SK285461B6 - Izolovaný polypeptid KIM, modulátor tkanivovej regenerácie a nukleová kyselina, ktorá ho kóduje, spôsob prípravy polypeptidu a farmaceutická kompozícia obsahujúca polypeptid - Google Patents

Izolovaný polypeptid KIM, modulátor tkanivovej regenerácie a nukleová kyselina, ktorá ho kóduje, spôsob prípravy polypeptidu a farmaceutická kompozícia obsahujúca polypeptid Download PDF

Info

Publication number
SK285461B6
SK285461B6 SK1609-98A SK160998A SK285461B6 SK 285461 B6 SK285461 B6 SK 285461B6 SK 160998 A SK160998 A SK 160998A SK 285461 B6 SK285461 B6 SK 285461B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
kim
seq
thr
protein
antibody
Prior art date
Application number
SK1609-98A
Other languages
English (en)
Other versions
SK160998A3 (en
Inventor
Michele Sanicola-Nadel
Joseph V. Bonventre
Catherine A. Hession
Takaharu Ichimura
Henry Wei
Richard L. Cate
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
The General Hospital Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26690881&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK285461(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Ma Inc., The General Hospital Corporation filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of SK160998A3 publication Critical patent/SK160998A3/sk
Publication of SK285461B6 publication Critical patent/SK285461B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

Sú opísané proteíny KIM - modulátory tkanivovej regenerácie, ktorých koncentrácia vzrastá v poranených alebo regenerujúcich tkanivách obličiek, ako aj DNA kódujúca tieto proteíny. Tiež je opísaná farmaceutická kompozícia.

