BG102967A - Модулатори на тъканна регенерация - Google Patents

Модулатори на тъканна регенерация Download PDF

Info

Publication number
BG102967A
BG102967A BG102967A BG10296798A BG102967A BG 102967 A BG102967 A BG 102967A BG 102967 A BG102967 A BG 102967A BG 10296798 A BG10296798 A BG 10296798A BG 102967 A BG102967 A BG 102967A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
seq
kim
polypeptide
sequence
protein
Prior art date
Application number
BG102967A
Other languages
English (en)
Other versions
BG64678B1 (bg
Inventor
Michele Sanicola-Nadel
Joseph Bonventre
Catherine Hession
Takaharu Ichimura
Henry Wei
Richard Cate
Original Assignee
Biogen Idec Inc.
The General Hospital Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26690881&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG102967(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Inc., The General Hospital Corporation filed Critical Biogen Idec Inc.
Publication of BG102967A publication Critical patent/BG102967A/bg
Publication of BG64678B1 publication Critical patent/BG64678B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до протеини, които се използват за up-регулиране при наранени или регенериращи тъкани, както и до ДНК, кодираща тези протеини. Изобретението се отнася и до терапевтични състави включващи съединенията, както и до методи за лечение.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Изобретението се отнася до протеини, които се използуват за ир-регулиране при наранени или регенериращи тъкани, както и до ДНК кодираща тези протеини. Изобретението се отнася, освен това, и до терапевтични състави и методи на лечение, включващи тези съединения.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
По време на развитието, както и по време на зарастването на тъканите при увреждане, се осъществява динамично премоделиране на тъканната архиктектура.
Μ»
Бъбрекът е В състояние на поправи разрушенията в епитела на проксималното канално, посредством сложни серии от събития, включващи см ърт на клетките, пролиферация на преживелите епителни клетки на каналното, образуване на слабо диференцииран регенериращ епител над оголената базална мембрана, и диференцииране на регенериращият епител до образуване на напълно функционални епителни клетки на каналчето (Wallin et al., Lab. Invest. 66&474-4S4, 1992; Witzgall et al., Mol. Cell. Biol. 13:1933-1942, 1994; Ichimura et al., Am, J.
Q Physiol. 269:F653-662, 1995; Thadhani et al, N. Engl. J. Med. 334:1448-1460, 1996). В процеса на зарастване взимат участие и растежни фактори като IGF, EGF, и HGF, както и молекула ICAM-1 за ендотелна клет ъчна адхезия. Въпреки това още не са разбрани механизмите по които се възстановяват епителните клетки на каналчето.
За да се идентифицират молекулите включени в процеса на увреждане и заздравяване на епитела, на каналчено, бяха анализирани разликите в тРНК популациите между наранени/регенериращи и нормални бъбреци чрез използуване на θ представителен анализ на разликите (RDA). RDA е анализ основаващ се на PCR метода за изваждане, който води до желаните тъкани или клетъчно специфични сДНК фрагменти, чрез повтарящо се изваждане и амплифициране (НиЬапк and Schutz, Nucl. Acids Res. 22:5640-5648, 1994).
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Изобретението най-общо се отнася до Свързани с Увреждане на Бъбреците Молекули (всяка от които оттук нататък се нарича KIM (Kidney Injury-related Molecules), които са ир-регулирани В бъбречната тъкан след увреждане иа бъбрека. KIM протеините и пептидите на изобретението, така както тяхните агонисти и антагонисти, и тяхните съответни, са полезни при многобройни терапевтични интервенции.
Изобртението осигурява пречистена и изолирана ДНК молекула притежаваща нуклеотидна. последователност посочена в SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6. Изобретението включва, също така, и комплементарните вериги на тези последователности, ДНК молекули, които хибридизират при строги реакционни условия към гореспоменатите ДНК молекули, които, поради разпада на генетичния код, биха хибридизирали към които и да са дефинирани по-горе ДНК молекули. ДНК молекулите могат да са рекомбинантни и могат да са операционно свързани към експресионна контролна последователност.
Изобретението предоставя, освен това, вектор включващ пречистена и изолирана ДНК молекула притежаваща нуклеотидна последователност посочена в SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7,или друга от дефинираните по-горе ДНК молекули. Векторът може да е биологично функционален плазмид или вирусен ДНК-ов вектор. Един вариант за изпълнение на изобретените предоставя прокариотни или еукариотни клетки-гостоприемници, стабилно трансформирани или трансфектирани от вектор включващ ДНК молекула от SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6. При един друг вариант за изпълнение на изобретението се предоставя метод за продуциране на KIM
noAuncnmugci ι продукт, кодиран от ДНК молекула, както е описано по-горе; мстотъд включва култивиране при подходящи културални условия, прокариотни или еукариотни клетки гостоприемници, трансформирани или трансфектирани с ДНК молекулата по начин позволяващ експресията на ДНК молекулата, и получаване на полипептидния продукт на посочспата експресия.
Пречистен и изолиран човешки KIM протеин по същество лишен от други човешки протеини, е същноста на изобретението, както и метод за продуциране на полипептидния продукт, притежаващ част от първичната структурна конформация и биологична активност на KIM протеин. К1М протеините на изобретението могат да притежават аминокиселинна последователност включваща SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7, или варианти на SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7, или пречистен и изолиран протеин кодиран от ДНК със SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6. Тези протеини могат да се предоставят по същество лишени от други човешки протеини. Изобретението се отнася, освен това, до варианти на тези протеини, като например разтворими варианти или сляти протеини. KIM слятите протеини, съгласно изобретението, включват имуноглобулин, токсин, съединения, които могат да се изобразят или радиоактивни нуклеотиди.
Изобретението се отнася, освен това, до специфично моноклонално антитяло към описаните по-горе KIM протеини. Анти-KIM антитялото може да е прикрепено към токсин, съединение способно да бъде изобразено или радиоактивен нуклеошид. Става въпрос и за хибридомна клетъчна линия, продуцираща такова специфично антитяло.
В обхвата на изобретението се включват и фармацевтични състави, фармацевтичен състав, съгласно изобретението, може да включва терапевтично ефективно количество от KIM протеина или aiimu-KIM антитяло, съгласно изобретението, заедно с фармацевтич но приемлив носител.
В обхвата на изобретението се включват, освен това и методи за диагностика, като например установяване присъствието или причините за липсата на разграничаване на б ъбречното увреждане чрез измерване на концентрацията на KIM в урината, серума или седиментите в урината на пациенти, които рискуват или са в рискова група да развият б ъбречни заболявания.
Методите за лечение, съгласно изобретението включват третиране на пациентите с ефективни количества от KIM, варианти на KIM, аналози на KIM, KIM сляти протеини, К1М агонисти, и антитела към KIM или към К1М лиганди. Други терапевтични съединения, съгласно изобретението, включват KIM лиганди, анти-К1М антитела, и сляти протеини на KIM лигандите. Тези съединения могат да са полезни при терапевтичните методи, които или стимулират или инхибират клетъчните отговори, които зависят от функционирането на KIM.
Други методи, съгласно изобретението, се отнасят до инхибиране растежа на KIM-експресиращи туморни клетки чрез привеждане на клетките в контакт със слят протеин на KIM лиганд и било то токсин или радиоактивен нуклеотид, било mo е анти-KIM антитяло, конюгирано към токсин или към радионуклеотид. Подобно, растежът на туморни клетки, които скпрссират KIM лиганди, може да се инхибира чрез поставяне на клетките в контакт със слят протеин на KIM и било то токсин или радионуклеотид, било то с анти-KIM лиганд антитяло, конюгиран с токсин или с радионуклеотид.
Изобретението включва, също така, методи па генна терапия. Те включват метод за лечение на пациент с бъбречни нарушения, метод за спомагане растежа на нова тъкан при пациент, и метод за спомагане преживяването на засегнатите от увреждане тъкани при пациент, включващ прилагане върху пациента на вектор включващ ДНК, която съдържа нуклеотидна последователност от SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6.
Съединенията на изобретението са полезни за изобразяване на тъкани, било то in vitro или in vivo. Един такъв метод включва насочване на едно съединение, което може да се изобрази, към клетка експресираща протеин от SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5, или SEQ ID N0:7, включващ привеждане на клетката в контакт било то с моноклонално антитяло, съгласно изобретението, или слят протеин, съдържащ протеин както е описано по-горе, слят със способно да бъде изобразено съединение. При in vivo методите, клетката е в пациента, а протеинът или моноклоналното антитяло се прилага върху пациента.
Изобретението включва и методи за диагностика, като например метод за идентифициране на увредените или регенериращи бъбречни клетки в субекта, включващ сравняване на степента на експресия или на SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2,
SEQ ID N0:4 uau SEQ ID N0:6 В бъбречните клетки на субекта към контролна степен на експресия на последоВателноста В контролни бъбречни клетки. Друг метод на изобретението Включва идентифициране на регулацията на SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6 В клетки, ВключВащ привеждане на клетките В контакт е антисенс проба и измерВане на хибридизацията на РНК В клетките.
Друг вариант за изпълнение на методите за диагностика на изобретението, включва установяване присъствието или концентрацията па молекула, съгласно изобретението или В урина, серум или В други телесни течности, или В седименти на урината или тъкан пи проби. Измереното ниво на свързани е увреждането молекули може да се свърже е присъствието, обхВата или причините за патологичен процес. Корелацията може да се използува за определяне сфикастноста на режима на лечение.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ фигура 1 е нуклеотидна последователност на клонирана сДНК 3-2 от плъх, с рамка на разчитане от 615 до 1535 на предполагаем протеин.
фигура 2 е списък е списък на ДНК последователностите на клон 1-7 от плъх, на рамка за разчитане от 145 до 1065 на предполагаем протеин.
фигура 3 е списък е списък на ДНК последователностите на клон 4-7 от плъх, на рамка за разчитане от 107 до 1822 на предполагаем протеин.
Фигура 4 е списък на сДНК и изведените аминокиселинни последователности от човешки клон Н13-10-85, с предполагаема рамка на разчитане от 1 до 1002. Най-горната линия от списъка е сДНК последователноста (SEQ ID N0:6), а най-долната е изведената аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:7).
Фигура 5 е BESTFIT сравнение на нуклеотидната последователност на човешки клон Н13-10-85 е клон 3-2 от плъх.
ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
KIM гените се идентифицираха чрез анализиране на различията в експресията на иРНК между регенериращите и нормалните бъбреци, при използуване на анализ на представителните разлики (RDA). RDA е метод, основан на PCR за изваждане и амплификация. сДНК репрезентацията на РНК от бъбрек на 48 часов постизсхемичен възрастен плъх се изважда от пробабата на нормален (симулиращ обработка) бъбрек на възрастен плъх. При тази процедура, последователностите, които са общи за двете проби, от постизсхемичния и нормалния б ъбрек се отстраняват, като ее остават тези последователности, които са значително експресирани единствено в увредената бъбречна тъкан. Такива гени кодират протеини, които могат да бъдат терапевтично полезни при бъбречни нарушения или ее включват В процеса на увреждане. Получени са няколко клона, секвснирани са и са охарактеризирани. След това клоновете се изследват за тяхния модел на експресия по време на възстановяването на бъбрека, развитието и тъканното разпределение чрез Northern анализ и in situ PI IK хибридизация.
ИДЕНТИФИКАЦИОННИ НОМЕРА НА IЮСЛЕДОВАП ЛНОСГИ П/
Нуклеотидните и аминокиселинните последователности, които се посочват в описанието, са посочени под следните идентификационни номера:
SEQ ID N0:1 - нуклсотидна последователност на 3-2 сДНК инсърт от плъх
SEQ ID N0:2 - нуклсотидна последователност на 1-7 сДНК инсърт от плъх
SEQ ID N0:3 - амииокиселинна последователност на KIM-1, кодирана от 3-2 и 1-7 сДНК
SEQ ID N0:4 - нуклсотидна последователност на 4-7 сДНК инсърт от плъх
SEQ ID N0:5 - амииокиселинна последователност кодирана от 4-7 сДНК инсърт
SEQ ID N0:6 - нуклсотидна последователност на човешка сДНК клон Н13--10-854-7 сДНК
ДЕфИНИЦИ НА термини пз
KIM протеин, използуван в настоящото като синоним на KIM, представлява протеин кодиран от тРНК, която селективно се регулира след увреждане на бъбрека. Една група от KIM протеини, представляващи интерес, включва тези кодирани от тРНК, която селективно се регулира по всяко време през седмицата следваща какъвто и да е инсулт, които води до увреждане на бъбречната тъкан. Примери за периоди от време, когато могат да се регулират такива процеси на регулация включват 10 часа, 24 часа, 48 часа или 96 часа след инсулт. Примери за видовете инсулт включват тези, при които се стига до изсхемично, токсично или друг вид увреждане.
KIM агонист представлява молекула, която специфично може да предизвика клетъчен отговор, нормално предизвикан от взаимодействието на KIM е К1М лиганда. KIM агонист може да е вариант на KIM, или специфично антитяло към KIM, или разтворима форма на KIM лиганда.
