DE19851294C1 - Ischämie/reperfusionsinduzierbare DNAs und Proteine - Google Patents
Ischämie/reperfusionsinduzierbare DNAs und ProteineInfo
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Abstract
Kurzzeitige Phasen koronären Verschlusses führen zu einer ischämischen Präkonditionierung des Herzens. Dies führt dazu, daß das betroffene Myokard gegenüber längeren Phasen von Ischämie resistenter wird. Bei der ischämischen Präkonditionierung sind eine Reihe von Genen induziert oder bevorzugt exprimiert. Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für Proteine kodieren, die in der Lage sind, bei der ischämischen Präkonditionierung, insbesondere der ischämischen Präkonditionierung des Herzens, mitzuwirken. Die Erfindung betrifft weiterhin die Proteine selbst, unter anderem auch zur Verwendung als Arzneimittel, beispielsweise zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verhinderung von Herzinfarkten oder örtlichen kontraktilen Dysfunktionen. Daneben stellt die Erfindung Nucleinsäuresonden bereit, mit denen die Expression von Genen, die eine Rolle bei der ischämischen Präkonditionierung spielen, nachgewiesen werden kann.
Description
Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für Proteine ko
dieren, die bei der ischämischen Präkonditionierung eine
Rolle spielen. Die Erfindung betrifft weiterhin Expressi
onsvektoren, die eine entsprechende DNA enthalten, und
Wirtszellen, die mit einem dieser Expressionsvektoren
transformiert sind. Die Erfindung betrifft weiterhin Pro
teine, die bei der ischämischen Präkonditionierung betei
ligt sind, Antikörper gegen diese Proteine sowie pharmazeu
tische Zusammensetzungen, die dieses Protein enthalten.
Kurzzeitige Phasen koronären Verschlusses führen zu einer
ischämischen Präkonditionierung (IPC) und einem myokardia
len Stunning (MS) (myokardiale Funktionsstörung) des Her
zens. Die ischämische Präkonditionierung führt dazu, daß
das betroffene Myokard gegenüber längeren Phasen von Ischä
mie resistenter wird, wodurch in dramatischer Weise die
Stärke eines etwaig folgenden Myokardinfarktes verringert
wird und wodurch der kontraktile, metabolische und ionische
Zustand verbessert wird (Murry, C. E., Jennings, R. B., Rei
mer, K. A., Preconditioning with ischemia: a delay of lethal
cell injury in ischemic myocardium, Circulation 1986;
74: 1124-1136; Schott, R. J., Rohmann, S., Brau, E. R., Scha
per, W., Ischemic preconditioning reduces infarct size in
swine myocardium, Cir. Res. 1990; 66: 1133-1142; de Albu
querque, C. P., Gerstenblith, G. Weiss, R. G., Importance of
metabolic inhibition and cellular pH in mediating precondi
tioning contractile and metabolic effects in rat hearts,
Cir. Res. 1994; 74: 139-150; Steenbergen, C., Perlman, M. E.,
London, R. E., Murphy, E., Mechanism of preconditioning: Io
nic alteration, Cir. Res. 1993; 72: 112-125). Im Unterschied
dazu wird MS als eine regionale kontraktile Dysfunktion de
finiert, die lange andauert, ohne daß sie zu irreversiblen
Schädigungen führt (Heyndrickx, G. R., Millard, R. W., Mcrit
chie, R. J., Maroko, P. R., Vatner, S. F., Regional myocardial
functional and electrophysiological alterations after brief
coronary artery occlusion in conscious dogs, J. Clinic.
Inv. 1975; 56: 978-985; Braunwald, E., Kloner, R. A., The
stunned myocardium: prolonged, postischemic ventricular
dysfunction, Circulation 1982; 66: 1146-1149). Die exakten
Mechanismen, die für IPC und MS verantwortlich sind, wurden
bisland noch nicht ermittelt. Einige Untersuchungen haben
ergeben, daß sich infolge kurzer Phasen der Ischämie, ge
folgt von Reperfusion, Veränderungen der Expression einer
Reihe von Genen ergeben. So wurde beispielsweise gezeigt,
daß in Schweineherzen nach 10minütigem Verschluß der linken
vorderen absteigenden Koronararterie, gefolgt von einer 30-
minütigen Reperfusion, gefolgt von einem erneuten 10minüti
gen Verschluß mit anschließender 30minütiger Reperfusion,
die Genexpression von c-fos, egr-1 und jun B in starkem Ma
ße induziert war (Brand, T., Sharma, H. S., Fleischmann,
K. E., Duncker, D. J., McFalls, E. O., Verdouw, P. D., Schaper,
W., Proto-oncogene expression in porcine myocardium sub
jected to ischaemia and reperfusion, Cir. Res. 71: 1351-
1360, 1992). Diese frühen Ergebnisse führten jedoch nicht
zu einem vollständigen Verständnis der Ereignisse, die zu
einer ischämischen Präkonditionierung und damit zu einem
verringerten Infarktrisiko führen. Im wesentlichen sind die
Gene, deren Expression als Folge eines durch Ischämie/Re
perfusion hervorgerufenen Stresses induziert bzw. verstärkt
ist, noch nicht bekannt.
Der vorliegenden Erfindung liegt damit die Aufgabe zugrun
de, DNAs bereitzustellen, die für Proteine kodieren, die in
der Lage sind, bei der ischämischen Präkonditionierung mit
zuwirken und die insbesondere in der Lage sind, das Infark
trisiko zu senken und/oder die Schwere eines Infarktes zu
verringern. Weiterhin sollten die Proteine selbst bereitge
stellt werden. Zudem war es Aufgabe der Erfindung, DNA-Son
den bereitzustellen, mit denen die Expression von Genen
nachgewiesen werden kann, die insbesondere bei der ischämi
schen Präkonditionierung verstärkt exprimiert oder gar in
duziert werden. Derartige Sonden sind auch geeignet,
Vollänge-cDNAs oder genomische DNAs dieser Gene zu identi
fizieren. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die in
den Patentansprüchen aufgeführten Merkmale gelöst.
Demgemäß betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die für Pro
teine codieren, die in der Lage sind, bei der ischämischen
Präkonditionierung, insbesondere der ischämischen Präkondi
tionierung des Herzens mitzuwirken, ausgewählt aus:
- a) einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 oder dem jeweiligen kom plementären Strang dazu,
- b) einer DNA-Sequenz, die mit einer der Sequenzen unter (a) oder Fragmenten davon unter stringenten Bedingun gen hybridisieren kann,
- c) einer DNA, die lediglich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes nicht befähigt ist, unter strin genten Bedingungen mit einer der unter (a) definierten Sequenzen zu hybridisieren.
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 sind
die Nucleinsäuresequenzen von cDNAs von Genen aus dem
Schweineherz, die als Folge von Ischämie/Reperfusion und
dem damit verbundenen Streß induziert werden bzw. in ver
stärktem Maße exprimiert werden. In dieser Anmeldung wird
die Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 manchmal als RKD
7.1 bezeichnet. Entsprechend sind (i) SEQ ID NO: 3 und W12
sowie (ii) SEQ ID NO: 4 und W28 rev und (iii) SEQ ID NO: 5
und W28 uni identisch.
Unter Ischämie versteht man eine Unterbrechung oder spürba
re Verringerung der Durchblutung, oder eine Blutleere ein
zelner Organteile infolge mangelnder Blutzufuhr, z. B. in
folge von Thrombose, Embolie, Endarteriitis, Druck von Tu
moren oder durch experimentellen Verschluß von blutzufüh
renden Gefäßen. Eine Ischämie kann zur Nekrose des betref
fenden Gewebes führen. Unter Reperfusion versteht man den
Vorgang, daß das Unterbrechen der Blutzufuhr wieder aufge
hoben wird.
Ischämie kann bei jedem durchbluteten Organ auftreten. Von
besonderer Wichtigkeit ist jedoch im allgemeinen die Ischä
mie, die durch Verschluß von Herzgefäßen hervorgerufen wird
(Ischämie des Herzens). Unter dem Begriff "Ischämie/Reper
fusion" ist ein Vorgang zu verstehen, bei dem zeitweise,
beispielsweise durch den Verschluß oder Abbinden eines
Blutgefäßes, eine Ischämie erzeugt wird und anschließend
das Gewebe wieder durchblutet wird. Ein typisches Ischä
mie/Reperfusionsprotokoll ist eine zweimalige Abfolge eines
10minütigen Verschlusses eines Gefäßes, gefolgt von einer
30minütigen Reperfusion.
"Ischämische Präkonditionierung" (IPC) bedeutet, daß durch
kurzzeitige Phasen der Ischämie, die noch zu keiner Nekrose
des Gewebes führen, die Empfindlichkeit des Gewebes gegen
über erneuten ischämischen Vorgängen erniedrigt wird. Wie
bereits ausgeführt, führt eine ischämische Präkonditionie
rung des Herzens dazu, daß etwaig nachfolgende Infarkte in
ihrer Stärke verringert sind oder das Risiko eines Infark
tes vermindert ist.
Zum Isolieren der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 wird im wesentlichen wie folgt
vorgegangen: Die linke vordere absteigende Koronararterie
von Schweinen wird während zehn Minuten verschlossen. Dann
folgt eine 30minütige Reperfusion und ein erneuter 10minü
tiger Verschluß, und eine weitere 30minütige Reperfusion.
Aus dem auf diese Weise vorbehandelten Herzgewebe dieser
Tiere wird die RNA isoliert, und es werden mittels mRNA
Differential Displays cDNAs hergestellt, und deren Sequenz
ermittelt. Dadurch wird ein Rückschluß auf Gene möglich,
deren Expression im Schweineherz als Folge der Ischämie in
duziert oder aber verstärkt wird. Das Verfahren zum Durch
führen des Differential Displays ist dem Fachmann bekannt
(Liang, P., Pardee, A. B., Differential display of eukaryo
tic messenger RNA by means of the polymerase chain reacti
on, Science 1992, 257: 967-971; Liang, P., Averboukh, L.,
Pardee, A. B., Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs
by means of differential display: refinements and optimiza
tion, Nucleic Acids Res., 1993, 21: 3269-3275; Bauer, D.,
Muller, H., Reich, J. et al., Identification of differen
tially expressed mRNA species by an improved display tech
nique (DDRT-PCR), Nucleic Acids Res., 1993, 21: 4272-4280).