Description

Vynález opisuje proteíny, ktorých koncentrácia vzrastá v poranených alebo regenerujúcich tkanivách, ako aj DNA kódujúcu tieto proteíny. Vynález ďalej opisuje farmaceutické kompozície a spôsoby liečby využívajúce tieto proteíny.
Doterajší stav techniky
Počas vývoja orgánov a počas regenerácie tkanív po poranení prebieha dynamické formovanie tkanív. Pri štúdiu tohto procesu sme sa zamerali na model poškodenia obličiek spôsobeného ischemickou reperfúznou traumou (poškodenie vznikajúce obnovením krvného obehu po ischemickom stave).
Obličky sú schopné regenerovať sa po poškodení proximálneho tubulárneho epitelu pomocou komplexnej série udalostí zahrnujúcej programovanú smrť bunky, proliferáciu prežívajúcich buniek proximálneho tubulárneho epitelu na odkrytej bazálnej membráne, diferenciáciu regeneratívneho epitelu na úplne funkčné bunky proximálneho tubulámeho epitelu (pozri Wallin a kol., Lab. Invest. 66: strana 474 až 484, 1992; Witzgall a kol., Mole. Celí. Biol. 13: strana 1933 až 1942, 1994; lchimura a kol., Am. J. Physiol. 269, strana 653 až 662, 1995; Thadhani a kol., N. Engl. J. Med. 334: strana 1448 až 1460, 1996). Na tomto regeneračnom procese sa zúčastňujú rastové faktory, ako sú IGF, EGF a HGF, ako aj adhezívne molekuly endotelových buniek ICAM-1. Napriek uvedenému, mechanizmus, ktorým sa bunky tubulárneho epitelu obnovujú, nie je doteraz známy.
Na štúdium a identifikáciu molekúl podieľajúcich sa na priebehu traumy a následnej regenerácii tubulárneho epitelu sme analyzovali rozdiel v populáciách mRNA medzi poranenými respektíve regenerujúcimi a normálnymi obličkami pomocou diferenčnej analýzy mRNA (RDA, representational difference analysis). RDA je spôsob založený na polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) a opakovanom odrátavaní a amplifikácii ostávajúcich fragmentov, čím sa môžu získať cDNA fragmenty špecifické pre určité cieľové tkanivo alebo bunku (pozri Hubank a Schutz, Nucl. Acids Res. 22: strana 5640 až 5648, 1994).
Podstata vynálezu
Vynález najmä opisuje molekuly spojené s poškodením obličiek (Kidney injury related molecules, ďalej sú nazývané molekuly „KIM”), ktorých koncentrácia v renálnom (obličkovom) tkanive sa po poškodení obličiek zvyšuje. Proteíny a peptidy KIM podľa vynálezu, ako aj ich deriváty, sú vhodné na rôzne terapeutické použitie.
Vynález opisuje prečistenú a izolovanú molekulu DNA s nukleotidovou sekvenciou SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 alebo SEQ ID NO: 6. Vynález ďalej opisuje komplementárne vlákna k týmto sekvenciám, molekuly schopné za stringentných podmienok hybridizovať s týmito DNA molekulami a DNA molekuly, ktoré sú v dôsledku degenerácie genetického kódu podobné uvedeným. Tieto molekuly DNA môžu byť rekombinantné a môžu byť funkčne spojené so sekvenciou kontrolujúcou expresiu.
Vynález ďalej opisuje vektor obsahujúci prečistenú a izolovanú molekulu DNA s nukleotidovou sekvenciou SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 alebo SEQ ID NO: 6 alebo ľubovoľnú definovanú DNA molekulu. Tento vektor môže byť biologicky funkčný plazmid alebo vírusový DNA vektor. Jedno z uskutočnení vynálezu opisuje prokaryotickú alebo eukaryotickú hostiteľskú bunku stabilne transformovanú alebo transfekovanú s vektorom obsahujúcim molekulu DNA podľa sekvencie SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 alebo SEQ ID NO: 6. V ďalšom uskutočnení vynálezu je opisovaný spôsob prípravy polypeptidu KIM kódovaného opísanou molekulou DNA; pričom tento spôsob zahrnuje kultiváciu prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek transformovaných alebo transfekovaných molekulou DNA podľa vynálezu, pri kultivačných podmienkach vhodných na expresiu tohto peptidu a následnú izoláciu produktu tejto expresie.
Vynález opisuje izolovaný a prečistený ľudský protein KIM v postate neobsahujúci ďalšie ľudské proteíny, ako aj spôsob produkcie polypeptidového produktu, ktorý má časť alebo celú primárnu štruktúrnu konformáciu s biologickou aktivitou proteínu KIM.
Proteíny KIM podľa vynálezu môžu mať aminokyselinové sekvencie obsahujúce sekvenciu SEQ ID NO: 3, 5 alebo 7 alebo môžu byť variantmi sekvencií SEQ ID NO: 3, 5 alebo 7, alebo môže ísť o izolované a prečistené proteínové produkty kódované DNA podľa sekvencií SEQ ID NO: 1, 2, 4 alebo 6. Tieto proteíny sa môžu pripraviť v podstate bez všetkých ďalších ľudských proteínov. Vynález ďalej opisuje varianty týchto proteínov, ako sú napríklad rozpustné varianty alebo fúzne proteíny. Fúzne proteíny KIM podľa vynálezu môžu obsahovať imunoglobulín, toxín, zobraziteľnú kontrastnú látku vhodnú na detekciu alebo rádionuklid.
Vynález ďalej opisuje špecifickú monoklonálnu protilátku proti opísaným proteínom KIM. Anti-KIM protilátka sa môže spojiť s toxínom, so zobraziteľnou kontrastnou látkou vhodnou na detekciu alebo s rádionuklidom. Vynález tiež opisuje hybridom produkujúci takúto špecifickú protilátku.
Vynález rovnako zahrnuje farmaceutické kompozície. Farmaceutické kompozície podľa vynálezu môžu obsahovať terapeuticky účinné množstvo proteínu KIM alebo protilátky proti proteínu KIM podľa vynálezu spolu s farmakologicky prijateľným nosičom.
Vynález tiež opisuje diagnostické metódy na odhad rozsahu a priebehu poškodenia obličiek pomocou merania koncentrácie proteínov KIM v moči, sére alebo močovom sedimente pacientov s poškodením obličiek alebo s rizikom takéhoto ochorenia.
Spôsoby liečby podľa vynálezu zahrnujú ošetrenie pacientov terapeuticky účinným množstvom proteínov KIM, variantov proteínov KIM, analógov proteínov KIM, fuznych proteínov KIM, agonistov proteínov KIM a protilátok proti proteínom KIM alebo ligandom proteínov KIM. Ďalšie terapeutické zlúčeniny podľa vynálezu zahrnujú ligandy proteínov KIM, protilátky proti proteínom KIM a fúzne proteíny ligandov proteínov KIM. Tieto zlúčeniny sú významné pre spôsoby liečby stimulujúce alebo inhibujúce bunkové odpovede závislé od funkcií proteínov KIM.
Vynález ďalej opisuje spôsoby inhibície rastu nádorových buniek exprimujúcich proteíny KIM pomocou kontaktu nádorovej bunky s fúznym proteínom KIM-Iigandu a toxínu alebo rádionuklidu, alebo pomocou kontaktu s anti-KIM protilátkou konjugovanou s toxínom alebo s rádionuklidom. Podobným spôsobom sa môže inhibovať aj rast nádorových buniek, ktoré exprimujú ligand proteínu KIM.
V tomto prípade sa výhodne využije kontakt nádorovej bunky s fúznym proteínom pozostávajúcim z proteínu KIM a toxínu alebo rádionuklidu, alebo kontaktu protilátky proti ligandu proteínu KIM konjugované s toxínom alebo rádionuklidom.
Vynález tiež opisuje spôsoby génovej terapie. Tieto spôsoby zahrnujú ošetrenie liečeného organizmu s poruchou funkcie obličiek, spôsob povzbudenia rastu nového obličkového tkaniva a spôsob podporujúci prežitie poškodeného tkaniva, pričom tieto spôsoby zahrnujú podanie vektora, ktorý obsahuje DNA s nukleotidovou sekvenciou podľa sekvencie SEQ ID NO: 1, 2, 4 alebo 6, liečenému organizmu.
Zlúčeniny podľa vynálezu sú ďalej užitočné na štúdium a zobrazovanie tkaniva a to tak in vitro ako aj in vivo. Jeden takýto spôsob zahrnuje špecifické nasmerovanie zobraziteľnej kontrastnej zlúčeniny slúžiacej na detekciu k bunkám exprimujúcim proteín podľa sekvencie SEQ ID NO: 3, 5 alebo 7, pričom dochádza ku kontaktu bunky s monoklonálnou protilátkou podľa vynálezu naviazaný na skupinu slúžiacu na vizuálnu detekciu. Tento systém možno použiť aj na spôsoby detekcie in vivo, pričom uvedené bunky sú v tele liečeného organizmu a tomu je potom podaný proteín alebo monoklonálna protilátka podľa vynálezu.
Vynález ďalej zahrnuje spôsoby diagnózy, ako je spôsob stanovenia poškodenia alebo regenerácie buniek obličiek pomocou porovnania úrovne expresie jedného z polypeptidov so sekvenciou podľa sekvencie SEQ ID NO: 1,2, 4 alebo 6 v obličkových bunkách liečeného organizmu s úrovňou expresie týchto polypeptidov v kontrolných obličkových bunkách. Ďalší spôsob podľa vynálezu zahrnuje identifikáciu zvýšenej koncentrácie (upregulation) polypeptidov podľa sekvencií SEQ ID NO: 1, 2, 4 alebo 6 v bunkách, pričom tento spôsob zahrnuje kontakt bunky s antisense hybridizačnou sondou a meranie signálu po hybridizácii s RNA v bunke.
V ďalšom uskutočnení zahrnujú diagnostické spôsoby podľa vynálezu odhad prítomnosti alebo koncentrácie molekúl podľa vynálezu v moči, sére či inej telesnej tekutine, alebo v sedimente moču, alebo vzorkách tkaniva. Namerané koncentrácie molekúl spojených s poranením obličiek možno korelovať s prítomnosťou, rozsahom alebo priebehom patologického procesu. Tento vzťah sa môže využiť na vyhodnotenie účinnosti terapie.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: na obrázku je znázornená nukleotidová sekvencia potkanieho cDNA klonu 3-2 s otvoreným čítacím rámcom proteínu v nukleotidoch 615 až 1535.
Obrázok 2: na obrázku je znázornená nukleotidová sekvencia potkanieho cDNA klonu 1-7 s vyznačeným pravdepodobným čítacím rámcom proteínu v nukleotidoch 154 až 1065.
Obrázok 3: na obrázku je znázornená nukleotidová sekvencia potkanieho cDNA klonu 4-7 s vyznačeným pravdepodobným čítacím rámcom proteínu v nukleotidoch 107 až 1822.
Obrázok 4: na obrázku je znázornená nukleotidová sekvencia a odvodená proteínová sekvencia ľudského cDNA klonu HI3-1O-85, s vyznačeným pravdepodobným čítacím rámcom proteínu v nukleotidoch 1 až 1002. Na horných riadkoch je vyznačená cDNA sekvencia (SEQ ID
NO: 6) a na dolných riadkoch je odvodená aminokyselinová sekvencia (SEQ ID NO: 7).
Obrázok 5: je porovnanie nukleotidových sekvencií ľudského klonu HI3-10-85 s potkaním klonom 3-2 uskutočnené programom BESTFIT.
Gény kódujúce proteíny KIM sa identifikovali tak, že sa analyzovali rozdiely v expresii mRNA medzi regenerujúcim a normálnym obličkovým tkanivom. Na to sa použila reprezentatívna diferenčná analýza (RDA). RDA je metóda založená na PCR, ktorá slúži na zachytenie tkanivovej alebo bunkovej špecifickej cDNA pomocou opakovaného odrátavania a amplifikácie fragmentov. cDNA reprezentujúca mRNA z obličiek dospelého potkana 48 hodín po ischemickom stave sa nechá hybridizovať s normálnou kontrolou obličky dospelého potkana (podobným spôsobom operované, ale bez navodenia ischemického stavu). Tým sa odstránia sekvencie, ktoré sú bežné tak pre postischemickú ako aj pre normálnu obličku a zostanú iba sekvencie, ktoré sú významnou mierou exprimované iba v zranenom obličkovom tkanive. Tieto gény kódujú proteíny, ktoré môžu byť užitočné na terapiu poškodenia obličiek, alebo sa môžu podieľať na procese poranenia a regenerácie obličkového tkaniva. Týmto spôsobom sa získalo niekoľko klonov, ktoré sa sekvenovali a charakterizovali. Klony sa potom skúmali a testovala sa ich expresia počas regenerácie obličky, vývoja a diferenciácie tkaniva pomocou northem prenosu a in situ RNA hybridizácie.
Opis sekvencií
Nukleotidy a aminokyselinové sekvencie uvedené v opise sa označili nasledujúcimi identifikačnými číslami: Sekvencia SEQ ID NO: 1 - nukleotidová sekvencia potkanieho inzertu 3-2.
Sekvencia SEQ ID NO: 2 - nukleotidová sekvencia potkanieho cDNA inzertu 1 -7.
Sekvencia SEQ ID NO: 3 - aminokyselinová sekvencia potkanieho proteínu KIM-1, kódovaná potkaními cDNA 3-2 a 1-7.
Sekvencia SEQ ID NO: 4 - nukleotidová sekvencia potkanieho cDNA inzertu 4-7.
Sekvencia SEQ ID NO: 5 - aminokyselinová sekvencia kódovaná cDNA inzertom 4-7.
Sekvencia SEQ ID NO: 6 - nukleotidová sekvencia ľudskej cDNA klonu H13-10-85.
Sekvencia SEQ ID NO: Ί - aminokyselinová sekvencia kódovaná ľudským cDNA klonom Hl 3-10-85.
Použité termíny
Termínom „proteín KIM” alebo „KIM” sa rozumie proteín kódovaný mRNA, ktorého množstvo je selektívne zvýšené následne po poranení obličiek. Jedna skupina sledovaných proteínov KIM zahrnuje tie proteíny, ktoré sú kódované mRNA, ktorej množstvo sa selektívne zvyšuje počas jedného týždňa po zásahu, ktorý spôsobí poranenie tkaniva obličiek. Zvýšenie množstva tejto mRNA sa môže pozorovať napríklad 10 hodín, 24 hodín, 48 hodín či 96 hodín po takomto zásahu. K zásahom patria také, ktoré spôsobujú ischémiu, alebo toxický, alebo iný typ poranenia.
„Agonista proteínu KIM” je taká molekula, ktorá je schopná špecificky spustiť bunkové odpovede, ktoré sú pri normálnych podmienkach spúšťané interakciou proteínu KIM s KIM ligandom. Agonista proteínu KIM môže byť buď variant proteínu KIM, alebo špecifická protilátka proti proteínu KIM, alebo rozpustná forma KIM ligandu.
„Antagonista proteínu KIM” sa rozumie molekula, ktorá sa môže špecificky spájať s ligandom proteínu KIM alebo s proteínom KIM a tak zablokovať alebo inak inhibovať väzbu proteínu KIM ku KIM ligandu. Naviazanie antagonistu blokuje alebo inhibuje bunkovú odpoveď, ktoré sa spustili väzbou KIM ligandu k proteínu KIM alebo k agonistovi proteínu KIM. Príklady antagonistov proteínu KIM zahrnujú jednak určité varianty proteínu KIM a ďalej fúzne proteíny s proteínom KIM a špecifické protilátky proti ligandu KIM či proteínu KIM.
„Ligand proteínu KIM” je akákoľvek molekula, ktorá sa nekovalentne a špecificky viaže k proteínu KIM. Takýmto ligandom môže byť proteín, peptid, steroid, protilátka, derivát aminokyseliny či iný typ molekuly. Môže ísť o prirodzene sa vyskytujúcu, rekombinantne produkovanú, či inak syntetizovanú molekulu. Ligand proteínu KIM môže byť v akejkoľvek forme, t. j. môže byť rozpustný, membránovo viazaný, môže byť súčasťou fúznej konštrukcie s imunoglobulínom, s mastnou kyselinou alebo s inou funkčnou skupinou. Ligand proteínu KIM môže byť integrín. Ligand proteínu KIM, ktorý je viazaný v membráne, môže fungovať ako receptor. Jeho prostredníctvom prebehne po naviazaní či pripojení proteínu KIM spustenie bunkovej odpovede. V prípade niektorých interakcií sa môže proteín KIM viazať k viac ako jednému ligandu KIM, alebo sa môže viazať k ligandu KIM ako súčasť komplexu, v ktorom je jedna alebo viac ďalších molekúl, prípadne kofaktorov, V prípade, že sú tak proteín, ako aj ligand proteínu KIM viazané k bunkovej membráne, môže sa proteín KIM viazať a reagovať s ligandom proteínu KIM, ktorý je viazaný buď k membráne rovnakej bunky, alebo k membráne inej bunky. Ak však dôjde k väzbe proteínu KIM a jeho ligandu, ktoré sú viazané k dvom rôznym bunkám, môžu byť tieto bunky rovnakého alebo odlišného typu a pôvodu. Tieto bunky sa môžu nachádzať v iných metabolických podmienkach, môžu sa líšiť fenotypom a ďalej typom a stupňom bunkovej odpovede na určitý stimul (napríklad rastom, diferenciáciou či apoptózou). „Väzba proteínu KIM” sa rozumie kontakt a väzba proteínu KIM ku KIM ligandu.
„Porovnávanie sekvencií” sa rozumie také umiestnenie jednej buď aminokyselinovej, alebo nukleotidovej sekvencie k inej sekvencií, ktoré umožni porovnávanie príslušných častí daných sekvencií. Príklad metódy na porovnanie sekvencií uvádza Needleman a kol. (J. Mol. Biol. 48: strana 443 až 453, 1970). Porovnávanie sekvencií môže byť jednoducho uskutočňované pomocou počítačových programov, ku ktorým patrí napríklad program Align (DNAstar, Inc.). Ako je známe odborníkom, homologické a funkčne ekvivalentné sekvencie zahrnujú funkčne ekvivalentné usporiadanie cysteínových zvyškov vnútri konzervované cysteínové kostry, vrátane inzercií a delécií aminokyselín, ktoré menia lineárne usporiadanie týchto cysteínov, fyzicky však nenarušujú ich vzťah v sekundárnej a terciámej štruktúre (folded structure) proteínu. Interné delécie a inzercie aminokyselín v navrhovanej sekvencií sú teda ignorované kvôli stanoveniu celkovej homológie či identity v aminokyselinovej sekvencií medzi navrhovanou a referenčnou sekvenciou. Jednou z charakteristík, ktorá jc často používaná pri určovaní homológie dvoch proteínov, je podobnosť v počte a umiestnení cysteínových zvyškov v týchto proteínoch.
„Antisense DNA” sa vzťahuje na sekvenciu chromozómovej DNA, ktorá je prekladaná.
„Antisense DNA sonda” je taká sonda, ktorá zahrnuje aspoň časť antisense DNA k časti nukleových kyselín, ktoré sú študované.
„Klonovaním” sa rozumie použitie in vitro rekombinantných techník, aby sa inzertoval konkrétny gén či iná DNA sekvencia do molekuly vektora. Na úspešné klonovanie požadovaného génu je treba používať metódy zaisťujúce tvorbu DNA fragmentov, pripojovanie fragmentov do vektorovej molekuly, vnesenie zloženej DNA molekuly do hostiteľskej bunky, v ktorej sa môže táto molekula replikovať a selekciu klonov, ktoré majú požadovaný gén, medzi ostatnými recipientnými hostiteľskými bunkami.
„cDNA” sa rozumie komplementárny reťazec DNA k určitej RNA alebo komplementárny reťazec k tomuto komplementárnemu reťazcu. Komplementárna DNA sa tvorí z RNA templátu pôsobením RNA-závislej DNA polymerázy (reverznej transkriptázy). „cDNA kloň” jc teda dvojreťazcová DNA sekvencia, ktorá je komplementárna k požadovanej molekule RNA, nesená klonovacím vektorom.
„cDNA knižnica” sa rozumie súbor rekombinantných molekúl DNA, ktorý obsahuje cDNA inzerty. Tieto inzerty dohromady reprezentujú mRNA molekuly prítomné v celom organizme či tkanive v závislosti od zdroja RNA templátov. Takáto cDNA knižnica sa môže pripraviť metódami, ktoré sú opísané napríklad v: Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Všeobecne sa RNA najskôr izoluje z buniek organizmu, z ktorého genómu sa má klonovať určitý gén. Vo vynáleze sa kladie dôraz predovšetkým na cicavčie, osobitne potom ľudské bunkové línie. RNA sa môže prípadne izolovať z nádorových buniek, ktoré pochádzajú zo živočíšneho, najlepšie však ľudského nádoru. Knižnica sa teda môže pripraviť napríklad z ľudského nádoru nadobličiek, použiť sa však môže akýkoľvek nádor.
Termín „polymorfizmus DNA” v tomto vynáleze označuje taký stav, keď sa môžu v určitom mieste DNA vyskytovať dve alebo viac rôznych nukleotidových sekvencií.
„Expresný vektor” sa rozumie taký vektor, ktorý jc schopný exprimovať DNA sekvencie, ktoré obsahuje. To znamená, že kódujúce sekvencie v tomto vektore sú funkčne spojené so sekvenciami, ktoré sú schopné spustiť ich expresiu. Napriek tomu, že to nie explicitne stanovené, predpokladá sa, že tieto expresné vektory musia byť replikovateľné v hostiteľskom organizme, buď ako epizómy, alebo ako integrálna súčasť chromozómovej DNA. Užitočnou, aj keď nie nevyhnutnou súčasťou expresného vektora je sekvencia kódujúca nejaký marker, t. j. taká sekvencia, ktorá kóduje nejaký proteín, ktorý je zodpovedný za určitú fenotypickú vlastnosť buniek (napríklad rezistenciu proti tetracyklínu), vďaka ktorej sa môžu tieto bunky ľahko identifikovať. Sumárne, „expresný vektor” je funkčne definovaný a zahrnuje akúkoľvek DNA sekvenciu, ktorá je schopná spúšťať expresiu prítomného špecifického DNA kódu. V súčasnosti sú takéto vektory často vo forme plazmidov. Preto sa termíny „plazmid” a „expresný vektor” často používajú synonymicky. Vynález tiež opisuje určité ďalšie formy expresných vektorov, ktoré majú rovnakú funkciu a ktoré môžu v budúcnosti vzniknúť a byť uznané odborníkmi.
„Funkčným derivátom” sa rozumejú „fragmenty”, „varianty”, „analógy” alebo „chemické deriváty” určitej molekuly. „Fragmentom” danej molekuly, ako je napríklad ktorýkoľvek z antigénov podľa vynálezu, sa rozumie akákoľvek polypeptidová podskupina tejto molekuly. „Variant” takejto molekuly sa rozumie určitá prirodzene sa vyskytujúca molekula z veľkej časti podobná buď celej molekule, alebo fragmentu tejto molekuly. „Analógom” určitej molekuly sa rozumie prirodzene sa nevyskytujúca sa molekula z veľkej časti podobná buď celej molekule, alebo fragmentu tejto molekuly.
Termín „gén” označuje polynukleotidovú sekvenciu kódujúcu peptid.
Termín „homogénny” v prípade peptidu alebo DNA sekvencie znamená, že primárna molekulová štruktúra (t. j. aminokyselinová alebo nukleotidová sekvencia) väčšiny molekúl prítomných v skúmanej uvažovanej zmesi je identická.
Termín „izolovaný” sa vzťahuje buď na taký proteín, ktorý nie je viazaný k iným proteínom, respektíve proteínom, respektíve génom či iným kontaminujúcim molekulám, v spojení s ktorými sa môže vyskytovať v prírode. Takto izolovaný daný proteín sa v prírode nenachádza.
Termín „purifikačná značka“ označuje akákoľvek funkčná skupina uľahčujúca detekciu. Purifikačnými značkami môžu byť bez akéhokoľvek obmedzenia rádioaktívne izotopy, enzýmy, luminiscenčné látky a farbivá.
