JP2001505761A - 組織再生のモジュレーター - Google Patents

組織再生のモジュレーター

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Abstract

(57)【要約】 損傷されたまたは再生中の組織においてアップレギュレートされるタンパク質、およびこれらのタンパク質をコードするDNA、ならびに治療的組成物、およびこれらの組成物を包含する処置の方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 組織再生のモジュレーター 発明の分野 本発明は、損傷されたまたは再生中の組織においてアップレギュレートされる タンパク質、およびこれらのタンパク質をコードするDNAに関する。本発明はさ らに、治療的組成物、およびこれらのタンパク質を包含する処置方法に関する。 発明の背景 組織構造の動力学的再造形は、発達の間および損傷後の組織修復の間に生じる 。 このプロセスを研究するために、本発明者らは、虚血−再灌流傷害により引き起 こされる腎臓損傷のモデルに注目した。 腎臓は、近位細管上皮に対する損傷を、細胞死、生存近位細管上皮細胞の増殖 、露出された基底膜の上のあまり分化していない再生性上皮の形成、および完全 に機能性の近位細管上皮細胞を形成する再生性上皮の分化を含む複雑な一連の事 象を介して修復し得る（Wallinら、Lab．Invest．66:474-484，1992；Witzgall ら、Mol．Cell．Biol．13:1933-1942，1994；Ichimuraら、Am．J．Physiol．269 :F653-662，1995；Thadhaniら、N．Engl．J．Med．334:1448-1460，1996）。IGF 、EGF、およびHGFのような増殖因子は、内皮細胞接着分子ICAM-1と同様に、この 修復のプロセスに関連付けられている。しかし、それによって細管上皮細胞が復 元される機構はなお理解されていない。 細管上皮の損傷および修復のプロセスに関与する分子を同定するために、本発 明者らは、損傷／再生腎臓と、正常腎臓との間のmRNA集団における差異を、呈示 差異分析（reprensentational difference analysis）（RDA）を使用して分析し た。RDAは、反復するサブトラクションおよび増幅により標的組織または細胞特 異的cDNAフラグメントを生じる、サブトラクションのためのPCRに基づく方法で ある（HubankおよびSchutz，Nucl．Acids Res．22:5640-5648，1994）。発明の要旨 本発明は、一般に、腎臓損傷関連分子（Kidney Injury-related Molecule）（ その各々が以下で「KIM」と呼ばれる）を提供する。これは、腎臓に対する損傷 後に腎臓組織においてアップレギュレートされる。本発明のKIMタンパク質およ びペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにそれ らの対応物は、種々の治療介入において有用である。 本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、または配列番号６に記載さ れるヌクレオチド配列を有する精製および単離されたDNA分子を提供する。本発 明はまた、これらの配列の相補鎖、上記DNA分子にストリンジェントな条件下で ハイブリダイズするDNA分子、および遺伝子コードの縮重がなければ、任意の上 記で定義されるDNA分子にハイブリダイズするDNA分子を包含する。これらのDNA 分子は組換え体であり得、そして発現制御配列に作動可能に連結され得る。 本発明はさらに、配列番号１、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６ に記載されるヌクレオチド配列を有する精製および単離されたDNA分子、または 上記で定義される他のDNA分子の１つを含むベクターを提供する。このベクター は、生物学的に機能性のプラスミドまたはウイルスDNAベクターであり得る。本 発明の１つの実施態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、または配列番 号６のDNA分子を含むベクターにより安定に形質転換またはトランスフェクトさ れた原核生物または真核生物宿主細胞を提供する。本発明の別の実施態様におい て、上記のようなDNA分子によりコードされるKIMポリペプチド産物の産生のため のプロセスが提供され；このプロセスは、適切な培養条件下で、DNA分子で形質 転換またはトランスフェクトされた原核生物または真核生物宿主細胞を、DNA分 子の発現を可能にする様式で増殖させること、およびこの発現のポリペプチド産 物を回収することを含む。 詳細には、実質的に他のヒトタンパク質を含まない精製および単離されたヒト KIMタンパク質は、KIMタンパク質の一次構造コンホメーションおよび生物学的活 性の一部または全部を有するポリペプチド産物の産生のためのプロセスと同様に 、本発明の範囲内である。本発明のKIMタンパク質は、配列番号３、配列番号５ 、もしくは配列番号７を含むアミノ酸配列を有し得るか；または配列番号３、配 列 番号５、もしくは配列番号７の改変体であり得るか；または配列番号１、配列番 号２、配列番号４、もしくは配列番号６のDNAによりコードされる精製もしくは 単離されたタンパク質であり得る。これらのタンパク質は、実質的に他のヒトタ ンパク質を含まないで提供され得る。本発明はさらに、これらのタンパク質の改 変体（例えば、可溶性改変体または融合タンパク質）を包含する。本発明のKIM 融合タンパク質は、免疫グロブリン、毒素、造影可能化合物、または放射性核種 を含み得る。 本発明はまた、上記のKIMタンパク質に対する特異的モノクローナル抗体を提 供する。抗KIM抗体は、毒素、造影可能化合物、または放射性核種と結合され得 る。そのような特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞株がさらに教示される 。 薬学的組成物もまた、本発明の範囲内である。本発明の薬学的組成物は、治療 有効量の本発明のKIMタンパク質または抗KIM抗体を、薬理学的に受容可能なキャ リアとともに含み得る。 腎臓疾患を有するか、または腎臓疾患を発生する危険にある患者の尿、血清、 または尿沈渣におけるKIMの濃度を測定することにより、腎臓損傷の存在または 消散の過程を評価することのような診断方法は、本発明の範囲内である。 本発明の処置方法は、患者を、治療有効量のKIM、KIM改変体、KIMアナログ、K IM融合タンパク質、KIMアゴニスト、およびKIMまたはKIMリガンドに対する抗体 で処置する工程を包含する。本発明の他の治療化合物は、KIMリガンド、抗KIM抗 体、およびKIMリガンドの融合タンパク質を包含する。これらの化合物は、KIMの 機能に依存している細胞性応答を刺激するかまたは阻害するかのいずれかの治療 方法において有用であり得る。 本発明のさらなる方法は、細胞を、KIMリガンドの融合タンパク質および毒素 もしくは放射性核種のいずれかと、または毒素もしくは放射性核種に結合された 抗KIM抗体と接触させることにより、KIM発現腫瘍細胞の増殖を阻害する。同様に 、KIMリガンドを発現する腫瘍細胞の増殖は、細胞を、KIMの融合タンパク質およ び毒素もしくは放射性核種のいずれかと、または毒素もしくは放射性核種に結合 された抗KIMリガンド抗体と接触させることにより、阻害され得る。 本発明はまた、遺伝子治療の方法を包含する。これらは、腎臓障害を有する被 験体を処置する方法、被験体における新たな組織の成長を促進する方法、および 被験体における損傷された組織の生存を促進する方法を包含し、被験体に、配列 番号１、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のヌクレオチド配列を含む DNAを含むベクターを投与する工程を包含する。 本発明の化合物はまた、インビトロまたはインビボのいずれかで組織を画像化 するために有用である。そのような方法の１つは、造影可能化合物を、配列番号 ３、配列番号５、または配列番号７のタンパク質を発現する細胞に標的化する工 程を包含し、これは、細胞を、造影可能化合物に融合された、本発明のモノクロ ーナル抗体または上記のようなタンパク質を含む融合タンパク質のいずれかと接 触されることを含む。インビボ方法については、細胞は被験体内にあり、そして タンパク質またはモノクローナル抗体は、被験体に投与される。 本発明はまた、被験体の腎臓細胞における配列番号１、配列番号２、配列番号 ４、または配列番号６のいずれかの発現のレベルを、コントロール腎臓細胞にお けるこの配列の発現のコントロールのレベルと比較する工程を包含する、被験体 における腎臓細胞の損傷または再生を同定する方法のような、診断方法を包含す る。本発明の別の方法は、細胞をアンチセンスプローブと接触させること、およ び細胞内のRNAに対するハイブリダイゼーションを測定することを含む、細胞に おける配列番号１、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のアップレギュ レーションを同定する工程を包含する。 本発明の診断方法のさらなる実施態様は、尿、血清、もしくは他の体液におけ る、または尿沈渣、もしくは組織サンプルにおける本発明の分子の存在または濃 度を評価する工程を包含する。測定される損傷関連分子は、病理学的プロセスの 存在、程度、または過程に相関させられ得る。この相関はまた、治療レジメの効 力を評価するために使用され得る。 図面の簡単な説明 図１は、ラットクローンcDNA3-2のヌクレオチド配列であり、推定タンパク質 リーディングフレームは615〜1535である。 図２は、ラットクローン1-7のcDNA配列のリストであり、推定タンパク質リー ディングフレームは145〜1065である。 図３は、ラットクローン4-7のcDNA配列のリストであり、推定タンパク質リー ディングフレームは107〜1822である。 図４は、ヒトクローンH13-10-85のcDNAおよび推定アミノ酸配列のリストであ り、推定タンパク質リーディングフレームは１〜1002である。リストの上の行は cDNA配列であり（配列番号６）、そして下の行は推定アミノ酸配列である（配列 番号７）。 図５は、ヒトクローンH13-10-85のヌクレオチド配列のラットクローン3-2のヌ クレオチド配列とのBESTFIT比較である。 発明の詳細な説明 本発明者らは、呈示差異分析（RDA）を使用して、再生中の腎臓と正常腎臓と の間のmRNA発現における差異を分析することにより、KIM遺伝子を同定した。RDA は、反復するサブトラクションおよび増幅により標的組織または細胞特異的cDNA フラグメントを生じる、サブトラクションのためのPCRに基づく方法である。虚 血後48時間の成体ラット腎臓RNA由来のcDNA呈示は、正常（疑似手術した）成体 ラット腎臓由来のサンプルを用いてサブトラクトされる。この手順において、虚 血後腎臓サンプルおよび正常腎臓サンプルの両方に共通する配列は除去され、損 傷された腎臓組織においてのみ顕著に発現される配列を残す。