KIM антагонист” представлява молекула, която може специфично да се асоциира с KIM лиганд или KIM, като по този начин блокира, или иначе казано инхибира свързването на KIM към KIM лиганда. Антагонистичното свързване блокира или инхибира клетъчните отговори, които иначе биха били предизвикани от свързването на KIM лиганда с KIM или с К1М агониста. Примери за KIM антагонисти включват някои варианти на KIM, KIM сляти протеини и специфични антитела към KIM лиганда или KIM.
KIM лиганд е коя да е молекула, която нековалентно и специфично се свързва към KIM протеина. Такъв лиганд може да е протеин, пептид, стероид, антитяло, производно на аминокиселина, или друг тип молекула, в каквато и да форма, включително срещащи се в природата, получени чрез рекомбинантни техники, или синтетично получени по друг начин. KIM лигандата може да е под каквато и да форма, включително разтворима, свързана с мембрана, или част от слята структура е имуноглобулин, мастна киселина, или други части. KIM лигандата може да е интегрин. Свързана с мембрана KIM лиганда може да действа като рецептор, който когато е свързан с или асоцииран към KIM, предизвиква клет ъчен отговор. При някои взаимодействия, К1М може да се асоциира с повече от един KIM лиганд, или да се асоциира с К1М лиганд като част от комплекс от една или повече други молекули или фактори. В ситуации, при които и двете, KIM както и KIM лиганда, са свързани към клетъчните стени, KIM може да асоциира и да реагира е KIM лиганда, която е свързана с втора клетка. Когато се стигне go KI M лигиране между молекули свързани към различни клетки, дВете клетки могат да са еднакви или различни, с оглед на клетъчния тип или произход, фенотипното или метаболитното състояние, или тип или степен на клетъчен отговор (например, растеж, диференциация или апоптоза) към дадения стимул. KIM лигиране се отнася до контакта и свързването на KIM с KIM лиганд.
Под подреждане на последователностите се разбира позиционирането на една последователност, било то нуклеотидна или амииокиселинна, с това на друга последователност, за да стане възможно сравняването на последователноста със съответните участъци на едната с тези на другата. Пример за един метод на тази процедура се посочва в Neederleman et al., (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970). Методът може подходящо да се осъществи посредством компютърна програма, като Align program (DNAster, Inc.). Както ще бъде ясно за специалистите в областа, хомоложни или функционално еквивалетнти последователности включват еквивалентно подреждане на цистеиновите остатъци в запазения цистешюв скелет, включително аминокиселиннитс инсерти или делеции, които променят линейното подреждане на глези цистеини, но не нарушават материалната връзка в нагънатата структура на протеина. Следователно, вътрешните дупки и аминокиселинните инсерти в кандидат последователноста се игнорират, е цел да се пресметне хомоложноета на аминокиселинната последователност или идентичности между кандидат и сравнителната последователност. Една характеристика, която често се използува при установяването на хомоложност между протеините е подобието на броя и локализацията на цистеиновите остатъци между единия и другия участък.
Антисенс ДНК се отнася до последователността на хромозомална ДНК, която се транскрибира.
Антисенс проба представлява проба, която съдържа най-малкото една, част от антисенс ДНК за интересуващата ни част от нуклеинова киселина.
Под клониранс ес разбира използуването на in vitro рекомбинантни техники за инсериране на определен ген или друга ДНК последователност в молекулата на. вектора. С цел успешно да се клонира желания ген, трябва да се ползуват методи за генериране на ДНК фрагменти, за да се свържат фрагментите к ъм векторните мобекули, и за да се подбере клона притежаващ гена мишена измежду клетките гостоприемници на реципиента.
Под сДНК се разбира комплементарна или копие на ДНК, продуцирана от матрица РНК под действието на РНКзависима ДНК полимераза (обратна траскриптаза). Следователно сДНК клон означава двойна ДНК последователност комплементарна на интересуваща ни РНК молекула, пренасяна от клониращ вектор.
Под сДНК библиотека се разбира колекция от рекомбшiaiimiш ДНК молекули, съдържащи сДНК иисерти които всички заедно са представителни за тРНК молекулата присъстваща в един цял организъм или тъкан, в зависимост от източника на РНК матриците. Една такава сДНК библиотека може да се изготви чрез методи, известни на специалистите в областа, и описани, например, от Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, виж no- горе. Обикновено, РНК се изолира първо от клетките па организъм от чийто геиом желаем да клонираме определен ген. Предпочетени за целите на настоящото изобретение са клетъчни линии от бозайници, и по-специално от човек. Алтернативно, РНК може да се изолира от туморна клетка, произхождаща от животински тумор, и за предпочитане от човешки тумор. По този начин може да се изготви библиотека от, например, човешки надбъбречен тумор, но може да се използува които и да е тумор.
Терминът ДНК полиморфизъм, както се използува тук, се отнася до състоянието, при което две или повече различни нуклеотидни последователности могат да съществуват при един определен сайт в ДНК.
Експресионсн вектор включва вектори, които са способни да експресират ДНК последователности, които са включени в тях, т.е. кодиращите последователности са операционно свързани към други последователности, способни да осъществят експресията. Подразбира се, въпреки че не винаги ясно се установява, че тези експресионни вектори трябва да са способни на репликация в организъма гостоприемник или чрез епизоми или като интегрална част от хромозомалната ДНК. Необходим, но не задължителен, елемент на ефективната експресия на вектора е маркерна кодираща последователност, която е последователност, кодираща протеин, които води до феи опитни свойства (като например рсзистентност на тетрациклин) на клетките съдържащи протеина, които позволява тези клетки точно да бъдат идентифицирани. В обобщение, експресионния вектор дава функционална дефиниция, и която и да е ДНК последователност, която е в състояние да осъществи експресия на определен съдържащ се ДНК код се включва в този термин, както се прилага към определената последователност. Както е в настоящия случай, такива вектори често са под формата на плазмиди, така че плазмидите и експресионните вектори често се използуват като взаимозаменяеми. Въпреки това, изобретението има претенциите да включва такива други форми на експресионни вектори, които имат еквивалентни функции, и които могат отвреме на време да са известни от предшестващото състояние на техниката.
Под функционални производни се разбира фрагменти, варианти, аналози, или химични производни на молекула. Под фрагмент на молекула, като всеки антиген от настоящето изобретение, се разбира, че се отнася до всеки полипептидсн комплект от молекули. Под вариант на такива молекули се разбира, че се отнася до естествено съществуващи в природата молекули, по същество подобни или на цялата молекула, или на неин фрагмент. Под аналог на молекула се разбира, че се отнася до несъществуващи естествено в природата молекули, по същество подобни или на цялата молекула, или на неин фрагмент.
Терминът ген се отнася до полинуклеотидна последователност, кодираща пептид.
Под хомоложен се разбира, когато се отнася до пептид или ДНК последователност, че първичната молекулярна структура (т.е. аминокиселинна или нуклеотидна последователност) на по същество всички молекули присъствуващи във Въпросния състав са идентични.
Изолиран се отнася до протеин от настоящето изобретение, или който и да е ген кодиращ такъв протеин, който по същество е лишен от други протеини или гени, съответно, или от други онечиствания, с които нормално може да се открие в природата, а като такъв същестВува под форма, която не се открива В природата.
Терминът маркер ее отнася до молекулярна част, която е в състояние да бъде открита, включително, като пример, без ограничения, радиоактивни изотопи, ензими, лумшшецентни средства, и багрила.
Терминът проба се отнася до лиганд с известни качества, способен на селективно свързване към антилиганд мишена. Когато се прилага към нуклеинови киселини, терминът проба се отнася до верига на нуклеинова киселина притежаваща последователност от бази комплементарни на веригата мишена.
Под рекомбинантни клетки мишени се разбира клетки, които са трареформирани е вектори, конструирани чрез използуване на техниките на рекомбинантната ДНК. Както е дефинирано тук, антитялото или негова модификация, продуцирано от рекомбинантни клетки гостоприемници, е в следствие на трансформациите в толкова по-малки количества, или по просто, с толкова по-малко от количествата, които могат да се определят, както биха били продуцирани от нетрансформиран гостоприемник.
Под чист по същество се разбира които и да протеин от настоящето изобретение, или който и да е ген, кодиращ който и да е такъв протеин, който изцяло е лишен от други протеини или гени, съответно, или от други онечиствапия с които нормално може да се открие в природата, и като такъв съществува под форма несрещаща се в природата.
Една молекула се нарича подобна по същество на друга молекула, когато аминокиселинната последователност и в двете молекули е изцяло същата, и когато и двете молекули притежават подобна биологична активност. Така, при положение, че две молекули притежават подобна активност, то те се считат като варианти, както се използува термина тук, даже когато едната молекула притежава допълнителни аминокиселинни остатъци, които не се откриват В другата, или когато аминокиселинната последователност не е идентична. Както се използува тук, за една молекула се казва, че е химическо производно на друга молекула, когато притежава допълнителни химически частици, които нормално не са част от молекулата. Такива частици могат да подобрят разтворимоста на молекулата, абсорбцията, биологичния полуживот, и т.н. Частиците могат, алтернативно, да намаляват токсичности на молекулата, да намалят силата или да елиминират някои нежелан ефект, т.н. Частици способни да медииират такива ефекти са описани, например, в Remongton's Pharmaceutical Sciences, 16 th ed., Mack Publishing Co.
Под Вектор ее има предВид ДНК молекула, произлезла от плазмид или от бактериофаг, В която могат да се инссрират или клонират фрагменти от ДНК. Векторът съдържа един или повече уникални рестрикционни сайта и може да е способен на автономна репликация В определен гостоприемник или организъм носител, така че клонираната последователност да може да бъде репродуцирана.
СЪЕДИНЕНИЯ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Изобретението Включва сДНК от SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, така както и последователности включващи последоВателноста от SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, u производни на тези последователности. Изобретението Включва, също така, Вектори, липозоми и други носители, които включват тези последователности или тяхни произВодни. Изобретението ВключВа освен това, протеини транскрибирани от SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, включително, но без да се ограничават до, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 7, както u тяхните производни и варианти.
Един вариант за осъщестВяВане на изобретението Включва разтворими Варианти на KIM протеин, който обикноВено се синтезира като протеин асоцииран с мембраната, и който е ир-регулиран след увреждане. При разтворимите варианти липсва най-малкото част от трасмембранния или интрамембранния участък от нативния KIM протеин. При някои примери, при разтворимият вариант липсва целия трасмембранен или интрамембранен участък от пати в пия К1М протеин. Разтворимите варианти включват сляти протеини, особено тези, които включват производни на KIM протеини, при които липсва поне една част от трасмембранния или интрамембранния участък от нативния KIM протеин. Включват се всички типове сляти KIM протеини, а особено тези, които инкорпорират his-tag, Ig-tag и myc-tag молекулярни форми. Тези сляти KIM протеини могат да притежават характеристики, които имат терапевтични качества, като например увеличен полуживот, които се придава от Ig-tag. Включват се, също така, и сляти протеини, които инкорпорират участъци от избрани домени от KIM протеина.
Вариантите могат да се различават от естествено съществуващия в прородата KIM протеин по амшюкиселинната последователност или по начин, които не включва последователност, или по двете. Вариантите в аминокиселинната последователност се продуцират, когато една или пвече аминокиселини от нормално срещания в природота К1М протеин се замести от друга нормално сресщана в прородата аминокиселина, производно на аминокиселина или ненативна аминокиселина. Предпочитаните варианти включват естествено срещан в природата KIM протеин, или биологично активен фрагмент от стествено срещан в природата К1М протеин, чиито последователности се различават от последователноста на дивия тип по една или повече консервативни аминокиселини и замествания, които типично имат минимално влияние върху вторичната структура и хидрофобното естество на протеина или пептида.
Вариантите могат да притежават, също така, и последователности, които се различават по една или повече неконссрвативни аминокиселини замествания, делеции или инсерции, които не разрушават биологичната активност на KIM протеина. Консервативнити замествания типично включват заместване на една аминокиселина с друга, притежаваща подобни характеристики, като например заместване в следните групи : валии, глицин; глицин, аланин; валии, изолевцин; аспартат, глутамат; аспаргин, глутамин; серии, треонин; лизин, аргини; и фенилаланин, тирозин. Неполярни (хидрофобни) аминокиселини включват аланин, левцин, изолевцин, валии, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярните неутрални аминокиселини включват глицин, серии, треонин, цистсин, тирозин, аспаргин и глутамин. Положително заредените (основни) аминокиселини включват аргинин, лизин и хистидин. Отрицателно заредените (киселинни) аминокиселини включват аспартат и глутамат.
Други консервативни замествания могат да се вземат от долната таблица, като други са описани също от Dayhoff в Atlas of Protein Sequence and Structure (1988).
