CZ295936B6 - Izolovaný polypeptid KIM, modulátor tkáňové regenerace, a nukleová kyselina, která ho kóduje, způsob přípravy polypeptidu a farmaceutická kompozice obsahující polypeptid - Google Patents

Izolovaný polypeptid KIM, modulátor tkáňové regenerace, a nukleová kyselina, která ho kóduje, způsob přípravy polypeptidu a farmaceutická kompozice obsahující polypeptid Download PDF

Info

Publication number
CZ295936B6
CZ295936B6 CZ19983813A CZ381398A CZ295936B6 CZ 295936 B6 CZ295936 B6 CZ 295936B6 CZ 19983813 A CZ19983813 A CZ 19983813A CZ 381398 A CZ381398 A CZ 381398A CZ 295936 B6 CZ295936 B6 CZ 295936B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
polypeptide
kim
thr
ser
Prior art date
Application number
CZ19983813A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ381398A3 (cs
Inventor
Michele Sanicola-Nadel
Joseph V. Bonventre
Catherine A. Hession
Takaharu Ichimura
Henry Wei
Richard L. Cate
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
The General Hospital Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26690881&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ295936(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Ma Inc., The General Hospital Corporation filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of CZ381398A3 publication Critical patent/CZ381398A3/cs
Publication of CZ295936B6 publication Critical patent/CZ295936B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)

Abstract

Popisují se proteiny, jejichž koncentrace vzrůstá v poraněných nebo regenerujících tkáních, jakož i DNA kódující tyto proteiny. Dále se popisují farmaceutické kompozice a způsoby léčby využívající tyto proteiny.

Description

Oblast techniky
Vynález popisuje proteiny jejichž koncentrace vzrůstá v poraněných nebo regenerujících tkáních, jakož i DNA kódující tyto proteiny. Vynález dále popisuje farmaceutické kompozice a způsoby léčby využívající tyto proteiny.
Dosavadní stav techniky
Během vývoje orgánů a během regenerace tkání po poranění dochází k dynamickému formování tkání. Pro studium tohoto procesu jsme se zaměřili na model poškození ledvin způsobeného ischemickým reperfuzním traumatem (poškození vznikající obnovením krevního oběhu po ischemickém stavu).
Ledviny jsou schopny regenerovat po poškození proximálního tubulámího epitelu pomocí komplexní série událostí zahrnující programovou buněčnou smrt, proliferaci přeživších buněk proximálního tubulárního epitelu, vznik slabě diferencovaného regenerativního epitelu na obnažené bazální membráně, diferenciaci regenerativního epitelu na zcela funkční buňky proximálního tubulárního epitelu (viz Wallin a další, Lab. Invest. 66: strana 474 až 484, 1992; Witzgall a další, Mol. Cell. Biol. 13: strana 1933 až 1942, 1994; Ichimuraa další, Am. J. Physiol. 269, strana F653 až 662, 1995; Thadhani a další N. Engl. J. Med. 334: strana 1448 až 1460, 1996). Na tomto regeneračním procesu se účastní růstové faktory jako jsou IGF, EGF a HGF, jakož i adhezní molekula endoteliálních buněk ICAM-1. Nicméně, mechanizmus, kterým jsou buňky tubulámího epitelu obnovovány, je stále neznámý.
Pro studium a identifikaci molekul podílejících se na průběhu traumatu a následné regeneraci tubulámího epitelu jsme analyzovali rozdíl v populacích mRNA mezi poraněnými respektive regenerujícími a normálními ledvinami pomocí diferenční analýzy mRNA (RDA, representational difference analysis). RDA je způsob založený na polymerázové řetězové reakci (PCR) a opakovaném odečítání a amplifíkaci zbývajících fragmentů, čímž lze získat cDNA fragmenty specifické pro určitou cílovou tkáň nebo buňku (viz Hubank a Schutz, Nucl. Acids Res. 22: strana 5640 až 5648, 1994).
Podstata vynálezu
Vynález především popisuje molekuly spojené s poškozením ledvin (Kidney injury related molecules, dále jsou nazývány molekulami „KIM“), jejichž koncentrace vrenální (ledvinové) tkáni se po poškození ledvin zvyšuje. Proteiny a peptidy KIM podle vynálezu, jakož i jejich agonisté a antagonisté, jakož i jejich deriváty jsou vhodné pro různá terapeutická použití.
Vynález popisuje přečištěnou a izolovanou molekulu DNA s nukleotidovou sekvencí podle Sekvence id. č.:l, Sekvence id. č.:2, Sekvence id. č.:4 nebo Sekvence id. č.:6. Vynález dále popisuje komplementární vlákna k těmto sekvencím, molekuly DNA schopné za stringentních podmínek hybridizovat s těmito DNA molekulami a DNA molekuly, které jsou v důsledku degenerace genetického kódu obdobné výše zmíněným. Tyto molekuly DNA mohou být rekombinantní a mohou být funkčně spojeny se sekvencí kontrolující expresi.
Vynález dále popisuje vektor obsahující přečištěnou a izolovanou molekulu DNA s nukleotidovou sekvencí podle Sekvence id. č.:l, Sekvence id. č.:2, Sekvence id. č.:4 nebo Sekvence id. č.:6 a nebo libovolnou výše definovanou DNA molekulu. Tento vektor může být biologicky funkční
-1 CZ 295936 B6 plazmid nebo virový DNA vektor. Jedno z provedení vynálezu popisuje prokaryotickou nebo eukaryotickou hostitelskou buňku stabilně transformovanou nebo transfikovanou vektorem obsahujícím molekulu DNA podle Sekvence id. č.:l, Sekvence id. č.:2, Sekvence id. č.:4 nebo Sekvence id. č.:6. V dalším provedení vynálezu je popisován způsob přípravy polypeptidu KIM kódovaného výše popsanou molekulou DNA; přičemž tento způsob zahrnuje kultivaci prokaryotických nebo eukaiyotických hostitelských buněk transformovaných nebo transfíkovaných molekulou DNA podle vynálezu, za kultivačních podmínek vhodných pro expresi tohoto peptidu a následnou izolaci polypeptidového produktu této exprese.
Vynález popisuje izolovaný a přečištěný lidský protein KIM v podstatě zbavený dalších lidských proteinů, jakož i způsob produkce polypeptidového produktu, který má část nebo celou primární strukturní konformaci a biologickou aktivitu proteinu KIM.
Proteiny KIM podle vynálezu mohou mít aminokyselinové sekvence obsahující Sekvence id. č.:3, 5 nebo 7 a nebo mohou být variantami Sekvencí id. č.:3, 5 nebo 7, nebo může jít o izolované a přečištěné proteinové produkty kódované DNA podle Sekvencí id. č.:l, 2, 4 nebo Sekvencí id. č.:6. Tyto proteiny mohou být připraveny jako v podstatě prosté všech dalších lidských proteinů. Vynález dále popisu je varianty těchto proteinů, jako jsou například rozpustné varianty nebo fúzní proteiny. Fúzní proteiny proteinu KIM podle vynálezu mohou obsahovat imunoglobulin, toxin, zobrazitelnou kontrastní látku vhodnou pro detekci nebo radionuklid.
Vynález dále popisuje specifickou moklonální protilátku proti výše popsaným proteinům KIM. Anti-KIM protilátka může být spojena s toxinem, se zobrazitelnou kontrastní látkou vhodnou pro detekci nebo s radionuklidem. Vynález rovněž popisuje hybridom produkující takovou specifickou protilátku.
Vynález rovněž zahrnuje farmaceutické kompozice. Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou obsahovat terapeuticky účinné množství proteinu KIM nebo protilátky proti proteinu KIM podle vynálezu spolu farmakologicky přijatelným nosičem.
Vynález rovněž popisuje diagnostické metody pro odhad rozsahu a průběhu poškození ledvin pomocí měření koncentrace proteinů KIM v moči, séru nebo močovém sedimentu pacientů s poškozením ledvin nebo s rizikem takového onemocnění.
Způsoby léčby podle vynálezu zahrnují ošetření pacientů terapeuticky účinným množstvím proteinů KIM, variant proteinů KIM, analogů proteinů KIM, fúzních proteinům KIM, agonistů proteinu KIM a protilátek proti proteinům KIM nebo proti ligandům proteinů KIM. Další terapeutické sloučeniny podle vynálezu zahrnují ligandy proteinů KIM, protilátky proti proteinům KIM a fúzní proteiny ligandů proteinů KIM. Tyto sloučeniny jsou významné pro způsoby léčby stimulující nebo inhibující buněčné odpovědi závislé na funkčních proteinů KIM.
Vynález dále popisuje způsoby inhibice růstu nádorových buněk exprimujících proteiny KIM pomocí kontaktu nádorové buňky s fúzním proteinem KIM-ligandu a toxinu nebo radionuklidu, nebo pomocí kontaktu s anti-KIM protilátkou konjugovanou s toxinem nebo k radionuklidem. Podobným způsobem může být inhibován i růst nádorových buněk, které exprimují ligand proteinu KIM. V tomto případě se výhodně využije kontaktu nádorové buňky s fúzním proteinem sestávajícím z proteinu KIM a toxinu nebo radionuklidu, nebo kontaktu protilátky proti ligandu proteinu KIM konjugováné s toxinem nebo radionuklidem.
Vynález také popisuje způsoby genové terapie. Tyto způsoby zahrnují ošetření léčeného organizmu s poruchou funkce ledvin, způsob na povzbuzení růstu nové ledvinové tkáně a způsob podporující přežití poškozené tkáně, přičemž tyto způsoby zahrnují podání vektoru, který obsahuje DNA s nukleotidovou sekvencí podle Sekvence id. č.:l, Sekvence id. č.:2, Sekvence id. č.:4 nebo Sekvence id. č.:6, léčenému organizmu.
-2CZ 295936 B6
Sloučeniny podle vynálezu jsou dále užitečné pro studium a zobrazování tkáně, a to jak in vitro, tak i in vivo. Jeden takový způsob zahrnuje specifické nasměrování zobrazitelné kontrastní sloučeniny sloužící pro detekci k buňkám exprimujícím protein podle Sekvence id. č.:3, Sekvence id. č.:5 nebo Sekvence id. č.:7, přičemž dochází ke kontaktu buňky buď smoklonální protilátkou podle vynálezu, nebo fúzním proteinem obsahujícím protein podle vynálezu navázaný na skupinu sloužící k vizuální detekci. Tento systém lze použít i pro způsoby detekce in vivo, přičemž uvedené buňky jsou v těle léčeného organizmu a tomu je poté podán protein nebo monoklonální protilátka podle vynálezu.
Vynález dále zahrnuje způsoby diagnózy jako je způsob stanovení poškození nebo regenerace buněk ledvin pomocí porovnání úrovně exprese jednoho z polypeptidů se sekvencí podle Sekvence id. č.: 1, 2, 4 nebo Sekvence id. č.:6 v ledvinových buňkách léčeného organizmu s úrovní exprese těchto polypeptidů v kontrolních ledvinových buňkách. Další způsob podle vynálezu zahrnuje identifikaci zvýšené koncentrace (upregulace) polypeptidů podle Sekvencí id. č.:l, 2, 4 nebo Sekvence id. č.:6 v buňkách, přičemž tento způsob zahrnuje kontakt buňky s antisense hybridizační sondou a měření signálu po hybridizaci s RNA v buňce.
V dalším provedení zahrnují diagnostické způsoby podle vynálezu odhad přítomnosti nebo koncentrace molekul podle vynálezu v moči, séru či jiné tělesné tekutině, nebo v sedimentu moči nebo vzorcích tkáně. Naměřené koncentrace molekul spojených s poraněním ledvin lze korelovat s přítomností, rozsahem nebo průběhem patologického procesu. Tohoto vztahu lze rovněž využít pro vyhodnocení účinnosti terapie.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1: na obrázku je znázorněna nukleotidová sekvence krysího cDNA klonu 3-2 s odvozeným čtecím rámcem proteinu v nukleotidech 615 až 1535.
Obrázek 2: na obrázku je znázorněna nukleotidová sekvence krysího cDNA klonu 1-7 s vyznačeným pravděpodobným čtecím rámcem proteinu v nukleotidech 145 až 1065.
Obrázek 3: na obrázku je znázorněna nukleotidová sekvence krysího cDNA klonu 4-7, s vyznačeným pravděpodobným čtecím rámcem proteinu vnukleotidech 107 až 1822.
Obrázek 4: na obrázku je znázorněna nukleotidová sekvence a odvozená proteinová sekvence lidského cDNA klonu HI3-10-85, s vyznačeným pravděpodobným čtecím rámcem proteinu vnukleotidech 1 až 1002. Na horních řádkách je vyznačena cDNA sekvence (Sekvence id.č.:6) a na dolních řádcích je odvozená sekvence aminokyselinová (Sekvence id.č. :7)
Obrázek 5: je srovnání nukleotidových sekvencí lidského klonu HI3-10-85 s krysím klonem 32 provedené programem BESTFIT.
Příklady provedení vynálezu
Geny pro proteiny KIM byly identifikovány tak, že byly analyzovány rozdíly v expresi mRNA mezi regenerující a normální ledvinovou tkání. K tomu bylo použito reprezentativní diferenční analýzy (RDA). RDA je metoda založená na PCR, která slouží k zachycení tkáňové nebo buněčné specifické cDNA pomocí opakovaného odečítání a amplifíkace fragmentů. cDNA reprezentující mRNA z ledvin dospělé krysy 48 hodin po ischemickém stavu se nechá hybridizovat s normální kontrolní dospělé krysí ledviny (podobným způsobem operované, ale bez navození ischemického stavu). Tím se odstraní sekvence, které jsou běžné jak pro postischemickou, tak i pro normální ledvinu a zůstanou pouze sekvence, které jsou významnou měrou exprimovány pouze ve zraněné ledvinové tkáni. Tyto geny kódují proteiny, které mohou být užitečné pro tera
-3CZ 295936 B6 pii poškození ledvin, nebo se mohou podílet na procesu poranění a regenerace ledvinové tkáně. Tímto způsobem bylo získáno několik klonů, které byly sekvenovány a charakterizovány. Klony byly poté zkoumány a byla testována jejich exprese během regenerace ledviny, vývoje a diferenciace tkáně pomocí northern blotu a in šitu RNA hybridizace.
Popis sekvencí
Nukleotidy a aminokyselinové sekvence odkazované v popisu byly označeny následujícími identifikačními čísly:
Sekvence id. č.: 1 - nukleotidová sekvence krysího cDNA inzertu 3-2
Sekvence id. č.:2 - nukleotidová sekvence krysího cDNA inzertu 1-7
Sekvence id. č.:3 - aminokyselinová sekvence krysího proteinu KIM-1, kódovaná krysími cDNA 3-2 a 1-7
Sekvence id. č.:4 - nukleotidová sekvence krysího cDNA inzertu 4-7
Sekvence id. č.:5 - aminokyselinová sekvence kódovaná cDNA inzertem 4-7
Sekvence id. č.:6 - nukleotidová sekvence lidské cDNA klonu H13-10-85
Sekvence id. č.:7 - aminokyselinová sekvence kódovaná lidským cDNA klonem H13-10-85.
Použité termíny
Termínem „protein KIM“ nebo „KIM“ se rozumí protein kódovaný mRNA, jejíž množství je selektivně zvýšeno následně po poranění ledvin. Jedna skupina sledovaných proteinů KIM zahrnuje ty proteiny, které jsou kódovány mRNA, jejíž množství se selektivně zvyšuje během jednoho týdne po zásahu, který vede k poranění tkáně ledvin. Zvýšení množství této mRNA může být pozorováno například 10 hodin, 24 hodin, 48 hodin či 96 hodin po takovém zásahu. Mezi zásahy patří takové, které vedou k ischemii či k toxickému nebo jinému typu poranění.
„Agonista proteinu KIM“ je taková molekula, která je schopná specificky spustit buněčné odpovědi, jenž jsou za normálních podmínek spouštěny interakcí proteinu KIM s KIM ligandem. Agonista proteinu KIM může být buď varianta proteinu KIM, nebo specifická protilátka proti proteinu KIM nebo rozpustná forma KIM ligandu.
„Antagonistou proteinu KIM“ se rozumí molekula, která se může specificky spojovat s ligandem proteinu KIM nebo s proteinem KIM, a tak zablokovat či jinak inhibovat vazbu proteinu KIM ke KIM ligandu. Navázání antagonisty blokuje nebo inhibuje buněčné odpovědi, které by byly spuštěny vazbou KIM ligandy k proteinu KIM nebo k agonistovi proteinu KIM. Příklady antagonistů proteinu KIM zahrnují jednak určité varianty proteinu KIM a dále fúzní proteiny s proteinem KIM a specifické protilátky proti ligandu KIM či proteinu KIM.
„Ligand proteinu KIM“ je jakákoliv molekula, která se nekovalentně a specificky váže kproteinu KIM. Takovýmto ligandem může být protein, peptid, steroid, protilátka, derivát aminokyseliny či jiný typ molekuly. Může jít o přirozeně se vyskytující, rekombinantně produkovanou, či jinak syntetizovanou molekulu. Ligand proteinu KIM může být v jakékoliv formě, tj. může být rozpustný, membránově vázaný, může být součástí fúzního konstruktu s imunoglobulinem, s mastnou kyselinou nebo s jinou funkční skupinou. Ligand proteinu KIM může být integrin. Ligand proteinu KIM, který je vázaný v membráně, může fungovat jako receptor. Jeho prostřednictvím dochází po navázání či připojení proteinu KIM ke spuštění buněčné odpovědi. V případě některých interakcí se může protein KIM vázat k více než jednomu ligandu KIM nebo se může
-4CZ 295936 B6 vázat k ligandu KIM jako součást komplexu, ve kterém je jedna či více dalších molekul, případně kofaktorů. V případě, že jsou jak protein KIM, tak ligand proteinu KIM vázané k buněčné membráně, může se protein KIM vázat a reagovat s ligandem proteinu KIM, jenž je vázán buď k membráně stejné buňky, nebo k membráně jiné buňky. Dojde-li k vazbě proteinu KIM a jeho ligandu, které jsou vázány ke dvěma různým buňkám, mohou být tyto buňky stejného nebo odlišného typu a původu. Tyto buňky se mohou nacházet v jiných metabolických podmínkách, mohou se lišit fenotypem a dále typem a stupněm buněčné odpovědi na určitý stimulus (například růstem, diferenciací či apoptózou). „Vazbou proteinu KIM“ se rozumí kontakt a vazba proteinu KIM ke KIM ligandu.