Auf diese Weise wurden die cDNAs mit der SEQ ID NO: 3, 4, 5
und 6 erhalten. Sollte die isolierte cDNA nicht Vollänge
besitzen, so ist es möglich, eine Herz-cDNA-Genbank des
Schweines auf Vollänge-cDNAs durchzumustern. Schweineherz
cDNA-Genbanken sind z. B. von Stratagene, Heidelberg,
Deutschland, verfügbar (in Uni-ZAP XR) bzw. für einen Fach
mann ohne weiteres herstellbar. Das Verfahren zum Durchmu
stern einer cDNA-Genbank ist dem Fachmann bekannt und wird
zudem in der Beispielsektion detailliert beschrieben. Mit
tels des beschriebenen Grundverfahrens wurde unter Verwen
dung einer DNA mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID
NO: 6 als Hybridisierungssonde eine Vollänge cDNA mit einer
Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 erhalten. Die Expres
sion der den SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 und 6 entsprechenden Gene
im Schweineherzen ist als Folge der Ischämie induziert bzw.
verstärkt.
SEQ ID NO: 1 ist die Nucleinsäuresequenz einer cDNA mit 3463
Bp. Die Sequenz enthält ein typisches Polyadenylierungs
signal AATAAA, 23 Nucleotide stromaufwärts des Poly(A)-
Schwanzes. Weiterhin wurde ein offener Leserahmen von 2031
BP nachgewiesen. 97% der Vertebraten-mRNAs besitzen ein Pu
rin, üblicherweise ein A in Position -3; 46% der Vertebra
ten-mRNAs besitzen ein G in Position +4 (Kozak, M., An Ana
lysis of vertebrate mRNA sequence: intimation of transla
tional control, J. Cell. Biol., 115: 887-903, 1991). Somit
ergibt sich bei Vertebraten die Konsensus-Sequenz A/GNNATGG
für ein Translationsstartsignal. Das erste ATG in der SEQ
ID NO: 1, das diese Bedingungen erfüllt, liegt an Position
195 und ist somit ein wahrscheinliches Translations-Initia
tionssignal. Unter Verwendung des FASTA-Programmes wurde
die EMBL-DNA-Datenbank auf etwaige Homologien mit der SEQ
ID NO: 1 untersucht. Diese Untersuchung ergab, daß SEQ ID
NO: 1 keine signifikante Homologie zu irgendeiner anderen
DNA-Sequenz in dieser Datenbank aufweist. Lediglich drei
kurze EST-Sequenzen weisen eine Homologie von etwa 89% zu
SEQ ID NO: 1 auf. Die ESTs mit der Zugangsnummer AA177794,
AA215030 und W62755 sind dabei homolog zu den Nucleotiden
1211-1556, 1711-2049 bzw. 2782-3077 der SEQ ID NO: 1. Weite
re Informationen zu diesen ESTs sind nicht bekannt.
Um zu bestätigen, daß das zu SEQ ID NO: 1 gehörende Gen be
vorzugt in ischämischem Myokard exprimiert wird, wurde eine
DNA mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 als
Sonde verwendet, um die Expression dieses Gens im Schweine
herz zu überprüfen. Die statistische Analyse ergibt, daß
die Expression des Gens im Schweineherz tatsächlich infolge
von Ischämie/Reperfusion erhöht ist. Es wurden zwei RNA-
Transkripte nachgewiesen, deren Größe etwa 6 und 8 kBp be
trug. Weiterhin wurde die Expression des entsprechenden
Gens in anderen Organen überprüft, und es wurde nachgewie
sen, daß die Messenger-RNA in Herz, Leber, Lunge, Niere,
Milz, Darmgewebe, Gehirn und Skelettmuskulatur exprimiert
wird.
Insbesondere betrifft die Erfindung DNAs, die die kodieren
de Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder aber einen Teil der kodie
renden Sequenz der SEQ ID NO: 1 umfassen. Unter einem "Teil
der kodierende Sequenz der SEQ ID NO: 1" soll ein DNA-Frag
ment verstanden werden, das in der Lage ist, unter strin
genten Bedingungen an den kodierenden Abschnitt gemäß SEQ
ID NO: 1 zu hybridisieren.
Ebenfalls mittels des Verfahrens des Differential Displays
wurden Nucleinsäuren mit Sequenzen gemäß der SEQ ID NO: 3,
NO: 4, NO: 5 und NO: 6 identifiziert. Bei SEQ ID NO: 3, NO: 4,
NO: 5 und NO: 6 handelt es sich somit ebenfalls um cDNAs. SEQ
ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 sind dabei Teilsequenzen einer ein
zelnen, durch Differential Display aufgefundenen cDNA. Die
Sequenzanalyse der SEQ ID NO: 3, NO: 4 und NO: 5 ergab, daß
diese keinerlei signifikante Homologie zu irgendeinem ande
ren Gen aufweisen. Die Expression der Gene, von denen die
cDNAs der SEQ IDs NO: 3, NO: 4 und NO: 5 abgeleitet wurden,
sind ebenfalls im Schweinegewebe infolge von Ischämie/Re
perfusion in signifikanter Weise im Vergleich zu nicht
ischämischem Myokardgewebe erhöht. Im Vergleich zu nicht
ischämischem Myokardgewebe ist ihre Expression zweifach
(SEQ ID NO: 3) bzw. 1,9fach (SEQ ID NO: 4 und 5) erhöht. Er
neut ergab eine Untersuchung der Gesamt-RNA anderer Gewebe,
daß die Gene, von denen SEQ ID NO: 3, NO: 4 und NO: 5 abgelei
tet sind, in Herz, Leber, Lunge, Darm, Hirn, Niere und Ske
lettmuskel exprimiert werden.
Die Erfindung betrifft somit insbesondere die Sequenzen ge
mäß SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4, NO: 5 und NO: 6. In Kenntnis der
Nucleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4, NO: 5
und NO: 6 ist es für den Fachmann völlig problemlos, bei
spielsweise unter Verwendung einer PCR-Reaktion und geeig
neten Primern die entsprechenden cDNAs aus einer geeigneten
Genbank zu amplifizieren und anschließend zu klonieren. Mu
tationen in den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4,
NO: 5 und NO: 6 können mittels dem Fachmann bekannter Verfah
ren eingeführt werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin auch die zu den SEQ ID
NO: 1, NO: 3, NO: 4, NO: 5 und NO: 6 komplementären Stränge.
Weiterhin umfaßt die Erfindung auch die DNA-Sequenzen, die
mit einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4, NO: 5 oder
NO: 6 oder den dazu komplementären Strängen unter stringen
ten Bedingungen hybridisieren können. Insbesondere umfaßt
die Erfindung DNAs, die unter stringenten Bedingungen mit
der kodierenden Region gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisieren kön
nen. Der Begriff "stringente Bedingungen" bezieht sich auf
Hybridisierungsbedingungen bzw. auf nachfolgende Waschvor
gänge, die der Fachmann üblicherweise als "stringent" be
zeichnet (siehe z. B. T. Maniatis et al., Molecular Cloning
(Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory 1982,
pp. 387-389). Ein nicht-einschränkendes Beispiel für eine
derartige Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung
mit 4 X SSC bei 65°C, gefolgt von einer Stunde Waschen in
0,1 X SSC bei 65°C. Ein alternatives Beispiel für stringen
te Hybridisierung ist eine Hybridisierung in 50% Formamid
und 4 X SSC bei 42°C. Die Erfindung betrifft weiterhin
DNAs, die letztlich für die gleiche Aminosäuresequenz ko
dieren wie die SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4 oder NO: 5, oder aber
für Muteine, fusionierte Proteine oder funktionelle Deriva
te davon, die jedoch aufgrund der Degeneriertheit des gene
tischen Codes von der Sequenz ID NO: 1, NO: 3, NO: 4 oder NO: 5
unterschiedlich sind. Möglicherweise würde eine derartige
DNA unter stringenten Bedingungen nicht an die DNA-Sequen
zen der SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4 oder NO: 5 hybridisieren,
obwohl sie unter Umständen für ein in der Proteinsequenz
identisches Protein kodieren würde. Die Erfindung umfaßt
daher auch die DNAs, die aufgrund der Degeneriertheit des
genetischen Codes nicht befähigt sind, mit einer der cDNA-
Sequenzen der SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 oder NO: 6
zu hybridisieren. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind
dabei bevorzugt DNA-Sequenzen, die vom Schwein, dem Men
schen, dem Kaninchen, der Maus oder einem anderen Wirbel
tier abgeleitet sind. Hybridisierungsexperimente mit einer
Nucleinsäure der SEQ ID NO: 1 mit DNA aus Menschen, Schwei
nen, Kaninchen und Maus zeigten, daß das entsprechende Gen
in diesen Arten in hohem Maße konserviert ist. Die Erfin
dung betrifft daneben auch synthetische Gene.
Die Erfindung betrifft insbesondere erfindungsgemäße DNA-
Sequenzen, die für ein Protein kodieren, das in der Lage
ist, bei der ischämischen Präkonditionierung mitzuwirken,
insbesondere aber Proteine, die bei der ischämischen Prä
konditionierung des Herzens eine Rolle spielen. Wie bereits
oben ausgeführt und wie in der Beispielsektion noch im ein
zelnen ausgeführt werden wird, sind die den SEQ IDs NO: 1,
NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 und NO: 6 entsprechenden Gene des
Schweines infolge der Ischämie/Reperfusion induziert bzw.
in der Expression verstärkt. Somit müssen die von diesen
Genen kodierten Proteine eine Rolle bei der ischämischen
Präkonditionierung spielen. Derartige Proteine können Pro
teine sein, die in nicht durch Ischämie/Reperfusion ge
streßten Zellen nicht nachweisbar sind, da die dazugehöri
gen Gene nicht exprimiert werden. Durch Ischämie/Reperfu
sion werden die entsprechenden Gene induziert, und dadurch
können als Folge dieses Stresses die Proteine nach Ischä
mie/Reperfusion nachgewiesen werden. Daneben können aber
die Proteine, die eine Rolle bei der ischämischen Präkondi
tionierung spielen, auch Proteine sein, die in geringerer
Konzentration auch außerhalb der Phasen der Ischämie/Reper
fusion nachweisbar sind, deren Konzentration in der Zelle
als Folge einer verstärkten Genexpression aber nach Ischä
mie/Reperfusion erhöht ist. Beispiele derartiger Proteine
sind Reparaturproteine, insbesondere Proteine, die eine
Rolle bei der DNA-Reparatur spielen. "Mitwirken bei der
ischämischen Präkonditionierung" bedeutet insbesondere, daß
die betreffenden Proteine in der Lage sind, die Toleranz
des Gewebes gegenüber erneuten ischämischen Vorgängen zu
erhöhen. In bezug auf das Herz bedeutet ein Mitwirken eines
Proteins bei der ischämischen Präkonditionierung insbeson
dere, daß das Protein in der Lage ist, die Stärke eines
Herzinfarktes zu verringern und/oder das Risiko eines In
farktes zu vermindern. Verfahren zur Bestimmung, ob ein
Protein bei einer ischämischen Präkonditionierung mitwirkt,
sind dem Fachmann bekannt (Vogt, A. M., Htun, P., Kluge, A.,
Zimmermann, R. und Schaper, W.; Insulin-Like Growth Factor
II Delays Myocardial Infarction in Experimental Coronary
Artery Occlusion, Cardiovascular Research 33 (1997), S.