ТАБЛИЦА 1
КОНИРВАТИВНИ АМИНОКИСЕЛИННИ ЗАМЕСТВАНИЯ
за аминокиселина код заменена е коя да е от
аланин А D-Ala, Gly, beta-Ala, L-
аргинин R Cys, D-Cys D-Arg, Lys, homo-Arg,
аспаргин N D-homo-Arg, Met, D- Met, He, D-Ile, Orn, D- Orn D-Asn, Asp, D-Asp, Glu,
acnapmam D D-Glu, Gin, D-Gln D-Asp,D-Asn, Asn, Glu,
цистеин С D-Glu, Gin, D-Gln D-Cys, S-Me-Cys, Met, n Mpf Thr П Tbr
глутамин Q L/ JVJClj 111Ц Lz- 1 ill D-Gln, Asn, D-Asn. Glu,
глутамат р JL—/ D-Glu. Asp, D-Asp D-Glu, D-Asp, Asp, Asn,
глицин G Asn, D-Asn, Gin, D-Gln Ala, D-Ala, Pro, D-Pro,
изолевцин I Beta-Ala, Acp D-Не, Vai, D-Val, Leu,
левцин L D-Leu, Met, D-Met D-Leu, Vai, D-Val, Met,
лизин К D-Met D-Lys, Arg, D-Arg,
homo-Arg, D-homo-Arg,
Met, D Met, lie, D-Ile,
Orn, D-Orn
метионин фенилаланин пролин
серии треонин
гпирозин валии
м D-Met, S-Me-Cys, lie,
F D-lle, Leu, D-Leu, Vai, D-Val, Norleu D-Phe, Tyr, D-Thr, L-
Р Dopa, His, D-FIis, Trp, D-Trp, Trans 3,4 или 5фенилпролин, cis 3,4 или 5 фенилпролин 1)- Pro, LT
S тиоазолидин-4карбоксилна киселина, D- или L-L оксазолидин-4карбоксилна киселина D-Ser, Thr, D-Thr, allo-
т Thr, Met, D-Met, Mct(O), D-Met(O), Vai, D-Val D-Thr, Ser, D-Ser, allo-
¥ Thr, Met, D-Met, Met(O), D-MetO), Vai, D-Val D-Tyr, Phe, D-Phe, L-
V Dopa, His, D-His D-Val, Leu, D-Leu, lie,
Други варианти на изобретението са тези, с модификации които повишават стабилноста на пептида. Такива варианти могат да съдържат, например, една или повече непептидни връзки (които заместват пептидните връзки) в пептидната последователност. Включват се, също така и : варианти, които включват варианти различни от естествено срещаните в природата L-аминокиселини, като D-аминокиселини или посрещани в природата или синтетични аминокиселини, като бета или гама аминокиселини и циклични варанти. Инкорпорирането на D- вместо L-аминокиселини в полипептида може да увеличи устоичивоста му к ъм протеази. Виж например патент на САЩ 5 219 990.
Обикновено, заместванията, от които се очаква да индуцират промени във функционалните качества на К1М полипептидите са тези, в които : (1) хидрофилен остатък, например серии или треонин, се замества е хидрофобен остатък, например левцин, изолевцин, фенилаланин, или аланин;
(2) цистеинов остатък се замества с който и да е друг остатък; (3) остатък притежаващ електропозитивна странична верига, например лизин, аргинин или хистидин, се замества е остатък притежаващ електронегативен товар, например глутамат или аспартат; или (4) остатък притежаващ обемиста странична верига, например фенилаланин се замества е аминокиселина не притежаваща обемиста странична вмерига, например глицин.
Пептидът, съгласно изобретението, може също така да се модифицира чрез многообразни промени като инсерции, делеции и замествания, било то консервативни или неконсервативни, когато такива промени могат да оситурят
предимства при използуването им. Варианти на снаждане специално се включват в изобретението.
При един друг вариант за изпълнение на изобретението, Варианти с аминокиселинни замествания, които са по-малко консервативни, могат също да дадат желаните производни, например чрез причиняване на промяна в заряда, конформационни и други биологически способности. Такива замествания включват, например, замесваме на хидрофилен остатък с хидрофобен остатък, замесваме на цистеина или пролина с друг остатък, заместване на остатък притежаващ къса странична верига с остатък притежаващ обемиста странична верига. Когато не могат предварително да се предвидят със сигурност резултатите от даденото заместване, производното може веднага да се изследва съгласно методити, описани В настоящето изобретение, за определяне наличието или отсъствието на желаните характеристики.
Варианти Включени В обхВата на изобретението, Включват протеини и пептиди с аминокиселинни последователности притежаващи най-малко осемдесет процента хомоложност с KIM протеин. За предпочитане хомоложноста на последователностите е най-малко деветдесет процента, или най-малко деветдесет и пет процента. С цел да се определи хомоложноста, дължината на последователностите за сравнение обикновено трябва да е най-малко 8 аминокиселинни остатъка, обикновено най-малко аминокиселинни остатъка. Варианти на съставите на изобретението включват, също така, който и да е протеин, който 1) притежава аминокиселинна последователност, която поне В четиридесет процента е хомоложна на KIM протеина от изобретението, и който 2) след като е приведен в оптимален вид на подреждане е последователности на ΚΙΜ (както е изобразено на фигура 5 за човешки и плъши ΚΙΜ-1) има поне 80% от цистеиновите си остатъци подредени срещу цистеините на К1М протеина от изобретението.
Така както е възможно да се заместят заместители от скелета, възможно е също така да се заместят функционални групи, които са свързани със келеша е характеризиращи се е подобни качества. Първоначално земестването е консервативно, т.е. заместващате група е е приблизително същия размер, форма, хидрофобност и заряд, както изходната група. Моадификации на последователностите, могат да включват, например, in vivo или in vitro създаване на химически производни на участъци от съществуващия в природата К1М протеин, така както и промяна в ацетилирането, метилирането, фосфорилирансто, карбоксилирането и гликолизата.
В изобретенението се включват също така и агенти, които се свързват специфично към протеина (SEQ ID NO : 3 или 7). Тези агенти включват лиганди и антитела (вклк)чително моноклонални, едноверижни, двуверижни, Fab фрагменти, и други, било то нативни, човешки, хуманизирани, приматизирани, или химерни). Допълнителни описания на тези категороии агенти могат да се намерят в РСТ заявка 95/16709, чисто описание е включено тук за справка.
КОНКРЕТНИ ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
1. Генериране на РНК от изхемични и нормални бъбреци от възрастен плъх
Изхемични увредени бъбреци от плъх ее получават както е описано от Witzgall at al., (J. Clin. Invast. 93:2175-2188, 1994). Накратко, бъбречната артерия и вена от един бъбрек на възрастен Sparague-Dawley плъх се стягат за 40 минути и после отново се обливат. Взимат се наранените бъбреци от плъховете на 24-ия час и на 48-ия час след обливането. Бъбрци от наужким оперирани възрастни Sparague-Dawley плъхове също се взимат.
Общата РНК се приготвя от органи, на основата на протокол на Glisin et al., (Biochemistry 13:2633, 1974). Бързо, отделените органи се слагат веднага в GNC буфер (4 М гуанизин тиоцианат, 0,5% SDS, 25 тМ натриев цитрат, 0,1% протимопенител от Sigma) и се разрушават върху лед с
политрон. Клетъчните отломки ее отстраняват е нискооборотна клинична центрифуга и супернатантната течност се поставя върху възглавница от 5,7 М CsCl, 25 тМ натриев цитрат, 1 тМ EDTA. РНК се утаява през възглавницата в SW40T1 ротор при 22К за 15 часа. РНК отново се суспендира в стерилна третирана с DEPC вода, утаява ее двукратно с 1/10 обем ЗМ натриев ацетат и 2,5 обема EtOH. Poly А+РНК се изолира чрез ползуваме на комплект за тРНК пречистване (Pharmacia, catalog No. 27-9258-02).
2. Метод на анализ на представителна разлика (RDА) за изолиране на 1-7, 3-2 и 4-7 RDA фрагменти
Синтезира се двуверижна сДНК от наужким оперирани бъбреци и от poly А+РНК от 48 часа след изхемични бъбреци, при използуване на BRL от Gibco Superscript Choice™ System cDNA Synthesis Kit, каталожен номер No. 18090. Първата верига се синтезира чрез праймер от олиго dT и при използуване на Superscript Π™ обратна транскриптаза. Втората верига се генерира чрез използуване на ДНК полимераза I от Е. coli и РНаза Н следвана от Т4 ДНК полимераза при използуване на препоръчаните от BRL условия.
RDA анализът се осъществява основно, както е описано от Hubank and Schatz (Nucleic Acid Research 22:5640-48, 1994). Бързо, сДНК от 48 часа след-изхемичен бъбрек се смила с рестрикционен ензим Ddp II и се лигира към R-Bgl-12/24 олигонуклеотиди (виж справка за точната последователност). PCR амплификация (осъществена е Perkin-Elmer Tag полимераза и съотвс! imi uni PCR буфер) на сДНК лигирана към линкера се използува за генериране на първоначалното представяне. PCR продуктът се означава като тестер ампликон. Същата процедура се използува за генериране на драйвър ампликон от сДНК от бъбрек на наужким опериран плъх.
Хибридизацията на тестер и драйвър ампликоните, следвани от селективна амплификация се осъществява трикратно за генериране на Диференциален Продукт Едно (DPI), Две (DP2) и Три (DP3). Генерирането на DPI продукта се осъществява както е описано от Hubank and Schatz (Nucleic Acid Research 22: 5640-48, 1994). DP2 u DP3 продуктите също се τι генерираш както е описано от Hubank and Schatz (виж по-горе), с изключение на това, че отношенията драйвър : тестер се изменят до 5,333:1 за DP2 и до 40,000:1 за DP3.
RDA продуктите се клонират от DP3 във вектор за клониране pUC 18 : RDA продукт 1-7 (252 bp), когато се генерира при използуване на отношение от 40,000:1, и продукт RD А 3-2 (445 Ьр) и 4-7 (483 Ьр), когато се генерира DP3 при използуване на съотношение 4,000:1. фрагментите от ДНК се субклонират чрез използуване на Pharmacia Sureclone™ комплект (каталожен номер No. 27-9300-01) за ремонтиране на краищата на PCR фрагментите с ензим на Klenow и за улесняване лигирането на тъпите краища на фрагментите във вектор pUC18.
3. Northern анализ
Poly А+РНК (2,5 pg) от бъбрек на нормален възрастен плъх (привидно опериран), от бъбрек на възрастен 48 часа след изхсмично увреждане, и от бъбрек на 18 дневен ембрион, се подлагат на електрофореза и Northern блотинг (Cate, Cell 45685, 1986) върху GeneScreen™ мембрана (Dupont). Хибридизацията в PSB буфер (50 mM Tris 7,5, 1 М NaCl, 0,1% Na пирофосфат, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% BSA, 1% SDS), съдържащ 10% декстрин сулфат и 100 pg/ml tPHK, се осъществява при 65°С при използуване на три различни проби : 1-7 RD А продукт, 3-2 RDA продукт и 4-7 RDA продукт. Всички те се бележат с радиоактивен изотоп, като се използува Pharmacia's Ready to Go™ случаен комплект за маркиране на праимер (каталожен номер No. 27-9251.01). RDA продукти 1-7,
3-2 u 4-7 хибридизира c mPHK-me присъстващи и в трите проби, но по-интензивно с тРНК-те в РНК пробите от 48 часа след изсхемичен бъбрек.
Northern блот анализ на тъкани от възрастен плъх показват, че 1-7 ген ът се експресира при много ниски нива в нормален бъбрек, тестиси, далак и бели дробове на възрастно животно. 3-2 генът се експресира в черния дроб, бъбреците, далака и мозъка. 4-7 генът се експресира в далака, бъбреците, белите дробове, тестисите, сърцето, мозъка, черния дроб и скелетната мускулатура. Присъствието на различни размери тРНК в някои тъкани в 1-7 и 3-2 блот означава, че първоначалният продукт на транскрипцията на 1-7 гена и на 32 гена може да претърпи променен сплаисинг и/или полиаденилация.
4. Изолиране на 3-2 и 4-7 сДНК клонове
Генерира се сДНК библиотека от 4 pg Poly А+РНК от 48 часа след-изсхемичен увреден бъбрек чрез използуване на реагенти от BRL Superscript Choice™ System за сДНК синтез, и Stratagene™ Lambda Zapll комплект за клониранс (каталожен номер No. 236201), съгласно протоколите препоръчани от производителя.
11)5 клона се скринират с 3-2 RDA продукт като проба (случайно маркиране на праймера, както е описано по-горе). Подбират се осем позитивни клона, а четири се избират случайно за вторичен анализ за получаване на чисти фагови плаки. След третичен скрининг се изолират четири чисти фагови клона. Клонираните инсерти от фага се изолират чрез процедурата на in vivo изрязване, съгласно Stratagene™ Lambda Zap II комплект. Най-големият инсерт, от приблизително 2,6 kb отбелязан като сДНК клон 3-2), се подлага на ДНК секвениране. Последователността на инсерта (SEQ ID No: 1) е показана на фигура 1. сДНК клон 3-2 (Е. coli К-12, SOLR/p3-2#51) е депозиран като АТСС No. 98061. Последователността на сДНК клон 3-2 е идентична на тази на клон 1-7 сДНК (SEQ ID N0:2), е изключение на това, че нуклеотиди 136-605 от SEQ ID N0:1 представляват една инсерция. Следователно, SEQ ID N0:2 представлява слепен вариантна форма на SEQ ID N0:1. Клона от 1-7 (Е. coli К-12, SOLR/pl-7#3-l) е депозиран като АТСС No. 98060.
