DE69735364T2

DE69735364T2 - Modulatoren für die regenerierung von gewebe

Info

Publication number: DE69735364T2
Application number: DE69735364T
Authority: DE
Inventors: Michele Winchester SANICOLA-NADEL; V. Joseph Wayland BONVENTRE; A. Catherine Hingham HESSION; Takaharu Cambridge ICHIMURA; Henry Newton WEI; L. Richard Weston CATE
Original assignee: General Hospital Corp; Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: General Hospital Corp; Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-23
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2017-05-24
Also published as: JP4602482B2; PL330313A1; NZ336467A; EP0907735B1; DE69735364D1; CN1147584C; JP2008067701A; JP4316640B2; US20070141590A1; DK0907735T4; PL188826B1; WO1997044460A1; HU226205B1; HUP9902770A3; JP2001505761A; NO327597B1; HK1021746A1; HUP9902770A2; EP0907735B9; DE69735364T3

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Die Erfindung bezieht sich auf Proteine, die in verletzten oder sich regenerierenden Geweben hochreguliert sind, sowie auf die DNA, die für diese Proteine kodiert. Ferner bezieht sich die Erfindung auf therapeutische Zusammensetzungen und Behandlungsverfahren, die diese Proteine umfassen.
ERFINDUNGSHINTERGRUND
Während der Entwicklung und während der Gewebewiederherstellung nach einer Verletzung findet eine dynamische Umgestaltung der Gewebearchitektur statt. Um diesen Vorgang zu untersuchen, haben wir uns auf ein Modell einer Nierenverletzung konzentriert, die durch einen Ischämie-Reperfusions-Insult ausgelöst wurde.
Die Niere ist in der Lage, Schäden am Epithel des proximalen Tubulus zu reparieren, und zwar durch eine komplexe Abfolge von Vorgängen einschließlich des Zelltods, der Proliferation überlebender Epithelzellen des proximalen Tubulus, der Bildung von schwach differenziertem regenerativen Epithel über der entblößten Basalmembran und der Differenzierung des regenerativen Epithels zur Bildung vollständig funktionaler Epithelzellen des proximalen Tubulus (Wallin et al., Lab. Invest. 66: 474984, 1992; Witzgall et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1933–1942, 1994; Ichimura et al., Am. J. Physiol. 269: F653–662, 1995; Thadhani et al., N. Engl. J. Med. 334: 1448–1460, 1996). Wachstumsfaktoren wie IGF, EGF und HGF wurden mit diesem Reparaturmechanismus ebenso in Verbindung gebracht wie das endotheliale Zelladhäsionsmolekül ICAM-1. Die Mechanismen, durch die die Tubulus-Epithelzellen wiederhergestellt werden, sind jedoch nicht ganz geklärt.
Um Moleküle zu identifizieren, die an dem Vorgang von Verletzung und Wiederherstellung des Tubulus-Epithels beteiligt sind, haben wir den Unterschied in den mRNA-Populationen zwischen verletzen/sich regenerierenden und normalen Nieren mittels Repräsentativer Differenzanalyse (RDA) untersucht. RDA ist eine PCR-basierte Methode zur Subtraktion, die durch repetitive Substraktion und Amplifizierung für das Ziel-Gewebe oder die Ziel-Zelle spezifische cDNA-Fragmente liefert (Hubank and Schutz, Nucl. Acids Res. 22: 5640–5648, 1994).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In der Hauptsache bietet die Erfindung nierenverletzungsbezogene Moleküle (die ab hier „NVM" genannt werden sollen), die im Nierengewebe nach einer Nierenverletzung hochreguliert werden. Die NVM-Proteine und -Peptide nach der Erfindung sowie ihre Agonisten und Antagonisten und verwandte Moleküle sind in einer Vielzahl von therapeutischen Interventionen anwendbar.
Die Erfindung bietet ein gereinigtes und isoliertes DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt ist. Die Erfindung umfasst auch die komplementären Stränge dieser Sequenzen, DNA-Moleküle, die unter stringenten Bedingungen an die genannten DNA-Moleküle hybridisieren, und DNA-Moleküle, die wegen der Degeneration des genetischen Codes an eines der oben definierten DNA-Moleküle binden würden. Diese DNA-Moleküle können rekombinant sein und mit einer Expressionssteuerungs-Sequenz verbunden sein.
Die Erfindung bietet ferner einen Vektor, der ein gereinigtes und isoliertes DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt ist, umfasst. Dieser Vektor kann ein biologisch funktionales Plasmid oder ein biologisch funktionaler viraler DNA-Vektor sein. Eine Ausführungsform der Erfindung bietet eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die stabil mit einem Vektor transformiert oder transfiziert wurde, der ein gereinigtes und isoliertes DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt ist, umfasst. In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines NVM-Polypeptidprodukts, für das ein oben beschriebenes DNA-Molekül kodiert, bereitgestellt; das Verfahren umfasst das Heranziehen von prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen, die mit dem DNA-Molekül in einer Weise transformiert oder transfiziert wurden, die die Expression des DNA-Moleküls erlaubt, und die Gewinnung des Polypeptidprodukts besagter Expression.
Ein gereinigtes und isoliertes humanes NVM-Protein, das im wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen ist, ist ausdrücklich Teil der Erfindung, so wie auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidprodukts, das teils oder ganz die Primärstruktur-Konformation und die biologische Aktivität eines NVM-Proteins hat. NVM-Proteine nach der Erfindung können eine Aminosäuresequenz haben, die SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 umfasst, oder eine Variante von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 sein, oder ein gereinigtes und isoliertes Protein, das von der DNA nach SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 kodiert wird, sein. Diese Proteine können im wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen bereitgestellt werden. Die Erfindung umfasst ferner Varianten dieser Proteine, wie lösliche Varianten oder Fusionsproteine. NVM-Fusionsproteine nach der Erfindung können ein Immunglobulin, ein Toxin, eine bildgebungsfähige Verbindung oder ein Radionuklid umfassen.
Die Erfindung bietet auch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gegen die oben beschriebenen NVM-Proteine. Der anti-NVM-Antikörper kann mit einem Toxin, einer bildgebungsfähigen Verbindung oder einem Radionuklid assoziiert sein. Ebenfalls gelehrt wird eine Hybridom-Zelllinie, die einen solchen spezifischen Antikörper produziert.
Der Umfang der Erfindung erstreckt sich auch pharmazeutische Zusammensetzungen. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach der Erfindung kann eine therapeutisch effektive Menge eines NVM-Proteins oder eines anti-NVM-Antikörpers nach der Erfindung umfassen, zusammen mit einem pharmakologisch akzeptablen Träger.
Diagnostische Zusammensetzungen sind von der Erfindung umfasst, wie Zusammensetzungen, die geeignet sind, das Vorliegen oder den Verlauf des Rückgangs der Nierenverletzung durch Messung der Konzentration von NVM in Harn, Serum oder Harnsediment von Patienten, die eine Nierenkrankheit haben oder das Risiko tragen, eine solche zu entwickeln.
Zusammensetzungen nach der Erfindung umfassen Zusammensetzungen, die geeignet sind, Patienten zu behandeln, umfassend therapeutisch effektive Mengen von NVM, NVM-Varianten, NVM-Analoga, NVM-Fusionsproteine, NVM-Agonisten und Antikörper gegen NVM oder NVM-Liganden. Weitere therapeutische Verbindungen nach der Erfindung umfassen NVM-Liganden, anti-NVM-Antikörper und Fusionsproteine von NVM-Liganden. Diese Verbindungen können in therapeutischen Verfahren nützlich sein, die von der NVM-Funktion abhängige zelluläre Antworten entweder stimulieren oder inhibieren.
Weitere Verfahren nach der Erfindung inhibieren das Wachstum von NVM-exprimierenden Tumorzellen durch das Kontaktieren der Zellen mit einem Fusionsprotein aus einem NVM-Liganden und entweder einem Toxin oder einem Radionuklid, oder mit einem anti-NVM-Antikörper, der an ein Toxin oder ein Radionuklid konjugiert ist. Desgleichen kann das Wachstum von Tumorzellen, die einen NVM-Liganden exprimieren durch Kontaktieren der Zellen mit einem Fusionsprotein aus einem NVM und entweder einem Toxin oder Radionuklid inhibiert werden, oder mit einem anti-NVM-Ligand-Antikörper, der an ein Toxin oder ein Radionuklid konjugiert ist.
Die Erfindung umfasst auch Zusammensetzungen, die für die Gentherapie geeignet sind. Diese umfassen Zusammensetzungen, die zur Behandlung eines Subjekts mit einer Nierenstörung, zur Förderung des Wachstums neuen Gewebes in einem Subjekt und zur Förderung des Überlebens beschädigten Gewebes in einem Subjekt geeignet sind, und die einen Vektor umfassen, der DNA umfasst, die die Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 umfasst.
Die Verbindungen nach der Erfindung sind auch geeignet zur Bildgebung von Geweben, entweder in vitro oder in vivo. Ein solches Verfahren umfasst das Zielsteuern einer bildgebungsfähigen Verbindung zu einer Zelle, die ein Protein nach SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 exprimiert, umfassend das Kontaktieren der Zelle entweder mit einem monoklonalen Antikörper nach der Erfindung oder mit einem ein wie oben beschriebenes Protein umfassenden Fusionsprotein, verbunden mit einer bildgebungsfähigen Verbindung. Bei in vivo-Verfahren ist die Zelle in einem Subjekt, und das Protein oder der monoklonale Antikörper wird dem Subjekt verabreicht.
Die Erfindung umfasst auch Zusammensetzungen, die sich für diagnostische Verfahren eignen, wie ein Verfahren zur Identifizierung von Schäden oder der Regeneration von Nierenzellen in einem Subjekt, umfassend das Vergleichen des Expressionsniveaus von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 in Nierenzellen des Subjekts mit einem Kontroll-Expressionsniveau der Sequenz in Kontroll-Nierenzellen. Ein weiteres Verfahren nach der Erfindung umfasst das Identifizieren einer Hochregulierung von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 in Zellen, umfassend das Kontaktieren der Zellen mit einer Antisense-Sonde und das Messen der Hybridisierung an RNA in der Zelle.
Eine weitere Ausführungsform der diagnostischen Verfahren nach der Erfindung umfasst die Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration eines Moleküls nach der Erfindung entweder in Harn, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten oder in Harnsediment oder Gewebeproben. Das gemessene verletzungsbezogene Molekül kann mit dem Vorliegen, dem Ausmaß oder dem Verlauf eines pathologischen Vorgangs korreliert werden. Diese Korrelation kann auch verwendet werden, um die Effizienz eines therapeutischen Regimes zu beurteilen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die Nukleotidsequenz der Rattenklon-cDNA 3-2 dar, einschließlich des mutmaßlichen Protein-Leserahmens von 615 bis 1535.
2 listet die cDNA-Sequenz von Rattenklon 1-7, einschließlich des mutmaßlichen Protein-Leserahmens von 145 bis 1065.
3 listet die cDNA-Sequenz von Rattenklon 4-7, einschließlich des mutmaßlichen Protein-Leserahmens von 107 bis 1822.