469-477, und Vogt, A. M., Htun, P., Arras, M., Podzuweit, T.
und Schaper, W.; Intramyocardial Infusion of Tool Drugs for
the Study of Molecular Mechanisms in Ischemic Precondi
tioning, Basic Res. Cardiol. 91 (1996), S. 389-400). Ein
typischer Test zur Bestimmung, ob und inwieweit ein Protein
bei der ischämischen Präkonditionierung des Herzens mit
wirkt, kann beispielsweise wie folgt vorgenommen werden:
Schweine erhalten während 60 Minuten intramyokardiale Infu
sionen mit einer Lösung, die das Protein, das bei der
ischämischen Präkonditionierung des Herzens mitwirkt, ent
hält. Kontrolltiere erhalten ebenfalls intramyokardiale In
fusionen, allerdings lediglich mit einem Puffer (z. B.
Krebs-Hanseleit-Puffer). Auch in diesem Fall beträgt die
Injektionszeit 60 Minuten. Anschließend werden bei Tieren
aus beiden Gruppen die linken vorderen absteigenden Koro
nararterien während 60 Minuten beispielsweise durch eine
Ligatur verschlossen (Okklusion), gefolgt von 120 Minuten
Reperfusion. Danach wird die linke vordere absteigende Ko
ronararterie erneut verschlossen, und es wird Natriumfluo
rescein intravenös als Bolus injiziert. Nach Töten der Tie
re wird das linke Ventrikel in Scheiben geschnitten. Ischä
mische Regionen können beispielsweise als nichtfluoreszie
rende Bereiche bei Untersuchung mit Schwarzlicht identifi
ziert werden. Anstelle des oben beschriebenen Verfahrens
können auch fluoreszierende Mikrosphären verwendet werden.
Weiterhin kann eine Infarktdiagnose mit Triphenyltetrazoli
umchlorid (TTC) oder aber durch Co-Infusion von Propidiumi
odid und dem zu untersuchenden Protein erfolgen (Vogt et
al., 1996 a. a. O.). Detaillierte Hinweise auf Verfahren zur
Bestimmung, ob ein Protein eine Rolle bei der ischämischen
Präkonditionierung spielt, finden sich in der Beispielsek
tion. Ein Protein besitzt dann die Fähigkeit, bei einer
ischämischen Präkonditionierung des Herzens mitzuwirken,
wenn Tiere, die mit dem betreffenden Protein vorbehandelt
wurden, in dem eben beschriebenen Testsystem kleinere In
farktbereiche, insbesondere kleinere nekrotische Bereiche,
aufweisen als Kontrolltiere, die mit dem entsprechenden
Protein nicht vorbehandelt wurden.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine wie oben definierte
DNA-Sequenz zusammen mit anderen DNA-Sequenzen, die die Ex
pression ermöglichen. Dazu wird die entsprechende DNA, ins
besondere der kodierende Bereich der SEQ ID NO: 1, funktio
nell mit transkriptionellen und translationellen regulato
rischen Sequenzen verbunden. Transkriptionelle regulatori
sche Sequenzen sind beispielsweise Promotoren, Enhancer und
Terminationssignale, wie auch Spleißsignale. Translationel
le regulatorische Sequenzen sind beispielsweise die RNA-
Stabilität erhöhende oder modifizierende Sequenzen, RNA-
Promotoren und dergleichen.
Bei den Sequenzen, die mit einer der Sequenzen gemäß SEQ ID
NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 oder NO: 6 oder dem komplemen
tären Strang dazu hybridisieren können oder die lediglich
aufgrund des genetischen Codes nicht befähigt sind, unter
stringenten Bedingungen mit diesen Sequenzen zu hybridisie
ren, kann es sich um eine genomische DNA-Sequenz oder aber
um eine cDNA-Sequenz handeln.
Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen, ausgewählt aus der
Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4 oder NO: 5. Am
meisten bevorzugt sind DNAs, die den kodierenden Bereich
gemäß SEQ ID NO: 1 enthalten. Gegenstand der Erfindung sind
weiterhin Varianten der kodierenden Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 1, insoweit diese Varianten entweder für ein Protein ko
dieren, das bei der ischämischen Präkonditionierung eine
Rolle spielt, oder/und unter stringenten Bedingungen mit
dem kodierenden Bereich gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisieren
können. Beispiele von Varianten sind DNAs, bei denen ein
oder mehrere Nucleotide des kodierenden Bereichs gemäß SEQ
ID NO: 1 deletiert oder durch ein anderes Nucleotid substi
tuiert sind. Bevorzugt weisen diese Varianten eine Homolo
gie auf Nucleotidebene von mehr als 50%, bevorzugt mehr als
60%, bevorzugter mehr als 70%, bevorzugter mehr als 80% und
am meisten bevorzugt von mehr als 90% auf. Diese Homologien
treten bevorzugt in einem Bereich von mehr als 100 Nucleo
tiden, bevorzugt mehr als 500 Nucleotiden, bevorzugter mehr
als 1000 und am bevorzugtesten von mehr als 1500 Nucleoti
den auf. Weitere Beispiele der erfindungsgemäßen Varianten
sind Varianten, die zur SEQ ID NO: 1 eine Homologie von
mehr als 70% in einem Bereich von mehr als 500 Nucleotiden,
bevorzugt eine Homologie von 70% in einem Bereich von mehr
als 1000 Nucleotiden, bevorzugter eine Homologie von mehr
als 70% in einem Bereich von 1500 Nucleotiden, aufweisen.
Die erfindungsgemäßen DNAs, insbesondere der kodierende Be
reich gemäß SEQ ID NO: 1, können zudem mit beliebigen ande
ren DNA-Fragmenten fusioniert sein.
Darüberhinaus sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung
DNA-Varianten der SEQ ID NO: 1, die lediglich aufgrund der
Degeneriertheit des genetischen Codes nicht an die SEQ ID
NO: 1 hybridisieren können, die aber immer noch für ein Pro
tein kodieren, das bei der ischämischen Präkonditionierung
eine Rolle spielen kann.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Expressionsvektor,
der eine erfindungsgemäße DNA, insbesondere die kodierende
Region der SEQ ID NO: 1, enthält. Diese Vektoren können zu
dem regulatorische Sequenzen in funktioneller Verbindung
mit den oben definierten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
enthalten, so daß die Expression der erfindungsgemäßen DNA
möglich ist. Der Expressionsvektor kann zudem einen bakte
riellen Replikationsursprung, wie z. B. den ColE1-Origin von
Escherichia coli, enthalten, so daß eine Replikation des
Expressionsvektor in Bakterien möglich ist. Weiterhin kann
der Expressionsvektor Sequenzen enthalten, die eine Persi
stenz des Vektors in eukaryonten Zellen ermöglicht. Hier
kann es sich beispielsweise um ein episomales Replikations
signal handeln, wie z. B. den Replikationsursprung des
Epstein-Barr-Virus. In diesem Fall muß der Expressionsvek
tor zusätzlich noch ein Gen für die die Persistenz auf
rechterhaltenden Gene, die zur Erkennung des Epstein-Barr-
Origin of Replications benötigt werden, enthalten. Der Ex
pressionsvektor kann auch ein Integrationssignal enthalten,
das die Integration des Plasmides in das Genom eukaryonter
Zellen ermöglicht.
Bevorzugte prokaryonte Plasmide sind pBR322-Derivate, be
vorzugte eukaryonte Vektoren schließen virale Vektoren, wie
z. B. BPV, Vaccinia oder SV40, 2-Micron-Plasmide oder ihre
Derivate ein.
Die erfindungsgemäßen DNAs, insbesondere die Nucleinsäure
sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4, NO: 5 oder NO: 6,
können u. a. auch als DNA-Sonden dienen, die in der Lage
sind, mit einer RNA zu hybridisieren, die von einer erfin
dungsgemäßen DNA durch Transkription gebildet wurde. Die
erfindungsgemäßen DNAs, insbesondere die Nucleinsäuren ge
mäß SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4, NO: 5 und NO: 6, können weiter
hin dazu verwendet werden, die entsprechenden natürlichen
DNAs bzw. Gene und die von diesen Genen transkribierten
RNAs nachzuweisen. Auf diese Art und Weise können die er
findungsgemäßen DNAs dazu verwendet werden, die Stärke der
Expression der betreffenden Gene in verschiedenen Geweben
nachzuweisen. Die hierzu benötigten Verfahren sind dem
Fachmann bekannt. Insbesondere ist hier die in-situ-Hybri
disierung, die in-situ-PCR, quantitative Northern-Hybridi
sierung, quantitative RNA-PCR usw. zu nennen. Es ist für
einen Fachmann offensichtlich, daß als Hybridisierungssonde
außer den erfindungsgemäßen DNAs auch RNAs einer entspre
chenden Nucleinsäuresequenz verwendet werden können. Diese
RNAs sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Eine Hybridi
sierung kann zudem auch zu dem Zweck erfolgen, das Vollän
ge-Gen oder das vollständige genomische Gen zu den Nuclein
säuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4, NO: 5 und NO: 6
zu isolieren. Die beschriebenen Verwendungen als Hybridi
sierungssonde sind zudem nicht einschränkend, sondern es
ist jede Verwendung der erfindungsgemäßen DNA oder entspre
chender erfindungsgemäßer RNAs als Hybridisierungssonde Ge
genstand dieser Erfindung. Die Durchführung von Hybridisie
rungsversuchen ist dem Fachmann bekannt. Beispiele für Hy
bridisierungsbedingungen finden sich an anderer Stelle in
dieser Anmeldung sowie in dem Abschnitt "Beispiele".