„Porovnáváním sekvencí“ se rozumí takové umístění jedné buď aminokyselinové, nebo nukleotidové sekvence kjiné sekvenci, které umožní srovnávání příslušných částí daných sekvencí. Příklad metody na porovnávání sekvencí uvádí Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: strana 443 až 453, 1970). Porovnávání sekvencí může být jednoduše prováděno pomocí počítačových programů, mezi které patří například program Align (DNAstar, INC.). Jak je známo odborníkům, homologní a funkčně ekvivalentní sekvence zahrnují funkčně ekvivalentní uspořádání cysteinových zbytků uvnitř konzervované cysteinové kostry, včetně inzercí a deleci aminokyselin, které mění lineární uspořádání těchto cysteinů, fyzicky však nenarušují jejich vztah v sekundární a terciární struktuře (folded structure) proteinu. Interní delece a inzerce aminokyselin v navrhované sekvenci jsou tedy ignorovány za účelem stanovení celkové homologie či identity v aminokyselinové sekvenci mezi navrhovanou a referenční sekvencí. Jednou z charakteristik, která je často používána při určování homologie dvou proteinů, je podobnost v počtu a umístění cysteinových zbytků v těchto proteinech.
„Antisense DNA“ se vztahuje k sekvenci chromosomální DNA, která je překládána.
„Antisense DNA sonda“ je taková sonda, která zahrnuje alespoň část antisense DNA k části nukleových kyselin, které jsou studovány.
„Klonováním“ se rozumí použití in vitro rekombinačních technik za účelem inzerce konkrétního genu či jiné DNA sekvence do molekuly vektoru. K úspěšnému klonování požadovaného genu je třeba používat metody zajišťující tvorbu DNA fragmentů, připojování fragmentů do vektorové molekuly, vnesení složené DNA molekuly do hostitelské buňky, ve které se může tato molekula replikovat, a selekci klonů, které mají požadovaný gen, mezi ostatními recipientními hostitelskými buňkami.
„cDNA“ se rozumí komplementární řetězec DNA k určité RNA nebo komplementární řetězec k tomuto komplementárnímu řetězci. Komplementární DNA se tvoří z RNA templátu působením RNA-dependentní DNA polymerázy (reverzní transkriptázy). „cDNA klon“ je tedy dvouřetězcová DNA sekvence, která je komplementární k požadované molekule RNA, nesená klonovacím vektorem.
„cDNA knihovnou“ se rozumí soubor rekombinantních molekul DNA, který obsahuje cDNA inzerty. Tyto inzerty dohromady reprezentují mRNA molekuly přítomné v celém organizmu či tkáni v závislosti na zdroji RNA templátů. Takováto cDNA knihovna může být připravena metodami, které jsou popsány například v: Maniatis a další, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,1989. Obecně je RNA nejprve izolována z buněk organizmu, z jehož genomu má být klonován určitý gen. Ve vynálezu je kladen důraz především na savčí, zvláště pak lidské, buněčné linie. RNA může být případně izolována z nádorových buněk, které pocházejí z živočišného, nejlépe však lidského, nádoru. Knihovna tedy může být připravena například z lidského nádoru nadledvinek, použít však lze obecně jakýkoliv nádor.
Termín „polymorfísmus DNA“ v tomto vynálezu označuje takový stav, kdy se v určitém místě DNA mohou vyskytovat dvě nebo více různých nukleotidových sekvencí.
-5CZ 295936 B6 „Expresním vektorem“ se rozumí takový vektor, který je schopný exprimovat DNA sekvence, které obsahuje. To znamená, že jsou kódující sekvence v tomto vektoru funkčně spojeny se sekvencemi, které jsou schopné spustit jejich expresi. Přestože to není explicitně stanoveno, předpokládá se, že tyto expresní vektory musí být replikovatelné v hostitelském organizmu buď jako episomy, nebo jako integrální součásti chromosomální DNA. Užitečnou, nikoliv však nezbytnou, součástí expresního vektoru je sekvence kódující nějaký markér, tj. taková sekvence, která kóduje nějaký protein, jenž je zodpovědný za určitou fenotypovou vlastnost buněk (například rezistenci k tetracyklinu), díky které mohou být tyto buňky snadno identifikovány. Shrnuto, „expresní vektor“ je definován funkčně a zahrnuje jakoukoliv DNA sekvenci, která je schopná spouštět expresi specificky obsaženého DNA kódu. V současné době jsou takové vektory často ve formě plazmidů. Proto jsou termíny „plazmid“ a „expresivní vektor“ často používány synonymně. Vynález nicméně popisuje rovněž určité další formy expresních vektorů, které mají stejnou funkci a které mohou v budoucnu vzniknout a být uznány odborníky.
„Funkčním derivátem“ se rozumí „fragmenty“, „varianty“, „analogy“ nebo „chemické deriváty“ určité molekuly. „Fragmentem“ dané molekuly, jakou je například kterýkoliv z antigenů podle vynálezu, se rozumí jakákoliv polypeptidová podskupina této molekuly. „Variantou“ takové molekuly se rozumí určitá přirozeně se vyskytující molekula z velké části podobná buď celé molekule, nebo fragmentu této molekuly. „Analogem“ určité molekuly se rozumí přirozeně se nevyskytující molekula z velké části podobná buď celé molekule, nebo fragmentu této molekuly.
Termín „gen“ označuje polynukleotidovou sekvenci kódující peptid.
Termín „homogenní“ v případě peptidu nebo DNA sekvence znamená, že primární molekulární struktura (tj. aminokyselinová nebo nukleotidová sekvence) většiny molekul přítomných ve zkoumané uvažované směsi je identická.
Termín „izolovaný“ se vztahuje buď k proteinu podle vynálezu, nebo k jakémukoliv genu kódujícímu takový protein, který není vázán k jiným proteinům, respektive genům či jiným kontaminujícím molekulám, ve spojení s kterými se může vyskytovat v přírodě. Takto izolovaný se daný protein v přírodě nenachází.
Termínem „purifíkační značka“ se označuje jakákoliv funkční skupina usnadňující detekci. Purifikačními značkami mohou být bez jakéhokoli omezení radioaktivní izotopy, enzymy, luminiscenční látky a barviva.
Termín „sonda“ označuje ligandy známých vlastností schopné se selektivně vázat k cílovým antiligandům. V případě nukleových kyselin se termín „sonda“ používá k označení takového vlákna nukleové kyseliny, které má základní sekvenci komplementární k cílovému vláknu.
„Rekombinantními hostitelskými buňkami“ se rozumí takové buňky, které byly transformovány vektorem konstruovaným za použití technik rekombinantní DNA. Protilátka nebo modifikace této protilátky je produkovaná rekombinantní hostitelskou buňkou díky této transformaci. Nebýt této transformace, hostitelská buňka by produkovala mnohem menší nebo nejspíše nedetekovatelné množství takové protilátky.
Jako „vysoce čistý“ se označuje jakýkoliv protein předkládaného vynálezu nebo jakýkoliv gen kódující tento protein, který v podstatě není kontaminovaný jinými proteiny, respektive geny či dalšími kontaminujícími molekulami, ve spojení s kterými může být nacházen v přírodě. Takto čistý se daný protein v přírodě nenachází.
Molekula je označována jako „vysoce podobná“ jiné molekule tehdy, je-li aminokyselinová sekvence obou molekul v zásadě stejná a je-li biologická aktivita obou molekul podobná. To znamená, že pokud tyto dvě molekuly vykazují podobné biologické aktivity jsou podle vynálezu
-6CZ 295936 B6 považovány za varianty, přestože buď jedna z těchto molekul obsahuje přídavné aminokyselinové zbytky, které se nenachází v druhé molekule, nebo sekvence aminokyselin není u těchto dvou molekul stejná. Podle vynálezu se molekula označuje jako „chemický derivát“ jiné molekuly tehdy, obsahuje-li navíc chemické funkční skupiny, které nejsou přirozeně součástí dané molekuly. Takovéto funkční skupiny mohou zlepšovat rozpustnost dané molekuly, její absorpci, zvyšovat její biologický poločas života atd. Případně mohou snižovat toxicitu dané molekuly, eliminovat nebo snižovat nežádoucí vedlejší efekty dané molekuly atd. Funkční skupiny schopné zajistit takovéto vlastnosti jsou uvedeny například v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).
„Vektorem“ se rozumí molekula DNA odvozená od plazmidu nebo bakteriofágu, do níž mohou být vloženy nebo klonovány fragmenty DNA. Vektor obsahuje jedno nebo více jedinečných restrikčních míst a měl by být schopen autonomní replikace v definovaných hostitelských buňkách nebo nosném organizmu, takže klonovaná sekvence je reprodukovatelná.
Sloučeniny podle vynálezu
Vynález popisuje cDNA podle Sekvence id. č.: 1, id.č.: 2, Sekvence id. č.: 4 nebo Sekvence id. č.: 6, jakož i sekvence, které obsahují Sekvenci id.č.: 1, Sekvenci id.č.: 2, Sekvenci id. č.: 4 nebo Sekvenci id. č.: 6 a dále všechny deriváty těchto sekvencí. Vynález dále popisuje vektory, lipozómy a další nosné prostředky, které obsahují tyto sekvence, nebo jejich deriváty. Vynález dále obsahuje i proteiny, které vznikly transkripcí ze sekvencí podle Sekvence id. č.: 1, Sekvence id. č.: 2, Sekvence id. č.: 4 nebo Sekvence id. č.: 6, včetně, ale nejenom, proteinů podle Sekvence id. č.: 3, Sekvence id. č.: 5, nebo Sekvence id. č.: 7, jakož i jejich deriváty a varianty.
Ve výhodném provedení vynález zahrnuje rozpustnou variantu proteinu KIM, který je obvykle syntetizován jako protein spojený s membránou (membránový protein) a u něhož dochází ke zvýšení koncentrace po poškození. U rozpustných variant chybí přinejmenším část proteinu procházející membránou (transmembránová část) nebo vnitřní membránová část, které jsou součástí přirozeně se vyskytujícího (nativního) proteinu KIM. Vynález dále rozpustné varianty proteinu KIM, které postrádají celou transmembránovou nebo vnitřní membránovou část nativního proteinu KIM. Rozpustné varianty mohou dále zahrnovat fúzní proteiny, které obsahují deriváty proteinů KIM, ve kterých schází přinejmenším část proteinu procházející membránou (transmembránová část) nebo část pocházející z vnitřní strany membrány, která je součástí přirozeně se vyskytujícího (nativního) KIM proteinu. Vynález dále popisuje všechny typy KIM fúzních proteinů, zvláště ty, které obsahují purifíkační značky (kotvy) jako jsou his-tag, Ig-tag amyc-tag. Tyto fúzní produkty KIM mají rysy, které lze s výhodou využít při terapeutickém použití, jako je například prodloužený poločas rozpadu, který byl prokázán u purifíkační značky Ig-tag. Vynález zahrnuje také fúzní proteiny, které obsahují části vybraných oblastí (domén) proteinu KIM.
Varianty se mohou od přirozeně se vyskytujícího proteinu lišit buď aminokyselinovou sekvencí, nebo ve vlastnostech, které s aminokyselinovým složením nesouvisejí, nebo v obojím. Varianty lišící se aminokyselinovým složením (sekvencí) se připravují tak, že jedna nebo více aminokyselin, které se nacházejí v přirozeně se vyskytujícím proteinu KIM se zamění za jinou přirozeně se vyskytující aminokyselinu, za derivát této aminokyseliny, nebo za přirozeně se nevyskytující aminokyselinu.
Zvláště výhodně používané varianty obsahují přirozeně se vyskytující protein KIM, nebo biologicky aktivní části tohoto přirozeně se vyskytujícího KIM proteinu, jejichž sekvence se liší od přirozeně se vyskytujících sekvencí jednou nebo více konzervativními substitucemi aminokyselin, pro které je typické, že mají minimální vliv na sekundární strukturu a hydrofobní chování proteinu nebo peptidů. Varianty mohou mít také sekvence, které se liší jednou nebo více nekonzervativnimi substitucemi aminokyselin, jejich vynecháním (delecemi) nebo naopak vložením (inzercemi), které ale nemění biologickou aktivitu proteinu KIM. Konzervativní substituce
-7 CZ 295936 B6 obvykle zahrnují substituce jedné aminokyseliny za jinou, která má ale podobné vlastnosti. Jsou to substituce v rámci následujících skupin (oddělených středníkem): valin, glycin; glycin, alanin; valin, izoleucin; kyselina asparagová, kyselina glutamová; asparagin, glutamin; serin, threonin; lyzin, arginin; a fenylalanin s tyrozinem.
Mezi nepolární (hydrofobní) aminokyseliny patří alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. Mezi polární neutrálně nabité aminokyseliny lze zařadit glycin, serin, threonin, cystein, tyrozin, asparagin a glutamin. Pozitivně nabité (bazické) jsou aminokyseliny arginin, lyzin a histidin. Negativně nabité (kyselé) aminokyseliny zahrnují kyselinu 10 asparagovou a glutamovou.
Další konzervativní substituce mohou být navrženy podle následující tabulky a ještě další jsou popsány Dayhoffem v Atlase proteinových sekvencí a struktury (Atlas of Protein Sequence and structure) (1988).
-8CL 295936 B6
Tabulka 1: Konzervativní náhrady aminokyselin
Aminokyselinu kód lze nahradit libovolnou z:
Alanin. A Ď-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginin R D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, DMet, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Asparagin A D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselinu asparagovou D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D- Glu, Gin, D— Gin
Cystein C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamin Q D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kyselinu glutamovou E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycin G Ala, D-Ala, Pro, DPro, Beta-Ala, Acp
Isoleucin I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucin L D-Leu, Val, D-Val, Met, D- Met
Lyzin K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, DIle, Orn, D-Orn
Methionin M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu
Fenylalanin F D-Phe, Tyr, D-Thr, LDopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3, 4 nebo 5-fenylprolirv Cis 3, 4 nebo 5-fenylprolin
-9CZ 295936 B6
Tabulka 1: Konzervativní náhrady aminokyselin
Aminokyselinu kód lze nahradit libovolnou z:
Prolin P D-Pro, L-I- thioazolidin-4karboxylová kyselina, D- nebo L-l- Oxazolidin -4karboxylová kyselina
Serin s D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(0), Val, D-Val
Threonin T D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D- Met(O), Val, D-Val
Tyrosin Y D-Tyr, Phe, D-Phe, LDopa, His, D-His
Valin V D-Val, Leu, D-Leu, Tle, D-Ile, Met, D-Met
Vynález dále popisuje varianty proteinu KIM modifikované tak, aby se zvýšila stabilita peptidů. Takovéto varianty mohou obsahovat například zavedení jedné, nebo více nepeptidových vazeb, které nahradí vazby peptidové v sekvenci peptidů. Dále jsou zahrnuty varianty, které obsahují jiné aminokyselinové zbytky, než jsou přirozeně se vyskytující L-aminokyseliny, jako jsou D-aminokyseliny a přirozeně se nevyskytující nebo syntetické aminokyseliny jako jsou například beta nebo gama aminokyseliny a cyklické varianty. Zavedení D-aminokyseliny místo L-aminokyseliny do polypeptidu může zvýšit jeho rezistenci k působení proteáz, viz například Patent US 5 219 990.
Obecně řečeno, substituce, u kterých se dá předpokládat, že vyvolají změny ve funkčních vlastnostech polypeptidu KIM jsou ty, ve kterých je: (I) hydrofílní zbytek, to znamená například serin nebo threonin nahrazen hydrofobním zbytkem, jako jsou například leucin, izoleucin, fenylalanin nebo alanin; (ii) cysteinový zbytek je substituován nebo je sám nahrazen jiným zbytkem; (iii) aminokyselinový zbytek, který má elektropozitivní postranní řetězec, jako je například lysin, arginin nebo histidin je substituován nebo sám zbytky nesoucími elektronegativní náboj, jako je například kyselina glutamová nebo asparagová, nebo dále (iv) aminokyseliny mající rozměrný postranní řetězec (například fenylalanin) jsou substituovány, nebo jsou samy nahrazeny aminokyselinami, které tyto objemné postranní řetězce nemají, jako je například glycin.
Peptidy podle vynálezu mohou být modifikovány také pomocí dalších změn, jako jsou inzerce, delece a substituce, a to jak konzervativní, tak nekonzervativní, kde takovéto změny mohou vytvořit jisté výhody pro jejich použití. Zkrácené varianty jsou uvedeny ve vynálezu samostatně.
Dalším provedením vynálezu jsou i varianty s méně konzervativní substitucí aminokyselin, které mohou také poskytnout deriváty s požadovanými vlastnostmi, například změnou v náboji, konformaci a dalších biologických vlastnostech. Takovéto substituce zahrnují například substituce hydrofílních zbytků za hydrofobní zbytky, substituci cysteinu nebo prolinu za další zbytek, substituci zbytku nesoucího malý postranní řetězec, nebo substituce zbytku nesoucího pozitivní celkový náboj za zbytek s nábojem negativním. Není-li možno předem s určitostí předpovědět cho
-10CZ 295936 B6 vání takovéto sloučeniny, je možné takto připravený derivát podrobit zkouškám způsoby, které jsou zde popsány, aby bylo možno s určitostí říci, zda derivát požadované vlastnosti má, nebo nemá.
