NO327597B1 - Modulatorer for vevsregenerering - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår slike polypeptider som er angitt i krav 1. Slike proteiner blir oppregulert i skadet eller regenererende vev. Oppfinnelsen angår også DNA som koder for disse proteiner som angitt i krav 8. Oppfinnelsen angår videre farmasøytiske sammensetninger og omfattende disse proteiner som angitt i krav 19 samt anvendelse av slike polypeptider for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger som angitt i krav 20 - 22..

Bakgrunn for oppfinnelsen.

En dynamisk remodullering av vevsarkitektur inntreffer under utvikling og under vevs-reparasjon etter skade. For å studere denne prosess har søker fokusert på en modell av nyreskade forårsaket av et ischemi reperfusjonsinngrep.

Nyren er i stand til å reparere skade på det proksimale tubulepitel via en kompleks serie av hendelser som involverer celledød, proliferasjon av overlevende proksimale epitale tubulceller, dannelse av dårlig differensiert regenerativt epitel over den blottlagte ba-salmembran og differensiering av det regenerative epitel for å danne fullstendig funk-sjonsdyktige proksimale tubulepitelceller (Wallin et al., Lab Invest. 66:474-484, 1992;Witzgall et al., Mol. Cell. Biol. 13:1933-1942, 1994; Ichimura et al., Am. J. Physiol. 269:F653-662, 1995; Thadhani et al., N. Engl. J. Med. 334:1448-1460, 1996). Vekstfaktorer så som IGF, EGF og HGF har blitt implikert i denne reparasjonsprosess og likeledes har endotelcelle adhesjonmolekylet ICAM-1. Imidlertid er mekanismene hvorved de tubulære epitelceller blir gjendannet fremdeles ikke forstått.

For å identifisere molekyler som er involvert i prosessen av skade og reparasjon av det tubulære epitel analyserte søker forskjellen i mRNA-populasjonene mellom skadede/regenererende og normale nyrer ved å bruke representativ differensanalyse (RDA). RDA er en PCR-basert metode for subtraksjon som gir målvev eller cellespesifikke cDNA-fragmenter ved gjentatt subtraksjon og amplifikering (Hubank og Schutz, Nucl. Acids Res. 22:5640-5648, 1994).

Oppsummering av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen fremskaffer polypeptider som er nyreskaderelaterte molekyler (hvor hver senere blir kalt en "KIM') og som blir oppregulert i renalt vev etter skade på nyren. KIM-proteinene og peptidene ifølge oppfinnelsen, så vel som deres agonister og anago-nister er anvendelige i en mengde terapeutiske inngrep.

Oppfinnelsen fremskaffer videre et renset og isolert DNA-molekyl som har en nukleotidsekvens angitt i SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO:6, eller hvor nukleinsyren hybridiserer under stringente betingelser til disse sekvenser og som koder for et KIM, hvor nevnte KIM er et celleoverflateprotein som selektivt uttrykkes i post-ischemisk nyrevev hos pattedyr, og hvor hybridiseringsbetingelsene innbefatter en vask i 2 x SSC ved 55 °C og en sluttvask i 0,5 x SSC ved 55 °C. Disse DNA-molekyler kan være rekombinante og kan være operativt knyttet til en ekspresj onskontroll sekvens.

Oppfinnelsen fremskaffer videre en vektor omfattende et renset og isolert DNA-molekyl som har en nukleotidsekvens angitt i SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO:6 eller et av de andre DNA-molekyler definert ovenfor. Denne vektor kan være et biologisk funksjonelt plasmid eller viral DNA-vektor. En utførelsesform av oppfinnelsen fremskaffer en prokaryot eller eukaryot vertscelle som er stabilt transformert eller transfektert med en vektor omfattende et DNA-molekyl av SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO:6. I en annen utførelsesform av oppfinnelsen blir det fremskaffet en fremgangsmåte for fremstilling av et KIM polypeptidprodukt kodet for av et DNA-molekyl som beskrevet ovenfor hvor fremgangsmåten innbefatter dyrking under passende dyrkningsbetingelser av prokaryote eller eukaryote vertsceller som er transformert eller transfektert med DNA-molekylet på en måte som tillater ekspresjon av DNA-molekylet og gjenvinner polypeptidproduktet av nevnte ekspresjon.

Et renset og isolert humant KIM-protein som i hovedsak er fritt for andre humane proteiner ligger spesielt innenfor oppfinnelsen, samt en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptidprodukt som har en del eller alt av den primære strukturelle konformasjon og den biologiske aktivitet til et KIM-protein. KIM-proteiner ifølge oppfinnelsen kan ha en aminosyresekvens som omfatter SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 eller SEQ ID NO:7, eller kan være en variant av SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 eller SEQ ID NO:7, eller et renset og isolert protein kodet for av DNA ifølge SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO:6. Disse proteiner kan bli fremskaffet i hovedsak fri for andre humane proteiner. Oppfinnelsen innbefatter ytterligere varianter av disse proteiner som er 90 % identiske med sekvensene SEQ ID NO: 3,5 eller 7 så som oppløse-lige varianter eller fusjonsproteiner. KIM fusjonsproteiner kan ifølge oppfinnelsen omfatte et immunoglobulin, et toksin, en påvisbar forbindelse eller et radionuklid.

Oppfinnelsen fremskaffer også et spesifikt monoklonat antistoff til KIM-proteinene beskrevet ovenfor. Anti-KIM antistoffet kan være assosiert med et toksin, påvisbar forbindelse eller radionuklid. Videre beskrevet er en hybridom cellelinje som danner et slikt spesifikt antistoff.

Farmasøytiske sammensetninger som angitt i krav 19 ligger også innenfor omfanget av oppfinnelsen. En farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen kan omfatte en terapeutisk mengde av et KIM-protein eller anti-KIM antistoff ifølge oppfinnelsen sammen med et farmakologisk akseptabelt bæremiddel.

Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan benyttes til å påvise tilstedeværelse eller resolu-sjonsforløp av renal skade hvor konsentrasjonen av KIM i urinen, serum eller urinsediment hos pasienter som har eller er i risiko for å utvikle renal sykdom måles.

Andre terapeutiske forbindelser kan innbefatte KIM-ligander, anti-KIM-antistoff og fusjonsproteiner av KIM-ligander. Disse forbindelser kan være anvendelige ved terapeutiske metoder som enten stimulerer eller hemmer celleresponser som er avhengige av KIM-funksjonen.

Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan benyttes til å inhibere veksten av KIM-uttrykkende tumorceller hvor cellene settes i kontakt med et fusjonsprotein av en KIM-ligand og enten et toksin eller radionuklid eller med et anti-KIM-antistoff konjugert til et toksin eller til et radionuklid. Likeledes kan vekst av tumorceller som uttrykker KIM-ligand bli hemmet ved å sette cellene i kontakt med et fusjonsprotein av et KIM og enten et toksin eller radionuklid, eller med et anti-KIM-ligand antistoff konjugert til et toksin eller til et radionuklid.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er også anvendelige for å avbilde vev enten in vitro eller in vivo. En slik metode innbefatter å målrette en avbildbar forbindelse til en celle som uttrykker et protein av SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 eller SEQ ID NO:7 omfattende å sette cellen i kontakt med enten et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, eller et fusjonsprotein omfattende et protein som beskrevet ovenfor fusert til en påvisbar forbindelse.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan også benyttes til å undersøke tilstedeværelsen eller konsentrasjonen av et slikt molekyl enten i urin, serum eller andre kroppsvæsker eller i urinsediment eller vevsprøver. Det målte skaderelaterte molekyl kan bli korrelert med tilstedeværelsen, utstrekningen eller forløpet av en patologisk prosess. Denne korrelasjonen kan også bli brukt for å undersøke effektiviteten av en terapeutisk metode.

Kort beskrivelse av tegningene.

Figur 1 er en nukleotidsekvens av rotteklon cDNA 3-2, med forsøksvis proteinleseramme av 615 - 1535. Figur 2 er en opplisting av cDNA-sekvensen av rotteklon 1-7 med forsøksvis proteinleseramme av 145 - 1065. Figur 3 er en opplisting av cDNA-sekvensen av rotteklon 4-7 med forsøksvis proteinleseramme av 107 - 1822. Figur 4 er en opplisting av cDNA og avledet aminosyresekvens av human klon Ffl3 - 10 - 85 med en forsøksvis proteinleseramme på 1 - 1002. Den øvre linje av opplistingen er cDNA-sekvensen (SEQ ID NO:6) og den nedre linje er den avledede aminosyresekvens (SEQ ID NO:7).

Figur 5 er en BESTFIT sammenligning av nukleotidsekvensen av human klon på HI3 - 10-85 med den fra rotteklon 3-2.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.

Søker identifiserte KIM-gener ved å analysere forskjeller i mRNA-ekspresjonen mellom regenererende og normale nyrer ved å bruke representasjonsmessig differensanalyse (RDA). RDA er en PCR-basert metode for subtraksjon som gir målvev eller cellespesifikke cDNA-fragmenter ved gjentatt subtraksjon og amplifikering. cDNA-representa-sjonen fra 48 timer postischemisk voksen rottenyre RNA blir subtrahert med prøven fra normal (liksom-operert) voksen rottenyre. I denne prosedyre blir sekvenser som er felles for både postischemiske og normale nyreprøver fjernet, noe som etterlater de sekvenser som blir signifikant uttrykt kun i skadet nyrevev. Slike gener koder for proteiner som kan være terapeutisk gunstige for nyrelidelser eller som er involvert i skadeproses-sen. Flere kloner har blitt dannet, sekvensert og karakterisert. Klonene blir så under-søkt for sitt ekspresjonsmønster under nyrereparasjonen, utvikling og vevsdistribusjo-nen med northern analyse og RNA in situ hybridisering.