Die Erfindung betrifft weiterhin Wirtszellen, die einen Ex
pressionsvektor enthalten, der die erfindungsgemäße DNA
enthält. Geeignete Wirtszellen sind prokaryonte oder euka
ryonte Wirtszellen. Bevorzugte prokaryonte Wirtszellen sind
beispielsweise Bakterien, wie Escherichia coli, Bazillus,
Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Seratia etc. Der be
vorzugte prokaryonte Wirt ist E. coli. Beispiele für E. co
li-Stämme sind E. coli K12 Stamm 94 (ATCC 31446) und E. co
li X1776 (ATCC 31537). Bevorzugte eukaryonte Wirtszellen
sind Säugetierzellen, wie z. B. menschliche Zellen, Affen
zellen, Mauszellen und chinesische Hamster-Eierstockzellen
(Chinese hamster ovary; CHO), da in diesen Zellen in der
Regel eine korrekte posttranslationelle Modifikation statt
findet, die Proteine sich in korrekter Weise falten, eine
korrekte Ausbildung von Disulfidbindungen erfolgt, wie auch
eine korrekte Glycosylierung. Weitere geeignete Zellen sind
Hefezellen und Insektenzellen. Um eine Selektion in den
Wirtszellen zu ermöglichen, können die Expressionsvektoren
geeignete Selektionsmarkergene enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Proteine, die
von einer der erfindungsgemäßen DNAs exprimiert werden. Es
handelt sich somit also unter anderem um Proteine, die in
der Lage sind, bei der ischämischen Präkonditionierung,
insbesondere der ischämischen Präkonditionierung des Herzens
mitzuwirken, und die von
einer DNA-Sequenz, ausgewählt aus (a) einer der Sequenzen
gemäß SEQ ID NO: 1, NO: 3, NO: 4, NO: 5 oder dem jeweils kom
plementären Strang dazu, (b) einer DNA-Sequenz, die mit ei
ner der Sequenzen unter (a) oder Fragmenten davon unter
stringenten Bedingungen hybridisieren kann, oder (c) einer
DNA, die lediglich aufgrund der Degeneriertheit des geneti
schen Codes nicht befähigt ist, unter stringenten Bedingun
gen mit einer unter (a) definierten Sequenz zu hybridisie
ren, codiert werden. Ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes
Protein ist das von der cDNA mit der Nucleinsäuresequenz
gemäß SEQ ID NO: 1 abgeleitete Protein mit der Aminosäurese
quenz gemäß SEQ ID NO: 2. Dieses Protein wird in dieser An
meldung manchmal als gp67 bezeichnet. Das entsprechende Gen
wird bevorzugt in Herz exprimiert, das durch Ischämie/Per
fusion in Streß versetzt wurde.
Dieses Protein enthält 608 Aminosäuren mit einem berechne
ten Molekulargewicht von etwa 67 kd. Das Protein enthält
zwei N-gebundene Glucosylierungsstellen. Da die Kodonse
quenz für die N-gekoppelte Glycosylierung ein Tripeptid der
Sequenz NXS/T aufweist (wobei X jede Aminosäure außer Pro
lin ist), sind die Aminosäuresequenzen NRS von Aminosäure
rest 221-223 und NNS von 469 bis 471 zwei mögliche N-ge
koppelte Glycosylierungsstellen. (In dieser Anmeldung sind
die Aminosäuren z. T. unter Bezugnahme auf den Ein-Buchsta
ben-Code bezeichnet.) Zusätzlich enthält die Sequenz eine
mögliche cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinase-Phosphory
lierungsstelle (Konsensussequenz: R/K(2)-X-S/T), acht mög
liche Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstellen (Konsensus
sequenz: S/T-X-R/K), zehn mögliche Caseinkinase-II-Phospho
rylierungsstellen (Konsensussequenz: S/T-X-X-D/E) und zwei
mögliche N-Myristylierungsstellen [Konsensussequenz: G-X
(wobei X jede Aminosäure mit Ausnahme von E oder D, R, K,
H, P, F, Y, W ist)-X-X-S/T/A/G/C/N-X (jede Aminosäure außer
P)]. Das Protein weist keine wesentliche Homologie zu ir
gendeinem bekannten Protein auf. Das Molekül weist außerdem
mögliche ATP/GTP-Bindungsstellen auf. Hierbei handelt es
sich um die Sequenzmotive AGLSTMKT und AARLERKT, die eine
signifikante Ähnlichkeit zu dem ATP/GTP-P-Loop-Motiv der
allgemeinen Sequenz A/GXXXXGKS/T haben. Zudem besitzt das
Protein außer dem P-Loop-Motiv auch die Kernsequenz DXXG
der G3-Region, die bei allen GTPasen konserviert ist. So
findet sich die Aminosäuresequenz DMRG an den Positionen
457-460. Da die Hydrophilizitätsberechnung der 608 Amino
säuren zeigt, daß das Polypeptid vollständig hydrophil zu
sein scheint und keinen langen hydrophoben Abschnitt auf
weist, wodurch der Schluß naheliegt, daß dieses Protein
wahrscheinlich kein Transmembranprotein ist. Der vorher be
rechnete isoelektrische Punkt des Proteins beträgt 6,74.
Aufgrund dieser Sequenzmotive kann davon ausgegangen wer
den, daß das Protein mit der SEQ ID NO: 2 eine Rolle bei Re
paraturprozessen, insbesondere bei der DNA-Reparatur,
spielt.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Protein, das eine
Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, sowie ein Mu
tein, ein fusioniertes Protein oder ein funktionelles Deri
vat der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 2 sowie ein
Protein, das einen Teil der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID
NO: 2 aufweist, oder ein Mutein davon, wobei die erfindungs
gemäßen Proteine in der Lage sind, bei der ischämischen Prä
konditionierung, insbesondere bei der ischämischen Präkondi
tionierung des Herzens mitzuwirken. Die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID NO: 2 ist dabei von der Nucleinsäuresequenz ge
mäß SEQ ID NO: 1 abgeleitet. Daneben betrifft die Erfindung
alle DNAs, die für die erfindungsgemäßen Proteine kodieren.
Muteine in der hier verwendeten Bedeutung bezieht sich auf
Analoga der SEQ ID NO: 2, bei denen
- a) eine oder mehrere Aminosäuren durch andere Aminosäu ren ersetzt wurden, und/oder
- b) eine oder mehrere Aminosäuren deletiert wurden, und/oder
- c) eine oder mehrere Aminosäuren der Sequenz hinzuad diert wurden.
Insbesondere erfaßt die Erfindung derartige Proteine, Mu
teine, fusionierte Proteine, funktionelle Derivate oder
Proteine, die einen Teil der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID
NO: 2 aufweisen, die noch in der Lage sind, bei der ischämi
schen Präkonditionierung mitzuwirken. Derartige Muteine
können nach bekannten Verfahren und/oder durch ortsspezifi
sche Mutageneseverfahren oder andere bekannte Techniken
hergestellt werden. Ein derartiges Mutein hat vorzugsweise
eine Aminosäuresequenz, die insoweit verändert wurde, daß
die Funktion des entsprechenden Proteins noch aufrechter
halten werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
besitzt ein derartiges Mutein eine wenigstens 40%ige Iden
tität oder Homologie in bezug auf die Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 2. Bevorzugter beträgt die Homologie wenigstens 50%, we
nigstens 60%, wenigstens 70%, wenigstens 80% oder am bevor
zugtesten wenigstens 90%. Bevorzugte Aminosäureaustausche
in den Muteinen sind sogenannte "konservative Substitutio
nen". Diese schließen synonyme Aminosäuren-Substitutionen
innerhalb einer Gruppe ein, die ausreichend ähnliche physi
kochemische Eigenschaften haben, so daß die Substitution
zwischen Mitgliedern der Gruppe die biologische Funktion
des Moleküls aufrechterhalten läßt. Beispiele für bevorzug
te Gruppen synonymer Aminosäuren sind in der folgenden Ta
belle 1 gezeigt:
Ebenso können Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren
vorgenommen werden, ohne daß die Funktion des Proteins ver
ändert wird. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die
Insertionen oder Deletionen lediglich einige wenige Amino
säuren, z. B. weniger als 100, umfassen, vorzugsweise weni
ger als 50, bevorzugter weniger als 25, besonders bevorzugt
weniger als 10, und dabei nicht Aminosäuren ausgetauscht
werden, die für die Funktion kritisch sind, wie die oben
beschriebenen cAMP-cGMP-abhängigen Proteinkinase-Phosphory
lierungsstellen. Beispiele zur Herstellung von Aminosäure
substitution in den erfindungsgemäßen Proteinen sind in den
US-Patenten 4,959,314, 4,588,585 und 4,737,462 beschrieben.
Der Begriff "fusioniertes Protein" bezieht sich auf Poly
peptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 auf
weisen, oder Muteine davon, die mit einem anderen Protein
oder mit einem Peptid fusioniert sind. Als Peptide kommen
beispielsweise sogenannte TAGs in Frage, mit denen bei
spielsweise die Aufreinigung des Proteins erleichert ist,
wie z. B. ein HIS-TAG (Quiagen, Deutschland) oder kurze Pep
tide, die Epitope enthalten, über die ein Nachweis oder ei
ne Reinigung des Fusionsproteins mit entsprechenden Anti
körpern möglich ist. Als anderes Protein kommen beliebige
Proteine in Frage, beispielsweise Proteine, mit denen die
Verweildauer in Körperflüssigkeiten erhöht werden kann. Un
ter den Begriff fusionierte Proteine fallen im weiteren
auch erfindungsgemäße Proteine, die mit anderen chemischen
Verbindungen fusioniert wurden, wie z. B. mit Polyethylen
glykol (PEG). Auf diese Art und Weise kann die Verweildauer
in Körperflüssigkeiten ebenfalls erhöht werden.
Unter dem Begriff "funktionelle Derivate" der Proteinse
quenzen der SEQ ID NO: 2, der entsprechenden fusionierten
Proteine oder der entsprechenden Muteine sollen Derivate
verstanden werden, die z. B. dadurch hergestellt werden kön
nen, daß die funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenket
ten oder die N- oder C-terminalen Gruppen modifiziert wer
den. Funktionelle Derivate dieser Art sind ebenfalls Gegen
stand dieser Erfindung, so lange durch die Derivatisierung
die biologische Aktivität der Proteine nicht zerstört wird
und so lange durch die Modifikationen keine toxischen Pro
teine entstehen. Derartige Derivate können z. B. die Ami
nosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, Muteine oder fusionierte
Proteine davon sein, die mit Polyethylenseitenketten modi
fiziert wurden, wodurch beispielsweise antigene Epitope
maskiert werden können, wodurch die Verweilzeit des ent
sprechend modifizierten Polypeptids in Körperflüssigkeiten
erhöht werden kann. Andere Derivate schließen aliphatische
Ester von Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen (durch
Umsetzung mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären
Aminen), N-Acylderivate, freie Aminogruppen der Aminosäure
reste, die mit Acylgruppen gebildet wurden (z. B. Alkanoyl
oder carbocyclische Aroylgruppen), oder O-Acylderivate
freier Hydroxylgruppen, die mit mit Acylgruppen gebildet
wurden (z. B. Derivate der Seryl- oder Treonylreste), ein.