11)5 клонове се скринират с 1-7 RDA продукт като проба (случайно радиомаркиране на праимера, както е описано погоре). Подбират се осем позитивни клона, а четири се избират случайно за вторичен анализ за получаване на чисти фагови плаки. След третичен скршшнг сс изолират четири чисти фагови клона. Клонираните инсерти от фага се изолират чрез процедурата на in vivo изрязване, съгласно Stratagene™ Lambda Zap II комплект. Най-големият инсерт, от приблизително 2,0 kb (отбелязан като сДНК клон 1-7), се подлага на ДНК секвениране; последователността на инсерта (SEQ ID No: 2) е показана на фигура 2.
1()5 клона се скринират с 4-7 RD А продукт като проба (случайно маркиране на праимера, както е описано по-горе и се хибридизират в PBS ри 65°С). Подбират се осем позитивни клона, а четири се избират случайно за вторичен анализ за получаване на чисти фагови плаки. След вторичния скрининг се изолират два чисти фагови клона. Клонираните инсерти от фага се изолират чрез процедурата на in vivo изрязване, съгласно Stratagene™ Lambda Zap II комплект. Наи-голсмият ииесрт, от приблизително 2,4 kb (отбелязан като сДНК клон
4-7), се подлага на ДНК секвениранс. Последователността на инсерта, SEQ ID No: 4 е показана на фигура 3. сДНК клон 4-7 (Е. coli К-12, SOLR/p4-7#l-l) е депозиран като ATCC No. 98062
5. Охарактеризиране на 1-7, 3-2 и 4-7 сДНКклоновете
А) Последователности на ДНК на протеина Последователността на 3-2 сДНК (фигура 1; SEQ ID
N0:1) съдържа отворена рамка на разчитане от 307 аминокиселини (фигура 1; SEQ ID N0:3). Сигнална последователност от 2SEQ ID NO: 1 се подсказва от анализа на
Von Heijne (Von 1 lcijne et al., Nucleic Res. 14:14683 (1986)), u трансмембранна област обхващаща приблизително aa 235-257 означава, че 3-2 продуктът е повърхностен клетъчен протеин.
Последователност 1-7 сДНК (фигура 2; SEQ ID N0:2) съдържа отворена рамка на разчитане от 307 аминокиселини, която е идентична е отворената рамка на разчитане в 3-2 сДНК (SEQ ID N0:3). Последователност 4-7 сДНК (фигура 3; SEQ ID N0:4) съдържа отворена рамка на разчитане от 572 аминокиселини (SEQ ID N0:5). Грансмембра ината област е локализирана приблизително при аминокиселини 501-521.
В) In situ анализ на 1-7, 3-2 и 4-7 тРНК в koi ι тралат срало ι и пост-изсхемични бъбреци от възрастен плъх :
In situ хибридизация се осъществява съгласно метода описан от Finch et al., Dev. Dynamics 203:223-240, 1995. Бързо, и двата, изхсмичння и контралатералния бъбрек се фиксират е 4% параформалдехид в PBS. След това бъбреците се фиксират през поща при 4°С. Парафинови срезове се депарафинизират и се хидратират отново, фиксират се е 4% параформалдехид в PBS, смилат се е протеиназа Н, отново се фиксират, след което се ацетилиран оцетен анхидрид в триетаноламин буфер. След това срезовете се дехидратират и се хибридизират е 32р_ маркирани рибопроби при 55°C за цяла нощ, е З^Р-маркирани проби, генерирани от 3-2 RDA или 1-7 RDA продукти субклонирани в BamHI сайт на pGEM-HZ. След хибридизация, срезовете се промиват при строги условия (2 х SSC, 50% формамид при 65°С). Срезовете се дехидратират накрая, покриват се е емулсия (NBT-2) за авторадиография и се експонират поне за една седмица. Сребърни зрънца се проявяват и срезовете се оцветяват за преброяване с толуидин блу и се микрофотографират.
Анализът на 1-7 и 3-2 тРНК експресията чрез in situ хибридизация показват, че тези гени са силно ир-регулирани в повредените бъбречни клетки, в сравнение с тяхната експресия в нормалните бъбречни срезове. Показаната експресия е в регенеративни клетки от кортекса и външната медула, повечето от които изглежда са проксимални тубулни клетки.
Анализът in situ на 1-7 РНК модела на експресия също разкрива силна експресия на този ген в увредения изхимичен бъбрек в сръвнение с нормален бъбрек от възрастно животно. Изглежда сайт на експресия са филтриращите клетки.
6) Изолиране на клон от човешка сДНК, които хибридизира кръстосано с 3-2 сДНК от плъх
Получават се 32р_маркирани ДНК проби, съдържащи нуклеотиди 546-969 от инсерта на клон 3-2, показан на фигура 1 и се използуват за скриниране на човешки ембрионален черен дроб ламбда gtlO сДНК библиотека (Clontech Catalog#HL5003a). 1 х 1()6 плаки се подлагат на скриниране с повторение, чрез използуване на стандартни условия, както е описано по-горе, но температурата при скринирането е 55°С. За промиването при строги условия, филтрите ее промиват е 2 х SSC при 55°C. Идентифципани са петдесет позитивни фага и плаките се пречистват. ДНК от фагите се подлагат на Southern анализ, при използуване на същите проби както по-горе. Southern блот филтърът се, подлага на крайното промиване е 0,5 х SSC при 55°С. Два клона се идентифицират като позитивни. Инсерта на клон Н13-10-85 се подлага на секвениране и е открита област, която кодира за протеин с висока степен на идентичност с 3-2 протеина, показан на фигура 3.
Нуклеотидна последователност (SEQ ID N0:6) и предсказаните аминокиселинни последователности (SEQ ID N0:7) на човешки 3-2 свързан протеин, са показани на фигура 4. Както се вижда от bestfit анализа, посочен на фигура 5, човешки
3-2 свързан протеин е 43,8% идентичен и 59,1% подобен на 3-2 протеина от плъх. И двата съдържат IgG, муцин, трансмембранни и цитоплазмични домени. Шесте цистеина в IgG домените на двата протеина са консервативни.
Ί) Продуциране на KlM-1 Ig слят протеин
Слят протеин на извънклетъчният домен на KIM и Fc областа на имуноалобулин (Ig) е полезно средство за изучаване на молекулярната и клетъчна биолога на увреден/регенериран бъбрек и като терапевтична молекула. За продуциране на KIM Ig слят протеин с изв ънклетъчен домен от KIM-1, сДНК се амплифицира чрез PCR и се клонира в Biogen скспресионен вектор рСА125, за временна експресия в COS клетки. Експресиошшят вектор рСА12 продуцира слят протеин, които притежава структура от ген, клониран при N-края и човешка Ig Fc област при С-края. COS клетките се трансфектират е плазмид SIR 103 или 104; тези плазмиди скспресират слят протеин, които съд ържа човешки KIM последователности 2631147 (SEQ ID N0:6; SJR 103) или KIM последователности 5991319 (SEQ ID N0:1; SIR 104) на извънклетъчния домен слят към човешка Ig Fc област. Клетките се култивират в 10% BS В DMEM в лаборатория за клетки (Nunc, Naperville, II). Два до три дни след трансфектирането се събира средата, концентрира се чрез Arnicon концентратор и слятият протеин се пречиства чрез използуване на Protein-A Sepharose колона. След пречистването чистотата на слятия протеин се измерва чрез SDS-PAGE.
ДИАГНОСТИЧНА УПОТРЕБА НА СЪЕДИНЕНИЯТА ОТ ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Aiimu-KlМ антитела, съгласно изобретението, които специфично се свързват към протеина на SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7 или тяхни фрагменти, са полезни при някои диагностични методи. Тези агенти могат да се бележат е маркери, които могат да се установят, като например флуороскопично или радиографично непрозрачни вещества, и да се приложат върху пациент за да позВолят онагледяването на тъканите, които експрееират KIM протеин. Агентите могат, също така, да бъдат свързани към вещества, като пероксидаза от хрян, която може да се използува като имуноцитохимични багрила, което да позволява визуализирането на площите на клетките с положителен KIM протеин върху хистологични срезове. По този начин може самостоятелно да се използува специфично антитяло, и местата в които то се свързва се визуализират чрез сандвич-метода, чрез използуване на антиимуноглобулин антитяло, което самото то е свързано към маркер, които може да се отчете.
Специфичните антитела к ъм К1М протеина са полезни, също така, в имуноизследванията за измерване на присъствието на KIM или концентрацията в пробите от телесни тъкани и течности. Такива концентрации могат да се свържат с различни стадии на заболяване. Като вариант за изпълнение на изобретението от изключителен интерес, изобретението включва метод за диагностициране на б ъбречно увреждане, или онагледяване на процес на бъбречно възстановя валс, чрез измерВане на концентрацията на KIM или фрагменти на К1М в урина, плазма или серум на пациент. Подобно, KIM може да се измери в утайката на урината, а поточно в клетъчните отломки на утайката на урината. Изхвърлените бъбречни тубулни клетки, които могат да присъстват в утайката на урината на пациенти с протичащи бъбречни заболявания, могат да съдържат завишени нива на KIM протеин и тРНК.
Специфични антитела за KIM ротеина могат да се свържат, също така, към твърда повърхност, като перли или съдове, и да се използуват за отстраняване на лиганда от разтвора, било то за измерване, или за пречистване и охарактеризиране на протеина или неговите характерни качества (като посттранслационни модификации). Такова охарактеризиране на KIM протеина на пациента може да се окаже полезно при идентифициране на вредни мутанти или дефекти, които се застъпват е функциите на KIM и се свързват е ненормалните фенотипове на пациентите. Всяка една от тези техники е добре позната на специалистите в областа от имунологичната литература.
Допълнителни методи за онагледяване използуват К1М или фрагменти на KIM, слят с части, които могат да се изобразят, за диагностично изобразяване на тъкани, които ексресират КШ лиганди, а по-спацално тумори.
Други диагностични техники се основават на upрегулирането на KI.M. тРНК в тъканите, като показател за свързани с увреждане процеси. Тази техника е тествана и приложима за работа в модел на изхемич1 ю наранване в плъхове, както следва.
За да се определи дали ее е покачило нивото на KIM-1 протеина след увреждане, се разглаждат хомогенати от бъбрек на контралатерални и постизсхемични бъбреци 24 и 48 часа след 40 минутно стягане на бъбречната артерия и вена на единия бъбрек за всеки плъх. Бъбречният хомогенат се изследва за присъствие на KIM-1 протеин. Western блот анализът
идентифицира три протеина определени чрез две различни антитела след изсхемично нараняване, които не могат да се установят в хомогенатите от контралатералните бъбреци, които не са изложени на изсхемично нараняване. Явните молекулни тегла на ивиците са приблизително 40 kDa, 50 kDa и 70-80 kDa. Установените три вида протеини чрез western блотинг биха могли да представляват потенциални N или О свързани сайтове на гликозилиране. фактът, че всеки от тези протеини реагира с два различни комплекта поликлонални антитела поддържа идеята, че те са свързани към KIM-1 и не са кръстосано реагиращи ивици. Потвърждението на това предсказание дойде от резултатите от частично CNBr разцепване на трите протеина, които разкриха, че те делят общи CNBr фрагменти на разцепване. Тъй като не е предсказано, чс цитоплазматичният домен на KIM-1 съдържа каквато и да е голяма пост-транслационна модификация, двата най-малки продукта от смилането (4,7 kDa и 7,4 kDa) определени с антитела срещу цитоплазматичния домен на KIM-1, би трябвало да са със същия размер за трите различни ивици на KIM-1 протеина, ако те произлизат от един и същ протеин. Наблюдаваме, че KIM-1 40 kDa и 70-80 kDa протеините носят фрагменти, които мигрират като предсказания размер. Смилането на ивицата на 50 kDa протеина дава също ивица на същия С-краен пептид.
KIM-1 последователността представя два предполагаеми сайта за N-гликозилиране и муцинов домен, където Огликозилирането може да покрие полипептидната верига. Установените три KIM-1 ивици в пост-изсхемичен бъбрек, могат да съответстват на гликозилирани варианти на същия
ΜμΜι протеин на сърцевината. De-N-гликозилиране на PNG-аза F води до преместване на всичките три ивици към по-ниско молекулно тегло, което съответства на загуба на около 3 kDa, което означава, че всичките три протеина са N-гликозилирани. Разликите при О-гликозилирането може да обясни разликите в размера на тези три ивици.
ТЕРАПЕВТИЧНА УПОТРЕБА НА СЪЕДИНЕНИЯТА ОТ ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Терапевтичните методи от изобретението включват селективно спомагане или инхибиране на клетъчните отговори, които зависят от KIM лигирането. Когато KIM и KIM лиганда са свързани мембаранно и двата, и се експресират от различни клетки, трансдукцията на сигнала може да се прояви в експресираща KIM клетка в KIM лиганд-експресираща клетка, или и двете.
KIM лигиране-бързо реагиращ отговор в KIM лигандекпресиращи клетки може да се генерира при влизането на клетките в контакт с екзогенни KIM, KIM сляти протеини или чрез активизиране на антитела срещу KIM лиганд, било то in vitro или in vivo. По-нататък, отговорите на К1М лигандекпресираща клетка, която иначе щеше бързо да бъде задействана от ендогенен KIM, би могла да се блокира чрез влизането в контакт на KIM лиганд-скпресираща клетка с KIM лиганд антагонист (например, антитяло антагонист, което се свързва е KIM лиганд), или чрез влизането в контакт на ендогенния KIM е анти-К1М антитяло или друга свързваща
KIM молекула, която предпазва действителното лигиране иа KIM с KIM лиганда.