Sekvensidentiifkasj onsnumre.

Nukleotid- og aminosyresekvenser referert til i beskrivelsen har blitt gitt følgende sek-vensidentifikasj onsnumre:

SEQ ID NO: 1 - nukleotidsekvens av rotte 3-2 cDNA innskudd

SEQ ID NO:2 - nukleotidsekvens av rotte 1-7 cDNA innskudd

SEQ ID NO:3 - aminosyresekvens av rotte KIM-1, kodet for av rotte 3-2 og 1-7 cDNA SEQ ID NO:4 - nukleotidsekvens av rotte 4-7 cDNA innskudd

SEQ ID NO:5 - aminosyresekvens kodet for av 4-7 cDNA innskudd

SEQ ID NO:6 - nukleotidsekvens av human cDNA-klon H13-10-85

SEQ ID NO:7 - aminosyresekvens kodet for av human cDNA-klon H13-10-85.

Definisjoner av uttrykk.

Et "KIM-protein", heri brukt synonymt med "KIM" er et protein kodet for av mRNA som er selektivt oppregulert etter en nyreskade. En gruppe av KIM-proteiner av interesse innbefatter dem kodet for av mRNA som blir selektivt oppregulert ved enhver tid innen en uke etter ethvert inngrep som resulterer i en skade på nyrevev. Eksempler på tider hvorved slik oppregulering kunne bli identifisert innbefatter 10 timer, 24 timer, 48 timer eller 96 timer etter en skade. Eksempler på typer skade innbefatter dem som resulterer i ischemisk, toksisk eller andre typer skade.

En "KIM-agonist" er et molekyl som spesifikt kan sette i gang en cellulær respons normalt satt i gang av interaksjonen mellom KIM og en KIM-ligand. En KIM-agonist kan være en KIM-variant eller et spesifikt antistoff mot KIM, eller en oppløselig form av KIM-liganden.

En "KIM-antagonist" er et molekyl som spesifikt kan assosiere med en KIM-ligand eller KIM for derved å blokkere eller på annen måte hemme KIM-binding til KIM-liganden. Antagonistbindingen blokkerer eller hemmer cellulær-responser som ellers kunne bli satt i gang ved ligering av KIM-liganden til KIM eller med en KIM-agonist. Eksempler på KIM-antagonister innbefatter visse KIM-varianter, KIM-fusjonsproteiner og spesifikke antistoff mot en KIM-ligand eller KIM.

En "KIM-ligand" er ethvert molekyl som ikke-kovalent og spesifikt binder seg til et KIM-protein. En slik ligand kan være et protein, peptid, steroid, antistoff, aminosyrederivat eller annen type molekyl i enhver form innbefattende naturlig forekommende, rekombinant produserte eller på annen måte syntetiske. En KIM-ligand kan være i enhver form, innbefattende oppløselig, membranbundet eller del av en fusjonskonstruk-sjon med immunoglobulin, fettsyre eller andre enheter. KIM-liganden kan være et inte-grin. En membranbundet KIM-ligand kan virke som en reseptor som når den er bundet til eller assosiert med KIM setter i gang en cellerespons. I enkelte interaksjoner kan KIM assosiere med mere enn en enkel KIM-ligand eller kan assosiere med en KIM-ligand som deler av et kompleks med en eller flere andre molekyler eller ko-faktorer. I en situasjon hvor både KIM og KIM-liganden er bundet til cellemembraner kan KIM assosiere og reagere med KIM-ligand som er bundet til samme celle som KIM eller den kan assosiere og reagere med KIM-ligand som er bundet til en annen celle. Hvor KIM-ligering inntreffer mellom molekyler bundet til forskjellige celler kan de to celler være like eller forskjellige med hensyn til celletype eller opprinnelse, fenotype eller metabolsk tilstand eller type eller grad av cellerespons (for eksempel vekst, differensiering eller apoptose) til en gitt stimulus. "KIM-ligering" refererer til kontakten og bindingen av KIM til en KIM-ligand.

Med "sammenligning mellom sekvenser" menes plasseringen av en sekvens, enten nukleotid eller aminosyre med den til en annen for å tillate sammenligning av sekvensen av relevante deler av en med den til den andre. Et eksempel på en metode av denne prosedyre er gitt i Needleman et al (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970). Metoden kan bli passende utført med computerprogrammer så som Align-programmet (DNAstar, Inc.). Som vil bli forstått av fagmannen innbefatter homologe eller funksjonelt ekvivalente sekvenser funksjonelt ekvivalente arrangementer av cysteinresiduene i det konserverte cysteinskjelett, innbefattende aminosyreinnsetninger eller utelatelser som endrer det lineære arrangement av disse cysteiner, men ikke i vesentlig grad ødelegger deres forhold i den foldede struktur av proteinet. Følgelig blir innvendige gap og aminosyreinnsetninger i kandidatsekvensen ignorert for formål med å beregne nivået av aminosyre-sekvenshomologi eller identitet mellom kandidaten og referansesekvenser. Et karakte-ristikum som ofte blir brukt ved etablering av homologien av proteiner er likheten mellom antall og beliggenhet av cysteinresiduene mellom et protein og et annet.

"Antisens DNA" refererer til sekvensen av kromosomalt DNA som blir transkribert.

En "antisens probe" er en probe som omfatter minst en del av antisens DNA for en nukleinsyredel av interesse.

Med "kloning" menes anvendelsen av in vitro rekombinasjonsteknikker for å sette inn et spesielt gen eller annen DNA-sekvens i et vektormolekyl. For å lykkes med å klone et ønsket gen er det nødvendig å anvende metoder for å danne DNA-fragmenter for å spleise fragmentene til vektormolekyler for å innføre det sammensatte DNA-molekyl i en vertscelle hvor det kan replikere og for å velge ut klonen som har målgenet fra de mottakende vertsceller.

Med "cDNA" menes komplementær eller kopi DNA dannet fra et RNA-templat ved virkningen av RNA-avhengig DNA-polymerase (revers transkriptase). Således betyr "cDNA-klon" en dupleks DNA-sekvens som er komplementær til et RNA-molekyl av interesse, båret i en kloningsvektor.

Med "cDNA-bibliotek" menes en samling av rekombinante DNA- molekyler inneholdende cDNA-innskudd som sammen utgjør en representasjon av mRNA-molekylene som er til stede i en fullstendig organisme eller vev avhengige av kilden for RNA-templatene. Et slikt cDNA-bibliotek kan bli fremstilt ved metoder kjent for fagmannen og beskrevet for eksempel i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra. Generelt blir RNA først isolert fra cellene hos en organisme fra viss genom det er ønsket å klone et spesielt gen. Foretrukket for formålet med foreliggende oppfinnelse er pattedyr og spesielt menneskelige cellelinjer. Alternativt kan RNA bli isolert fra en tumorcelle avledet fra en animalsk tumor og fortrinnsvis fra en human tumor. Således kan et bibliotek bli fremstilt fra for eksempel en human adrenal tumor, men enhver tumor kan bli brukt.

Som brukt heri refererer uttrykket "DNA polymorfi" til tilstanden hvor 2 eller flere forskjellige nukleotidsekvenser kan eksistere ved et spesielt område i DNA.

"Ekspresjonsvektor" innbefatter vektorer som er i stand til å uttrykke DNA-sekvenser inneholdt deri, dvs. de kodende sekvenser er operativt bundet til andre sekvenser som er i stand til å utføre deres ekspresjon. Det er implikert, selv om ikke alltid eksplisitt angitt at disse ekspresjonsvektorer må være replikerbare i vertsorganismen enten som episo-mer eller som en integral del av det kromosomale DNA. Et nyttig, men ikke et nødven-dig element av en effektiv ekspresjonsvektor er en markørkodende sekvens som er en sekvens som koder for et protein som resulterer i en fenotypisk egenskap (så som tetra-cyklinresistens) hos cellene som inneholder proteinet som tillater disse celler lett å bli identifisert. I korthet er "ekspresjonsvektor" gitt en funksjonell definisjon og enhver DNA-sekvens som er i stand til å utføre ekspresjonen av en spesiell inneholdt DNA-kode blir inkludert i uttrykket slik det blir anvendt på den spesielle sekvens. For tiden foreligger slike vektorer ofte i form av plasmider, og således blir "plasmid" og "ekspresjonsvektor" ofte brukt om hverandre. Imidlertid er oppfinnelsen ment å innbefatte slike andre former for ekspresjonsvektorer som har ekvivalente funksjoner og som, fra tid til annen kan bli kjent innen faget.

Med "funksjonelt derivat" menes "fragmentene", "variantene", "analogene" eller "kjemiske derivater" av et molekyl. Et "fragment" av et molekyl, så som enhver av antige-nene ifølge foreliggende oppfinnelse er ment å referere til ethvert polypeptid undersett av molekylet. En "variant" av slike molekyler er ment å referere til et naturlig forekommende molekyl som i hovedsak er likt, enten hele molekylet eller et fragment derav. En "analog" av et molekyl er ment å referere til et ikke-naturlig molekyl som i hovedsak er likt enten hele molekylet eller et fragment derav.

Uttrykket "gen" betyr en polynukleotidsekvens som koder for et peptid.

Med "homogen" menes når det refereres til et peptid eller DNA-sekvens at den primære molekylstruktur (dvs. sekvensen av aminosyrer eller nukleotider) av i hovedsak alle molekyler som er til stede i sammensetningen som betraktes er identiske.