4 ist eine Auflistung der cDNA und der davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen des menschlichen Klons HI3-10-85, einschließlich des mutmaßlichen Protein-Leserahmens von 1 bis 1002. Die obere Zeile in der Auflistung ist die cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 6), und die untere Zeile ist die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 7).
5 ist ein BESTFIT-Vergleich der Nukleotidsequenz des menschlichen Klons HI3-10-85 mit der des Rattenklons 3-2.
DETAILLIERTE BESCHEIBUNG DER ERFINDUNG
Wir haben NVM-Gene durch die Analyse von Unteerschieden in der mRNA-Expression zwischen sich regenerierenden und normalen Nieren mittels repräsentativer Differenzanalyse (RDA) identifiziert. RDA ist eine PCR-basierte Methode zur Subtraktion, die Zielgewebe- oder -zell-spezifische cDNA-Fragmente durch repetitive Subtraktion und Amplifizierung liefert. Die cDNA-Repräsentation aus postischämischer (48 Stunden) Nieren-RNA ausgewachsener Ratten wird von der Probe aus normalen (scheinoperierten) Nieren ausgewachsener Ratten subtrahiert. In diesem Verfahrem werden Sequenzen, die postischämischen und normalen Nierenproben gemein sind, entfernt, und die Sequenzen, die nur in verletztem Nierengewebe signifikant exprimiert werden, bleiben zurück. Solche Gene kodieren für Proteine, die bei Nierenstörungen therapeutisch nutzbringend oder an Vorgängen nach der Verletzung beteiligt sein könnten. Mehrere Klone wurden erhalten, sequenziert und charakterisiert. Die Klone werden dann auf ihre Expressionsmuster während der Nierenwiederherstellung, auf Entwicklung und Gewebeverteilung mittels Northern-Analyse und RNA-in situ-Hybridisierung untersucht.
Sequenz-Identifizierungsnummern
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, auf die in der Beschreibung Bezug genommen wird, wurden mit folgenden Sequenz-Identifizierungsnummern versehen:
SEQ ID NO: 1 – Nukleotidsequenz des 3-2-cDNA-Inserts aus Ratten
SEQ ID NO: 2 – Nukleotidsequenz des 1-7-cDNA-Inserts aus Ratten
SEQ ID NO: 3 – Aminosäuresequenz von Ratten-NVM-1, kodiert von den 3-2- und 1-7-cDNAs aus Ratten
SEQ ID NO: 4 – Nukleotidsequenz des Ratten-4-7-cDNA-Inserts
SEQ ID NO: 5 – Vom 4-7-cDNA-Insert kodierte Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 6 – Nukleotidsequenz des menschlichen cDNA-Klons HI3-10-85
SEQ ID NO: 7 – Vom menschlichen cDNA-Klon HI3-10-85 kodierte Aminosäuresequenz
Begriffsdefinitionen
Ein „NVM-Protein", hierin mit „NVM" synonym gebraucht, ist ein Protein, für das mRNA kodiert, die nach einer Nierenverletzung selektiv hochreguliert wird. Eine Gruppe von interessanten NVM-Proteinen umfasst jene, für die mRNA kodiert, welche selektiv zu irgendeiner Zeit innerhalb einer Woche nach einem Insult, der zu einer Verletzung von Nierengewebe führt, hochreguliert wird. Beispiele für Zeitpunkte, an denen eine solche Hochregulierung festgestellt werden könnte, umfassen 10 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden oder 96 Stunden nach einem Insult. Beispiele für Insult-Typen umfassen jene, die zu ischämischen, toxischen oder anderen Arten von Verletzungen führen.
Ein „NVM-Agonist" ist ein Molekül, das spezifisch eine zelluläre Antwort auslösen kann, die normalerweise durch die Wechselwirkung von NVM mit einem NVM-Liganden ausgelöst wird. Ein NVM-Agonist kann eine NVM-Variante oder ein für NVM spezifischer Antikörper oder eine lösliche Form des NVM-Liganden sein.
Ein „NVM-Antagonist" ist ein Molekül, das spezifisch mit einem NVM-Liganden oder NVM assoziieren kann und dadurch die Bindung von NVM an den NVM-Liganden blockiert oder anderweitig inhibiert. Die Bindung des Antagonisten blockiert oder inhibiert zelluläre Antworten, die sonst durch Bindung des NVM-Liganden an NVM oder einen NVM-Agonisten ausgelöst würden. Beispiele für NVM-Antagonisten umfassen gewisse NVM-Varianten, NVM-Fusionsproteine und spezifische Antikörper gegen einen NVM-Liganden oder NVM.
Ein „NVM-Ligand" ist jedes Molekül, das nichtkovalent und spezifisch an ein NVM-Protein bindet. Solch ein Ligand kann ein Protein, ein Peptid, ein Steroid, ein Antikörper, ein Aminosäurederivat oder ein Molekül anderen Typs sein, in jeglicher Form, einschließlich der natürlich vorkommenden, der rekombinant produzierten oder einer anderweitig synthetischen Form. Ein NVM-Ligand kann in jeglicher Form vorliegen, einschließlich der löslichen und der membrangebundenen Form, oder als Teil eines Fusionskonstrukts mit Immunglobulin, Fettsäure oder anderen Bestandteilen. Der NVM-Ligand kann ein Integrin sein. Ein membrangebundener NVM-Ligand kann als ein Rezeptor wirken, der, wenn er an NVM gebunden oder mit NVM assoziiert ist, eine zelluläre Antwort auslöst. Bei manchen Wechselwirkungen kann NVM mit mehr als einem einzigen NVM-Liganden assoziieren, oder mit einem NVM-Liganden als Teil eines Komplexes mit einem oder mehreren anderen Molekülen oder Kofaktoren assoziieren. In einer Situation, in der sowohl NVM als auch der NVM-Ligand an Zellmembranen gebunden sind, kann NVM mit einem NVM-Liganden assoziieren und reagieren, der an dieselbe Zelle wie NVM gebunden ist, oder es kann mit einem NVM-Liganden assoziieren und reagieren, der an eine zweite Zelle gebunden ist. Findet die NVM-Wechselwirkung zwischen an zwei verschiedene Zellen gebundenen Molekülen statt, so können die zwei Zellen gleich oder verschieden sein im Hinblick auf den Zelltyp oder die Zellherkunft, den phänotypischen oder metabolischen Zustand, oder den Typ oder den Grad zellulärer Antwort (z.B. Wachstum, Differenzierung oder Apoptose) auf einen bestimmten Stimulus. „NVM-Bindung" bezieht sich auf den Kontakt und die Bindung von NVM an einen NVM-Liganden.
„Sequenzalignment" bezeichnet die Positionierung einer (Nukleotid- oder Aminosäure-)Sequenz gegen eine andere, um die Sequenz fraglicher Abschnitte der einen mit der der anderen vergleichen zu können. Ein Beispiel für ein Verfahren für diese Prozedur findet sich in Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: 443–453, 1970). Das Verfahren kann in geeigneter Weise in Computerprogrammen wie Align (DNAstar, Inc.) implementiert werden. Wie Fachleute begreifen werden, umfassen homologe und funktional äquivalente Sequenzen funktional äquivalente Anordnungen der Cysteinreste innerhalb des konservierten Cysteinskeletts, einschließlich Aminosäureinsertionen oder -deletionen, die die lineare Anordnung dieser Cysteine verändern, aber deren Beziehungen zueinander in der gefalteten Proteinstruktur nicht erheblich stören. Daher werden interne Lücken und Aminosäureinsertionen in der Kandidatensequenz für die Berechnung der Höhe der Aminosäureidentität zwischen der Kandidaten- und der Referenzsequenz ignoriert. Ein häufig benutztes Charakteristikum bei der Berechnung der Homologie von Proteinen ist die Ähnlichkeit in Zahl und Position der Cysteinreste zwischen dem einen und dem anderen Protein.
„Antisense-DNA" bezieht sich auf die Sequenz der chromosomalen DNA, die transkribiert wird.
Eine „antisense-Sonde" ist eine Sonde, die zumindest einen Teil der antisense-DNA eines interessierenden Nukleinsäureabschnitts umfasst.
„Klonieren" bezeichnet die Verwendung von in-vitro-Rekombinationsmethoden, um ein bestimmtes Gen oder eine andere DNA-Sequenz in ein Vektor-Molekül zu inserieren. Um ein gewünschtes Gen erfolgreich zu klonieren, ist es erforderlich, Verfahren zur Herstellung von DNA-Fragmenten, zur Verbindung der Fragmente mit Vektor-Molekülen, zur Einbringung des zusammengesetzten DNA-Moleküls in eine Wirtszelle, in der es sich replizieren kann, und zur Aussonderung des Klons, der das Zielgen besitzt, aus den Empfängerwirtszellen anzuwenden.
„cDNA" steht für komplementäre oder Kopie-DNA, die durch die Aktivität der RNA-abhängigen DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase) von einer RNA-Vorlage abgelesen wird. Daher ist ein „cDNA-Klon" eine Duplex-DNA-Sequenz, die komplementär zu einem interessierenden RNA-Molekül ist, getragen von einem Klonierungsvektor.
„cDNA-Bibliothek" bezeichnet eine Sammlung von rekombinanten DNA-Molekülen, die cDNA-Inserts enthalten, und die zusammen die mRNA-Moleküle repräsentieren, die in einem gesamten Organismus oder Gewebe vorhanden sind, je nach Herkunft der RNA-Vorlagen. Solch eine cDNA-Bibliothek kann mit Fachleuten bekannten und z.B. in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, a.a.O., beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Im allgemeinen wird zunächst RNA aus den Zellen eines Organismus isoliert, aus dessen Genom ein bestimmtes Gen kloniert werden soll. Bevorzugt für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Säuger- und insbesondere menschliche Zelllinien. Alternativ kann RNA aus einer Tumorzelle isoliert werden, die aus einem tierischen, vorzugsweise aus einem menschlichen Tumor stammt. Daher kann eine Bibliothek beispielsweise aus einem menschlichen Nebennierentumor hergestellt werden, aber auch jeder andere Tumor kann verwendet werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „DNA-Polymorphismus" auf den Zustand, in dem zwei oder mehr verschiedene Nukleotid-Sequenzen an einer bestimmten Stelle in der DNA existieren können.
Der Begriff „Expressionsvektor" umfasst Vektoren, die darin enthaltene DNA-Sequenzen exprimieren können, d.h., die kodierenden Sequenzen sind mit anderen Sequenzen verbunden, die deren Expression bewirken können. Stillschweigend vorausgesetzt, aber nicht immer explizit gesagt ist, dass diese Expressionsvektoren in den Wirtsorganismen entweder als Episomen oder als integraler Teil der chromosomalen DNA replizierbar sein müssen. Ein nützliches, aber nicht notwendiges Element eines effektiven Expressionsvektors ist eine für einen Marker kodierende Sequenz, was eine Sequenz ist, die für ein Protein kodiert, das zu einer phänotypischen Eigenschaft (wie Tetracyclin-Resistenz) der Zellen führt, die das Protein enthalten, das es ermöglicht, diese Zellen auf einfache Weise zu identifizieren. Zusammengefasst erhält „Expressionsvektor" eine funktionale Definition, und jede DNA-Sequenz, die die Expression eines spezifizierten enthaltenen DNA-Codes bewirken kann, wird von diesem Begriff umfasst, wenn er auf die spezifizierte Sequenz angewendet wird. Da in der heutigen Zeit solche Vektoren oft in der Form von Plasmiden vorliegen, werden „Plasmid" und „Expressionsvektor" oft synonym gebraucht. Die Erfindung soll jedoch auch solche anderen Formen von Expressionsvektoren umfassen, die eine äquivalente Funktion ausüben und von Zeit zu Zeit im Fachgebiet bekannt werden können.