Vynález popisuje všechny varianty proteinu a peptidu, jejichž aminokyselinová sekvence má alespoň osmdesáti procentní homologii s proteinem KIM. V ještě výhodnějším uspořádání je sekvenční homologie devadesáti procentní, nebo ještě výhodněji alespoň devadesáti pěti procentní. Pro účely určení sekvenční homologie se užívá délka srovnávaných sekvencí, obecně nejméně osmi aminokyselinových zbytků, nejobvykleji však nejméně dvaceti aminokyselinových zbytků. Varianty sloučenin podle vynálezu zahrnují také všechny proteiny, které 1) mají aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze čtyřiceti procent homologní s proteinem KIM podle vynálezu a dále se všemi sloučeninami, které 2) mohou být dány do optimálního souladu se sekvencí KIM (jak je vyznačeno na obrázku 5 pro lidský a pro krysí KIM-1), která má 80 % cysteinových zbytků shodných s cysteinovými zbytky v proteinu KIM podle vynálezu.
Stejně jako je možné nahradit substituenty hlavního řetězce je možné nahradit i funkční skupiny, které jsou na hlavní řetězec navázány, a to skupinami majícími podobné vlastnosti. Tyto substituce jsou míněny jako konzervativní, to znamená, že nahrazující skupina má přibližně stejnou velikost, tvar, hydrofobicitu a náboj, jako měla původní skupina. Nesekvenční modifikace mohou zahrnovat například in vivo či in vitro chemickou změnu části přirozeně se vyskytujícího proteinu KIM, jakož i změny v acetylaci, metylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci.
Vynález dále popisuje činidla, která se specificky vážou na daný protein, nebo proteinový fragment (podle Sekvence id.č.:3, 5 nebo 7). Tato činidla zahrnují ligandy a protilátky (včetně monoklonálních protilátek, jednořetězcových protilátek, dvouřetězcových protilátek, Fab fragmentů a dalších, a to jak nativních, lidských, humanizovaných, primatizovaných nebo chimérických). Další popis kategorií těchto látek je uveden v přihlášce PCT 95/16709.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava RNA z normálních a ischemických ledvin dospělých krys
Ischemicky poškozené krysí ledviny jsou připraveny tak, jak je popsáno Witzgallem a dalšími (J. Clin. Invest.93: strana 2175 až 2188, 1994). Stručně lze tento postup popsat následovně: renální arterie a žíla z jedné ledviny dospělé Sprague-Dawley krysy je na čtyřicet minut zaškrcena a potom je znovu obnoven krevní oběh (reperfuze). Poškozené ledviny jsou vyjmuty z krys a použity 24 a 48 hodin po reperfuzi. Ledviny z normálních dospělých Sprague-Dawley krys, které byly podrobeny kontrolní operaci bez zaškrcení krevního oběhu jsou použity jako srovnávací materiál.
Celková RNA se připraví z orgánů způsobem podle Glisina a dalších, viz Biochemistry 13: strana 2633, 1974. Tento způsob obsahuje tyto kroky: vyjmuté orgány jsou vloženy ihned do GNC pufru (4M guanidin thiokyanát, 0,5% SDS, 25 mM citrát sodný, 0,1% Sigma anti foam - prostředek proti pěnění) a rozmělněny v ledu polytronem. Buněčné zbytky se odstraní nízkoobrátkovou centrifugací v klinické odstředivce a supematant je navrstven na polštář skládající se z 5,7M CsCl, 25mM octanu sodného a lmM EDTA. RNA se vysráží po průchodu polštářem v průběhu odstřeďování v rotoru SW40TÍ při 22K po dobu 15 hodin. Dále se RNA resuspenduje ve sterilní DEPC ošetřené vodě, přesráží se dvakrát pomocí 1/10 objemu 3M octanu sodného a 2,5 objemů ethanolu. Póly A+ RNA se izoluje za použití purifikačního kitu (Pharmacia, katalogové číslo 27-9258-02).
-11 CZ 295936 B6
Příklad 2: Způsob diferenční analýzy (Representational difference analysis- RDA) sloužící k izolaci RDA fragmentů 1-7, 3-2 a 4-7
Dvouvláknová cDNA se syntetizuje z ledvinových póly A+ RNA jednak z kontrolních krys a jednak z krys 48 hodin po ischemickém poškození ledvin. Používá se souprava od firmy Gibco BRL „Superscript Choice Systém cDNA Synthesis kit“, katalogové číslo 18090. První vlákno se syntetizuje za použití primeru oligo dT a za použití Superscript II reverzní transkriptázy. Druhé vlákno se vytváří použitím E.coli DNA polymerázy I a RNAázy H po kterých následuje T4DNA polymeráza. Všechny kroky jsou provedeny za podmínek doporučených výrobcem-BRL.
RDA analýza byla provedena tak, jak popisuje Hubank a Schatz (Nucleic Acid Research 22: strana 5640 až 48, 1994). Stručně lze postup popsat takto: cDNA izolovaná z ledvin 48 hodin po ischemickém poškození se naštěpí restrikčním enzymem DpnII a spojí se ligací s R-Bgl-12/24 oligonukleotidy (přesné sekvence viz literatura). cDNA spojena ligací s linkery se amplifikuje pomoci PCR reakce provedené Taq polymerázou firmy Perkin-Elmer v odpovídajícím PCR pufru, čímž vzniká počáteční populace (reprezentace) fragmentů. Tento PCR produkt je nazýván „tester amplikon“. Stejný postup byl zvolen k vytvoření „driver amplikonu“ pouze byla použita cDNA pocházející z ledvin kontrolních krys.
Po hybridizaci „tester“ a „driver“ amplikonu následovala selektivní amplifikace, která byla provedena třikrát. Tak byl vytvořen diferenciální produkt jedna (DPI), dvě (DP2) a tři (DP3). DPI byl připraven tak, jak je popsáno Hubankem a Schatzem (viz Nucleic Acid Research 22: strana 5640 až 48, 1994). DP2 a DP3 produkty byly také připraveny podle postupu popsaného Hubankem a Schatzem, viz citace výše, jediný rozdíl byl v tom, že se změnily poměry mezi množstvím driveru a testeru, a to 5.333:1 pro DP2 a 40.000:1 nebo 4.000:1 pro DP3.
ZDP3 byly nakloňovány tři RDA produkty do klonovacího vektoru pUC18: vytvořil se RDA produkt 1-7 o velikosti (252bp), a to při použití poměru driveru: testeru 40,000:1 a produkt RDA 3-2 o velikosti 445bp a produkt 4—7 o velikosti 483bp, který vznikl, byl-li amplifikován DP3 za použití poměru 4,000:1. DNA fragmenty byly reklonovány za použití Pharmacia Sureclone kitu (katalogové číslo 27-9300-01). Konce PCR fragmentů byly zarovnány Klenowovým fragmentem, což usnadnilo ligaci těchto fragmentů na tupo do klonovacího vektoru pUC18.
Příklad 3: Northem analýza
PolyA+RNA (2,5 pg) získaná z ledvin normálních kontrolních krys, dále z ledvin dospělých krys 48 hodin po ischemickém poškození a z ledvin 18 denního krysího zárodku byly elektroforeticky rozděleny a podrobeny Northeřn blotu (viz Cate, Cell 45: strana 685, 1986) na GeneScreen™ membráně (Dupont).
Dále následovala hybridizace v PSB pufru (50mM Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% pyrofosforečnan sodný, 0,2%PVP, 0,2%Ficoll, 0,2%BSA, 1%SDS) obsahující 10% sulfát dextranu a 100pg/ml tRNA. Hybridizace probíhala při 65 °C za použití tří různých sond: 1-7 RDA produktu, 3-2 RDA produktu a 4-7 RDA produktu. Všechny sondy byly radioaktivně značeny pomocí kitu „Pharmacia Ready to Go random priming labeling kit“ (katalogové číslo 27-9521-01). RDA produkty 1-7,3-2 a 4-7 hybridizovaly smRNA přítomnými ve všech třech vzorcích, ale k nejsilnější reakci došlo se vzorky mRNA získanými z ledvin krys 48 hodin po ischemickém poškození.
Northem blotová analýza ledvinové tkáně získané z dospělých krys prokázala, že gen 1-7 se exprimuje ve velmi nízké koncentraci v ledvinách normálních dospělých krys, varlatech, slezině a plicích. Gen 3-2 se exprimuje v játrech, ledvinách, slezině a mozku. Gen 4-7 se exprimuje ve slezině, ledvinách, plicích, varlatech, srdci, mozku, játrech a kosterních svalech. Přítomnost mRNA o různých velikostech v některých tkáních pro 1-7 a 3-2 bloty naznačuje, že produkty
-12CZ 295936 B6 primární transkripce genů 1-7 a 3-2 mohou být pozměněny buď alternativním sestřihem, nebo polyadenylací.
Příklad 4: Izolace 3-2 a 4-7 cDNA klonů cDNA knihovna byla připravena ze 4pg poly+RNA izolované z ledvin 48 hodin po ischemickém poškození. Knihovna byla připravena podle návodů doporučených výrobcem pomocí následujících kitů: BRL Superscript Choice™ Systém pro syntézu cDNA a klonovacího kitu Stratagene™ Lambda Zapil (katalogové číslo 236201).
Pomocí náhodně radioaktivně označeného (viz výše) produktu 3-2 RDA, sloužícího jako sonda, bylo prozkoumáno 105 klonů. Bylo vybráno osm pozitivních klonů a čtyři z nich byly náhodně vybrány pro následnou analýzu sloužící k získání čistých fágových plaků. Po dalším, v pořadí třetím kole prohledávání, byly vyizolovány čtyři čisté fágové klony. Klonované inzerty z fágů byly izolovány způsobem in vivo vyjmutí (excise), a to podle návodu a za použití kitu Stratagene™ Lambda Zapil.
DNA inzertu o největší velikosti, přibližně 2,6kb (odpovídající cDNA klonu 3-2) byla sekvenována. Sekvence inzertu (označená jako Sekvence id. č.:l) je znázorněna na obrázku 1. cDNA klon 3-2 (E. coli K-12, SOLR/p3-2#5-l) byl uložen pod označením ATCC č. 98061. Sekvence cDNA klonu 3-2 je identická se sekvencí klonu 1-7 cDNA (označenou jako Sekvence id.č.:2), s výjimkou nukleotidů 136 až 605 ze Sekvence.id.č.:l, které představují sekvenci inzertu. Tak Sekvence id.č.: 2 reprezentuje sestřihovou variantu formy Sekvence id.č.: 1. Klon 1-7 (E. coli K12,SOLR/pl-7#3-l) byl uložen pod označením ATCC č.98060.
Pomocí sondy tvořené náhodně radioaktivně značeným (viz výše) produktem 1-7 RDA, bylo prozkoumáno 105 klonů. Bylo vybráno osm pozitivních klonů a čtyři z nich byly náhodně vybrány pro další analýzu sloužící k získání čistých fágových plaků. Po dalším, v pořadí třetím kolem prohledávání, byly vyizolovány čtyři čisté fágové klony. Klonované inzerty z fágů byly izolovány metodou in vivo vyjmutí (excise), a to podle návodu a za použití kitu Stratagene™ Lambda Zapil. Inzert o největší velikosti, přibližně 2,0 kb (odpovídající cDNA klonu 1-7) byl sekvenován. Sekvence inzertu (označená jako Sekvence, id. č.:2) je znázorněna na obrázku 2.
Pomocí sondy tvořené náhodně radioaktivně značeným (viz výše) produktem 4-7 RDA bylo hybridizací v PSB při 65 °C prozkoumáno 105 klonů. Bylo vybráno osm pozitivních klonů a čtyři z nich byly náhodně vybrány pro následnou druhou analýzu sloužící k získání čistých fágových plaků. Po tomto druhém kole prohledávání byly vyizolovány dva čisté fágové klony. Klonované inzerty z fágů byly izolovány metodou in vivo vyjmutí (excise), a to podle návodu a za použití kitu Stratagene™ Lambda Zapil. Inzert o největší velikosti, přibližně 2,4 kb (odpovídající cDNA klonu 4-7) byl sekvenován. Sekvence inzertu (označená jako Sekvence id. č.:4) je znázorněna na obrázku 3. Klon pro 4-7 (E. coli K-12, SOLR/p4—7#1-1) byl uložen pod označením ATCC č. 98062.
Příklad 5: Charakterizace cDNA klonů 1-7, 3-2 a 4-7
A.) Sekvence DNA a proteinů:
Sekvence cDNA 3-2 (viz obrázek 1; Sekvence id. č.:l) obsahuje otevřený čtecí rámec sestávající z 307 aminokyselin (viz obrázek 1; Sekvence id. č.:3). Signální sekvence dlouhá 21 aminokyselin je odvozena z analýzy provedeném Von Heijnem (viz Von Heijne a další, Nucl. Acid Res. 14: strana 14683 (1986)), a transmembránové oblasti sestávající přibližně z aminokyselin 235 až 257 naznačují že produkt klonu 3-2 je buněčný povrchový protein.
- 13CZ 295936 B6
Sekvence cDNA 1-7 (viz obrázek 2; Sekvence id. č.:2) obsahuje otevřený čtecí rámec sestávající z 307 aminokyselin, který je identický s otevřeným čtecím rámcem v klonu cDNA 3-2 (viz Sekvence id. č.:3).
Sekvence cDNA 4-7 (obrázek 3; Sekvence id. č.:4) obsahuje otevřený čtecí rámec dlouhý 572 aminokyselin (Sekvence id. č.:5). Transmembránová část se nachází přibližně mezi aminokyselinami 501 až 521.
B.) In šitu analýza mRNA 1-7, 3-2 a 4-7 v post-ischemických a v protilehlých (kontralaterálních) dospělých krysích ledvinách;
In šitu hybridizace se provádí způsobem popsaným v práci Finch a další Dev. Dynamics 203: strana 223 až 240, 1995. Ve stručnosti se tento způsob provádí tak, že se ischemická a protilehlá perfuzně fixuje 4% paraformaldehyd v PBS. Ledviny se poté dále fixují přes noc při 4 °C a dále se zpracovávají. Parafinové řezy se deparafinizují a rehydratují, poté se fixují 4% paraformaldehydem v PBS, štěpí se proteinázou K, znovu se zafixují a poté se acetylují anhydridem kyseliny octové v triethanolaminovém pufru. Řezy se poté dehydratují a nechají se hybridizovat s RNA sondami značenými 32P při teplotě 55 °C. RNA sondy značené 32P byly vytvořeny 3-2 RDA nebo 1-7 RDA produktů nakloňovaných do cílového místa BamHI v plazmidu pGEM-11Z. Po hybridizaci byly řezy promyty za velmi stringentních podmínek (2 x SSC, 50% formamid při teplotě 65 °C). Řezy se nakonec opět dehydratují, potáhnou se emulzí (NBT-2) a provede se autoradiografie přičemž se použije alespoň týdenní expozice. Stříbrná zrna se vyvolají standardním způsobem a řezy se kontrastně obarví toluidinovou modří pro mikrofotografické pozorování.
In šitu hybridizační analýza exprese mRNA 1-7 a 3-2 naznačuje, že exprese těchto genů je velmi vysoká v buňkách poškozené ledviny ve srovnání s jejich expresí v řežích normální ledviny. K expresi dochází hlavně v regenerujících buňkách kortexu a vnější dřeně (outer medulla), přičemž většina exprese se soustředí do proximálních tubulámích buněk.
In šitu hybridizační analýza exprese mRNA 4-7 rovněž naznačuje silnou expresi tohoto genu v zraněné ischemické ledvině ve srovnání s normální dospělou ledvinou. Místem exprese se zdají být filtrační buňky.
Příklad 6: Izolace lidského cDNA klonu, který je schopen křížově-hybridizovat s krysí
3-2 cDNA
Byla vytvořena DNA sonda značená 32P obsahující nukleotidy 546 až 969 inzertu klonu 3-2 podle obrázku 1. Tato sonda byla použita k prohledání lambda gtlO cDNA knihovny z lidských embryonálních jaterních buněk (Clontech katalogové číslo HL5003a). Bylo duplikovaně prohledáno lxlO6 plaků za použití standardních, výše popsaných podmínek, pouze byla použita teplota 55 °C. Během promývání za vysoce stringentních podmínek byly filtry promyty v pufru 2xSSC při 55 °C. Bylo identifikováno padesát pozitivních fágů, které byly přečištěny z odpovídajících plaků a byla z nich izolována DNA. Fágové DNA byly analyzovány Southem blotem za použití stejné sondy jako v předchozím příkladě. Filtr se Southernovým blotem byl na závěr promyt v pufru 0,5 x SSC při teplotě 55 °C. Po této analýze byly jako pozitivní identifikovány dva klony. Inzert nacházející se v klonu H13-10-85 byl osekvenován a byla nalezena oblast, kódující protein s vysokou úrovní identity s proteinem 3-2 podle obrázku 3.
Nukleotidová sekvence (viz Sekvence id. č.:6) a odpovídající dedukovaná aminokyselinová sekvence (viz Sekvence id. č.:7) lidského proteinu příbuzného s proteinem 3-2 jsou znázorněny na obrázku 4. Bylo provedeno hledání analogických motivů a vybráno nejvíce si odpovídající srovnání sekvencí (viz obrázek 5). Z provedené analýzy vyplývá, že lidský protein příbuzný proteinu 3-2 je ze 43,8 % identický a z 59,1 % podobný s krysím proteinem 3-2. Oba proteiny obsahují
-14CZ 295936 B6
IgG, mucinovou, transmembránovou a cytoplazmatickou doménu. Je konzervováno i šest cysteinových zbytků v IgG doménách obou proteinů.