"Isolert" refererer til et protein ifølge foreliggende oppfinnelse, eller ethvert gen som koder for ethvert slikt protein som i hovedsak er fritt for henholdsvis andre proteiner eller gener, eller for andre forurensninger med hvilke de normalt blir funnet i naturen og som sådan eksisterer i en form som ikke finnes i naturen.

Uttrykket "markør" refererer til en molekylenhet som er i stand til påvisning, innbefattende som eksempel, uten begrensning radioaktive isotoper, enzymer, luminescente midler og fargestoffer.

Uttrykket "probe" refererer til en ligand med kjente egenskaper som er i stand til selektivt å binde til en mål-antiligand. Når anvendt på nukleinsyrer refererer uttrykket "probe" til en kjede av nukleinsyrer som har en basesekvens som er komplementær til en målkjede.

"Rekombinante vertsceller" refererer til celler som har blitt transformert med vektorer konstruert ved å bruke rekombinante DNA-teknikker. Som definert heri, er antistoffet eller modifikasjonen derav fremstilt av en rekombinant vertscelle med basis i denne transformasjonen i stedet for i mye mindre mengder eller oftere i slike mindre enn påvisbare mengder som ville bli produsert av den utransformerte vertsorganisme.

Med "i hovedsak ren" menes ethvert protein ifølge foreliggende oppfinnelse, eller ethvert gen som koder for ethvert slikt protein som er i hovedsak fritt for henholdsvis andre proteiner eller gener, eller for andre forurensninger med hvilke det normalt kunne bli funnet i naturen og eksisterer som sådan i en form ikke funnet i naturen.

Et molekyl er hevdet å være "i hovedsak lik" et annet molekyl dersom sekvensen av aminosyrer i begge molekyler er i hovedsak den samme, og dersom begge molekyler har en lignende biologisk aktivitet. Således, forutsatt at 2 molekyler har en lignende aktivitet blir de vurdert som varianter slik uttrykket blir brukt heri selv om et av molekylene inneholder ytterligere aminosyreresiduer som ikke finnes i det andre, eller dersom sekvensen av aminosyreresiduer ikke er identisk. Som brukt heri blir et molekyl hevdet å være et "kjemisk derivat" av et annet molekyl dersom det inneholder ytterligere kjemiske enheter som ikke normalt er en del av molekylet. Slike enheter kan forbedre molekylets oppløselighet, absorpsjon, biologiske halveringstid, osv.. Enhetene kan alternativt minke toksisiteten av molekylet, eliminere eller svekke enhver uønsket bieffekt av molekylet, osv.. Enheter som er i stand til å gi slike effekter er for eksempel beskrevet i Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Med "vektor" menes et DNA-molekyl som er avledet fra et plasmid eller en bakteriofag, i hvilke fragmenter av DNA kan være satt inn eller klonet. En vektor vil inneholde et eller flere enestående restriksjonsseter, og kan være i stand til autonom replikasjon i en gitt vert eller bærerorganisme slik at den klonede sekvens er reproduserbar.

Forbindelser ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen innbefatter cDNA av SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO:6 så vel som sekvenser som inkluderer sekvensen av SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO:6 og derivater av disse sekvenser. Oppfinnelsen innbefatter også vektorer, som omfatter disse sekvenser eller derivater av disse. Oppfinnelsen innbefatter ytterligere proteiner transkribert fra SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO:6, innbefattende SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 eller SEQ ID NO:7 og deres derivater og varianter.

En utførelsesform av oppfinnelsen innbefatter oppløselige varianter av et KIM-protein som vanligvis blir syntetisert som et membranassosiert protein og som blir oppregulert etter skade. Oppløselige varianter mangler i det minste en del av den transmembrane eller intramembrane del av et nativt KIM-protein. I enkelte eksempler mangler den oppløselige variant hele den transmembrane eller intramembrane del av et nativt KIM-protein. Oppløselige varianter innbefatter fusjonsproteiner som omfatter derivater av KIM-proteiner som mangler minst en del av den transmembrane eller intramembrane del av et nativt KIM-protein. Alle typer KIM-fusjonsproteiner er innbefattet, spesielt dem som inkluderer his-tag, Ig-tag og myc-tag former av molekylet. Disse KIM-fusjo-ner kan ha karakteristika som er terapeutisk fordelaktige så som øket halveringstid fremskaffet av Ig-tag. Også innbefattet er fusjonsproteiner som inkorporerer deler av utvalgte domener av KIM-proteinet.

Varianter kan være forskjellige fra naturlig forekommende KIM-protein i aminosyresekvens eller i måter som ikke involverer sekvensen eller begge deler. Varianter i aminosyresekvens blir dannet når en eller flere aminosyrer i naturlig forekommende KIM-protein blir substituert med en forskjellig naturlig aminosyre, et aminosyrederivat eller en ikke-nativ aminosyre. Spesielt foretrukne varianter innbefatter naturlig forekommende KIM-protein eller biologisk aktive fragmenter av naturlig forekommende KIM-protein viss sekvenser er forskjellige fra villtypesekvensen ved en eller flere konservative aminosyresubstitusjoner som typisk har minimal innvirkning på den sekundære struktur og hydrofobe natur av proteinet eller peptidet. Varianter kan også ha sekvenser som er forskjellige med en eller flere ikke-konservative aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller innsetninger som ikke fjerner den biologiske KIM-proteinaktivitet. Konservative substitusjoner innbefatter typisk utskiftingen av en aminosyre med en annen med lignende karakteristika så som utskiftninger innenfor de følgende grupper: valin, glysin; glysin, alanin; valin, isoleucin; asparaginsyre, glutaminsyre; asparagin, glutamin; serin, treonin; lysin, arginin; og fenylalanin, tyrosin. De ikke-polare (hydrofobe) aminosyrer innbefatter alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. De polare, nøytrale aminosyrer innbefatter glysin, serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer innbefatter arginin, lysin og histidin. De negativt ladede (sure) aminosyrer innbefatter asparaginsyre og glutaminsyre.

Andre konservative substitusjoner kan bli tatt fra tabellen nedenfor og atter andre er beskrevet av Dayhoff i the Atlas of Protein Sequence and Structure (1988). Andre varianter innenfor oppfinnelsen er slike med modifikasjoner som øker peptidsta-bilitet. Slike varianter kan inneholde for eksempel en eller flere ikke-peptidbindinger (som erstatter peptidbindingene) i peptidsekvensen. Også innbefattet er: varianter som inkluderer residuer andre enn de naturlig forekomne L-aminosyrer, så som D-aminosyrer eller ikke-naturlig forekomne eller syntetiske aminosyrer så som beta eller gamma aminosyrer og cykliske varianter. Inkorporering av D- i stedet for L-aminosyrer i polypeptidet kan øke dets motstandsdyktighet overfor proteaser. Se for eksempel US patent 5,219,990.

Generelt er substitusjoner som kan bli ventet å indusere endringer i de funksjonelle egenskaper av KIM-polypeptider slike hvor: (i) et hydrofilresiduum, for eksempel serin eller treonin er skiftet ut med et hydrofobt residuum, for eksempel leucin, isoleucin, fenylalanin eller alanin; (ii) et cysteinresiduum er skiftet ut med (eller av) ethvert annet residuum; (iii) et residuum med en elektropositiv sidekjede, for eksempel lysin, arginin eller histidin er skiftet ut med (eller av) et residuum med en elektronegativ ladning, for eksempel glutaminsyre eller asparaginsyre; eller (iv) et residuum med en omfangsrik sidekjede, for eksempel fenylalanin er skiftet ut med (eller av) en som ikke har en slik sidekjede, for eksempel glysin.

Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli modifisert med forskjellige endringer så som innskudd, delesjoner og substitusjoner som enten er konservative eller ikke-konservative, hvor slike endringer kan gi visse fordeler i deres bruk. Spleisede varianter er spesielt innbefattet i oppfinnelsen.

I andre utførelsesformer kan varianter med aminosyresubstitusjoner som er mindre konservative også resultere i ønskede derivater, for eksempel ved å forårsake endringer i ladning, konformasjon og andre biologiske egenskaper. Slike substitusjoner ville for eksempel innbefatte substitusjon av hydrofile residuer med et hydrofobt residuum, substitusjon av et cystein eller prolin med et annet residuum, substitusjon av et residuum med en liten sidekjede med et residuum som har en omfangsrik sidekjede eller substitusjon av et residuum som har en netto positiv ladning med et residuum som har en netto negativ ladning. Idet resultatet av en gitt substitusjon ikke kan bli forutsagt med sikkerhet kan derivatene lett bli undersøkt i henhold til metoder beskrevet heri for å bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av de ønskede karakteristika.

Varianter innenfor omfanget av oppfinnelsen innbefatter proteiner og peptider med aminosyresekvenser som har minst 80% homologi med et KIM-protein. Mer foretrukket er sekvenshomologien minst 90% eller minst 95%. For formålene med å bestemme homologi vil lengden av sammenligningssekvenser generelt være minst 8 aminosyreresiduer, vanligvis minst 20 aminosyreresiduer. Varianter av forbindelsene ifølge oppfinnelsen innbefatter også ethvert protein som 1) har en aminosyresekvens som er minst 40% homolog med et KIM-protein ifølge oppfinnelsen, og også som 2) etter å ha blitt plassert i en optimal samstilling med KIM-sekvensen (som angitt i figur 5 for human og for rotte KIM-1) har minst 80% av sine cysteinresiduer samstilt med cysteiner i KIM-proteinet ifølge oppfinnelsen.