Подобно, отговорите, които се задействат от KI M лигиране в KIM екпресираща клетка могат да се спомогнат или да се инхибират от екзогенни съединения. KIM лигирансзадействащият отговор в KIM екпресиращата клетка, може да се генерира чрез поставянето на клетката в контакт с разтворим KIM лиганд, или някои анти-К1М активиращи антитела. По-нататък, отговорите 11а К1М екпресираща клетка, която иначе щеше бързо да бъде задействана от взаимодействието с ендогенен KIM лиганд, би могла да се блокира чрез влизането в контакт на KIM екпресиращата клетка е един антагонист иа KIM (например, блокиращо антитяло, което ее свързва с KIM по начин предотвратяващ действителното генерирщо-сигнал К1М лигиране), или чрез влизането в контакт на ендогенния KIM лиганд с анти-К1М лиганд антитяло или друга свързваща KIM лиганд молекула, която предпазва действителното лигиране на KIM с KIM лиганда.
Изборът на горе-описаните начини на действие, който да е полезен за определено терапевтична употреба, зависи от проявеният етиологичен механизъм или на патологичния процес, който трябва да бъде инхибиран, или от желания медицински процес, който трябва да бъде спомогнат, както става ясно на специалистите в областа на медицината. Например, когато KIM лигирането води до желан клетъчен растеж, поддържане на диференцииран фенотип, устойчивост на апоптозис, индуциран от различни инсулти, или други полезни от медицинска гледна точка отговори, може да се
използува един от горе-описаните начини на действие, спомагащ лигиране-задействащ отговор. Алтернативно, един от инхибиращите начини на действие може да е полезен, когато KIM лигиране се придружава от нежелани последствия, като неопластичен растеж, вредна загуба на клетъчните функции, предразположение към апоптозис, или епомагане на възпалителни състояния.
Следват примери за описаните вече терапевтични методи на изобретението. Едно терапевтично приложение на свързаните е KIM съединения, съгласно изобретението, е за лечение на субект е бъбречно заболяване, епомагане растежа на нови тъкани в субекта, или епомагане преживяването па наранената тъкан в субекта, и включва етапа па прилагане върху субекта на терапевтично ефективно количество от KIM. протеин, съгласно изобретението, или на фармацевтичен състав, който включва протеин, съгласно изобретението. Използуваният В тези методи протеин може да бъде фрагмент от KIM протеин В пълен размер, разтворим KIM лиганд протеин или слят фрагмент, или KIM агонист. Тези методи могат, също така, да се практикуват чрез прилагане Върху субекта на терапевтично ефективно количество антитяло агонист, съгласно изобретението. KIM протеинът може да се прилага конкурентно с терапевтично ефективно количество второ съединение, което проявява терапевтично желан помощен ефект. гГъй като интересуващите ни тъкани за тези методи могат да включват каквато и да е тъкан, предпочитаните тъкани включват бъбречна тъкан, чернодробна, неврвна тъкан, сърце, стомах, тънките черва, гръбначния мозък, или бял дроб. Особенни бъбречни състояния, koumo могат благоприятно да се лекуват със съединенията на изобретението, включват остра бъбречна недостатъчност, остър нефрит, хронична бъбречна недостатъчност, нефротичен синдром, дефекти на бъбречните тубули, бъбречни трансплантанти, токсични наранявания, хипоксично (с намалено съдържание на кислород) нараняване, и травми. Дефектите на бъбречните тубули включват, тези с наследствена или придобита същност, като например полицистично бъбречно заболяване, медуларно цистично заболяване, и медуларен гъбест бъбрек. Този списък не е ограничен и може да включва още много други бъбречни нарушения (виж например, Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th ed., 1994, което се включва тук за справка). Субект на методите може да бъде човек.
Терапевтична интервенция за инхибиране растежа на нежелана KIM лиганд-експрссираща тъкан в пациент включва етапа на прилагане върху субекта на терапевтично ефективно количество КТМ антагонист (например, антитяло антагонист, което може да се свържи към KIM лиганда), или чрез прилагане на терапевтично ефективно количество антиKIM антитяло или друга KIM-свързваща молекула, която блокира свързването на KIM към KIM лиганд-експресиращата тъкан. В един вариант за изпълнение на изобретението, представляващ интерес, KIM антагониста или anmu-KlM антитялото може да се използува терапевтично за инхибиране или блокиране растежа на туморите, чйто растеж зависи от К1М протеина.
Други методи на изобретението включват убиване на KIM лиганд-експресиращи туморни клетки, или инхибиране на
растежа им, чрез поставянето на клетките в контакт със слят протеин на KIM и токсин или радионуклеид, или антиKIM. лиганд антитяло конюгирано е токсин или радионуклеотид. Клетката може да е в пациента, а протеинът или конюгипаното антитяло се прилага в ърху пациента.
В изобретението се включва също метод за насочване на токсин или радионуклеотид в клетка екепресираща KIM, които метод включва привеждане на клетката в контакт със слят протеин, съдържащ KIM лиганд и токсин или радионуклеотид, или едно анти-К1М антитяло конюгирано е токсин или е радионуклеотид. Друг вариант за изпълнение на изобретението включва премахване растежа на туморниата клетка, която експресира KIM, включващ привеждане на клетката в контакт със слят протеин на KIM лиганд и токсин или радионуклеотид или е анти-КШ антитяло, конюгирано с токсин или радионуклеотид; клетката може да е в субекта, и протеин ът се прилага върху субекта.
Терминът субект, както се използува в описанието, се отнася до кои да е бозайник, на които може да се приложи KIM. Субектите, изключстолно подходящи за третиране по метода на изобретението, включват хора, така както и нечовешки примати, овце, коне, рогат добит ък, кози, прасета, кучета, котки, зайци, морски свинчета, хамстери, плъхове и мишки, както и органи, тумори, и клетки произлизащи от тези гостоприемници.
ИЗПОЛЗУВАНЕ НА СЪЕДИНЕНИЯТА НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ПРИ ГЕННАТА ТЕРАПИЯ
KIM гените, съгласно изобретението, се въвеждат в увредеаната тъкан или в тъкан, к ъдето е желан стимулация на растеж. Такава генна терапия стимулира продуцирането на KIM протеин от трансфсктираните клетки, спомагайки клетъчния растеж и/или преживяването на клетките, които експресират KIM протеин.
В един специфичен вариант за изпълнение на метода на генна терапия, ген кодиращ за KIM протеин може да се въведе в бъбречната тъкан мишена. KIM протеина ще се експресира стабилно и ще стимулира тъканния растеж, деленето, или диференциацията, или би подсилил клетъчната преживяемост. KIM генът може, освен това, да се въведе в клетка мишена чрез използуване на голям брой добре известни методи, при които се използува вирусна или не-вирусна основана стратегия.
Не-вирусните методи включват електропорация, мембранно сливане с липозоми, бомбардиране с висока скорост е микроенаряди покрити с ДНК, инкубиране е калциевофосфатна ДНК утайка, DEAE-декстран медиирана трансфекция, и директно микро-инжектиране в единични клетки. KIM ген може, например, да бъде въведен в клетка чрез калциево фосфатно ко-утаявапс (Pillicer et al., Science, 209:14141422 (1980); механично микроинжектиране и/или ускоряване на частици (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5399-54-3 (1980); основаващ се на липозоми ДНК трансфер (например, LIPOFECTIN-медиирано трансфектиране- Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 471-477, 1987; Gao arid Huang, Biophys.
Res. Comm., 179: 280-285, 1991; DEAL Dextran-мединрана трансфекция; електропорация (патент на САЩ 4 956 288); или методи основаващи се на полилизина, при които ДНК се конюгира, така че ДНК за предпочитане да бъде доставена в чернодробните хепатоцити (Wolff et al., Science, 247: 465-468, 1990; Curiel et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992).
Клетки мишени могат да бъдст трансфектирани е гените на изобретението чрез директен генен трансфер. Виж например Wolff et al., Direct Gene Transfer Into Moose Muscle in vivo, Science 247:1465-68, 1990. В много случаи, векторMcguupailumc трансфекции са желани. Може да се използува който и да е метод известен от състоянието на техниката за инсериране на полинуклеотидни последователности във вектор (виж например Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; u Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, N Y, 1992, като и двата източника се включват тук за справка). Активирането на промотора може да бъде тъканно специфично или индуцируемо от мстаболитен продукт или приложено съединение. Такива промотори/енхансери включват, на без да се ограничават до, нативен c-ret лиганд протеин промотор, цитомегаловирус непосредствен-бърз промотор/ енхансер (Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13, 1989); бетаактинов промотор (Gunning et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:4831, 1987; глюкокортикоид-индуцируем промотор присъстващ в дългия краен повтор на миши туморен вирус на млечната жлеза (MMTV LTR) (Kiessig et. al., Mol. Cell. Biol., 4: 1354, 1984); последователности на дълги крайни повтори на вируса на Moloney миша левкемия (MuL V LTR) (Weiss et al.,
RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1985); SV40 ранен промотор на областа (Bernoist and Chambon, Nature, 290:304, 1981); промотор на Вируса на Rous саркомата (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 22:787, 1980); тимидин киназен промотор на Вируса на херпес симплекс (HSV) (Wagner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 3567, 1985).
KIM гените могат, също така, да бъдат ВъВсдсни чрез специфични Вирусни Вектори за използуване при системи на гспен трансфер, които вече са добре утвърдени. Виж например: ф Medzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533-36, 1992 (паповаВирус SV40);
Berkner et al., Curr. Rop. Microbiol. Immunol., 158: 39-61, 1992 (аденовирус); Hofman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 10099-10103, 1995 (бакулоВирус); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:25-38, 1992 (вакциниа вирус); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123 (адено-асоцииран вирус); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93, 1992 (херпес симплекс вирус (HSV) u Epstein-Barr virus (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24, 1992 (ретровирус); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol. 4: 749-754, 1984 (ретровирус); Miller et al., Nature, q 357: 455-450. 1992 (ретровирус); Anderson, Science, 256: 808-813,
1992 (ретровирус); Current Protocols in Moleculdr Biology: Sections 9.10-9.14 (Ausubel et al.,Eds.), Green Publishing Associcates, 1989, всички които са включени тук за справка.
Предпочитани вектори са ДНК-овите вируси, които включват аденовируси (за предпочитане вектор основаВащ се на Вируса на херпес симплекс и паповавирус (за предпочитане дефектен или не-автономен паповавирус, по-предпочитано вектори на основата на адено-асоцииран Вирус, още попредпочитано Вектори базирани на AVV-2). Виж например, Ali et al., Gene Therapy 1: 365-384, 1994; патент на САЩ 4 797 368 u 5 399 346, kakmo u следващите разисквания.
Изборът на определена векторна система за трансфер, например, KIM последователност, ще зависи от голям брой фактори. Един важен фактор е естеството на популацията от клетки мишени. Въпреки че ретровирусните вектори нашироко са били изследвани и използувани в голем брой генно терапевтични приложения, те не са подходящи за инфектиране на клетки, които не се делят, но могат да са иполузуват в противо-раковаята терапия, тъй като те само интегрират и експресират тяхнитс гени в реплициращите се клетки. Те са полезни при in vivo подход и са примамливи, в това отношение, поради факта на тяхното интегриране в генома на клетката мишена.
Аденовирусите са ДНК-ови вируси, които могат да бъдат модифицирани, така че ефикасно да доставят терапевтичен или репортер трансген на голямо разнообразие от типове клетки. Обикновените аденовируеи тип 2 и 5 (Ad2 и Ad5, съответно), които пречиняват дихателни заболявания при хората, са разработени най-общо за генна терапия на Duchenne Мускулна Атрофия (DMA) и Диетична фиброза (CF). Ad2 както и Ad5 принадлежат на подклас аденовируеи, които не са асоциирани к ъм злокачествени заболявания при хора. Адсновирусните вектори са способни да доставят изключително високи нива на транегени до практически всички видови клетки, без значение от миотичното състояние. Лесно могат да се генерират високи титри (10^ плака образуваща еденица/ml) на рекомбинантен вирус в 293 клетки (аденовирустрансформирана, комплементарна ембрионална бъбречна клетъчна линия : ATCC CRL1573) и могат да се съхраняват замразени за продължителни периоди без значителни загоби. Ефикастността на тази система при доставянето на терапевтичен транеген in vivo, които допълва генетичния дисбаланс е демонстрирана при животински модели е различни разтроиства. Виж Watanabe, Athereosclerosis, 36: 261-268, 1986; Tanzawa et al., FEBS Letters 118(1):81-84, 1980; Golasten et al., New Engl. J. Med. 309: 288-296, 1983; Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 92: 883-893, 1993; u Ishibashi et al, J. Clin. Invest. 93: 1889-1893, 1994, като всичките източници са включени тук за справка. Действително, рекомбинантни е дефектна репликация аденовируси кодиращи сДНК за трансмембранния регулатор на цистична фиброзна (CFTR) са били удобрени за използуване при поне две човешки CF клинични изпитания. Виж например, Wilson, Nature, 365: 691-692, 1993. Друг факт в поддръжка на безопааиюстта на рекомбинантните аденовируси за генна терапия е широкия опит да се поддържа жива аденовирусна ваксина в човешки популации.