Termín „sonda” označuje ligandy známych vlastnosti schopných viazať sa na cieľové antiligandy. V prípade nukleových kyselín sa termín „sonda” používa na označenie takého vlákna nukleovej kyseliny, ktorá má základnú sekvenciu komplementárnu k cieľovému vláknu.
„Rekombinantnými hostiteľskými bunkami” sa rozumejú také bunky, ktoré sa transformovali vektorom skonštruovaným s použitím techník rekombinantnej DNA. Protilátka alebo modifikácia tejto protilátky je produkovaná rekombinantnou hostiteľskou bunkou vďaka tejto transformácii. Bez tejto transformácie by hostiteľská bunka produkovala omnoho menšie alebo najskôr nedetegovateľné množstvo takejto protilátky.
Ako „vysoko čistý” sa označuje akýkoľvek proteín predkladaného vynálezu alebo akýkoľvek gén kódujúci tento proteín, ktorý v podstate nie je kontaminovaný inými proteínmi, respektíve génmi či ďalšími kontaminujúcimi molekulami, v spojení s ktorými sa môže nachádzať v prírode. Takto čistý sa daný proteín prirodzene nenachádza. Molekula je označovaná ako „vysoko podobná” inej molekule vtedy, ak je aminokyselinová sekvencia obidvoch molekúl v zásade rovnaká a ak je biologická aktivita obidvoch molekúl podobná. To znamená, že pokiaľ tieto dve molekuly majú podobné biologické aktivity, sú podľa vynálezu považované za varianty, aj keď jedna z týchto molekúl obsahuje aminokyselinové zvyšky navyše, ktoré sa nenachádzajú v druhej molekule, alebo sekvencia aminokyselín nie je v týchto dvoch molekulách rovnaká. Podľa vynálezu sa molekula označuje ako „chemický derivát” inej molekuly vtedy, ak obsahuje navyše chemické funkčné skupiny, ktoré nie sú prirodzenou súčasťou danej molekuly. Takéto funkčné skupiny môžu zlepšovať rozpustnosť danej molekuly, jej absorpciu, zvyšovať jej biologický polčas života atď. Funkčné skupiny schopné zaistiť takéto vlastnosti sú uvedené napríklad v Remington’s Pharmaceuticals Sciences, 16. Vydanie, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).
„Vektorom” sa rozumie molekula DNA odvodená z plazmidu alebo bakteriofága, do ktorých sa môžu vložiť alebo klonovať fragmenty DNA. Vektor obsahuje jedno alebo viac jedinečných reštrikčných miest a mal by byť schopný autonómne sa replikovať v definovaných hostiteľských bunkách alebo nosnom organizme, takže klonovaná sekvencia je reprodukovateľná.
Zlúčeniny podľa vynálezu
Vynález opisuje cDNA podľa sekvencií SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 alebo SEQ ID NO: 6, ako aj sekvencie, ktoré obsahujú sekvencie SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 alebo SEQ ID NO: 6 a ďalej všetky deriváty týchto sekvencií. Vynález ďalej opisuje vektory, lipozómy a ďalšie nosné prostriedky, ktoré obsahujú tieto sekvencie, alebo ich deriváty. Vynález ďalej obsahuje aj proteíny, ktoré vznikli transkripciou zo sekvencií SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 6, vrátane a nielen proteínov podľa sekvencie SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 alebo SEQ ID NO: 7, ako aj ich deriváty a varianty.
Vo výhodnom uskutočnení vynález zahrnuje rozpustný variant proteínu KIM, ktorý je obyčajne syntetizovaný ako proteín spojený s membránou (membránový proteín) a ktorého koncentrácia sa po poškodení zvyšuje. V rozpustných variantoch chýba minimálne časť proteínu prechádzajúceho membránou (transmembránová časť) alebo vnútorná membránová časť, ktoré sú súčasťou prirodzene sa vyskytujúceho (natívneho) proteínu KIM. Vynález ďalej opisuje rozpustný variant proteínu KIM, ktorý neobsahuje celú transmembránovú alebo vnútornú membránovú časť natívneho proteínu KIM. Rozpustné varianty môžu ďalej zahrnovať fúznc proteíny, ktoré obsahujú deriváty proteínov KIM, v ktorých sa nenachádza minimálne časť proteínu prechádzajúceho membránou (transmembránová časť) alebo časť pochádzajúca z vnútornej strany membrány, ktorá je súčasťou prirodzene sa vyskytujúceho (natívneho) KIM proteínu. Vynález ďalej opisuje všetky typy KIM fúznych proteínov, osobitne tie, ktoré obsahujú purifikačné značky (kotvy) ako je his-tag, Ig-tag a myc-tag. Tieto fúzne produkty KIM majú črty, ktoré možno výhodne využiť na terapeutické použitie, ako je napríklad predĺžený polčas rozpadu, ktorý sa dokázal pre purifikačnú značku Ig-tag. Vynález tiež zahrnuje fúzne proteíny, ktoré obsahujú časti vybraných oblastí (domén) proteínu KIM.
Varianty sa môžu od prirodzene sa vyskytujúceho proteínu líšiť aminokyselinou sekvenciou alebo vo vlastnostiach, ktoré s aminokyselinovým zložením nesúvisia, alebo v obidvoch. Varianty líšiace sa aminokyselinovým zložením (sekvenciou) sa pripravujú tak, že jedna alebo viac aminokyselín, ktoré sa nachádzajú v prirodzene sa vyskytujúcom proteíne KIM so zámenou aminokyselín, ktoré sa nachádzajú v prirodzene vyskytujúcom sa proteíne KIM so zámenou za inou prirodzene sa vyskytujúcej sa aminokyseliny, za derivát tejto aminokyseliny, alebo za prirodzene sa nevyskytujúcu sa aminokyselinu.
Mimoriadne výhodne používané varianty obsahujú prirodzene sa vyskytujúci proteín KIM, alebo biologicky aktívnu časť tohto prirodzene sa vyskytujúceho sa KIM proteínu, ktorých sekvencia sa líši od prirodzene sa vyskytujúcich sekvencií jednou alebo viac konzervatívnymi substitúciami aminokyselín, pre ktoré je typické, že majú minimálny vplyv na sekundárnu štruktúru a hydrofóbne správanie proteínu alebo peptidu. Varianty môžu mať tiež sekvencie, ktoré sa líšia jednou alebo viacerými nekonzervatívnymi substitúciami aminokyselín, ktorých vynechaním (deléciami) alebo naopak vložením (inzerciami), ktoré sa nemenia biologickou aktivitou proteínu KIM. Konzervatívna substitúcia obyčajne zahrnuje substitúciu jednej aminokyseliny za inú, ktorá má ale podobné vlastnosti. Sú to substitúcie v rámci nasledujúcich skupín (oddelených medzerníkom): valín, glycin; glycín, alanin; valín izoleucín; kyselina asparágová, kyselina glutámová; asparagín, glutanrin, serín, treonín; lyzín, arginín; a fenylalanín s tyrozinom.
K nepolámym (hydrofóbnym) aminokyselinám patria alanin, leucín, izoleucín, valín, prolín, fenylalanín, trypto fán a metionín. K polárnym neutrálne nabitým aminokyselinám možno zaradiť glycín, serín , treonín, cysteín, tyrozín, asparagín a glutamín. Pozitívne nabité (bázické) sú aminokyseliny arginín, lyzín a histidín. Negatívne nabité (kyslé) aminokyseliny zahrnujú kyselinu asparágovú a glutámovú.
Ďalšie konzervatívne substitúcie sa môžu navrhnúť podľa nasledovnej tabuľky a ešte ďalšie sú opísané Dayhoffom v Atlase proteínových sekvencií a štruktúry (Atlas of Proteín Sequence and Structure) (1988).
Tabuľka 1: Konzervatívne náhrady aminokyselín
Aminokyselinu kód možno nahradiť ľubovoľnou z:
Alanin A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginín R D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Om, D-Om
Asparagín A D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselina asparágová D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cysteín C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamín Q D-Gln, AsnD-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kyselina glutámová E D-Glu, D-Asp, Asp. Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycín G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-Ala, Acp
Izoleucín I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucín L D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lyzín K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, DIle, Om, D-Om
Metionín M D-Met, S-Me-Cys, Íle, D-lle, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu
Fenylalanín F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3,4 alebo 5-fenylprolín, Cis 3,4 alebo 5-fenylprolín
Prolín P D-Pro, L-I-tioazolidín-4-karboxylová kyselina, D- alebo L-l- Oxazolidin-4-karboxylová kyselina
Serín S D-Ser, Thr, D-Thr. Allo-Thr, Met, D-Met. Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Treonín T D-Thr, Ser, D-Ser, Allo-Thr, Met, D-Met, Mct(O), D-Mct(O), Val, D-Val
Tyrozin Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valín v D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
Vynález ďalej opisuje varianty proteínu KIM modifikované tak, aby sa zvýšila stabilita peptidu. Takéto varianty môžu obsahovať napríklad vnesenie jednej alebo viacerých peptidových väzieb, ktoré nahradia väzby peptidové v sekvencii peptidu. Ďalej sú tu zahrnuté varianty, ktoré obsahujú iné aminokyselinové zvyšky, ako sú prirodzene sa vyskytujúce L-aminokyseliny, ako sú D-aminokyseliny a prirodzene sa nevyskytujúce alebo syntetické aminokyseliny, ako sú napríklad beta a gama aminokyseliny a cyklické varianty. Vnesenie D-aminokyseliny namiesto L-aminokyseliny do polypeptidu môže zvýšiť jeho rezistenciu proti pôsobeniu proteáz, pozri napr. US patent č. 5,219,990.
Všeobecne povedané, substitúcie, pri ktorých sa dá predpokladať, že vyvolajú zmeny vo funkčných vlastnostiach polypeptidu KIM, sú tie, v ktorých je: (i) hydrofilný zvyšok, to znamená napríklad serín alebo treonín nahradený hydrofóbnym zvyškom, ako sú napríklad leucín, izoleucín, fenylalanín alebo alanin; (ii) cysteínový zvyšok je substituovaný alebo je sám nahradený iným zvyškom; (iii) aminokyselinový zvyšok, ktorý má elektropozitívny bočný reťazec, ako je napríklad lyzín, arginín alebo histidín je substituovaný alebo sám zvyškami nesúcimi elektronegatívny náboj, ako je napríklad kyselina glutámová alebo asparágová, alebo ďalej (iv) aminokyseliny majúce rozmerný bočný reťazec (napríklad fenylalanín) sú substituované, alebo sú samy nahradené aminokyselinami, ktoré tieto objemné bočné reťazce nemajú, ako je napríklad glycín.
Peptidy podľa vynálezu sa môžu modifikovať tiež pomocou ďalších zmien, ako sú inzercie, delécie a substitúcie, a to tak konzervatívne ako aj nekonzervatívne, keď takéto zmeny môžu vytvoriť isté výhody na ich použitie. Skrátené varianty sú uvedené vo vynáleze samostatne.
Ďalším uskutočnením vynálezu sú aj varianty s menej konzervatívnou substitúciou aminokyselín, ktoré môžu tiež poskytnúť deriváty s požadovanými vlastnosťami, napríklad zmenou v náboji, konformácii a ďalších biologických vlastnostiach. Takéto substitúcie zahrnujú napríklad substitúcie hydrofilných zvyškov, substitúciu cysteínu alebo prolínu a ďalší zvyšok, substitúciu zvyšku nesúceho malý bočný reťazec za zvyšok nesúci objemný bočný reťazec, alebo substitúcia zvyšku nesúceho pozitívny celkový náboj za zvyšok s nábojom negatívnym. Ak nie je možné dopredu s určitosťou predpovedať správanie takejto zlúčeniny, je možné pripravený derivát preskúšať spôsobmi, ktoré sú tu opísané, aby sa mohlo s určitosťou povedať, či derivát má alebo nemá požadované vlastnosti.
Vynález opisuje všetky varianty proteínu a peptidu, ktorých aminokyselinová sekvencia má aspoň osemdesiat percentnú homológiu s proteínom KIM. V ešte výhodnejšom usporiadaní je sekvenčná homológia deväťdesiatpercentná, alebo ešte výhodnejšie aspoň deväťdesiat päť percentná. Na určenie sekvenčnej homológie sa používa dĺžka porovnávaných sekvencií, všeobecne najmenej ôsmich aminokyselinových zvyškov, najčastejšie však najmenej dvadsiatich aminokyselinových zvyškov. Varianty zlúčenín podľa vynálezu zahrnujú tiež všetky proteíny, ktoré (1) majú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na štyridsať percent homologická s proteínom KIM podľa vynálezu a ďalej so všetkými zlúčeninami, ktoré (2) môžu byť dané do optimálnej zhody so sekvenciou KIM (ako je vyznačené na obrázku 5 pre ľudský a pre potkaní K1M-1), ktorá má 80 % cysteínových zvyškov v proteíne KIM podľa vynálezu.
Rovnako ako sa môžu nahradiť substituenty hlavného reťazca, môžu sa nahradiť aj funkčné skupiny, ktoré sú na hlavnom reťazci naviazané a to skupinami majúcimi podobné vlastnosti. Tieto substitúcie sú mienené ako konzervatívne, to znamená, že nahradzujúca skupina má približne rovnakú veľkosť, tvar, hydrofóbnosť a náboj ako mala pôvodná skupina. Nesekvenčné modifikácie môžu zahrnovať napríklad in vivo či in vitro chemickú zmenu časti prirodzene sa vyskytujúceho proteínu KIM, ako aj zmeny v acetylácii, metylácii, fosforylácii, karboxylácii alebo glykozylácii.
Vynález ďalej opisuje činidlá, ktoré sa špecificky viažu na daný proteín alebo proteínový fragment (podľa sekvencie SEQ ID NO: 3, 5 alebo 7). Tieto činidlá zahrnujú ligandy a protilátky (vrátane monoklonálnych protilátok, dvojreťazcových protilátok, Fab fragmentov a ďalších, a to tak natívnych, ľudských, humanizovaných, primatizovaných alebo chimémych). Ďalší opis kategórií týchto látok je uvedený v prihláške PCT 95/16709.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava RNA z normálnych a ischemických obličiek dospelých potkanov
Ischemický poškodené potkanie obličky sa pripravia tak, ako opísali Witzgal a kol. (J. Clin. Invest. 93: strana 2157 až 2188, 1994). Stručne možno tento postup opísať nasledovne: renálna artéria a žila z jednej obličky dospelého Sprague-Dawley potkana sa na štyridsať minút uzavrú a potom sa obnoví krvný obeh (reperfúzia). Poškodené obličky sa vyberú z potkana a použijú 24 a 48 hodín po reperfúzii. Obličky z normálnych dospelých Sprague-Dawney potkanov, ktoré sa podrobili kontrolnej operácii bez zastavenia krvného obehu, sa použili ako porovnávací materiál.
Celková RNA sa pripraví z orgánov spôsobom podľa Glisina a kol., pozri Biochemistry 13: strana 2633, 1974. Tento spôsob obsahuje tieto kroky: vybraté orgány sa vložia ihneď do GNC pufra (4M guanidín tiokyanát, 0,5 % SDS, 25mM citrát sodný, 0,1 % Sigma anti-foam - prostriedok proti peneniu) a zhomogenizovali v ľade s polytrónom. Zvyšky buniek sa odstránia nízkootáčkovou centrifugáciou v klinickej odstredivke a supematant sa navrství na roztok skladajúci sa z 5,7M CsCl, 25mM octanu sodného a lmM EDTA. RNA sa vyzráža po prechode cez roztok v priebehu odstreďovania v rotore SW40TÍ pri 22K počas 15 hodín. Ďalej sa RNA resuspenduje v sterilnej vode opracovanej s DEPC, prezráža sa dvakrát pomocou 1/10 objemu 3M octanu sodného a 2,5 objemu etanolu. Poly A+ RNA sa izoluje s použitím purifikačného kitu (Pharmacia, katalógové číslo 27-9258-02).
Príklad 2
Spôsob diferenčnej analýzy (Representational difference analy-sis-RDA) slúžiacej na izoláciu RDA fragmentov 1-7, 3-2 a 4-7
Dvojvláknová cDNA sa syntetizuje z obličkových polyA+ RNA jednak z kontrolných potkanov a tiež z potkanov 48 hodín po ischemickom poškodení obličiek. Používa sa súprava firmy Gibco BRL „Superscript Choice Systém cDNA Synthesis Kit”, katalóg, číslo 18090. Prvé vlákno sa syntetizuje s použitím primeru oligodT a s použitím Superscript II reverznej transkriptázy. Druhé vlákno sa vytvára použitím E. coli DNA polymerázy I a RNázy H, po ktorých nasleduje T4DNA polymeráza. Všetky kroky sa uskutočňujú pri podmienkach odporučených výrobcom -BRL.
RDA analýza sa uskutočnila tak, ako opisuje Hubank a Schatz (Nucleic Acids Research 22: strana 5640 až 48, 1994). Stručne možno postup opísať takto: cDNA izolovaná z obličiek 48 hodín po ischemickom poškodení sa naštiepi reštrikčným enzýmom Dpnll a spojí sa ligáciou s RBgl-12/24 oligonukleotidmi (presné sekvencie pozri literatúra). cDNA spojená ligáciou s linkermi sa amplifikuje pomocou PCR reakcie uskutočnenej s Taq polymerázou firmy Perkin-Elmer v zodpovedajúcom PCR pufri, čím vzniká počiatočná populácia (reprezentácia) fragmentov. Tento PCR produkt sa nazýva „tester amplikon”. Rovnaký postup sa zvolil na vytvorenie „driver amplikonu”, len sa použila cDNA pochádzajúca z obličiek kontrolných potkanov.
Po hybridizácii „tester” a „driver” amplikonu nasledovala selektívna amplifikácia, ktorá sa uskutočnila trikrát. Tak sa vytvoril diferenciálny produkt jeden (DP1), dva (DP2) a tri (DP3). DP1 sa pripravil tak , ako je opísané Hubankom a Schatzom (pozri Nucleic Acids Research 22: strana 5640 až 48, 1994). DP2 a DP3 sa tiež pripravili postupom podľa Hubanka a Schatza, pozri citáciu, jediný rozdiel bol v tom, že sa zmenili pomery medzi množstvom driveru a testeru, a to 5.333 : 1 pre DP2 a 40.000 : 1 alebo 4.000 : 1 pre DP3.
Z DP3 sa naklonovali tri RDA produkty do klonovacieho vektora pUC18: vytvoril sa RDA produkt 1-7 s veľkosťou 252 bp, a to s použitím pomeru driver : tester 40,000 : 1 a produkt RDA 3-2 s veľkosťou 445 bp a produkt 4-7 s veľkosťou 483 bp, ktorý vznikol, ak sa amplifikoval DP3 s použitím pomeru 4,000 : 1. DNA fragmenty sa reklonovali s použitím Pharmacia Sureclone kitu (katalóg, číslo 27-9300-01). Konce PCR fragmentov sa zarovnali Klenowovým fragmentom, čo uľahčilo ligáciu týchto fragmentov na tupo do klonovacieho vektora pUCl 8.
Príklad 3
Northem analýza
PolyA+ RNA (2,5 pg) získaná z obličiek normálnych kontrolných potkanov, ďalej z obličiek dospelých potkanov 48 hodín po ischemickom poškodení a z obličiek 18 denného potkanieho embrya sa clcktroforeticky rozdelili a použili na Northem prenos (pozri Čate, Celí 45, strana 685, 1985) na GeneScreen™ membráne (Dupont).
Ďalej nasledovala hybridizácia v PBS pufri (50mM Tris HC1 pH 7,5, IM NaCl, 0,1 % pyrofosforečnan sodný, 0,2 % PVP, 0,2 % Ficoll, 0,2 % BSA, 1 % SDS), ktorý obsahoval 10 % sulfát dextránu a 100 pg/ml tRNA. Hybridizácia prebiehala pri 65 °C s použitím troch rôznych sond: 1 -7 RDA produktu, 3-2 RDA produktu a 4-7 RDA produktu. Všetky sondy sa rádioaktívne značili pomocou kitu „Pharmacia Ready to Go random priming labelling kit” (katalóg, číslo 27-9521-01). RDA produkty 1-7, 3-2 a 4-7 hybridizovali s mRNA prítomnými vo všetkých troch vzorcoch, ale najsilnejšej reakcia prebehla so vzorkami mRNA získanými z obličiek potkanov 48 hodín po ischemickom poškodení.
Northem analýza prenosu obličkového tkaniva získaného z dospelých potkanov dokázala, že gén 1-7 sa exprimuje vo veľmi nízkej koncentrácii v obličkách normálnych dospelých potkanov, semenníkoch, slezine a pľúcach. Gén
3- 2 sa exprimuje v pečeni, obličkách, slezine a mozgu. Gén
4- 7 sa exprimuje v slezine, obličkách, pľúcach, semenníkoch, srdci, mozgu, pečeni a v kostrových svaloch. Prítomnosť mRNA s rôznymi veľkosťami v niektorých tkanivách pre 1-7 a 3-3 prenosy naznačuje, že produkty primárnej transkripcie génov 1 -7 a 3-2 sa môžu pozmeniť buď alternatívnym zostrihom, alebo polyadenyláciou.
Príklad 4
Izolácia 3-2 a 4-7 cDNA klonov cDNA knižnica sa pripravila zo 4 pg polyA+ RNA izolovanej z obličiek 48 hodín po ischemickom poškodení. Knižnica sa pripravila podľa návodov odporučených výrobcom pomocou nasledovných kitov: BRL Superscript Choice™ Systém pre syntézu cDNA klonovacieho kitu Stratagene™ Lambda Zapli (katalógové číslo 236211).
Pomocou náhodne rádioaktívne označeného (pozri skôr) produktu 3-2 RDA, slúžiaceho ako sonda, sa preskúmalo 105 klonov. Vybralo sa osem pozitívnych klonov a štyri z nich sa náhodne vybrali na následnú analýzu slúžiacu na získanie čistých fágových plakov. Po ďalšom, v poradí treťom kole prehľadávania, sa izolovali štyri čisté fágové klony. Klonované inzerty sa izolovali z fágov spôsobom in vivo excízie a to podľa návodu a s použitím kitu Stratagene™ Lambda Zapil.
DNA inzertu s najväčšou veľkosťou, približne 2,6 kb (zodpovedajúca cDNA klonu 3-2) sa sekvenovala. Sekvencia inzertu (označená ako SEQ ID NO: 1) je znázornená na obrázku L cDNA kloň 3-2 (E. coli K-12, SOLR/p3-2#5-l) sa uložil pod označením ATCC č. 98016. Sekvencia cDNA klonu 3-2 je identická so sekvenciou klonu 1-7 cDNA (označená ako SEQ ID NO: 2) s výnimkou nukleotidov 136 až 605 zo SEQ ID NO: 1, ktoré predstavujú sekvenciu inzertu. Tak SEQ ID NO: 2 reprezentuje zostrihový variant formy SEQ ID NO: 1. Kloň 1-7 (E. coli K-12, SOI.R/pl-7#3-1) sa uložil pod označením ATCC č. 98060).
Pomocou sondy tvorenej náhodne rádioaktívne značeným (pozri skôr) produktom 1-7 RDA, sa preskúmalo 105 klonov. Vybralo sa osem pozitívnych klonov a štyri z nich sa náhodne vybrali na nasledovnú druhú analýzu slúžiacu na získanie čistých fágových plakov. Po ďalšom, v poradí treťom kole prehľadávania sa izolovali štyri čisté fágové klony. Klonované inzerty z fágov sa izolovali metódou in vivo excízie a to podľa návodu a s použitím kitu Stratagene™ Lambda Zapil. Inzert s najväčšou veľkosťou, približne 2,0 kb (zodpovedajúci cDNA klonu 1-7) sa sekvenoval. Sekvencia inzertu (označená ako SEQ ID NO: 2) je znázornená na obrázku 2.