Likesom det er mulig å erstatte substituenter i et reisverk er det også mulig å substituere funksjonelle grupper som er bundet til reisverket med grupper som er særpreget av lignende trekk. Disse substitusjoner vil initielt være konservative, dvs. den erstattende gruppe vil ha omtrentlig samme størrelse, form, hydrofobisitet og ladning som den opp-rinnelige gruppe. Ikke-sekvensmodifisering kan for eksempel innbefatte in vivo eller in vitro kjemisk derivatisering av deler av naturlig forekomne KIM-protein så vel som endringer i acetylering, metylering, fosforylering, karboksylering eller glykosylering.

Også innbefattet innen oppfinnelsen er midler som spesifikt binder til proteinet eller et fragment av proteinet (SEQ ID NO:3, 5 eller 7). Disse midler innbefatter ligander og antistoff (innbefattende monoklonale, enkeltkjedet, dobbeltkjedet, Fab-fragmenter og andre, hvorvidt de er native, humane, humaniserte, primatiserte eller kimeriske). Ytterligere beskrivelser av disse kategorier av midler er i PCT-søknad 95/16709.

Eksperimentelle prosedyrer.

1. Generering av RNA fra ischemiske og normale voksne rottenyrer.

Ischemisk skadede rottenyrer blir dannet som beskrevet av Witzgall et al. (J. Clin Invest. 93:2175-2188, 1994). Kort angitt blir nyrearterien og venen fra en nyre hos en voksen Sprague-Dawley rotte klemt sammen i 40 minutter og så reperfusert. Skadede nyrer blir innhøstet fra rottene ved 24 timer og ved 48 timer etter reperfusjon. Nyrer fra liksomopererte normale voksne Sprague-Dawley rotter blir også samlet inn.

Totalt RNA blir fremstilt fra organene basert på metoden til Glisin et al (Biochemistry 13:2633, 1974). Kort angitt blir de innsamlede organer plassert umiddelbart i GNC-buffer (4M guanidin tiocyanat, 0,5% SDS, 25mM natriumcitrat, 0,1% Sigma antiskum) og ødelagt på is med en polytron. Celleavfall blir fjernet med lavhastighet sentrifuge-ring i en klinisk sentrifuge og supernatantvæsken blir plassert på et 5,7 M CsCl, 25mM natriumacetat, ImM EDTA-lag. RNA blir pelletert gjennom laget i en SW40Ti-rotor ved 22K i 15 timer. RNA blir resuspendert i steril DEPC-behandlet vann, utfelt to ganger med 1/10 volumdel 3M natriumacetat og 2,5 volumdeler EtOH. Poly A+RNA isoleres ved å bruke et mRNA opprenskningssett (Pharmacia, katalog nr. 27-9258-02). 2. Representasjonsmessig differensanalyse ( RDA) metode for å isolere 1- 7, 3- 2 oe 4- 7 RDA fragmenter.

Dobbeltkjedet cDNA syntetiseres fra liksomopererte og fra 48 timers post-ischemiske nyrer poly A+RNA ved å bruke Gibco BRL "Superscript Choice™ System cDNA Synthesis Kit", katalog nr. 18090. Første kjede syntetiseres ved å forbehandle med oligo dT og bruke Superscript II™ revers transcriptase. Andre kjede dannes ved å bruke E. coli DNA polymerase I og RNase H fulgt av T4 DNA polymerase ved å bruke BRL-anbefalte betingelser.

RDA-analyse utføres i hovedsak som beskrevet av Hubank og Schatz (Nucleic Acid Research 22: 5640-48, 1994). Kort angitt blir 48 timer post-ischemisk nyre-cDNA spaltet med restriksjonsenzymet Dpn II og ligert til R-Bgl-12/24 oligonukleotider (se referanse for nøyaktig sekvens). PCR-amplifikering (utført med Perkin-Elmer Taq polymerase og deres tilsvarende PCR-buffer) av det linkerligerte cDNA benyttes for å danne den initielle representasjon. Dette PCR-produkt blir betegnet "tester amplicon". Den samme fremgangsmåte benyttes for å danne "driver amplicon" fra liksomoperert rottenyre cDNA.

Hybridisering av tester- og driverampliconner fulgt av selektiv amplifikering blir utført 3 ganger for å danne differensielt produkt en (DPI), to (DP2) og tre (DP3). Generering av DPI-produktet blir utført som beskrevet av Hubank og Schatz (Nucleic Acid Research 22: 5640-48, 1994). DP2- og DP3-produktene blir også generert som beskrevet av Hubank og Schatz (id), bortsett fra at driverttesterforholdet er endret til 5.333:1 for DP2 og til 40.000:1 eller 4.000:1 for DP3.

Tre RDA-produkter blir klonet fra DP3 inn i kloningsvektoren pUC 18:RDA-produkt 1-7 (252 bp) når DP3 ble dannet ved å bruke et forhold på 40.000:1, og produkt RDA 3-2

(445 bp) og 4-7 (483 bp) når DP3 ble dannet ved å bruke et forhold på 4.000:1. DNA-fragmentene blir subklonet ved å bruke Pharamacia Sureclone™ kit (katalog nr. 27-9300-01) for å reparere endene av PCR-fragmentene med Klenow-enzym og å lette buttendet ligering av fragmentene i pUC18-vektoren.

3. Northern Analyse.

Poly A+RNA (2,5 ug) fra voksne normale rottenyrer (liksomoperert) fra 48 timers post-ischemisk skadet voksen nyre, og fra dag 18 embryonisk nyre elektroforeres og Northern blottes (Cate, Cell 45:685, 1986) til en GeneScreen™-membran (Dupont). Hybridisering i PSB-buffer (50 mM Tris 7,5 IMNaCI, 0,1% Na pyrofosfat, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% BSA, 1% SD A), inneholdende 10% dekstransulfat og 100 ug/ml tRNA, utføres ved 65°C ved å bruke tre forskjellige prober: 1-7 RDA-produkt, 3-2 RDA-produkt og 4-7 RDA-produkt. Alle er radiomerket ved å bruke Pharmacias "Ready to Go™" tilfeldig priming markørsett (katalog nr. 27-9251-01). RDA-produkter 1-7, 3-2 og 4-7 hybridiserer til mRNA som er til stede i alle tre prøver, men mest intens til mRNA i 48 timers post-ischemisk nyre-RNA-prøvene.

En Northern-blott-analyse av voksent rottevev indikerer at 1-7-genet blir uttrykt ved meget lave nivåer i normale, voksne nyrer, testis, milt og lunge. 3-2-genet blir uttrykt i lever, nyre, milt og hjerne. 4-7-genet blir uttrykt i milt, nyre, lunge, testis, hjerte, hjerne, lever og skjelettmuskel. Tilstedeværelsen av mRNA av forskjellig størrelse i enkelte vev i 1-7 og 3-2-blottene indikerer at det primære transkripsjonsprodukt av 1-7-genet og av 3-2-genet kan undergå alternativ spleising og/eller polyadenylering.

4. Isolering av 3- 2 oe 4- 7 cDNA- kloner.

Et cDNA-bibliotek dannes fra 4 ug av poly A+RNA fra 48 timers post-ischemiske skadede nyrer ved å bruke reagenser fra BRL Superscript Choice™ System for cDNA-syntese og Stratagene™ Lambda ZapII cloning sett (katalog nr. 236201), i henhold til fremgangsmåtene anbefalt av forhandlerne.

10<5->kloner blir undersøkt med 3-2 RDA-produktet som en probe (tilfeldig merket som beskrevet ovenfor). Åtte positive kloner blir valgt ut og fire blir tilfeldig valgt for se-kundær analyse for å fremskaffe rene fag-plakker. Etter tertiær utvelgelse blir fire rene fagkloner isolert. Klonede innskudd fra fagen isoleres ved in vivo utkuttingsprosedyre i henhold til Stratagene™ Lambda Zap II sett. Det største innskudd på omtrent 2,6 kb (referert til som cDNA-klon 3-2) utsettes for DNA-sekvensering. Sekvensen av inn-

skuddet (SEQ ID N0:1) er vist i figur 1. cDNA-klon 3-2 (£. coli K-12, SOLR/p3-2#5-1) har blitt deponert som ATCC nr. 98061. Sekvensen av cDNA-klon 3-2 er identisk til den for klon 1-7 cDNA (SEQ ID NO:2), bortsett fra at nukleotid 136-605 av SEQ ID NO: 1 representerer et innskudd. Således representerer SEQ ID NO:2 en spleisevariant-form av SEQ ID NO: 1. Klonen for 1-7 ( E. coli K-12, SOLR/pl-7#3-l) har blitt deponert som ATCC nr. 98060.

10<5->kloner blir undersøkt med 1-7 RDA-produktet som en probe (tilfeldig primet radiomerket som beskrevet ovenfor). Åtte positive kloner velges ut og fire blir tilfeldig valgt for sekundæranalyse for å fremskaffe rene fag-plakker. Etter tertiær utvelgelse blir fire rene fag-kloner isolert. Klonede innskudd fra fagen isoleres ved in vivo utkuttingsprosedyre i henhold til Stratagene™ Lambda Zap II sett. Det største innskudd på omtrent 2,0 kb (referert til som cDNA-klon 1-7) underkastes DNA-sekvensering hvor sekvensen av innskuddet (SEQ ID NO:2) er vist i figur 2.