Unter einem „funktionalen Derivat" versteht man „Fragmente", „Varianten", „Analoga" oder „chemische Derivate" eines Moleküls. Ein „Fragment" eines Moleküls, z.B. eines der Antigene nach der vorliegenden Erfindung, soll einen beliebigen Polypeptid-Ausschnitt des Moleküls bezeichnen. Eine „Variante" solcher Moleküle soll ein natürlich vorkommendes Molekül bezeichnen, das im wesentlichen entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon ähnelt. Ein „Analogon" eines Moleküls soll ein nicht-natürliches Molekül bezeichnen, das im wesentlichen entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon ähnelt.
Der Ausdruck „Gen" beschreibt eine Polynukleotid-Sequenz, die für ein Peptid kodiert.
Wenn er sich auf eine Peptid- oder eine DNA-Sequenz bezieht, bedeutet der Ausdruck „homogen", dass die primäre molekulare Struktur (d.h. die Sequenz der Aminosäuren oder Nukleotide) im wesentlichen aller Moleküle in der fraglichen Zusammensetzung identisch ist.
Der Begriff „isoliert" bezieht sich auf ein Protein nach der vorliegenden Erfindung, oder ein Gen, das für ein solches Protein kodiert, das im wesentlichen frei von anderen Proteinen bzw. Genen oder anderen Kontaminationen ist, mit denen es normalerweise in der Natur vorkommt, und als solches in einer Form vorliegt, die in der Natur nicht vorkommt.
Der Ausdruck „Label" bezieht sich auf einen detektierbaren Molekülbestandteil, einschließlich (um ein Beispiel zu nennen, das nicht einschränkend sein soll) radioaktiver Isotope, Enzyme, lumineszenter Agenzien und Farbstoffe.
Der Ausdruck „Sonde" bezeichnet einen Liganden bekannter Beschaffenheit, der selektiv an einen Ziel-Antiliganden binden kann. Wenn in Verbindung mit Nukleinsäuren gebraucht, bezieht sich der Begriff „Sonde" auf einen Nukleinsäurestrang mit einer Basensequenz, die zu einem Zielstrang komplementär ist.
„Rekombinante Wirtszellen" bezieht sich auf Zellen, die mit Vektoren transformiert wurden, welche wiederum mit DNA-Rekombinationsmethoden konstruiert wurden. Wie hierin definiert, wird der von einer rekombinanten Wirtszelle produzierte Antikörper oder dessen Modifikation aufgrund dieser Transformation in hohen Mengen produziert, im Gegensatz zu den geringeren Mengen, oder noch häufiger, zu den nicht mehr detektierbaren Mengen, die von einem untransformierten Wirt produziert würden.
Als „im wesentlichen rein" angesehen werden soll jedes Protein der vorliegenden Erfindung, oder jedes Gen, das für ein solches Protein kodiert, das im wesentlichen frei von anderen Proteinen bzw. Genen oder anderen Kontaminationen ist, mit denen es normalerweise in der Natur vorkommt, und als solches in einer Form vorliegt, die so in der Natur nicht vorkommt.
Ein Molekül wird als „im wesentlichen ähnlich" zu einem anderen Molekül bezeichnet, wenn die Aminosäuresequenz in beiden Molekülen im wesentlichen dieselbe ist, und wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität besitzen. Besitzen also zwei Moleküle eine ähnliche Aktivität, werden sie als Varianten angesehen, da dieser Ausdruck hierin sogar benutzt wird, wenn eines der Moleküle zusätzliche Aminosäurereste besitzt, die das andere nicht hat, oder wenn die Aminosäuresequenz nicht identisch ist. So wie hierin verwendet, wird ein Molekül als „chemisches Derivat" eines anderen Moleküls bezeichnet, wenn es zusätzliche chemische Bestandteile enthält, die normalerweise nicht Teil des Moleküls sind. Solche Bestandteile können die Löslichkeit, die Absorption, die biologische Halbwertszeit etc. des Moleküls erhöhen. Alternativ können diese Bestandteile die Toxizität des Moleküls erniedrigen, unerwünschte Nebenwirkungen des Moleküls unterbinden oder abschwächen usw. Bestandteile, die solche Effekte vermitteln, sind z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Edition, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980) offenbart.
"Vektor" steht für ein DNA-Molekül, das von einem Plasmid oder Bakteriophagen abgeleitet ist und in das DNA-Fragmente inseriert oder kloniert werden können. Ein Vektor wird eine oder mehrere nur einmal vorkommende Restriktionsstellen besitzen, und kann zur autonomen Replikation in einem bestimmten Wirt oder Vehikelorganismus befähigt sein, so dass die klonierte Sequenz replizierbar ist.
Verbindungen nach der Erfindung
Die Erfindung umfasst die cDNA nach SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 sowie Sequenzen, die die Sequenz nach SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 umfassen, und Derivate dieser Sequenzen. Die Erfindung umfasst auch Vektoren, Liposomen und andere Trägervehikel, die diese Sequenzen oder Derivate davon umfassen. Die Erfindung umfasst ferner Proteine, die von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 transkribiert wurden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 und deren Derivate und Varianten.
Eine Ausführungsform nach der Erfindung umfasst lösliche Varianten eines NVM-Proteins, das üblicherweise als membranassoziiertes Protein synthetisiert wird, und das nach einer Verletzung hochreguliert wird. Löslichen Varianten fehlt zumindest ein Teil der Transmembran- oder Intramembranregion eines nativen NVM-Proteins. In einigen Fällen fehlt der löslichen Variante die gesamte Transmembran- oder Intramembranregion eines nativen NVM-Proteins. Lösliche Varianten umfassen Fusionsproteine, welche Derivate von NVM-Proteinen umfassen, denen zumindest ein Teil der Transmembran- oder Intramembranregion eines nativen NVM-Proteins fehlt. Alle Arten von NVM-Fusionsproteinen sind umfasst, insbesondere jene, die His-tag-, Ig-tag- und Myc-tag-Formen des Moleküls enthalten. Diese NVM-Fusionen können Charakteristika aufweisen, die für die Therapie Vorteile bringen, wie die erhöhte Halbwertszeit, die der Ig-tag mit sich bringt. Ebenfalls umfasst sind Fusionsproteine, die Teile ausgewählter Domänen des NVM-Proteins beinhalten.
Varianten können sich von natürlich vorkommendem NVM-Protein in der Aminosäuresequenz oder einer Weise, die nichts mit der Sequenz zu tun hat, oder in beidem unterscheiden. Aminosäuresequenz-Varianten werden hergestellt, indem eine oder mehrere Aminosäuren in natürlich vorkommendem NVM-Protein durch eine andere natürliche Aminosäure, ein Aminosäurederivat oder eine nicht-natürliche Aminosäure substituiert werden. Besonders bevorzugte Varianten umfassen natürlich vorkommendes NVM-Protein oder biologisch aktive Fragmente natürlich vorkommenden NVM-Proteins, deren Sequenzen sich von der Wildtypsequenz durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, die typischerweise minimalen Einfluß auf die Sekundärstruktur und Hydrophobizität des Proteins oder Peptids haben. Varianten können auch Sequenzen besitzen, die sich durch eine oder mehrere nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen unterscheiden, die die biologische Aktivität des NVM-Proteins nicht unterbinden. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise die Substitution einer Aminosäure durch eine andere mit ähnlichen Eigenschaften, etwa Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Valin, Glycin; Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren umfassen Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Weitere konservative Substitutionen können der Tabelle unten entnommen werden, und noch mehr wurden von Dayhoff im Atlas of Protein Sequence and Structure (1998) beschrieben.
TABELLE 1: KONSERVATIVE AMINOSÄURE-SUBSTITUTIONEN
Weitere Varianten nach der Erfindung sind jene mit Modifikationen, welche die Peptid-Stabilität erhöhen. Solche Varianten können z.B. eine oder mehrere Nicht-Peptidbindungen (die die Peptidbindungen ersetzen) in der Peptidsequenz enthalten. Des weiteren sind umfasst: Varianten, die Reste enthalten, die sich von natürlich vorkommenden L-Aminosäuren unterscheiden, wie D-Aminosäuren oder nicht natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren wie Beta- oder Gamma-Aminosäurem und zyklische Varianten. Der Einbau von D- anstelle von L-Aminosäuren in das Polypeptid kann dessen Widerstandsfähigkeit gegen Proteasen erhöhen, siehe z.B. US-Patent 5,219,990.
Substitutionen, von denen man erwarten kann, dass sie Änderungen in den funktionalen Eigenschaften von NVM-Polypeptiden bewirken, sind im allgemeinen jene, in welchen: (i) ein hydrophiler Rest, z.B. Serin oder Threonin, durch einen hydrophoben Rest, z.B. Leucin, Isoleucin, Phenylalanin oder Alanin, substituiert ist; (ii) ein Cysteinrest einen anderen Rest ersetzt oder durch einen anderen Rest ersetzt ist; (iii) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysin, Arginin oder Histidin, einen Rest mit einer elektronegativen Seitenkette, z.B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure, ersetzt oder durch einen solchen Rest ersetzt ist; oder (iv) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, einen Rest, der solch eine Seitenkette nicht besitzt, z.B. Glycin, ersetzt oder durch einen solchen Rest ersetzt ist.
Die Peptide nach dieser Erfindung können auch durch verschiedene Änderungen wie Insertionen, Deletionen und konservative oder nicht-konservative Substitutionen modifiziert werden, wenn solche Änderungen durch ihre Verwendung gewisse Vorteile bieten. Insbesondere sind Spleißvarianten von dieser Erfindung umfasst.
In weiteren Ausführungsformen können Varianten mit Aminosäuresubstitutionen, die weniger konservativ sind, auch zu erwünschten Derivaten führen, z.B. durch Änderungen in Ladung, Konformation und anderen biologischen Eigenschaften. Solche Substitutionen umfassen z.B. die Substitution eines hydrophilen Rests für einen hydrophoben Rest, die Substitution eines anderen Rests für Cystein oder Prolin, die Substitution eines Restes mit sperriger Seitenkette für einen Rest mit kleiner Seitenkette oder die Substitution eines Restes mit negativer Nettoladung für einen Rest mit positiver Nettoladung. Kann das Resultat eine bestimmten Substitution nicht mit Sicherheit vorhergesagt werden, so können die Derivate auf einfache Weise nach den hierin offenbarten Methoden untersucht werden, um die An- oder Abwesenheit der gewünschten Eigenschaften zu bestimmen.