そのような遺伝子 は、腎臓障害のために治療的に有益であり得るか、または損傷プロセスに関与し 得るタンパク質をコードする。いくつかのクローンが得られ、配列決定され、そ して特徴付けられた。次いで、クローンは、腎臓修復の間のそれらの発現パター ン、発達、および組織分布について、ノーザン分析およびRNAインサイチュハイ ブリダイゼーションにより研究される。配列番号 本明細書中で言及されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、以下の配列番 号が与えられている： 配列番号１−ラット3-2cDNAインサートのヌクレオチド配列 配列番号２−ラット1-7cDNAインサートのヌクレオチド配列 配列番号３−ラット3-2および1-7cDNAによりコードされるラットKIM-1のアミ ノ酸配列 配列番号４−ラット4-7cDNAインサートのヌクレオチド配列 配列番号５−4-7cDNAインサートによりコードされるアミノ酸配列 配列番号６−ヒトcDNAクローンH13-10-85のヌクレオチド配列 配列番号７−ヒトcDNAクローンH13-10-85によりコードされるアミノ酸配列用語の定義 本明細書中で「KIM」と同義的に用いられる「KIMタンパク質」は、腎臓に対す る損傷後に選択的にアップレギュレートされるmRNAによりコードされるタンパク 質である。目的のKIMタンパク質の１つの群は、腎臓組織に対する損傷を生じる 任意の傷害後１週間以内の任意の時点で選択的にアップレギュレートされるmRNA によりコードされるタンパク質を含む。そのようなアップレギュレーションが同 定され得る時点の例は、傷害後10時間、24時間、48時間、または96時間を含む。 傷害の型の例は、虚血性、毒性、または他の型の損傷を生じる傷害を含む。 「KIMアゴニスト」は、KIMのKIMリガンドとの相互作用により通常引き起こさ れる細胞性応答を特異的に引き起こし得る分子である。KIMアゴニストは、KIM改 変体、またはKIMに対する特異的抗体、またはKIMリガンドの可溶性形態であり得 る。 「KIMアンタゴニスト」は、KIMリガンドまたはKIMと特異的に会合し得、それ によりKIMリガンドへのKIMの結合をブロックするかまたはそうでなければ阻害す る分子である。アンタゴニストの結合は、そうでなければKIMリガンドのKIMまた はKIMアゴニストとの連結により引き起こされる細胞性応答をブロックまたは阻 害する。KIMアンタゴニストの例は、特定のKIM改変体、KIM融合タンパク質、お よびKIMリガンドまたはKIMに対する特異的抗体を含む。 「KIMリガンド」は、KIMタンパク質に非共有結合的に、そして特異的に結合す る任意の分子である。そのようなリガンドは、任意の形態の（天然、組換え生産 、またはそうでなければ合成を含む）、タンパク質、ペプチド、ステロイド、抗 体、 アミノ酸誘導体、または他の型の分子であり得る。KIMリガンドは、任意の形態 （可溶性、膜結合、または免疫グロブリン、脂肪酸、もしくは他の部分との融合 構築物の一部）であり得る。KIMリガンドは、インテグリンであり得る。膜結合K IMリガンドは、KIMに結合または会合される場合に、細胞性応答を引き起こすレ セプターとして作用し得る。いくつかの相互作用において、KIMは、１つより多 いKIMリガンドと会合し得るか、または１つ以上の他の分子もしくは補因子との 複合体の一部としてのKIMリガンドと会合し得る。KIMおよびKIMリガンドの両方 が細胞膜に結合されている状況において、KIMは、KIMと同じ細胞に結合している KIMリガンドと会合および反応し得るか、またはそれは第２の細胞に結合してい るKIMリガンドと会合および反応し得る。KIM連結が異なる細胞に結合している分 子間で生じる場合、２つの細胞は、細胞型もしくは起源、表現型もしくは代謝条 件、または所定の刺激に対する細胞性応答（例えば、増殖、分化、もしくはアポ トーシス）の型もしくは程度に関して同一であり得るか、または異なり得る。「 KIM連結」は、KIMのKIMリガンドとの接触および結合をいう。 「配列のアラインメント」によって、一方の関連する部分の配列の、他方の関 連する部分の配列との比較を可能にする、１つの配列（ヌクレオチドまたはアミ ノ酸のいずれか）の、別の配列との位置決めが意味される。この手順の１つの方 法の例は、Needlemanら(J.Mol.Biol．48:443-453，1970)において示される。こ の方法は、Alignプログラム(DNAstar，Inc.)のようなコンピュータープログラム により都合良く実行され得る。当業者に理解されるように、相同なまたは機能的 に等価な配列は、保存されたシステイン骨格内のシステイン残基の機能的に等価 な配置を含む。これは、これらのシステインの直線的な配置を変えるが、タンパ ク質の折り畳み構造におけるそれらの関連を実質的に損なわないアミノ酸の挿入 または欠失を含む。それゆえ、候補の配列中の内部ギャップおよびアミノ酸挿入 は、候補と参照配列との間のアミノ酸配列相同性または同一性のレベルを算出す る目的のために無視される。タンパク質の相同性を確立することにおいて頻繁に 使用される１つの特徴は、１つのタンパク質と別のタンパク質との間でのシステ イン残基の数および位置の類似性である。 「アンチセンスDNA」は、転写される染色体DNAの配列をいう。 「アンチセンスプローブ」は、目的の核酸部分に対するアンチセンスDNAの少 なくとも一部を含むプローブである。 「クローニング」によって、ベクター分子中へ特定の遺伝子または他のDNA配 列を挿入するためのインビトロ組換え技術の使用が意味される。所望の遺伝子を 首尾良くクローン化するために、DNAフラグメントを生成するための、フラグメ ントをベクター分子に連結するための、混成DNA分子をそれが複製し得る宿主細 胞中に導入するための、および受容体宿主細胞の中から標的遺伝子を有するクロ ーンを選択するための方法を用いることが必要である。 「cDNA」によって、RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によりRN Aテンプレートから産生される相補性DNAまたはコピーDNAが意味される。従って 、「cDNAクローン」は、クローニングベクター中に有される目的のRNA分子に相 補的な二重鎖DNA配列を意味する。 「cDNAライブラリー」によって、全体の生物または組織（RNAテンプレートの 供給源に依存して）中に存在するmRNA分子の提示を一緒に構成するcDNAインサー トを含む組換えDNA分子の収集物が意味される。そのようなcDNAライブラリーは 、当業者に公知の方法、および例えば、Maniatisら，Molecular Cloning:A Labo ratory Manual（前出）に記載される方法により調製され得る。一般に、RNAは、 最初にそのゲノムから特定の遺伝子をクローン化することが所望される生物の細 胞から単離される。本発明の目的にとって、哺乳動物、そして特にヒトの細胞株 が好ましい。あるいは、RNAは動物の腫瘍、そして好ましくはヒト腫瘍由来の腫 瘍細胞から単離され得る。従って、ライブラリーは、例えば、ヒト副腎腫瘍から 調製され得るが、任意の腫瘍が使用され得る。 本明細書中で使用される用語「DNA多型性」は、二つ以上の異なるヌクレオチ ド配列が、DNA中の特定の部位に存在し得る状態をいう。 「発現ベクター」は、その中に含まれるDNA配列を発現し得る（即ち、コード 配列が、それらの発現をもたらし得る他の配列に作動可能に連結されている）ベ クターを含む。常にはっきりと述べられるわけではないが、これらの発現ベクタ ーが、エピソームとしてまたは染色体DNAの組込み部分としてのいずれかで宿主 生物中で複製されなければならないことが意味される。効率的な発現ベクターの 有用であるが必要ではない要素はマーカーコード配列であり、これは、細胞が容 易に同定されることを可能にするタンパク質を含む細胞の表現型特性（例えば、 テトラサイクリン耐性）を生じるタンパク質をコードする配列である。つまり、 「発現ベクター」は機能的な定義を示し、そして特定される含まれるDNAコード の発現をもたらし得る任意のDNA配列が、それが特定される配列に適用されるよ うに、この用語に含まれる。現在、このようなベクターは、しばしばプラスミド の形態であるので、従って、「プラスミド」および「発現ベクター」はしばしば 互換的に使用される。しかし、本発明は、等価の機能に作用し、そして時々当該 分野で公知になり得る発現ベクターのその他の形態を含むことが意図される。 「機能性誘導体」によって、分子の「フラグメント」、「改変体」、「アナロ グ」、または「化学的誘導体」が意味される。分子の「フラグメント」（例えば 、本発明の任意の抗原）は、分子の任意のポリペプチドサブセットをいうように 意味される。そのような分子の「改変体」は、全体の分子またはそのフラグメン トのいずれかに実質的に類似する天然に生じる分子をいうように意味される。分 子の「アナログ」は、全体の分子またはそのフラグメントのいずれかに実質的に 類似の非天然の分子をいうように意味される。 用語「遺伝子」はペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を意味する。 「均質」によって、ペプチドまたはDNAの配列をいう場合、考慮される組成物 中に存在する実質的に全ての分子の一次分子構造（すなわち、アミノ酸配列また はヌクレオチドの配列）が同一であることが意味される。 「単離された」は、本発明のタンパク質、またはそのようなタンパク質をコー ドする任意の遺伝子をいい、これは、それぞれ他のタンパク質もしくは遺伝子を 、またはそれとともにそれが通常天然において見出され得る他の混入物を本質的 に含まず、そしてそれで天然において見出されない形態で存在する。 用語「標識」は、例として、限定ではなく、放射性同位元素、酵素、ルミネセ ンス物質、および色素を含む、検出可能な分子部分をいう。 用語「プローブ」は、標的の抗リガンドに選択的に結合し得る既知の性質のリ ガンドをいう。核酸に適用される場合、用語「プローブ」は、標的鎖に相補的な 塩基配列を有する核酸の鎖をいう。 「組換え宿主細胞」は、組換えDNA技術を用いて構築されたベクターで形質転 換されている細胞をいう。本明細書中で定義されるように、組換え宿主細胞によ り産生される抗体またはその改変体は、この形質転換によって、非形質転換宿主 により産生されるような、より少ない量、またはより一般的には、検出可能な量 より少ない量ではない。 「実質的に純粋な」によって、本発明の任意のタンパク質、または任意のその ようなタンパク質をコードする任意の遺伝子が意味される。それらは、それぞれ 、他のタンパク質もしくは遺伝子、または通常それとともにそれが天然において 見出され得る他の混入物を本質的に含まず、そしてそれで天然では見出されない 形態で存在する。 分子は、両方の分子中のアミノ酸の配列が実質的に同一である場合、そして両 方の分子が類似の生物学的活性を有する場合、別の分子に「実質的に類似してい る」といわれる。