10<5> kloner blir undersøkt med 4-7 RDA-produktet som en probe (tilfeldig primet merket som beskrevet ovenfor og hybridisert i PSB ved 65°C). Åtte positive kloner velges ut og fire blir tilfeldig valgt for sekundæranalyse for å danne rene fag-plakker. Etter se-kundær utvelgelse blir to rene fag-kloner isolert. Klonede innskudd fra fagen isoleres ved in vivo utkuttingsprosedyre i henhold til Stratagene™ Lambda Zap II sett. Det største innskudd, som er omtrentlig 2,4 kb (referert til som cDNA-klon 4-7) underkastes DNA-sekvensering. Sekvensen av innskuddet, SEQ ID NO:4 er vist i figur 3. cDNA-klonen 4-7 ( E. coli K-12, SOLR/p4-7#l-l) har blitt deponert som ATCC nr. 98062.

5. Karakterisering av 1- 7, 3- 2 oe 4- 7 cDNA- kloner.

A.) DNA og proteinsekvenser:

Sekvensen av 3-2 cDNA (figur 1; SEQ ID NO: 1) inneholder en åpen leseramme på 307 aminosyrer (figur 1; SEQ ID NO:3). En signal sekvens på 21 aminosyrer blir antydet fra Von Heijne analyse (Von Heijne et al., Nucl. Acid Res. 14:14683 (1986), og et transmembrant område som strekker seg over omtrentlig aa 235-257 indikerer at 3-2-produktet er et celleoverflateprotein.

Sekvensen av 1-7 cDNA (figur 2; SEQ ID NO:2) inneholder en åpen leseramme på 307 aminosyrer som er identisk med den åpne leseramme inneholdt i 3-2 cDNA (SEQ ID NO:3). Sekvensen av 4-7 cDNA (figur 3; SEQ ID NO:4) inneholder en åpen leseramme på 572 aminosyrer (SEQ ID NO:5). Et transmembrant område ligger ved omtrentlig aminosyrer 501-521.

B. In situ analyse av 1-7, 3-2 og 4-7 mRNA i kontralaterale og i post-ischemiske voksne rottenyrer: In situ hybridisering utføres i henhold til metoden beskrevet av Finch et al., Dev. Dynamics 203: 223-240, 1995. Kort angitt blir både ischemiske og kontralaterale nyrer perfusjonsfiksert med 4% paraformaldehyd i PBS. Nyrer blir videre fiksert over natten ved 4°C og behandlet. Parafinsnitt blir deparafinisert og rehydrert, fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS, spaltet med proteinase K, refiksert, så acetylert med eddiksyrean-hydrid i trietanolaminbuffer. Snitt blir så dehydrert og hybridisert med <32>P-merkede riboprober ved 55°C over natten, med 33 P-merkede riboprober dannet fra 3-2 RDA eller 1-7 RDA-produkter subklonet i BamH-sete av pGEM-11Z. Etter hybridisering ble snittene vasket under høystringensbetingelser (2X SSC, 50% formamid ved 65°C). Snitt blir endelig dehydrert, emulsjon (NBT-2)-belagt for autoradiografi og eksponert i minst en uke. Sølvkorn blir utviklet og deler motfarget med toluidinblått og mikrofoto-grafert.

Analyse av 1-7 og 3-2 mRNA-ekspresjon ved in situ hybridisering indikerer at disse gener er svært oppregulert i skadede nyreceller sammenlignet med deres ekspresjon i normale nyresnitt. Den observerte ekspresjon er i regenerative celler av kortex og den ytre medulla, hvorav mesteparten synes å være proksimale tubulceller.

Analyse av 4-7 in situ RNA ekspresjonsmønster viser også stor ekspresjon av dette gen i den skadede ischemiske nyre sammenlignet med den normale voksne nyre. Ekspre-sjonsområdet synes å være infiltrerende celler. 6. Isolering av en human cDNA- klon som krysshvbridiserer med rotte 3- 2 cDNA.

En <32>P-merket DNA-probe omfattende nukleotider 546-969 av innskuddet av klon 3-2 vist i figur 1 blir dannet og brukt for å fremskaffe et humant embryonisk lever lambda gtlO cDNA-bibliotek (Clontech Calalog #HL5003a). 1 X IO<6> plakker blir undersøkt i duplikat ved å bruke standard betingelser som beskrevet ovenfor, men temperatur for undersøkelse var 55°C. For høystringensvasken blir filtrene vasket i 2 X SSC ved 55°C. Femti positive fager blir identifisert og plakkrenset og DNA blir fremstilt. Fag-DNA underkastes Southern analyse ved å bruke samme probe som ovenfor. Southern blot-filteret utsettes for en endelig vask med 0,5 X SSC ved 55°C. To kloner blir identifisert som positive. Innskuddet av klon H13-10-85 sekvenseres og et område blir funnet som koder for et protein med et høyt identitetsnivå med 3-2-proteinet vist i figur 3.

Nukleotidsekvensen (SEQ ID NO:6) og den forutsagte aminosyresekvens (SEQ ID NO:7) av det humane 3-2-relaterte protein er vist i figur 4. Som vist av bestfit-analysen angitt i figur 5 er det humane 3-2-relaterte protein 43,8% identisk og 59,1% likt 3-2 rotteproteinet. Begge inneholder IgG, mucin, transmembran og cytoplasmiske domener. De seks cysteiner inne i IgG-domenet hos begge proteiner er konservert.

7. Fremstilling av KJM- 1 Ig- fusjonsprotein.

Et fusjonsprotein av det ekstracellulære domene av KIM og Fc-området av immuglobu-lin (lg) er et anvendelig verktøy for studium av den molekulære og cellulære biologi av skadet/regenererende nyre og som et terapeutisk molekyl. For å fremstille KIM lg fusjonsprotein med det ekstracellulære domene av human og rotte KIM-1 protein, ble et fragment av det ekstracellulære domene av KIM-1 cDNA amplifikert med PCR og klonet i Biogen ekspresjonsvektoren pCA125 for transient ekspresjon i COS-celler. Ekspresjonsvektoren pCA125 danner et fusjonsprotein som har en struktur fra et gen klonet ved N-terminalen og et humant lg Fc-område ved C-terminalen. COS-celler ble transfektert med plasmidene SJR 103 eller 104 idet disse plasmider uttrykker et fusjonsprotein som inneholder de humane KIM-sekvenser 263-1147 (SEQ ID NO:6; SJR 103) eller rotte-KJM-sekvenser 599-1319 (SEQ ID NO:l; SJR 104) av det ekstracellulære domene fusert til humant lg Fc område. Cellene ble dyrket i 10% FBS i DMEM i celle-fabrikken (Nunc, Naperville, II). To til tre dager etter transfeksjonen ble medium høstet inn, konsentrert ved å bruke en Ami con konsentrator og fusjonsproteinet ble renset ved å bruke Protein-A Sepharose-kolonne. Etter opprenskning ble renhet av fusjonsproteinet vurdert med SDS-PAGE.

Diagnostiske anvendelser av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Anti-KIM antistoff ifølge oppfinnelsen, som spesifikt binder seg til proteinet av SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 eller SEQ ID NO:7 eller et fragment derav er anvendelige i flere diagnostiske metoder. Disse midler kan bli merket med påvisbare markører så som fluoroskopisk eller radiografisk ugjennomsiktige substanser og tilført til en person for å tillate avbildning av vev som uttrykker KIM-protein. Midlene kan også være bundet til substanser, så som pepperrot peroksidase som kan bli brukt som immunocytokjemiske fargemidler for å tillate visualisering av områder av KIM-proteinpositive celler på his-tologiske snitt. Et spesielt antistoff kunne bli brukt alene på denne måte og områder hvor det ble bundet kan bli visualisert i sandwich-assay ved å bruke et anti-immunoglobulin-antistoff som i seg selv er bundet til en påvisbar markør.

Spesifikke antistoff mot KIM-protein er også anvendelige i immunoassays for å måle tilstedeværelse av KIM eller konsentrasjonen i prøver av kroppsvev og væsker. Slike konsentrasjoner kan bli korrelert med forskjellige sykdomstilstander. Som en utførel-sesform av spesiell interesse innbefatter oppfinnelsen en metode for å diagnostisere nyreskade eller for å overvåke en prosess av nyrereparasjon ved å måle konsentrasjonen av KIM eller av KIM-fragmenter i urin, plasma eller serum hos en pasient. På lignende måte kan KIM bli målt i urinsediment, spesielt i celleavfall i urinsedimentet. Avstøp-ninger av renale tubulceller som kan være til stede i urinsediment fra pasienter med vedvarende nyresykdom kan inneholde økede nivåer av KIM-protein og mRNA.

Spesifikke antistoff mot KIM-protein kan også bli bundet til faste støttematerialer så som kuler eller skåler og brukt for å fjerne liganden fra en oppløsning, enten for måling eller for opprenskning og karakterisering av proteinet eller dets attributter (så som post-translasjonelle modifikasjoner). Slik karakterisering av en pasients KIM-protein kan være anvendelig ved identifisering av skadelige mutanter eller prosessering av defekter som innvirker på KIM-funksjonen og er assosiert med abnormale pasientfenotyper. Hver av disse teknikker er rutinemessig for fagmannen i det immunologiske felt.

Ytterligere avbildningsmetoder anvender KIM eller KIM-fragmenter fusert til avbild-bare enheter for diagnostisk avbildning av vev som uttrykker KIM-ligander, spesielt svulster.

Ytterligere diagnostiske teknikker er basert på påvisning av oppregulert KIM mRNA i vev som en indikasjon på skaderelaterte prosesser. Denne teknikk har blitt undersøkt og funnet anvendbar i en modell av ischemisk skade hos rotter som følger.