Příklad 7: Produkce fúzního proteinu KIM-1 s Ig
Fúzní protein sestávající z extracelulámí domény proteinu KIM a Fc oblasti imunoglobulinu (Ig) je výhodný pro studium molekulární a buněčné biologie procesů, probíhajících v poraněné nebo regenerující ledvině a rovněž jako molekula vhodná pro terapii. Při přípravě fúzního proteinu KIM a Ig s extracelulámí doménou lidského a krysího KIM-1 proteinu byl zvolen následující postup. Fragment cDNA kódující extracelulámí doménu proteinu KIM-1 byl amplifikován pomocí PCR a nakloňován do expresivního vektoru Biogen pCA125 pro přechodnou expresi v buňkách COS. Expresivní vektor pCA125 produkuje fúzní protein, který sestává z proteinu kódovaného genem nakloňovaným na N-konec a lidské Ig Fc oblasti na C-konci. Buňky COS byly transfikovány plazmidy SJR 103 nebo 104; tyto plazmidy exprimují fúzní protein obsahující část sekvence lidského proteinu KIM (nukleotidy 263 až 1147, Sekvence id. č.:6; SJR 103) nebo část sekvence krysího proteinu KIM (nukleotidy 599 až 1319, Sekvence id. č.:l; SJR 104), což jsou extracelulámí domény tohoto proteinu. Druhou částí fúzního proteinu je lidská Ig Fc oblast. Buňky byly pěstovány v 10% fetálním telecím séru (FBS fetal bovine sérum) v médiu DMM (Dulbecco's modified Eagle's medium) ve fermentoru (Nunc, Naperville, II.). Dva až tři dny po transfekci bylo médium odebráno, zakoncentrováno pomocí koncentrátoru Amicon a fúzní protein byl přečištěn na Sepharózové koloně s proteinem A. Po purifikaci byla čistota fúzního proteinu stanovena pomocí SDS-PAGE.
Průmyslová využitelnost
Diagnostické použití sloučenin podle vynálezu
Protilátky proti proteinu KIM podle vynálezu, které jsou schopné specifické vazby na protein se Sekvencí id. č.:3, id. č.:5 nebo id. č.:7 nebo na fragmenty těchto proteinů, jsou výhodné pro několik diagnostických způsobů. Tyto protilátky mohou být značeny detekovatelnými markéry jako jsou fluorescenční značky nebo radiografické kontrastní látky a poté mohou být podávány léčenému organizmu za účelem zobrazení tkání exprimujících protein KIM. Tyto protilátky mohou být také navázány na látky, jako je křenová peroxidáza, které lze pak využít k imunocytochemickému barvení KIM pozitivních buněk na histologických řezech. Takovým způsobem lze použít i samotnou specifickou protilátku, přičemž místa, na která se tato protilátka navázala lze detekovat pomocí další protilátky proti prvnímu imunoglobulinu, na které je navázán detekční markér.
Specifické protilátky proti proteinu KIM jsou také použitelné v imuno-enzymatických testech určených pro měření přítomnosti nebo koncentrace proteinů KIM ve vzorcích tkání a tělesných tekutin. Tyto koncentrace mohou být v korelaci s různými stavy onemocnění. Ve výhodném provedení vynálezu jsou popsány způsoby diagnózy poranění ledvin nebo způsoby sledování průběhu regenerace ledvin měřením koncentrace proteinů KIM nebo fragmentů proteinů KIM v moči, plazmě nebo séru pacienta.
Podobným způsobem lze měřit koncentraci proteinů KIM v močovém sedimentu, především pak ve zbytcích buněk v močovém sedimentu. Zbytky renálních tubulárních buněk, které mohou být přítomny v močovém sedimentu pacientů s onemocněním ledvin mohou obsahovat zvýšenou koncentraci proteinů KIM a příslušných mRNA.
Specifické protilátky proti proteinu KIM mohou být rovněž navázány na pevný nosič, například na kuličky nebo misky, pro použití při odstraňování ligandu z roztoku, buď kvůli měření, nebo kvůli purifikaci a charakterizaci proteinů nebo jejich vlastností (jako jsou post-translační modifi
-15CZ 295936 B6 kace). Charakterizace KIM proteinů pacienta může napomoci při identifikaci škodlivých mutací nebo chyb v post-translačním zpracování proteinů, které zasahují do funkcí KIM a jsou spojeny s nenormálním fenotypovým projevem. Uvedené způsoby jsou odborníkům v imunologických technikách dobře známy.
Další způsoby využívají proteinů KIM nebo fragmentů proteinů KIM navázaných na kontrastní nebo detekovatelné skupiny pro diagnostickou vizuální kontrolu tkání exprimujících ligandy proteinů KIM, obzvláště například nádorových tkání.
Další diagnostické způsoby jsou založeny na detekci zvýšeného množství KIM mRNA v tkáních, což slouží jako indikace pochodů spojených s poškozením ledvin. Tato technika byla vyzkoušena na modelu krys s ischemickým poškozením ledvin (viz dále) a na tomto modelu se osvědčila.
Pro stanovení zda-li je množství proteinu KIM-I po zranění zvýšené, jsme zkoumali homogenáty ledvin odebrané z kontrolní a protilehlé post-ischemické ledviny 24 a 48 hodin po 40 minutovém uzavření ledvinové tepny a žíly. Toto uzavření krevního oběhu bylo provedeno u každé krysy svorkou vždy na jedné z ledvin. Homogenáty ledvin byly testovány na přítomnost proteinu KIM-I. Pomocí western blotu byly dvěma různými protilátkami identifikovány tři proteiny detekované po ischemickém poškození, který nebyly detekovány v homogenátech z protilehlých ledvin, nevystavených ischemickému poškození.
Molekulové hmotnosti odvozené od elektroforetické pohyblivosti proteinů jsou přibližně 40kDa, 50kDa a 70 až 80kDa. Tři různé proteiny detekované westem-blotem mohou reprezentovat glykosylované formy téhož proteinu díky přítomnosti potenciálních N a O glykosylačních míst. Fakt že každý z těchto proteinů reaguje se dvěma rozdílnými sadami polyklonálních protilátek podporuje domněnku, že jde o proteiny příbuzné s ΚΓΜ-1 a nikoliv pouze o nezávislé, křížově reagující proteiny.
Potvrzení tohoto předpokladu vyplývá z výsledků částečného CNBr štěpení tří proteinů, které odhalilo, že všechny tyto proteiny sdílejí společné fragmenty CNBr štěpení. Vzhledem k tomu, že v cytoplazmatické doméně proteinu KIM-1 nebyly předpovědezeny žádné větší posttranslační modifikace, měly by dva nejmenší produkty štěpení (o velikosti 4,7 kDa a 7,4 kDa) detekovatelné protilátkami proti cytoplazmatické doméně proteinu KIM-1 mít stejnou velikost pro všechny tři různé elektroforetické proužky proteinů KIM-1. Tento předpoklad by byl splněn pouze v případě, jestliže štěpné fragmenty vznikají ze stejného proteinu. Bylo pozorováno, že proteiny KIM-I o velikosti 40 kDa a 70 až 80kDa dávají vzniknout fragmentům, migrujícím s předpokládanou pohyblivostí. Štěpením elektroforetického proužku odpovídajícího proteinu o velikosti 50 kDa vzniknul také stejný C-terminální peptidový fragment.
V sekvenci proteinu KIM-1 se vyskytují dvě možná místa pro N-glykosylaci a mucinová doména kde může docházet k O-glykosylaci polypeptidového řetězce. Tři elektroforetické proužky KIM-1 detekované v post-ischemických ledvinách by mohly odpovídat glykosylačním variantám proteinu s totožným jádrem. De-N-glykosylace pomocí enzymu PNGase F vedla k posunu pohyblivostí všech tří elektroforetických proužků o zhruba 3 kDa směrem k nižší molekulární váze. Plyne z toho, že všechny tři proteiny jsou N-glykosylovány. Rozdílnou O-glykosylací lze vysvětlit setrvávající rozdíly ve velikostech těchto tří elektroforetických proužků.
Terapeutické použití sloučenin podle vynálezu
Způsoby léčby podle vynálezu zahrnují selektivní aktivaci nebo inhibici buněčné odpovědi související s navázáním ligandu na protein KIM. Tam kde jsou jak protein KIM tak i jeho ligand membránovými proteiny, exprimovanými různými buňkami, může dojít k transdukci signálu jak v buňce exprimující protein KIM, tak v buňce exprimující ligand proteinu KIM a nebo v obou buňkách.
-16CZ 295936 B6
Buněčná odpověď spouštěná navázáním ligandu na protein KIM může být v buňce exprimující ligand proteinu KIM generována kontaktem této buňky s exogenním proteinem KIM, fúzním proteinem KIM nebo aktivační protilátkou proti ligandu proteinu KIM, a to jak v prostředí in vitro, tak i in vivo. V jiném případě může být odpověď buněk exprimujících ligand proteinu KIM, za normálních okolností spouštěná endogenním proteinem KIM, zablokována kontaktem buňky exprimující ligand proteinu KIM s antagonistou ligandu proteinu KIM (například s protilátkou, která se váže s ligandem proteinu KIM), nebo kontaktem endogenního proteinu KIM s protilátkou proti proteinu KIM nebo pomocí jiné molekuly vázající se na protein KIM, která je schopna zabránit účinné vazbě proteinu KIM s jeho ligandem.
Podobně může být i odpověď buňky exprimující protein KIM spouštěná aktivací proteinu KIM ligandem aktivována nebo inhibována exogenními molekulami. Například k odpovědi buňky exprimující protein KIM spouštěné navázáním ligandu na protein KIM může dojít po kontaktu buňky s rozpustným ligandem proteinu KIM, nebo po kontaktu s určitými anti-KIM protilátkami. Dále lze tvrdit, že odpověď buňky exprimující protein KIM, která je za normálních okolností spouštěná interakcí s endogenním ligandem proteinu KIM lze zablokovat kontaktem KIM-I exprimující buňky s antagonistou proteinu KIM (například s blokující protilátkou, která se váže na protein KIM takovým způsobem, že to zabraňuje efektivnímu signálnímu impulzu vznikajícímu po navázání proteinu KIM na endogenní ligand) nebo kontaktem endogenního ligandu proteinu KIM s protilátkou proti tomuto ligandu nebo s jinou molekulou vázající se na tento ligand, který zabrání efektivnímu spojení proteinu KIM a jeho endogenního ligandu (a tím i vzniku signálu).
Který z výše uvedených způsobů ovlivnění signálních drah závislých na KIM proteinech bude výhodný pro konkrétní terapeutické použití, závisí na etiologii příslušného léčeného patologického procesu nebo naopak podporovaného žádoucího procesu. Toto rozhodnutí je zcela v možnostech příslušných odborníků.
Například, v případech kde interakce mezi proteinem KIM a ligandem vede k žádoucímu buněčnému růstu, udržení diferencovaného fenotypu, rezistenci vůči apoptóze zapříčiněné různými poškozeními, nebo vede k jiné, z lékařského hlediska výhodné odpovědi, lze použít jeden z výše uvedených způsobů aktivace signálních drah spouštěných interakcí proteinu KIM s ligandem. V jiném případě, kdy má uvedená interakce za následek nežádoucí změny stavu pacienta jako například růst nádoru, škodlivou ztrátu buněčných funkcí, citlivost k apoptóze nebo rozvoj zánětu lze použít jeden z výše uvedených způsobů inhibice odpovědi spouštěné interakcí proteinu KIM s ligandem.
Dále následují příklady výše popsaných terapeutických způsobů podle vynálezu. Jedním z terapeutických užití molekuly podle vynálezu příbuzné proteinu KIM je použití při léčbě subjektů s onemocněním ledvin, podpora růstu nové tkáně nebo podpora poškozených tkání. Uvedené způsoby zahrnují krok podání terapeuticky účinného množství proteinu KIM podle vynálezu, nebo farmaceutické kompozice obsahující protein podle vynálezu. Protein použitý v těchto způsobech může být fragmentem úplného proteinu KIM, rozpustným ligandem proteinu KIM nebo jeho fúzním fragmentem, nebo agonistou proteinu KIM. Tyto způsoby mohou být také prováděny podáním terapeuticky účinného množství agonistické protilátky podle vynálezu, nebo farmaceutické kompozice obsahující agonistickou protilátku podle vynálezu. Protein KIM může být podán souběžně s terapeuticky účinným množstvím druhé sloučeniny, která rozšíří žádoucí terapeutický účinek. Zatímco tyto způsoby lze použít v každé tkáni, výhodnými tkáněmi jsou zejména ledvinová tkáň, tkáň jaterní, nervová tkáň, srdce, žaludek, tenké střevo, mícha nebo plíce. Konkrétní poruchy ledvin, které mohou být výhodně léčeny sloučeninami podle vynálezu zahrnují akutní selhání ledvin, akutní nefritidu, chronické selhání ledvin, nefrotický syndrom, defekty ledvinových tubulů, transplantace ledvin, poruchy způsobené otravou, poruchy a traumata způsobená hypoxií. Defekty ledvinových tubulů mohou být buď dědičné, nebo získané povahy, jako je například polycystické onemocnění ledvin a medulární cystická choroba.
-17CZ 295936 B6
Tento výčet není nijak omezující a může zahrnovat mnoho dalších poruch funkce ledvin (viz například Harrisonovy Principy vnitřní medicíny, Principles of Intemal Medicine), 13-té vydání, 1994). Léčeným organizmem uvedenými způsoby může být člověk.
Terapeutický zásah inhibující růst nežádoucí tkáně obsahující buňky exprimující ligand proteinu KIM zahrnuje krok podání léčenému organizmu terapeuticky účinného množství antagonisty proteinu KIM (například antagonistické protilátky, která se váže na ligand proteinu KIM), nebo podáním terapeuticky účinného množství protilátky proti proteinu KIM nebo jiné molekuly schopné vazby na molekulu KIM, která blokuje přirozenou vazbu proteinu KIM na tkáň exprimující ligand proteinu KIM. Ve výhodném provedení vynálezu může být terapeuticky použit antagonista proteinu KIM nebo protilátka proti proteinu KIM tak, aby zpomalila nebo zablokovala růst nádorů, jejichž růst je podmíněn proteinem KIM.
Vynález dále popisuje způsob zabíjení nádorových buněk exprimujících ligand proteinu KIM, nebo způsob inhibice jejich růstu. Tohoto výsledku je dosaženo kontaktem příslušných buněk s fúzním proteinem obsahujícím protein KIM spolu s toxinem nebo radionuklidem, nebo s konjugátem protilátky proti ligandů proteinu KIM s toxinem nebo radionuklidem. Buňka může být v těle léčeného organizmu a protein nebo konjugát protilátky je vhodným způsobem tomuto léčenému organizmu podána.
Vynález dále popisuje způsob specifického nasměrování toxinu nebo radionuklidu k buňce exprimující protein KIM. Toho je dosaženo kontaktem takové buňky s fúzním proteinem sestávajícím z ligandů proteinu KIM a toxinu nebo radionuklidu, nebo kontaktem takové buňky s konjugátem protilátky proti proteinu KIM s toxinem nebo radionuklidem. Další provedení vynálezu zahrnuje způsob inhibice růstu nádorových buněk exprimujících protein KIM. Tento způsob je založen na kontaktu příslušných buněk s fúzním proteinem sestaveným z ligandů proteinu KIM a toxinu nebo radionuklidu nebo s konjugátem protilátky proti proteinu KIM s toxinem nebo radionuklidem. Buňka může být v těle léčeného organizmu a protein nebo konjugát protilátky je vhodným způsobem tomuto léčenému organizmu podána.
Termínem „léčený organizmus“ se rozumí libovolný savec, kterému může být podán protein KIM. Organizmy specificky určenými pro léčbu způsobem podle vynálezu jsou mimo jiné člověk, jakož i další primáti, ovce, koně, dobytek, kozy, prasata, psi, kočky, králíci, morčata, křečci, krysy a myši, jakož i orgány, nádory a buňky odvozené nebo pocházející z těchto hostitelů.
Použití sloučenin podle vynálezu v genové terapii
Geny kódující protein KIM podle vynálezu jsou vkládány do poškozené tkáně, nebo do tkáně, ve které je zapotřebí povzbudit růst buněk. Takováto genová terapie povzbuzuje v transfikovaných buňkách produkci proteinů KIM, podporuje buněčný růst a/nebo podporuje přežití buněk exprimujících protein KIM.
Ve zvláštním provedení genové terapie podle vynálezu může být do ledvinové cílové tkáně uveden gen kódující protein KIM. Protein KIM by mohl být stabilně exprimován a povzbuzovat tak růst tkáně, dělení nebo diferenciaci buněk, nebo by mohl zvyšovat přežití buněk. Gen pro protein KIM může být vložen do cílové buňky za použití různých, ze stavu techniky dobře známých způsobů používajících jak virové, tak i nevirové vektory.
Způsoby využívající nevirových vektorů zahrnují elektroporaci, fúzi buněčných membrán pomocí lipozómů, bombardování vysoko-rychlostními mikroprojektily pokrytými DNA, inkubaci s fosforečnanem vápenatým a DNA precipitátem, transfekci zprostředkovanou DEAE-dextranem a přímou mikroinjekcí DNA do jednotlivých buněk. Například gen pro protein KIM může být vložen do buňky společnou precipitací s fosforečnanem vápenatým (viz Pillicer a další, Science 209: strana 1414 až 1422 (1980); mechanickou mikro-injekcí a/nebo nastřelením
-18CZ 295936 B6 částic (Anderson a další, Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 77: strana 5399 až 5403 (1980); přenosem DNA pomocí lipozómů (například transfekcí LIPOFECTINem, viz Fefgner a další, Proč. Nat. Acad. Sci., USA, 84: strana 471 až 477, 1987; Gao a Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179: strana 280 až 285, 1991; DEAE transfekcí Dextranem; elektroporací (viz Patent US 4 956 288); nebo transfekcí za pomoci polylysinu, ve kterých je DNA konjugována tak, aby byla přednostně dopravena do hepatocytů (víz Wolff a další, Science 247: strana 465 až 468, 1990; Curiel a další, Human gene therapy 3 (Lidská genová terapie 3): strana 147 až 154, 1992).
K transfekcí cílových buněk geny podle vynálezu může být rovněž použito přímého přenosu genů, viz například Wolff a další „Direct Gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo“, (Přímý přenos genů do losího svalu in vivo“, Science 247: strana 1465 až 68, 1990. V mnoha případech bude žádoucí transfekce zprostředkovaná vektorem. Pro vložení polynukleotidové sekvence do vektoru může být použito libovolných způsobů známých ze stavu techniky, viz například, Sambrook a další Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; a Ausubel a další Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992.