Pomocou sondy tvorenej náhodne rádioaktívne značeným (pozri skôr) produktom 4-7 RDA preskúmalo sa 105 klonov pomocou hybridizácie v PBS pri 65 °C. Vybralo sa osem pozitívnych klonov a štyri z nich sa náhodne vybrali na následnú druhú analýzu slúžiacu na získanie čistých fágových plakov. Po tomto druhom kole prehľadávania sa vyizolovali dva čisté fágové klony. Klonované inzerty z fágov sa izolovali metódou in vivo excízie, a to podľa návodu a s použitím kitu Stratagene™ Lambda Zapil. Inzert s najväčšou veľkosťou, približne 2,4 kb (zodpovedajúci cDNA klonu 4-7) sa sekvenoval. Sekvencia inzertu (označená ako SEQ ID NO: 4) je znázornená na obrázku 3. Kloň pre 4-7 (E. coli K-12,SOLR/p4-7#l-l) sa uložil pod označením ATCC č. 98062.
Príklad 5 Charakterizácia cDNA klonov 1-7, 3-2 a 4-7 A) Sekvencie DNA a proteínov:
Sekvencia cDNA 3-2 (pozri obrázok 1; SEQ ID NO: 1) obsahuje otvorený čítací rámec pozostávajúci z 307 aminokyselín (pozri obrázok 1; SEQ ID NO: 3). Signálna sekvencia dlhá 21 aminokyselín je odvodená z analýzy uskutočnenej Von Heijnom (pozri Von Heijne a kol., Nucl. Acid Res. 14: strana 14683 (1986)) a transmembránové oblasti pozos távajúce približne z aminokyselín 235 až 257 naznačujú, že produkt 3-2 je bunkový povrchový proteín.
Sekvencia cDNA 1-7 (pozri obrázok 2; SEQ ID NO: 2) obsahuje otvorený čítací rámec pozostávajúci z 307 aminokyselín, ktorý je identický s otvoreným čítacím rámcom v klone cDNA 3-2 (pozri SEQ ID NO: 3).
Sekvencia cDNA 4-7 (obrázok 3; SEQ ID NO: 4) obsahuje otvorený čítací rámec dlhý 572 aminokyselín (SEQ ID NO: 5). Transmembránová časť sa nachádza približne medzi aminokyselinami 501 až 521.
B) In situ analýza mRNA 1-7, 3-2 a 4-7 v post-ischemických a protiľahlých (kontralaterálnych) dospelých potkaních obličkách:
In situ hybridizácia sa uskutočňuje spôsobom opísaným v práci Finch a koľ, Dev. Dynamics 203: strana 223 až 240, 1995. V stručnosti sa tento spôsob uskutočňuje tak, že sa ischemická a protiľahlá perfúzne fixuje 4 % paraformaldehydom v PBS. Obličky sa potom ďalej fixujú cez noc pri 4 °C a ďalej sa spracujú. Parafínové rezy sa deparafmizujú a rehydratujú, potom sa fixujú 4 % paraformaldehydom v PBS, štiepia sa proteinázou K, znova sa zafixujú a potom sa acetylujú anhydridom kyseliny octovej v trietanolamínovom pufri. Rezy sa potom dehydratujú a nechajú sa hybridizovať s RNA sondami značenými 32P pri teplote 55 °C. RNA sondy značené 32P sa vytvorili z 3-2 RDA alebo 1-7 RDA produktov naklonovaných do cieľového miesta BamHI v plazmide pGEM-ΠΖ. Po hybridizácii sa rezy premyli pri veľmi stringentných podmienkach (2 x SSC, 50 % formamid pri teplote 65 °C). Rezy sa nakoniec opäť dehydratujú, prevrstvia sa emulziou (NBT-2) a uskutoční sa autorádiografia, pričom sa použije aspoň týždenná expozícia. Strieborné zrná sa vyvolajú štandardným spôsobom a rezy sa kontrastne zafarbia toluidínovou modrou na mikrofotografické pozorovanie.
In situ hybridizačná analýza expresie mRNA 1-7 a 3-2 naznačuje, že expresia týchto génov je veľmi vysoká v bunkách poškodenej obličky v porovnaní s ich expresiou v rezoch normálnej obličky. Expresia prebieha hlavne v regenerujúcich bunkách kortexu a vonkajšej drene (outer medulla), pričom väčšina expresie sa sústreďuje do proximálnych tubulámych buniek.
In situ hybridizačná analýza expresie mRNA 4-7 rovnako naznačuje silnú expresiu tohto génu v zranenej ischemickej obličke v porovnaní s normálnou dospelou obličkou. Miestom expresie sa zdajú byť filtračné bunky.
Príklad 6
Izolácia ľudského cDNA klonu, ktorý je schopný krížovo hybridizovať s potkaňou 3-2 cDNA
Vytvorila sa DNA sonda značená 32P obsahujúca nukleotidy 546 až 969 inzertu klonu 3-2 podľa obrázka 1. Táto sonda sa použila na prehľadanie lambda gtlO cDNA knižnice z ľudských embryonálnych pečeňových buniek (Clontech katalógové číslo HL5003a). Duplikované sa prehľadalo 1 x 106 plakov s použitím štandardných, opísaných podmienkach, iba sa použila teplota 55° C. Počas premývania pri vysoko stringentných podmienkach sa filtre premyli v pufri 2xSSC pri 55 °C. Identifikovalo sa päťdesiat pozitívnych fágov, ktoré sa prečistili zo zodpovedajúcich plakov a izolovala sa z nich DNA. Fágové DNA sa analyzovali Southem prenosom s použitím rovnakej sondy ako v predchádzajúcom príklade. Filter so Southem prenosom sa na záver premyl v pufri 0,5 x SSC pri teplote 55 °C. Po tejto analýze sa ako pozitívne identifikovali dva klony. Inzert nachádzajúci sa v klone H13-10-85 sa osekvenoval a našla sa oblasť, kódujúca proteín s vysokou úrovňou identity s proteínom 3-2 podľa obrázka 3.
Nukleotidová sekvencia (pozri SEQ ID NO: 6) a zodpovedajúca odvodená aminokyselinová sekvencia (pozri SEQ ID NO: 7) ľudského proteínu príbuzného s proteínom 3-2 sú znázornené na obrázku 4. Uskutočnilo sa hľadanie analogických motívov a vybralo sa najviac si zodpovedajúce porovnanie sekvencií (pozri obrázok 5). Z uskutočnenej analýzy vyplýva, že ľudský protein príbuzný proteínu 3-2 je na 43,8 % identický a na 59,1 % podobný s potkaním proteínom 3-2. Oba proteíny obsahujú IgG, mucínovú, transmembránovú a cytoplazmatickú doménu. Je konzervovaných aj šesť cysteínových zvyškov v IgG doménach obidvoch proteínov.
Príklad 7
Produkcia fúzneho proteínu KIM-1 s Ig
Fúzny proteín pozostávajúci z extracelulámej domény proteínu KIM a Fc oblasti imunoglobulínu (Ig) je výhodný na štúdium molekulovej a bunkovej biológie procesov prebiehajúcich v poranenej alebo regenerujúcej obličke a rovnako ako molekula vhodná na terapiu. Pri príprave fúzneho proteínu KIM a Ig s extracelulámou doménou ľudského a potkanieho KIM-1 proteínu sa zvolil nasledovný postup. Fragment cDNA kódujúci extracelulámu doménu proteínu KIM-1 sa amplifikoval pomocou PCR a naklonoval do expresného vektora Biogen pCA125 na prechodnú expresiu v bunkách COS. Expresný vektor pCA125 produkuje fúzny proteín, ktorý pozostáva z proteínu kódovaného génom naklonovaným na N-koniec a ľudské Ig Fc oblasti na C-konci. Bunky COS sa transfekovali s plazmidmi SJR 103 alebo 104; tieto plazmidy exprimujú fúzny proteín obsahujúci časť sekvencie ľudského proteínu KIM (nukleotidy 263 až 1147, SEQ ID NO: 6; SJR 103) alebo časť sekvencie potkanieho proteínu KIM (nukleotidy 599 až 1319, SEQ ID NO: 1; SJR 104), čo sú extraceluláme domény tohto proteínu. Druhá časť fúzneho proteínu je ľudská Ig Fc oblasť. Bunky sa pestovali v 10 % fetálnom teľacom sére (FBS fetal bo vine sérum) v médiu DMEM (Dulbecco’s modifícd Eagle’s médium) vo fermentore (Nunc, Naperville, II.). Dva až tri dni po transfekcii sa médium odobralo, zakoncentrovalo pomocou koncentrátora Amicon a fúzny protein sa prečistil na sepharózovej kolóne s proteínom A. Po purifikácii sa čistota fúzneho proteínu stanovila pomocou SDSPAGE.
Priemyselná využiteľnosť
Diagnostické použitie zlúčenín podľa vynálezu
Protilátky proti proteínu KIM podľa vynálezu, ktoré sú schopné špecifickej väzby na proteín so sckvenciou SEQ ID NO: 3, SEQ 1D NO: 5 alebo SEQ ID NO: 7, alebo na fragmenty týchto proteínov, sú výhodné na niekoľko diagnostických spôsobov. Tieto protilátky sa môžu značiť detegovateľnými markermi ako sú fluorescenčné značky alebo rádiografické kontrastné látky a potom sa môžu podávať liečenému organizmu, aby sa zobrazilo tkanivo exprimujúce proteín KIM. Tieto protilátky sa môžu tiež naviazať na látky, ako je chrenová peroxidáza, ktoré sa potom dajú využiť na imunocytometrické farbenie KIM pozitívnych buniek na histologických rezoch. Takýmto spôsobom sa môže použiť aj samotná špecifická protilátka, pričom miesta, na ktoré sa táto protilátka naviazala, sa môžu detegovať pomocou ďalšej protilátky proti prvému imunoglobulínu, na ktorom je naviazaný detekčný marker.
Špecifické protilátky proti proteínu KIM sú tiež použiteľné v imuno-enzýmových testoch určených na meranie prítomnosti alebo koncentrácie proteínov KIM vo vzorkách tkanív a telesných tekutín. Tieto koncentrácie môžu byť v korelácii s rôznymi stavmi ochorenia. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú opísané spôsoby diagnózy poranení obličiek alebo spôsoby sledovania priebehu regenerácie obličiek meraním koncentrácie proteínov KIM alebo fragmentov proteínov KIM v moči, plazme alebo sére pacienta.
Podobným spôsobom možno merať koncentráciu proteínov KIM v močovom sedimente, predovšetkým potom v zvyškoch buniek v močovom sedimente. Zvyšky renálnych tubulámych buniek, ktoré môžu byť prítomné v močovom sedimente pacientov s ochorením obličiek môžu obsahovať zvýšenú koncentráciu proteínov KIM a príslušných mRNA.
Špecifické protilátky proti proteínu KIM sa môžu rovnako naviazať na pevný nosič, napríklad na guľôčky alebo misky, na použitie pri odstraňovaní ligandu z roztoku, buď kvôli meraniu, alebo kvôli puriftkácii a charakterizácii proteinov alebo ich vlastností (ako sú post-translačná modifikácia). Charakterizácia KIM proteínov pacienta môže pomôcť pri identifikácii škodlivých mutácií alebo chýb v post-translačnom spracovaní proteínov, ktoré zasahujú do funkcií KIM a sú spojené s nenormálnym fenotypovým prejavom. Uvedené spôsoby sú odborníkom v imunologických technikách dobre známe.
Ďalšie spôsoby využívajú proteíny KIM alebo fragmenty proteínov KIM naviazaných na kontrastné alebo detegovateľné skupiny na diagnostickú vizuálnu kontrolu tkanív exprimujúcich ligandy proteínov KIM, osobitne napríklad nádorových tkanív.
Ďalšie diagnostické spôsoby sú založené na detekcii zvýšeného množstva KIM mRNA v tkanivách, čo slúži ako indikácia procesov spojených s poškodením obličiek. Táto technika sa vyskúšala na modeli potkanov s ischemickým poškodením obličiek (pozri ďalej) a na tomto modeli sa osvedčila.
Na stanovenie, či je množstvo proteínu KIM-I po zranení zvýšené, sme skúmali homogenáty obličiek odobraté z kontrolnej a post-ischemickej obličky 24 a 48 hodín po 40 minútovom uzavretí obličkovej tepny a žily. Toto uzavretie krvného obehu sa uskutočnilo pri každom potkanovi svorkou vždy na jednej z obličiek. Homogenáty obličiek sa testovali na prítomnosť proteínu KIM-I. Pomocou Westem prenosu s dvoma rôznymi protilátkami identifikovali tri proteíny detegované po ischemickom poškodení, ktoré sa nedetegovali v homogenátoch z kontrolných obličiek, nevystavených ischemickému poškodeniu.
Molekulové hmotnosti odvodené z elektroforetickej pohyblivosti proteínov sú približne 40 kDa, 50 kDa a 70 až 80 kDa. Tri rôzne proteíny detegované analýzou westem blot môžu reprezentovať glykozylované formy toho istého proteínu vďaka prítomnosti potenciálnych N a O glykozylačných miest. Fakt, že každý z týchto proteínov reaguje s dvoma rozdielnymi súbormi polyklonálnych protilátok, podporuje domnienku, že ide o proteíny príbuzné s KIM-1 a nie iba o nezávislé, krížovo reagujúce proteíny.
Potvrdenie tohto predpokladu vyplýva z výsledkov čiastočného CNBr štiepenia troch proteínov, ktoré odhalilo, že všetky tieto proteíny majú spoločné fragmenty CNBr štiepenia. Vzhľadom na to, že v cytoplazmatickej doméne proteínu KIM-1 sa neuskutočnili žiadne väčšie translačné modifikácie, mali by dva najmenšie produkty štiepenia (s veľkosťou 4,7 kDa a 7,4 kDa) detegovateľné protilátkami proti cytoplazmatickej doméne proteínu KIM-1 mať rovnakú veľkosť pre všetky tri rôzne elektroforetické pásiky proteínov KIM-1. Tento predpoklad by sa splnil iba v prípade, ak štiepne fragmenty vznikajú z rovnakého proteínu. Pozorovalo sa, že proteíny KIM-I s veľkosťou 40 kDa a 70 až 80 kDa dávajú fragmenty migrujúce s predpokladanou pohyblivosťou. Štiepením elektroforetického pásika zodpovedajúceho proteínu s veľkosťou 50 kDa vznikol rovnaký C-koncový peptidový fragment.
V sekvencii proteínu K1M-1 sa vyskytujú dve možné miesta pre N-glykozyláciu a mucínová doména, na ktorej môže prebiehať glykozylácia peptidového reťazca. Tri elektroforetické pásiky KIM-1 detegované v post-ischemických obličkách by mohli zodpovedať glykozylačným variantom proteínu s totožným jadrom. De-N-glykozylácia pomocou enzýmu PNGáza F spôsobila posun pohyblivosti všetkých troch elektroforetických pásikov o približne 3 kDa smerom k nižšej molekulovej hmotnosti. Vyplýva z toho, že všetky tri proteíny sú N-glykozylované. Rozdielnu O-glykozyláciu možno vysvetliť zotrvávajúcimi rozdielmi vo veľkostiach týchto troch elektroforetických pásikov.
Terapeutické použitie zlúčenín podľa vynálezu
Spôsoby liečby podľa vynálezu zahrnujú selektívnu aktiváciu alebo inhibíciu bunkovej odpovede súvisiacej s naviazaním ligandu na proteín KIM. Tam, kde sú tak proteín KIM ako aj ligand membránové proteíny exprimované rôznymi bunkami, môže prebehnúť signál transdukcie tak v bunke exprimujúcej proteín KIM, ako aj v bunke exprimujúcej ligand proteínu KIM alebo v obidvoch bunkách.
Bunková odpoveď spustená naviazaním ligandu na proteín KIM môže byť v bunke exprimujúcej ligand proteínu KIM generovaná kontaktom tejto bunky s exogénnym proteínom KIM, fúznym proteínom KIM alebo aktivačnou protilátkou proti ligandu proteínu KIM a to tak v prostredí in vitro ako aj in vivo. V inom prípade môže byť odpoveď buniek exprimujúcich ligand proteínu KIM za normálnych okolností spustená endogénnym proteínom KIM, zablokovaná kontaktom bunky exprimujúcej ligand proteínu KIM a antagonistom ligandu proteínu KIM (napríklad s protilátkou, ktorá sa viaže s ligandom proteínu KIM), alebo kontaktom endogénneho proteínu KIM s protilátkou proti proteínu KIM alebo pomocou inej molekuly viažucej sa na proteín KIM, ktorá je schopná zabrániť účinnej väzbe proteínu KIM s jeho ligandom.
Podobne môže byť aj odpoveď bunky exprimujúcej proteín KIM spustená aktiváciou proteínu KIM ligandom aktivovaná alebo inhibovaná exogénnymi molekulami. Napríklad odpoveď bunky exprimujúcej proteín KIM spustená naviazaním ligandu na proteín KIM môže nastať po kontakte bunky s rozpustným ligandom proteínu KIM, alebo po kontakte s určitými anti-KIM protilátkami. Ďalej možno tvrdiť, že odpoveď bunky exprimujúcej proteín KIM, ktorá je pri normálnych okolnostiach spustená interakciou s endogénnym ligandom proteínu KIM možno zablokovať kontaktom KIM-I exprimujúcim bunky s antagonistom proteínu KIM (napríklad s blokujúcou protilátkou proti tomuto ligandu, ktorá sa viaže na proteín KIM takým spôsobom, že to zabraňuje efektívnemu signálnemu impulzu vznikajúcemu po naviazaní proteínu KIM na endogénny ligand) alebo kontaktom endogénneho proteínu KIM s protilátkou proti tomuto ligandu alebo s inou molekulou viažucou sa na tento ligand, ktorý zabráni efektívnemu spojeniu proteínu KIM ajeho endogénneho ligandu ( a tým aj vzniku signálu).
Ktorý z uvedených spôsobov ovplyvnenia signálnych dráh závislých od KIM bude výhodný na konkrétne terapeutické použitie, závisí od etiológie príslušného liečeného patologického procesu alebo naopak podporovaného žiaduceho procesu. Toto rozhodnutie je úplne v možnostiach príslušných odborníkov.
Napríklad, v prípadoch keď interakcia medziproteínom KIM a ligandom spôsobuje žiaduci bunkový rast, udržanie diferencovaného fenotypu, rezistencie proti apoptóze zapríčinenej rôznym poškodeniami, alebo spôsobuje iné, z lekárskeho hľadiska výhodné odpovede, možno použiť jeden z uvedených spôsobov aktivácie signálnych dráh spúšťaných interakciou proteínu KIM s ligandom. V inom prípade, keď následkom uvedenej interakcie sú nežiaduce zmeny stavu pacienta ako napríklad rast nádorov, škodlivá strata bunkových funkcií, citlivosť na apoptózu alebo rozvoj zápalu, možno použiť jeden z uvedených spôsobov inhibície odpovede spustenej interakciou proteínu KIM s ligandom.
Ďalej nasledujú príklady opísaných terapeutických spôsobov podľa vynálezu. Jedným z terapeutických použití molekuly podľa vynálezu príbuznej proteínu KIM je použitie pri liečbe subjektov s ochorením obličiek, podpora rastu nového tkaniva alebo podpora poškodených tkanív. Uvedené spôsoby zahŕňa krok podania terapeuticky účinného množstva proteínu KIM podľa vynálezu alebo farmaceutické kompozície obsahujúce proteín podľa vynálezu. Proteín použitý v týchto spôsoboch môže byť fragmentom úplného proteínu KIM, rozpustným ligandom proteínu KIM alebo jeho fúznym fragmentom, alebo agonistom proteínu KIM. Tieto spôsoby sa môžu tiež uskutočniť podaním terapeuticky účinného množstva agonistickej protilátky podľa vynálezu, alebo farmaceutickej kompozície obsahujúcej agonistickú protilátku podľa vynálezu. Proteín KIM sa môže podať súbežne s terapeuticky účinným množstvom druhej zlúčeniny, ktorá rozšíri žiaduci terapeutický účinok. Zatiaľ čo tieto spôsoby možno použiť v každom tkanive, výhodnými tkanivami sú konkrétne obličkové tkanivo, pečeňové tkanivo, nervové tkanivo, srdce, žalúdok, tenké črevo, miecha alebo pľúca. Konkrétne poruchy obličiek, ktoré sa môžu výhodne liečiť zlúčeninami podľa vynálezu, zahŕňa akútne zlyhanie obličiek, akútna nefritída, chronické zlyhanie obličiek, nefrotický syndróm, defekty obličkových tubulov, transplantácie obličiek, poruchy spôsobené otravou, poruchy a traumy spôsobené hypoxiou. Defekty obličkových tubulov môžu byť buď dedičné, alebo získané, ako je napríklad polycystické ochorenie obličiek a meduláma cystická choroba. Tento zoznam nie je nijako obmedzený a môže zahŕňať mnoho ďalších porúch funkcie obličiek (pozri napr. Harrisonove Princípy vnútornej medicíny (Principles of Intemal Medicíne), 13. vydanie, 1994). Uvedenými spôsobmi liečeným organizmom môže byť človek.
Terapeutický zásah inhibujúci rast nežiaduceho tkaniva obsahujúceho bunky exprimujúce ligand proteínu KIM zahrnuje krok podania terapeuticky účinného množstva antagonistov proteínu KIM liečenému organizmu (napríklad antagonistickej protilátky, ktorá sa viaže na ligand proteínu KIM), alebo podanie terapeuticky účinného množstva protilátky proti proteínu KIM alebo inej molekuly schopnej väzby na molekulu KIM, ktorá blokuje prirodzenú väzbu proteínu KIM na tkanivo exprimujúce ligand proteínu KIM. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa môže použiť antagonista proteínu KIM alebo protilátka proti proteínu KIM tak, aby spomalila alebo zablokovala rast nádorov, ktorých rast je podmienený proteínom KIM.
Vynález ďalej opisuje spôsob zabíjania nádorových buniek exprimujúcich ligand proteínu KIM, alebo spôsob inhibície ich rastu. Tento výsledok sa dosiahne kontaktom príslušných buniek s fúznym proteínom obsahujúcim proteín KIM spolu s toxínom alebo rádionuklidom, alebo s konjugátom protilátky proti ligandu proteínu KIM s toxínom alebo rádionuklidom. Bunka môže byť v tele organizmu a proteín alebo konjugát protilátky je vhodným spôsobom podaný tomuto liečenému organizmu.
Vynález ďalej opisuje spôsob špecifického nasmerovania toxínu alebo rádionuklidu k bunke exprimujúcej proteín KIM. Toto sa dosiahne kontaktom takej buky s fúznym proteínom pozostávajúcim z ligandu proteínu KIM a toxínu alebo rádionuklidu, alebo kontaktom takej bunky s konjugátom protilátky proti proteínu KIM s toxínom alebo rádionuklidom. Ďalšie uskutočnenie vynálezu zahrnuje spôsob inhibície rastu nádorových buniek exprimujúcich proteín KIM. Tento spôsob je založený na kontakte príslušných buniek s fúznym proteínom zloženým z ligandu proteínu KIM a toxínu alebo rádionuklidu alebo s konjugátom protilátky proti proteínu KIM s toxínom alebo rádionuklidom. Bunka môže byť v tele liečeného organizmu a proteín alebo konjugát protilátky je vhodným spôsobom podaný tomuto liečenému organizmu.
Termínom „liečený organizmus” sa rozumie ľubovoľný cicavec, ktorému sa môže podať proteín KIM. Organizmami špecificky určenými na liečbu podľa vynálezu sú okrem iných človek, ako aj ďalšie primáty, ovce, kone, dobytok, kozy, prasce, psy, mačky, králiky, morčatá, škrečky, potkany a myši, ako aj orgány, nádory a bunky odvodené alebo pochádzajúce z týchto hostiteľov.
Použitie zlúčenín podľa vynálezu v génovej terapii
Gény kódujúc proteín KIM podľa vynálezu sa vkladajú do poškodeného tkaniva alebo do tkaniva, v ktorom je potrebné povzbudiť rast buniek. Takáto terapia povzbudzuje v transfekovaných bunkách produkciu proteinov KIM, podporuje bunkový rast alebo podporuje prežitie buniek exprimujúcich proteín KIM.
V zvláštnom uskutočnení génovej terapie podľa vynálezu môže byť do obličkového cieľového tkaniva zavedený gén kódujúci proteín KIM. Proteín KIM by mohol byť stabilne exprimovaný a povzbudzovať tak rast tkaniva, delenie alebo diferenciáciu buniek. Gén pre proteín KIM sa môže vložiť do cieľovej bunky s použitím rôznych, zo stavu techniky dobre známych spôsobov používajúcich tak vírusové ako aj nevirusové vektory.