For å bestemme om mengden av KIM-1-protein er øket etter skade undersøkte søker nyrehomogenater av kontralaterale og post-ischemiske nyrer 24 og 48 timer etter en 40 minutters avsnøring av renalarterien og venen hos en enkelt nyre for hver rotte. Nyre-homogenatet ble undersøkt for tilstedeværelse av KIM-1-protein. Western blot-analyse identifiserer tre proteiner påvist av to forskjellige antistoff etter ischemisk skade som ikke er påvisbare i homogenater fra kontralaterale nyrer som ikke var eksponert for ischemisk skade. De observerte molekylvekter av båndene er omtrent 40kDa, 50kDa og 70-80kDa. De tre proteintyper som er påvist med Western blotting kunne representere glykoliserte former av det samme protein gitt tilstedeværelsen av potensielle N- og O-tilknyttede glykosyleringsseter. Det faktum at hver av disse proteiner reagerer med to forskjellige sett av polyklonale antistoff støtter ideen at de er relatert til KIM-1 og ikke er kryssreagerende bånd. Bekreftelse på denne forutsigelse kom fra resultatene av par-tiell CNBr-spaltning av de tre proteiner som viste at de delte felles CNBr-spaltning-fragmenter. Siden det cytoplasmiske domene av KIM-1-proteinet ikke er forutsagt å inneholde noen store post-translasjonelle modifikasjoner, bør de to minste produkter av spaltningen (4,7kDa og 7,4kDa) påvist med antistoff rettet mot det cytoplasmiske domene av KIM-1 være av samme størrelse for de tre forskjellige KIM-l-proteinbånd dersom de stammer fra samme protein. Søker observerte at KIM1 40kDa og 70-80kDa-proteinene ga fragmenter som migrerte ved den forutbestemte størrelse. Spaltning av 50kDa proteinbånd ga også det samme C-terminale signatur-båndpeptid.

KIM-1-sekvensen presenterer to forsøksvise seter for N-glykosylering og et mucindo-mene hvor O-glykosylering kunne dekke polypeptidkjeden. De tre KIM-1-bånd påvist i post-ischemisk nyre kunne tilsvare glykosyleringsvarianter av samme kjerneprotein. De-N-glyksosylering med PNGase F resulterte i et skift av alle tre bånd til en lavere molekylvekt som tilsvarer et tap på omkring 3kDa, og dette indikerer at alle tre proteiner er N-glykosylert. Forskjeller i O-glykosylering kunne forklare forskjellene i størrel-sene av disse tre bånd.

Terapeutisk anvendelse av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

De terapeutiske metoder ifølge oppfinnelsen involverer selektivt å fremme eller inhibere cellulære responser som er avhengig av KIM-ligering. Når KIM og KIM-liganden begge er bundet til membranen og uttrykt av forskjellige celler kan signaltransduksjo-nen inntreffe i den KIM-uttrykkende celle, den KIM-liganduttrykkende celle eller i begge.

KIM-ligering-igangsatt respons i en KIM-ligand-uttrykkende celle kan bli dannet ved å sette cellen i kontakt med eksogen KIM, KIM fusjonsproteiner eller aktiverende anti-stoff mot KIM-ligand, enten in vitro eller in vivo. Videre kan responser hos den KIM-ligand-uttrykkende celle som ellers ville bli aktivert av endogen KIM bli blokkert ved å sette en KIM-ligand-uttrykkende celle i kontakt med en KIM-ligand-antagonist (for eksempel et antagonistisk antistoff som binder til KIM-liganden) eller ved å sette det endogene KIM i kontakt med et anti-KIM-antistoff eller annet KIM-bindende molekyl som forhindrer effektiv ligering av KIM til en KIM-ligand.

På lignende måte kan responsene satt igang av KJM-ligering i den KIM-uttrykkende celle bli fremmet eller inhibert med eksogene forbindelser. For eksempel kan KJM-ligering-igangsatte responser i en KIM-uttrykkende celle bli dannet ved å sette cellen i kontakt med en oppløselig KIM-ligand eller visse anti-KIM aktiverende antistoffer. Videre kan responser hos den KIM-uttrykkende celle som ellers ville bli satt i gang ved interaksjon med endogen KIM-ligand bli blokkert ved å sette en KIM-uttrykkende celle i kontakt med en antagonist til KIM (for eksempel et blokkerende antistoff som binder til KIM på en måte som forhindrer effektiv, signalgenererende KIM-ligering) eller ved å sette den endogene KIM-ligand i kontakt med et anti-KIM-ligand antistoff eller annet KIM-ligandbindende molekyl som forhindrer effektiv ligering av KIM til KIM-liganden.

Hvilke av tiltakene som er beskrevet ovenfor som er anvendelige for spesiell terapeutisk anvendelse avhenger av den relevante etiologiske mekanisme for hver av de patologiske prosesser som skal inhiberes, eller av de medisinsk ønskelige prosesser som skal frem-mes som det fremgår for fagmannen innen det medisinske felt. For eksempel kan, hvor KIM-ligering resulterer i ønskelig cellevekst, opprettholdelse av differensiell fenotype, resistens mot apoptose indusert av forskjellige skader eller andre medisinsk fordelaktige responser en av de ovenfor beskrevne metoder som fremmer ligerings-igangsatte responser bli anvendt. Alternativt kan en av de inhibitoriske metoder være anvendelige når KIM-ligering setter i gang uønskede følger så som neoplastisk vekst, skadelig tap av cellefunksjonen, følsomhet overfor apoptose eller igangsettelse av inflammasjonshen-delser.

Nedenfor er eksempler på de tidligere beskrevne terapeutiske metoder. En terapeutisk anvendelse av de KIM-relaterte forbindelser ifølge oppfinnelsen er for å behandle en pasient med renal sykdom, fremme vekst av nytt vev hos en pasient eller fremme overlevelse av skadet vev hos en pasient, og innbefatter trinnet å tilføre til pasienten en terapeutisk effektiv mengde av et KIM-protein ifølge oppfinnelsen, eller av en farmasøytisk sammensetning som innbefatter et protein ifølge oppfinnelsen. Proteinet anvendt i disse metoder kan være et fragment av et KIM-protein av full lengde, et oppløselig KIM-ligand-protein eller fusjonsfragment, eller en KIM-agonist. Disse metoder kan også bli utført ved å tilføre til pasienten en terapeutisk effektiv mengde av et agonist-antistoff ifølge oppfinnelsen, eller en farmasøytisk sammensetning som innbefatter et agonist antistoff ifølge oppfinnelsen. Et KIM-protein kan bli tilført samtidig med en terapeutisk effektiv mengde av en andre forbindelse som oppviser en medisinsk ønsket tilleggseffekt. Mens vev av interesse for disse metoder kan innbefatte ethvert vev, innbefatter foretrukne vev, nyrevev, lever, nervevev, hjerte, mage, tynntarm, rygg-marg eller lunge. Spesielt innbefatter nyretilstander som gunstig kan behandles med forbindelser ifølge oppfinnelsen akutt nyresvikt, akutt nefritt, kronisk nyresvikt, nefro-tisk syndrom, renale tubuldefekter, nyretransplantasjoner, toksisk skade, hypoksisk skade og traumer. Renale tubuldefekter innbefatter dem som enten er arvelige eller har oppstått naturlig så som polycystisk nyresykdom, medullær nyresyksom og medullær svampnyre. Denne liste er ikke begrenset og kan innbefatte mange andre nyresykdom-mer ( se for eksempel Harrisons Principles of Internal Medicine, 13. utgave, 1994 som er innbefattet heri pr. referanse). Pasienten som utsettes for metodene kan være et menneske.

Et terapeutisk inngrep for å hindre vekst av uønsket KIM-liganduttrykkende vev hos en pasient innbefatter trinnet å innføre til pasienten en terapeutisk effektiv mengde av en KXM-antagonist (for eksempel et antagonistisk antistoff som binder til KIM-ligand) eller ved å tilføre en terapeutisk effektiv mengde av et anti-KIM-antistoff eller annet KIM-bindende molekyl som blokkerer KIM-binding til det KIM-liganduttrykkende vev. I en utførelsesform av interesse kan KIM-antagonisten eller KIM-antistoffet bli brukt terapeutisk for å hemme eller blokkere vekst av svulster som avhenger av KIM-protein for vekst.

Andre metoder ifølge oppfinnelsen innbefatter å avlive KIM-liganduttrykkende svulst-celler eller å hemme deres vekst ved å sette cellene i kontakt med et fusjonsprotein av et KIM eller et toksin eller et radionuklid eller et anti-KIM-ligand antistoff konjugert til et toksin eller radionuklid. Cellen kan være inne i en pasient og proteinet eller det konju-gerte antistoff tilføres til pasienten.

Uttrykket "pasient" brukt heri blir tatt til å bety ethvert pattedyr til hvilket KIM kan bli tilført. Pasienter spesielt tiltenkt behandling med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter mennesker så vel som ikke-menneskelige primater, sauer, hester, kyr, geiter, griser, hunder, katter, kaniner, marsvin, hamstre, gerbiler, rotter og mus, såvel som organene, svulstene og cellene avledet eller som stammer fra disse vertsorganismer.

Anvendelse av forbindelser ifølge oppfinnelsen i genterapi.

KIM-genene ifølge oppfinnelsen blir innført i skadet vev eller i vev hvor stimulert vekst er ønskelig. Slik genterapi stimulerer produksjon av KIM-protein av de transfekterte celler, fremmer cellevekst og/eller overlevelse av celler som uttrykker KIM-proteinet.