Die oben gegebenen Definitionen für Muteine, fusionierte
Proteine und funktionelle Derivate ist so zu verstehen, daß
in einem Molekül gleichzeitig mehrere Modifikationen im
Vergleich zu der ursprünglichen Sequenz gemäß der SEQ ID
NO: 2 auftreten können. So ist es beispielsweise möglich,
daß ein Protein an manchen Aminosäurepositionen deletiert
ist, daß an anderer Stelle eine oder mehrere Aminosäuren
gegen andere Aminosäuren ausgetauscht wurden, daß ein oder
mehrere zusätzliche Aminosäuren hinzugefügt wurden und ein
derartiges Molekül mit einem zweiten Protein fusioniert
wurde. Derartige, für den Fachmann offensichtliche Modifi
kationen der ursprünglichen Aminosäuresequenz sind eben
falls Gegenstand dieser Erfindung.
Unter einem Protein, daß einen Teil der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO: 2 aufweist, sollen Proteine oder Peptide ver
standen werden, die wenigstens einen kontinuierlichen Ab
schnitt von 10% der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 be
sitzen. Bevorzugt sind Proteine, die mehr als 40%, bevor
zugter sind Proteine, die mehr als 60%, und besonders be
vorzugt sind Proteine, die mehr als 80% der Aminosäurese
quenz der SEQ ID NO: 2 in kontinuierlicher Sequenz aufwei
sen. Muteine dieser so definierten Proteine sind ebenfalls
Gegenstand der Erfindung, das heißt also, Proteine, die wie
oben definiert, beispielsweise Substitutionen, Additionen
oder weitere Deletionen der wie gerade definierten Amino
säuresequenz aufweisen können.
Die erfindungsgemäßen Proteine sind bevorzugt Proteine, die
bei der ischämischen Präkonditionierung, insbesondere der
ischämischen Präkonditionierung des Herzens, eine Rolle
spielen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung eines wie oben definierten Proteins. Hierzu
wird der Fachmann mittels Verfahren, die auf dem Fachgebiet
üblich sind, zunächst eine DNA herstellen, die für das ge
wünschte Protein mit der gewünschten Aminosäuresequenz ko
diert. Diese DNA wird, basierend auf gängigen Methoden, in
einen geeigneten, wie oben definierten Expressionsvektor
insertiert, der wiederum in eine geeignete Wirtszelle ein
geführt wird. Diese Wirtszelle wird nun unter geeigneten
Kultivierungsbedingungen kultiviert, so daß die Expression
des Proteins ermöglicht wird. Zur Expression des Proteins
kann die DNA-Sequenz und dadurch auch die Proteinsequenz so
modifiziert werden, daß das Protein durch Anfügen eines Si
gnalpeptids in das Medium sekretiert wird. In diesem Fall
kann die Isolierung des Proteins aus dem Medium erfolgen.
Wird ein derartiges Sekretierungssignal nicht an die Pro
teinsequenz angefügt, so wird das Protein im Zellinneren
akkumulieren. In diesem Fall wird der Fachmann mittels gän
giger Verfahren eine Isolierung des Proteins aus der be
treffenden Wirtszelle vornehmen. Verfahren zur Reinigung
des Proteins sind dem Fachmann bekannt und schließen chro
matographische Trennschritte (Anionenchromatographie, re
verse Phasenchromatographie etc.), Gelfiltration, elektro
phoretische Auftrennungen, Ammoniumsulfatfällungen, Dialy
se, Affinitätschromatographie etc. ein.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Antikörper gegen
die oben definierten erfindungsgemäßen Proteine. Der Be
griff "Antikörper" schließt polyklonale Antikörper, mono
klonale Antikörper, chimäre Antikörper, anti-idiotypische
Antikörper gegen Antikörper ein. Die Antikörper können ent
weder vollständige Moleküle oder Antikörperfragmente, wie
beispielsweise das Fab-Fragment sein.
Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von An
tikörpermolekülen, die aus den Seren von Tieren gewonnen
werden können, die mit einem Antigen immunisiert wurden.
Ein monoklonaler Antikörper besteht aus einer im wesentli
chen homogenen Population von Antikörpern, die für ein An
tigen spezifisch sind, wobei die Population im wesentlichen
identische Epitopbindungsstellen aufweist. Monoklonale An
tikörper und polyklonale Antikörper können nach dem Fach
mann bekannten Verfahren gewonnen werden. In bezug auf
monoklonale Antikörper siehe z. B. Kohler und Millstein, Na
ture 256: 495-497 (1975) und US-Patent Nr. 4,376,110. Anti
körper können von jeder Immunglobulinklasse einschließlich
IgG, IgM, IgE, IgA oder irgendeiner Subklasse davon sein.
Ein Anti-Idiotyp-Antikörper ist ein Antikörper, der Deter
minanten erkennt, die mit der Antigenbindungsstelle eines
Antikörpers assoziiert sind. Ein Anti-Idiotyp-Antikörper
kann durch Immunisierungs eines Tieres der gleichen Art und
des gleichen genetischen Typs (z. B. Mausstamm) wie die
Quelle des monoklonalen Antikörpers mit dem monoklonalen
Antikörper gegen den der Anti-Idiotyp-Antikörper gebildet
werden soll, hergestellt werden. Das immunisierte Tier wird
gegen den monoklonalen Antikörper einen Antikörper bilden,
der gegen die idiotypischen Determinanten des monoklonalen
Antikörpers gerichtet ist. In diesem Zusammenhang wird auf
das US-Patent Nr. 4,699,880 verwiesen. Beispiele für Anti
körperfragmente sind, wie bereits erwähnt, das Fab- und das
F(ab')-Fragment, die in der Lage sind, Antigene zu binden.
Den Fab- bzw. F(ab')-Fragmenten fehlt der Fc-Fragmentteil
des intakten Antikörpers. Die erfindungsgemäßen Antikörper
einschließlich der Antikörperfragmente können verwendet
werden, um in quantitativer oder qualitativer Weise die wie
oben definierten Proteine nachzuweisen. Bevorzugt können
die Antikörper z. B. verwendet werden, um die Expression,
d. h. die Bildung eines Proteins gemäß der SEQ ID NO: 2, in
Zellen nachzuweisen. Ein derartiger Nachweis kann durch Im
munfluoreszenzverfahren unter Verwendung eines fluoreszenz
markierten Antikörpers, verbunden mit Lichtmikroskopie,
Flußzytometrie oder fluorometrischem Nachweis, erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können somit auch histolo
gisch, beispielsweise in der Immunfluoreszenz oder in der
Immunelektronenmikroskopie, zum in-situ-Nachweis eines wie
oben definierten Proteins usw. verwendet werden. Der in
situ-Nachweis kann durch Entnahme einer Probe des betref
fenden Gewebes aus einem Patienten und Verwendung eines
markierten proteinspezifischen Antikörpers erfolgen. Auf
diese Weise kann nicht nur das Vorhandensein eines wie oben
definierten Proteins oder verwandter Proteine, sondern auch
die Verteilung des Proteins in untersuchtem Gewebe bestimmt
werden. Derartige histologische Assays umfassen die Inkuba
tion einer biologischen Probe, wie z. B. einer biologischen
Flüssigkeit, eines Gewebeextraktes, frisch geernteter Zel
len oder Zellen, die in Zellkultur inkubiert wurden, in Ge
genwart eines Antikörpers, der an die entsprechenden Pro
teine bindet, gefolgt von dem Nachweis des gebundenen Anti
körpers mit einem weiteren markierten Antikörper. Alterna
tiv ist es auch möglich, daß der erste Antikörper bereits
markiert ist, so daß er direkt nachgewiesen werden kann.
Die Antikörper können weiterhin verwendet werden, um Pro
teine in einem Proteinextrakt nachzuweisen. Derartige Ver
fahren, wie z. B. die Western-Blot-Verfahren, sind dem Fach
mann bekannt.
Eine weitere erfindungsgemäße Anwendung des Antikörpers
sind Assays, insbesondere enzymgebundene Immunoassays
(ELISA). In diesem Fall wird das Protein in einem in-vitro-
Testsystem so nachgewiesen, daß es entweder direkt mit ei
nem Antikörper umgesetzt wird, an den ein Enzym gebunden
wird; alternativ kann das Protein mit einem ersten Antikör
per umgesetzt werden, der wiederum mit einem zweiten Anti
körper, an den ein entsprechendes Enzym gebunden wurde, um
gesetzt wird. Wenn der so gebildete Komplex mit einem ge
eigneten Substrat umgesetzt wird, so kann das Enzym dieses
Substrats so umsetzen, daß ein nachweisbares Reaktionspro
dukt entsteht, das beispielsweise durch Photometrie, Fluo
rometrie oder durch ein sonstiges optisches Verfahren nach
gewiesen werden kann. Beispiele für derartige Enzyme sind
die Mallatdehydrogenase, die Alkoholdehydrogenase, die
Meerrettichperoxidase, die alkalische Phosphatase usw. An
dere üblicherweise verwendete Nachweisverfahren unter Ver
wendung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern sind
ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Zudem können Antikörper
verwendet werden, um die Proteine, gegen die sie gerichtet
sind, zu reinigen bzw. zu isolieren. Dem Fachmann sind dem
entsprechende Affinitätschromatographische Verfahren be
kannt.
Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammen
setzungen, die ein wie oben definiertes Protein umfassen.
Da die wie oben definierten Proteine eine Rolle bei der
ischämischen Präkonditionierung spielen, können sie geeig
net sein, nach Verabreichung in einen Patienten dessen In
farktrisiko zu senken. Die erfindungsgemäßen pharmazeuti
schen Zusammensetzungen können einen pharmazeutisch annehm
baren Träger enthalten. Eine Verabreichung kann auf belie
bigem Wege erfolgen, beispielsweise intramuskulär, intrave
nös, subkutan, oral oder mittels Suppositorien. Die erfin
dungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden zur
Verabreichung durch Mischen eines erfindungsgemäßen Pro
teins oder eines Derivates davon mit physiologisch annehm
baren Trägern oder Stabilisatoren und/oder Exzipienten her
gestellt und in Dosisform, z. B. durch Lyophilisierung in
Dosierungsgefäßen, hergestellt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein wie oben de
finiertes Protein zur Verwendung als Arzneimittel. Diese
Proteine können beispielsweise zur Herstellung einer Zusam
mensetzung zur Prävention von Herzinfarkten oder örtlichen
kontraktilen Dysfunktionen verwendet werden.