従って、２つの分子が類似の活性を有するのであれば、たとえ 分子の一方が他方において見出されないさらなるアミノ酸残基を含んでも、また はアミノ酸残基の配列が同一でなくても、それらはその用語が本明細書中で用い られるような改変体であると考えられる。本明細書中で用いられる場合、分子は 、通常には分子の一部ではないさらなる化学的部分を含む場合、別の分子の「化 学的誘導体」といわれる。そのような部分は、分子の可溶性、吸収、生物学的半 減期などを改善し得る。あるいは、この部分は分子の毒性を減少させ得るか、分 子の任意の所望でない副作用を除去し得るか、または減弱するなどし得る。この ような効果を媒介し得る部分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Science s 、第16版 、Mack Publishing Co.，Easton，Penn.(1980)中に開示される。 「ベクター」によって、その中にDNAのフラグメントが挿入され得るかまたは クローン化され得るプラスミドまたはバクテリオファージに由来するDNA分子が 意味される。ベクターは１つ以上の唯一の（unique)制限部位を含み、そしてク ローン化された配列が再生されるように規定された宿主またはビヒクル生物体に おいて自律的な複製が可能であり得る。本発明の化合物 本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のcDNA、 ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号４，または配列番号６の配列を含む 配列、およびこれらの配列の誘導体を含む。本発明はまた、ベクター、リポソー ム、およびこれらの配列またはこれらの配列の誘導体を含む他のキャリアービヒ クルを含む。本発明はさらに、配列番号１、配列番号２、配列番号４、または配 列番号６から転写されるタンパク質（配列番号３、配列番号５、または配列番号 ７を含むがこれらの限定されない）ならびにそれらの誘導体および改変体を含む 。 本発明の１つの実施態様は、通常膜結合型タンパク質として合成され、そして 損傷後にアップレギュレートされる、KIMタンパク質の可溶性改変体を含む。可 溶性改変体は、天然のKIMタンパク質の膜貫通部分または膜内部分の少なくとも 一部を欠く。いくつかの例において、可溶性改変体は、天然のKIMタンパク質の 膜貫通部分または膜内部分の全体を欠く。可溶性改変体は、天然のKIMタンパク 質の膜貫通部分または膜内部分の少なくとも一部を欠くKIMタンパク質の誘導体 を含む融合タンパク質を含む。全ての型のKIM融合タンパク質、特に、hisタグ、 Igタグ、およびmycタグ形態の分子を組み込むタンパク質が含まれる。これらのK IM融合体は、治療的に有利である特徴（例えば、Igタグにより与えられる増加し た半減期）を有し得る。KIMタンパク質の選択されたドメインの部分を組み込む 融合タンパク質もまた含まれる。 改変体は、アミノ酸配列で、もしくは配列が関与しない方法で、またはその両 方で天然に生じるKIMタンパク質とは異なり得る。アミノ酸配列における改変体 は、天然に生じるKIMタンパク質における１つ以上のアミノ酸が異なる天然のア ミノ酸、アミノ酸誘導体、または非天然のアミノ酸で置換される場合、生成され る。特に好ましい改変体は、天然に生じるKIMタンパク質、または天然に生じるK IMタンパク質の生物学的に活性なフラグメントを含み、その改変体の配列は、代 表的には、タンパク質またはペプチドの２次構造および疎水的性質に対して最小 限の影響を有する１つ以上の保存的アミノ酸の置換により野生型配列とは異なる 。改変体はまた、KIMタンパク質の生物学的活性を無効にしない、１つ以上の非 保存的アミノ酸の置換、欠失、または挿入により異なる配列を有し得る。保存的 置換は、代表的には、１つのアミノ酸を同様の特徴を有する別のアミノ酸への置 換 （例えば、以下の群内での置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリ ン、イソロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン ；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシ ン）を含む。非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン 、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを 含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロ シン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ 酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）ア ミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。 他の保存的置換は、以下の表から引用され得、そしてさらに他はDayhoff，the Atlas of Protein Sequence and Structure(1988)に記載される。 表１：保存的アミノ酸置換 本発明内の他の改変体は、ペプチドの安定性を増大する改変を有する改変体で ある。そのような改変体は、例えば、ペプチド配列内に１つ以上の非ペプチド結 合（ペプチド結合を置換する）を含み得る。さらに以下のものが挙げられる：天 然に生じるL-アミノ酸以外の残基（（例えば、D-アミノ酸または天然に生じない かもしくは合成アミノ酸（例えば、βまたはγアミノ酸および環状改変体））を 含む改変体。ポリペプチド内へのL-アミノ酸の代わりのD-アミノ酸の取り込みは 、プロテアーゼへのその耐性を増加し得る。例えば、米国特許第5,219,990号を 参照のこと。 一般的に、KIMポリペプチドの機能的特性に変化を誘導すると予想され得る置 換は、以下のものである：(I)親水性残基（例えば、セリンまたはトレオニン） は、疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、または アラニン）により置換される；(ii)システイン残基は、任意の他の残基へ（また はその残基によって）置換される；(iii)正に帯電した側鎖を有する残基（例え ば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）は、負に帯電した電荷を有する残 基（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）へ（またはその残基によって ）置換される；または(iv)かさ高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニ ン）は、そのような側鎖を有さない（例えば、グリシン）残基へ（またはその残 基によって）置換される。 本発明のペプチドもまた、挿入、欠失、および置換のような種々の変化（この ような変化が、それらの使用において特定の利点を提供し得る保存的かまたは非 保存的かのいずれか）により改変され得る。スプライス改変体は特に本発明に含 まれる。 他の実施態様において、より保存的でないアミノ酸置換を有する改変体もまた 、所望の誘導体を（例えば、電荷、立体構造、および他の生物学的特性における 変化を生じることによって）生じ得る。このような置換は、例えば、親水性残基 の疎水性残基への置換、システインもしくはプロリンの別の残基への置換、小さ な側鎖を有する残基のかさ高い側鎖を有する残基への置換、または正味の正電荷 を有する残基の正味の負電荷を有する残基への置換を含む。所定の置換の結果が 確信を持って予測され得ない場合、誘導体は、所望の特徴の存在または非存在を 決定するために本明細書中に開示される方法に従って容易にアッセイされ得る。 本発明の範囲内の改変体は、KIMタンパク質に少なくとも80％の相同性を有す るアミノ酸配列を有するタンパク質およびペプチドを含む。より好ましくは、配 列相同性は、少なくとも90％、または少なくとも95％である。相同性を決定する 目的のために、配列比較の長さは、一般には、少なくとも８アミノ酸残基であり 、通常には、少なくとも20アミノ酸残基である。本発明の化合物の改変体はまた 、1)本発明のKIMタンパク質と少なくとも40％相同なアミノ酸配列を有し、そし てまた２）KIM配列（図５中に、ヒトおよびラットのKIM-1について示される）の 最適なアラインメントで配置された後、本発明のKIMタンパク質内のシステイン と整列したそのシステイン残基の少なくとも80％を有する、任意のタンパク質も 含む。 まさに、骨格の置換基を置換することが可能であるので、同様の特色により特 徴付けられる基を有する骨格に結合される官能基の置換もまた可能である。これ らの置換は、まず保存的である（すなわち、置換基は元の基とほぼ同じサイズ、 形、疎水性および電荷を有する）。非配列改変は、例えば、インビボまたはイン ビトロでの天然に生じるKIMタンパク質の一部の化学的誘導体化、ならびにアセ チル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化またはグリコシル化における変化 を含み得る。 本発明のタンパク質、またはそのタンパク質のフラグメント（配列番号３、５ 、 または７）に特異的に結合する因子もまた本発明内に含まれる。これらの因子は 、リガンドおよび抗体（天然の、ヒトの、ヒト化された、霊長類化された(prima tized)、またはキメラのいずれかであろうと、モノクローナル、単鎖、二本鎖、 Fabフラグメントなどを含む）を含む。これらのカテゴリーの因子のさらなる説 明は、PCT出願95/16709にあり、その明細書は、本明細書中に参考として援用さ れる。実験手順 １．虚血性および正常なラット成体腎臓からのRNAの作製 虚血損傷ラット腎臓を、Witzgallら（J．Clin Invest．93:2175-2188，1994） に記載のように作製する。手短には、成体Sprague-Dawleyラットの１つの腎臓か らの腎動脈および腎静脈を40分間締め付け、次いで再灌流する。損傷した腎臓を 再灌流後24時間および48時間でラットから採取する。偽手術した正常成体Spragu e-Dawleyラットからの腎臓もまた採取する。 総RNAを、Glisinら（Biochemistry 13:2633，1974）によるプロトコルに基づ いて器官から調製する。手短には、採取した器官を直ちにGNC緩衝液（４Ｍチオ シアン酸グアニジン、0.5％SDS、25mMクエン酸ナトリウム、0.1％Sigma消泡剤） 中に入れ、そしてポリトロンを用いて氷上で破壊する。細胞破片を、臨床的遠心 分離機における低速遠心で除去し、そして上清液を5.7M CsCl、25mM酢酸ナトリ ウム、１mM EDTAのクッション上に載せる。RNAを、SW40Tiローターにおいて22Ｋ で15時間、クッションを通してペレット化させる。RNAを滅菌DEPC処理水中に再 懸濁し、1/10容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび2.5容量のEtOHで２回沈澱させる 。