Първото поколение рекомбинантни, с дефект в репликацията аденовируси, които са разработени за генна терапия на DMD и други наследствени нарушения, съдържат делеция на цялата Е1а и част от Elb областите. Този вирус е дефект в репликацията се култивира в 293 клетки съд ържащи функционален аденовируеен Е1а ген, които дава възможност за прехвърляне на Е1а протеина. Вируси е делеция на Е1а са способни да се реплицират и да продуцират инфекциозни вируси в 293 клетки, които предоставят гении продукти от Е la и Elb областите в транс. Полученият вирус е способен да инфектира много типове клетки и може да експресира ишпродуцирания ген (при положение, че moil носи собствен промотор), но не може да се реплицира в клетка, която не носи Е1 областа на ДНК, освен ако клетката не е инфектирана е много висока мултипленост на инфекцията. Аденовируеите имат предимството че притежават широк кръг гостоприемници, че могат да инфектират неподвижни или терминално дифсренциирани клетки, като например неврони, и че ся явяват неонкогенни по същество. Аденовируеите изглежда не се интегрират в генома на гостоприемника. Рискът от инсерционен мутагенез е силно намален поради факта, че те съществуват извънхромозомно. Ali et al., 373 (виж по-горе). Рекомбинантните аденовируси (rAd V) продуцират многто високи титри, вирусните частици са сравнително стабилини, нивата на експресия са високи, и могат да се инфектират широк кръг клетки. Тяхния естествен гостоприемник е въздухообменния епител, така че те са полезни за терапия на рак на белите дробове.
Бакуловирус-медиираният трансфер притежава някои предимства. Бакуловирусният генен трансфер може да се осъществи в реплициращи и нереплициращи клетки, както също и в бъбречни клетки, така както и в хепатоцити, нервни клетки, клетки на далака, на кожата и мускулите. Бакуловирус не се реплицира и не е патогенен в клетки на бозайници. При хората липсват прадварително съществуващи антитела за рекомбинантни бакуловируси, които биха могли да блокират инфекцията. Бакуловирус е в състояние, освен това, да инкорпорира и да транедуцира много голями ДНК инсерти.
Адено-асоциираните вируси (AVV) също се използуват като вектори за соматична генна терапия. AVV е малък, едноверижен (ss) ДНК-ов вирус с проста геномна организация (4-7 kb), което го прави идеален субстрат за генно инженерство. Две отворени рамки на разчитане кодират серии от rep и cap полипептиди. Rep полипептидите (гер78, гер68, и гер40) са въвлечени в репликацията, запазването и интегрирането на AVV генома. cap протеините (VP1, VP2 и VP3) образуват капсида на вириона. Заграждайки rep и cap отворените рамки на разчитане при 5' и 3' краищата, се намират 145Ьр обратни повтори (ITRs), п ървият 125 Ьр, от които е способен да образува У- ири Т-образни сдвоени конструкции. За развитието на AVV вкторитс е от значение целите rep и cap домени да могат да бъдат изрязани и заменени с терапевтичен или репортер трансген. Виж В. J. Carter, in Hanbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155-168 (1990). Показано е, че ITRs представлява минималната последователност необходима за репликация, запазване, обвиване, и интегриране на AVV генома.
Адено-асоциираните вируси (AVV) притежават значителен потенциал при генната терапия. Вирусните частици са много стабилни и рекомбииантните A VVs (rAAV) притежават лекарствено-подобни характеристики по това, че rAAV могат да се пречистят чрез утаяване или чрез свързване в градиент на CsCl. Те са термостаблни и мога да се лиофилизират до прахообразно състояние и да се рехидратират до пълна активност. Тяхната ДНК стабилно се интегрира в хромозомата на гостаприемника, така че експресията е дълготрайна. Те имат широк обхват от гостоприемници и AVV не пречиняват познати заболявания, така че рекомбииантните вектори не са токсични.
След като веднъж са въведени в клетката мишена, интересуващите ни последователности могат да се идентифицират чрез конВентционнални методи, като например хибридизация на нуклеинови киселини чрез използуване на проби съд ържащи последователности, които са хомоложни/комплементарни на инсерираната генна последователност на вектора. Съгласно друг подход, последователонстите могат да се идентифицират според присъствието или отсъствието на маркерен ген функция (например, тимидин киназна активност, устойчивост на антибиотик, и други подобни), причинена от въвеждането на експресионния вектор в клетката мишена.
ЛЕКАРСТВЕНИ ФОРМИ И ПРИЛОЖЕНИЕ
Съединенията, съгласно изобретението, се привеждат във вид на лекарствани форми, съгласно стандартната практика, така както се приготвят и за носител вехикулум. Терминът фармакологично приемлив носител означава една или повече органични или неорганични съставки, естествени или синтетични, с които мутантният протоонкоген или мутантен онкопротеин се комбинира за да се улесни неговото прилагане. Подходящи носители включват стерилен физологичен разтвор, въпреки че на специалистите в областа са известни други водни или неводни изоточни стерилни разтвори и стерилни суспенсии, за които е известно, че са фармацевтично приемливи носители. В този смисъл терминът носител включва липизоми и 111V-1 tat протеин (виж Chen et al., Anal. Biochem. 227: 168-175, 1995), maka kakmo u koumo u ga e плазмид и вирусни екпресионни вектори.
Всеки от новите полипептиди от настоящото изобретение може да се използува под формата на фармацевтично приемлива сол. Подходящи киселини и бази, които са способни да образуват соли с полипептида от настоящото изобретение, са добре известни на специалистите в областа, и включват неорганични и оргнични киселини и основи.
Съединение, съгласно изобретението, се прилага върху субект в терапевтично-ефективно количество, което означава такова количество от съединението, което причинява желан медицински резултат или упражнява влияние в ърху
определеното състояние, което се третира. Ефективно количество от съединението на изобретението е способно да подобри или да забави развитието на болестното, дегенеративно или увредено състояние. Ефективното количество може да се определи индивидуална основа и ще се основава, отчасти, върху наблюденията на лекуващия лекар на субекта, симптомите, които трябва да се третират и постигнатите резултати. Ефективното количество може да ес определи от всеки специалист в областа, чрез прилагане на такива фактори и при използуване не повече рутинни екперименти.
Липозомната система за доставка на съединение от изобретението, може да е които и да е от голямото разнообразие еднослойни везикули, стабилни многослойни везикули, и може да се приготви и да се прилага съгласно методи, добре известни на специалистите в областа, например, съгласно посоченото В патенти на САЩ No 5 169 637, 4 762 915, 5 000 958 или 5 185 154. Освен това може да се окаже желателно да се експресира новия пептид на изобретението, така както и други избрани полипептиди, като липопротешш, е цел да се засили тяхното прикрепяне към липозомите. Като пример може да се осъществи in vivo третиране на остра бъбречна недостатъчност с капсулиран в липозом KIM протеин, в клетки, които се нуждаят от такова лечение чрез липозоми. Липозомите могат да се доставят до бъбречната артерия чрез катетър. Рекомбинантният KIM протеин се пречиства, например, от СНО клетки чрез имуноафинитентна хроматография или който и да друг подходящ метод, след което се смесва с липозомите и се инкорпорира в тях при висока ефикастност. Инкапсу лира пият протеин може да се тествува in vivo за какъвто и да ефект на стимулиране на клетъчния растеж.
Съединенията, съгласно изобретението, могат да се прилагат по какъвто и да е, медицинско приемлив, начин. Това може да включва инжектиране, по параитерален път, като интравенозно, интраваскуларно, интрапарентерално, подкожно, мускулно, интратуморно, интраперитонеалио, интравентрикуларно, интраепидурално, или друго, така както и орално, назално, офталмично, ректално, или локално. Прилагането със забавено действие също се включва специфично в изобретението, по такива начини като инжекции с депо действие, или ерозивни импланти. Локализираното доставяне е изключително подходящо, чрез такива начини за доставяне чрез катетър до една или две артерии, като например бъбречната артерия или мехур, подпомагащ локализацията на тумора.
Въпреки, че горното изобретение е описано В детайли за да илюстрира и като пример с цел по-ясно разбиране, на специалистите в областа ще бъде ясно, че могат да се наложат промени и модификации в обхвата на изобретението, който единствено се ограничава от обхвата на прилежащите патентни претенции.
СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) Обща информация :
(i) заявител : Michele Sanicola-Nadel
Joseph V. Bonventura
Catherine A. Hession
Takaharu Ichimura
Henry Wei
Richard L. Cate (ii) заглавие на изобретението :
МОДУЛАТОРИ НА ТЪКАННА РЕГЕНЕРАЦИЯ (iii) брои на последователностите : 7 (iv) адрес за кореспонденция :
(A) адрес : Biogen, Inc.
(B) улица :14 Cambridge Center (C) град : Cambridge (D) щат : МА (E) страна : USA (F) код ZIP :02142 (v) компютърна форма за разчитане :
(A) тип на средата : флопи диск (B) компютър : IBM PC съвместим (C) операционно система : PC-DPS/MS-DOS (D) програмен продукт : Patentin Release #1.0, версия #1.30 (vi) данни за настоящата заявка :
(A) номер на заявката :
(B) датата на заявяване : 23.05.1997 (C) класификация (vii) данни за предшестващи заявки :
(A) номер на заявката : US 60/018 228 (B) датата на заявяване : 24.05.1996 (viii) данни за патентния представител :
(A) име : Levine, Leslie Μ.