Das Plasmid pBlue-gp67 in E. coli wurde am 05.11.1998 bei
der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland,
unter der Nummer DSM 12473 hinterlegt. Dieses Plasmid ent
hält als Basisvektor das Plasmid pBlueskript SK (Strata
gene, Heidelberg, Deutschland) und ein 3,5 Kbp EcoRI-XhoI-
Insert, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfaßt.
Die Erfindung wird im weiteren durch die folgenden, in kei
ner Weise einschränkenden Beispiele und Figuren erläutert.
Fig. 1: Putative Aminosäuresequenz des gp67-Proteins (SEQ
ID NO: 2), das durch Analyse des Leserahmens der SEQ ID NO: 1
abgeleitet wurde
A). Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist im Einbuchstaben
code angegeben. Die angenommenen ATP-GTP-Bindungsstellen
sind unterstrichen. Die möglichen N-gebundenen Glucosylie
rungsstellen (NXS/T) sind durch Fettdruck hervorgehoben.
B). Hydrophylizitätsplot der abgeleiteten Aminosäuresequenz
des erwarteten gp67-Proteins. Hydrophobe Regionen befinden
sich unterhalb der in der Mitte befindlichen waagerechten
Linie, während hydrophile Bereiche darüber liegen. Der Plot
wurde mit einem Fenster von sieben Aminosäuren [nach dem
Verfahren von Kyte, J. and Doolittle, R. F., J. Mol. Biol.
157: 105-132 (1982)] ermittelt.
Fig. 2: Analyse der Expression des SEQ ID NO: 1 entspre
chenden Gens ("gp67-Gen") durch Northern-Blot-Experimente
A). Expression des gp67-Gens in ischämischem reperfundier
tem oder nicht-ischämischem Schweinemyokard nach 10 Minuten
Ischämie durch Verschluß der linken, vorderen absteigenden
Koronararterie, gefolgt von 30 Minuten Reperfusion und er
neutem Verschluß während 10 Minuten (10'-30'-10') bzw. in
Kontrollgewebe ("sham"). Als Sonde bei diesem Northern-
Blot-Experiment wurde ein radioaktives Fragment aus der Se
quenz gemäß SEQ ID NO: 1 verwendet. C: Nichtischämisches
Kontrollgewebe. E: ischämisches/Reperfusions-Experimental
gewebe. B). Die balkengraphische Darstellung zeigt die sta
tistische Analyse der gp67-Genexpression. Die Daten sind
als Mittelwert und Standardabweichung angegeben. C: Nicht
ischämisches Kontrollgewebe. E: ischämisches/Reperfusions-
Experimentalgewebe. C). Northern-Blot-Analyse, die die Ge
websverteilung von gp67-mRNA in Schweineorganen (Herz, Le
ber, Lunge, Niere, Milz, Darm, Hirn und Skelettmuskulatur)
zeigt.
Fig. 3: Evolutionäre Konservierung des gp67-Gens
Genomische DNA, die aus dem Menschen (1), dem Schwein (2),
dem Kaninchen (3) und der Maus (4) gewonnen wurde, wurde
mit dem Enzym EcoRI (A) oder PstI (B) gespalten, dann auf
ene Nylonmembran transferiert und mit dem EcoRV/NdeI-cDNA-
Fragment aus SEQ ID NO: 1, enthaltend die gesamte kodierende
Sequenz des gp67-Gens, hybridisiert. Die Filter wurden zu
letzt in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 60°C während 40 min gewa
schen. Marker: Lambda-DNA, mit den Enzymen EcoRI und Hindl-
II gespalten.
Fig. 4: Bestätigung der differentiellen Expression der Ge
ne, die den cDNAs der SEQ ID NO: 3 und NO: 4 entsprechen
A). Northern-Hybridisierung, die die Expression der Gene
zeigt, die den SEQ ID NO: 3 ("W12") und NO: 4 ("W28") ent
sprechen, in ischämischem reperfundiertem oder nicht-ischä
mischem Schweinemyokard nach 10 Minuten Ischämie durch Ver
schluß der linken, vorderen absteigenden Koronararterie,
gefolgt von 30 Minuten Reperfusion und erneutem Verschluß
während 10 Minuten ("10'-30'-10'"), ebenso wie in Kontroll
geweben ("sham"). C: nicht-ischämisches Kontrollgewebe. E:
ischämisches/Reperfusions-Experimentalgewebe. Hinweis: Die
schwachen Banden über den spezifischen Banden, die SEQ ID
NO: 4 entsprechen ("W28"), sind Kreuz-Hybridisierungsbanden
mit der 18S-rRNA. B). Statistische Analyse der Genexpressi
on der Gene, die den SEQ ID NO: 3 und NO: 4 entsprechen. Im
Vergleich mit nicht-ischämischem Myokard war die Expression
der Gene, die den SEQ ID NO: 3 und NO: 4 entsprechen, in
ischämischem reperfundiertem Myokard in hohem Maße erhöht.
Als radioaktive Sonde wurde ein Fragment aus SEQ ID NO: 3
("W12") bzw. SEQ ID NO: 4 ("W28") verwendet.
Fig. 5: Northern-Blot-Analyse, die die Expression der Ge
ne, die den SEQ ID NO: 3 und NO: 4 entsprechen, in Organen
des Schweines zeigt. RNA wurde aus dem Herz-, Leber-, Lun
ge-, Nieren-, Milz-, Darm-, Hirn- und Skelettmuskelgewebe
isoliert, geblotted und mit den cDNA-Fragmenten der SEQ ID
NO: 3 ("W12") bzw. NO: 4 ("W28") hybridisiert. Hinweis: Die
Banden über den spezifischen Banden sind Kreuz-Hybridisie
rungsbanden mit 185-rRNA.
Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der
American Physiological Society gehalten. Kastrierte männli
che deutsche Hausschweine vom Landrassentyp mit einem Ge
wicht von 21-39 kg wurden mit Azaperon (2 mg/kg i. m.) se
diert und mit Pentobarbiton (30 mg/kg i. v.) anästhesiert.
Nach einer Luftröhrenintubation wurde der Thorax mittels
einer Mittenlinien-Thorakotomie eröffnet. Nach 30 Minuten
Stabilisierung nach der Operation wurde die linke vordere
absteigende Koronararterie (LAD) während 10 Minuten ver
schlossen (Okklusion) - beispielsweise durch Abbinden des
Gefäßes - gefolgt von 30 min Reperfusion, gefolgt von einem
erneuten Verschluß während 10 Minuten. Die Schweine wurden
unmittelbar nach der zweiten Okklusion (Zeitpunkt: 10'-30'-
10') oder nach 30 min (Zeitpunkt: 10'-30'-10'-30') bzw. 90 min
(Zeitpunkt: 10'-30'-10'-90') Reperfusion getötet. Kon
trolloperierte Tiere wurden ohne Verschluß getötet. Experi
mentelles Gewebe wurde von dem LAD-Bereich und von Kon
trollgewebe aus dem Bereich des linken Zirkumflex-Herzarte
rienbereichs entnommen.
Gesamt-RNA wurde durch das Guanidin-Isothiocyanatverfahren
isoliert. Um kontaminierende DNA zu entfernen, wurden 50 µg
Gesamt-RNA bei 37°C während 30 min mit 10 Einheiten
rmasin-RNase-Inhibitor (Promega, Heidelberg, Deutschland,
40 E/µl), 10 Einheiten RQI-RNase-freie DNase (Promega,
1 E/µl) in 1 × PCR-Puffer II (Perkin-Elmer), 1,5 mM MgCl2
gespalten und dann mit Phenol : Chloroform (3 : 1) extrahiert
und in Gegenwart von 0,3 M NaOAc mit Ethanol präzipitiert.
Das Pellet wurde in Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem
Wasser aufgelöst.
Das Verfahren des Differential Displays wurde eingesetzt,
um Gene zu identifizieren, die als Folge eines koronaren
Verschlusses verstärkt exprimiert werden bzw. sogar indu
ziert werden. Dazu wurde RNA aus Herzgewebe isoliert, das,
wie in Beispiel 1 beschrieben, einer koronaren Okklusion
unterzogen wurde und mit RNA von Kontrollgewebe verglichen,
das keinerlei Okklusion unterzogen wurde.
mRNA-Differential Display wurde in zwei parallelen Ansätzen
unter Verwendung des Gene ExScreen Primer Kits (BIOMETRA
GmbH, Deutschland) durchgeführt. Es wurden 2 µl gereinigte
Gesamt-RNA (100 ng/µl) bei 70°C während 10 min mit 2 µl
"Downstream Primer" (25 µM) und 3,5 µl DEPC-behandeltem
Wasser denaturiert. Das Röhrchen wurde sofort auf Eis gege
ben, und es wurden 4 µl dNTP-Gemisch (jeweils 100 µM), 4 µl
5 × Puffer für der ersten Strang (mit dem Superscript-II-
Enzym, Life Technologies, Deutschland geliefert), 2 µl DTT
(0,1 M), 0,5 µl rRNasin-RNase-Inhibitor zugegeben und bei
Raumtemperatur während 3 min stehengelassen, bevor 2 µl Su
perscript-reverse Transkriptase (Life Technologies, 200
E/µl) zugegeben wurden. Nach 8 min Inkubation bei Raumtem
peratur wurde die reverse Transkription bei 35°C während
einer Stunde durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Erhit
zen bei 95°C während 5 min beendet, auf Eis zur sofortigen
PCR-Amplifikation gegeben oder bei -20°C gelagert. Die PCR-
Amplifikation (DDRT-PCR) wurde durch Herstellung eines Ma
stermixes vorbereitet. Für jedes Primerset wurden 20 µl
PCR-Gemisch, enthaltend 1/10 Volumen Erststrang cDNA, 2,5
µM Downstream-Primer, der in der reversen Transkription
verwendet wurde, 0,5 µM Upstream-Primer, 2 µM dNTP-Gemisch,
10 µCi 35S-dATP (Amersham, Braunschweig, Deutschland, 10
mCi/ml) unter Verwendung eines GeneAmpl-PCR-Systems 9600
(Perkin-Elmer, Deutschland) amplifiziert. Die Reaktion be
gann mit einer initialen Denaturierung bei 95°C während 2 min.
gefolgt von 40 Runden bei 94°C während 30 s, 40°C wäh
rend 1 min. 72°C während 30 s und einer zusätzlichen Exten
sionsphase von 5 min bei 72°C. Nach der Amplifikation wur
den 3,5 µl PCR-Produkt mit 2 µl Auftragspuffer (25% Glyce
rin, 0,5% Bromphenol-Blau, 0,5% Xylencyanol) gemischt und
durch Elektrophorese auf einem 6%igen nativen Polyacryl
amidgel in 1 × TBE-Puffer bei 60 W konstanter Leistung wäh
rend 2,5 Stunden aufgetrennt. Das Gel wurde auf ein Stück
3-mm-Papier übertragen, ohne Fixierung getrocknet, und da
mit wurde ein Röntgenfilm während drei Tagen bei Raumtempe
ratur belichtet.