Varianten innerhalb des Umfangs dieser Erfindung umfassen Proteine und Peptide mit Aminosäuresequenzen mit mindestens neunzig Prozent Identität zu einem NVM-Protein. Bevorzugter ist eine Sequenzidentität von mindestens fünfundneunzig Prozent. Für die Zwecke der Identitätsbestimmung wird die Länge der verglichenen Sequenzen im allgemeinen mindestens 8 Aminosäurereste, üblicherweise mindestens 20 Aminosäurereste sein.
So wie es möglich ist, Substituenten des Gerüsts zu ersetzen, so ist es auch möglich, funktionale Gruppen, die an das Gerüst gebunden sind, durch Gruppen zu substituieren, die durch ähnliche Merkmale gekennzeichnet sind. Diese Substitutionen werden anfangs konservativ sein, d.h., die ersetzende Gruppe wird annähernd dieselbe Größe, Form, Hydrophobizität und Ladung wie die ursprüngliche Gruppe haben. Nicht-Sequenzmodifikationen können z.B. eine chemische Derivatisierung von Teilen eines natürlich vorkommenden NVM-Proteins in vivo oder in vitro als auch Änderungen in der Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Carboxylierung oder Glykosylierung umfassen.
Auch umfasst von der Erfindung sind Agenzien, die spezifisch an das Protein binden, oder ein Fragment des Proteins (SEQ ID NO: 3, 5 oder 7). Diese Agenzien umfassen Liganden und Antikörper (einschließlich monoklonaler, einzelkettiger, doppelkettiger, Fab-Fragmente und anderer, seien sie nativ, human, humanisiert, primatisiert oder chimär). Weitere Beschreibungen dieser Kategorien von Agenzien finden sich in PCT-Anmeldung 95/16709.
Experimentelle Verfahren
1. Gewinnung von RNA aus ischämischen und normalen ausgewachsenen Rattennieren
Ischämische verletzte Rattennieren werden wie in Witzgall et al. (J. Clin. Invest. 93: 2175–2188, 1994) erzeugt. In Kürze: Die Nierenarterie und -vene aus einer Niere einer ausgewachsenen Sprague-Dawley-Ratte werden 40 Minuten abgeklemmt und dann reperfundiert. Verletzte Nieren werden den Ratten 24 Stunden und 48 Stunden nach Reperfusion entnommen. Nieren aus scheinoperierten, normalen Sprague-Dawley-Ratten werden ebenfalls entnommen.
Gesamt-RNA wird aus den Organen nach dem Protokoll von Glisin et al. (Biochemistry 13: 2633, 1974) präpariert. In Kürze: Die entnommenen Organe werden unverzüglich in GNC-Puffer (4 M Guanidin-Thiocyanat, 0,5% SDS, 25 mM Natriumcitrat, 0,1% Sigma-Antifoam) eingelegt und auf Eis mit einem Polytron zerlegt. Zelltrümmer werden durch langsames Zentrifugieren in einer klinischen Zentrifuge entfernt und die Flüssigkeit des Überstands auf ein Kissen aus 5,7 M CsCl, 25 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA gelegt. Die RNA wird in einem SW40Ti-Rotor bei 22 K 15 Stunden durch das Kissen pelletiert. Die RNA wird in sterilem DEPC (Diethylpyrocarbonat)-behandeltem Wasser resuspendiert und zweimal mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumen EtOH gefällt. Poly-A+-RNA wird mittels eines mRNA-Reinigungskits (Pharmacia, Katalognummer 27-9258-02) isoliert.
2. Verfahren der Repräsentativen Differenzanalyse (RDA) zur Isolierung der RDA-Fragmente 1-7, 3-2 und 4-7
Doppelsträngige cDNA wird mittels des Gibco BRL-„Superscript Choice^TM System cDNA Synthesis Kits" (Katalognummer 18090) aus Poly-A+-RNA aus scheinoperierter sowie 48h-postischämischer Niere synthetisiert. Der erste Strang wird mit Oligo-dT als Primer und Superscript II^TM-Reverser Transkriptase synthetisiert. Der zweite Strang wird mit E.coli-DNA-Polymerase I und RNase H, gefolgt von T4-DNA-Polymerase, unter von BRL empfohlenen Bedingungen synthetisiert.
Die RDA-Analyse wird im wesentlichen wie von Hubank und Schatz beschrieben (Nucleic Acid Research 22: 5640–48, 1994) durchgeführt. In Kürze: 48h-postischämische Nieren-cDNA wird mit dem Restriktionsenzym Dpn II verdaut und an R-Bgl-12/24-Oligonukleotide ligiert (siehe obige Literaturstelle für die exakte Sequenz). Eine PCR-Amplifizierung (durchgeführt mit Perkin-Elmer-Taq-Polymerase und deren zugehörigem PCR-Puffer) der Linker-ligierten cDNA wird durchgeführt, um eine initiale „Repräsentation" zu erzeugen. Dieses PCR-Produkt wird „Tester-Amplikon" genannt. Dieselbe Prozedur wird angewendet, um ein „Driver-Amplikon" aus Nieren-cDNA scheinoperierter Ratten zu gewinnen.
Die Hybridisierung von Tester- und Driver-Amplikons, gefolgt von selektiver Amplifizierung, werden dreimal durchgeführt, um Differentialprodukt Eins (DP1), Zwei (DP2) und Drei (DP3) zu erzeugen. Die Erzeugung des DP1-Produkts wird wie von Hubank und Schatz beschrieben (Nucleic Acid Research 22: 5640–48, 1994) durchgeführt. Die DP2- und DP3-Produkte werden ebenfalls wie in Hubank und Schatz beschrieben (a.a.O.) erzeugt, außer dass die Driver:Tester-Verhältnisse auf 5.333:1 (DP2) und 40.000:1 oder 4.000:1 (DP3) geändert wurden.
Drei RDA-Produkte werden aus DP3 in den Klonierungsvektor pUC18 kloniert: RDA-Produkt 1-7 (252 Basenpaare), wenn DP3 mit einem Verhältnis von 40.000:1 erzeugt wurde, und RDA-Produkte 3-2 (445 Basenpaare) und 4-7 (483 Basenpaare), wenn DP3 mit einem Verhältnis von 4.000:1 erzeugt wurde. Die DNA-Fragmente wurden mithilfe des Pharmacia-Sureclone^TM-Kits (Katalognummer 27-9300-01) subkloniert, um die Enden der PCR-Fragmente mit Klenow-Enzym zu aufzufüllen und die Blunt-end-Ligation der Fragmente in den pUC18-Vektor zu ermöglichen.
3. Northern-Anal
Poly-A+-RNA (2,5 μg) aus normalen ausgewachsenen Rattennieren (scheinoperiert), aus 48h-postischämischen verletzten ausgewachsenen Nieren, und aus Tag-18-embryonischen Nieren wird der Elektrophorese unterworfen und auf eine GeneScreen^TM-Membran (Dupont) Northern-geblottet (Cate, Cell 45: 685, 1986). Die Hybridisierung in PSB-Puffer (50 mM Tris pH 7,5, 1 M NaCl, 0,1% Natriumpyrophosphat, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% BSA, 1% SDS), der 10% Dextran-Sulfat und 100 μg/ml tRNA enthält, wird bei 65°C mithilfe dreier verschiedener Sonden durchgeführt: 1-7-RDA-Produkt, 3-2-RDA-Produkt und 4-7-RDA-Produkt. Alle sind mittels Pharmacias „Ready-to-go^TM"-Zufallsprimer-Labeling-Kits (Katalognummer 27-9251-01) radiogelabelt. Die RDA-Produkte 1-7, 3-2 und 4-7 hybridisieren an mRNAs in allen drei Proben, aber am intensivsten an mRNAs in den 48h-postischämischen Nieren-RNA-Proben.
Eine Northern-Blot-Analyse von ausgewachsenen Rattengeweben zeigt, dass das 1-7-Gen in sehr geringen Mengen in normaler ausgewachsener Niere, Hoden, Milz und Lunge exprimiert wird. Das 3-2-Gen wird in Leber, Niere, Milz und Gehirn exprimiert. Das 4-7-Gen wird in Milz, Niere, Lunge, Hoden, Herz, Gehirn, Leber und Skelettmuskel exprimiert. Das Vorhandensein von verschieden großen mRNAs in einigen Geweben in den 1-7- und 3-2-Blots zeigt, dass das primäre Transkriptionsprodukt des 1-7-Gens und des 3-2-Gens alternativem Spleißen und/oder Polyadenylierung unterliegen kann.
4. Isolierung der 3-2- und 4-7-cDNA-Klone
Eine cDNA-Bibliothek wird aus 4 μg Poly-A+-RNA aus 48h-postischämischer verletzter Niere mittels Reagenzien aus dem BRL-Superscript-Choice^TM-System für die cDNA-Synthese und dem Stratagene^TM-Lambda-Zap II-Klonierungskit (Katalognummer 236201) erzeugt, nach den von den Herstellern empfohlenen Protokollen.
10⁵ Klone werden mit dem 3-2-RDA-Produkt als Sonde gescreent (Zufallsprimerradiogelabelt wie oben beschrieben). Acht positive Klone werden ausgelesen, und vier werden daraus nach dem Zufallsprinzip für eine sekundäre Analyse ausgewählt, um reine Phagen-Plaques zu erhalten. Nach einem tertiären Screening werden vier reine Phagen- Klone isoliert. Klonierte Inserts aus dem Phagen werden mittels einer in-vivo-Ausschneide-Prozedur nach dem Stratagene^TM-Lambda-Zap II-Klonierungskit isoliert. Das größte Insert mit etwa 2,6 Kilobasen (als cDNA-Klon 3-2 bezeichnet) wird einer DNA-Sequenzierung unterworfen. Die Sequenz des Inserts (SEQ ID NO: 1) findet sich in 1. cDNA-Klon 3-2 (E.coli K-12, SOLR/p3-2#5-1) wurde unter ATCC-Nummer 98061 deponiert. Die Sequenz des cDNA-Klons 3-2 ist identisch mit der der Klon-1-7-cDNA (SEQ ID NO: 2), außer dass die Nukleotide 136-605 der SEQ ID NO: 1 eine Insertion darstellen. Daher stellt SEQ ID NO: 2 eine Spleißvariantenform der SEQ ID NO: 1 dar. Der Klon für 1-7 (E.coli K-12, SOLR/p1-7#3-1) wurde unter ATCC-Nummer 98060 deponiert.
10⁵ Klone werden mit dem 1-7-RDA-Produkt als Sonde gescreent (Zufallsprimerradiogelabelt wie oben beschrieben). Acht positive Klone werden ausgelesen, und vier davon werden nach dem Zufallsprinzip für eine sekundäre Analyse ausgewählt, um reine Phagen-Plaques zu erhalten. Nach einem tertiären Screening werden vier reine Phagen-Klone isoliert. Klonierte Inserts aus dem Phagen werden mittels einer in-vivo-Ausschneide-Prozedur nach dem Stratagene^TM-Lambda-Zap II-Klonierungskit isoliert. Das größte Insert mit etwa 2,0 Kilobasen (als cDNA-Klon 1-7 bezeichnet) wird einer DNA-Sequenzierung unterworfen. Die Sequenz des Inserts (SEQ ID NO: 2) findet sich in 2.