(B) регистрационен номер : 35 245 (C) справка : А010 РСТ CIP (ix) телекомуникационна информация :
(A) телефон : (617) 679-2810 (B) факс : (617) 679-2838 (2) информация за SEQ ID NO : 1 :
(i) характеристики на последовател) юста :
(A) дължина : 2566 базови двойки (B) тип : нуклеинова киселина (C) верижност : единична (D) топология : линейна (ii) тип на молекулата : сДНК (ix) характеристики :
(A) име/ключ : CDS (B) локализация : 615..1535 (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO : 1:
(2) информация за SEQ ID NO : 2 :
(i) характеристики на последователноста :
(A) дължина : 2084 базови двойки (B) тип : нуклеинова киселина (C) верижност : еденична (D) топология : линейна (ii) тип на молекулата : сДНК (ix) характеристики :
(A) име/ключ : CDS (B) локализация : 145..1065 (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO : 2 :
(2) информация за SEQ ID NO : 3 :
(i) характеристики на последователноста :
(A) дължина : 307 базови двойки (B) тип: аминокиселина (C) верижиост : единична (D) топология : линейна (п) тип на молекулата : протеин (xi) описание на последоватслноста : SEQ ID NO : 3 :
(2) информация за SEQ ID NO : 4 :
(i) характеристики на последоватслноста :
(A) дължина : 2303 базови двойки (B) тип : нуклеинова киселина (C) верижиост : единична (D) топология : линейна (п) тип на молекулата : сДНК (ix) характеристики :
_ (А) име/ключ : CDS (В) локализация : 107..1822 (xi) описание на последоватслноста : SEQ ID NO : 4 ;
(2) информация за SEQ ID NO : 5 :
(i) характеристики на последоватслноста :
(А) дължина : 572 аминокиселини (B) mun : аминокиселина (D) топология : линейна (ii) тип на молекулата : протеин (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO : 5 :
(2) информация за SEQ ID NO : 6 :
(i) характеристики на последователноста :
(A) дължина : 1795 базови двойки (B) тип : нуклеинова киселина (C) верижност: еденична (D) топология : линейна (ii) тип на молекулата : сДНК (ix) характеристики :
(A) име/ключ : CDS (B) локализация : 278..1279 (xi) описание на последователноста : SEQ ID NO : 6 :
(2) информация за SEQ ID NO : 7 :
(i) характеристики на последователноста :
(А) дължина : 334 аминокиселини (B) mun : аминокиселина (D) топология : линейна (ii) тип на молекулата : протеин (xi) описание на последовател!юста : SEQ ID NO : 7 :
TTG ACA ATA GAG AAC TCT GTT GAT AGT GAT Asp AGT Ser GGT CTG TAT TGT Cys TGC Cys 938
Leu Thr lie 95 Glu Asn Ser Vai Asp 100 Ser Gly Leu 105 Tyr
CGA GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG ACC TTT TCA 986
Arg Vai Glu lie Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met Thr Phe Ser
110 115 120
TTG GAA GTT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA AGA CCC ACA 1034
Leu Glu Vai Lys Pro Glu He Pro Thr Ser Pro Pro Thr Arg Pro Thr
125 130 135 140 .,
ACT ACA AGA ccc ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA ACA AGA TCC 1082
Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr He Ser Thr Arg Ser
145 150 155
ACA CAT GTA CCA ACA TCA ACC AGA GTC TCC ACC TCT ACT CCA ACA CCA 1130
Thr His Vai Pro Thr Ser Thr Arg Vai Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro
160 165 170
GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC ~CT ACA TTT TAT GCC CAT 1178
Glu Gin Thr Gin Thr His Lys Pro Glu He Thr Thr phe Tyr Ala His
175 iao 185
GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT CCT GCA GAC 1226
Glu Thr Thr Ala Glu Vai Thr Glu Thr Pro Ser Tyr Thr Pro Ala Asp
190 195 200
TGG AAT GGC ACT GTG ACA TCC TCA GAG GAG GCC TGG AAT AAT CAC ACT 1274
Trp Asn Gly Thr Vai Thr Ser Ser Glu Glu Ala Trp Asn Asn His Thr
205 210 215 220
GTA AGA ATC CCT TTG AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT AAG GGC TTC 1322
Vai Arg lie Pro Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn Pro Thr Lys Gly Phe
225 230 235
TAT GTT GGC ATG TCC GTT GCA GCC CTG CTG ,CTG CTG CTG CTT GCG AGC 1370
Tyr Vai Gly Met Ser Vai Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser
240 245 250
ACC GTG GTT GTC Xcc AGG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAG ATG GGC TCT 1418
Thr Vai Vai Vai Thr Arg Tyr He He lie Arg Lys Lys Met Gly Ser
255 260 265
CTG AGC TTT GTT GCC TTC CAT GTC TCT AAG AGT AGA GCT TTG CAG AAC 1466
Leu Ser Phe Vai Ala Phe His Vai Ser Lys Ser Arg Ala Leu Gin Asn
270 275 280
GCA GCG ATT GTG CAT CCC CGA GCT GAA GAC AAC ATC TAC ATT ATT GAA 1514
Ala Ala He Vai His Pro Arg Ala Glu Asp Asn lie Tyr He He Glu
265 290 295 300
GAT AGA TCT CGA GGT GCA GAA TGAGTCCCAG AGGCCTTCTG TGGGGCCTTC Asp Arg Ser Arg Gly Ala Glu
305
1565
TGCCTGGGAT TACAGAGATC GTGACTGATT TCACAGAGTA AAATACCCAT TCCAGCTCCT 1625
GGGAGATTTT GTGTTTTGGT TCTTCCAGCT GCAGTGGAGA GGGTAACCCT CTACCCTGTA 1685
TATGCAAAAC TCGAGGTTAA CATCATCCTA ATTCTTGTAT CAGCAACACC TCAGTGTCTC 1745 i. ·. · ... S
CACTCACTGC AGCGATTCTC TCAAATGTGA ACATTTTAGA AGTTTGTGTT TCCTTTTGTC 1805
CATGTAATCA TTGGTAATAC AAGAATTTTA TCTTGTTTAT TAAAACCATT AATGAGAGGG 1865
GAATAGGAAT TAAAAGCTGG TGGGAAGGGC CTCCTGAATT TAGAAGCACT TCATGATTGT 1925
GTTTATCTCT TTTATTGTAA TTTGAAATGT TACTTCTATC CTTCCCAAGG GGCAAAATCA - 1985
TGGGAGCATG GAGGTTTTAA TTGCCCTCAT AGATAAGTAG AAGAAGAGAG TCTAATGCCA 2045
CCAATAGAGG TGGTTATGCT TTCTCACAGC TCTGGAAATA TGATCATTTA TTATGCAGTT 2105
GATCTTAGGA TGAGGATGGG TTTCTTAGGA GGAGAGGTTA CCATGGTGAG TGGACCAGGC 2165
ACACATCAGG GGAAGAAAAQ AATGGATCAA GGGATTGAGT TCATTAGAGC CAIi’TCCACT 2225
CCACTTCTGT CTTGATGCTC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG AATTAGGTGC 2285
AGGGAGGAGA CGTGCAGAAA CGAAAGAGGA AAGAAAGGAG AGAGAGCAGG ACACAGGCTT 2345
A ’ TCTGCTGAGA . GAAGTCCTAT TGCAGGTGTG ACAGTGTTTG GGACTACCAC GGGTTTCCTT 2405
CAGACTTCTA i AGTTTCTAAA TCACTATCAT GTGATCATAT. TTATTTTTAA AATTATTTCA 2465
GAAAGACACC ACATTTTCAA TAATAAATCA GTTTGTCACA ATTAATAAAA TATTTTGTTT 2525
GCTAAGAAGT AAAAAAAAAA AAAAAAAGTC GACGCGGCCG C 2566
(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:2:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2*084 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
I .
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 145..1065 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:2:
GCGGCCGCGT CGACGGTGCC TGTGAGTAAA TAGATCAGGG TCTCCTTCAC AGCACATTCT
0'1
CCAGGAAGCC GAGCAAACAT TAGTGCTATT TTACCCAGGA GGAAATCTAG GTGTAGAGAG 120
CTCTACGGAT CTAAGGTCAA CACC ATG GTT CAA CTT CAA GTC TTC ATT TCA 171
Met Vai Gin Leu Gin Vai Phe lie Ser
GGC CTC CTG CTG 1 CTT CTT CCA GGC TCT GTA Vai 5 GAT TCT TAT GAA GTA GTG Vai 25 219
Gly 10 Leu Leu Leu Leu Leu 15 Pro Gly Ser Asp Ser 20 Tyr Glu Vai
AAG GGG GTG GTG GGT CAC CCT GTC ACA ATT CCA TGT ACT TAC TCA ACA 267
Lys Gly Vai Vai Gly His Pro Vai Thr lie Pro Cys Thr Tyr Ser Thr
30 35 40 -
CGT GGA GGA ATC ACA ACG ACA TGT TQG GGC CGG GGG CAA TGC CCA TAT ' 315
Arg Gly Gly lie Thr Thr Thr Cys Trp Gly Arg Gly Gin Cys Pro Tyr
' ’ 45 50 55
TCT AGT TGT CAA AAT ATA CTT ATT TGG ACC AAT GGA TAC CAA GTC ACC 363
Ser Ser Cys Gin Asn He Leu lie Trp Thr Asn Gly Tyr Gin Vai Thr
60 65 70
TAT A CGG AGC AGC GGT CGA TAC AAC ATA AAG Ggg CGT ATT TCA GAA GGA 411
Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Asn lie Lys Gly Arg lie Ser Glu Gly
75 80 85
gAc GTA TCC TTG ACA ATA GAG AAC TCT GTT GAT AGT GAT AGT GGT CTG 459
ASP Vai Ser Leu Thr lie Glu Asn Ser Vai Asp Ser Asp Ser Gly Leu
90 95 100 105
tat TGT TGC CGA GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG 507
Tyr Cys Cys Arg Vai Glu lie Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met
J j 110 115 120
ACC TTT TCA TTG GAA GTT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA 555
Thr Phe Ser Leu Glu Vai Lys Pro Glu lie Pro Thr Ser Pro Pro Thr
1 1 125 130 135
AGA CCC ACA ACT ACA AGA CCC ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA 603
Arg Pro Thr Thr Thr Arg pro Thr Thr Thr 'Arg Pro Thr Thr lie Ser
140 145 150
ACA AGA TCC ACA ’CAT GTA CCA ACA TCA ACC AGA GTC TCC ACC TCT ACT 651
Thr Arg Ser Thr His Vai Pro Thr Ser Thr Arg Vai Ser Thr Ser Thr
155 160 165
CCA ACA CCA GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC ACT ACA TTT 699
Pro Thr Pro Glu Gin Thr Gin Thr His Lys Pro G1U He Thr Thr Phe
170 175 180 185
TAT GCC CAT GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT 747
Tyr Ala His Glu Thr Thr Ala Glu Vai Thr Glu Thr Pro Ser Tyr Thr
190 195 200
£2
CCT GCA Pro Ala GAC TGG AAT GGC ACT GTG АСА TCC TCA GAG GAG GCC TGG AAT 795
Asp Trp Asn Gly 205 Thr Vai Thr 210 Ser Ser Glu Glu Ala Trp Asn 215
AAT CAC ACT GTA AGA ATC CCT TTG AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT 843
Asn His Thr Vai Arg lie Pro Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn Pro Thr
220 225 230
AAG GGC TTC TAT GTT GGC ATG Tec GTT GCA GCC CTG CTG CTG CTG CTG 891
Lys Gly Phe Tyr Vai Gly Met Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu
2^35 24 0 245
CTT GCG AGC ACC GTG GTT GTC ACC AGG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAG 939
Leu Ala Ser Thr Vai Vai Vai Thr Arg Tyr He Ide lie Arg Lys Lys
250 Λ i . 1 255 260 265
Wst GGC Gly TCT Ser CTG Leu AGC Ser TTT Phe GTT val GCC Ala TTC Phe CAT His GTC Val TCT Ser AAG Lys AGT Ser AGA Arg GCT Ala 987
270 275 280
TTG I CAG AAC GCA GCG ATT GTG CAT CCC CG« GCT GAA GAC AAC ATC TAC 1035
Leu Gin Asn Ala Ala He Val His Pro Arg Ala Glu Asp Asn lie Tyr
285 290 295
ATT ATT GAA GAT AGA TCT CGA GGT GCA GAA TGAGTCCCAG AGGCCTTCTG 1085
He lie Glu Asp Arg Ser Arg Gly Ala G1U
300 305
TGGGGCCTTC TGCCTGGGAT TACAGAGATC GTGACTGATT TCACAGAGTA AAATACCCAT 1145
TCCAGCTCCT GGGAGATTTT GTGTTTTGGT TCTTCCAGCT GCAGTGGAGA GGGTAACCCT 1205
CTACCpTGTA TATGCAAAAC TCGAGGTTAA CATCATCCTA ATTCTTGTAT CAGCAACACC 1265
TCAGTGTCTC CACTCACTGC AGCGATTCTC TCAAATGTGA ACATTTTAGA agtttgtgtt 1325
TCCTTTTGTC CATGTAATCA TTGGTAATAC AAGAATTTTa” TCTTGTTTAT TAAAACCATT 1385
AATGAGAGGG GAATAGGAAT TAAAAGCTGG TGGGAAGGGC CTCCTGAATT TAGAAGCACT 1445
TCATGATTGT GTTTATCTCT TTTATTGTAA TTTGAAATGT TACTTCTATC CTTCCCAAGG 1505
GGCAAAATCA TGGGAGCATG GAGGTTTTAA TTGCCCTCAT AGATAAGTAG AAGAAGAGAG 1565
TCTAATGCCA CCAATAGAGG TGGTTATGCT TTCTCACAGC TCTGGAAATA TGATCATTTA 1625
TTATGCAGTT GATCTTAGGA TGAGGATGGG TTTCTTAGGA GGAGAGGTTA CCATGGTGAG 1685
TGGACCAGGC ACACATCAGG GGAAGAAAAC AATGGATCAA GGGATTGAGT TCATTAGAGC 1745
CATTTCCACT CCACTTCTGT CTTGATGCTC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG 1805
AATTAGGTGC AGGGAGGAGA CGTGCAGAAA CGAAAGAGGA AAGAAAGGAG AGAGAGCAGG 1865
ACACAGGCTT TCTGCTGAGA GAAGTCCTAT TGCAGGTGTG ACAGTGTTTG GGACTACCAC 1925
<5Ъ
GGGTTTCCTT
CAGACTTCTA
AGTTTCTAAA
TCACTATCAT GTGATCATAT TTATTTTTAA
1985
AATTATTTCA
GAAAGACACC
ACATTTTCAA
TAATAAATCA GTTTGTCACA ATTAATAAAA
2045
TATTTTGTTT
GCTAAGAAGT
AAAAAGTCGA
CGCGGCCGC
2084
(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:3:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 307 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (il) MOLECULE TYPE: protein
j (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :3:
Met 1 1 Vai Gin Leu Gin 5 Vai Phe He Ser Gly 10 Leu Leu Leu Leu Leu 15 Pro
Gly Ser Vai Asp 20 Ser Tyr Glu Vai Vai 25 Lys Gly Vai Vai Gly 30 His Pro
Vai Thr He 35 Pro Cys Thr Tyr Ser 40 Thr Arg Gly Gly lie 45 Thr Thr Thr
Cys Trp 50 Gly Arg Gly Gin Cys 55 Pro Tyr Ser Ser Cys 60 Gin Asn lie Leu
Ils 6'5 1 Trp Thr Asn Gly Tyr 70 Gin Vai Thr Tyr Arg 75 Ser Ser Gly Arg Tyr 80
Asn lie Lys Gly Arg 85 He Ser Glu Gly Asp 90 Vai Ser Leu Thr lie 95 Glu
Asn Ser Vai Asp 100 Ser Asp Ser Gly Leu 105 Tyr Cys Cys Arg Vai 110 Glu lie
Pro Gly Trp 115 Phe Asn Asp Gin Lys 120 Met Thr Λ Phe Λ Ser Leu 125 Glu Vai Lys
Pro Glu 130 lie Pro Thr Ser Pro 135 Pro Thr Arg Pro Thr 140 Thr Thr Arg Pro
Thr 145 Thr Thr Arg Pro Thr 150 Thr He Ser Thr Arg 155 Ser Thr His Val Pro 160
Thr Ser Thr Arg Vai 165 Ser Thr Ser Thr Pro 170 Thr Pro Glu Gin Thr 175 Gin
Thr His Lys Pro Glu He Thr Thr Phe Tyr Ala His Glu Thr Thr Ala
180 185 190
Glu Vai Thr Glu Thr 195 Pro Ser Tyr 200 Thr Pro Ala Asp Trp 205 Asn Gly Thr
Vai Thr Ser Ser Glu Glu Ala Trp Asn Asn His Thr Val Arg He Pro
210 215 220
Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn Pro Thr Lys Gly Phe Tyr Val Gly Met
ϊ 225 230 235 240
Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Thr Val Val Val.