Aktivace promotoru může být tkáňově specifická nebo indukovatelná metabolickým produktem nebo podanou látkou. Takovými promotory/enhancery jsou například (ale nejenom) promotor nativního ligandu proteinu c-ret, časný promotor/enhancer cytomegaloviru (Karasuyama a další J. Exp. Med., 169: strana 13, 1989); lidský beta-aktinový promotor (Gunning a další Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 84: strana 4831, 1987; promotor indukovatelný glukokortikoidy, který se vyskytuje v dlouhé terminální repetici viru nádoru myší mléčné žlázy (Mouše mammary tumor virus MMTV LTR, viz Klessig a další Mol. Cell. Biol., 4: strana 1354, 1984); v dlouhé terminální repetici viru myší leukemie (Moloney muríne leukemia virus, MuLV LTR, viz Weiss a další, nádorové RNA viry, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1985); v promotoru časné oblasti viru SV40, viz Bemoist a Chambon, Nátuře 290: strana 304, 1981); promotor viru Rousova sarkomu (RSV, viz Jamamoto a další Cell 22: strana 787, 1980); thymidin-kinázový promotor viru herpes simplex (HSV, viz Wagner a další, Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 1441, 1981); promotor adenoviru (viz Yamada a další Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 82: strana 3567, 1985).
Geny pro proteiny KIM mohou být do cílových buněk vloženy rovněž specifickými virovými vektory sestrojenými právě pro použití v systémech na genový přenos, které jsou v současnosti dobře dostupné, viz například: Madzak a další J. Gen. Virol., 73: strana 1533 až 1536, 1992 (papovavirus SV40); Berkner a další Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: strana 39 až 61, 1992 (adenovirus); Hofmann a další Proč. Nati. Acad. Sci. 92: strana 10099 až 10103, 1995 (bakulovirus); Moss a další, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: strana 25 až 38, 1992 (vacciniavirus); Muzyczka, Curr, Top. Microbiol. Immunol., 158: strana 97 až 123, 1992 (adeno-asociovaný virus); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: strana 67 až 93, 1992 (virus oparu (herpes simplex virus, HSV) a virus Epsteina a Barrové (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: strana 1 až 24, 1992 (retrovirus); Brandyopadhyay a další, Mol. Cell. Biol., 4: strana 749 až 754, 1984 (retrovirus); Miller a další, Nátuře 357: strana 455 až 450, 1992 (retrovirus); Anderson, Science 256: strana 808 až 813, 1992 (retrovirus), Current Protocols in Molecular Biology: sekce 9.10 až 9.14 (Ausubel a další, editoři), nakladatelství Greene Publishing Associcates, 1989.
Výhodnými vektory podle vynálezu jsou vektory založené na DNA virech jako jsou adenoviry (ve výhodném provedení vynálezu vektory založené na Ad-2 nebo Ad-5), bakuloviry, viry herpes simplex (ve výhodném provedení vynálezu vektory založené na viru herpes simplex) a parvoviry (ve výhodném provedení vynálezu vektory založené na „defektním“ nebo neautonomním parvoviru, v ještě výhodnějším provedení vynálezu vektory založené na adeno-asociovaných virech a nejvýhodněji vektory založené na AAV-2, viz například Ali a další, Gene Therapy 1: strana 367 až 384, 1994; Patent US 4 797 368 a 5 399 346 a níže uvedená diskuse.
-19CZ 295936 B6
Výběr konkrétního vektoru pro přenos například nukleotidové sekvence kódující protein KIM závisí na mnoha faktorech. Jedním z důležitých faktorů je povaha populace cílových buněk. Ačkoli retrovirové vektory jsou prostudovány poměrně podrobně a používají se v řadě aplikací genové terapie, jsou většinou nevhodné pro infekci buněk, které se nedělí. Tyto vektory jsou vhodnější pro léčbu rakoviny, protože se integrují a jejich geny se exprimují pouze v replikujících se buňkách. Jsou vhodné pro ex vivo způsoby a jejich výhodnost spočívá zejména v tom, že se stabilně integrují do genomu cílové buňky.
Adenoviry jsou DNA viry eukaryotických buněk, které mohou být upraveny pro účinný přenos terapeutických nebo reportérových transgenů do různých buněčných typů. V současné době se využívají obecné adenoviry typu 2 a 5 (Ad2 respektive Ad5), které způsobují lidská respirační onemocnění. Jsou vyvinuty adenoviry pro genovou terapii Duchennovy svalové dystrofíe (DMD) a cystické fibrózy (CF). Oba adenoviry Ad2 a Ad5 patří do podtřídy adenovirů, která nezpůsobuje lidské zhoubné nádory. Adenovirové vektory poskytují extrémně vysokou úroveň přenosu transgenů do téměř všech buněčných typů, bez ohledu na mitotický stav. Vysoké titry (až 1013 plak vytvářejících jednotek/ml) rekombinantního viru lze snadno vytvořit v buňkách 293 (což je lidská komplementující embryonální ledvinná buněčná linie transformovaná adenovirem: ATCC CRL1573) a mohou být zamraženy na dlouhou dobu bez patrných ztrát aktivity. Účinnost tohoto systému při přenosu terapeutického transgenů in vivo doplňujícího vrozenou genetickou nerovnováhu byla demonstrována na zvířecích modelech s různými poruchami, viz Watanabe, Atherosclerosis, 36: strana 261 až 268, 1986; Tanzawa a další FEBS Letters 118(1): strana 81 až 84, 1980; Golasten a další New Engl. J. Med. 309: strana 288 až 296, 1983; Ishibashi a další J. Clin. Invest. 92: strana 883 až 893, 1993; a Ishibashi a další J. Clin. Invest. 93: strana 1889 až 1893, 1994. Rekombinantní, replikace neschopný adenovirus kódující cDNA pro transmembránový regulátor cystické fibrózy (CFTR) byl schválen pro použití v alespoň dvou klinických zkouškách s lidskými pacienty s CF, viz například Wilson, Nátuře 365: strana 691 až 692, 1993. Další důkazy podporující bezpečnost použití rekombinantních adenovirů pro genovou terapii lze získat z rozsáhlých zkušeností živými adenovirovými vakcínami běžně používanými v lidské populaci.
První generace rekombinantních, replikace nedoschopných adenovirů vyvinutá pro genovou terapii DMD a dalších dědičných poruch obsahovala deleci celé El oblasti a části Elb oblasti. Tento replikace neschopný virus byl pěstován v buňkách 293 obsahujících funkční gen El a adenovirů, který poskytuje trans-účinkující Ela protein. Viry s deletovaným El genem jsou schopny replikace a produkce infekčních virových částic v buňkách 293, které poskytují produkty genů El a Elb in trans. Výsledné viry mohou infikovat mnoho buněčných typů a mohou exprimovat vložený gen (má-li svůj vlastní promotor), ale nemohou se replikovat v buňkách, které nenesou El oblast DNA (alespoň pokud není buňka infikována mnohonásobnou dávkou infekčního agens). Adenoviry mají výhodu v tom, že mají široké hostitelské spektrum. Mohou infikovat klidové nebo terminálně diferencované buňky jako jsou neurony a navíc se zdá, že jsou zcela neonkogenní.
Zdá se, že adenoviry se neintegrují do genomu hostitelské buňky. Vzhledem k tomu, že se jejich životní cyklus obejde bez integrace do genomu hostitelské buňky, velmi se snižuje riziko inzerční mutageneze, viz Ali a další Gene Therapy T. strana 373. Rekombinantní adenoviry (rAdV) dávají velmi vysoké titry virových partikulí s průměrnou stabilitou, síla exprese vložených genů je vysoká a spektrum hostitelských buněk je široké. Jejich přirozenými hostitelskými buňkami jsou buňky epitelu dýchacích cest, proto jsou velmi vhodné pro genovou terapii rakoviny plic.
Přenos genů založený na bakulovirových vektorech má několik výhod. Bakulovirový genový přenos může být použit u replikujících se i nereplikujících se buněk a může tak být použit v ledvinových buňkách i v hepatocytech, nervových buňkách, buňkách sleziny, kožních a svalových buňkách. Bakulovirus se v savčích buňkách nereplikuje a není patogenní. V lidském organizmu se normálně nevyskytují protilátky proti rekombinantnímu bakuloviru, které by mohly
-20CZ 295936 B6 blokovat infekci. Navíc je bakulovirus schopen pojmout a transdukovat velmi velké inzerty DNA.
Adeno-asociované viry (AAV) mohou být rovněž použity jako vektory pro genovou terapii somatických buněk. AAV jsou malé, jednovláknové (ss) DNA viry s jednoduchou organizací genomu (4 až 7 kb), což z nich činí ideální model pro genové inženýrství. Dva otevřené čtecí rámce kódují sérii rep a cap polypeptidů. Rep polypeptidy (rep78, rep8, rep62 a rep40) se podílejí na replikaci, uvolnění a integraci AAV genomu. Cap proteiny (VP1, VP2 a VP3) tvoří proteinový obal virové částice. Po stranách otevřených čtecích rámců rep a cap na 5' a 3' koncích jsou 145 bází dlouhé invertované terminální repetice (ITR), z nichž prvních 125 bází je schopno tvořit duplexní struktury ve tvaru Y nebo T. Velký význam pro vývoj AAV vektorů má skutečnost, že celé rep a cap domény lze z genomu vyjmout a nahradit terapeutickým nebo reportérovým transgenem, viz B. J. Carter v knize Parvoviruses, editor P. Tijsser, CRC Press, strany 155 až 168 (1990).
Adeno-asociované viry (AAV) mají významný potenciál použití v genové terapii. Virové částice jsou velmi stabilní a rekombinantní AAV (rAAV) mají charakteristiky „podobné léčivům“ („drug-like“), což se projevuje tím, že rAAV mohou být purifíkovány centrifugaci nebo rozdělením v CsCl gradientu. Jsou odolné vůči vyšším teplotám a mohou být lyofílizovány na prášek a rehydratovány při zachování aktivity. Jejich DNA se stabilně integruje do chromozómu hostitele, takže exprese transgenu je dlouhodobá. Spektrum jejich hostitelských buněk je široké a AAV nezpůsobují žádnou známou nemoc takže na nich založené rekombinantní vektory jsou netoxické.
Po zavedení vektoru do cílové buňky lze vložené sekvence identifikovat konvenčními způsoby jako je hybridizace nukleových kyselin za použití hybridizační sondy obsahující sekvence homologické/komplementámí k sekvencím vloženým do vektoru. V dalším způsobu mohou být vložené sekvence identifikovány podle přítomnosti nebo absence funkce „markerového“ genu (například thymidin kinázové aktivity, rezistence k antibiotiku a podobně) po vložení expresivního vektoru do cílové buňky.
Formulace a podávání sloučenin podle vynálezu
Sloučeniny podle vynálezu jsou formulované standardním způsobem, například přípravek v nosném vehikulu. Termínem „farmakologicky přijatelný nosič“ se rozumí jedna nebo více organických nebo anorganických přísad, přírodních nebo syntetických, se kterým je mutantní protoonkogen nebo mutantní onkoprotein spojen pro usnadnění aplikace. Vhodným nosičem je například sterilní fyziologický roztok, ačkoli jsou odborníkům známy další vodné a nevodné izotonické sterilní roztoky a sterilní suspenze jako farmaceuticky přijatelné. Termín „nosič“ zahrnuje lipozómy a HIV-1 tat protein (viz Chen a další Anal. Biochem. 227: strana 168 až 175, 1995) jakož i libovolné plazmidy a virové expresivní vektory.
Libovolný polypeptid podle vynálezu může být použit ve formě farmaceutické přijatelné soli. Vhodné kyseliny a zásady schopné tvorby soli s polypeptidy podle vynálezu jsou odborníkům dobře známy a patří mezi ně anorganické i organické kyseliny a zásady.
Sloučenina podle vynálezu je léčenému organizmu podávána v terapeuticky účinném množství, čímž se rozumí takové množství, které způsobuje z lékařského hlediska žádoucí výsledek nebo má vliv na určitý léčený stav. Účinné množství sloučeniny podle vynálezu je schopno zlepšit stav nebo zpomalit postup nemoci, degenerativní poruchy nebo stavu po poškození organizmu. Účinné množství lze stanovit individuálně a může být zcela nebo částečně založeno na zvážení fyzických vlastností léčeného organizmu, léčených symptomů a předpokládaných účinků a výsledků. Účinné množství může stanovit odborník po zvážení uvedených faktorů a s použitím pouze rutinního experimentování.
-21 CZ 295936 B6
Lipozomální systém pro podání sloučeniny podle vynálezu může být libovolně vybrána z mnoha jednolamelárních vesikulů, multilamelárních vesikulů, nebo stabilních plurilamelárních vesikulů a může být připraven a podán odborníkům dobře známými způsoby, viz například patenty Spojených států US 5 169 637; US 4 762 915; US 5 000 958 nebo US 5 185 154. Navíc může být výhodné exprimovat polypeptidy podle vynálezu, jakož i další vybrané polypeptidy ve formě lipoproteinů za účelem zvýšit jejich vazbu na lipozómy. Například akutní selhání ledvin u člověka lze léčit proteiny KIM obalenými lipozómy, což může být provedeno in vivo vložením proteinů KIM v lipozómech do buněk, které to potřebují. Lipozómy mohou být podány přes katetr do ledvinové tepnu. Rekombinantní protein KIM lze například purifíkovat z buněk CHO pomocí imunoafinitní chromatografíe nebo libovolným jiným vhodným způsobem a poté smíchat s lipozómy tak, aby byly do lipozómů přijaty s vysokou účinností. Vložený protein může být testován in vitro na své účinky na stimulaci buněčného růstu.
Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány libovolným, z lékařského hlediska přijatelným způsobem. Tím se rozumí například injekce parenterálními cestami jako jsou intravenózní, intravaskulámí, intraarteriální, subkutánní, intramuskulámí, intratumorové, intraperitoneální, intraventrikulární, intraepidurální nebo jiné injekce, jakož i ústní, nosní, oční, rektální, nebo místní aplikace. Vynález rovněž popisuje stabilní dlouhodobé uvolňování účinné látky způsoby jako je deponovaná injekce nebo erodovatelné implantáty. Lokální podání je zvláště výhodné a jsou popsány způsoby lokální aplikace pomocí katetru do jedné nebo více tepen, například do ledvinové tepny nebo cévy vyživující lokální nádor.
Přestože byl vynález poměrně podrobně popsán v popisu a příkladech za účelem dobrého vysvětlení předmětu vynálezu a jeho pochopení, odborníkům je zřejmé, že v rámci vynálezu lze provádět určité změny a modifikace, které jsou omezeny pouze následujícími nároky.