10⁵ Klone werden mit dem 4-7-RDA-Produkt als Sonde gescreent (Zufallsprimerradiogelabelt wie oben beschrieben, und in PSB bei 65°C hybridisiert). Acht positive Klone werden ausgelesen, und vier daraus werden nach dem Zufallsprinzip für eine sekundäre Analyse ausgewählt, um reine Phagen-Plaques zu erhalten. Nach einem sekundären Screening werden zwei reine Phagen-Klone isoliert. Klonierte Inserts aus dem Phagen werden mittels einer in-vivo-Ausschneide-Prozedur nach dem Stratagene^TM-Lambda-Zap II-Klonierungskit isoliert. Das größte Insert mit etwa 2,4 Kilobasen (als cDNA-Klon 4-7 bezeichnet) wird einer DNA-Sequenzierung unterworfen. Die Sequenz des Inserts (SEQ ID NO: 4) findet sich in 3. Der cDNA-Klon 4-7 (E.coli K-12, SOLR/p4-7#1-1) wurde unter ATCC-Nummer 98062 deponiert.
5. Charakterisierung der 1-7-, 3-2- und 4-7-cDNA-Klone
A.) DNA- und Protein-Sequenzen:
Die Sequenz der 3-2-cDNA (1; SEQ ID NO: 1) enthält einen offenen Leserahmen von 307 Aminosäuren (1; SEQ ID NO: 3). Eine Signalsequenz von 21 Aminosäuren wird aus einer Von-Heijne-Analyse (Von Heijne et al., Nucl. Acid Res. 14: 14683 (1986)) gefolgert, und eine Transmembranregion etwa von Aminosäure 235 bis 257 zeigt, dass das 3-2-Produkt ein Zelloberflächenprotein ist.
Die Sequenz der 1-7-cDNA (2; SEQ ID NO: 2) enthält einen offenen Leserahmen von 307 Aminosäuren, der mit dem offenen Leserahmen identisch ist, der in der 3-2-cDNA (SEQ ID NO: 3) enthalten ist. Die Sequenz der 4-7-cDNA (3; SEQ ID NO: 4) enthält einen offenen Leserahmen von 572 Aminosäuren (SEQ ID NO: 5). Eine Transmembranregion befindet sich etwa bei Aminosäuren 501–521.
B.) In-situ-Analyse der 1-7-, 3-2- und 4-7-mRNAs in kontralateralen und postischämischen ausgewachsenen Rattennieren:
Die in-situ-Hybridisierung wird nach der von Finch et al. beschriebenen Methode durchgeführt (Dev. Dynamics 203: 223–240, 1995). In Kürze: Sowohl ischämische als auch kontralaterale Nieren werden mit 4% Paraformaldehyd in PBS perfusionsfixiert. Die Nieren werden über Nacht bei 4°C weiterfixiert und verarbeitet. Paraffinschnitte werden entparaffiniert und rehydriert, mit 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert, mit Proteinase K verdaut, wieder fixiert, dann mit Essigsäureanhydrid in Triethanolamin-Puffer acetyliert. Die Schnitte werden dann dehydriert und mit ³²P-gelabelten Ribosonden bei 55°C über Nacht hybridisiert, mit ³³P-gelabelten Ribosonden, die aus den 3-2-RDA- oder 1-7-RDA-Produkten erzeugt wurden und in die BamH1-Site von pGEM-11Z subkloniert wurden. Nach der Hybridisierung wurden die Schnitte unter hochstringenten Bedingungen (2 × SSC, 50% Formamid bei 65°C) gewaschen. Die Schnitte wurden schließlich dehydriert, mit einer Emulsion (NBT-2) für die Autoradiographie umhüllt und mindestens eine Woche lang exponiert. Die Silberkörner werden entwickelt, und die Schnitte werden mit Toluidinblau gegengefärbt und mikrofotografiert.
Die Analyse der 1-7- und 3-2-mRNA-Expression durch in-situ-Hybridisierung zeigt, dass diese Gene in Zellen einer beschädigten Niere im Vergleich zu ihrer Expression in Schnitten normaler Nieren stark hochreguliert sind. Die beobachtete Expression findet in regenerativen Zellen des Cortex und der äußeren Medulla statt, und die meisten davon scheinen Zellen des proximalen Tubulus zu sein.
Die Analyse des 4-7-in-situ-RNA-Expressionsmusters zeigt auch eine reichliche Expression dieses Gens in der verletzten ischämischen Niere, verglichen mit der normalen ausgewachsenen Niere. Der Expressionsort scheinen infiltrierende Zellen zu sein.
6. Isolierung eines menschlichen cDNA-Klons, der mit Ratten-3-2-cDNA kreuzhybridisiert
Eine ³²P-gelabelte DNA-Sonde, umfassend Nukleotide 546–969 des Inserts des in 1 gezeigten Klons 3-2, wird erzeugt und verwendet, um eine menschliche embryonische Leber-Lambda-gt10-cDNA-Bibliothek (Clontech-Katalognummer HL5003a) zu durchsuchen. 1 × 10⁶ Plaques werden in doppelter Ausführung unter Standardbedingungen wie oben beschrieben gescreent, die Screening-Temperatur war jedoch 55°C. Zum Hochstringenzwaschen werden die Filter in 2 × SSC bei 55°C gewaschen. Fünfzig positive Phagen werden identifiziert und plaquegereinigt, und die DNA wird präpariert. Die Phagen-DNAs werden einer Southern-Analyse mithilfe derselben Sonde wie oben unterworfen. Der Southern-Blot-Filter wird einem finalen Waschen mit 0,5 × SSC bei 55°C unterzogen. Zwei Klone werden als positiv identifiziert. Das Insert von Klon H13-10-85 wird sequenziert und es wird eine Region gefunden, die für ein Protein kodiert, das einen hohen Identitätsgrad mit dem 3-2-Protein aus 3 hat.
Die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 6) und davon abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 7) des menschlichen 3-2-verwandten Proteins sind in 4 dargestellt. Wie durch die in 5 dargestellte Bestfit-Analyse gezeugt, ist das menschliche 3-2-verwandte Protein 43.8% identisch und 59.1% homolog zu dem Ratten-3-2-Protein. Beide enthalten IgG-, Mucin-, Transmembran- und cytoplasmatische Domänen. Die sechs Cysteine in den IgG-Domänen beider Proteine sind konserviert.
7. Herstellung eines NVM-1-Ig-Fusionsproteins
Ein Fusiosnprotein der extrazellulären Domäne von NVM und der Fc-Region von Immunglobulin (Ig) is ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Molekular- und Zellbiologie der verletzten/sich regenerierenden Niere und als therapeutisches Molekül. Um ein NVM-Ig-Fusionsprotein mit der extrazellulären Domäne von menschlichem und Ratten-NVM-1-Protein zu erzeugen, wurde ein Fragment der extrazellulären Domäne von NVM-1-cDNA mit PCR amplifiziert und für eine transiente Expression in COS-Zellen in den Biogen-Expressionsvektor pCA125 kloniert. Der Expressionsvektor pCA125 erzeugt ein Fusionsprotein, das eine Struktur mit Gen am N-Terminus und einer menschlichen Ig-Fc-Region am C-Terminus hat. COS-Zellen wurden mit den Plasmiden SJR 103 oder 104 transfiziert; diese Plasmide exprimieren ein Fusionsprotein, das die menschlichen NVM-Sequenzen 263–1147 (SEQ ID NO: 6; SJR 103) oder die Ratten-NVM-Sequenzen 599–1319 (SEQ ID NO: 1; SJR 104) der extrazellulären Domäne, fusioniert mit der menschlichen Ig-Fc-Region enthält. Die Zellen wurden in 10% FBS in DMEM in der Zellfabrik (Nunc, Naperville, IL) gezogen. Zwei bis drei Tage nach Transfektion wurde das Medium geerntet, mit einem Amicon-Konzentrator konzentriert, und das Fusionsprotein wurde mit einer Protein-A-Sepharose-Säule gereinigt. Nach der Reinigung wurde die Reinheit des Fusionsproteins mit SDS-PAGE bestimmt.
Diagnostische Anwendungen für die Verbindungen nach der Erfindung
Anti-NVM-Antikörper nach der Erfindung, die spezifisch an das Protein nach SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder ein Fragment davon binden, sind für mehrere diagnostische Verfahren verwendbar. Diese Agenzien können mit detektierbaren Markern, wie fluoroskopisch und radiographisch undurchlässigen Substanzen, gelabelt sein und einem Subjekt verabreicht werden, um Gewebe sichtbar zu machen, die NVM-Protein exprimieren. Die Agenzien könen auch an Substanzen wie Meerrettich-Peroxidase gebunden sein, die als immuncytochemische Färbestoffe zur Visualisierung von Bereichen NVM-Protein-positiver Zellen auf histologischen Schnitten verwendet werden können. Ein spezifischer Antikörper könnte allein auf diese Weise verwendet werden, und Stellen, wo er gebunden ist, können mit einem Sandwich-Assay mittels eines anti-Immunglobulin-Antikörpers visualisiert werden, der selbst an einen detektierbaren Marker gebunden ist.
Spezifische Antikörper gegen NVM-Protein sind ebenfalls in Immunoassays zur Messung der Anwesenheit oder Konzentration von NVM in Proben von Körpergeweben und -flüssigkeiten verwendbar. Solche Konzentrationen können mit verschiedenen Krankheitszuständen korreliert sein. Als eine Ausführungsform von besonderem Interesse umfasst die Erfindung Zusammensetzungen, die sich zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose von Nierenverletzungen oder einem Verfahren zum Überwachen eines Nierenreparaturvorgangs eignen, indem man die Konzentration von NVM oder NVM-Fragmenten in Harn, Plasma oder Serum eines Patienten mißt. In ähnlicher Weise kann NVM in Harnsediment gemessen werden, insbesondere in Zelltrümmern im Harnsediment. Harnzylinder aus Nierentubuli-Zellen, die sich in Harnsediment von Patienten mit einer chronischen Nierenerkrankung befinden können, können erhöhte Spiegel an NVM-Protein und mRNA enthalten.
Spezifische Antikörper gegen NVM-Protein können auch an feste Träger wie Kügelchen oder Schalen gebunden sein und zur Entfernung des Liganden aus einer Lösung verwendet werden, entweder für eine Messung oder zur Reinigung und Charakterisierung des Proteins oder seiner Merkmale (wie posttranslationaler Modifizierungen). Solch eine Charakterisierung des NVM-Proteins eines Patienten könnte für die Identifizierung von schädlichen Mutanten oder Prozessierungsfehlern, die die NVM-Funktion beeinträchtigen und mit abnormalen Patienten-Phänotypen einhergehen, nützlich sein. All diese Methoden sind Routine für Fachleute in Immunologie.
Weitere bildgebende Verfahren machen sich zum diagnostischen Imaging von Geweben, die NVM-Liganden exprimieren, insbesondere Tumoren, NVM oder NVM-Fragmente zunutze, die an bildgebungsfähige Bestandteile gebunden sind.
Weitere diagnostische Techniken basieren auf dem Nachweis von hochregulierter NVM-mRNA in Geweben, als ein Hinweis auf verletzungsbezogene Vorgänge. Dieses Verfahren wurde getestet und für ein Modell ischämischer Verletzung in Ratten für praktikabel erfunden, wie im folgenden beschrieben.