ポリＡ＋RNAを、mRNA精製キット（Pharmacia，カタログ番号27-9258-02）を用 いて単離する。 ２．1-7 、3-2、および4-7提示差違分析（RDA）フラグメントを単離するためのRD A方法 二本鎖cDNAを、偽手術した腎臓、および虚血後48時間の腎臓のポリＡ＋RNAか ら、Gibco BRL「Superscript ChoiceTMSystem cDNA Synthesis Kit」、カタロ グ番号18090を用いて合成する。第１鎖を、オリゴdTでプライムし、そしてSuper script IITM逆転写酵素を用いることにより合成する。第２鎖を、E.coli DNAポ リメラーゼＩおよびRNase H、続いてT4 DNAポリメラーゼを用いてBRLの推奨する 条件を用いて作製する。 RDA分析を、基本的にHubankおよびSchatz（Nucleic Acid Research 22:5640-4 8，1994）により記載されたように実施する。手短には、虚血後48時間の腎臓cDN Aを、制限酵素Dpn IIで消化し、そしてR-Bgl-12/24オリゴヌクレオチドに連結す る（正確な配列については文献を参照のこと）。リンカー連結cDNAのPCR増幅物 （Perkin-Elmer Taqポリメラーゼおよびそれらに対応するPCR緩衝液を用いて実 施する）を用いて、最初の提示物を作製する。このPCR産物を、「テスターアン プリコン」と称する。同じ手順を用いて偽手術ラット腎臓cDNAから「ドライバー アンプリコン」を作製する。 テスターアンプリコンおよびドライバーアンプリコンのハイブリダイゼーショ ン、それに続く選択的増幅を３回実施して、ディファレンシャル産物１（DP1） 、２（DP2）、および３（DP3）を作製する。DP1産物の作製を、HubankおよびSch atz（Nucleic Acid Research 22:5640-48，1994）により記載されたように実施 する。DP2産物およびDP3産物もまた、ドライバー：テスター比がDP2については5 ,333:1に、そしてDP3については40,000:1または4,000:1に変更される以外は、Hu bankおよびSchatz（同書）に記載されたように作製する。 ３つのRDA産物を、DP3からクローニングベクターpUC18ヘクローン化する：40, 000:1の比を用いてDP3を作製する場合、RDA産物1-7（252bp）、そして4,000:1の 比を用いてDP3を作製する場合、産物RDA 3-2（445bp）および4-7（483bp）。DNA フラグメントを、Pharmacia SurecloneTMキット（カタログ番号27-9300-01）を 用いてサブクローン化し、PCRフラグメントの末端をKlenow酵素を用いて修復し 、そしてpUC18ベクター中へのフラグメントの平滑末端連結を容易にする。 ３．ノーザン分析 ラット正常成体腎臓(疑似手術)から、虚血損傷後48時間の成体腎臓から、およ び18日目の胎児腎臓からのポリＡ＋RNA(2.5μg)を電気泳動し、そしてGeneScree nTMメンブレン(Dupont)にノーザンブロット(Cate、Cell45:685、1986)する。10% の硫酸デキストランおよび100μg/mlのtRNAを含む、PSB緩衝液(50mM Tris7.5、1 M NaCl、0.1%ピロリン酸Na、0.2%PVP、0.2%Ficoll、0.2%BSA、１%SDS)中のハイ ブリダイゼーションを、３つの異なるプローブ：1-7RDA産物、3-2RDA産物および 4-7RDA産物、を用いて65℃で行った。すべての産物は、Pharmaciaの「Ready to GoTM」ランダムプライミングラベリングキット(カタログ番号27-9521-01)を用い て放射能標識する。RDA産物1-7、3-2および4-7は、すべての３つのサンプル中に 存在するmRNAにハイブリダイズするが、虚血後48時間の腎臓RNAサンプル中のmRN Aに最も強くハイブリダイズする。 成体ラット組織のノーザンブロット分析は、1-7遺伝子が、正常な成体腎臓、 精巣、脾臓および肺では、非常に低レベルで発現されることを示す。3-2遺伝子 は、肝臓、腎臓、脾臓、および脳で発現される。4-7遺伝子は、脾臓、腎臓、肺 、精巣、心臓、脳、肝臓、および骨格筋で発現される。1-7および3-2ブロットに おけるいくつかの組織中の異なるサイズのmRNAの存在は、1-7遺伝子および3-2遺 伝子の主要な転写産物が、オルターネートスプライシングおよび/またはポリア デニル化を行い得ることを示す。 ４．3-2 および4-7cDNAクローンの単離 虚血損傷後48時間の腎臓由来の４μｇのポリＡ＋RNAから、cDNA合成用のBRL S uperscript ChoiceTMSystem、およびStratageneTM、Lambda ZapIIクローニング キット(カタログ番号236201)からの試薬を用い、製造業者により推奨されたプロ トコールに従って、cDNAライブラリーを生成する。 105のクローンを、プローブとして3-2RDA産物(上記のようにランダムプライム ラベルされる)を用いてスクリーニングする。８つのポジティブなクローンを選 択し、そして４つを第２の分析用にランダムに選択し純粋ファージプラークを得 る。三次スクリーニングの後、４つの純粋ファージクローンを単離する。ファー ジからのクローン化インサートを、StratageneTM、Lambda ZapIIキットに従った インビボ切除手順により単離する。約2.6kbの最も大きいインサート(cDNAクロー ン3-2と呼ばれる)を、DNA配列決定に供する。インサート(配列番号１）の配列 を図１に示す。cDNAクローン3-2(E.coli K-12、SOLR/p3-2#5-1)をATCC No.98061 として寄託した。cDNAクローン3-2の配列は、配列番号１のヌクレオチド136〜60 5が挿入を示すことを除いて、クローン1-7cDNA(配列番号２)の配列と同じである 。従って、配列番号２は、配列番号１のスプライス改変体を示す。1-7に対する クローン1-7(E.coli K-12、SOLR/p1-7#3-1)をATCC No.98060として寄託した。 105のクローンを、プローブとして1-7RDA産物(上記のようにランダムプライム 放射ラベルされる)を用いてスクリーニングする。８つのポジティブなクローン を選択し、そして４つを第２の分析用にランダムに選択し純粋ファージプラーク を得る。三次スクリーニングの後、４つの純粋ファージクローンを単離する。フ ァージからのクローン化インサートを、StratageneTM、Lambda ZapIIキットに従 ったインビボ切除手順により単離する。約2.0kbの最も大きいインサート(cDNAク ローン1-7と呼ばれる)を、DNA配列決定に供する；インサート(配列番号２)の配 列を図２に示す。 105のクローンを、プローブとして4-7RDA産物(上記のようにランダムプライム ラベルし、そして65℃でPSB中でハイブリダイズした)を用いてスクリーニングす る。８つのポジティブなクローンを選択し、そして４つを第２の分析用にランダ ムに選択し純粋ファージプラークを得る。二次スクリーニングの後、２つの純粋 ファージクローンを単離する。ファージからのクローン化インサートを、Strata geneTM、Lambda ZapIIキットに従ったインビボ切除手順により単離する。約2.4k bの最も大きいインサート(cDNAクローン4-7と呼ばれる)を、DNA配列決定に供す る；インサートの配列、配列番号４の配列を図３に示す。cDNAクローン4-7(E.co li K-12、SOLR/p4-7#1-1)をATCC No.98062として寄託した。 ５．1-7 、3-2および4-7cDNAクローンの特徴付け A.)DNA配列およびタンパク質配列： 3-2cDNAの配列(図１；配列番号１)は、307アミノ酸のオープンリーディングフ レームを含む(図１；配列番号３)。21アミノ酸のシグナル配列が、Von Heijne分 析(Von Heijneら、Nucl.Acid Res.14:14683(1986))から推断され、そして約aa23 5〜257に広がる膜貫通領域は、細胞表面タンパク質である3-2産物を示す。 1-7cDNAの配列(図２；配列番号２)は、3-2cDNA(配列番号３)中に含まれるオー プンリーディングフレームと同一である、307アミノ酸のオープンリーディング フレームを含む(配列番号３)。4-7cDNAの配列(図３；配列番号４)は、572アミノ 酸のオープンリーディングフレームを含む(配列番号５)。膜貫通領域は、約アミ ノ酸501〜521に位置する。 B.)対側のそして虚血後の成体ラット腎臓における1-7、3-2および4-7mRNAのイ ンサイチュ分析： インサイチュハイブリダイゼーションを、Finchら、Dev．Dynamics 203:223〜 240、1995により記載される方法に従って実施する。要約すれば、虚血および対 側の腎臓の両方を、PBS中の４%パラホルムアルデヒドで灌流固定する。腎臓をさ らに４℃で一晩固定し、そして処理する。パラフィン切片を脱パラフィンおよび 再水和し、PBS中の４%パラホルムアルデヒドで固定し、プロティナーゼＫで消化 し、再固定し、次いでトリエタノールアミン緩衝液中の無水酢酸でアセチル化す る。次いで、切片を脱水し、そして32P標識リボプローブと55℃で一晩ハイブリ ダイズする。33P標識リボプローブは、pGEM-11ZのBamHI部位中にサブクローン化 した3-2RDA産物または1-7RDA産物から生成する。ハイブリダイゼーションの後、 切片を高ストリンジェンシー条件下(２×SSC、65℃で50%ホルムアミド)で洗浄し た。切片を最後に脱水し、オートラジオグラフィー用にエマルジョン(NBT-2)コ ートし、そして少なくとも１週間感光した。銀粒子を展開し、そして切片をトル イジンブルーで対比染色し、そして顕微鏡撮影する。 インサイチュハイブリダイゼーションによる1-7および3-2mRNA発現の分析は、 これらの遺伝子が、正常腎臓切片中のそれらの発現と比較して、損傷腎臓細胞で 大きくアップレギュレートされることを示す。観察される発現は、皮質および外 部髄質の再生細胞中にあり、その大部分は、基部細管細胞であるように見える。 4-7インサイチュRNA発現パターンの分析はまた、正常成体腎臓と比較して損傷 虚血腎臓中でこの遺伝子の豊富な発現を示す。発現の部位は、浸潤細胞であるよ うに見える。6.) ラット3-2cDNAに交差ハイブリダイズするヒトcDNAクローンの単離 図１に示されるクローン3-2のインサートのヌクレオチド546〜969を含む32P標 識DNAを生成し、そしてヒト胎児肝臓λgt10cDNAライブラリー(Clontechカタログ #HL5003a)をスクリーニングするために用いる。１×106のプラークを、上記の標 準的条件を用い、ただしスクリーニング温度は55℃で２回スクリーニングする。 高ストリンジェンシー洗浄のために、フィルターを２×SSC中55℃で洗浄する。5 0のポジティブファージを同定し、そしてプラーク精製し、そしてDNAを調製する 。ファージDNAを、上記と同じプローブを用いてサザン分析に供する。