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2566 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 615 až 1535
-22CZ 295936 B6
GCGGCCGCGT CGACGGTGCC TGTGAGTAAA TAGATCAGGG TCTCCTTCAC AGCACATTCT 60
CCAGGAAGCC GAGCAAACAT TAGTGCTATT TTACCCAGGA GGAAATCTAG GTGTAGAGAG 120
CTCTACGGAT CTAAGGTTTG GATCTGTACC CAGTGCTTTT TTAGGTGTCT TTAGACATTT 180
CTCAGGAAGA TGTAGTCTCT GTCACCATGT GTGGCTGAAT TCTAGCTCAG TCCATCTTAT 240
TGTGTTTAAG GTAGTTGAAG TTTAGGAACC AACCAGTATG TCTCTGAGCA GAAGAGTACA 300
GTGTCCATCT TGAGGACAAG CTCATCTTTA CCATTAGAGG GCTGGCCTTC GCTTAGATTC 360
TACCGAGAAC ATACTCTCTA ATGGCTGCCC TCAGTTTTCT CTGTTTGCTG TCTTATTTGT 420
GTCATGGCCA GAAGTCATAT GGATGGCTCT ATGTGAGCAA GGACCCAGAT AGAAGAGTGT 480
ATTTGGGGGA ACAGGTTGCC CTAACAGAGA GTCCTGTGGG ATTCATGCAG TQAGGATGAA 540
GACCTGATCA GACAGAGTGT GCTGAGTGCC ACGGCTAACC AGAGTGACTT GTCACTGTCC 600
TTCAGGTCAA CACC ATG Met GTT CAA CTT CAA GTC TTC ATT TCA GGC CTC CTG 650
Val Gin Leu Gin Val Phe 5 Ile Ser Gly Leu Leu 10
1
CTG ctt CTT CCA GGC TCT GTA GAT TCT TAT GAA GTA GTG AAG GGG GTG 698
Leu Leu Leu Pro Gly Ser Val Asp Ser Tyr Glu Val val Lye Gly Val
15 20 25
GTG GGT CAC CCT GTC ACA ATT CCA TGT ACT TAC TCA ACA CGT GGA GGA 746
Val Gly His Pro Val Thr Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Thr Arg Gly Gly
30 35 40
ATC ACA ACG ACA TGT TGG GGC CGG GGG CAA TGC CCA TAT TCT AGT TGT 794
Ile Thr Thr Thr Cys Trp Gly Arg Gly Gin Cys Pro Tyr Ser Ser Cys
45 50 55 60
CAA ΆΑΤ ATA CTT ATT TGG ACC AAT GGA TAC CAA GTC ACC TAT CGG AGC 842
Gin Asn Ile Leu ile Trp Thr Asn Gly Tyr Gin Val Thr Tyr Arg Ser
65 70 75
AGC GGT CGA TÁC AAC ATA AAG GGG CGT ATT TCA GAA GGA GAC GTA TCC 890
Ser Gly Arg Tyr Asn 11 e Lys Gly Arg ile Ser Glu Gly Asp Val Ser
80 85 90
-23CZ 295936 B6
TTG Leu ACA Thr ATA GAG Ile Glu 95 AAC TCT GTT GAT AGT GAT AGT GGT CTG TAT TGT TGC 938
Asn Ser Val Asp 100 Ser Asp Ser Gly Leu 105 Tyr Cys Cys
CGA GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG ACC TTT TCA 986
Arg Val Glu Ile Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met Thr Phe Ser
110 115 120
TTG GAA GTT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA AGA CCC ACA 1034
Leu Glu Val Lys Pro G1U Ile Pro Thr Ser Pro Pro Thr Arg Pro Thr
125 130 13S 140
ACT ACA AGA CCC ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA ACA AGA TCC 1082
Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Ile Ser Thr Arg Ser
145 150 155
ACA CAT GTA CCA ACA TCA ACC AGA GTC TCC ACC TCT ACT CCA ACA CCA 1130
Thr His Val Pro Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro
160 16 5 170
GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC ACT ACA TTT TAT GCC CAT 1178
Glu Gin Thr Gin Thr His Lys Pro Glu Ile Thr Thr Phe Tyr Ala His
175 180 ias
GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT CCT GCA GAC 1226
Glu Thr Thr Ala Glu Val Thr Glu Thr Pro Ser Tyr Thr Pro Ala Asp
190 195 200
TGG AAT GGC ACT GTG ACA TCC TCA GAG GAG GCC TGG ΆΑΤ AAT CAC ACT 1274
Trp Asn Gly Thr val Thr Ser Ser Glu Glu Ala Tip Asn Asn His Thr
205 210 215 220
GTA AGA ATC CCT TTG AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT AAG GGC TTC 1322
Val Arg Ile Pro Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn Pro Thr Lys Gly Phe
225 230 235
TAT GTT GGC ATG TCC GTT GCA GCC CTG CTG CTG CTG CTG CTT GCG AGC 1370
Tyr val Gly Met Ser Val Ar a Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser
240 245 250
ACC GTG GTT GTC ACC AGG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAG ATG GGC TCT 1418
Thr val val Val Thr Arg Tyr Ile Ile Ile Arg Lys Lys Met Gly Ser
255 260 265
CTG AGC. TTT GTT GCC TTC CAT GTC TCT AAG AGT AGA GCT TTG CAG AAC 1466
Leu Ser Phe Val Ala Phe His Val Ser Lys Ser Arg Ala Leu Gin Asn
270 275 280
GCA GCG ATT GTG CAT CCC CGA GCT GAA GAC AAC ATC TAC ATT ATT GAA 1514
Ala Ala Ile Val His Pro Arg Ala Glu Asp Asn Ile Tyr Ile Ile Glu
285 290 295 300
GAT AGA TCT CGA GGT GCA GAA TGAGTCCCAG AGGCCTTCTG TGGGGCCTTC 1565
Asp Arg Ser Arg Gly Ala Glu
305
-24CZ 295936 B6
TGCCTGGGAT TACAGAGATC GTGACTGATT TCACAGAGTA AAATACCCAT TCCAGCTCCT1625
GGGAGATTT7 GTGTTTTGGT TCTTCCAGCT GCAGTGGAGA GGGTAACCCT CTACCCTGTA1685
TATGCAAAAC TCGAGGTTAA CATCATCCTA ATTCTTGTAT CAGCAACACC TCAGTGTCTC1745
CACTCACTGC AGCGATTCTC TCAAATGTGA ACATTTTAGA AGTTTGTGTT TCCTTTTGTC1805
CATGTAATCA TTGGTAATAC AAGAATTTTA TCTTGTTTAT TAAAACCATT AATGAGAGGG1865
GAATAGGAA7 TAAAAGCTGG TGGGAAGGGC CTCCTGAATT TAGAAGCACT TCATGATTGT1925
GTTTATCTCT TTTATTGTAA TTTGAAATGT TACTTCTATC CTTCCCAAGG GGCAAAATCA1985
TGGGAGCATG GAGGTTTTAA TTGCCCTCAT AGATAAGTAG AAGAAGAGAG TCTAATGCCA2045
CCAATAGAGG TGGTTATGCT TTCTCACAGC TCTGGAAATA TGATCATTTA TTATGCAGTT2105
GATCTTAGGA TGAGGATGGG TTTCTTAGGA GGAGAGGTTA CCATGGTGAG TGGACCAGGC2165
ACACATCAGG GGAAGAAAAC AATGGATCAA GGGATTGAGT TCATTAGAGC CATTTCCACT2225
CCACTTCTGT CTTGATGCTC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG AATTAGGTGC2285
AGGGAGGAGA CGTGCAGAAA CGAAAGAGGA AAGAAAGGAG AGAGAGCAGG ACACAGGCTT2345
TCTGCTGAGA GAAGTCCTAT TGCAGGTGTG ACAGTGTTTG GGACTACCAC GGGTTTCCTT2405
CAGACTTCTA AGTTTCTAAA TCACTATCAT GTGATCATAT ΊΤΑΤΤΤΤΤΑΑ AATTATTTCA2465
GAAAGACACC ACATTTTCAA TAATAAATCA GTTTGTCACA ATTAATAAAA TATTŤTGTTT2525
GCTAAGAAGT ΆΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAAGTC GACGCGGCCG C2566
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2084 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 145 až 1065 (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 2:
-25CZ 295936 B6
GCGGCCGCGT CGACGGTGCC TGTGAGTAAA TAGATCAGGG TCTCCTTCAC AGCACATTCT 60
CCAGGAAGCC GAGCAAACAT TAGTGCTATT TTACCCAGGA GGAAATCTAG GTGTAGAGAG 120
CTCTACGGAT CTAAGGTCAA CACC ATG GTT CAA CTT CAA GTC TTC ATT TCA 171
Met Val Gin Leu Gin Val Phe Ile Ser
GGC CTC CTG CTG CTT CTT 1 CCA GGC TCT GTA GAT 5 TCT TAT GAA GTA GTG Val 2S 219
Gly Leu 10 Leu Leu Leu Leu 15 Pro Gly Ser Val Asp 20 Ser Tyr Glu Val
aag GGG CTG GTG GGT CAC CCT GTC ACA ATT CCA TGT ACT TAC TCA ACA 267
Lys Gly val Val Gly His Pro Val Thr Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Thr
30 35 40
CGT GGA GGA ATC ACA ACG ACA TGT TGG GGC CGG GGG CAA TGC CCA TAT 315
Arg Gly Gly Ile Thr Thr Thr Cys Trp Gly Arg Gly Gin Cys Pro Tyr
4S 50 55
TCT AGT TGT CAA AAT Asn ATA Ile CTT ATT TGG ACC AAT GGA TAC CAA GTC Val ACC Thr 363
ser Ser cys 60 Gin Leu Ile 65 Trp Thr Asn Gly Tyr 70 Gin
TAT CGG AGC AGC GGT CGA TAC AAC ATA AAG GGG CGT ATT TCA GAA GGA 411
Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Asn Ile Lys Gly Arg Ile Ser Glu Gly
75 00 85
GA.C GTA TCC TTG ACA ATA GAG AAC TCT GTT GAT AGT GAT AGT GGT CTG 459
Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Ser Val Asp Ser Asp Ser Gly Leu
90 95 100 105
TAT TGT TGC CGA GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG 507
Tyr Cys Cys Arg Val Glu Ile Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met
110 lis 120
ACC TTT TCA TTG GAA GTT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA 555
Thr Phe Ser Leu Glu Val Lys Pro Glu Ile Pro Thr Ser Pro Pro Thr
125 130 135
AGA CCC ACA ACT ACA AGA CCC ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA 603
Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Ile Ser
140 145 15Q
ACA AGA TCC ACA CAT GTA CCA ACA TCA ACC AGA GTC TCC ACC TCT ACT 6S1
Thr Arg Ser Thr His Val Pro Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr
155 160 165
CCA ACA CCA GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC ACT ACA TTT 699
Pro Thr Pro Glu Gin Thr Gin Thr His Lys Pro Glu Ile Thr Thr Phe
170 175 180 185
TAT GCC CAT GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT 747
Tyr Ala Hie Glu Thr Thr Ala Glu Val Thr Glu Thr Pro Ser Tyr Thr
190 195 200
-26CZ 295936 B6
CCT GCA GAC TGG AAT GGC ACT GTC ACA TCC TCA GAG GAG GCC TCG AAT795
Pro Ala Asp Trp Asn Gly Thr Val Thr Ser Ser Glu Glu Ala Trp Asn
205 210215
AAT CAC ACT GTA AGA ATC CCT TTC AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT843
Asn His Thr Val Arg ile Pro Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn ProThr
220 22S230
AAG GGC TTC TAT GTT GGC ATG TCC GTT GCA GCC CTC CTC CTG CTG CTG891
Lys Gly Phe Tyr Val Gly Met Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu LeuLeu
235 240245
CTT GCG AGC ACC GTG GTT GTC ACC AGG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAG939
Leu Ala Ser Thr Val Val Val Thr Arg Tyr Ile Ile Ile Arg LysLys
280 255 260265
ATG GGC TCT CTG AGC TTT GTT GCC TTC CAT GTC TCT AAG AGT AGA GCT987
Met Gly Ser Leu Ser Phe Val Ala Phe His Val Ser Lys Ser ArgAla
270 275280
TTG CAG AAC GCA GCG ATT GTG CAT CCC CGA GCT GAA GAC AAC ATC TAC1035
Leu Gin Asn Ala Ala Ile Val His Pro Arg Ala Glu Asp Asn IleTyr
285 290295
ATT ATT GAA GAT AGA TCT CGA GGT GCA GAA TGAGTCCCAG AGGCCTTCTG1085
Ile Ile Glu Asp Arg Ser Arg Gly Ala Glu
300305
TGGGGCCTTC TGCCTGGGAT TACAGAGATC GTCACTCATT TCACAGAGTA AAATACCCAT1145
TCCAGCTCCT GGGAGATTTT GTGTTTTGGT TCTTCCAGCT GCAGTGGAGA GGGTAACCCT1205
CTACCCTGTA TATGCAAAAC TCGAGGTTAA CATCATCCTA ATTCTTGTAT CAGCAACACC1265
TCAGTCTCTC CACTCACTGC AGCGATTCTC TCAAATGTGA ACATTTTAGA AGTTTCTGTT1325
TCCTTTTGTC CATGTAATCA TTGGTAATAC AAGAATTTTA TCTTGTTTAT TAAAACCATT1385
AATGAGAGGG GAATAGGAAT TAAAAGCTGG TGGGAAGGGC CTCCTGAATT TAGAAGCACT1445
TCATGATTGT GTTTATCTCT TTTATTGTAA TTTGAAATGT TACTTCTATC CTTCCCAAGG1505
GGCAAAATCA TCGGAGCATG GAGGTTTTAA TTCCCCTCAT AGATAAGTAG AAGAAGAGAG156S
TCTAATGCCA CCAATAGAGG TGGTTATCCT TTCTCACAGC TCTGGAAATA TCATCATTTA162S
TTATGCAGTT GATCTTAGGA TGAGGATGGG TTTCTTAGGA GGAGAGGTTA CCATGGTGAG1685
TGGACCAGGC ACACATCAGG GGAAGAAAAC AATCGATCAA GGGATTCAGT TCATTAGAGC1745
CATTTCCACT CCACTICTGT CTTGATGCTC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG1805
AATTAGGTGC AGGGAGGAGA CGTCCAGAAA CGAAAGAGGA AAGAAAGGAG AGAGAGCAGG1855
ACACAGGCTT TCTGCTGAGA GAAGTCCTAT TGCAGGTCTG ACAGTGTTTG GGACTACCAC1925
-27CZ 295936 B6
GGGTTTCCTT CAGACTTCTA AGTTTCTAAA TCACTATCAT GTGATCATAT ΤΤΑΤΤΤΤΤΆΑ
AATTATTTCA GAAAGACACC ACATTTTCAA TAATAAATCA GTTTGTCACA ATTAATAAAA
TATTTTGTTT GCTAAGAAGT AAAAAGTCGA CGCGGCCGC
198S
2045
2084
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 307 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 3:
Met Val Gin Leu Gin Val Phe Ile Ser Gly Leu Leu Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ser Val ASP Ser Tyr Glu Val Val Lys Gly Val Val Gly His Pro
20 25 30
val Thr Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Thr Arg Gly Gly Ile Thr Thr Thr
35 40 45
Cys Trp Gly Arg Gly Gin Cys Pro Tyr Ser Ser Cys Gin Asn Ile Leu
50 55 60
ile Trp Thr Asn Gly Tyr Gin Val Thr Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Tyr
65 70 75 80
Asn Ile Lys Gly Arg Ile Ser Glu Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu
85 90 95
Asn Ser Val Asp Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Arg Val Glu Ile
100 105 110
Pro cly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met Thr Phe Ser Leu Glu Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ile Pro Thr Ser Pro Pro Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro
130 135 140
Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Ile Ser Thr Arg Ser Thr His Val Pro
145 150 155 160
Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr ser Thr Pro Thr Pro Glu Gin Thr Gin
16S 170 175
Thr His Lys Pro Glu Ile Thr Thr Phe Tyr Ala His Glu Thr Thr Ala
180 105 190
-28CZ 295936 B6
Glu Val Thr Glu Thr Pro Ser Tyr 200 Thr Pro Ala Asp Trp 205 Asn Gly Thr
135
Val Thr Ser Ser Glu Glu Ala Trp Asn Asn His Thr Val Arg Ile Pro
210 215 220
Leu Arg tys Pro Gin Arg Asn Pro Thr Lys Gly Phe Tyr Val Gly Met
225 230 235 240
ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Thr Val Val Val
245 250 2SS
Thr Arg Tyr Tle Ile Ile Arg Lys Lys Met Gly Ser Leu Ser Phe Val
260 265 270
Ala Phe His Val Ser Lys Ser Arg Ala Leu Gin Asn Ala Ala Ile Val
275 260 285
His Pro Arg Ala Glu Asp Asn Ile Tyr Ile Ile Glu Asp Arg Ser Arg
290 295 300
Gly Ala Glu
305
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2303 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 145 až 1065 (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 4:
GCGGCCGCGT CGACTCGCAG GAGGCCGGCA CTCTGACTCC TGGTGGATGG GACTAGGGAG 60
TCAGAGTCAA GCCCTGACTG GCTGAGGGCG GGCGCTCCGA GTCAGC ATG GAA AGT 11S
Met Glu 5er
CTC TGC GGG GTC CTG GTA TTT CTG CTG CTG GCT GCA GGA CTG CCG CTC 1«3
Leu Cys Gly Val Leu val Phe Leu Leu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Leu
5 10 15
CAG GCG GCC AAG CGG TTC CGT GAT GTG CTG GGC CAT GAG CAG TAT CCG 211
Gin Ala Ala Lye Arg Phe Arg Asp Val Leu Gly His Glu Gin Tyr Pro
20 25 30 35
-29CZ 295936 B6
GAT CAC ASp Hle ATG AGG Met Arg GAG AAC AAC CAA TTA CGT GGC TGG TCT TCA GAT GAA Glu 259
Glu 40 Asn Asn Gin Leu Arg 45 Gly Trp Ser Ser Asp 50
AAT GAA TGG GAT GAA CAG CTG TAT CCA GTG TGG AGG AGG GGA GAG GGC 307
Asn Glu Trp Asp 55 Glu Gin Leu Tyr Pro 60 Val Trp Arg Arg Gly 65 Glu Gly
AGA TGG AAG GAC TCC TGG GAA GGA GGC CGT GTG CAG GCA GCC CTA ACC 35S
Arg Trp Lys 70 Asp Ser Trp Glu Gly Gly 7S Arg Val Gin Ala eo Ala Leu Thr
AGT GAT TCA CCG GCC TTG GTG GGT TCC AAT ATC ACC TTC GTA GTG AAC 403
Ser Asp 85 Ser Pro Ala Leu val 90 Gly Ser Asn Ile Thr 95 Phe Val Val Asn
CTG GTG TTC CCC AGA TGC CAG AAG GAA GAT GCC AAC GGC AAT ATC GTC 451
Leu 100 Val Phe Pro Arg Cys 105 Gin Lys Glu Asp Ala 110 Asn Gly Ash Ile Val lis
TAT GAG AGG AAC TGC AGA AGT GAT TTG GAG CTG GCT TCT GAC CCG TAT 499
Tyr Glu Arg Asn Cys 120 Arg Ser Asp Leu Glu 125 Leu Ala Ser Asp Pro 130 Tyr
GTC TAC AAC TGG ACC ACA GGG GCA GAC GAT GAG GAC TGG GAA GAC AGC S47
Val Tyr Asn Trp 13 5 Thr Thr Gly Ala Asp 140 Asp Glu Asp Trp Glu 145 Asp Ser
ACC AGC CAA GGC CAG CAC CTC AGG TTC CCC GAC GGG AAG CCC TTC CCT 595
Thr Ser Gin 150 Gly Gin His Leu Arg 155 Phe Pro Asp Gly Lys 160 Pro Phe Pro
CGC CCC CAC GGA CGG AAG AAA TGG AAC TTC GTC TAC GTC TTC CAC ACA 643
Arg Pro 16S His Gly Arg Lys Lys 170 Trp Asn Phe Val Tyr 175 Val Phe His Thr
CTT GGT CAG TAT TTT CAA AAG CTG GGT CGG TGT TCA GCA CGA GTT TCT 691
Leu 1S0 Gly Gin Tyr Phe Gin 185 Lys Leu Gly Arg Cys 190 Ser Ala Arg Val Ser 195
ATA AAC ACA GTC AAC TTG ACA GTT GGC CCT CAG GTC ATG GAA GTG ATT 739