Nach Entwicklung des Films und Auflegen in korrekter Lage
auf das Gel wurden cDNA-Banden von Genen, die in differen
tieller Weise exprimiert wurden, identifiziert. Hierzu wur
de das Expressionsmuster von Ansätzen aus Gewebe, das einem
Verschluß unterzogen wurde, mit dem von Ansätzen vergli
chen, das aus Gewebe stammt, welches keinem Verschluß un
terzogen wurde. Die Experimente wurden grundsätzlich minde
stens zweimal unabhängig durchgeführt. Die Banden, die auf
differentiell exprimierte Gene hinweisen, wurden mit Nadel
stichen markiert und die Gelstücke ausgeschnitten. Das Gel
stück wurde zusammen mit dem 3-mm-Papier während 15 min in
einem dicht verschlossenen Mikrozentrifugenröhrchen nach
Hydratisierung während 10 min bei Raumtemperatur in 100 µl
destilliertem Wasser gekocht. Die cDNA-Fragmente wurden
durch Ethanolfällung in Gegenwart von 0,3 M NaOAc, 50 µg
Glycogen gefällt und in 10 µl destilliertem Wasser aufge
löst. 4 µl eluierte DNA in einem Reaktionsvolumen von 40 µl
wurde unter Verwendung des gleichen Primersets erneut am
plifiziert; die PCR-Bedingungen waren wie zuvor beschrie
ben, mit der Ausnahme, daß die Konzentration des Downstre
am- und des Upstream-Primers 1,0 µM bzw. 0,5 µM betrug und
daß 200 µM eines jeden dNTPs eingesetzt wurden und kein
Isotop zugegeben wurde. Die entstandenen PCR-Produkte wur
den in pCR-Script-Amp-SK-(+)-Vektor entsprechend den Anga
ben des Herstellers (Stratagene, Heidelberg, Deutschland)
kloniert. Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung eines
AutoRead-Sequenzierungskits und des ALF-automatischen Se
quenziergerätes (Pharmacia, Freiburg, Deutschland). Die Se
quenz wurde durch Computeranalyse analysiert und mit der
EMBL-DNA-Datenbank unter Verwendung des FASTA-Programms
verglichen. Auf diese Weise wurden die Sequenzen der SEQ ID
NO: 3, NO: 4, NO: 5 und NO: 6 identifiziert. Diese weisen keine
bzw. keine signifikante Homologie zu irgendwelchen bekann
ten Genen auf. SEQ ID NO: 4 und NO: 5 sind Teilsequenzen ei
ner vollständigen cDNA-Sequenz.
Durch das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren des Diffe
rential Displays werden cDNAs gewonnen, die Genen entspre
chen, die in dem analysierten Gewebe in bevorzugter Weise
exprimiert werden. Die auf diese Weise gewonnene cDNA-Se
quenzen entsprechen allerdings meist nicht der vollständi
gen mRNA, und somit ist auch auf diese Weise in der Regel
nicht die vollständige kodierende Sequenz des korrespondie
renden Gens zu identifizieren. Zum Gewinnen der vollständi
gen kodierenden Sequenz sollte daher eine Durchmusterung
einer cDNA-Genbank erfolgen. Zum Durchmustern einer cDNA-
Genbank wurde eine DNA mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß
SEQ ID NO: 6 mittels der Folymerase-Kettenreaktion amplifi
ziert und gleichzeitig markiert. 25 µl eines Gemisches,
enthaltend 1 × PCR-Puffer (Perkin-Elmer, Deutschland),
200 µM dNTP (ohne dCTP), 2 mM MgCl2, jeweils 25 µmol eines jeden
Primers, 20 ng Matrizen-cDNA-Fragment, 0,5 µl Ampli-Taq-
DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, 5 E/µl) und 5 µl α32P dCTP
(Amersham, 10 mCi/ml) wurden bei 94°C während 5 min. ge
folgt von 30 Runden bei 94°C (45 s), 52°C (45 s), 72°C (1
min) amplifiziert. Im Anschluß daran erfolgte noch eine Ex
tensionszeit von 10 min bei dem letzten Zyklus. Nach der
Amplifikation wurden nicht-eingebaute Nucleotide und Primer
im Überschuß durch Ethanolfällung in Gegenwart von 4 M Am
moniumacetat entfernt. Eine Schweineherz-cDNA-Genbank in
Uni-ZAP XR (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) wurde un
ter Verwendung der wie oben markierten Sonde durchgemu
stert. Etwa 4,4 × 105 pfu ("Plaque bildende Einheiten") wur
den auf Filter transferiert, die in 50% Formamid, 5 × SSC,
5 × Denhart-Lösung, 1% SDS, 100 µg/ml denaturierter Lachs
sperma-DNA und denaturierter Sonde bei 42°C über Nacht hy
bridisiert wurden. Die Filter wurden zweimal während 15 min
in 2 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen und dann
15 min in 0,2 × SSC, 0,1% SDS zuerst bei 42°C und dann er
neut während 15 min bei 55°C gewaschen. Zuletzt wurde zwei
mal in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 68°C während einer Stunde ge
waschen (hierbei handelt es sich um stringente Hybridisie
rungsbedingungen). Die Filter wurden zur Exposition eines
Röntgenfilms bei -80°C mit einer Belichtungsdauer von
12-18 h verwendet. Positive Klone wurden gepickt und bis zur
Reinheit erneut durchgemustert. Das Herausschneiden des
pBlueskript-Phagemids aus dem Uni-Zap XR-Vektor erfolgte
nach den Angaben des Herstellers. Das ausgeschnittene Plas
mid wurde als pBluegp67 bezeichnet. Die DNA wurde wie oben
beschrieben sequenziert, und die Sequenzdaten wurden erneut
unter Verwendung des FASTA-Programms mit der EMBL-Datenbank
verglichen.
Bei diesem Experiment wurde zu einem mittels Differential
Display aufgefundenen kurzen cDNA-Fragment mit der Nuclein
säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 die entsprechende vollstän
dige cDNA-Sequenz erhalten. Diese cDNA-Sequenz ist die SEQ
ID NO: 1, die in dem Plasmid pBluegp67 enthalten ist. Die
daraus abgeleitete Proteinsequenz ist als SEQ ID NO: 2 ge
zeigt.
Identische Mengen von Gesamt-RNA (20 µg) wurden auf einem
1%-Agarosegel, das 0,6 M Formaldehyd enthält, elektrophore
tisch aufgetrennt. Nach der Größenfraktionierung wurde die
RNA auf eine Hybond-N-Nylonmembran (Amersham) mit einer
20 × SSC-Lösung durch Kapillartransfer geblottet und durch UV-
Crosslinking immobilisiert (Stratagene). Die Hybridisierung
wurde über Nacht bei 42°C mit α-32P-markierten Sonden (Read
prime DNA Labeling System, Amersham, und α-32P-dCTP,
3000 Ci/mMol, Amersham) in einem Puffer durchgeführt, der 50%
Formamid, 1 × P Puffer (5 × P Puffer: 1% BSA, 1% PVP, 1%
Ficoll, 250 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5% Na-Pyrophosphat, 5%
SDS), 5% Dextransulfat, 1 M NaCl und 100 mg/ml denaturierte
Lachssperma-DNA enthält. Die Membranfilter wurden dann
zweimal in 2 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur während
20 min hybridisiert, gefolgt von zwei Waschungen jeweils wäh
rend 10 min in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur, bei
42°C bzw. 56°C. Die Filter wurden verwendet, um einen Rönt
genfilm unter Verwendung eines verstärkenden Schirms bei
-80°C zu belichten. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel
erfolgte unter Verwendung eines Phosphorlmagers (Molecular
Dynamics) und der ImageQuant-Software, und Unterschiede,
die auf eine unterschiedliche Beladung der Spuren zurückzu
führen sind, wurden unter Verwendung eines 18S-rRNA-Sonde
normalisiert. Durch derartige Experimente konnte bestätigt
werden, daß die Expression der den SEQ ID NO: 1, NO: 3 und
NO: 4 bzw. NO: 5 entsprechenden Gene in Gewebe, das durch
Ischämie/Reperfusion gestreßt wurde, in signifikante Weise
im Vergleich zu nicht-ischämischem Myokardgewebe erhöht ist
(siehe auch Fig. 2A, B und 4). Die Expression der den
SEQ ID NO: 3 und NO: 4 bzw. NO: 5 entsprechenden Gene war um
den Faktor 2 bzw. 1,9 erhöht. Die Expression des der SEQ ID
NO: 1 entsprechenden Genes war in Schweineherzgewebe, das
durch Ischämie/Reperfusion gestreßt wurde, um den Faktor
1,7 erhöht. Durch Northern-Blot-Experimente wurde ebenfalls
überprüft, ob die den SEQ ID NO: 1, NO: 3 und NO: 4 bzw. NO: 5
entsprechenden Gene in anderen Geweben als dem durch Ischä
mie/Reperfusion gestreßten Herzen exprimiert werden (siehe
auch Fig. 2C und 5). Hierzu wurde RNA aus der Leber, der
Lunge, der Niere, der Milz, des Darms, des Hirns und des
Skelettmuskels von Schweinen isoliert und in bezug auf die
Genexpression durch Northern Blot analysiert. Dadurch wurde
gezeigt, daß die den SEQ ID NO: 1, NO: 3 und NO: 4 bzw. NO: 5
entsprechenden RNAs in allen Geweben exprimiert werden
(siehe auch Fig. 2C und 4).
