dort ist zu sehen, daß kleine Mengen von SAAT1 in vielen Organen transkribiert werden. Am stärksten wird SAAT1 in der Skelettmuskulatur (Fig. 5 A3), in der Prostata (Fig. 5 A7), im Dünndarm (Fig. 5 C3), in der Lunge (Fig. 5 D2) und in der fötalen Leber (Fig. 5 E4) transkribiert.
Beispiel 3: Expression von [14C]-ß-D-Glc IPM Transport durch SAAT1 in
Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis.
In Xenopus laevis Oozyten wurden 50 nl Wasser mit und ohne 1 0 ng cRNA von SGLT1 (Typ eines Saccharid-Transporter aus Kaninchen), SGLT1 (Mensch), Hu 14 (Typ eines weiteren Saccharid-Transporters aus Mensch), SMIT (Typ eines weiteren Saccharid-Transporters aus Hund) oder SAAT1 (Schwein) injiziert. Nach 2-4 Tagen Inkubation wurde die Expression des jeweiligen Transporters durch Messung der Phlorizin-inhibierbaren Aufnahme nach 30 Minuten Inkubation mit 50 μM [14C] AMG (SGLT1 , SAAT1 ), 1 ,25 mM [1 C] AMG (Hu14) und 1 μM [3H] myo-lnositol gemessen. Die verwendeten Phiorizin-Konzentrationen waren 1 00 μM (SGLT1 aus Kaninchen), 200 μM (SGLT1 aus Mensch, Hu 1 4, SAAT1 ) oder 500 μM (SMIT). Die exprimierte Phlorizin-inhibierbare Aufnahmera¬ te von AMG und myo-lnositol waren 274 ± 22 (AMG, SGLT1 , Kaninchen), 48 ± 5 (AMG, SGLT1 , Mensch), 25 ± 1 (AMG, Hu 1 4), 6,5 ± 0,7 (myo-lnositol, SMIT) bzw. 1 8 ± 2 (AMG, SAAT1 ) pmol x Oozyte'1 x h 1. Unter identischen experimentellen Bedingungen wurden die gleichen Chargen injizierter Oozyten auf die Phlorizin-inhibierbare Aufnahme von 1 00 μM [14C]-ß-D-Glc-IPM getestet.
Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt, woraus klar hervorgeht, daß nur SAAT1 das Saccharid-gekoppelte Zytostatikum zu transportieren vermag.
Beispiel 4: Expression des Transportes von ß-D-Glycosylgentisinsäure- methylester durch SAAT1
Gentisinsäuremethylester ist ein Antioxidationsmittel, welches z.B. bei Morbus Parkinson, eingesetzt werden kann. Die Strukturformel von ß-D-Glycosylgen- tisinsäuremethylester (ß-D-GIc-GME) ist im oberen Teil von Fig. 4 dargestellt. In Xenopus laevis Oozyten wurden 50 nl Wasser mit oder ohne 10 ng cRNA von SAAT1 (Schwein) oder SGLT1 (Menschen) injiziert. Nach 3 Tagen Inkubation wurde der durch SAAT1 vermittelte Transport von ß-D-Glycosylgentisinsäureme- thylester elektrisch gemessen. Dies ist möglich, da der SAAT1 -Transporter ein sog. Na+-Kotransporter ist, der seine Substrate, also AMG oder ß-D-Glyco- syslgentisinsäuremethylester, immer zusammen mit Natriumionen transportiert. Im vorliegenden Beispiel wurden die Oozyten entweder mit 1 mM AMG oder 1 mM ß-D-GIc-GME überströmt und der in die Oozyten gerichtete Natrium-Strom gemessen. Dabei wurde die Spannung über die Membran auf -50 mV "ge¬ klemmt" (sof. voltage-clamp Methode, s. Busch et al. , J. of Biologicial Chemi- stry, Vol. 271 , No. 51 , S. 32599-32604, 1 996) . Während die mit Wasser injizierten Oozyten nach Überströmung mit AMG oder ß-D-GIc-GME keinen Strom zeigten, induzierte ß-D-GIc-GME bei den Oozyten einen Strom, die SAAT1 exprimierten. Durch AMG konnten dagegen sowohl in den SGLT1 exprimieren¬ den als auch in den SAAT1 exprimierenden Oozyten Ströme gemessen induziert werden. Das Ergebnis ist in Fig. 4 gezeigt, d.h. daß die Saccharid-gekoppelte therapeutisch wirksame Substanz ß-D-GIc-GME von SAAT1 , aber nicht von SGLT1 transportiert wird.
Beispiel 5: [14C]-ß-D-Glc IPM Aufnahme in menschl. Carcinomazellen
T84-Zellen (ECACC Nr. 88021 101 ), die von EACC (Salisbury, GB) erhalten wurden, wurden bei 37 °C in einer 1 : 1 Mischung von Dulbecco's modified Eagle's- Medium und Ham's T1 2 Medium (Fa. Sigma) bei 5 % CO2 auf Gewerbekulturschalen der Firma Greiner kultiviert. Die Mischung enthielt weiter 10% fötales Rinderserum, 4 mM L-Glutamin, 10 U/ml Penicillin und 1 00 μg/ml Streptomycin. Nach Konfiuenz der Zellen wurden diese durch 1 -stündige Inkubation für 1 Std. bei 37 °C mit Mg2 +- Ca2 +-freiem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) enthaltend 0,5 mM EDTA, 1 0 mM Hepes und 28 mM NaHC03, pH7,4 abgelöst, bei 1000g sedimentiert und in PBS resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden 30 Sek. mit PBS, enthaltend verschiedene Konzentrationen D-[14C] ß-D-GIc-IPM inkubiert. Die Inkubationen wurden mit eiskaltem PBS enthaltend 1 mM Phlorizin (bekannt als Inhibitor für Glucosetransporter) gestoppt. Die Zellen wurden zweimal mit dieser Stoplösung gewaschen, mit 4M Guanidinthiocyanat solubili- siert und auf Radioaktivität untersucht.
Dieses Ergebnis ist in Fig. 7 gezeigt. Aus dem Ergebnis geht klar hervor, daß T84-Zellen über einen Transporter verfügen, der es ermöglicht, daß ß-D-GIc-IPM aufgenommen wird.
Beispiel 6: Herstellung von Antikörpern
Mit einem Gel-gereinigten Transporter-Proteinfragment gemäß Fig. 2 wurden Tiere wie folgt immunisiert:
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung wurden 35μg Gel-gereinigtes Protein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt. Tag O: 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80 Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 1 0, ( 1 984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, ( 1 994), 21 5-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37 °C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens ( 1 : 1 0000 in PBS) . Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen- IgG-Antikörper (Dianova) ( 1 :5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bromo-4-chloro- 3-indolylphosphat, 400μM Nitroblau-tetrazolium, 1 00mM Tris-HCI, pH 9.5, 1 00 mM NaCI, 5 mM MgCI2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.
Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung wurden 40μg Gel-gereinigtes Protein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O. 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung wurden 1 2μg Gel-gereinigtes Protein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag O. 1 . Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 28 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 56 3. Immunisierung (icFA) Tag 84 4. Immunisierung (PBS) Tag 87 Fusion
Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungs¬ gemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.
BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE rNTERNAUONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Bayrische Julius- Maximilians-Universität Anatomisches Institut I Prof. Dr. Koepsell Koellikerstr. 6 EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, 97070 Würzburg ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER hSAATl
DSM 11991
π WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMJSCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I bezeichneten Mikroorganismus wurde
(X ) eine wissenschaftliche Beschreibung
(X ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen) in EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1998 - 02 - 11 (Datum der Ersthinterlegung)' eingegangen ist
IV EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst- hmterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)
V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschnft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungssteile MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten
Anschrift Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig
Datum 1998 - 02 -13
Falls Regel 64 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt zu dem der Status einer mtemauonalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196 BUDAPESTΕR VERTRAG OBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Bayrische Julius- Maximilians-Universität Anatomisches Institut I Prof. Dr. Koepsell Koelli erstr. 6 LEBENSFAMGKEΓΓSBESCHEΓNIGUNG 97070 Würzburg ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. HINTERLEGER II KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name. Bayrische Julius- Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
Maximilians-Universität zugeteilte EINGANGSNUMMER. Anschrift Anatomisches Institut I DSM 11991
Prof. Dr. Koepsell
Koellikerstr. 6 Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung':
97070 Würzburg 1998 - 02 - 11
m. LEBENSFAffiGKErrSBESCHEiNIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 1998 - 02 - l l : geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
(X)1 lebensfähig
( )' nicht mehr lebensfähig
IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST*
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschπft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten.
Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig (S. CCJA.- C
Datum. 1998 - 02 - 13
Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regel 10-2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten LebensfähigkeitsprUfüng.
Zutreffendes ankreuzen.
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.
Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 0196