Ile Asn Thr Val Asn 200 Leu Thr Val Gly Pro 20S Gin Val Met Glu Val 210 Ile
GTC TTT CGA AGA CAC GGC CGG GCA TAC ATT CCC ATC TCC AAA GTG AAA 787
Val Phe Arg Arg 215 His Gly Arg Ala Tyr 220 Ile Pro Ile Ser Lys 225 Val Lys
GAC GTG TAT GTG ATA ACA GAT CAG ATC CCT ATA TTC GTG ACC ATG TAC 835
Asp Val Tyr 230 Val Ile Thr Asp Gin 235 Ile Pro Ile Phe Val 240 Thr Met Tyr
CAG AAG AAT GAC CGG AAC TCG TCT GAT GAA ACC TTC CTC AGA GAC CTC 883
Gin Lys 245 Asn ASp Arg Asn Ser 250 Ser Asp G1U Thr Phe 255 Leu Arg Asp Leu
-30CZ 295936 B6
ccc Pro 260 ATT Ile TTC TTC GAT Asp GTC CTC ATT CAC GAT CCC AGT CAT TTC CTC AAC 931
Phe Phe Val 265 Leu Ile His Asp Pro 270 Ser His Phe Leu Asn 275
TAC TCT GCC ATT TCC TAC AAG TGG AAC TTT GGG GAC AAC ACT GGC CTG 979
Tyr Ser Ala Ile Ser Tyr Lys Trp Asn Phe Gly Asp Asn Thr Gly Leu
280 285 290
TTT GTC TCC AAC AAT CAC ACT TTG AAT CAC ACG TAT GTG CTC AAT GGA 1027
Phe val Ser Asn Asn His Thr Leu Asn His Thr Tyr Val Leu Asn Gly
295 300 305
ACC TTC AAC TTT AAC CTC ACC GTG CAA ACT GCA GTG CCG GGA CCA TGC 1075
Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val Gin Thr Ala Val Pro Gly Pro Cys
310 315 320
ccc TCA CCC ACA CCT TCG CCT TCT TCT TCG ACT TCT CCT TCG CCT GCA 1123
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser Pro Ala
325 330 335
TCT TCG CCT TCA ccc ACA TTA TCA ACA CCT AGT CCC TCT TTA ATG CCT 1171
Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro Ser Leu Met Pro
340 345 350 355
ACT GGC CAC AAA TCC ATG GAG CTG AGT GAC ATT TCC AAT GAA AAC TGC 1219
Thr Gly His Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp Ile Ser Asn Glu Asn Cys
360 365 370
CGA ATA AAC AGA TAT GGT TAC TTC AGA GCC ACC ATC ACA ATT GTA GAT 1267
Arg Ile Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Ala Thr Ile Thr Ile Val Asp
375 380 385
GGA ATC CTA GAA GTC AAC ATC ATC CAG GTA GCA GAT GTC CCA ATC CCC 1315
Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gin Val Ala Asp Val Pro Ile Pro
390 395 400
ACA CCG CAG CCT GAC AAC TCA CTG ATG GAC TTC ATT GTG ACC TGC AAA 1363
Thr Pro Gin Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe Ile Val Thr cys Lys
405 410 415
GGG GCC ACT CCC ACG CAA GCC TGT ACG ATC ATC TCT GAC CCC ACC TGC 1411
Gly Ala Thr Pro Thr Glu Ala Cya Thr tle Ile Ser Asp Pro Thr Cys
420 425 430 435
CAG ATC GCC CAG AAC AGG GTG TGC AGC CCG GTG GCT GTG GAT GAG CTG 1459
Gin Ile Ala Gin Asn Arg Val Cya Ser Pro Val Ala Val Asp Glu Leu
440 445 450
TGC CTC CTG TCC GTG AGG AGA GCC TTC AAT GGG TCC GGC ACG TAC TGT 1507
Cys Leu Leu Ser val Arg Arg Ala Phe Asn Gly Ser Gly Thr Tyr Cys
455 460 465
GTG AAT TTC ACT CTG GGA GAC GAT GCA AGC CTG GCC CTC ACC AGC GCC 1555
Val Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Ala Ser Leu Ala Leu Thr Ser Ala
470 475 480
-31 CZ 295936 B6
CTG ATC TCT ATC CCT GGC AAA GAC CTA GGC TCC CCT CTG AGA ACA GTG1S03
Leu Ile Ser Ile Pro Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro Leu Arg ThrVal
4Θ5 490495
AAT GGT GTC CTG ATC TCC ATT GGC TGC CTG GCC ATG TTT GTC ACC ATG1651
Asn Gly Val Leu Ile Ser Ile Gly Cys Leu Ala Met Phe Val ThrMet
500 505 510515
GTT ACC ATC TTG CTG TAC AAA AAA CAC AAG ACG TAC AAG CCA ATA GGA1699
Val Thr Ile Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Thr Tyr Lys Pro IleGly
520 525530
AAC TGC ACC AGG AAC GTG GTC AAG GGC AAA GGC CTG AGT GTT TTT CTC174 7
Asn Cys Thr Arg Asn Val Val Lys Gly Lys Gly Leu Ser Val PheLeu
S35 540545
AGC CAT GCA AAA GCC CCG TTC TCC CGA GGA GAC CGG GAG AAG GAT CCA1795
Ser His Ala Lys Ala Pro Phe Ser Arg Gly Asp Arg Glu Lys AspPro
S50 555560
CTG CTC CAG GAC AAG CCA TGG ATG CTC TAAGTCTTCA CTCTCACTTC1842
L<*u Leu Gin. Asp Lys Pro Trp Met Leu
565570
TGACTGGGAA CCCACTCTTC TGTGCATGTA TGTGAGCTGT GCAGAAGTAC ATGACTGGTA1902
GCTGTTGTTT TCTACGGATT ATTGTAAAAT GTATATCATG GTTTAGGGAG CGTAGTTAAT1962
TGGCATTTTA GTGAAGGGAT GGGAAGACAG TATTTCTTCA. CATCTGTATT GTGGTTTTTA2022
TACTGTTAAT AGGGTGGGCA CATTGTGTCT GAAGGGGGAG GGGCAGGTCA CTGCTACTTA2082
AGGTCCTAGG TTAACTGGGA GAGGATGCCC CAGGCTCCTT AGATTTCTAC ACAAGATGTG2142
CCTGAACCCA GCTAGTCCTG ACCTAAAGGC CATGCTTCAT CAACTCTATC TCAGCTCATT2202
GAACATACCT GAGCACCTGA TGGAATTATA ATGGAACCAA GCTTGTTGTA TGGTGTGTGT2262
GTGTACATAA GATACTCATT AAAAAGACAG TCTATTAAAA A2303
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 572 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární ίο (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 5:
-32CZ 295936 B6
Met Glu 1 Ser Leu Cys Gly Val Leu Val Phe 10 Arg
Leu Gin 20 5 Ala Arg Phe 25
Leu Pro Ala Lys
Gin Tyr Pro 35 Asp His Met Arg Glu 40 Asn Asn
Ser Asp 50 Glu Asn Glu Trp Asp 55 Glu Gin Leu
Gly 65 Glu Gly Arg Trp Lys 70 Asp Ser Trp Glu
Ala Leu Thr Ser Asp 85 ser Pro Ala Leu Val 90
Leu Leu Leu Ala Ala Gly 15
Asp Val Leu Gly His Glu 30
Gin Leu Arg Gly Trp Ser
Tyr Pro Val Trp Arg Arg
Gly Gly Arg Val Gin Ala
7580
Gly Ser Asn Ile Thr Phe
Val Val Asn Leu Val Phe Pro Arg Cys· Gin Lys
100105
Asn Ile Val Tyr Glu Arg Asn Cys Arg Ser Asp 115120
Asp Pro Tyr val Tyr Asn. Trp Thr Thr Gly Ala 130135
Glu Asp Ser Thr Ser Gin Gly Gin His Leu Arg 145 1501SS
Pro Phe Pro Arg Pro His Gly Arg Lys Lys Trp
165170
Glu Asp Ala Asn Gly
110
Leu Glu Leu Ala Ser
125
Asp Asp Glu ASp Trp
140
Phe Pro Asp Gly Lys
160
Asn Phe Val Tyr Val
175
Phe
His
Thr
Leu
180
Gly
Gin
Tyr
Phe
Gin
185
Lys
Leu
Gly Arg
Cys
190
Ser
Ala
Arg val
Ser
195
Ile
ASn
Thr
Val
Asn
200
Leu
Thr
Val
Gly
Pro
205
Gin val
Met
Glu
Val
210
Ile
Val
Phe
Arg
Arg
215
His
Gly
Arg
Ala
Tyr
220
Ile
Pro
Ile
Ser
Lys
225
Val
Lys
Asp
Val
Tyr
230
Val
Ile
Thr
Asp
Gin
235
Ile
Pro
Ile
Phe
Val
240
Thr
Met
Tyr
Gin
Lys
245
Asn
Asp
Arg
Asn
Ser
250
Ser
Asp
Glu
Thr
Phe
255
Leu
Arg
ASP
Leu
Pro
260
Ile
Phe
Phe
Asp
Val
265
Leu
Ile
His
Asp
Pro
270
Ser
His
Phe
Leu
Asn
275
Tyr
Ser
Ala
Xle
Ser
280
Tyr
Lys
Trp
Asn
Phe
285
Gly
Asp
Asn
Thr
Gly
290
Leu
Phe
Val
Ser
Asn
295
Asn
His
Thr
Leu
Asn
300
His
Thr
Tyr
Val
-33 CZ 295936 B6
Leu Asn 305 Gly Thr Phe Asn 310 Phe Asn Leu Thr Val 315 Gin Thr Ala Val
Gly Pro Cys Prc Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser
325 330 335
Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro
340 345 3S0
Leu Met Pro Thr Gly His Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp Ile Ser
355 360 365
Glu Asn Cys Arg Ile Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Ala Thr Ile
370 375 380
Ile Val Asp Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gin Val Ala ASp
38S 3 90 395
Pro Ile Pro Thr Pro Gin Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe Ile
405 410 415
Thr Cys Lys Gly Ala Thr Pro Thr Glu Ala Cys Thr Ile Ile Ser
420 425 430
Pro Thr Cys Gin I le Ala Gin Asn Arg val Cys Ser Pro Val Ala
435 440 445
Asp Glu Leu Cys Leu Leu Ser Val Arg Arg Ala Phe Asn Gly Ser
450 455 460
Thr Tyr Cys Val Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Ala Ser Leu Ala
465 470 47S
Thr Ser Ala Leu ile Ser Ile Pro Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro
485 490 495
Arg Thr Val Asn Gly Val Leu Tle Ser ile Gly Cys Leu Ala Met
500 505 510
Val Thr Met Val Thr Ile Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Thr Tyr
515 520 525
Pro Ile Gly Asn Cys Thr Arg Asn Val Val Lys Gly Lys Gly Leu
530 535 540
Val Phe Leu Ser His Ala Lys Ala Pro Phe Ser Arg Gly Asp Arg
545 550 S55
Lys Afip Pro Leu Leu Gin Asp Lys Pro Trp Met Leu
Pro
Ser
Thr
Val
A®p
Val
Gly
Leu
Phe
Lys
Ser
565
Pro
320
Val
400
Leu
480
Glu
560
Asn
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1795 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina
570
-34CZ 295936 B6 (C) POČET VLÁKEN; jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 278 až 1279 (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 6:
GCGGCCGCGT CGACGAAGCT GGGAAGTCAG GGGCTGTTTC TGTGGGCAGC TTTCCCTGTC60
CTTTGGAAGG CACAGAGCTC TCAGCTGCAG GGAACTAACA GAGCTCTGAA GCCGTTATAT120
GTGGTCTTCT CTCATTTCCA G£AGAGCAGG CTCATATGAA TCAACCAACT GGGTGAAAAG180
ATAAGTTGCA ATCTGAGATT TAAGACTTGA TCAGATACCA TCTGGTGGAG GGTACCAACC240
AGCCTGTCTG CTCATTTTCC TTCAGGCTGA TCCCATA ATG CAT CCT CAA GTG GTC 295 Met His Pro Gin Val Val
ATC TTA AGC CTC ATC CTA CAT CTG GCA GAT TCT GTA GCT GGT TCT GTA val 343
Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp 1S ser Val Ala Gly 20 Ser
10
AAG GTT GGT GGA GAG GCA GGT CCA TCT GTC ACA CTA CCC TGC CAC TAC 391
Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val Thr Leu Pro cys His Tyr
25 30 35
AGT GGA GCT GTC ACA TCA ATG TGC TGG AAT AGA GGC TCA TGT TCT CTA 439
Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn Arg Gly Ser Cys Ser Leu
40 45 50
TTC ACA TGC CAA AAT GGC ATT GTC TGG ACC AAT GGA ACC CAC GTC ACC 487
Phe Thr Cys Gin Asn Gly Ile Val Trp Thr Asn Gly Thr His Val Thr
55 60 65 70
TAT CGG AAG GAC ACA CGC TAT AAG CTA TTG GGG GAC CTT TCA AGA AGG 535
Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Asp Leu Ser Arg Arg
75 80 85
GAT GTC TCT TTG ACC ATA GAA AAT ACA GCT GTG TCT GAC AGT GGC GTA 583
Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala Val Ser Asp Ser Gly val
90 95 100
TAT TGT TGC CGT GTT GAG CAC CGT GGG TGG TTC AAT GAC ATG AAA ATC 631
Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met Lys Ile
105 110 115
-35CZ 295936 B6
ACC GTA TCA TTG GAG ATT GTG Val 125 CCA CCC AAG GTC ACG ACT ACT CCA ATT ne 679
Thr Val Ser Leu Glu Ile Pro Pro Lys Val Thr 130 Thr Thr Pro
120
GTC ACA ACT GTT CCA ACC GTC ACG ACT GTT CGA ACG AGC ACC ACT GTT 727
val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val Arg Thr Ser Thr Thr Val
13S 140 145 150
CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCA ACG ACA ACT GTT CCA ACA ACA ATG AGC 775
Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Ser
155 160 165
ATT CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCG ACG ACA ATG ACT GTT TCA ACG ACA 823
Ile Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Thr Val Ser Thr Thr
170 175 180
ACG AGC GTT CCA ACG ACA ACG AGC ATT CCA ACA ACA ACA AGT GTT CCA 371
Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser Ile Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro
18S 190 195
GTG ACA ACA ACG GTC TCT ACC TTT GTT CCT CCA ATG CCT TTG CCC AGG 919
Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro Pro Met Pro Leu Pro Arg
200 205 210
CAG AAC CAT GAA CCA GTA GCC ACT TCA CCA TCT TCA CCT CAG CCA GCA 967
Gin Asn His Glu Pro Val Ala Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gin Pro Ala
215 220 225 230
GAA ACC CAC CCT ACG ACA CTG CAG GGA GCA ATA AGG AGA GAA CCC ACC 1015
Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gin Gly Ala Ile Arg Arg Glu Pro Thr
235 240 245
AGC TCA CCA TTG TAC TCT TAC ACA ACA GAT GGG AAT GAC ACC GTG ACA 1063
Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr
2S0 255 260
GAG TCT TCA GAT GGC CTT TGG AAT AAC AAT CAA ACT CAA CTG TTC CTA 1111
Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn Gin Thr Gin Leu Phe Leu
265 270 275
GAA CAT AGT CTA CTG ACG GCC AAT ACC ACT AAA GGA ATC TAT GCT GGA 1159
Glu His Ser Leu Leu Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly Ile Tyr Ala Gly
280 285 290
GTC TGT ΑΤΓ TCT GTC TTG GTG CTT CTT GCT CTT TTG GGT GTC ATC ATT 1207
Val Cys Ile Ser Val Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Val Ile Ile
295 300 30S 310
GCC AAA AAG TAT TTC TTC AAA AAG GAG GTT CAA CAA CTA AGA CCC CAT 1255
Ala hys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val Gin Gin Leu Arg Pro Hie
315 320 325
AAA TCC TGT ATA CAT CAA AGA GAA TAGTCCCTGG AAACATAGCA AATGAACTTC 1309
Lys Ser Cys rie His Gin Arg Glu
330
-36CZ 295936 B6
TATCTTGGCC ATCACAGCTG TCCAGAAGAG ACGTGAOACT TCATTTGGAA GCATTGTATG AATGTTGCAT TTCCTATGTT TTCCAAAGGT GGGAAACAAA GTGAGTCTAA CTCACAGGTT ATGCATTAAG TACTGGATCT CTGAATTGGG ATAGTATGGA ACACATAGAC ACCAGGGGAA TTATGCAATT TTTTTTTTTT TTTTTGAGAT ŤGCGATGGTG AAATCTCGGC TCACTGTAAC GTCGAC
GGGAATCTGT CTTAAAAACC AGCAAATCXA1369
ATTATCTCTT GTTTCTATGT TATACTTCCA1429
TTCAAATCGT GGGTTTTTAT TTCCTCCGTG1499
TAGCTGTTTT CTCATAACTC TGGAAATGTG1549
GTAGCTGTTT TACCAGTTAA AGAGCCTACA1609
GAAAATCATT TGCCAGGTGA TTTAACATAT1669
GGAGCTTTGC TCTTGTTGCC CAGGCTGGAG1729
CTCCACCTTC CGGGTTCAAG CAATTCTCCC1789
1795
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 334 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 7:
Met His 1 Pro Gin Val 5 Val Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp
10 15
Ser Val Ala Gly Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser val
20 25 30
Thr Leu Pro Cys His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn
35 40 45
Arg Gly Ser cys Ser Leu Phe Thr Cys Gin Asn Gly Ile Val Trp Thr
50 55 60
Asn Gly Thr His Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu
65 70 75 80
Gly Asp Leu Ser Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala
85 90 95
Val Ser Aep Ser Gly Val Tyr Cys cya Arg Val Glu His Arg Gly Trp
100 105 110
Phe Αβη Asp Met Lys Ile Thr val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys
lis 120 125
-37CZ 295936 B6
val Thr Thr Thr 130 Pro lle Val 135 Thr Thr Val Pro Thr Val 140 Thr Thr val
Arg Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr
145 150 155 160
Val Pro Thr Thr Met Ser lle Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr
165 170 175
Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser lle Pro
180 185 190
Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro
195 200 205
Pro Met Pro Leu Pro Arg Gin Asn His Glu Pro Val Ala Thr Ser Pro
210 215 220
Ser Ser Pro Gin Pro Ala Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gin Gly Ala
225 230 235 240
lle Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr ser Tyr Thr Thr Asp
245 250 255
Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn
260 265 270
Gin Thr Gin Leu Phe Leu Glu His Ser Leu Leu Thr Ala Asn Thr Thr
275 280 285
Lys Gly lle Tyr Ala Gly Val Cys lle Ser Val Leu Val Leu Leu Ala
290 295 300
Leu Leu Gly val lle Xle JL1. a Lys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val
305 310 315 320
Gin Gin Leu Arg Pro His Lys Ser Cys lle His Gin Arg Glu
325 330
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z 90 % idenío tická se Sekvencí id. č. 3, Sekvencí id. č. 5 nebo Sekvencí id. č. 7.