サザンブ ロットフィルターを、0.5×SSC、55℃で最終洗浄に供する。２つのクローンがポ ジティブとして同定される。クローンH13-10-85のインサートを配列決定し、そ して図３に示される3-2タンパク質に高いレベルの同一性を備えたタンパク質を コードする領域が見出される。 ヒト3-2関連タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号６)および推定アミノ酸 配列(配列番号７)を図４に示す。図５に示される最も適合する分析により示され るように、ヒト3-2関連タンパク質は、ラット3-2タンパク質に対して43.8％同一 および59.1%類似である。両者は、IgG、ムチン、膜貫通、および細胞質ドメイン を含む。両タンパク質のIgGドメイン内の６つのシステインが保存されている。 7)KIM-1 Ig 融合タンパク質の産生 KIMの細胞外ドメインおよび免疫グロブリン(Ig)のFc領域の融合タンパク質は 、損傷/再生腎臓の分子および細胞生物学の研究用、および治療分子として有用 なツールである。ヒトおよびラットKIM-1タンパク質の細胞外ドメインとのKim I g融合タンパク質を産生するために、KIM-1 cDNAの細胞外ドメインのフラグメン トを、PCRにより増幅し、そしてCOS細胞における一過性発現のためにBiogen発現 ベクターpCA125中にクローン化した。発現ベクターpCA125は、Ｎ末端でクローン 化した遺伝子およびＣ末端でヒトIg Fc領域由来の構造を有する融合タンパク質 を産生する。COS細胞を、プラスミドSJR103または104でトランスフェクトした； これらのプラスミドは、ヒトIg Fc領域に融合した細胞外ドメインのヒトKIM配列 263〜1147(配列番号６；SJR103)またはラットKIM配列599〜1319(配列番号１；SJ R104)を含む融合タンパク質を発現する。細胞を、細胞ファクトリー(Nunc，Nape rv ille，II)中のDMEM中10％FBS中で増殖させた。感染の２〜３日後、培地を回収し 、Amicon濃縮器を用いて濃縮し、そしてProtein-A Sepharoseカラムを用いて融 合タンパク質を精製した。精製後、融合タンパク質の純度をSDS-PAGEにより評価 した。本発明の化合物の診断用途 配列番号３、配列番号５または配列番号７のタンパク質またはそのフラグメン トに特異的に結合する本発明の抗KIM抗体は、いくつかの診断方法において有用 である。これらの因子(agent)は、Ｘ線透視法によりまたは放射線撮影で不透過 性の物質のような、検出マーカーで標識され得、そして被験体に投与され、KIM タンパク質を発現する組織の造影を可能にし得る。因子はまた、西洋ワサビペル オキシダーゼのような、組織学切片上のKIMタンパク質ポジティブ細胞の領域の 可視化を可能にする免疫細胞化学的染色として用いられ得る基質に結合され得る 。特異的抗体は、このように、単独で使用され得、そしてそれが結合する部位は 、それ自身が検出マーカーに結合する抗免疫グロブリン抗体を用いるサンドイッ チアッセイで可視化され得る。 KIMタンパク質に特異的な抗体はまた、身体組織および体液サンプル中のKIMの 存在またはその濃度を測定するためのイムノアッセイで有用である。このような 濃度は、異なる疾患状態と相関し得る。特定の目的の実施態様として、本発明は 、患者の尿、血漿または血清中のKIMまたはKIMフラグメントの濃度を測定するこ とにより、腎臓損傷を診断する、または腎臓修復のプロセスを監視する方法を含 む。同様に、KIMは、尿沈渣中、特に尿沈渣中の細胞残渣中で測定され得る。腎 臓細管細胞の円柱は、腎臓疾患が進行中の患者からの尿沈渣中に存在し得、KIM タンパク質およびmRNAの増加したレベルを含み得る。 KIMタンパク質に特異的な抗体はまた、ビーズまたはディッシュのような固体 支持体に結合され、そして測定のため、精製およびタンパク質またはその特質（ 翻訳後の改変など）の特徴付けためのいずれかに、溶液からリガンドを取り除く ために用いられ得る。患者のKIMタンパク質のこのような特徴付けは、KIM機能を 妨害し、そして異常な患者表現型をともなう有害な変異体またはプロセッシング 欠陥の同定に有用であり得る。これら技法の各々は、免疫学の分野の当業者には ルーチンに行われている。 さらなる造影方法は、KIMリガンドを発現する組織、特に腫瘍の診断造影のた めに、造影可能な部分に融合されたKIMまたはKIMフラグメントを利用する。 さらなる診断技法は、損傷関連プロセスの指標として、組織中のアップレギュ レートされたKIMm RNAの実証に基く。この技法が試験され、そして以下のように 、ラットにおける虚血損傷のモデル中で行い得ることが見出された。 損傷後、KIM-1タンパク質の量が増加するか否かを測定するために、本発明者 らは、各ラットの１つの腎臓の腎臓動脈および静脈を40分クランプで遮断した24 時間後および48時間後に、対側および虚血後の腎臓のホモジネートを調べた。腎 臓ホモジネートを、KIM-1タンパク質の存在について評価した。ウェスタンブロ ット分析は、虚血損傷後、２つの異なる抗体により検出される３つのタンパク質 を同定し、これらは、虚血損傷に曝されなかった対側の腎臓からのホモジネート 中には検出されない。バンドの見かけの分子量は、約40kDa、50kDaおよび70〜80 kDaである。ウェスタンブロッティングにより検出される、この３つのタンパク 質種は、潜在的なＮおよびＯ連結グリコシル化部位があるとして、同一タンパク 質のグリコシル化形態を示し得る。これらのタンパク質の各々が、ポリクローナ ル抗体の２つの異なるセットと反応する事実は、それらがKIM-1と関連し、そし て交差反応するバンドではないという考えを支持する。この予測の確認は、それ らが共通のCNBr切断フラグメントを共有していたことを示した３つのタンパク質 のCNBr部分切断の結果から得られた。KIM-1タンパク質の細胞質ドメインは、任 意の主要な翻訳後改変を含むことは予測されないので、KIM-1の細胞質ドメイン に対して惹起された抗体で検出された、消化物の２つの最小の産物(4.7kDaおよ び7.4kDa)は、それらが同じタンパク質に由来する場合、３つの異なるKIM-1タン パク質バンドについて同じサイズであるべきである。本発明者らは、KIM1 40kDa および70〜80kDaタンパク質が、予測されたサイズで移動するフラグメントを生 じることを観察した。50kDaタンパク質バンドの消化物もまた、同じＣ末端特徴 バンドペプチドを与えた。 KIM-1配列は、２つの推定のＮグリコシル化部位およびＯグリコシル化部位が ポリペプチド鎖をカバーするムチンドメインを示す。虚血後の腎臓中に検出され た３つのKIM-1バンドは、同じコアタンパク質のグリコシル化改変体に対応し得 る。PNGアーゼＦを用いた脱Ｎグリコシル化は、すべての３つのバンドの、約３k Daの損失に対応する低分子量へのシフトを生じ、３つのタンパク質のすべてがＮ グリコシル化されることを示した。Ｏグリコシル化の違いは、これら３つのバン ドのサイズにおける差違を説明し得る。本発明の化合物の治療的使用 本発明の治療方法は、KIM連結に依存する細胞性応答を選択的に促進するまた は阻害することを含む。KIMおよびKIMリガンドが共に膜結合であり、そして異な る細胞により発現される場合、シグナル伝達は、KIM発現細胞、KIMリガンド発現 細胞、またはその両方で起こり得る。 KIMリガンド発現細胞中のKIM連結により引き起こされる応答は、細胞を、外因 性KIM、KIM融合タンパク質、またはKIMリガンドに対する活性化抗体と、インビ トロまたはインビボのいずれかで接触させることにより生成され得る。さらに、 そうでなければ内因性KIMにより引き起こされるKIMリガンド発現細胞の応答は、 KIMリガンド発現細胞をKIMリガンドアンタゴニスト（例えば、KIMリガンドに結 合するアンタゴニスト抗体）と接触させることにより、または内因性KIMを抗KIM 抗体もしくは他の、KIMの、KIMリガンドとの有効な連結を妨げるKIM結合分子と 接触させることによりブロックされ得る。 同様に、KIM発現細胞中のKIM連結により引き起こされる応答は、外因性化合物 を用いて促進され得るか、または阻害され得る。例えば、KIM発現細胞中のKIM連 結により引き起こされる応答は、細胞を可溶性KIMリガンド、または特定の抗KIM 活性化抗体と接触させることにより、生成され得る。さらに、そうでなければ、 内因性KIMリガンドとの相互作用により引き起こされるKIM発現細胞の応答は、KI M発現細胞を、KIMに対するアンタゴニスト（例えば、有効な、シグナルを生成す るKIM連結を妨げる様式でKIMに結合するブロッキング抗体）と接触させることに より、または内因性KIMリガンドを、抗KIMリガンド抗体もしくは他の、KIMの、K IMリガンドとの有効な連結を妨げるKIMリガンド結合分子と接触させることによ り、ブロックされ得る。 上記の介入のいずれが特定の治療的使用のために有用であるかは、医学の当業 者に明らかであるように、阻害されるべき病理学的プロセスまたは促進されるべ き医療学的に所望されるプロセスのいずれかの、関連する病因学的機構に依存す る。例えば、KIM連結が、所望の細胞性増殖、分化した表現型の維持、種々の傷 害により誘導されるアポトーシスに対する耐性、または他の医学的に有利な応答 を生じる場合、連結により引き起こされる応答を促進する上記介入の１つが使用 され得る。代替において、KIM連結が、新形成性増殖、細胞性機能の有害な欠失 、アポトーシスに対する感受性、または炎症性事象の促進のような所望でない結 果を引き起こす場合、阻害的介入の１つが、有用であり得る。 以下は、本発明の以前に記載した治療方法の例である。本発明のKIM関連化合 物の治療的使用の１つは、腎臓疾患を有する被験体の処置、被験体における新た な組織の増殖の促進、または被験体における損傷した組織の生存の促進のためで あり、そして治療有効量の本発明のKIMタンパク質、または本発明のタンパク質 を含む薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む。これらの方法において使用 されるタンパク質は、全長KIMタンパク質のフラグメント、可溶性KIMリガンドタ ンパク質もしくは融合フラグメント、またはKIMアゴニストであり得る。これら の方法はまた、治療有効量の本発明のアゴニスト抗体、または本発明のアゴニス ト抗体を含む薬学的組成物を被験体に投与することにより実施され得る。KIMタ ンパク質は、医学的に所望させる補助的効果を発揮する第２の化合物の治療有効 量と共に、同時に投与され得る。これらの方法のための目的の組織は任意の組織 を含み得るが、好ましい組織は、腎臓組織、肝臓、神経組織、心臓、胃、小腸、 脊髄、または肺を含む。本発明の化合物で有益に処置され得る特定の腎臓状態は 、急性腎不全、急性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、腎尿細管欠損症、腎 臓移植、毒性損傷、低酸素性損傷、および外傷を含む。