Spôsoby využívajúce nevirusové vektory zahrnujú elektroporáciu, fúziu bunkových membrán pomocou lipozómov, bombardovanie vysokorýchlostnými mikroprojektilmi pokrytými s DNA, inkubáciu s fosforečnanom vápenatým a DNA zrazeninou, transfekciu sprostredkovanú DEAE-dextránom a priamu mikroinjekciu DNA do jednotlivých buniek. Napríklad gén pre proteín KIM sa môže vložiť do bunky spoločnou precipitáciou s fosforečnanom vápenatým (pozri Pillicer a kol., Science 209: strana 1414 až 1422 (1980); mechanickou mikroinjekciou alebo nastrelením častíc (Anderson a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77: strana 5399 až 5403 (1980); prenosom DNA pomocou lipozómov (napríklad transfekciou s LIPOFECTINom, pozri Fefgner a kol., Proc. Nat. Acad. Sci USA, 84: strana 471 až 477, 1987; Gao a Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179: strana 280 až 285, 1991; DEAE transfekciou Dextránom; elektroporáciou (pozri US patent č.: 4,965,288); alebo transfekciou pomocou polylyzínu, s ktorým je DNA konjugovaná tak, aby sa prednostne dopravila do hepatocytov (pozri Wolff a kol., Science 247: strana 465 až 468, 1990; Curiel a kol., Human gene therapy 3 (Ľudská génová terapia 3): strana 147 až 154, (1992).
Na transfekciu cieľových buniek podľa vynálezu sa môže tiež použiť priamo prenos génov, pozri napríklad Wolff a kol. „Direct Gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo”, (Priamy prenos génov do losieho svalu in vivo), Science 247: strana 1465 až 68, 1990: V mnohých prípadoch je žiaduca transfekcia sprostredkovaná vektorom. Na vloženie plynukleotidovej sekvencie do vektora sa môžu použiť ľubovoľné spôsoby známe zo stavu techniky, pozri napríklad Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; a Ausubel a kol., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992.
Aktivita promótora môže byť tkanivovo špecifická alebo indukovateľná metabolickým produktom alebo podanou látkou. Takýmito promótormi/enhancermi sú napríklad (ale nielen) promótor natívneho ligandu proteínu c-ret, včasný promótor/enhancer cytolmegalovirusu (Karasuyama a kol., J. Exp. Med., 169: strana 13, 1989); ľudský beta-aktínový promótor (Gunning a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: strana 4831, 1987; promótor indukovatcľný glukokortikoidmi, ktorý sa vyskytuje v dlhej terminálnej repetícii vírusu nádoru myšacej mliečnej žľazy (Mouse mammary tumor vírus, MMTV LTR, pozri Klessig a kol., Mol. Celí. Biol. 4: strana 1354, 1984); v dlhej terminálnej repetícii vírusu myšacej leukémie (Moloney murine leukémia vírus, MuLV LTR, pozri Weiss a kol., nádorové RNA vírusy, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1985); v promótore ranej oblasti vírusu SV40, pozri Bemoist a Chambon, Náture 290: strana 304, 1981); promótor vírusu Rousovho sarkómu (RSV, pozri Jamamoto a kol., Celí 22: strana 787, 1980); tymidínkinázový promótor vírusu herpes simplex (HSV, pozri Wagner a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1441, 1981); promótor adenovírus (pozri Yamada a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: strana 3567,1985).
Gény pre proteíny KIM sa môžu do cieľových buniek vložiť tiež špecifickými vírusovými vektormi skonštruovanými práve na použitie v systémoch na génový prenos, ktoré sú v súčasnosti dobre dostupné, pozri napríklad: Madzak a kol., J. Gen. Virol. 73: strana 1533 až 1536, 1992 (papovavírus SV40); Berkner a kol., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: strana 39 až 61, 1992 (adenovírus); Hofmann a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92: strana 10099 až 10103, 1995 (baculovírus); Moss a kol., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: strana 25 až 38, 1992 (vacciniavírus); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: strana 97 až 123, 1992 (adeno-asociovaný vírus); Morgulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, strana 67 až 93 (vírus oparu (herpes simplex vírus, HSV) a vírus Epsteina a Barrovej (EBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158: strana 1 až 24, 1992 (retrovírus); Brandyopadhyay a kol., Mol. Celí. Biol. 4: strana 749 až 754, 1984 (retrovírus); Miller a kol., Náture 357: strana 455 až 450, 1992 (retrovírus); Anderson, Science 256: strana 808 až 813, 1992 (retrovírus), Current Protocols in Molecular Biology: sekcia 9.10 až 9.14 (Ausubel a kol., editori), vydavateľstvo Greene Publishing Associates, 1989.
Výhodné vektory podľa vynálezu sú vektory založené na DNA vírusoch, ako sú adenovírusy (vo výhodnom uskutočnení vynálezu vektory založené na Ad-2 alebo Ad-5), baculovírusy, vírusu herpes simplex) a parvovírusy (vo výhodnom uskutočnení vynálezu vektory založené na „defektnom” alebo neautonómnom parvovíruse, v ešte výhodnejšom uskutočnení vynálezu vektory založené na adenoasociovaných vírusoch a najvýhodnejšie vektory založené na AAV-2, pozri napríklad Ali a kol., Gene Therapy 1: strana 367 až 384,1994; US patent 4.797,368 a 5,399,346 a uvedená diskusia.
Výber konkrétneho vektora napríklad na prenos nukleotidovej sekvencie kódujúcej proteín KIM závisí od mnohých faktorov. Jedným z dôležitých faktorov je charakter populácie cieľových buniek. Aj keď retrovírusové vektory sú preštudované pomerne podrobne a používajú sa v mnohých aplikáciách génovej terapie, sú väčšinou nevhodné na infekciu buniek, ktoré sa nedelia. Tieto vektory sú vhodnej šic na liečbu rakoviny, pretože sa integrujú a ich gény sa exprimujú iba v replikujúcich sa bunkách. Sú vhodné na ex vivo spôsoby a ich výhodnosť spočíva predovšetkým v tom, že sa stabilne integrujú do genómu cieľovej bunky.
Adenovírusy sú DNA vírusy eukaryotických buniek, ktoré sa môžu upraviť na účinný prenos terapeutických alebo reportérových transgénov do rôznych bunkových typov. V súčasnosti sa využívajú všeobecne adenovírusy typu 2 a 5 (Ad2, respektíve Ad5), ktoré spôsobujú ľudské respiračné ochorenia. Sú vyvinuté adenovírusy na génovú terapiu Duchennovej svalovej dystrofie (DMD) a cystickej fíbrózy (CF), Obidva adenovírusy Ad2 a Ad5 patria do podtriedy adenovírusov, ktoré nespôsobujú ľudské zhubné nádory. Adenovírusové vektory poskytujú extrémne vysokú úroveň prenosu transgénu do takmer všetkých bunkových typov, bez ohľadu na mitotický stav. Vysoké titre (až 1013 plak vytvárajúcich jednotiek/ml) rekombinantného vírusu sa môže ľahko vytvoriť v bunkách 293 (čo je ľudská komplementujúca embryonálna obličková bunková línia transformovaná adenovírusom: ATCC CRL1573) a môžu sa zamraziť na dlhý čas bez viditeľných strát aktivity. Účinnosť tohto systému pri prenose terapeutického transgénu in vivo doplňujúceho vrodenú genetickú nerovnováhu sa demonštrovala na zvieracích modeloch s rôznymi poruchami, pozri Watanage, Atherosclerosis 36: strana 261 až 268, +986; Tanzawa a kol., FEBS Letters 118 (1): strana 81 až 84, 1980; Golasten a kol., New Engl. J. Med. 309: strana 288 až 296, 1983; Ishibashi akol., J. Clin. Invest. 92: strana 883 až 893, 1993; a Ishibashi a kol. J. Clin. Invest. 93: strana 1889 až 1893, 1994. Rekombinantný adenovírus neschopný replikácie a kódujúci cDNA pre transmembránový regulátor cystickej fibrózy (CFTR) sa schválil na použitie v aspoň dvoch klinických skúškach s ľudskými pacientmi s CF, pozri napríklad Wilson, Náture 365: strana 691 až 692, 1993. Ďalšie dôkazy podporujúce bezpečnosť použitia rekombinantných adenovírusov na génovú terapiu možno získať z rozsiahlych skúseností so živými adenovírusovými vakcínami bežne používanými v ľudskej populácii.
Prvá generácia rekombinantných replikácií neschopných adenovírusov vyvinutá na génovú terapiu DMD a ďalších dedičných porúch obsahovala deléciu celej E1 oblasti a časti Elb oblasti. Tento vírus neschopný replikácie sa pestoval v bunkách 293 obsahujúcich funkčný gén Ela adenovírusu, ktorý poskytuje trans-účinkujúci Ela proteín. Vírusy s deletovaným E1 génom sú schopné replikácie a produkcie infekčných vírusových častíc v bunkách 293, ktoré poskytujú produkty génov E1 a Elb in trans. Výsledné vírusy môžu infikovať mnoho bunkových typov a môžu exprimovať vložený gén (ak má svoj vlastný promótor), ale nemôžu sa replikovať v bunkách, ktoré nenesú E1 oblasť DNA (aspoň pokiaľ nie je bunka infikovaná mnohonásobnou dávkou infekčného činidla). Adenovírusy majú výhodu v tom, že majú široké hostiteľské spektrum. Môžu infikovať pokojové alebo terminálne diferencované bunky, ako sú neuróny a navyše sa zdá, že sú úplne neonkogénne.
Zdá sa, že adenovírusy sa neintegrujú do genómu hostiteľskej bunky. Vzhľadom na to, že sa ich životný cyklus zaobíde bez integrácie do genómu hostiteľskej bunky, veľmi sa znižuje riziko inzerčnej mutagenézy, pozri Ali a kol., Gene Therapy 1: strana 373. Rekombinantné adenovírusy (rAdV) dávajú veľmi vysoké titre vírusových častíc s priemernou stabilitou, sila expresie vložených génov je vysoká a spektrum hostiteľských buniek je široké. Ich prirodzenými hostiteľskými bunkami sú bunky epitelu dýchacích ciest, preto sú veľmi vhodné na génovú terapiu rakoviny pľúc.
Prenos génov založený na baculovírusových vektoroch má niekoľko výhod. Baculovírusový génový prenos sa môže použiť pre replikujúce sa a nereplikujúce sa bunky a môže sa použiť tak v obličkových bunkách ako aj v hepatocytoch, nervových bunkách, bunkách sleziny, kožných a svalových bunkách. Baculovírus sa v cicavčích bunkách nereplikuje a nie je patogénny. V ľudskom organizme sa normálne nevyskytujú protilátky proti rekombinantnému baculovírusu, ktoré by mohli blokovať infekciu. Navyše baculovírus je schopný prijať a transdukovať veľmi veľké inzerty DNA.
Adeno-asociované vírusy (AAV) sa môžu tiež použiť ako vektory na génovú terapiu somatických buniek. AAV sú malé, jednovláknové (ss) DNA vírusy s jednoduchou organizáciou genómu (4 až 7 kb), čo z nich robí ideálny model na génové inžinierstvo. Dva otvorené čítacie rámce kódujú sériu rep a cap polypeptidov. Rep polypeptidy (rep78, rep8, rep62 a rep40) sa podieľajú na replikácií, uvoľnení a integrácii AAV genómu. Cap proteíny (VPI, VP2 a VP3) tvoria proteínový obal vírusovej častice. Po stranách otvorených čítacích rámcov rep a cap na 5’ a 3’ koncoch sú 145 báz dlhé invertované terminálne repetície (ITR), z ktorých prvých 125 báz je schopných tvoriť duplexné štruktúry v tvare Y a T. Veľký význam pre vývoj AAV vektorov má skutočnosť, že celé rep a cap domény možno z genómu vybrať a nahradiť terapeutickým alebo reportérovým transgénom, pozri B.J. Carter v knihe Parvoviruses, editor P. Tijsser, CRC Press, strany 155 až 168 (1990).
Adeno-asociované vírusy (AAV) majú významný potenciál použitia v génovej terapii. Vírusové častice sú veľmi stabilné a rekombinantný AAV (rAAV) majú charakteristiky „podobné liečivám“ („drug-like”), čo sa prejavuje tým, že rAAV sa môžu purifikovať centrifugáciou alebo rozdelením v CsCI gradiente. Sú odolné proti vyšším teplotám a môžu sa lyofilizovať na prášok a rehydratovaný so zachovaním aktivity. Ich DNA sa stabilne integruje do chromozómu hostiteľa, takže expresia transgénu je dlhodobá. Spektrum ich hostiteľských buniek je široké a AAV nespôsobujú žiadnu chorobu, takže na nich založené rekombinantné vektory sú netoxické.
Po vnesení vektora do cieľovej bunky možno vložené sekvencie identifikovať konvenčnými spôsobmi, ako je hybridizácia nukleových kyselín s použitím hybridizačnej sondy obsahujúcej sekvencie homologické/komplementámc k sckvcnciám vloženým do vektora. V ďalšom spôsobe sa môžu vložiť sekvencie identifikované podľa prítomnosti alebo absencie funkcie „markerového” génu (napríklad tymidin kinázové aktivity, rezistencie proti antibiotiku a podobne) po vložení expresného vektora do cieľovej bunky.
Formulácia a podávanie zlúčenín podľa vynálezu
Zlúčeniny podľa vynálezu sú formulované štandardným spôsobom, napríklad prípravok v nosnom vehikule. Termínom „farmakologicky prijateľný nosič” sa rozumie jedna alebo viac organických alebo anorganických prísad, prírodných alebo syntetických, s ktorými je mutantný protoonkogén alebo mutantný onkoproteín spojený na uľahčenie aplikácie. Vhodným nosičom je napríklad sterilný fyziologický roztok, aj keď odborníkom sú známe ďalšie vodné a nevodné izotonické sterilné roztoky a sterilné suspenzie ako farmaceutický prijateľné. Termín „nosič” zahrnuje lipozómy a HIV-1 tat proteín (pozri Chen a kol., Anál Biochem. 227: strana 168 až 175, 1995) ako aj ľubovoľné plazmidy a vírusové expresné vektory.
Ľubovoľný polypeptid podľa vynálezu sa môže použiť vo forme farmaceutický prijateľnej soli. Vhodné kyseliny a zásady schopné tvoriť soľ s polypeptidmi podľa vynálezu sú odborníkom dobre známe a patria medzi ncanorganické a organické kyseliny a zásady.
Zlúčenina podľa vynálezu je liečenému organizmu podávaná v terapeuticky účinnom množstve, čím sa rozumie také množstvo, ktoré spôsobuje z lekárskeho hľadiska žiaduci výsledok alebo má vplyv na určitý liečený stav. Účinné množstvo zlúčeniny podľa vynálezu je schopné zlepšiť stav alebo spomaliť postup choroby, degeneratívne poruchy alebo stavu po poškodení organizmu. Účinné množstvo sa môže stanoviť individuálne a môže byť úplne alebo čiastočne založené na zvážení fyzických vlastností liečeného organizmu, liečených symptómov a predpokladaných účinkov a výsledku. Účinné množstvo môže stanoviť odborník po zvážení uvedených faktorov a s použitím rutinného experimentovania.
Lipozómový systém na podanie zlúčeniny podľa vynálezu sa môže ľubovoľne vybrať z mnohých jednolamelárnych vezikúl, multilamelámych vezikúl alebo stabilných plurilamelámych vezikúl a môže sa pripraviť a podať odborníkom dobre známymi spôsobmi, pozri napríklad US patenty 5,169,637; 4,762,915; 5,000,958 alebo 5,185,154. Navyše môže byť podľa vynálezu výhodné exprimovať polypeptidy, ako aj ďalšie vybrané polypeptidy vo forme lipoproteínov, aby sa zvýšila ich väzba na lipozómy. Napríklad akútne zlyhanie obličiek u človeka sa môže liečiť proteínmi KIM obalenými lipozómami, čo sa môže uskutočniť in vivo vložením proteínu KIM v lipozómoch do buniek, ktoré to potrebujú. Lipozómy sa môžu podať cez katéter do obličkovej tepny. Rekombinantný protein KIM sa môže napríklad purifikovať z buniek CHO pomocou imunoafinitnej chromatografie alebo ľubovoľným iným vhodným spôsobom a potom zmiešať s lipozómami tak, aby sa do lipozómov prijali s vysokou účinnosťou. Vložený protein sa môže testovať in vitro na svoje účinky na stimuláciu bunkového rastu.
Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu podávať ľubovoľným, z lekárskeho hľadiska prijateľným spôsobom. Tým sa rozumie napríklad injekcia parenterálnymi cestami, ako sú intravenózne, intravaskuláme, intraarteriálne, subkutánne, intramuskuláme, intratumorové, intraperitoneálne, intraventrikuláme, intraepidurálne alebo iné injekcie, ako aj ústne, nosné, očné, rektálne alebo miestne aplikácie. Vynález rovnako opisuje stabilné dlhodobé uvoľňovanie účinnej látky spôsobmi, ako je deponovaná injekcia alebo erodovateľné implantáty. Lokálne podanie je osobitne výhodné a opísané sú spôsoby lokálnej aplikácie pomocou katétra do jednej alebo viacerých tepien, napríklad do obličkovej tepny alebo cievy vyživujúcej lokálny nádor.
Napriek tomu, že vynález sa pomerne podrobne opísal v opise a príkladoch, aby sa vysvetlil predmet vynálezu a jeho pochopenie, odborníkom je zrejmé, že v rámci vynálezu sa môžu uskutočniť určité zmeny a modifikácie, ktoré sú obmedzené iba nasledovnými nárokmi.
Zoznam sekvencii (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 2566 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) topológía: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristické črty:
(A) meno/kľúč: CDS (B) umiestnenie: 615 až 1535 gcggccg:
CGAC :c totgagtaaa Twa?CA&M tctccttcäc agcacai
CCACCAACCC GAÍCAÄACAI TAOTGCTATT CTACCCAOGA GGAAATCTiG GTGTAGAGAG
CTCTAC&5A'
GATCTGTÄGC CAG'i'GCTTZ·; TOGGIU'ľCT
GTCACCATCT GTCGCTGAAT TCTAGCTCAG TCCATCTTAT
GTÄGCTGAAG TTTAGGAACC AACOIGTÄTG TCTCTGÄCCA GAÄGACTACA ec
180
240
300
360
TACCGAGAÄC ATÄCTCTCTA AIGGCTGCCT TCAJt
TCT CTGTITGCTG TCTTATTTGT
420
GTCATGGCCA GAACTGATAT GGATGGCTCT ATGTGÄGCÄA GCACCCWA3 AíSUUlÄGTGT
ACTTGGGGCA ACAGCTTOCC CTAACAGÄfiA CTCCTGTGGG ATTCATOCIG TCAGGATGAA
480 ‘40
OACCTGATCA GACA0A3TGT gctgagtgct acggctaac:
AGämTSACCT GTCACTGTCC
ÍOO <so
CTC CCT CTT CC Leu Leu Leu P:
744
994
CAA ΑΛ .T AT a crr AH 1 TGG ACC AAT GGA TAC CAA GTC . ACC TAT CTG AGC 842
Gin *J n íl e Lei i Zle Trp Thr has Gly Tyr Gla Val Thr Tyr Arg Si
<s 70 7J
*GC GGT CGA TAC AAC : AT* AAG GGG CGT ATT TCA GAA GGA GAC GTA TCC 890
Ser G1 ,y Arg Tyr *sa íle Lya Gly Arg íle Ser Glu Gly Asp Val $ er
t 0 88 90
CTG ACA ATÄ GAC AAC tct GTT GAT AGT GAT AGT GGT CTG TAT TGT TGC 938
Leu Thr íle Glu Asn Ser Val Asp Ser Asp Ser cly Leu Tyr cye Cy·
95 100 105
CGA GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG MA ATG ACC tct TCA 986
•Arg Val Glu íle Pro ciy Trp Phe Asn Asp Gin Lya Mec Thr Phe Ser
110 11$ 120
TCG GAA GCT ΑΛΑ CGA GAA ATT CCC ACA ACT CCT CCA ACA AGA CCC ACA 1034
Leu Glu Val Ly· Pro Glu íle Pro Thr Ser Pro Pro Thr Arg Pro Thr
125 130 135 140
Ä“ ACA AGA CCC ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA aca AGA TCC 1082
Thr Thr *rg Pra Thr Thr Thr Arg Pre Thr Thr íle Ser Thr Arg Ser
145 150 15$
ACA CAT GTA CCA ACA TCA ACC AGA GTC TCC ACC TCT ACT CCA ACA CCA 1130
Thr KÁS Val Pro Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro
160 165 170
GAA CAA ACA GAG ACT CAC AAÄ CCA GAA ATC ACT ACA CTT TAT GCC CAT 1178
Glu Gin Thr Gin Thr His Lya Pro Glu íle Thr Thr Phe Tyr Ala ais
175 100 185
GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT CCT GCA SAC 1226
Glu Thr Thr Ala Glu Val Thr Glu Thr Pro Ser Thr Pro Ala Asp
190 195 200
TGG ΑΛΤ GGC ACT GTG ACA TCC TCA GAG GAG GCC TGG AAT AAT CAC ACT 1274
Trp Asn Gly Thr Val Thr Ser Ser Glu Glu Ala Trg Asn Asn Kií Thr
20S 210 21S 220
GTA AGA ATC CCT TTG AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT AAG GGC TTC 1322
Val Arg íle Pro Leu Arg Lya Pre Gla Arg Asn Pro Thr Ly· Gly Phe
22$ 230 235
TAT GTT GGC ATG TCC GCT GCA GCC CTG CTG CTG CTG CTG CTT GCG AGC 137C
Tyr V<1 Gly Met Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Lau Leu Leu Ala Ser
240 245 250
ACC GTG GTT GTC ACC AQG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAC ATC GGC TCT 1418
Thr Val Val Val Thr Arg Tyr Zle íle Zle Arg Lya Ly« Met Gíy ser
255 260 265
CTG AGC TCT GTT GCC TTC CAT GTC TCT AAG ACT AGA GCT CTa CAG AAC 146«
Leu Ser Phe Val Ala Phe Bi· Val Ser Ly· Ser Arg Ala Leu Gin Asn
270 275 280
GCA GCC ATT GTG CAT CCC CGA GCT GAA GAC AAC ATC TAC ATT ATT 1 GAA 1514
Ala Ala Zle Val ais Pro Arg Ala Glu Asp Asn Zle Tyr n« Zle : G1U
285 290 295 300
GAT ACA TCT CGA GGT GCA SA* TGAGTCCCAG AGCCCCTCTC TGGGGCCTTC Asp Ar? Ser Arg Gly Ala Glu
30$
1566
TGCCTGGGAT TACACAGATC GTGACTGACT TCACAGAGTA AAATACCCAT TCCAGCTCCT 1625 GúGAGÄTTrľ GTGTTTTGGT TCTTCOKT GCAGTGSMÄ GGGTMCCCT CTACCCTGTA 1HS TATGCAÄÄAC TCGAGGTTAA CATCATCCTÄ ATTCTTCTAT CAGCAACACC TCAGTGTCTC 1745 CACTCACTGC AGCGATTCTC TCKAATCTCA ACATCTTAGÄ ACTTTGTGTT TCťTľľWTC 1605 CATGTAATCA TTGGTÄATAC AAGAÄTTTTA TCTTGTTTAT TäAAACCäTT MTGÄGAGGG 186S
GAATAGGÄA? TÄAAÄ5CTOG CTGGAAGGGC CTCCTGAACT TAGAAGCACT TCATGATTGT 1925 GTTTATCTCľ TľTAľTGTAA ΓΓΠΑΑΑΤΤΓ TACTTCTATC CTTCCCAAOG OGCAAAAICA 198' TGGGAGCATG GÄGWmAA TCTCCCTCA? ÄGÄTAAGTAG AAGAäGÄGAC TCTäÄCTCCA 234' CCAATÄGÄGG TOGTľATGCT TľCTCACAGC TCTGGAAATA CTATCÄTCTA TľATSCAGTľ 210$ GAľZCTAGGA TGÄfiGATGSG TTTCTTAGGä GGAGÄGGTTA CCKTGGTGAG TGGACCAGGC 216' ACACATCÄGG GGAAGäNAC MTGGATCAA SGGATTGÄGT TCaTTAGAGC CATTTCCACT 2225 CCACTľCľGľ CTTGlTCCľC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG AATTAGGTGC 2285 ÄGGGAGGAGA CGTGCAGAAA CGAAÄflAGGÄ AAGÄAAGGAC AGAGÄGCÄGO ACACAGGCTT 2345 TCTGCTGAGA GAAGTCCTAT T3CAQGTGTG ACAGTGTTTC GGACTACCAC GGGTTTCCTT 2405 CAGACCTCTA ACTTľCTAAA TCACTATCA? GTGATCATAT TTACTTCTAA ΑΑΊΤΑΤΤΤΟΑ 2468
CTľ GCG AGC ACT CTG GCT GCT ACT AGG zx: ATC ACT ATA AO AAG AAC 339
Leu Ala Ser Thr Val Val val Thr Arg 11í Ue :i· Arg Lyt Lye
2S0 25S 260 263
ATS GCC TCT CTG AGC CTT GCT GCC CTC CÄT GTC TCT AAG AGT AGA GCT 967
Met Gly S«r Leu Ser Phe Val Ala Phe K.s Vel Ser Lys Ser Arg Ala
270 27S 280
TTG CAG AAC GCA GCG ACT GCT ατ CCC CGA GCT GAA GAC M£ ATC TAC 1035
_eu Glo kín Ala Ala Íle val Ei> Pro Arg Ala Glu Asp Asa íle Tyr
285 290 295
ACT ACT GAA GAT AGA TCT CGA GCT GA GAA CTÄCCTCCAS «GCCTTCTG 108S
íle íle Glu Aap Arg Ser Arg Gly Ala Glu
13C 305
TGGGGCCCTC ctcctgwat tacagagmc gtäctga:
TCÄCÄGÄCTA ÄAÄTÄCCTÄT
1145