Um zu bestimmen, ob die Menge an NVM-1-Protein nach einer Verletzung erhöht ist, haben wir Nierenhomogenate kontralateraler und postischämischer Nieren 24 und 48 Stunden nach einem 40minütigen Abklemmen der Nierenarterie und -vene einer einzelnen Niere bei jeder Ratte untersucht. Das Nierenhomogenat wurde auf die Anwesenheit von NVM-1-Protein untersucht. Eine Western-Blot-Analyse identifiziert drei Proteine, die durch zwei unterschiedliche Antikörper nach ischämischer Verletzung detektiert wurden, und die in Homogenaten aus kontralateralen Nieren, die keiner ischämischen Verletzung ausgesetzt waren, nicht detektierbar sind. Die scheinbaren Molekulargewichte der Banden sind etwa 40 kDa, 50 kDa und 70–80 kDa. Die drei durch Western-Blot detektierten Proteinspezies könnten, angesichts des Vorhandenseins von potentiellen N- und O-Glykosylierungsstellen, glykosylierte Formen desselben Proteins repräsentieren. Die Tatsache, dass jedes dieser Proteine mit zwei verschiedenen Gruppen von polyklonalen Antikörpern reagiert, unterfüttert die Vorstellung, dass sie mit NVM-1 verwandt und keine kreuzreagierenden Banden sind. Eine Bestätigung dieser Vorhersage ergab sich aus den Ergebnissen partieller CNBr-Spaltung der drei Proteine, die zeigte, dass sie gemeinsame CNBr-Spaltfragmente teilten. Da die zytoplasmatische Domäne des NVM-1-Proteins laut Vorhersage keine bedeutenden posttranslationalen Modifikationen enthält, sollten die zwei kleinsten Verdauungsprodukte (4,7 kDa und 7,4 kDa), die mit Antikörpern gegen die zytoplasmatische Domäne von NVM-1 detektiert wurden, bei den drei verschiedenen NVM-1-Proteinbanden dieselbe Größe haben, wenn sie vom selben Protein stammen. We beobachteten, dass die NVM-1-40 kDa- und -70-80-kDa-Proteine Fragmente ergeben, die an der vorhergesagten Größe migrieren. Verdauung der 50-kDa-Proteinbande ergab ebenfalls dasselbe C-terminale Signaturbanden-Peptid.
Die NVM-1-Sequenz besitzt zwei mögliche N-Glykosylierungsstellen und eine Mucin-Domäne, bei der O-Glykosylierung über die gesamte Polypeptidkette hinweg möglich ist. Die drei NVM-1-Banden, die in postischämischer Niere detektiert werden, könnten Glykosylierungsvarianten desselben Proteins repräsentieren. De-N-Glykosylierung mit PNGase F ergab eine Verschiebung aller drei Banden auf ein niedrigeres Molekulargewicht, entsprechend einem Verlust von etwa 3 kDa, was darauf hinweist, dass alle drei Proteine N-glykosyliert sind. Unterschiede in der O-Glykosylierung könnten die Unterschiede in den Größen dieser drei Banden erklären.
Therapeutische Anwendungen für die Verbindungen nach der Erfindung
Die therapeutischen Verfahren nach der Erfindung umfassen das selektive Fördern oder Verhindern zellulärer Antworten, die von der NVM-Bindung abhängig sind. Sind NVM und der NVM-Ligand beide membrangebunden und von unterschiedlichen Zellen exprimiert, kann die Signaltransduktion in der NVM-exprimierenden Zelle, in der NVM-Ligand-exprimierenden Zelle oder in beiden stattfinden.
Eine von NVM-Bindung ausgelöste Antwort in einer NVM-Ligand-exprimierenden Zelle kann durch das Kontaktieren der Zelle mit exogenem NVM, NVM-Fusionsproteinen oder aktivierenden Antikörpern gegen NVM-Ligand in vitro oder in vivo erzeugt werden. Des weiteren könnten Antworten der NVM-Ligand-exprimierenden Zelle, die sonst durch endogenes NVM ausgelöst würden, durch Kontaktieren der NVM-Ligand-exprimierenden Zelle mit einem NVM-Ligand-Antagonisten (z.B. einem antagonistischen Antikörper, der an den NVM-Ligand bindet) oder durch Kontaktieren des endogenen NVM mit einem anti-NVM-Antikörper oder einem anderen NVM-bindenden Molekül, das eine effektive Bindung von NVM an einen NVM-Liganden verhindert, blockiert werden.
In ähnlicher Weise können die Antworten, die durch NVM-Bindung in der NVM-exprimierenden Zelle ausgelöst werden, mit exogenen Verbindungen gefördert oder verhindert werden. Zum Beispiel kann die durch NVM-Bindung ausgelöste Antwort in einer NVM-exprimierenden Zelle durch Kontaktieren der Zelle mit einem löslichen NVM-Liganden oder gewissen anti-NVM-aktivierenden Antikörpern erzeugt werden. Ferner könnten Antworten der NVM-exprimierenden Zelle, die sonst durch Wechselwirkung mit endogenem NVM-Liganden ausgelöst würden, durch Kontaktieren der NVM- exprimierenden Zelle mit einem Antagonisten gegen NVM (z.B. einem blockierenden Antikörper, der an NVM in einer Weise bindet, die eine effektive, signalgenerierende NVM-Bindung verhindert), oder durch Kontaktieren des endogenen NVM-Liganden mit einem anti-NVM-Ligand-Antikörper oder einem anderen NVM-Ligand-bindenden Molekül, das eine effektive Bindung von NVM an den NVM-Liganden verhindert, blockiert werden.
Welche der oben beschriebenen Interventionen für bestimmte therapeutische Anwendungen nützlich sind, hängt von dem jeweiligen ätiologischen Mechanismus ab, ob entweder der pathologische Vorgang inhibiert werden soll, oder der medizinisch erwünschte Vorgang gefördert werden soll, wie einem Fachmann in der Medizin einleuchten sollte. Zum Beispiel kann eine der oben beschriebenen Interventionen, die die durch die Bindung ausgelöste Antwort fördern, eingesetzt werden, wenn die NVM-Bindung zu erwünschtem Zellwachstum, zum Erhalt eines differenzierten Phänotyps, zu einer Widerstandsfähigkeit gegen von verschiedenen Insulten induzierte Apoptose, oder zu anderen medizinisch vorteilhaften Antworten führt. Alternativ kann eine der inhibitorischen Interventionen nützlich sein, wenn die NVM-Bindung unerwünschte Konsequenzen auslöst, wie neoplastisches Wachstum, schädlichen Zellfunktionsverlust, Anfälligkeit gegenüber Apoptose oder Förderung von Entzündungsereignissen.
Es folgen Beispiele für die oben beschriebenen therapeutischen Verfahren nach der Erfindung. Eine therapeutische Anwendung für die NVM-verwandten Verbindungen nach der Erfindung ist das Herstellen einer Zusammensetzung zur Behandlung eines Subjekts mit einer Nierenkrankheit, das Fördern des Wachstums neuen Gewebes in einem Subjekt oder das Fördern des Überlebens von beschädigtem Gewebe in einem Subjekt, und umfasst das Herstellen einer Zusammensetzung, die eine therapeutisch effektive Menge eines NVM-Proteins nach der Erfindung umfasst, oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Protein nach der Erfindung umfasst. Das in diesen Verfahren verwendete Protein kann ein Fragment eines Volllängen-NVM-Proteins, ein lösliches NVM-Ligand-Protein oder -Fusionsfragment oder ein NVM-Agonist sein. Diese Verfahren können auch durch das Herstellen einer Zusammensetzung ausgeführt werden, die eine therapeutisch effektive Menge eines agonistischen Antikörpers nach der Erfindung umfasst, oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen agonistischen Antikörper nach der Erfindung umfasst. Ein NVM-Protein kann dabei zusammen mit einer therapeutisch effektiven Menge einer zweiten Verbindung, die einen zusätzlichen medizinisch erwünschten Effekt bewirkt, umfasst sein. Während für diese Verfahren interessante Gewebe jedes Gewebe umfassen können, umfassen bevorzugte Gewebe Nierengewebe, Leber, Nervengewebe, Herz, Magen, Dünndarm, Rückenmark oder Lunge. Besondere Nierenzustände, die vorteilhaft mit den Verbindungen nach der Erfindung behandelt werden können, umfassen akutes Nierenversagen, akute Nephritis, chronisches Nierenversagen, nephrotisches Syndrom, Nierentubuli-Defekte, Nierentransplantate, toxische Verletzung, hypoxische Verletzung und Trauma. Nierentubuli-Defekte umfassen jene erblicher oder erworbener Natur, wie polyzystische Nierenkrankheit, medulläre Nierenzyste und Markschwammniere. Diese Liste ist nicht beschränkend und kann viele weitere Nierenstörungen umfassen (siehe z.B. Harrison's Principles of Internal Medicine, 13. Edition, 1994). Das Subjekt dieser Verfahren kann menschlich sein.
Ein therapeutischer Eingriff zur Verhinderung des Wachstums von unerwünschtem NVM-Ligand-exprimierendem Gewebe in einem Subjekt umfasst den Schritt des Verabreichens einer therapeutisch effektiven Menge eines NVM-Antagonisten (z.B. eines antagonistischen Antikörpers, der an einen NVM-Liganden bindet) an ein Subjekt oder das Verabreichen einer therapeutisch effektiven Menge eines anti-NVM-Antikörpers oder eines anderen NVM-bindenden Moleküls, das die NVM-Bindung an das NVM-Ligand-exprimierende Gewebe blockiert. In einer Ausführungsform von Interesse kann der NVM-Antagonist oder anti-NVM-Antikörper zur Herstellung einer Zusammensetzung verwendet werden, die das Wachstum von für ihr Wachstum von NVM-Protein abhängigen Tumoren inhibieren oder blockieren kann.
Weitere Verfahren nach der Erfindung umfassen das Töten von NVM-Ligand-exprimierenden Tumorzellen oder das Hemmen ihres Wachstums durch das Kontaktieren der Zellen mit einem Fusionsprotein aus einem NVM und einem Toxin oder Radionuklid, oder mit einem mit einem Toxin oder Radionuklid konjugierten anti-NVM-Ligand- Antikörper. Die Zelle kann in einem Subjekt sein, und das Protein oder der konjugierte Antikörper wird dem Subjekt verabreicht.
Ebenfalls von der Erfindung umfasst ist eine Zusammensetzung zur Zielsteuerung eines Toxins oder Radionuklids zu einer Zelle, die ein NVM exprimiert, umfassend ein Fusionsprotein, das einen NVM-Liganden und ein Toxin oder Radionuklid umfasst, oder einen anti-NVM-Antikörper, der an ein Toxin oder Radionuklid konjugiert ist. Eine weitere Ausführungsform umfasst eine Zusammensetzung. die zur Unterdrückung des Wachstums einer NVM-exprimierenden Tumorzelle geeignet ist, umfassend ein Fusionsprotein aus einem NVM-Liganden und einem Toxin oder Radionuklid oder einen anti-NVM-Antikörper, der an ein Toxin oder Radionuklid konjugiert ist; die Zelle kann in einem Subjekt sein und das Protein an das Subjekt verabreicht werden.