腎尿細管欠損症は、多嚢 胞性腎疾患、腎髄質嚢胞病、および髄質海綿腎のような、遺伝性または後天性特 性のいずれかの欠損症を含む。このリストは限定されず、そして多くの他の腎障 害を含み得る（例えば、参考として本明細書中に援用されるHarrison's Princip les of Internal Medicine，第13版，1994を参照のこと）。この方法の被験体は ヒ トであり得る。 被験体における所望でないKIMリガンド発現組織の増殖を阻害するための治療 的介入は、KIMアンタゴニスト（例えば、KIMリガンドに結合するアンダゴニスト 抗体）の治療的有効量を被験体に投与する工程を含むか、または、KIMのKIMリガ ンド発現組織への結合をブロックする抗KIM抗体もしくは他のKIM結合分子の治療 有効量を投与することによる。目的の実施態様において、KIMアンタゴニストま たは抗KIM抗体は、増殖のためにKIMタンパク質に依存する腫瘍の増殖を阻害また はブロックするために治療的に使用され得る。 本発明の他の方法は、細胞を、KIMおよび毒素もしくは放射性核種の融合タン パク質と、または毒素もしくは放射性核種に結合された抗KIMリガンド抗体と接 触させることにより、KIMリガンド発現腫瘍細胞を死滅させるか、またはそれら の増殖を阻害することを含む。細胞は被験体内であり得、そしてタンパク質また は結合された抗体は被験体に投与される。 毒素または放射性核種をKIMを発現している細胞に標的化するための方法もま た本発明の範囲内である。この方法は、細胞を、KIMリガンドおよび毒素または 放射性核種を含む融合タンパク質、または毒素もしくは放射性核種に結合された 抗KIM抗体と接触させることを含む。別の実施態様は、KIMを発現する腫瘍細胞の 増殖を抑制する方法を包含し、この方法は、細胞を、KIMリガンドおよび毒素も しくは放射性核種の融合タンパク質、または毒素もしくは放射性核種に結合され た抗KIM抗体と接触させることを含み；細胞は被験体内であり得、そしてタンパ ク質は被験体に投与される。 本明細書中で用いられる用語「被験体」は、KIMが投与され得る任意の哺乳動 物を意味するとされる。本発明の方法を用いる処置について特に意図される被験 体は、ヒト、ならびに非ヒト霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、 ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラット、およびマウス、 ならびに、これらの宿主に由来するかまたはこれらを起源とする器官、腫瘍、お よび細胞を含む。遺伝子治療における本発明の化合物の使用 本発明のKIM遺伝子は、傷害組織または刺激された増殖が所望される組織へ導 入される。このような遺伝子治療は、トランスフェクトされた細胞によるKIMタ ンパク質の産生を刺激し、KIMタンパク質を発現する細胞の増殖および／または 細胞の生存を促進する。 遺伝子治療方法の特定の実施態様において、KIMタンパク質をコードする遺伝 子は、腎臓標的組織に導入され得る。KIMタンパク質は安定して発現され、そし て組織の増殖、分裂、もしくは分化を刺激し、または細胞生存を増強し得る。さ らに、KIM遺伝子は、ウイルスまたは非ウイルスベースの戦略のいずれかを使用 する、種々の周知の方法を使用して標的細胞に導入され得る。 非ウイルス方法は、エレクトロポレーション、リポソームを用いる膜融合、DN Aコート微粒子銃での高速ボンバードメント、リン酸カルシウム-DNA沈降物との インキュベーション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、および単一 細胞への直接マイクロインジェクションを含む。例えば、KIM遺伝子は、リン酸 カルシウム共沈澱により細胞に導入され得る（Pillicerら、Science、209:1414- 1422(1980)）；機械的マイクロインジェクションおよび／または粒子加速（Ande rsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:5399-5403(1980)）；リポソームベースの DNA移入（例えば、LIPOFECTIN媒介トランスフェクション−Fefgnerら、Proc.Nat .Acad.Sci.,USA，84:471-477,1987;GaoおよびHuang、Biochim．Biophys．Res．C omm.，179:280-285,1991）；DEAEデキストラン媒介トランスフェクション；エレ クトロポレーション（米国特許第4,956,288号）；またはDNAを結合してDNAを優 先的に肝細胞に送達させるポリリジンベースの方法（Wolffら、Science、247:46 5-468,1990；Curielら、Human Gene Therapy 3:147-154,1992）。 標的細胞は、直接的な遺伝子移入により、本発明の遺伝子でトランスフェクト され得る。例えば、Wolffら、「Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle In V ivo」，Science 247:1465-68,1990を参照のこと。多くの場合、ベクター媒介の トランスフェクションが所望される。ベクターへのポリヌクレオチド配列の挿入 のための、当該分野で公知の任意の方法が使用され得る。（例えば、Sambrookら 、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor，NY（1989）およびAusubelら、Current Protocols in Mole cu Iar Biology，J．Wiley & Sons，NY(1992)（これらの両方は、本明細書中に参考 として援用される）を参照のこと。）プロモーター活性化は、組織特異的であり 得るか、または代謝産物もしくは投与された物質により誘導され得る。このよう なプロモーター／エンハンサーは、ネイティブのc-retリガンドタンパク質プロ モーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー（Karasuya maら、J.Exp.Med.,169:13(1989)）；ヒトβアクチンプロモーター（Gunningら、 Proc．Nat．Acad．Sci．USA．84:4831(1987)）；マウス乳房腫瘍ウイルス長末端 反復（MMTV LTR）中に存在するグルココルチコイド誘導性プロモーター（Klessi gら、Mol.Cell.Biol.、4:1354(1984)）；モロニーマウス白血病ウイルスの長末 端反復配列（MuLV LTR）(Weissら、RNA Tumor Viruses，Cold Spring Harbor La boratory，Cold Spring Harbor，NY(1985))；SV40初期領域プロモーター(Bernoi stおよびChambon，Nature、290:304(1981))；ラウス肉腫ウイルス（RSV）のプロ モーター（Yamamotoら、Cell,22:787(1980))；単純ヘルペスウイルス（HSV）チ ミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、Proc.Nat．Acad．Sci．USA,78:1441(19 81))；アデノウイルスプロモーター(Yamadaら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,82:3567 (1985))を含むが、これらに限定されない。 KIM遺伝子はまた、現在充分に確立されている遺伝子移入系における使用のた めの特定のウイルスベクターにより導入され得る。例えば、Madzakら、J.Gen.Vi rol.，73:1533-36、1992（パポバウイルスSV40）；Berknerら、Curr.Top Microb iol.Immunol.,158:39-61、1992(アデノウイルス)；Hofmannら、Proc.Natl.Acad. Sci.92:10099-10103、1995（バキュロウイルス）；Mossら、Curr.Top.Microbiol .Immunol.,158:25-38、1992（ワクシニアウイルス）；Muzyczka、Curr.Top.Micr obiol.Immunol.，158:97-123、1992（アデノ随伴ウイルス）；Margulskee、Curr .Top.Microbiol.Immunol.，158:67-93、1992(単純ヘルペスウイルス(HSV)および エプスタイン-バーウイルス（HBV）)；Miller、Curr.Top.Microbiol.Immunol.， 158:l-24、1992(レトロウイルス）；Brandyopadhyayら、Mol.Cell.Biol.,4:749- 754、1984（レトロウイルス）；Millerら、Nature、357:455-450、1992(レトロ ウイルス)；Anderson、Science,256:808-813、1992（レトロウイルス）、Curren t Protocols in Molecular Biology:9.10-9.14節（Ausubelら、編）、Greene Publishing Associates,1989を参照のこと。これらすべては本明細書中で参考と して援用する。 好ましいベクターはDNAウイルスであり、これは、アデノウイルス（好ましく は、Ad-2またはAd-5に基づくベクター）、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス （好ましくは、単純ヘルペスウイルスに基づくベクター）、およびパルボウイル ス（好ましくは、「欠損」または非自律性パルボウイルスに基づくベクター、よ り好ましくは、アデノ随伴ウイルスに基づくベクター、最も好ましくは、AAV-2 に基づくベクター）を含む。例えば、Aliら、Gene Therapy 1:367-384,1994;米 国特許第4,797,368号および同第5,399,346号、ならびに以下の議論を参照のこと 。 例えば、KIM配列を移入するための特定のベクター系の選択は、種々の要素に 依存する。１つの重要な要素は、標的細胞集団の性質である。レトロウイルスベ クターは広範に研究されており、そして多数の遺伝子治療適用において使用され ているが、それらは、一般に分裂中ではない細胞を感染するためには適していな いが、ガン治療において有用であり得る。なぜなら、それらは、複製中の細胞に おいてそれらの遺伝子を組み込み、そして発現するだけだからである。それらは 、エクスビボアプローチに有用であり、そしてこの点で標的細胞ゲノムへのその 安定な組み込みによって魅力的である。 アデノウイルスは、真核細胞DNAウイルスであり、これは、治療的トランスジ ーンまたはレポータートランスジーンを種々の細胞型へと効率的に送達するよう に改変され得る。一般的なアデノウイルスの２型および５型（それぞれ、Ad2お よびAd5）は、ヒトにおいて呼吸器疾患を生じ、そして現在デュシェーヌ筋ジス トロフィー（DMD）および嚢胞性線維症（CF）の遺伝子治療のために開発されて いる。Ad2およびAd5の両方は、ヒト悪性腫瘍に関連しないアデノウイルスの亜網 に属する。