GAMSACACC ACATTÍTCAA TAATAAATCA G7TTGTCACA ΑΤΤλΑΤΑΑΑλ TATTTTGTTT 2525
GCTAAGAAG? ÄAAAAAAAÄA AÄAAAAAGTC GACGÚGGCCG C (1) Informácia o sekvencií SEQ JD NO: 2:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 20S4 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristické črty:
(A) meno/kľúč: CD S (B) umiestnenie: 145 až 1065 (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 2:
GCGGCCGCGT CGACGGTGCC TGTGAGTAAA TAGATCAGGG TCTCCTTCAC AGCACATTCT6 C
CCÄGGAAGCC GAGCUACAT TACTCCTATT TTACCCAGGA GGAAAľCTAí CTCTAGAGAC123
CTCTACGGAT CTAAGGTCAÄ CACC ATS CTT CAA CT? CAA GTC TTC AT? TCA1.71
Met Val Gla L«u Gin Val Phe íle Ser
GGC CTC CTG CTG CCT CTT CCA GGC TCT GTA GAT TCT TAT GAA GTA GTG 219
31y Leu Leu Leu Leu Lau Pro Gly Ser Val Asp Ser TyT Glu Val Val
10 1$ 20 25
AAG GGG GTC GTG GGT CAC CCT GTC ACA ATT CCA TGT ACC TAC TCA ACA 2Í7
Ly. Gly Val Val Gly ais Pro Val Thr íle Pro cy» Thr Tyr Ser Thr
30 35 40
CG7 CCA GGA ATC ACA ACG ACA TGT TGG GGC CGG GGG CAA TGC CCA TAT 3LS
Arg GLy Gly íle Thr Thr Thr Cyi TI? Gly Arg Gly Cla Cys Pre ryr
45 5C 55
TCT AGT TGT GAA AAT ATA CTT AT? TGG ACC AAT GGA TAC CAA GTC ACC 363
Ser Ser C/8 Gin Asn Ue Leu íle Thr AtD Gly Tyr Gla Val Thr
60 6$ 70
TA? CGG AGC AGC GCT CGA TAC AAC κτλ AAG GGG CCT ATT TCA GAA GGA 411
T/t Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Asn íle Lys Gly Arg íle Ser Glu Gly
7$ 80 IS
GAC GTA TCC CTC ACA ATA GAG AAC TCT GCT GAT ACT GAT AGT GGT CTG 45»
Asp Val Ser Leu Thr Íle Glu AS3 Ser val Aíp Ser Aep Ser Gly Leu
90 95 100 105
TAT TGT TGC CGA GTG GAG ACT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG 507
Tyr Cye cy« Arg Val Glu íle Pro Gly Trp Phe Asa ASp Gin Lys Mat
110 lis 120
ACC ΤΓΤ TCA TTC GAA GCT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA 555
Thr ItlO Ser Leu Glu Val Lya Pro Glu íle Pŕs Thr Ser Pro Pra Thr
125 130 135
AGA ccc ACA ACT ACA AGA ccc ACA ACC ACA ASC CCC ACA XCT ATT TCA <03
Arg Pre Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr íle Ser
140 14$ 150
ACA . AGA . TCC ACA CÄT GTA CCA ACA . TCA ACC AGA GTC TCC ACC TCT ACT <51
Thr Arg Ser Thr Hit -Val Pro Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr
_J5 1Í0 155
CCA ACA CCA GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC ACT ACA TTT 699
Pro Thr Pro GLu Gin Thr Gin Thr Hla Lye Pre Clu íle Thr Thr Phe
170 17S 110 US
TAT GCC CAT GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT 747
Tyr Ala Eia Glu Thr Thr Ala Glu Val Thr G1U Thr Pro Ser Thr
190 195 200
CCT CCA GAC TGC AAT GGC 1CT GTC ία tcc TCA GAC GAC GCT TCC AAT 745
Pro Ala Aa? Trp Aib Gly Thr Val Thr Ser Ser Glu Glu Ala Asn
2 OS 210 215
AAT CAC ACT CTA ASI ATC CCT TTG ACG AAC CCC CAC AGA AAC CCC ACT 843
Αλγ. Hli Tir val Arg íle Pro Leu Ar? Lyi Pro GLU Aig Jura Pro Ttr
220 225 230
AAG GCC CTC TAT GCT GGC ATG TCC CCT CTI GCC CW CTC CTC CTC CTC 891
Lya Gly Phe Tyr val Gly Het Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu
215 240 245 tccag:
CTACT
Tt
GGGAGATCTT CTGTCTKCľ TCCTCCnSCT OCWCTGA» GGCTAAC:
TCGAGCTTAÄ CACTATCCTA A“
CAGCAACACC
CACľCACTCC AGCGÄCTCTC TCAAACTCTa ACACTCTMA aTSTwra tctctaatxc jasaactcta tcctgctsi tsaääcot aatsasaosg oaatakaa:
TdíGA gocwaä:
tctaatcc:
L20S
134 5 u:
.36 5 taaamctqo toggaacgk ctcctoäact tmmgcact :ct cttäctctu ctctääactt tacctctatc ctctctäagc
CCÄÄTAGÄ3G TGGTTATUCT CTCTGU3USC TCTGGääATA TGATCXTTľi
1TGCAGT7 ClCTCTXGÄ TGAQGATCCG titcttagsa ggagacgctä ccactgctag ‘GGACCAGGC ACACATCAGG GCAACMMC UCTGATCAA QGGA3TCAGT TCACTAGAGC
CAľľlLLACT CTACTTCCTT CľlUASSCTC AGTCTCTCTA AACTCACCCA CIWOCTCTG
AATTAGGTGC ΑΟΟβΛββΑΟΑ CSTQOGMA CGAMCAQGA AAQAMOSlG JCASAGGAGG
1443
1505
1565
1425
1685
1745
1J05
1965
ÄCACÄGSCTT TCTGCCTAGÄ «ACTCCIAT TOCÄGGTCTG AOCTGCTCT GGACTKCAC 1J25
GCCCTTCCCT CAGACCTCTA AGTCTCTAAA TCACTATCAT SCTATCATA? TTATTľCTAA1S8S
AACTA7TTCA GAAAGACACC ACACTCTCAA TAATAAATCA GTľTCTCACA ATTAATAAAA2045
TA.’i-1¼. Λ . GCTAAGAACT AAAAACTCGA CSCG3CCSC2064 (1) Informácia o sckvcncii SEQ ID NO: 3:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 307 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 3:
Met Val Gin Leu Gin Val Phe íle Ser Gly Leu Leu Leu Leu Leu Pro
1 S 10 15
Gly Ser Val ASp Ser Tyr Glu Val Val Lys Gly Val Val Gly Kla Pro
20 25 30
Val Thr íle Pro Cys Thr Tyr Ser Thr Arg Gly Gly íle Thr Thr Thr
15 40 45
Cys Trp Gly Arg Gly Gin cys pro ryr Sex Ser Cye Gin Asn íle Leu
50 55 «0
íle Trp Thr Aen Gly Tyr Gin Val Thr Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Tyr
65 70 75 60
Asr. Ue Lys Gly Arg íle Sex Glu Gly Aap val Ser Leu Thr íle Glu
65 90 95
Asn Ser val Asp Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cy. Arg Val Glu íle
100 XCS 110
Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lyi Met Thr Phe Ser L«ti Glu Val Lys
115 12 Q 125
Pra Glu íle Pro Thr Ser Pro Pro Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro
130 13S 14 0
Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr íle Ser Thr Arg Ser Thr Hli Val Pro
145 150 155 16 ;o
Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro Glu Gin Thr Gin
165 170 175
Thr Hi* Lye Pro Glu íle Thr Thr Phe Tyr Ala Hi. Glu Thr Thr Ala
190 1S5 190
Clu val TJ·» Glu Thr Pro Ser Tyr Thr Pre Al* Anp Trp Aan Gly Thr 19S 200 20S
VaL fttr Ser Ser Glu Glu Ala Tr? Asn Asn Ki* Thr Val A-3 11* Pro
210 21.5 220
Leu Arg uy« Pra Gin Arg Asn Pro Thr Lys Gly Phe Tyr V»1 Gly Met
225 230 235 240
Sar val Al* Al* Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Thr v*l Val Val
245 250 255
Thr Arg Tyr Tie Tie ru Arg Lys Lys Met Gly Ser Leu Ser Phe Val
260 265 270
Ala Phe Kii Val Ser Lys Scť Arg U* Leu Gin Asr. Al* Al* rie Val
275 280 285
His Pra Are Al* Glu *sp Asn Zle Tyr íle íle Glu Asp Arg Ser Arg
290 295 300
Gly Al* Glu
305 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 2303 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristické črty:
(A) meno/kľúč: CDS (B) umiestnenie: 145 až 1065 (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 4:
GCGGCCGCGT WACTCOCXG GMQCCGGCA CTCTOACTCC TCTTCGATCG GJCTW2GM (9
TCAGACTCAA GCCCTGACTG GCTGAGGGCG GGCGCTCCGA GTCAGC kT3 ®A WT115
Met Glu Ser
TAC 1 TCT GCC ATT 1 TCC TAC AM TCG AAC TTT GGG 1 GAC AAC ACT GGC ' CTG 979
Tyr Ser Ala 11« sex Tyr Lys Trp Asn Phe Gly Asp Asn Thr Gly Leu
280 215 250
rrr GTC TCC AAC AAT CAC ACT CTG AAT CAC ACG TAT GTG CTC AAT GGA 1027
Phe Val Ser Asn A*n Hla Thr Leu Aaa Λί· Thr Tyr Val Leu Asn Gly
39$ 300 305
ACC TTC AAC TCT AAC CTC ACC GTG CAA ACT GCA OTO CCG GGA CCA TGC 107$
Thr Phe Asn Phe ME Leu Thr Val Glo Thr Ala val Pro Gly Pro Cys
J10 31$ 320
CCC TCA CCC ACA CCT TCG CCT TCT TCT TCC ACT TCT CCT TCG CCT GCA 1123
Pro Ser pro Thr pro Ser Pro Se: Ser Sex Thr Ser Pro Ser Pro Ala
32S 330 335
TCT TCG CCT TCA CCC ACA TTA TCA ACA CCT AGT CCC TCT TTA ATG CCT 1’71
Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Str Thr Pro Ser Pro Ser Leu Met Pro
340 345 350 3SS
ACT GGC CAC AAA TCC ATG GAG CTG AGT GAC ACT TCC AAT GAA AAC TGC 1219
Thr aiy Hus Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp Zle Ser Asn Glu Asn Cys
360 365 370
CGA ATA AAC AGA TAT GGT TAC TTC AGA GCC ACC ATC ACA ACT GTA GAT 1267
Arg Zle Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Ala Thr Zle Thr Zla Val Atp
37S 3 SO 31$
GGA ATC CT* , GAA CTC AAC ATC ATC CM GTA GCA GAT GTC : cca ATC CCC 1315
Gly 11· Leu , Glu Val Asn Zle Zle Gin Val Ala Asp Val Pro Zle Pro
390 3SS 400
ACA CCG CAC CCT GAC AAC TCA CTC ATG GAC TTC ATT GTG ACC TCC AAA1363
Thr Pro Gin Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe II· Val Thr Cy»ty·
40$ 4X041$
GGG GCC ACT CCC ACG CAA GCC TCT ACG ATC ATC TCT GAC CCC ACC TCC1411
Gly Ala Thr Pre Thr Glu Ala Cys Thr íle Zle Ser Asp Pro ThrCys
420 425 430435
CAG ATC GCC Cln lis Ala
AGC CCG GTC GCT GTG GAT GAG CTG Str Pro Val Ala Val Asp Glu L«u 44$450
CAG AAC AGG GTC TCC Gin Asn Arg Val Cys
440
TGCCTCCTGTCCGTCAGGAGAGCCTTCAATGKTCCCGCACGTACTGT
Cys Leu Leu Ser Val Arg Arg Ua Phe Asn Gly Ser Gly Thr Tyr Cys
4SS 450455
CTG AAT TTC ACT CTG GGA GAC GAT GCA AGC CTG GCC CTC ACC AGC GCC Val Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Ala Ser Ltv Ala Leu τηχ Ser Ala 470 47$410
1459
1507
1S5S
CTC TGC GCG GTC CTG GTA TTT CTG CTG CTG GCT t» 0GA CTG cca cx 163
Leu Cy· S Gly val Leu Val Phe Leu Leu Leu Ala Ala Gly Leu Pro ten
10 15
CAC GCC GCC MS CGG TTC CCT GAT CTC CTC GGC CAT GAG CM TAT CÍC 211
Gin Al* Ala lyi Arg Pha M Asp Val Leu Gly Bi* Glu Gin Tyr Pro
20 25 30 15
CTG ATC TCT ATC CCT GG· Leu Zle Ser Zle PrO Gl;
46S iíC3
16S1
GAT CAC ATG AGG GAG AAC AAC GAA TCA OTO GGC TGG TCT TCA GAT 1 GAA 259
Asp Hla Met Arg Glu Asn Asn Gin Leu Arg Gly Trp Sar Str A*p G1U
40 45 $0
AAT GAA TGG GAT GAA CAG CTC TAT CCA GTC TCG AGG AGG GGA GAG GGC 307
Asn Glu Trp Asp Glu Gin Leu iyr Pro Val Trp Arg Arg Gly Glu Gly
ss 50 5$
A£A TOS AAG GAC TCC TGG GAA GGA GGC CGT GTC CAG GCA GCC CTA ACC 3SS
Arg Tep Lys Asp Ser Trp Clu Gly Gly Arg Val Gin Ala Ala Lau Thr
70 75 10
AGT GAT TCA CCG GCC TTC CTC GCT TCC AAT ATC ACC TTC GTA GTG AAC 403
Ser A*p Ser Pro Ala Leu val Gly Ser Asn Zle Thr Phe Val Val Asn
• 5 90 95
CTG GTC TTC CCC AGA TCC CAG AAG GAA GAT GCC AAC GGC AAT ATC CTC 4S1
Lau Val Phe Pro Arg Cye Cln Ly. Glu Asp Ale Asn. Gly Asa 11« Val
100 íos 110 115
TAT GAG AGG AAC TCC AGA AGT GAT TTC GAG CTC GCT TCT GAC CCC TAT 499
Tyr Glu Arg Asn Cys Arg Ser Asp Leu Glu L«u Ala Str Asp Pro Tyr
220 125 130
GTC TAC AAC TCG ACC ACA GGG GCA GAC GAT GAG GAC TCG GAA GAC AGC S47
val Tyr Asn trp Thr Thr Cly Ala Atp Αβρ Glu Asp rrp GlU Asp Str
13 5 140 145
ACC AGC CA* GGC CAG CAC CTC AGG TTC CCC GAC SGG AAG CCC TTC CCT 595
Thr Ser Gin Gly Gin His Leu Arg Phe Pro Asp Gly Lys Pro Am Pro
150 15S l«0
Leu G X;
565 rc:
TGACTGGGAA CCCACTCTTC TCTOCATCIA TGTGÄGCTGT GCÄGAAGTAC ATGACTGGTA
GCTGTTCTTT TCTACGGACT ATTGTAAAAT GTATATCATG GTTTAGGGAG CGTAGTTAAT
TGGCATTTTA GTGAAGGGAT
TACTCTTAAT A3GOTOGGCA CATTCTGTCT OAAGGGGGAG GQGGAGGTCA CTGCTACTTA
AGSTCCTAGG TTAACTäGGA SAGGATQCCC GAOGCTCCTT AGATTTCTAC ACÄÄGATGTG
CCTGAACCCA GCTAGTCCTC ACCTAAAGGC CATGCTTCAT CAACTCTATC TCÄGCTCATT
GAACATACCT GAGCACCTCA TCGAATTATA AfGGAACCAA
CTGTACATAA OATACTCATT AAAAAGAC1G TCTATTAAAA A
169$ .747
95
1142
1902
1962
3023
2082
3142
120:
3253
2303
CGC CCC CAC GGA CGG AAG AAA TCG AAC TTC GTC TAC GTC TTC CAC ACA
Arg Pro Hl* Gly Arg Lyt Lyt Trp Aen Phe Val Tyr Val Pba Bil Thr 1Í5 170 175
643
CTT GGT CAC TAT TTT GAA AAQ CTC GGT CGG TCT Leu Gly Gin Tyr Phe Gin Lys Leu Gly Arg Cy« 180 185 190
TCA GCA CGA GTT TCT Ser Ala Arg Val Ser
195
691
ATA AAC ACA GTC AAC íle Asn Thr Val Asn
300
TTC AO GTT GGC CCT CAG GTC ATC GAA GTC ATT bou Thr Val Gly Pro Gin Val Mat Glu Val Zle 20í 210
739
GTC TTT CGA ASA CAC GGC CGG GCA TAC ATT CCC ATC TCC AAA GTC AAA 7B7
Val Phe Arg Arg His Gly Arg Ala Tyr íle P SO Zle Ser Lyt Val Lyt
315 320 225
GAC GTG TAT GTG ATA ACA GAT CAG ATC CCT ATA TTC GTC ACC ATC TAC $35
Asp Val Tyr Val Zle Thr Asp Gin Zle Pro Zle Phe Val Thr Met Tyv
330 235 240
CAS AAO AAT OAC CGG AAC TCT TCT GAT GAA ACC TTC CTC JUSA GAC CTC • 83
Gin Lys Asn Asp Arg Aan Ser Sar Asp Glu Thr Phe Lau Arg Asp Lau
24S 3S0 255
CCC Ä- TCC TTC GAT GTC CTC ATT CAC GAT CCC . ACT CAT ’ TTC < CTC AAC 931
Pro Zle : Phe Phe Asp Val Leu Zle »1« Asp Pro sar Hl· Phe : Leu Asn
260 265 270 275 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 572 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 5:
Met 1 Glu Ser ' Leu Cys Gly Val Lau Val Phe Leu Leu Lau S 10 XI» kla 15 Gly
Lau Pro Leu Gin 20 Ala Ala Lys Arg Phe Arg 25 ASp val Leu Gly 30 His Glu
Gin Tyr Pro 35 ÄSf His Met Arg Glu 40 Asn Asn Gin Leu Arg 45 Gly Trp Ser
Ser Asp 50 GlU Asn GlU Trp Asp 55 Glu Gin Leu Tyr Pro 60 Val Trp Arg Arg
Gly Glu 31y Arg Trp Lye Asp Ser Trp Glu Gly Gly A-rS Val Gin Ala
€5 70 7S 80
Ala Ku Thr Ser Aap Ser Pro Ala Ku Val Gly Ser Asn íle Thr Phe
65 90 95
Val Val Asn Leu val Phe Pro Arg Cya Gin Lys Glu Asp Ala Asn Gly
100 103 110
Asr. Xle Val Tyr Glu Arg Asn CyB Arg Ser Asp Leu Glu Leu Ala Ser
115 120 12 5
Asp Pro Tyr Val Tyr Asn Trp Thr Thr Gly Ala Aap Asp Glu Asp Trp
130 13S 1*0
Glu Asp Ser Thr Ser Gla Gly Gin Bis Ku Arg Phe Pro Asp Gly Lys
1*5 150 135 160
Pro Phe Pro Arg Pro His Gly Arg Lye Lys Trp Asn Phe Val Tyr Val
165 170 175
Phe Μ1» Thr Ku Gly Gin Tyr Phe Gin Lys Leu GLy Arg Cys Ser Ala
180 185 190
Arg Val Ser 11« Asn Thr Val Asr. Ku Thr Val Gly Pro Gin Val Met
195 200 20S
Glu Val íle Val Phe Axg Arg Hla Gly Arg Ala Tyr íle Pro íle S«r
210 215 220
GCGGCCGCGT CGACGAAGCT GGGAACTCAG GGGCTGCTTC TGTGGGOkK CTTCCCTGTC60
CTTTGGAAGG CA2AGAGCTC TCÄGCTGC1C GGAACTAACi G1GCTCTGAA GCCffITATAT120
GTG3TCTTCT CTCATTTCCÄ GCAGAGCAGG CTCATATGAA TCAACCAACT GGGTGAAAÄG110
ATAAGTÍGCA ATCTGAGACT TAMACCTGA KAGATACCA TCTGCTMÄG GCTACCAACT1*0
AGCCTGTCTC CTCATTTTCC TľCUSGCTGA TOCCATA ATG CA CCT GA GTC GTC195
Met lis Pro Gla Val Val
1s
Lys Val Ly« Αβρ Val Tyr Val 11« Thr Asp Gin íle Pro íle Phe val
225 230 235 240
Thr Met Tyr Gin Lys λ»η Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Ku
2*5 250 25S
Arg Asp Leu Pro Íle Phe Phe Asp Val Leu íle HÍB Asp Pro Set MÍS
260 265 270
Phe Ku Asn Tyr Ser Xle íle Ser Tyr Lys Trp Asn Phe Gly Asp Asn
275 280 285
Thr Gly Ku Phe Val Ser Asn Asn His Thr Ku Xen Hla Thr Tyr Val
290 295 300
ATC TTA AGC CIC ATC CTA ατ CTG GCA GAT TCT G“A GCT GG” TCT G” 3*3
íle Uu Ser Leu :le 14U Bil Leu Ala Asp Ser Vil Ala Gly Ser Vil
10 15 20
AAG GTT GCT GGA GAG GCA MT CCA TCT GTC ACA CCA CCC TOC CAC TAC 391
Lyj Val Gly Gly Glu Ala Gly PZO sk Vil Thr Leu Pro cyi HAS Tyr
2S 30 3$
AGT «I MT GTC ACA TCA ATG TGC TGG AAT AGA GGC TCA TC TCT CIA *39
Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Acn Arg Gly S«r Cye Ser Leu
40 *5 50
TTC ACA TGC CAA AAT SK ATT GTC ΤΦ3 ACC AAT GGA ACC CAC GTC ACC 48’
Phe Thr Cys Gin Asn Gly íle val Trp Thr Asn Gly Thr Hit Vil Thr
55 60 65 70
?A“ CM AA0 GAC ACA CGC TA? AAG CTA TTC GGG GAC CTT TCA ACA AM 53í
Tyr Arg Lys ASP Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly As; Leu Se: Arg Arg
75 80 15
WT CTC TCT CTG KC CU AAT ACA sc: CTC TCT CAC ACT GGC CTA 55J
Asp Val ser Leu Thr 11« Glu A«o Thr Ala Val Ser Asp Ser Gly Val
90 95 100
TAT TGT TGC CGT GTT GAG CAC CGT 9GG TCG TTC AAT GAC AK AAA ATC 631
Tyr. cy· cy· Arg val Glu HiS Arg Gly Trp Pite Asn Aig Met ty« íle
105 110 115
ACC GTA TCA CTG GAG AT? CTG
Thr Val Ser Ku Glu íle Val
120 125
CCA CCC AAG GTC XCÚ ACT ACT CCA ATT Pro Pro Lye Val Thr Thr Thr Pro íle 130 «79
GTC AGA ACT GTT CCA ACC CTC ACG ACT GTT
Val Thr Thr Val
KU Asn Gly Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val Gin Thr Ala val Pio
305 310 315 32C
Gly Pre Cys Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Se· Pre
325 330 335
Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ser Pro Thr Ku Ser Thr Pre Ser Pro Ser
340 3*3 350
Ku Met Pro Thr Gly Kí s Lys Ser Met Glu Ku Ser Asp Zle Ser Asn
3S5 360 36 5
Glu Asn Cy. Arg Σ1* Asn teg τγχ Gly Tyr Phe Arg Ala Thr Zle Thr
370 375 380
íle Val Asp Gly íle Leu Glu Val Asn íle íle Gin Val Ala Mp Val
365 390 393 400
Pro íle Pro Thr Pro Gin Pro Asp Asn Sex Leu Met Asp Phe íle Val
405 *10 415
Thr cye Lys □ly Ala Thr Pro Thr Glu Ala Cys Thr Zle íle Ser X?
420 *25 430
Pro Thr cys Gin íle Ala Gin Asn Arg Val Cys Sex Pro Val Ala Val
*15 440 445
Asp Glu Ku Cy» Leu Leu Ser Val Arg Arg Ala Phe Asn Gly Ser Gly
*so 495 460
Thr Tyr cys val Asn Phe Thr Leu Gly Asp ASp Ale Ser Leu Ala Leu
465 *70 475 480
Thr Ser Ala Ku íle Ser íle Pro Gly Lys A»P Ku Gly Ser Pro Leu
*05 *90 *95
13S
Pro Thr Val Thr Thr Val
CGA ACG AGC ACC ACT GTT
Arg Thr Ser Thr Thr Val 1*5 150
CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCA ACG Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr
1S5
ACA ACT GTT CCA ACA ACA ATG AGC Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Ser
160
165
ATT CCA ACG ACA ACG ACT CTT CM ACG XCA ATG ACT GTT TCA ACG ACA íle Pro Thr Thr Thr Thr val Pro Thr Thr Met Thr Val Ser Thr Thr
175 iíc
77®
823
Ärg Thr Val Asn Gly Val L®u íle Ser íle Gly Qyt Ku Ala Het. Phe 500 50S510
Val Thr Met Val Thr II· Ku Ku Tyr Lye Lys Hla Lye Thr Tyr Lys S15 520525
Pra íle Gly Asn Cya Thr Arg Asn Val Val Lys Gly Lye Gly Leu Ser 550 5355*0
ACG AGC GCT CCA ACC ACA ACG AGC ACT CCA ACA ACA ACA ACT GCT CCA 871
Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr S*r íle Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro
18 5 LJO l»i
CTG ACA ACA ACG GTC TCT ACC T7? 6TT CCT CCA ATC CCT TTC CCC AGG 919
Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe val Pro Pre Met Pre L«U pro Arg
200 20S 210
CAG AAC CAT GAA CCA GTA GCC ACT TCA CCA TCT TCA CCT CAG CCA GCA 967
Gin Asn His Glu Pro Val Ala Thx Ser Pro Ser Ser 5ro Gin Pro. Ala
215 220 225 230
GAA ACC CAC CCT ACG ACA CTG CAG GGA GCA ATA AGG AGA GAA CCC ACC 1015
Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gin Gly Ala íle Arg Arg Glu Pro Thr
23S 2*0 2*5
AGC TCA CCA TCG TAC TCT TAC ACA ACA GAT GGG AAT GAG ACC CTG ACA 1053
Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr
2S0 25: 260
GAG TCT TCA GAT GGC CTT TCG AAT AAC AA? CAA ACT CAA CTG CTC CTA 1111
Glu Ser Ser Aap Gly Leu Trp Asn Asn Asn Gin Thr Gin Leu Phe Leu
263 270 275
GAA CA? AG7 CTA CTC ACG GCC AAT ACC ACT XAA GGA ATC TAT GCT GGA 1159
Glu His Ser Leu Leu Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly íle Tyr Ala Gly
290 285 290
GTC TGT ATT TCT CTC TTG CTG CTT CTT GCT CTT TTG GGT GTC ATC ATT 1207
Val Cye íle Ser Val Leu Val Leu Leu Ala Ku Ku Gly Val íle íle
295 3 00 305 310
ccc AAA AAG TAT TTC TTC AAA AAG GAG σττ CAA CAA CTA AGA CCC 1 CAT 125 5
Ala Lys Lye Tyr Phe Phe Ly· Lye Glu val Gin Gin Ku Arg Pre i Bas
315 320 325
1309
Val Phe Ku ser His
5*5
Ala Lye Ala Pro
5S0
Phe Ser Arg Gly Asp Arg 555
Glu
560
Lye Aap Pro Leu Ku Gin Asp Lys Pro S6S
Trp STO
Met Ku
ΑΛΑ TCC TGT ATA CAT CAA AGA GAA TASTCCCTGG AAACATAGCA AATGAACTTC Lys Ser Cys 11« His Gin Arg Glu
330 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 6:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 1795 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristické črty:
(A) meno/klúč: CDS (B) umiestnenie: 278 až 1279 (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 6:
TATCTTGGCC ATCACWJCTG TCCAQÄAGAG GGGAATCTGT CTTAAAAACC AGCAAATCCA 1269 ACGTSAGACT TCATTTGGAA GCATTtSTATG ATTATCTCTT OTTTCTATCT TATACTTCCA 1*29 AATGTTGCAT TTCCTATGTT TTCCAAAGCT TTCÄAATCGT GGGTTTTTAT TTCCTCCSTG 1*89
GGGAAACAAA GTCAGTCTAA CTCACAGGTT TAGCTGTTTT CTCATXACTC TGGAAATCTG 15*9 XTCCATTAAC TACTCGATCT CTtMXTTGGC GTAGCTGTTT TACCAGTľAA AfiXGCCTACA 1609
ATACTATGGA ACACATAGAC ACCAG3GGAA GAAAATCATT TGCCAG3TGA TTTÄACATAT 1669 TTATGCÄATT ΓΤΤΓΤΓΤΤΤΓ TtTTTGAOAT GGAGCTTTGC TCTTGTTGCC CAGGCTGGAG 1729 TGCGATGGTG AAATCTCGGC TCACTGTÄAC CTCCACCTTC CGGGTTCAAG CAATTCTCCC 1769
GTCGAC
1795 (1) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 7:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 334 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 7:
Met His Pro Gin Val val íle Leu Ser Leu íle Leu His Leu Ala Asp
1 S 10 LS
Ser Val Ui Gly Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val
20 25 30
Thr Leu Pro Cy» Kia Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cye Trp Asn
35 40 45
Arg Gly Ser Cys Ser Leu Phe Thr Cya Gin Asn Gly íle Val Trp Thr
SO 55 SO
Asn Gly Thr Hla Val Thr Tyr Arg Lya Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu
«5 70 75 90
Gly Ajp Leu Ser Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr íle Glu Asn Thr Ala
ÍS to 95
Vel Set Mp Ser Gly V*1 Tyr Cy. Cy. Val Glu His Arg Gly Trp
100 105 110
Phe Kín Mp Met Lya íle Thr Val Ser Leu Glu 11« Val Pro Pro Lye
115 120 12S
Val Thr Thr Thr Pro 11« Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val
130 135 140
Arg Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr
145 150 155 150
Val Pre Thr Thr Met Ser n· Pre Thr Thr Thr Thr Val Pre Thr Thr
1SS 170 175
Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser íle Pro
180 185 190
Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro
195 200 2G5
Pre Met Pro Leu Pre Arg Gla Asr. His Glu Pro Val Ala Thr Ser Pro
210 215 220
Ser Ser Pro Gla Pre Ala Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gin Gly Ala
225 230 23$ 240
íle Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr ASp
24 5 2SC 253
Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn
250 255 270
Gin Thr Gla Leu Phe Leu G1U Η1» Ser Leu Leu Thr Al* Asa Thr Thr
27S 260 285
Lys Gly íle Tyr Ala Gly Val Cy» íle Ser Val Leu Val Leu Leu Ala
29C 29S 300
Leu Leu Gly val íle íle Ala Lya Lys Tyr Phe Phe Lye Ly» Glu Val
30S 310 315 220
Gin Glr. Leu Arg Prs His Lys Ser Cys íle Bi» Gin . Arg Glu
32S 330