I en spesiell utførelsesform av en gen-terapimetode kan et gen som koder for et KIM-protein bli innført i et renalt målvev. KIM-proteinet ville bli uttrykt stabilt og stimulere vevsvekst, deling eller differensiering, eller kunne fremme celleoverlevelse. Videre kan et KIM-gen bli innført i en målcelle ved å bruke en mengde velkjente metoder som anvender enten virale eller ikke-viralbaserte strategier.

Ikke-virale metoder innbefatter elektroporering, membranfusjon med liposomer, høy-hastighetsbombardement med DNA-belagte mikroprosjektiler, inkubering med kalsium-fosfat-DNA precipitat, DEAE-dekstranmediert transfeksjon og direkte mikro-injeksjon i enkle celler. For eksempel kan et KIM-gen bli innført i en celle ved kalsiumfosfat-co-utfelling (Pillicer et al., Science, 209:1414-1422 (1980); som er en mekanisk mikroin-jeksjon og/eller partikkelakselerering (Anderson et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 77:5399-5403 (1980); liposombasert DNA-overføring (for eksempel LIPOFECTIN-mediert transfeksjon- Fefgner et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, 84: 471-477, (1987); Gao og Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179:280-285 (1991); DEAE Dextran-mediert transfeksjon; elektroporering (US patent 4,956,288); eller polylysinbaserte metoder hvor DNA blir konjugert for å avlevere DNA, fortrinnsvis til leverhepacytter (Wolff et al., Science, 247: 465-468,(1990); Curiel et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, (1992).

Målceller kan bli transfektert med genene ifølge oppfinnelsen med direkte genoverfø-ring. Se for eksempel Wolff et al., "Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle In Vivo", Science 247: 1465-68, (1990). I mange tilfeller vil vektormediert transfeksjon være ønskelig. Enhver av metodene som er kjent innen faget for innsetning av polynukleo-tidsekvenser i en vektor kan bli brukt. (Se for eksempel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; og Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992.

Promotoraktivering kan være vevspesifikk eller induserbar med et metabolsk produkt eller tilført substans. Slike promotore/aktiverere innbefatter, men er ikke begrenset til den native c-ret ligand proteinpromotor, cytomegalovirus umiddelbar tidlig promotor/aktivator (Karasuyama et al., J.Exp. Med., 169: 13, 1989); den humane beta-aktin promotor (Gunning et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 84: 4831, 1987; den glykokorti-koidinduserbare promotor som er til stede i muse-brysttumorvirus langterminal gjenta-gelse (MMTV LTR)(Klessig et al., Mol. Cell. Biol.4: 1354, 1984); de lange terminale gjentatte sekvenser av Moloney murine leukemivirus (MuLV LTR)(Weiss et al., RNA Tumor Vimses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1985); den SV40 tidlige områdepromotor (Bernoist og Chambon, Nature, 290-304, 1981); promo-toren til Rous sarcoma-virus (RSV)(Yamamoto et al., Cell, 22: 787, 1980); herpes sim-pleksvirus (HSV) tymidinkinase promotor (Wagner et al., Proe. Nat. Acad. Sci.USA, 78: 1441, 1981); adenoviruspromotoren (Yamada et al., Proe. Nat. Acad. Sci.USA, 82: 3567, 1985).

KXM-genene kan også bli innført med spesielle virale vektorer for bruk i genoverfø-ringssystemer som nå er godt etablert. Se for eksempel: Madzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533-36, 1992 (papovavirus SV40); Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39-61, 1992 (adenovirus); Hofmann et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 92: 10099-10103, 1995 (bakulovirus); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38, 1992 (vaksiniavirus); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123, 1992 (ade-noassosiert virus); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93, 1992 (herpes simplex virus (HSV) og Epstein-Barr virus (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24, 1992 (retrovirus); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol.,4:749-754, 1984 (retrovirus); Miller et al., Nature, 357: 455-450, 1992 (retrovirus); Anderson, Science, 256: 808-813, 1992 (retrovirus), Current Protocols in Molecular Biology: Del 9.10-9.14 (Ausubel et al., Eds.), Greene Publishing Associates, 1989.

Foretrukne vektorer er DNA-virus som innbefatter adenovirus (fortrinnsvis Ad-2 eller Ad-5 baserte vektorer), bakulovirus, herpesvirus (fortrinnsvis herpes simplex virusba-sert vektor) og parvovirus (fortrinnsvis "defektive" eller ikke-autonome parvovirusba-serte vektorer, mer foretrukket adenoassosiertbaserte vektorer, mest foretrukket AAV-2 baserte vektorer). Se for eksempel Ali et al., Gene Therapy 1: 367-384, 1994; US patent 4,797,368 og 5,399,346 og diskusjonen nedenfor.

Valget av et spesielt vektorsystem for å overføre, for eksempel en KTM-sekvens vil av-henge av et antall faktorer. En viktig faktor er naturen til målcellepopulasjonen. Selv om retrovirale vektorer i utstrakt grad har blitt studert og brukt i et antall genterapian-vendelser er de generelt uegnet for å infisere celler som ikke deler seg, men kan være anvendelige i kreftterapi siden de kun integrerer og uttrykker sine gener i replikkerende celler. De er anvendelige for ex vivo metoder og er attraktive i dette henseende grunnet sin stabile integrering i målcellegenomet.

Adenovirus er eukaryote DNA-virus som kan bli modifisert for effektivt å avlevere et terapeutisk eller reporter transgen til en mengde celletyper. De generelle adenovirus type 2 og 5, (henholdsvis Ad2 og Ad5) som forårsaker respiratorisk sykdom hos mennesker blir for tiden utviklet for genterapi av Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) og Cystisk Fibrose (CF). Både Ad2 og Ad5 tilhører en sub-klasse av adenovirus som ikke er assosiert med humane sykdommer. Adenovirusvektorer er i stand til å fremskaffe ekstremt høye nivå av transgen avlevering til nesten alle celletyper, uavhengig av deres mitotiske tilstand. Høye titre (IO<13> plakkdannende enheter/ml) av rekombinante virus kan lett bli dannet i 293-celler (en adenovirustransformert, kompiementerende human embryonisk nyrecellelinje: ATCC CRL1573) og kryolagret for lange perioder uten på-viselige tap. Effektiviteten av dette system i å avlevere et terapeutisk transgen in vivo som kompiementerer en genetisk ubalanse har blitt vist i dyremodeller for forskjellige sykdommer. Se Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261-268, 1986; Tanzawa et al., FEBS Letters 118(1): 81-84, 1980; Golasten et al., New Engl. J. Med. 309: 288-296, 1983; Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 92: 883-893, 1993; og Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 93: 1889-1893, 1994. Faktisk har rekombinante replikasjonsdefektive adenovirus som koder for et cDNA for den cystisk fibrose transmembrane regulator (CFTR) blitt anbefalt for bruk i minst to humane CF kliniske forsøk. Se for eksempel Wilson, Nature 365: 691-692, 1993. Videre støtte for sikkerheten av rekombinante adenovirus for genterapi er den utstrakte erfaring av levende adenovirusvaksiner i humane populasjoner.

De første-generasjons rekombinante, replikasjonsdefisiente adenovirus som har blitt utviklet for genterapi av DMD og andre arvede sykdommer inneholder delesjoner av hele Ela og deler av Elb områdene. Dette replikasjonsvirus blir dyrket i 293-celler inneholdende et funksjonelt adenovirus Ela-gen som gir et transvirkende Ela-protein. El-deleterte virus er i stand til å replikkere og danne infeksjonsdyktige virus i 293-cellene, noe som gir Ela og Elb område genprodukter i trans. De resulterende virus er i stand til å infisere mange celletyper og kan uttrykke det innførte gen (forutsatt at det bærer sin egen promotor), men kan ikke replikkere i en celle som ikke inneholder El område DNA med mindre cellen blir infisert ved en meget høy infeksjonsmultiplisitet. Adenovirus har den fordel at de har et bredt vertsområde, kan infisere hvilende eller terminalt differensierte celler så som neuroner, og synes i hovedsak å være ikke-onko-gene. Adenovirus synes ikke å integrere i vertsgenomet. Fordi de kan eksistere eks-trakromosomalt blir risikoen for innsetningsmessig mutagenese sterkt redusert. Ali et al., supra, ved 373. Rekombinante adenovirus (rAdV) gir meget høye titre, hvor de virale partikler er moderat stabile, ekspresjonsnivåer er høye og en mengde celler kan bli infisert. Deres naturlige vertsceller er luftveisepitel så de er anvendelige for terapi av lungekreft.

Baculovirusmediert overføring har flere fordeler. Baculovirus genoverføring kan inntreffe i replikerende og ikke-replikerende celler, og kan inntreffe i nyreceller så vel som i hepatocytter, nerveceller, milt, hud og muskel. Baculovirus er ikke-replikerende og ikke-patogen i pattedyrceller. Mennesker mangler på forhånd eksisterende anti-stoff mot rekombinante baculovirus som kunne blokkere infeksjon. I tillegg er baculovirus i stand til å inkorporere og transdusere meget store DNA-innskudd.