Claims

Patentansprüche
1 . Nukleinsäure, kodierend für ein Transporterprotein für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel, wobei die Nukleinsäure umfaßt:
(a) die Nukleinsäure von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Nukleinsäure bzw. ein Fragment davon,
(b) eine mit der Nukleinsäure von (a) hybridisierende Nukleinsäure oder
(c) eine mit der Nukleinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte Nukleinsäure.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1 , wobei sie eine DNA ist.
3. Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 1 .
4. Transformante, enthaltend den Vektor nach Anspruch 3.
5. Transporterprotein für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 2, ein funktionelles Derivat oder Fragment davon.
6. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 5, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 4 unter geeigneten Bedingungen.
7. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach Anspruch 5.
8. Verwendung des Proteins nach Anspruch 5 als Reagens zur Analyse von erkranktem Gewebe oder Zellen, vorzugsweise Tumorzellen.
9. Verwendung der Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 als Reagens zur Analyse von erkranktem Gewebe oder Zellen, vorzugsweise Tumorzellen.
10. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 7 als Reagenz zur Analyse von erkranktem Gewebe oder Zellen, vorzugsweise Tumorzellen.
1 1 . Verwendung des Proteins nach Anspruch 5, der Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, oder des Plasmids nach Anspruch 3 zur Gentherapie von erkranktem Gewebe oder Zellen, insbesondere bei Tumorerkrankungen.
1 2. Verwendung des Proteins nach Anspruch 5, der Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, oder des Plasmids nach Anspruch 3 zur Austestung neuer Saccharid-gekoppelter Arzneimittel bezüglich ihrer prospektiven Aufnahme in erkranktem Gewebe oder Zellen, vorzugsweise Tumorzellen.
EP99915493A 1998-02-18 1999-02-18 Transporterprotein für saccharid-gekoppelte arzneimittel Withdrawn EP1056857A2 (de)

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