Claims (26)

1. Izolovaný polypetid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 90 % identická so sekvenciou SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 alebo SEQ ID NO: 7, a ktorý je molekulou spojenou s poškodením obličiek (KIM), pričom uvedená KIM je bunkovým povrchovým proteínom selektívne exprimovaným v post-ischemickom tkanive obličiek cicavcov.
2. Polypetid podľa nároku 1, kde aminokyselinová sekvencia je aspoň na 95 % identická so sekvenciou SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 alebo SEQ ID NO: 7, a ktorý je molekulou spojenou s poškodením obličiek (KIM), pričom uvedená KIM je bunkovým povrchovým proteínom selektívne exprimovaným v post-ischemickom tkanive obličiek cicavcov.
3. Polypetid podľa nároku 1, ktorý obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 alebo SEQ ID NO: 7.
4. Polypetid podľa nároku 1, pozostávajúci zo sekvencie SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 alebo SEQ ID NO: 7.
5. Izolovaný polypeptid obsahujúci rozpustný variant polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 4.
6. Fúzny protein obsahujúci polypeptid podľa nároku 5 a Fc oblasť imunoglobulínu.
7. Fúzny protein obsahujúci extracelulárnu doménu polypetidu podľa niektorého z nárokov 1 až 4 aFc oblasť imunoglobulínu.
8. Izolovaná nukleová kyselina kódujúca polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 4.
9. Nukleová kyselina kódujúca fúzny protein podľa nároku 6 alebo 7.
10. Nukleová kyselina podľa nároku 8, ktorá obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 alebo SEQ ID NO: 6.
11. Izolovaná nukleová kyselina, ktorá hybridizuje pri stringentných podmienkach so sekvenciou SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 alebo SEQ ID NO: 6 a ktorá kóduje molekulu spojenú s poškodením obličiek (KIM), pričom uvedená KIM je bunkovým povrchovým proteínom selektívne exprimovaným v post-ischemickom tkanive obličiek cicavcov, kde podmienky hybridizácie zahrnujú premytie v 2 x SSC pri 55 °C a finálne premytie v 0,5 x SSC pri 55 °C.
12. Vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa niektorého z nárokov 8 až 11.
13. Hostiteľská bunka obsahujúca vektor podľa nároku 12.
14. Spôsob prípravy polypeptidu, vyznačujúci sa t ý m , že zahrnuje kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 13 v kultivačnom médiu; a izoláciu polypeptidu exprimovaného z vektora v hostiteľskej bunke.
15. Protilátka, ktorá sa viaže na polypeptid podľa nároku 4.
16. Protilátka podľa nároku 15, ktorá je konjugovaná s toxínom alebo rádionuklidom.
17. Protilátka podľa nároku 15, ktorou je monoklonálna protilátka.
18. Protilátka podľa nároku 15, ktorou je humanizovaná protilátka, ľudská protilátka, protilátka s jedným reťazcom, Fab fragment alebo chiméma protilátka.
19. Hybridom, ktorý produkuje protilátku podľa nároku 15.
20. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje (i) polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 5, fúzny protein podľa nároku 6 alebo 7 alebo protilátku podľa niektorého z nárokov 15 až 18, a (ii) farmakologicky prijateľný nosič.
21. Použitie polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 5, fúzneho proteínu podľa nároku 6 alebo 7, alebo protilátky podľa niektorého z nárokov 15 až 18 na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie poškodenia alebo choroby obličiek u pacienta postihnutého poškodením alebo chorobou obličiek.
22. Použitie polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 5, fúzneho proteínu podľa nároku 6 alebo 7, alebo protilátky podľa niektorého z nárokov 15 až 18 na prípravu diagnostickej kompozície na zhodnotenie prítomnosti alebo priebehu poškodenia alebo choroby obličiek u pacienta postihnutého poškodením alebo chorobou obličiek.
23. Použitie podľa nároku 21 alebo 22, kde pacientom je človek.
24. Použitie protilátky podľa niektorého z nárokov 15 až 18, na prípravu kompozície na zobrazovanie buniek alebo tkanív exprimujúcich polypeptid podľa nároku 4.
25. Použitie protilátky podľa nároku 15, na prípravu farmaceutickej kompozície na špecifické nasmerovanie toxínu alebo rádionuklidu do buniek exprimujúcich polypeptid podľa nároku 4.
26. Polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 5, fúzny proteín podľa nároku 6 alebo 7, alebo protilátka podľa niektorého z nárokov 15 až 18 na použitie pri liečbe alebo diagnostikovaní.
SK1609-98A 1996-05-24 1997-05-23 Izolovaný polypeptid KIM, modulátor tkanivovej regenerácie a nukleová kyselina, ktorá ho kóduje, spôsob prípravy polypeptidu a farmaceutická kompozícia obsahujúca polypeptid SK285461B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1822896P 1996-05-24 1996-05-24
US2344296P 1996-08-23 1996-08-23
PCT/US1997/009303 WO1997044460A1 (en) 1996-05-24 1997-05-23 Modulators of tissue regeneration