Der Begriff „Subjekt", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jedes Säugetier, an das NVM verabreicht werden kann. Subjekte, deren Behandlung mit dem Verfahren nach der Erfindung speziell beabsichtigt ist, umfassen Menschen sowie nichtmenschliche Primaten, Schafe, Pferde, Rinder, Ziegen, Schweine, Hunde, Katzen, Kaninchen, Meerschweinchen, Hamster, Wüstenrennmäuse, Ratten und Mäuse, sowie Organe, Tumoren und Zellen, die von diesen Wirten abgeleitet sind oder stammen.
Verwendung von Verbindungen nach der Erfindung in der Gentherapie
Die NVM-Gene nach der Erfindung können verwendet werden, um Zusammensetzungen herzustellen, die in beschädigtes Gewebe oder in Gewebe, in denen stimuliertes Wachstum erwünscht ist, eingebracht werden. Solch Gentherapie stimuliert die Produktion von NVM-Protein in den transfizierten Zellen, was das Zellwachstum und/oder das Überleben von Zellen, die das NVM-Protein exprimieren, fördert.
In einer speziellen Ausführungsform eines Gentherapieverfahrens kann ein für ein NVM-Protein kodierendes Gen verwendet werden, um Zusammensetzungen zu bereiten, die in ein Nieren-Zielgewebe eingebracht werden. Das NVM-Protein würde stabil exprimiert und das Gewebewachstum, die Zellteilung oder -differenzierung stimulieren, oder könnte zum Zellüberleben beitragen. Ferner kann ein NVM-Gen verwendet werden, um Zusammensetzungen herzustellen, die in eine Zielzelle mithilfe einer Vielzahl von wohlbekannten Verfahren, die sich entweder viraler oder nicht-viraler Strategien bedienen, eingebracht werden.
Nicht-virale Verfahren umfassen Elektroporation, Membranfusion mit Liposomen, Hochgeschwindigkeitsbombardement mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen, Inkubation mit Calcium-Phosphat-DNA-Präzipitat, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion und direkte Mikroinjektion in einzelne Zellen. Ein NVM-Gen kann beispielsweise durch Calcium-Phosphat-Kopräzipitation (Pillicer et al., Science, 209 1414–1422, 1980), mechanische Mikroinjektion und/oder Partikelbeschleunigung (Anderson et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77: 5399–5403, 1980), Liposom-basierten DNA-Transfer (z.B. LIPOFECTIN-vermittelte Transfektion, Fefgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 84: 471–477, 1987; Gao and Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179: 280–285, 1991), DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Elektroporation (U.S.-Patent 4,956,288) oder polylysinbasierte Verfahren, in denen die DNA konjugiert ist, um DNA vorzugsweise zu Leberhepatozyten zu transportieren (Wolff et al., Science, 247: 465–468, 1990; Curiel et al., Human Gene Therapy 3: 147–154, 1992) in eine Zelle eingeführt werden.
Zielzellen können mit den Genen nach der Erfindung durch direkten Gentransfer transfiziert werden; siehe z.B. Wolff et al., "Direct Gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo", Science 247: 1465–68, 1990. In vielen Fällen wird eine vektorvermittelte Transfektion erwünscht sein. Jedes der im Fachbereich bekannten Verfahren zur Insertion von Polynukleotidsequenzen in einen Vektor kann verwendet werden (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992).
Die Promotor-Aktivierung kann gewebespezifisch oder durch ein metabolisches Produkt oder eine verabreichte Substanz induzierbar sein. Solche Promotoren/Enhancer umfassen, sind aber nicht beschränkt auf den nativen c-ret-Ligand-Protein-Promotor, den Cytomegalovirus-Immediate/Early-Promotor/Enhancer (Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13, 1989); den humanen beta-Actin Promotor (Gunning et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 4831, 1987); den Glucokortikoid-induzierbaren Promotor, der sich im langen terminalen Repeat des Maus-Brusttumorvirus (MMTV-LTR; Klessig et al., Mol. Cell. Biol., 4: 1354, 1984) befindet; die langen terminalen Repeat-Sequenzen von Moloney-Maus-Leukämievirus (MuLV-LTR; Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1985); den SV40-Frühe-Region-Promotor (Bernoist and Chambon, Nature, 290: 304, 1981); den Promotor von Rous-Sarkom-Virus (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 22: 787, 1980); den Herpes-simplex-Virus (HSV)-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 1441, 1981); und den Adenovirus-Promotor (Yamada et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 3567, 1985).
Die NVM-Gene könen auch durch spezielle virale Vektoren zur Verwendung in Gentransfer-Systemen eingebracht werden, die sich nun durchgesetzt haben; siehe z.B. Madzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533–36, 1992 (Papovavirus SV40); Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39–61, 1992 (Adenovirus); Hofmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 10099–10103, 1995 (Baculovirus); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25–38, 1992 (Vacciniavirus); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97–123, 1992 (Adenoassoziiertes Virus); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67–93, 1992 (Herpes-simplex-Virus (HSV) und Epstein-Barr-Virus (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1–24, 1992 (Retrovirus); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4: 749–754, 1984 (Retrovirus); Miller et al., Nature, 357: 455–450, 1992 (Retrovirus); Anderson, Science, 256: 808–813, 1992 (Retrovirus), Current Protocols in Molecular Biology: Abschnitte 9.10–9.14 (Ausubel et al., Ed.), Greene Publishing Associates, 1989.
Bevorzugte Vektoren sind DNA-Viren, die Adenoviren (vorzugsweise Ad-2- oder Ad-5-basierte Vektoren), Baculovirus, Herpesviren (vorzugsweise Herpes-simplex-Virus-basierte Vektoren) und Parvoviren (vorzugsweise „fehlerhafte" oder nicht-autonome parvovirusbasierte Vektoren, mehr vorzugsweise Vektoren basierend auf adenoassoziiertem Virus, am meisten vorzugsweise AAV-2-basierte Vektoren) umfassen; siehe z.B. Ali et al., Gene Therapy 1: 367–384, 1994; U.S.-Patente 4,797,368 und 5,399,346; und die Diskussion unten.
Die Wahl eines bestimmten Vektorsystems zum Transport z.B. einer NVM-Sequenz wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen. Ein wichtiger Faktor ist das Wesen der Zielzellpopulation. Obwohl retrovirale Vektoren ausgiebig untersucht und in einer Anzahl von Gentherapie-Anwendungen verwendet worden sind, sind sie im allgemeinen zur Infektion von sich nicht teilenden Zellen ungeeignet, aber können für die Krebstherapie nützlich sein, da sie sich nur in sich replizierende Zellen integrieren und nur in diesen ihre Gene exprimieren. Sie sind für ex-vivo-Herangehensweisen nützlich und wegen ihrer stabilen Integration in das Zielzellgenom in dieser Hinsicht attraktiv.
Adenoviren sind eukaryotische DNA-Viren, die effizient modifiziert werden können, um ein therapeutisches oder Reporter-Transgen zu einer Vielzahl von Zelltypen zu bringen. Die allgemeinen Adenovirus-Typen 2 und 5 (Ad2 bzw. Ad5), die Atemwegserkrankungen in Menschen auslösen, werden gegenwärtig für die Gentherapie von Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) und Zystischer Fibrose (CF) entwickelt. Sowohl Ad2 als auch Ad5 gehören zu einer Unterklasse von Adenoviren, die nicht mit menschlichen Tumoren in Verbindung stehen. Adenovirus-Vektoren können extrem hohe Niveaus im Transgen-Transport an im Grunde alle Zelltypen erreichen, unabhängig von der Mitosephase. Hohe Titer (10¹³ plaquebildende Einheiten/ml) von rekombinantem Virus können auf einfache Weise in 293-Zellen (eine adenovirustransformierte, menschliche embryonische Komplementations-Nierenzelllinie: ATCC CRL1573) erzeugt und über längere Zeiträume ohne nennenswerte Verluste kryogelagert werden. Die Effizienz dieses Systems beim Transport eines therapeutischen Transgens, das ein genetisches Ungleichgewicht komplementiert, in vivo wurde in Tiermodellen verschiedener Erkrankungen gezeigt; siehe Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261–268, 1986; Tanzawa et al., FEBS Letters 118 (1): 81–84, 1980; Golasten et al., New Engl. J. Med. 309: 288296, 1983; Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 92: 883–893, 1993; und Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 93: 1889–1893, 1994. In der Tat wurde ein rekombinantes replikationsdefektes Adenovirus, das für eine cDNA für den Transmembran-Regulator der Zystischen Fibrose (CFTR) kodiert, zur Verwendung in mindestens zwei klinischen Studien zur menschlichen Zystischen Fibrose zugelassen; siehe z.B. Wilson, Nature 365: 691–692, 1993. Weitere Stütze für die Ungefährlichkeit rekombinanter Adenoviren für die Gentherapie ist die umfangeiche Erfahrung mit Adenovirus-Lebendimpfstoffen in menschlichen Populationen.
Die rekombinanten replikationsdefekten Adenoviren der ersten Generation, die für die Gentherapie von DMD und anderen ererbten Erkrankungen entwickelt wurden, enthalten Deletionen der gesamten E1a- und von Teilen der E1b-Region. Dieses replikationsdefekte Virus wird in 293-Zellen gezogen, die ein funktionales Adenovirus-E1a-Gen enthalten, das für ein transagierendes E1a-Protein kodiert. E1-deletierte Viren können sich in den 293-Zellen, die E1a- und E1b-Region-Genprodukte in trans liefern, replizieren und infektiöses Virus erzeugen. Das daraus resultierende Virus kann viele Zelltypen infizieren und das eingebrachte Gen (wenn es seinen eigenen Promotor trägt) exprimieren, sich jedoch nicht in einer Zelle replizieren, die die E1-Region-DNA nicht trägt, es sei denn, die Zelle wäre mit einer sehr hohen Infektionsmultiplizität infiziert. Adenoviren besitzen den Vorteil, dass sie eine breite Wirtsspezifität haben, Zellen im Ruhezustand oder terminal differenzierte Zellen wie Neuronen infizieren können und im wesentlichen nicht-onkogen zu sein scheinen. Adenoviren scheinen sich nicht in das Wirtsgenom zu integieren. Da sie extrachromosomal existieren, ist das Risiko einer Mutagenese durch Insertion stark reduziert; siehe Ali et al., a.a.O., Seite 373. Rekombinante Adenoviren (rADV) erzeugen sehr hohe Titer, die Virenpartikel sind mittelgadig stabil, die Expressionsniveaus hoch, und eine breite Auswahl an Zellen kann infiziert werden. Ihre natürlichen Wirtszellen sind die des Atemwegsepithels, so dass sie für die Therapie von Lungenkarzinomen verwendet werden können.