  2. 2. Polypeptid podle nároku 1, kde aminokyselinová sekvence je alespoň z 95 % identická se Sekvencí id. č.
  3. 3, Sekvencí id. č. 5 nebo Sekvencí id. č. 7.
    15 3. Polypeptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako
    Sekvence id. č. 3, Sekvence id. č. 5 nebo Sekvence id. č. 7.
    -38CZ 295936 B6
  4. 4. Polypeptid podle nároku 1 sestávající ze Sekvence id. č. 3, Sekvence id. č. 5 nebo Sekvence id. č. 7.
  5. 5. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyseliny 21 až 290 ze Sekvence idč. 7.
  6. 6. Izolovaný polypeptid obsahující rozpustnou variantu polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
  7. 7. Fúzní protein obsahující polypeptid podle nároku 5 nebo 6 a úsek Fc z imunoglobulinu.
  8. 8. Fúzní protein obsahující extracelulámí doménu polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 a úsek Fc z imunoglobulinu.
  9. 9. Izolovaná nukleová kyselina kódující polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
  10. 10. Nukleová kyselina kódující fúzní protein podle nároku 7 nebo 8.
  11. 11. Nukleová kyselina podle nároku 9, která obsahuje sekvenci uvedenou zde jako Sekvence id. č. 1, Sekvence id. č. 2, Sekvence id. č. 4 nebo Sekvence id. č. 6.
  12. 12. Nukleová kyselina, která hybridizuje za stringentních podmínek se sekvencí uvedou zde jako Sekvence id. č. 1, Sekvence id. č. 2, Sekvence id. č. 4 nebo Sekvence id. č. 6.
  13. 13. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12.
  14. 14. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 13.
  15. 15. Způsob přípravy polypeptidu, v y z n a č u j i c í se t i m , že zahrnuje kroky, kdy se kultivují hostitelské buňky podle nároku 14 a izoluje se polypeptid exprimovaný z vektoru v hostitelských buňkách.
  16. 16. Protilátka, která se váže na polypeptid podle nároku 4.
  17. 17. Protilátka podle nároku 16, která je konjugována s toxinem nebo radionuklidem.
  18. 18. Hybridom, kteiý produkuje protilátku podle nároku 16.
  19. 19. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje (I) polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, fúzní protein podle nároku 7 nebo 8 nebo protilátku podle nároku 16 nebo 17 a (II) farmakologicky přijatelný nosič.
  20. 20. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, fúzního proteinu podle nároku 7 nebo 8 nebo protilátky podle nároku 16 nebo 17 pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení poškození nebo nemoci ledvin u pacienta, který trpí poškozením nebo nemocí ledvin.
  21. 21. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, fúzního proteinu podle nároku 7 nebo 8 nebo protilátky podle nároku 16 nebo 17 pro výrobu farmaceutické kompozice k vyšetřování přítomnosti nebo rozvoje poškození nebo nemoci ledvin u pacienta trpícího poškozením nebo nemocí ledvin nebo pacienta s rizikem rozvoje poškození nebo nemoci ledvin.
  22. 22. Použití podle nároku 20 nebo 21 kdy pacientem je člověk.
  23. 23. Použití protilátky podle nároku 16 nebo 17 pro výrobu kompozice pro zobrazování buněk nebo tkání exprimujících polypeptid podle nároku 4.
    -39CZ 295936 B6
  24. 24. Použití protilátky podle nároku 17 pro výrobu farmaceutické kompozice pro cílení toxinu nebo radionuklidu do buněk exprimujících polypeptid podle nároku 4.
  25. 25. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, fúzní protein podle nároku 7 nebo 8 nebo 5 protilátka podle nároku 16 nebo 17 pro použití při léčení.
CZ19983813A 1996-05-24 1997-05-23 Izolovaný polypeptid KIM, modulátor tkáňové regenerace, a nukleová kyselina, která ho kóduje, způsob přípravy polypeptidu a farmaceutická kompozice obsahující polypeptid CZ295936B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1822896P 1996-05-24 1996-05-24
US2344296P 1996-08-23 1996-08-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ381398A3 CZ381398A3 (cs) 1999-05-12
CZ295936B6 true CZ295936B6 (cs) 2005-12-14

Family

ID=26690881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19983813A CZ295936B6 (cs) 1996-05-24 1997-05-23 Izolovaný polypeptid KIM, modulátor tkáňové regenerace, a nukleová kyselina, která ho kóduje, způsob přípravy polypeptidu a farmaceutická kompozice obsahující polypeptid

Country Status (27)

Country Link
US (4) US6664385B1 (cs)
EP (2) EP1655367A1 (cs)
JP (3) JP4602482B2 (cs)
CN (1) CN1147584C (cs)
AT (1) ATE318903T1 (cs)
AU (1) AU712289B2 (cs)
BG (1) BG64678B1 (cs)
BR (1) BR9709115A (cs)
CA (1) CA2257851C (cs)
CZ (1) CZ295936B6 (cs)
DE (1) DE69735364T3 (cs)
DK (1) DK0907735T5 (cs)
EA (1) EA004402B1 (cs)
EE (1) EE04817B1 (cs)
ES (1) ES2258793T5 (cs)
HK (1) HK1021746A1 (cs)
HU (1) HU226205B1 (cs)
IL (1) IL127162A (cs)
IS (1) IS2636B (cs)
NO (2) NO327597B1 (cs)
NZ (1) NZ336467A (cs)
PL (1) PL188826B1 (cs)
PT (1) PT907735E (cs)
SI (1) SI0907735T2 (cs)
SK (1) SK285461B6 (cs)
TR (1) TR199802421T2 (cs)
WO (1) WO1997044460A1 (cs)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA004402B1 (ru) * 1996-05-24 2004-04-29 Байоджен, Инк. Модуляторы регенерации тканей
EP0983357A1 (en) * 1997-05-23 2000-03-08 Biogen, Inc. Modulators of tissue regeneration
SK287538B6 (sk) 1998-03-20 2011-01-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Syntetický gén obsahujúci dispergovanú alebo cudzorodú deoxyribonukleovú molekulu, génový konštrukt obsahujúci tento syntetický gén a prípravok obsahujúci tento syntetický gén
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1160321A1 (en) * 2000-05-31 2001-12-05 Sanofi-Synthelabo Kidney Injury Novel Gene-1: Isolation and therapeutic applications
US7179901B2 (en) 2000-06-16 2007-02-20 Biogen Idec Ma Inc. Renal regulatory elements and methods of use thereof
US6812002B2 (en) * 2000-08-30 2004-11-02 Pfizer Inc. Osteoactivin protein and nucleic acids encoding the same, compositions and methods of stimulating bone differentiation
ATE382060T1 (de) * 2001-06-01 2008-01-15 Biogen Idec Inc Moleküle und verfahren zur inhibierung der freisetzung von kim-1
US8709412B2 (en) 2001-06-29 2014-04-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modulation of TIM receptor activity in combination with cytoreductive therapy
CA2452196A1 (en) * 2001-06-29 2003-01-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes and methods of use thereof
WO2003080856A2 (en) * 2002-03-19 2003-10-02 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
EP1585546B1 (en) * 2002-12-30 2008-08-06 Biogen Idec MA Inc. Kim-1 antagonists and use to modulate immune system
US8067544B2 (en) * 2003-03-19 2011-11-29 Curagen Corporation Antibodies against T cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (TIM-1) antigen and uses thereof
JP5392980B2 (ja) * 2003-03-27 2014-01-22 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 早発型の腎尿細管細胞障害を検出するための方法およびキット
WO2005107793A2 (en) 2004-05-06 2005-11-17 The Trustees Of Columbia University Ngal for reduction and amelioration of ischemic and nephrotoxic injuries
US20050272101A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-08 Prasad Devarajan Method for the early detection of renal injury
RU2283666C9 (ru) * 2004-05-14 2007-03-10 Бизяев Алексей Вячеславович Средство для активации восстановления структуры и функции поврежденных тканей и органов
US20060003345A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 Pfizer Inc RNA bioassay
PL1831699T3 (pl) * 2004-12-20 2010-04-30 Antibodyshop As Oznaczanie lipokaliny neutrofilowej związanej z żelatynazą (NGAL) jako markera diagnostycznego dla zaburzeń nerek
JP2008531719A (ja) 2005-03-02 2008-08-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｔｈ２介在性状態の治療のためのＫＩＭ−１抗体
US20070037232A1 (en) * 2005-03-31 2007-02-15 Barasch Jonathan M Detection of NGAL in chronic renal disease
US20080090304A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Barasch Jonathan Matthew Diagnosis and monitoring of chronic renal disease using ngal
EP2548583A3 (en) 2005-11-10 2013-02-27 Curagen Corporation Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen
US20090197280A1 (en) 2006-05-30 2009-08-06 Kristian Bangert Methods and Devices for Rapid Assessment of Severity of Injury
EP2064553B2 (en) * 2006-08-07 2023-06-07 Antibodyshop A/S Diagnostic test to exclude significant renal injury
EP2137538B1 (en) * 2007-03-21 2014-04-09 Bioporto Diagnostics A/s Diagnostic test for renal injury
US8846036B2 (en) 2007-10-19 2014-09-30 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian NGAL and uses thereof
US20090297479A1 (en) * 2008-03-28 2009-12-03 Kiyoshi Ariizumi Dc-hil conjugates for treatment of t-cell disorders
NZ591437A (en) * 2008-08-28 2013-07-26 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CN105021826A (zh) * 2008-08-29 2015-11-04 阿斯图特医药公司 用于诊断和预后肾损伤和肾衰竭的方法和组合物
NZ592365A (en) * 2008-10-21 2014-08-29 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP3246707B1 (en) 2008-10-21 2020-09-30 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
NZ592488A (en) 2008-11-10 2012-10-26 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
NZ604873A (en) * 2008-11-22 2014-05-30 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CN102300875B (zh) 2009-01-28 2014-07-16 财团法人工业技术研究院 肾病相关的生物标记
US9229010B2 (en) 2009-02-06 2016-01-05 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2011017614A1 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
MX336280B (es) 2009-08-07 2016-01-13 Astute Medical Inc Metodos y composiciones para diagnosticos y pronosticos de lesion renal y falla renal.
CA2779902A1 (en) 2009-11-07 2011-05-12 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
ES2592386T3 (es) 2009-12-20 2016-11-29 Astute Medical, Inc. Métodos y composiciones para el diagnóstico y pronóstico de lesión renal e insuficiencia renal
PT2666872T (pt) 2010-02-05 2016-07-08 Astute Medical Inc Processos e composições para o diagnóstico e o prognóstico de lesões renais e de insuficiência renal
US9029093B2 (en) 2010-02-26 2015-05-12 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2011149962A1 (en) 2010-05-24 2011-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant ngal proteins and uses thereof
NZ605698A (en) 2010-06-23 2015-03-27 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
NZ605561A (en) 2010-06-23 2015-03-27 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2672980B1 (en) * 2011-02-09 2017-12-06 Lavivo AB Synbiotic compositions for restoration and reconstitution of gut microbiota
ES2933570T3 (es) 2011-12-08 2023-02-10 Astute Medical Inc Métodos y composiciones para el diagnóstico y el pronóstico de una lesión renal y de una insuficiencia renal
EP2925337B1 (en) 2012-11-21 2019-07-03 The Trustees of Columbia University in the City of New York Mutant ngal proteins and uses thereof
EP3734280B8 (en) 2013-01-17 2022-08-24 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US10420337B2 (en) * 2013-03-15 2019-09-24 Lifeline Scientific, Inc. Transporter with a glucose sensor for determining viability of an organ or tissue
US10265424B2 (en) * 2014-03-04 2019-04-23 Trust-Biosonics, Inc. Molecular imaging contrast agents and uses thereof
AU2017277305A1 (en) 2016-06-06 2018-12-20 Astute Medical, Inc. Management of acute kidney injury using insulin-like growth factor-binding protein 7 and tissue inhibitor of metalloproteinase 2

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2003A (en) * 1841-03-12 Improvement in horizontal windivhlls
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB9122820D0 (en) * 1991-10-28 1991-12-11 Wellcome Found Stabilised antibodies
WO1993022332A2 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
CA2166313A1 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 John N. Simons Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
US5622861A (en) * 1994-08-05 1997-04-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA encoding hepatitis A virus receptor
AU700913B2 (en) * 1994-08-18 1999-01-14 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Unique associated kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof
US6069230A (en) * 1994-11-10 2000-05-30 Promega Corporation High level expression and facile purification of proteins, peptides and conjugates for immunization, purification and detection applications
US6066322A (en) * 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
EA004402B1 (ru) * 1996-05-24 2004-04-29 Байоджен, Инк. Модуляторы регенерации тканей
US7179901B2 (en) * 2000-06-16 2007-02-20 Biogen Idec Ma Inc. Renal regulatory elements and methods of use thereof
ATE382060T1 (de) * 2001-06-01 2008-01-15 Biogen Idec Inc Moleküle und verfahren zur inhibierung der freisetzung von kim-1
US7838220B2 (en) * 2001-06-29 2010-11-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes associated with immune disease
CA2452196A1 (en) * 2001-06-29 2003-01-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes and methods of use thereof
US7215871B2 (en) * 2001-07-27 2007-05-08 Thomson Licensing Changing a playback speed for video presentation recorded in a field structure format
US7687454B2 (en) * 2001-12-03 2010-03-30 The University Of British Columbia Effectors of innate immunity determination
EP4091631A1 (en) * 2002-01-30 2022-11-23 The Brigham and Women's Hospital, Inc. A tim-3 binding molecule for use in the treatment of a disease
WO2003080856A2 (en) * 2002-03-19 2003-10-02 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
EP1585546B1 (en) * 2002-12-30 2008-08-06 Biogen Idec MA Inc. Kim-1 antagonists and use to modulate immune system
TW200539890A (en) * 2004-03-12 2005-12-16 Brigham & Womens Hospital Methods of modulating immune responses by modulating tim-1, tim-2 and tim-4 function
WO2005097211A2 (en) * 2004-03-24 2005-10-20 Telos Pharmaceuticals, Inc. Compositions as adjuvants to improve immune responses to vaccines and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
NO985427L (no) 1999-01-25
IL127162A (en) 2007-07-24
CA2257851C (en) 2011-11-15
JP2009039111A (ja) 2009-02-26
NZ336467A (en) 2000-10-27
JP4316640B2 (ja) 2009-08-19
JP2008067701A (ja) 2008-03-27
TR199802421T2 (xx) 1999-02-22
CZ381398A3 (cs) 1999-05-12
CA2257851A1 (en) 1997-11-27
CN1223685A (zh) 1999-07-21
EP0907735A1 (en) 1999-04-14
US20060286031A1 (en) 2006-12-21
HUP9902770A2 (hu) 1999-12-28
ATE318903T1 (de) 2006-03-15
NO985427D0 (no) 1998-11-20
BG102967A (bg) 2000-05-31
BG64678B1 (bg) 2005-11-30
PL188826B1 (pl) 2005-04-29
SI0907735T2 (sl) 2010-01-29
AU3567697A (en) 1997-12-09
EA199801044A1 (ru) 1999-04-29
HK1021746A1 (en) 2000-06-30
EE9800409A (et) 1999-06-15
US20050089868A1 (en) 2005-04-28
IS2636B (is) 2010-06-15
DK0907735T5 (da) 2010-06-14
US6664385B1 (en) 2003-12-16
NO327597B1 (no) 2009-08-31
BR9709115A (pt) 1999-08-03
PT907735E (pt) 2006-06-30
PL330313A1 (en) 1999-05-10
SI0907735T1 (sl) 2006-08-31
EP0907735B9 (en) 2010-05-19
SK160998A3 (en) 1999-07-12
EP0907735B1 (en) 2006-03-01
HU226205B1 (en) 2008-06-30
EA004402B1 (ru) 2004-04-29
EP1655367A1 (en) 2006-05-10
EP0907735B2 (en) 2009-10-07
HUP9902770A3 (en) 2001-09-28
SK285461B6 (sk) 2007-02-01
EE04817B1 (et) 2007-04-16
DK0907735T3 (da) 2006-06-26
US20070141590A1 (en) 2007-06-21
IL127162A0 (en) 1999-09-22
ES2258793T3 (es) 2006-09-01
DE69735364D1 (de) 2006-04-27
NO20090945L (no) 1999-01-25
IS4902A (is) 1998-11-20
DK0907735T4 (da) 2009-12-21
AU712289B2 (en) 1999-11-04
ES2258793T5 (es) 2010-01-25
JP4602482B2 (ja) 2010-12-22
CN1147584C (zh) 2004-04-28
DE69735364T3 (de) 2010-05-06
WO1997044460A1 (en) 1997-11-27
JP2001505761A (ja) 2001-05-08
DE69735364T2 (de) 2006-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ295936B6 (cs) Izolovaný polypeptid KIM, modulátor tkáňové regenerace, a nukleová kyselina, která ho kóduje, způsob přípravy polypeptidu a farmaceutická kompozice obsahující polypeptid
KR100587556B1 (ko) 신경 및 신장 증식을 자극하기 위한 ＲＥＴ리간드（ＲｅｔＬ)
US6861509B1 (en) Antibodies to Ret and RetL3
WO2001016169A2 (en) RET LIGAND 5 (Retl5) FROM HUMAN AND MOUSE
KR100498530B1 (ko) 조직재생조절물질
KR100554901B1 (ko) 신경및신장증식을자극하기위한RET리간드(RetL)
MXPA98009812A (en) Modulators of the regeneration of the tej
CA2496906A1 (en) Ret ligand (retl) for stimulating neural and renal growth
PL191248B1 (pl) Izolowane kwasy nukleinowe, wektor, komórka gospodarza, (54) sposób wytwarzania polipeptydu, polipeptyd, izolowane przeciwciało monoklonalne, kompozycja, białko fuzyjne

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20170523