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK160998A3 SK160998A3 (en) 1999-07-12
SK285461B6 true SK285461B6 (sk) 2007-02-01

Family

ID=26690881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1609-98A SK285461B6 (sk) 1996-05-24 1997-05-23 Izolovaný polypeptid KIM, modulátor tkanivovej regenerácie a nukleová kyselina, ktorá ho kóduje, spôsob prípravy polypeptidu a farmaceutická kompozícia obsahujúca polypeptid

Country Status (27)

Country Link
US (4) US6664385B1 (sk)
EP (2) EP0907735B9 (sk)
JP (3) JP4602482B2 (sk)
CN (1) CN1147584C (sk)
AT (1) ATE318903T1 (sk)
AU (1) AU712289B2 (sk)
BG (1) BG64678B1 (sk)
BR (1) BR9709115A (sk)
CA (1) CA2257851C (sk)
CZ (1) CZ295936B6 (sk)
DE (1) DE69735364T3 (sk)
DK (1) DK0907735T5 (sk)
EA (1) EA004402B1 (sk)
EE (1) EE04817B1 (sk)
ES (1) ES2258793T5 (sk)
HK (1) HK1021746A1 (sk)
HU (1) HU226205B1 (sk)
IL (1) IL127162A (sk)
IS (1) IS2636B (sk)
NO (2) NO327597B1 (sk)
NZ (1) NZ336467A (sk)
PL (1) PL188826B1 (sk)
PT (1) PT907735E (sk)
SI (1) SI0907735T2 (sk)
SK (1) SK285461B6 (sk)
TR (1) TR199802421T2 (sk)
WO (1) WO1997044460A1 (sk)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2257851C (en) * 1996-05-24 2011-11-15 Biogen, Inc. Modulators of tissue regeneration
JP2002516572A (ja) * 1997-05-23 2002-06-04 バイオジェン，インコーポレイテッド 組織の再生の調節
CA2487328A1 (en) 1998-03-20 1999-09-30 Benitec Australia Ltd. Sirna for control of gene expression
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1160321A1 (en) * 2000-05-31 2001-12-05 Sanofi-Synthelabo Kidney Injury Novel Gene-1: Isolation and therapeutic applications
EP1305409B1 (en) * 2000-06-16 2009-03-11 Biogen Idec MA Inc. Renal regulatory elements and methods of use thereof
US6812002B2 (en) * 2000-08-30 2004-11-02 Pfizer Inc. Osteoactivin protein and nucleic acids encoding the same, compositions and methods of stimulating bone differentiation
CA2448427C (en) * 2001-06-01 2013-09-24 Biogen, Inc. Molecules and methods for inhibiting shedding of kim-1
NZ530451A (en) 2001-06-29 2008-04-30 Univ Leland Stanford Junior TIM gene sequences and their use in immunological disorders and cancer
US8709412B2 (en) 2001-06-29 2014-04-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modulation of TIM receptor activity in combination with cytoreductive therapy
US20050014687A1 (en) * 2002-03-19 2005-01-20 Anderson David W. Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
JP4689275B2 (ja) 2002-12-30 2011-05-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｋｉｍ−１アンタゴニストおよび免疫系を調節するための使用
EP3000886A1 (en) * 2003-03-19 2016-03-30 Amgen Fremont Inc. Antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen and uses thereof
AU2004225472B2 (en) * 2003-03-27 2011-02-10 Children's Hospital Medical Center A method and kit for detecting the early onset of renal tubular cell injury
US20050272101A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-08 Prasad Devarajan Method for the early detection of renal injury
CA2565701A1 (en) 2004-05-06 2005-11-17 Jonathan M. Barasch Ngal for reduction and amelioration of ischemic and nephrotoxic injuries
RU2283666C9 (ru) * 2004-05-14 2007-03-10 Бизяев Алексей Вячеславович Средство для активации восстановления структуры и функции поврежденных тканей и органов
US20060003345A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 Pfizer Inc RNA bioassay
DK1831699T3 (da) * 2004-12-20 2010-03-15 Antibodyshop As Bestemmelse af neutrofil gelatine-associeret lipocalin (NGAL) som en diagnostisk markør for nyresygdomme
KR101213894B1 (ko) 2005-03-02 2012-12-20 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｔｈ2 매개성 병태를 치료하기 위한 ｋｉｍ-1 항체
US20070037232A1 (en) * 2005-03-31 2007-02-15 Barasch Jonathan M Detection of NGAL in chronic renal disease
US20080090304A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Barasch Jonathan Matthew Diagnosis and monitoring of chronic renal disease using ngal
CA2629453C (en) 2005-11-10 2018-03-06 Curagen Corporation Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen
ATE539351T1 (de) 2006-05-30 2012-01-15 Antibodyshop As Verfahren zur schnellen beurteilung der schwere eines traumas
JP2010500535A (ja) * 2006-08-07 2010-01-07 アンチボディショップ・アクティーゼルスカブ 重大な腎損傷を除外するための診断検査
WO2008113363A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-25 Bioporto Diagnostics A/S Diagnostic test for renal injury
US8846036B2 (en) 2007-10-19 2014-09-30 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian NGAL and uses thereof
US20090297479A1 (en) * 2008-03-28 2009-12-03 Kiyoshi Ariizumi Dc-hil conjugates for treatment of t-cell disorders
MX2011002233A (es) * 2008-08-28 2011-09-27 Astute Medical Inc Metodos y composiciones para la diagnosis y prognosis de daño renal y falla renal.
WO2010025434A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
NZ628843A (en) 2008-10-21 2016-02-26 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2010048347A2 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
BRPI0922021A2 (pt) 2008-11-10 2019-09-24 Astute Medical Inc método para avaliar a condição renal em um indivíduo, e, uso de um ou mais marcadores de lesão renal
ES2528799T3 (es) * 2008-11-22 2015-02-12 Astute Medical, Inc. Métodos para el pronóstico de insuficiencia renal aguda
PT2391653E (pt) * 2009-01-28 2015-02-13 Ind Tech Res Inst Biomarcadores associados a nefropatia
WO2011017654A1 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US9229010B2 (en) 2009-02-06 2016-01-05 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
AU2010279302B2 (en) * 2009-08-07 2015-06-18 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US10324093B2 (en) 2009-11-07 2019-06-18 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CA2784889C (en) 2009-12-20 2018-06-19 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
SI2666872T1 (sl) 2010-02-05 2016-08-31 Astute Medical, Inc. Postopki in sestavki za diagnozo in prognozo ledvične poškodbe in odpovedi ledvic
NZ602056A (en) 2010-02-26 2014-11-28 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2011149962A1 (en) 2010-05-24 2011-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant ngal proteins and uses thereof
WO2011162821A1 (en) 2010-06-23 2011-12-29 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US20130203074A1 (en) 2010-06-23 2013-08-08 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2012108830A1 (en) * 2011-02-09 2012-08-16 Lavivo Ab Synbiotic compositions for restoration and reconstitution of gut microbiota
EP2788759B1 (en) 2011-12-08 2019-02-20 Astute Medical, Inc. Methods and uses for diagnosis of renal injury and renal failure
EP2925337B1 (en) 2012-11-21 2019-07-03 The Trustees of Columbia University in the City of New York Mutant ngal proteins and uses thereof
CN105074466B (zh) 2013-01-17 2018-01-09 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
US10420337B2 (en) 2013-03-15 2019-09-24 Lifeline Scientific, Inc. Transporter with a glucose sensor for determining viability of an organ or tissue
US10265424B2 (en) * 2014-03-04 2019-04-23 Trust-Biosonics, Inc. Molecular imaging contrast agents and uses thereof
WO2017214203A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Astute Medical, Inc. Management of acute kidney injury using insulin-like growth factor-binding protein 7 and tissue inhibitor of metalloproteinase 2

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2003A (en) * 1841-03-12 Improvement in horizontal windivhlls
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB9122820D0 (en) * 1991-10-28 1991-12-11 Wellcome Found Stabilised antibodies
WO1993022332A2 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
WO1995021922A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Abbott Laboratories Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
US5622861A (en) * 1994-08-05 1997-04-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA encoding hepatitis A virus receptor
AU700913B2 (en) * 1994-08-18 1999-01-14 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Unique associated kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof
US6069230A (en) * 1994-11-10 2000-05-30 Promega Corporation High level expression and facile purification of proteins, peptides and conjugates for immunization, purification and detection applications
US6066322A (en) * 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
CA2257851C (en) * 1996-05-24 2011-11-15 Biogen, Inc. Modulators of tissue regeneration
EP1305409B1 (en) * 2000-06-16 2009-03-11 Biogen Idec MA Inc. Renal regulatory elements and methods of use thereof
CA2448427C (en) * 2001-06-01 2013-09-24 Biogen, Inc. Molecules and methods for inhibiting shedding of kim-1
NZ530451A (en) * 2001-06-29 2008-04-30 Univ Leland Stanford Junior TIM gene sequences and their use in immunological disorders and cancer
US7838220B2 (en) * 2001-06-29 2010-11-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes associated with immune disease
US7215871B2 (en) * 2001-07-27 2007-05-08 Thomson Licensing Changing a playback speed for video presentation recorded in a field structure format
US7687454B2 (en) * 2001-12-03 2010-03-30 The University Of British Columbia Effectors of innate immunity determination
AU2003303082B2 (en) * 2002-01-30 2009-07-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods related to TIM-3, a Th1-specific cell surface molecule
US20050014687A1 (en) * 2002-03-19 2005-01-20 Anderson David W. Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
JP4689275B2 (ja) * 2002-12-30 2011-05-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｋｉｍ−１アンタゴニストおよび免疫系を調節するための使用
TW200539890A (en) * 2004-03-12 2005-12-16 Brigham & Womens Hospital Methods of modulating immune responses by modulating tim-1, tim-2 and tim-4 function
KR20070037570A (ko) * 2004-03-24 2007-04-05 텔로스 파마슈티칼스 인코포레이티드 백신에 대한 면역반응을 향상시키는 보강제로서의 조성물및 이의 사용 방법

Also Published As

Publication number Publication date
SI0907735T1 (sl) 2006-08-31
CA2257851A1 (en) 1997-11-27
BR9709115A (pt) 1999-08-03
CA2257851C (en) 2011-11-15
DE69735364T3 (de) 2010-05-06
AU712289B2 (en) 1999-11-04
CN1223685A (zh) 1999-07-21
NO327597B1 (no) 2009-08-31
AU3567697A (en) 1997-12-09
NO20090945L (no) 1999-01-25
CZ381398A3 (cs) 1999-05-12
BG102967A (bg) 2000-05-31
EA004402B1 (ru) 2004-04-29
HU226205B1 (en) 2008-06-30
BG64678B1 (bg) 2005-11-30
EE9800409A (et) 1999-06-15
EE04817B1 (et) 2007-04-16
DK0907735T5 (da) 2010-06-14
EP0907735B2 (en) 2009-10-07
SK160998A3 (en) 1999-07-12
WO1997044460A1 (en) 1997-11-27
NO985427L (no) 1999-01-25
ES2258793T3 (es) 2006-09-01
EA199801044A1 (ru) 1999-04-29
IL127162A0 (en) 1999-09-22
SI0907735T2 (sl) 2010-01-29
EP1655367A1 (en) 2006-05-10
NZ336467A (en) 2000-10-27
US20070141590A1 (en) 2007-06-21
JP2001505761A (ja) 2001-05-08
IL127162A (en) 2007-07-24
US20050089868A1 (en) 2005-04-28
DE69735364D1 (de) 2006-04-27
IS4902A (is) 1998-11-20
PL188826B1 (pl) 2005-04-29
EP0907735B1 (en) 2006-03-01
EP0907735B9 (en) 2010-05-19
US6664385B1 (en) 2003-12-16
ATE318903T1 (de) 2006-03-15
HUP9902770A3 (en) 2001-09-28
JP2009039111A (ja) 2009-02-26
CN1147584C (zh) 2004-04-28
TR199802421T2 (xx) 1999-02-22
ES2258793T5 (es) 2010-01-25
HK1021746A1 (en) 2000-06-30
CZ295936B6 (cs) 2005-12-14
DK0907735T4 (da) 2009-12-21
JP2008067701A (ja) 2008-03-27
DK0907735T3 (da) 2006-06-26
PL330313A1 (en) 1999-05-10
JP4602482B2 (ja) 2010-12-22
HUP9902770A2 (hu) 1999-12-28
EP0907735A1 (en) 1999-04-14
PT907735E (pt) 2006-06-30
NO985427D0 (no) 1998-11-20
DE69735364T2 (de) 2006-11-30
JP4316640B2 (ja) 2009-08-19
IS2636B (is) 2010-06-15
US20060286031A1 (en) 2006-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK285461B6 (sk) Izolovaný polypeptid KIM, modulátor tkanivovej regenerácie a nukleová kyselina, ktorá ho kóduje, spôsob prípravy polypeptidu a farmaceutická kompozícia obsahujúca polypeptid
EP0914339B1 (en) RET LIGAND 3 (RetL3) FOR STIMULATING NEURAL AND RENAL GROWTH
US6861509B1 (en) Antibodies to Ret and RetL3
WO2001016169A2 (en) RET LIGAND 5 (Retl5) FROM HUMAN AND MOUSE
KR100498530B1 (ko) 조직재생조절물질
KR100554901B1 (ko) 신경및신장증식을자극하기위한RET리간드(RetL)
MXPA98009812A (en) Modulators of the regeneration of the tej

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Expiry of patent

Expiry date: 20170523