アデノウイルスベクターは、有糸分裂状態に関係なく、極度に高レベ ルのトランスジーンの実質的にすべての細胞型への送達を提供し得る。高力価（ 1013プラーク形成単位/ml）の組換えウイルスは、293細胞（アデノウイルスでト ランスフォームされた、相補性ヒト胚性腎細胞株：ATCC CRL1573）において容易 に生成され得、そして認識可能な損失なしに長期間凍結保存され得る。遺伝的ア ンバランスを補完する治療的トランスジーンをインビボで送達することにおけ るこの系の効力は、種々の障害の動物モデルにおいて実証されている。Watanabe 、Atherosclerosis、36:261-268（1986）；Tanzawaら、FEBS Letters、118(1)： 81-84(1980)；Golastenら、New Engl.J.Med.,309:288-296(1983)；Ishibashiら 、J.Clin.Invest.,92:883-893(1993)；およびIshibashiら、J.Clin.Invest.,93: 1889-1893(1994)を参照のこと。これらの全ては本明細書中で参考として援用さ れる。実際、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（CFTR)のcDNAをコードする組 換え複製欠損アデノウイルスは、少なくとも２つのヒトCF臨床試験における使用 を承認されている。例えば、Wilson，Nature，365:691-692，1993を参照のこと 。遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの安全性のさらなる支持は、ヒト集 団における生アデノウイルスワクチンの広範な経験である。 DMDおよび他の遺伝障害の遺伝子治療のために開発されている第一世代の組換 え複製欠損アデノウイルスは、E1aの全体およびE1b領域の一部の欠失を含む。こ の複製欠損ウイルスは、トランスに作用するE1aタンパク質を提供する機能的な アデノウイルスE1a遺伝子を含む293細胞において増殖される。E1欠失ウイルスは 、293細胞（これは、トランスにE1aおよびE1b領域遺伝子産物を提供する）にお いて複製し得、そして感染性ウイルスを生成し得る。得られるウイルスは、多く の細胞型を感染させ得、そして導入された遺伝子を発現し得る（自身のプロモー ターを保有している場合）が、細胞が非常に高い感染多重度で感染されない限り 、E1領域のDNAを有さない細胞においては複製し得ない。アデノウイルスは、そ れらが広い宿主範囲を有しているという利点を有し、静止細胞またはニューロン のような最終分化細胞に感染し得、そして本質的に非腫瘍形成性のようである。 アデノウイルスは、宿主ゲノムへは取り込まれないようである。それらが染色体 外で存在するので、挿入変異誘発の危険性は、多大に低減される。Aliら、前出 、373。組換えアデノウイルス(rAdV)は、非常に高い力価を生成し、ウイルス粒 子は、中程度に安定で、発現レベルは高く、そして広範囲の細胞が感染され得る 。これらの天然の宿主細胞は、気道上皮であるので、それらは肺ガンの治療のた めに有用である。 バキュロウイルス媒介移入は、いくつかの利点を有する。バキュロウイルス遺 伝子移入は、複製中の細胞および複製中でない細胞において生じ得、そして腎細 胞ならびに肝細胞、神経細胞、脾臓、皮膚、および筋肉において生じ得る。バキ ュロウイルスは、哺乳動物細胞において非複製および非病原性である。ヒトは、 感染をブロックし得る、組換えバキュロウイルスに対する既存の抗体を欠く。さ らに、バキュロウイルスは、非常に大きなDNA挿入物を取り込み得、そして形質 導入し得る。 アデノ随伴ウイルス（AAV）もまた、体細胞性遺伝子治療のためのベクターと して使用されている。AAVは、単純なゲノム構成（4〜7kb）を有する小さな１本 鎖(ss)のDNAウイルスであり、このことは、AAVを、遺伝子操作に理想的な基質と している。２つのオープンリーディングフレームは、一連のrepおよびcapポリペ プチドをコードする。Repポリペプチド（rep78、rep68、rep62、およびrep40） は、AAVゲノムの複製、レスキュー、および組み込みに関与する。capタンパク質 （VP1、VP2、およびVP3）は、ビリオンキャプシドを形成する。repおよびcapオ ープンリーディングフレームの5'および3'末端に隣接して、145bpの逆方向末端 反復配列（ITR）が存在し、その最初の125bpは、Y-およびT-形状の二重鎖構造を 形成し得る。AAVベクターの開発のために重要なことに、全体のrepドメインおよ びcapドメインが切り出され得、そして治療的またはレポータートランスジーン で置換され得る。B.J.Carter、Handbook of Parvoviruses、P.Tijsser編、CRC P ress、155〜168頁（1990）を参照のこと。ITRは、AAVゲノムの複製、レスキュー 、パッケージング、および組み込みに必要とされる最小配列を表すことが示され ている。 アデノ随伴ウイルス（AAV）は、遺伝子治療において重大な可能性を有する。 ウイルス粒子は、非常に安定であり、そして組換えAAV（rAAV）は、ペレット化 によるかまたはCsCl勾配バンド形成によりrAAVが精製され得るという点で、「薬 物様」の特徴を有する。それらは、熱安定性であり、そして凍結乾燥により粉末 にされ得、そして再水和されて完全な活性になり得る。それらのDNAは、宿主染 色体に安定に組み込まれるので発現は長期である。それらの宿主域は広範であり 、そしてAAVは既知の疾患を発症させず、それゆえ組換えベクターは非毒性であ る。 一旦、標的細胞に導入されると、目的の配列は、従来の方法（例えば、ベクタ ーの挿入された遺伝子配列に相同／相補的である配列を含むプローブを使用する 核酸ハイブリダイゼーション）により同定され得る。別のアプローチにおいて、 配列（単数または複数）は、標的細胞への発現ベクターの導入により生じる「マ ーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など）の存 在または非存在により同定され得る。処方および投与 本発明の化合物は、キャリアビヒクルにおける調製のような、標準的な実施に 従って投与される。用語「薬理学的に受容可能なキャリア」は、変異プロトオン コジーンまたは変異腫瘍性タンパク質がそれと結合され、その適用を容易にする 、１つ以上の有機または無機成分（天然または合成）を意味する。適切なキャリ アは、滅菌生理食塩水を含むが、薬学的に受容可能であることが既知である他の 水性および非水性等張滅菌溶液および滅菌懸濁液は、当業者に公知である。この 点において、用語「キャリア」は、リポソームおよびHIV-1 tatタンパク質（Che nら、Anal．Biochem．227:168-175，1995を参照のこと）ならびに任意のプラス ミドおよびウイルス性発現ベクターを包含する。 本発明の任意の新規なポリペプチドは、薬学的に受容可能な塩の形態において 使用され得る。本発明のポリペプチドと塩を形成することが可能な、適切な酸お よび塩基は、当業者に周知であり、そして無機性および有機性の酸および塩を含 む。 本発明の化合物は治療有効量で、被験体に投与され、これは、医学的に所望さ れる結果を生成するまたは特定の処置されている状態に対して影響を及ぼす化合 物の量を意味する。本発明の化合物の有効量は、疾患状態、変性状態、または損 傷状態の寛解または遅延が可能である。有効量は個体に基づいて決定され得、そ して部分的に、被験体の身体的特性、処置されるべき症状、および求められる結 果の考慮に基づく。有効量は、このような因子を使用して、そして慣習的実験以 下を使用して、当業者により決定され得る。 本発明の化合物のためのリポソーム送達システムは、任意の種々の単ラメラ小 胞、多重ラメラ小胞、または安定な複ラメラ（plurilamellar）小胞であり得、 そして当業者に周知の方法に従って（例えば、米国特許第5,169,637号、同第4, 762，915号、同第5,000,958号、または同第5,185,154号の教示に従って）調製お よび投与され得る。さらに、それらのリポソームへの結合を増強するために、本 発明の新規なポリペプチド、ならびに他の選択されたポリペプチドをリポタンパ ク質として発現することが所望され得る。例として、ヒト急性腎不全の、リポソ ーム被包化KIMタンパク質を用いた処置は、リポソームを使用するこのような処 置を必要とする細胞中に、KIMタンパク質を導入することにより、インビボで行 われ得る。リポソームはカテーテルを介して腎動脈に送達され得る。組換えKIM タンパク質は、例えば、イムノアフィニティクロマトグラフィーまたは任意の他 の便利な方法によりCHO細胞から精製され、次いでリポソームと混合され、そし て高い効率でそれらに組み込まれる。被包されたタンパク質は、細胞増殖の刺激 に対する任意の効果についてインビトロで試験され得る。 本発明の化合物は、医学的に受容可能な任意の様式で投与され得る。これは、 注射、非経口的経路（例えば、静脈内、血管内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内 、腹腔内、脳室内、硬膜内、またはその他）、ならびに経口、経鼻、経眼、直腸 的、もしくは局所的を含み得る。持続放出投与もまた、本発明に具体的に含まれ る（例えば、蓄積注射または侵食可能移植物のような手段による）。局所的な腫 瘍に供給している１つ以上の動脈（例えば、腎動脈または血管）に対するカテー テルを介する送達のような手段によるような、局在化送達が特に意図される。 上記の発明は、理解の明瞭さの目的で、例証および例によりいくらか詳細に記 載されているが、特定の変更および改変が、添付の請求の範囲によってのみ制限 されるような本発明の範囲内で実施され得ることは当業者に明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ 49/00 Ａ６１Ｐ 13/12 51/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｐ 13/12 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 49/02 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ヘシオン，キャサリン エイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02043，ヒングハム，オティス ヒル ロ ード 35 (72)発明者 市村 隆治 アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02138，ケンブリッジ，ブラッドバリー ストリート 32 (72)発明者 ウェイ，ヘンリー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02142，ニュートン，ファーウェル スト リート 62 (72)発明者 カテ，リチャード エル. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02193， ウェストン，アロウヘッド ロ ード 64