Genomische DNA, die aus dem Menschen, Schweinen, Kaninchen
und Maus isoliert wurde, wurde mit den Enzymen EcoRI oder
PstI über Nacht gespalten, dann durch Elektrophorese auf
einem 0,7%-Agarosegel aufgetrennt. Die DNA-Fragmente wurden
auf eine Nylonmembran übertragen und mit dem 1,9 kb
EcoRV/NdeI cDNA-Fragment der SEQ ID NO: 1 aus dem Plasmid
pBluegp67, das die gesamte kodierende Sequenz des gp67 ent
hält, hybridisiert. Die Hybridisierung wurde in einer Lö
sung durchgeführt, die 50% Formaldehyd, 5 × SSC, 5 × Den
hardts Reagenz, 1% SDS, 100 µg/ml denaturierte Lachssperma-
DNA enthält, bei 42°C über Nacht durchgeführt. Die Membra
nen wurden unter den gleichen Bedingungen wie oben hybridi
siert, mit der Ausnahme, daß ein Endwaschschritt in 0,2 ×
SSC/0,1% SDS bei 60° während 45 min erfolgte. Durch diese
Experimente konnte gezeigt werden, daß es in allen unter
suchten Organismen zu SEQ ID NO: 1 homologe Gene gibt (siehe
auch Fig. 3). Dies ist ein Hinweis darauf, daß das Gen von
funktioneller Bedeutung ist.
Kastrierte männliche deutsche Hausschweine vom Landrassen
typ mit Körpergewichten zwischen 27,5 und 33,5 kg werden
mit 2 mg/kg Körpergewicht i. M. Azaperon (Stresnil, Janssen
Pharmazeutika, Neuss, Deutschland), und 2 mg/kg Körperge
wicht s. c. Piritramid (Dipidolor, Janssen Pharmazeutika,
Neuss, Deutschland) 30 min vor dem Beginn der Anästhesie
mit 10 mg/kg Körpergewicht Metomidate (Hypnodil, Janssen
Pharmazeutika, Neuss, Deutschland) prämediziert. Nach ent
weder oraler oder endotrachealer Intubation wird ein Bolus
von 25 mg/kg Körpergewicht α-Chloralose (Sigma, Deisen
hofen, Deutschland) intravenös gegeben. Die Anästhesie wird
durch kontinuierliche intravenöse Infusion von 25 mg/kg
Körpergewicht je Stunde α-Chloralose aufrechterhalten. Nach
weiterem Präparieren des Herzens, beispielsweise zur Mes
sung des linken Ventrikulardrucks oder des Aortablutdrucks,
wird den Tieren eine Stabilisierungsperiode von 20 min ge
währt. Die Indexischämie ist eine 60minütige Okklusion
(Verschluß) der linken vorderen absteigenden Koronararte
rie, gefolgt von einer 120minütigen Reperfusion. Kontroll
tiere erhalten eine intramyokardiale Infusion von Krebs-
Hanseleit-Puffer während 60 Minuten vor der Indexischämie.
Zum Austesten einer Mitwirkung eines Proteins bei der
ischämischen Präkonditionierung wird eine Lösung dieses
Proteins in die Testtiere ebenfalls während 60 min durch
intramyokardiale Infusion verabreicht. Nach der Vorbehand
lung mit Krebs-Hanseleit-Puffer bzw. der Lösung des zu te
stenden Proteins erfolgt die 60minütige Okklusion, gefolgt
von einer 120minütigen Reperfusion.
Am Ende dieses experimentellen Protokolls wird die linke
vordere absteigende Koronararterie erneut verschlossen, und
1 g Natriumfluorescein (Flucka, Neu-Ulm, Deutschland, in
10 ml Kochsalzlösung gelöst) wird als Bolus in das linke Atri
um injiziert. Alternativ kann in Tiere auch der DNA-Farb
stoff Propidiumiodid in das linke Atrium zusammen mit
250 mg (entspricht 1,5 Mio Kügelchen) ZnCd-fluoreszierende Mi
krosphären einer Größe von 15 µm injiziert werden. Propidi
umiodid wird lediglich von nekrotischen Zellen aufgenommen
und bindet dort an nukleäre DNA; Propidiumiodid kann die
intakte Zellmembran nichtnekrotischer Zellen nicht passie
ren; die fluoreszierenden Mikrosphären markieren den nicht
okkludierten Bereich. Die Infarktdiagnose mit Triphenylte
trazoliumchlorid (TTC) kann zusätzlich in diesen Herzen
vorgenommen werden. Nach der Gesamtverteilung des Farb
stoffs werden die Tiere durch einen intravenösen Bolus von
20% Kaliumchlorid getötet, um einen Herzstillstand zu er
zielen. Das Herz wird herausgeschnitten, und beide Atrien
und das rechte Ventrikel werden entfernt. Das linke Ventri
kel wird in Scheibchen entlang der paarweise eingeführten
Mikroinfusionsnadeln, rechtwinklig zu der linken vorderen
absteigenden Koronararterie geschnitten. Nach dem Wiegen
der Scheibchen werden die ischämischen Bereiche als nicht
fluoreszierende Bereiche durch Schwarzlichtuntersuchung
oder als nichtfluoreszierende Bereiche bei einer Anre
gungswellenlänge von 366 nm (bei Mikrosphären) identifi
ziert. Der Infarktbereich wird unter Verwendung eines TTC-
Färbeverfahrens alleine oder zusätzlich zur Propidiumiodid
fluoreszenz abgegrenzt. Wenn entweder Fluorescein-Natrium
oder Propidiumiodid durch Mikroinfusion infundiert werden,
werden die gefärbten myokardialen Bereiche ebenfalls be
stimmt. Die gefärbten Bereiche werden photographiert. Risi
kobereiche und Infarktbereiche können außerdem durch native
NADH-Fluoreszenz, die bei einer Anregungswellenlänge von
366 nm emittiert und die für das bloße Auge nach 10 min
Ischämie verschwindet, bestimmt werden. Nach dieser Zeit
erscheint das ischämie/infarktgeschädigte Gewebe schwarz,
wodurch die Risikobereiche genau abgrenzbar sind. Die Kom
bination von Propidiumiodid mit nativer NADH-Fluoreszenz
ist eine andere Möglichkeit, um Änderungen in den NADH-Ge
webekonzentrationen für den Nachweis irreversibel geschä
digten Myokards nachzuweisen. Genauere Beschreibungen der
Verfahren zur Abgrenzung von geschädigtem bzw. nekroti
schem/ischämischem Gewebefinden sich in Vogt et al., 1996
a. a. O. und Vogt et al., 1997 a. a. O. Substanzen, die bei der
ischämischen Präkonditionierung eine Rolle spielen, lassen
sich mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren dadurch er
mitteln, daß Tiere, die mit dem wirksamen Protein behandelt
wurden, kleinere Infarktbereiche aufweisen als Tiere, die
lediglich mit Puffer vorbehandelt wurden.
Claims (22)
1. DNA-Sequenz, die für ein Protein codiert, das in der
Lage ist, bei der ischämischen Präkonditionierung mitzu
wirken, ausgewählt aus:
- a) einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 oder dem jewei ligen komplementären Strang dazu,
- b) einer DNA-Sequenz, die mit einer der Sequenzen unter (a) oder Fragmenten davon unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
- c) einer DNA, die lediglich aufgrund der Degene riertheit des genetischen Codes nicht befähigt ist, unter stringenten Bedingungen mit einer der unter (a) definierten Sequenzen zu hybridisieren.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz in
der Lage ist bei der ischämischen Präkonditionierung des
Herzens mitzuwirken.
3. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zusammen
mit anderen DNA-Sequenzen, die die Expression ermöglichen,
ausgewählt aus Promotoren, Enhancern, Terminationssignalen
oder sonstigen regulatorischen Sequenzen.
4. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es
sich bei der DNA-Sequenz um eine genomische DNA-Sequenz han
delt.
5. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es
sich bei der DNA-Sequenz um eine cDNA-Sequenz handelt.
6. Expressionsvektor, umfassend eine DNA nach einem der An
sprüche 1 bis 5.
7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei die DNA-Sequenz
nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 5 in funktioneller Ver
knüpfung mit regulatorischen Sequenzen vorliegt.
8. Wirtszelle, die einen Vektor nach einem der Ansprüche 6
oder 7 enthält.
9. Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch gekenn
zeichnet, daß es sich um eine eukaryonte Zelle han
delt.
10. Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch gekenn
zeichnet, daß es sich um eine prokaryonte Zelle han
delt.
11. Protein, welches von einer DNA nach einem der Ansprüche
1 bis 5 codiert wird.
12. Protein, das in der Lage ist, bei der ischämischen Prä
konditionierung mitzuwirken, ausgewählt aus der Gruppe
bestehend aus
- a) Proteinen, die eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 2 aufweisen,
- b) Muteinen, fusionierten Proteinen oder funktio nellen Derivaten der in (a) definierten Proteine,
- c) Proteinen, die einen Teil der Aminosäurese quenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweisen, oder Muteinen oder funktionellen Derivaten davon, oder derartige Proteine in Fusion mit anderen Proteinen oder Peptiden.
13. Protein nach Anspruch 12, wobei das Protein in der Lage
ist, bei der ischämischen Präkonditionierung des Herzens
mitzuwirken.
14. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der
Ansprüche 11 bis 13, umfassend das Kultivieren einer Wirts
zelle nach einem der Ansprüche 8 bis 10 unter Bedingungen,
die für die Expression des Proteins geeignet sind, und Iso
lierung des Proteins.
15. Antikörper gegen ein Protein nach einem der Ansprüche 11
bis 13.
16. Antikörper nach Anspruch 15, dadurch gekenn
zeichnet, daß es ein polyclonaler Antikörper ist.
17. Antikörper nach Anspruch 15, dadurch gekenn
zeichnet, daß es ein monoclonaler Antikörper ist.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Protein
nach einem der Ansprüche 11 bis 13.
19. Protein nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Verwen
dung als Arzneimittel.
20. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 11 bis 13 zur
Prävention von Herzinfarkten oder örtlicher kontraktiler
Dysfunktionen.
21. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 15
bis 17 in einem Assay zum Nachweis eines Proteins nach einem
der Ansprüche 11 bis 13.
22. Verwendung einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5
oder einer RNA, die mit einer dieser DNAs hybridisiert, als
Hybridisierungssonde.
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---|---|---|---|
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- 1999-11-02 WO PCT/EP1999/008372 patent/WO2000028023A2/de active Application Filing
- 1999-11-02 AU AU11592/00A patent/AU1159200A/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
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Circulation 66, S.1146-1149, 1982 * |
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