Ein Baculovirus-vermittelter Transfer bietet mehrere Vorteile. Der baculovirale Gentransfer kann in sich replizierenden und sich nicht replizierenden Zellen sowie in Nierenzellen als auch in Hepatozyten, Nervenzellen, Milz, Haut und Muskel vor sich gehen. In Säugerzellen repliziert sich das Baculovirus nicht und ist nicht pathogen. Menschen fehlen von vornherein vorliegende Antikörper gegen rekombinantes Baculovirus, die eine Infektion blockieren könnten. Darüber hinaus ist das Baculovirus in der Lage, sehr große DNA-Inserts aufzunehmen und zu transportieren.
Adenoassoziierte Viren (AAV) wurden ebenfalls als Vektoren für somatische Gentherapie verwendet. AAV ist ein kleines einzelsträngiges (ss) DNA-Virus mit einer einfachen genomischen Organisation (4–7 Kilobasen), die es zu einem idealen Substrat für genetische Manipulation macht. Zwei offene Leserahmen kodieren für eine Reihe von rep- und cap-Polypeptiden. Rep-Polypeptide (rep78, rep68, rep62 und rep40) sind in die Replikation, Rescue und Integration des AAV-Genoms involviert. Die cap-Proteine (VP1, VP2 und VP3) bilden das Virion-Kapsid. Inverse terminale Wiederholungssequenzen mit 145 Basenpaaren (ITRs) flankieren die offenen Leserahmen von rep und cap an den 5'- und 3'-Enden, wobei die ersten 125 Basenpaare Y- oder T-förmige Duplexstrukturen bilden können. Von Wichtigkeit für die Entwicklung von AAV-Vektoren ist, dass die gesamten rep- und cap-Domänen herausgeschnitten und durch ein therapeutisches oder Reporter-Transgen ersetzt werden können; siehe B. J. Carter, im Handbook of Parvoviruses, Ed., P. Tijsser, CRC Press, Seiten 155–168 (1990). Es ist gezeigt worden, dass die ITRs die kleinstmögliche für Replikation, Rescue, Verpackung und Integration des AAV-Genoms erforderliche Sequenz darstellen.
Adenoassoziierte Viren (AAV) haben ein signifikantes Potential in der Gentherapie. Die Viruspartikel sind sehr stabil, und rekombinante AAVs (rAAVs) besitzen „wirkstoffartige" Charakteristika, da sie durch Pelletierung oder CsCl-Gradienten-Bänderung gereinigt werden können. Sie sind hitzestabil und können zu einem Pulver lyophilisiert sowie zu voller Aktivität rehydriert werden. Ihre DNA integriert sich stabil in Wirtschromosomen, so dass die Expression langanhaltend ist. Ihre Wirtsspezifität ist breit, und AAV verursacht keine bekannte Krankheit, so dass die rekombinanten Vektoren nichttoxisch sind.
Einmal in die Zielzelle eingebracht, können interessierende Sequenzen mittels konventioneller Verfahren wie Nukleinsäure-Hybridisierung mithilfe von Sonden, die Sequenzen umfassen, die homolog oder komplementär zu den im Vektor inserierten Gensequenzen sind, identifiziert werden. In einer weiteren Herangehensweise kann/können die Sequenz(en) durch die An- oder Abwesenheit einer „Marker"-Gen-Funktion (z.B. Thymidinkinase-Aktivität, Antibiotika-Resistenz und so weiter), die durch das Einführen des Expressionsvektors in die Zielzelle verursacht wurde, identifiziert werden.
Formulierungen und Verabreichung
Die Verbindungen nach der Erfindung werden nach Standardverfahren wie der Einbettung in ein Trägervehikel formuliert. Der Begriff „pharmakologisch akzeptabler Träger" bezeichnet einen oder mehrere organische oder anorganische Inhaltsstoffe, natürlich oder künstlich, mit denen das mutierte Protoonkogen oder das mutierte Onkoprotein zur Erleichterung seiner Verabreichung kombiniert wird. Ein geeigneter Träger umfasst sterile Saline, obwohl weitere wäßrige und nicht-wäßrige isotonische sterile Lösungen und sterile Suspensionen, die als pharmazeutisch akzeptabel bekannt sind, dem ordentlichezi Fachmann bekannt sind. In dieser Hinsicht, umfasst der Begriff „Träger" Liposomen und das HIV-1-tat-Protein (siehe Chen et al., Anal. Biochem. 227: 168–175, 1995) sowie alle Plasmide und viralen Expressionsvektoren.
Alle neuartigen Polypeptide nach dieser Erfindung können in der Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes verwendet werden. Geeignete Säuren und Basen, die Salze mit den Polypeptiden nach der vorliegenden Erfindung bilden können, sind den Fachleuten wohlbekannt und umfassen anorganische und organische Säuren und Basen.
Eine Verbindung nach der Erfindung wird einem Subjekt in einer therapeutisch effektiven Menge verabreicht, also einer Menge an Verbindung, die ein medizinisch erwünschtes Resultat erzeugt oder einen Einfluß auf die jeweilige behandelte Erkrankung ausübt. Eine effektive Menge an einer Verbindung nach der Erfindung ist in der Lage, den kranken, degenerativen oder beschädigten Zustand zu verbessern oder dessen Fortschreiten zu verzögern. Die effektive Menge kann auf individueller Basis bestimmt werden und wird zum Teil auf der Abwägung der physischen Merkmale des Subjekts, der zu behandelnden Symptome und der angestrebten Resultate beruhen. Eine effektive Menge kann durch einen ordentlichen Fachmann durch die Anwendung dieser Faktoren und mit nicht mehr als Routineexperimenten bestimmt werden.
Ein liposomales Transportsystem für eine Verbindung nach der Erfindung kann jedes aus aus einer Vielzahl von unilamellaren Vesikeln, multilamellaren Vesikeln oder stabilen plurilamellaren Vesikeln sein und nach den Fachleuten wohlbekannten Verfahren hergestellt und verabreicht werden, zum Beispiel in Übereinstimmung mit der Lehre der U.S.-Patente 5,169,637, 4,762,915, 5,000,958 oder 5,185,154. Des weiteren kann es erstrebenswert sein, die neuartigen Polypeptide nach dieser Erfindung sowie andere ausgewählte Polypeptide als Lipoproteine zu exprimieren, um ihre Bindung an Liposomen zu verbessern. Zum Beispiel kann die Behandlung von menschlichem akutem Nierenversagen mit liposomal verkapseltem NVM-Protein in vivo durch Einbringen eines NVM-Proteins in Zellen, die solcher Behandlung bedürfen, mittels Liposomen durchgeführt werden. Die Liposomen können mittels Katheter in die Nierenarterie eingebracht werden. Das rekombinante NVM-Protein wird zum Beispiel aus CHO-Zellen durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt oder ein anderes passendes Verfahren gereinigt, dann mit Liposomen gemischt und in diese mit hoher Effizienz inkorporiert. Das verkapselte Protein kann in vitro auf Effekte auf die Stimulierung des Zellwachstums getestet werden.
Die Verbindungen nach der Erfindung können auf jede medizinisch akzeptable Weise verabreicht werden. Dies kann Injektionen auf parenteralem Wege wie intravenös, intravaskulär, intraarteriell, subkutan, intramuskulär, intratumoral, intraperitoneal, intraventrikulär, intraepidural oder andere ebenso umfassen wie orale, nasale, ophthalmische, rektale oder topische Verabreichung. Verabreichung mit verzögerter Freisetzung ist ebenfalls speziell von der Erfindung umfasst, durch solche Maßnahmen wie Depotinjektionen oder zerfallende Implantate. Lokale Verabreichung wird besonders in Betracht gezogen, durch Maßnahmen wie Transport via Katheter zu einer oder mehreren Arterien wie der Nierenarterie oder einem Gefäß, das einen lokalisierten Tumor versorgt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die wenigstens zu 90% identisch ist mit der Sequenz nach SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, oder SEQ ID NO: 7, und das ein Nierenverletzungs-Molekül (NVM) ist, wobei besagtes NVM ein Zelloberflächenprotein ist, das selektiv in post-ischämischem Nierengewebe von Säugetieren exprimiert wird.
Das Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz wenigstens zu 95% identisch ist mit der Sequenz nach SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, oder SEQ ID NO: 7, und das ein Nierenverletzungs-Molekül (NVM) ist, wobei besagtes NVM ein Zelloberflächenprotein ist, das selektiv in post-ischämischem Nierengewebe von Säugetieren exprimiert wird.
Das Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die Sequenz nach SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, oder SEQ ID NO: 7 umfaßt.
Das Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid aus SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, oder SEQ ID NO: 7 besteht.
Ein Polypeptid, umfassend eine lösliche Variante des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Ein Fusionsprotein, umfassend die extrazelluläre Domäne des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und eine Fc-Region eines Immunglobulins.
Eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert.
Eine Nukleinsäure, die für das Fusionsprotein nach Anspruch 6 kodiert.
Die Nukleinsäure nach Anspruch 7, wobei die Nukleinsäure SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 umfaßt, oder wobei besagte Nukleinsäure unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 hybridisiert, die für ein Nierenverletzungs-Molekül (NVM) kodiert, wobei besagtes NVM ein Zelloberflächenprotein ist, das selektiv in post-ischämischem Nierengewebe von Säugetieren exprimiert wird, wobei die Hybridisierungsbedingungen ein Waschen in 2 × SSC bei 55°C und ein finales Waschen in 0.5 × SSC bei 55°C umfassen.
Ein Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 7 bis 9.
Eine Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 10.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 11 in einem Zellkulturmedium; und Gewinnen des von dem Vektor in der Wirtszelle exprimierten Polypeptids.
Ein Antikörper, der an das Polypeptid nach Anspruch 4 bindet.
Der Antikörper nach Anspruch 13, wobei der Antikörper an ein Toxin oder Radionuklid konjugiert ist.
Der Antikörper nach Anspruch 13 oder 14, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Der Antikörper nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der Antikörper ein humanisierter Antikörper, ein menschlicher Antikörper, ein einzelkettiger Antikörper, ein Fab-Fragment, oder ein chimärer Antikörper ist.
Ein Hybridom, das den Antikörper nach Anspruch 13 oder 15 herstellt.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend (i) das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das Fusionsprotein nach Anspruch 6, oder den Antikörper nach einem der Ansprüche 13 bis 16, und (ii) einen pharmakologisch akzeptablen Träger.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5, des Fusionsproteins nach Anspruch 6, oder des Antikörpers nach einem der Ansprüche 13 bis 16 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der Nierenverletzung oder -krankheit eines Subjekts, das an einer Nierenverletzung oder -krankheit leidet.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5, des Fusionsproteins nach Anspruch 6, oder des Antikörpers nach einem der Ansprüche 13 bis 16 zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zur Beurteilung des Vorliegens oder des Verlaufs des Rückgangs der Nierenverletzung oder -krankheit eines Subjekts, das an einer Nierenverletzung oder -krankheit leidet.
Die Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Subjekt ein Mensch ist.
Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 13 bis 16 zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zur Bildgebung von Zellen oder Gewebe, die/das das Polypeptid nach Anspruch 4 exprimieren/exprimiert.
Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Zielsteuerung eines Toxins oder Radionuklids zu Zellen, die das Polypeptid nach Anspruch 4 exprimieren.
Das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das Fusionsprotein nach Anspruch 6, oder der Antikörper nach einem der Ansprüche 13 bis 16 zur Verwendung in der Therapie oder in der Diagnose.