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．腎臓損傷分子（KIM）をコードする精製および単離されたDNAであって、該KI Mは虚血後の哺乳動物腎臓組織において選択的に発現される細胞表面タンパク質 であり、該DNAは、 a）IgGドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを 有する307アミノ酸のKIM（KIM-1）ポリペプチド（ここで該IgGドメインは６つの 保存されたシステインを含む）、または b）膜貫通ドメインを有する572アミノ酸のKIMポリペプチド のいずれかをコードする、DNA。 ２．クローン3-2（ATCC番号98061）のインサート、クローン1-7（ATCC番号98060 ）のインサート、またはクローンH13-10-85のインサートによりコードされるポ リペプチドをコードする、請求項１(a)に記載のDNA。 ３．クローン4-7（ATCC番号98062）のインサートによりコードされるポリペプチ ドをコードする、請求項１(b)に記載のDNA。 ４．以下から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１(a)に記載のDNA： a）配列番号１、配列番号２、および配列番号６；または b）配列番号１、配列番号２、および配列番号６のスプライス改変体；または c）配列番号１、配列番号２、および配列番号６の縮重改変体。 ５．配列番号１、配列番号２、または配列番号６に相補的な配列を有するDNA。 ６．以下から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１(b)に記載のDNA： a）配列番号４；または b）配列番号４のスプライス改変体；または c）配列番号４の縮重改変体。 ７．配列番号４に相補的な配列を有するDNA。 ８．IgGドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを 有する307アミノ酸のKIM-1ポリペプチドをコードする精製および単離されたDNA であって、該ポリペプチドの配列が、配列番号３および配列番号７から；または 配列番号３および配列番号７と少なくとも40％の相同性を有し、そして配列番号 ３および配列番号７のシステイン残基の少なくとも80％を共有するアミノ酸置換 改変体から選択される、DNA。 ９．IgGドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを 有する307アミノ酸のKIM-1ポリペプチドの可溶性改変体をコードする精製および 単離されたDNAであって、該ポリペプチドの配列が、配列番号３および配列番号 ７から；または配列番号３および配列番号７と少なくとも40％の相同性を有し、 そして配列番号３および配列番号７のシステイン残基の少なくとも80％を共有す るアミノ酸置換改変体から選択される、DNA。 １０．以下を含む融合タンパク質をコードする精製および単離されたDNA： a）IgGドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを 有する307アミノ酸のKIM-1ポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列が、配 列番号３および配列番号７から；または配列番号３および配列番号７と少なくと も40％の相同性を有し、そして配列番号３および配列番号７のシステイン残基の 少なくとも80％を共有するアミノ酸置換改変体から選択される、ポリペプチド； および b）免疫グロブリン、毒素、または造影可能化合物。 １１．膜貫通ドメインを有する572アミノ酸のKIMポリペプチドをコードする精製 および単離されたDNAであって、該ポリペプチドの配列が、配列番号５から、お よび配列番号５と少なくとも40％の相同性を有し、そして配列番号５のシステイ ン残基の少なくとも80％を共有するアミノ酸置換改変体から選択される、DNA。 １２．膜貫通ドメインを有する572アミノ酸のKIMポリペプチドの可溶性改変体を コードする精製および単離されたDNAであって、該ポリペプチドの配列が、配列 番号５から、および配列番号５と少なくとも40％の相同性を有し、そして配列番 号５のシステイン残基の少なくとも80％を共有するアミノ酸置換改変体から選択 される、DNA。 １３．以下を含む融合タンパク質をコードする精製および単離されたDNA： a）膜貫通ドメインを有する572アミノ酸のKIMポリペプチドであって、該ポリ ペプチドの配列が、配列番号５から、および配列番号５と少なくとも40％の相同 性を有し、そして配列番号５のシステイン残基の少なくとも80％を共有するアミ ノ酸置換改変体から選択される、ポリペプチド；および b）免疫グロブリン、毒素、または造影可能化合物。 １４．その中にインサートとして存在する請求項８、９、１０、１１、１２、ま たは１３の核酸を有するベクターであって、該ベクターは必要に応じて該インサ ートに作動可能に連結された発現制御配列を含む、ベクター。 １５．請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。 １６．ポリペプチド産生方法であって、請求項１５に記載の宿主細胞を細胞培養 培地中で培養する工程；および、該宿主細胞内のベクターインサートから発現さ れるKIMポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。 １７．精製および単離されたKIMタンパク質であって： a）IgGドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを 有する307アミノ酸のKIM-1ポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列が、配 列番号３および配列番号７から選択される、ポリペプチド；または b）IgGドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを 有する307アミノ酸のKIM-1ポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列が、配 列番号３および配列番号７と少なくとも40％の相同性を有し、そして配列番号３ および配列番号７のシステイン残基の少なくとも80％を共有するアミノ酸置換改 変体から選択される、ポリペプチド；または c）膜貫通ドメインを有する572アミノ酸のKIMポリペプチドであって、該ポリ ペプチドの配列が、配列番号５に示される、ポリペプチド；または d）膜貫通ドメインを有する572アミノ酸のKIMポリペプチドであって、該ポリ ペプチドの配列が、配列番号５と少なくとも40％の相同性を有し、そして配列番 号５のシステイン残基の少なくとも80％を共有するアミノ酸置換改変体から選択 される、ポリペプチド、 を含む、タンパク質。 １８．請求項１７に記載のKIMタンパク質の可溶性改変体。 １９．請求項１７に記載のKIMタンパク質；および免疫グロブリン、毒素、また は造影可能化合物を含む融合タンパク質。 ２０．免疫グロブリン、毒素、造影可能化合物、または放射性核種に結合された 、請求項１７に記載のKIMタンパク質。 ２１．請求項１７に記載のKIMタンパク質に特異的に結合する抗体。 ２２．毒素、造影可能化合物、または放射性核種に結合された、請求項２１に記 載の抗体。 ２３．請求項２１に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。 ２４．請求項１４に記載のベクターの治療における使用。 ２５．請求項１７に記載のKIMタンパク質の治療における使用。 ２６．請求項１８に記載の可溶性改変体KIMタンパク質の治療における使用。 ２７．請求項１９に記載のKIM融合タンパク質の治療における使用。 ２８．請求項２０に記載のKIM結合体の治療における使用。 ２９．請求項２１に記載の抗体の治療における使用。 ３０．請求項２２に記載の抗体結合体の治療における使用。 ３１．その中に治療有効濃度までの請求項１４に記載のベクターが分散された生 理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。 ３２．その中に治療有効濃度までの請求項１７に記載のKIMタンパク質、請求項 １８に記載の可溶性改変体KIMタンパク質、請求項１９に記載のKIM融合タンパク 質、または請求項２０に記載のKIM結合体が分散された生理学的に受容可能なキ ャリアを含む薬学的組成物。 ３３．その中に治療有効濃度までの請求項２１に記載の抗体、または請求項２２ に記載の抗体結合体が分散された生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組 成物。 ３４．被験体における腎臓損傷の存在またはその消散の過程を評価する方法であ って、腎臓損傷もしくは疾患に罹患している、または腎臓損傷もしくは疾患を発 達する危険にある被験体の尿、血清、または尿沈渣における、請求項８もしくは １１に記載のKIM核酸、または請求項１７に記載のKIMポリペプチドの濃度を測定 する工程を包含する、方法。 ３５．請求項１７に記載のKIMポリペプチドを産生する細胞または組織を画像化 する方法であって、該細胞または組織を、造影可能な請求項２２に記載のKIM抗 体と接触させる工程を包含する、方法。 ３６．前記細胞または組織がインビボで被験体中で処理され、そして造影可能な 結合体が被験体に投与される、請求項３５に記載の方法。 ３７．毒素、放射性核種、または造影可能化合物を、請求項１７に記載のKIMポ リペプチドを産生する細胞に標的化する方法であって、該細胞を請求項２２に記 載のKIM抗体結合体と接触させる工程を包含する、方法。 ３８．前記細胞がインビボで被験体中で処理されるKIM発現腫瘍細胞であり、そ して前記結合体が該被験体に投与される、請求項３７に記載の方法。 ３９．腎臓疾患に罹患している、または腎臓疾患を発達する危険にある被験体を 処置する方法であって、請求項３１，３２、または３３に記載の薬学的組成物を 該被験体に投与する工程を包含する、方法。 ４０．被験体における組織成長を促進する方法であって、請求項３１，３２、ま たは３３に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。 ４１．被験体における損傷された組織の生存を促進する方法であって、請求項３ １，３２、または３３に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含す る、方法。 ４２．前記組織が腎臓組織である、請求項４０または４１に記載の方法。 ４３．前記被験体がヒトである、請求項３４、３６、３８、３９、４０、または ４１に記載の方法。
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