Adeno-assosierte virus (AAV) har også blitt anvendt som vektorer for somatisk genterapi. AAV er et meget lite, enkeltkjedet (ss) DNA-virus med en enkel genomisk organi-sering (4-7 kb), noe som gjør det til et ideelt substrat for genetisk manipulering. To åpne leserammer koder for en serie av rep og cap polypeptider. Rep polypeptider ( rep78, rep68, rep62 ogrep40) er involvert i replikasjon, redning og integrering av AAV-genomet. Cap-proteiner (VP1, VP2 og VP3) danner virionkapsidet. Flankerende rep og cap åpne leserammer ved 5' og 3' ender er 145 bp inverterte terminale gjentagel-ser (ITRs), hvorav de første 125 bp er i stand til å danne Y- eller T-formede duplex-strukturer. Av viktighet for utviklingen av AAV-vektorer kan hele rep- og cap- dome-nene bli fjernet og erstattet med et terapeutisk eller reportertransgen. Se B.J. Carter i Handbook of Parvoviruses, ed., P.Tijsser, CRC Press, side 155-168, 1990. Det har blitt vist at ITR representerer den minimale sekvens som er nødvendig for replikasjon, redning, pakking og integrering av AAV-genomet.

Adeno-assosierte virus (AAV) har signifikant potensiale i genterapi. De virale partikler er meget stabile og rekombinante AAVs (rAAV), har "medikamentlignende" karakteristika ved at rAAV kan bli renset med pelletering eller med CsCl-gradient band-dannelse. De er varmestabile og kan bli frysetørket til et pulver og rehydrert til full aktivitet. Deres DNA integrerer stabilt i vertskromosomer slik at ekspresjonen foregår over lang tid. Deres vertsområde er bredt og AAV forårsaker ingen kjent sykdom slik at de rekombinante vektorer er ikke-toksiske.

Når de er innført i en målcelle kan sekvenser av interesse bli identifisert med konven-sjonelle metoder så som nukleinsyrehybridisering ved å bruke prober omfattende sekvenser som er homologe/komplementære til de innsatte gensekvenser av vektoren. I en annen metode kan sekvensen (e) bli identifisert ved tilstedeværelsen eller fraværet av en "markør" genfunksjon (for eksempel tymidinkinaseaktivitet, antibiotisk resistens og lignende) forårsaket ved innføring av ekspresjonsvektoren i målcellen.

Formuleringer og administrering

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen blir formulert i henhold til standard praksis så som fremstilt i et bæremateriale. Uttrykket "farmakologisk akseptabelt bæremateriale" betyr en eller flere organiske eller uorganiske bestanddeler som er naturlige eller syntetiske, ved hvilke det mutante protoonkogen eller mutante onkoprotein blir kombinert for å lette deres anvendelse. Et passende bæremateriale innbefatter sterilt fysiologisk salt-vann selv om andre vandige og ikke-vandige isotone sterile oppløsninger og sterile sus-pensjoner som er kjent for å være farmasøytisk akseptable er kjent for fagmannen. I dette henseendet omfatter uttrykket "bæremateriale" liposomer og HIV-1 tat proteinet (Se Chen et al., Anal. Biochem. 227: 168-175, 1995) så vel som ethvert plasmid og virale ekspresjonsvektorer.

Ethvert av de nye polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli brukt i form av et farmaseutisk akseptabelt salt. Passende syrer og baser som er i stand til å danne salter med polypeptidene i foreliggende oppfinnelse er velkjent for fagmannen og innbefatter uorganiske og organiske syrer og baser.

En forbindelse ifølge oppfinnelsen blir tilført til en pasient i en terapeutisk effektiv

mengde, noe som betyr en mengde av forbindelsen som gir et medisinsk ønsket resultat eller gir en påvirkning på den spesielle tilstand som blir behandlet. En effektiv mengde av forbindelsen ifølge oppfinnelsen er i stand til å dempe eller forsinke progresjonen av den syke, degenerative eller skadede tilstand. Den effektive mengde kan bli bestemt på en individuell basis og vil delvis være basert på vurdering av den fysiske tilstand hos pasienten, symptomene som skal behandles og de søkte resultater. En effektiv mengde kan bli bestemt av fagmannen ved å anvende slike faktorer og ved ikke å bruke mere enn rutinemessige forsøk.

Et liposomavleveringssystem for en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan være enhver av en mengde unilamellære vesikler, multilamellære vesikler eller stabile plurilamellære vesikler, og kan bli fremstilt og tilført i henhold til metoder som er velkjent for fagmannen, for eksempel i samsvar med beskrivelsen i US patent 5,169,637, 4,762,915, 5,000,958 eller 5,185,154. I tillegg kan det være ønskelig å uttrykke de nye polypeptider ifølge oppfinnelsen så vel som andre utvalgte polypeptider som lipoproteiner for å fremme deres binding til liposomer. Som et eksempel kan behandling av human, akutt nyresvikt med liposominnkapslet KIM-protein bli utført in vivo ved å innføre et KIM-protein i celler i behov for slik behandling ved å bruke liposomer. Liposomene kan bli avlevert via kateter til nyrearterien. Det rekombinante KIM-protein blir renset, for eksempel fra CHO-celler med immunoaffinitetskromatografi eller annen passende metode, blir derpå blandet med liposomer og inkorporert i dem med høy effektivitet. Det inn-kapslede protein kan bli undersøkt in vitro for enhver effekt på stimulering av cellevekst.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan bli administrert på enhver måte som er medisinsk akseptabel. Dette kan innbefatte injeksjoner ved parenteralruter så som intravenøs, in-travaskulær, intraarteriell, subkutan, intramuskulær, intratumor, intraperitoneal, intra-ventrikulær, intraepidural eller andre så vel som oral, nasal, oftalmisk, rektal eller to-pisk. Vedvarende frigjøringsadministrasjon kan omfatte depot-injeksjoner eller eroder-bare implantater. Lokal avlevering blir spesielt påtenkt ved slike metoder som avlevering via kateter til en eller flere arterier, så som nyrearterien eller et blodkar som støtter en lokal tumor.

Claims (22)

1. Polypeptid omfattende en aminosyresekvens som er minst 90% identisk med sekvensen av SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 eller SEQ ID NO: 7 og som er et nyreskademolekyl (KIM), hvor nevnte KIM er et celleoverflateprotein som selektivt uttrykkes i post-ischemisk nyrevev hos pattedyr.

2. Polypeptid ifølge krav 1, hvor aminosyresekvensen er minst 95% identisk med sekvensen av SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 eller SEQ ID NO: 7 og som er et nyreskademolekyl (KIM), hvor nevnte KIM er et celleoverflateprotein som selektivt uttrykkes i post-ischemisk nyrevev hos pattedyr.

3. Polypeptid ifølge krav 1, hvor polypeptidet omfatter sekvensen SEQ ID NO: 3, SWQ ID NO: 5 eller SEQ ID NO: 7.

4. Polypeptid ifølge krav 1, hvor polypeptidet består av SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 eller SEQ ID NO: 7.

5. Polypeptid omfattende en oppløselig variant av polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 4.

6. Polypeptid ifølge ethvert av kravene 1 til 5, fusjonsproteinet ifølge krav 7 eller antistoffet ifølge ethvert av kravene 14 til 17 for anvendelse i terapi eller diagnose.

7. Fusjonsprotein omfattende det ekstracellulære domene av polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 4 og et Fc-område av et immunoglobulin.

8. Nukleinsyre som koder for polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 5.

9. Nukleinsyre som koder for fusjonsproteinet ifølge krav 7.

10. Nukleinsyre ifølge krav 8, hvor nukleinsyren omfatter SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 eller SEQ ID NO: 6 eller hvor nukleinsyren hybridiserer under stringente betingelser til SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 eller SEQ ID NO: 6 og som koder for et nyreskademolekyl (KIM) hvor nevnte KIM er et celleoverflateprotein som selektivt uttrykkes i post-ischemisk nyrevev hos pattedyr, hvor hybridiseringsbetingelsene innbefatter en vask i 2 x SSC ved 55°C og en sluttvask i 0,5 x SSC ved 55°C.

11. Vektor omfattende nukleinsyre ifølge ethvert av kravene 8 til 10.

12. Verscelle omfattende vektoren ifølge krav 11.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid eller fusjonsprotein, hvor fremgangsmåten omfatter: å dyrke vertscellen ifølge krav 12 i et celledyrkningsmedium, og å gjenvinne fra vertscellen polypeptidet eller fusjonsproteinet kodet av nukleinsyren ifølge ethvert av kravene 8 til 10.

14. Antistoff som binder til polypeptidet ifølge krav 4.

15. Antistoff ifølge krav 14, hvor antistoffet er konjugert til et toksin eller radionuklid.

16. Antistoff ifølge krav 14, hvor antistoffet er et monoklonalt antistoff.

17. Antistoff ifølge krav 14, hvor antistoffet er et humanisert antistoff, et humant anti-stoff, et enkeltkjedet antistoff, et Fab-fragment eller et chimerisk antistoff.

18. Hybridom som fremstiller antistoff ifølge krav 14.

19. Farmasøytisk sammensetning omfattende (i) polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 5 eller fusjonsproteinet ifølge krav 7 og (ii) et farmakologisk akseptabelt bæremiddel.

20. Anvendelse av polypeptid ifølge ethvert av kravene 1 til 5 eller fusjonsproteinet ifølge krav 7 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av nyreskade eller -sykdom i et individ som er angrepet av nyreskade eller -sykdom.

21. Anvendelse av polypeptid ifølge ethvert av kravene 1 til 5 eller fusjonsproteinet ifølge krav 7 for fremstiling av en diagnostisk sammensetning for undersøkelse av tilstedeværelsen eller forløpet av helbredelse av nyreskade eller -sykdom i et individ som er angrepet av nyreskade eller -sykdom.

22. Anvendelse ifølge krav 20 eller 21, hvor individet er et menneske.