245 250 255
Thr Arg Tyr He lie He Arg Lys Lys Met Gly Ser Leu Ser Phe Val
i 260 265 270
Ala Phe His Val Ser Lys Ser Arg Ala Leu Gin Asn Ala Ala He Val
275 280 285
His Pro 1 Arg Ala Glu Asp Asn lie Tyr He He Glu Asp Arg Ser Arg
290 295 300
Gly Ala Glu
305 (2) Information for seq id no:4:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2303 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear · (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix)
CDS
FEATURE:
(A) NAME/KEY:
(B) LOCATION:*107..1822
GCGGCCGCGT CGACTCGCAG GAGGCCGGCA CTCTGACTCC TGGTGGATGG GACTAGGGAG
TCAGAGTCAA GCCCTGACTG GCTGAGGGCG GGCGCTCCGA GTCAGC ATG GAA AGT 115
Met Glu Ser
CTC TGC GGG GTC CTG GTA TTT CTG CTG CTG GCT GCA GGA CTG CCG CTC
Leu Cys Gly Val Leu Val Phe Leu Leu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Leu
5 10 15
CAG GCG GCC AAG CGG TTC CGTGAT GTG CTG GGC CAT GAG CAG TAT CCG
Gin Ala Ala Lys Arg Phe Arg Asp Val Leu Gly His Glu Gin Tyr Pro
20 25 30 35
211
GAT CAC Asp His ATG AGG Met Arg GAG AAC AAC CAA TTA CGT GGC TGG TCT TCA GAT GAA Glu 259
Glu 40 Asn Asn Gin Leu Arg 45 Gly Trp Ser Ser Asp 50
AAT GAA TGG GAT GAA CAG CTG TAT CCA GTG TGG AGG AGG GGA GAG GGC 307
Asn Glu Trp Asp Glu Gin Leu Tyr Pro Vai Trp Arg Arg Gly Glu Gly
55 60 65
AGA TGG AAG GAC TCC TGG GAA GGA GGC CGT GTG CAG GCA GCC CTA ACC 355
Arg Trp Lys Asp Ser Trp Glu Gly Gly Arg Vai Gin Ala Ala Leu Thr
70 75 80
AGT GAT TCA CCG GCC TTG GTG GGT TCC AAT ATC ACC TTC GTA GTG AAC , 403
Ser Asp Ser Pro Ala Leu Vai Gly Ser Asn Ile Thr Phe Vai Vai Asn
85 90 95
CTG GTG TTC CCC AGA TGC CAG AAG GAA GAT GCC AAC GGC AAT ATC GTC 451
Leu Vai Phe Pro Arg Cys Gin Lys Glu Asp Ala Asn Gly Asn lie Vai
100 105 110 115
TAT GAG AGG AAC TGC AGA AGT GAT TTG GAG CTG GCT TCT GAC CCG TAT 499
Tyr Glu Arg Asn Cys Arg Ser Asp Leu Glu Leu Ala Ser Asp Pro Tyr ->*
120 125 130
GTC TAC AAC TGG ACC ACA GGG GCA GAC GAT GAG· GAC TGG GAA GAC AGC 547'
Vai Tyr Asn Trp Thr Thr Gly Ala Asp Asp Glu Asp Trp Glu Asp Ser
135 140 145
ACC AGC CAA GGC CAG CAC CTC AGG TTC CCC GAC GGG AAG CCC TTC CCT 595
Thr Ser Gin Gly Gin His Leu Arg Phe Pro Asp Gly Lys Pro Phe Pro
150 155 160
CGC CCC CAC GGA CGG AAG AAA TGG AAC TTC GTC TAC GTC TTC CAC ACA 643
Arg Pro His Gly Arg Lys Lys Trp Asn Phe Vai Tyr Vai Phe His Thr
165 170 175
CTT GGT CAG TAT TTT CAA AAG CTG GGT CGG TGT TCA GCA CGA GTT TCT 691
Leu Gly Gin Tyr Phe Gin Lys Leu Gly Arg .Cys Ser Ala Arg Vai Ser
180 185 190 195
ATA AAC ACA GTC ДАС TTG ACA GTT GGC CCT CAG GTC ATG GAA GTG ATT 739
lie Asn Thr Vai Asn Leu Thr Vai Gly Pro Gin Vai Met Glu Vai Ile
' 200 205 210
GTC TTT CGA AGA CAC GGC CGG GCA TAC ATT CCC ATC TCC AAA GTG AAA 787
vai Phe Arg Arg His Gly Arg Ala Tyr Ile Pro Ile Ser Lys Vai Lys
215 220 225
GAC GTG TAT GTG ATA ACA GAT CAG ATC CCT ATA TTC GTG ACC ATG TAC 835
Asp Vai Tyr Vai Ile Thr Asp Gin Ile Pro Ile Phe Vai Thr Met Tyr
230 235 240
CAG AAG AAT GAC CGG AAC TCG TCT GAT GAA ACC TTC CTC AGA GAC CTC 883
Gin Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu Arg Asp Leu
245 250 255
.1
CCC ATT TTC TTC GAT GTC CTC ATT CAC GAT CCC AGT CAT His TTC CTC AAC Asn 275
Pro 260 lie Phe Phe Asp Val 265 Leu lie His Asp Pro 270 Ser Phe Leu
TAC TCT GCC ATT TCC TAC AAG TGG AAC TTT GGG GAC AAC ACT GGC CTG
Tyr Ser Ala lie Ser Tyr Lys Trp Asn Phe Gly Asp Asn Thr Gly Leu
280 285 290
TTT GTC TCC AAC AAT CAC ACT TTG AAT CAC ACG TAT GTG CTC AAT GGA
Phe Val Ser Asn Asn His Thr Leu Asn His Thr Tyr Val Leu Asn Gly
295 300 305
ACC TTC AAC TTT AAC CTC ACC GTG CAA ACT GCA GTG CCG GGA CCA TGC
Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val Gin Thr Ala Val Pro Gly Pro Cys
310 315 320
CCC TCA CCC ACA CCT TCG CCT TCT TCT TCG ACT TCT CCT TCG CCT GCA
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser Pro Ala
325 330 335
TCT TCG CCT TCA CCC ACA TTA TCA ACA CCT AGT CCC TCT TTA ATG CCT
Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro Ser Leu Met Pro
340 345 350 355
ACT GGC CAC AAA TCC ATG GAG CTG AGT GAC ATT TCC AAT GAA AAC TGC
Thr Gly His Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp lie Ser Asn Glu Asn Cys
360 365 370
CGA ATA AAC AGA TAT GGT TAC TTC AGA GCC ACC ATC ACA ATT GTA GAT
Arg Xie Asn Arg Tyr Gly Tyr· Phe Arg Ala Thr lie Thr lie Val Asp
375 380 385
GGA !atc CTA GAA GTC AAC ATC ATC CAG GTA GCA GAT GTC CCA ATC CCC
Gly lie Leu Glu Val Asn He . He Gin Val Ala Asp Val Pro He Pro
390 395 400
ACA CCG CAG CCT GAC AAC -TCA CTG ATG GAC TTC ATT GTG ACC TGC AAA
Thr Pro Gin Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe He Val Thr Cys Lys
405 410 * · 415
GGG GCC ACT CCC ACG GAA GCC TGT ACG ATC ATC TCT GAC CCC ACC TGC
Gly Ala Thr Pro Thr Glu Ala Cys Thr lie He Ser Asp Pro Thr Cys
420 425 430 435
CAG ATC GCC CAG AAC AGG GTG TGC AGC CCG GTG GCT GTG GAT GAG CTG
Gin He Ala Gin Asn Arg Val Cys Ser Pro Val Ala Val Asp Glu Leu
440 - 445 450
TGC CTC CTG TCC GTG AGG AGA GCC TTC AAT GGG TCC GGC ACG TAC TGT
Cys Leu Leu Ser Val Arg Arg Ala Phe Asn Gly Ser Gly Thr Tyr Cys
455 460 465
GTG AAT TTC ACT CTG GGA GAC GAT GCA AGC CTG GCC CTC ACC AGC GCC
Vai Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Ala Ser Leu Ala Leu Thr Ser Ala
480
470
475
931 . 979
1027
1075
1123
1171
1219
1267
1315
1363
1411
1459
1507
1555
ΖΊ-
CTG ATC TCT Ser ATC CCT GGC Gly AAA GAC CTA GGC TCC CCT CTG AGA ACA GTG 1603
Leu He 485 He Pro Lys 490 Asp Leu Gly Ser Pro Leu Arg Thr Vai 495
AAT GGT GTC CTG ATC TCC ATT GGC TGC CTG GCC ATG TTT GTC ACC ATG 1651
Asn Gly Vai Leu He Ser He Gly Cys Leu Ala Met Phe Vai Thr Met .
500 505 510 515
GTT ACC ATC TTG CTG TAC AAA AAA CAC AAG ACG TAC AAG CCA ATA GGA 1699
Vai Thr lie Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Thr Tyr Lys Pro He Gly
520 525 530
AAC TGC ACC AGG AAC GTG GTC AAG GGC AAA GGC CTG AGT GTT TTT CTC · 1747
Asn Cys Thr Arg Asn Vai Vai Lys Gly Lys Gly Leu Ser Vai Phe Leu
535 540 545
AGC CAT GCA AAA GCC CCG TTC TCC CGA GGA GAC CGG GAG AAG GAT CCA 1795
Ser His Ala Lys Ala Pro Phe Ser Arg Gly Asp Arg Glu Lys Asp Pro
550 555 560
CTG CTC CAG GAC AAG CCA TGG ATG CTC TAAGTCTTCA ' CTCTCACTTC 1842
Leu Leu Gin Asp Lys Pro Trp Met Leu
565 570
TGACTGGGAA CCCACTCTTC GCTGTTGTTT TCTACGGATT TGGCATTTTA GTGAAGGGAT TAlCTGTTAAT AGGGTGGGCA AGGTCCTAGG TTAACTGGGA CCTGAACCCA GCTAGTCCTG GAACATACCT GAGCACCTGA GTGTACATAA GATACTCATT
TGTGCATGTA TGTGAGCTGT attgtaaAat GTATATCATG GGGAAGACAG TATTTCTTCA CATTGTGTCT GAAGGGGGAG GAGGATGCCC CAGGCTCCTT ACCTAAAGGC CATGCTTCAT TGGAATTATA ATGGAACCAA AAAAAGACAG ТСТАТТДААА
GCAGAAGTAC ATGACTGGTA GTTTAGGGAG CGTAGTTAAT CATCTGTATT GTGGTTTTTA GGGGAGGTCA CTGCTACTTA AGATTTCTAC ACAAGATGTG CAACTCTATC TCAGCTCATT GCTTGTTGTA TGGTGTGTGT A
1902
1962
2022
2082
2142
2202
2262
2303 (2) INFORMATION, FOR SEQ ID N0:5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 572 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein‘ . (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:5: \
Met Glu Ser Leu Cys Gly Vai Leu Vai Phe Leu Leu Leu Ala Ala Gly 15 1015
Leu Pro Leu Gin Ala Ala Lys 20 Arg Phe 25 Arg Asp Vai Leu Gly 30 His Glu
Gin Tyr Pro 35 Asp His Met Arg Glu 40 Asn Asn Gin Leu Arg 45 Gly Trp Ser
Ser Asp 50 Glu Asn Glu Trp Asp 55 Glu Gin Leu Tyr Pro 60 Vai Trp Arg Arg
Gly 65 Glu Gly Arg Trp Lys 70 Asp Ser Trp Glu Gly 75 Gly Arg Vai Gin Ala 80
Ala Leu Thr Ser Asp 85 Ser Pro Ala Leu Vai 90 Gly Ser Asn lie Thr 95 Phe
G Vai Vai Asn Leu 100 Vai Phe Pro Arg Cys 105 Gin Lys Glu Asp Ala 110 Asn Gly
Asn He Vai 115 Tyr Glu Arg Asn Cys 120 Arg Ser Asp Leu Glu 125 Leu Ala Ser
Asp Pro 130 Tyr Vai Tyr Asn Trp 135 Thr Thr Gly Ala Asp 140 Asp Glu Asp Trp
Glu 145 Asp Ser Thr Ser Gin 150 Gly Gin His Leu Arg 155 Phe Pro Asp Gly Lys 160
Pro Phe Pro Arg Pro 165 His Gly Arg Lys Lys 170 Trp Asn Phe Vai Tyr 175 Vai
Phe His Thr Leu 180 Gly Gin Tyr Phe Gin 185 Lys Leu Gly Arg Cys 190 Ser Ala
Arg Vai Ser 195 He Asn Thr Vai Asn 200 Leu Thr Vai Gly Pro 205 Gin Vai Met
• Glu Vai 210 lie Vai Phe Arg Arg 215 His Gly Arg Alar Tyr 220 He Pro He Ser
Lys 225 Vai Lys Asp Vai- Tyr 230 Vai He Thr Asp Gin 235 lie Pro He Phe Vai 240
Thr Met Tyr Gin Lys 245 Asn Asp Arg Asn Ser 250 Ser Asp Glu Thr Phe 255 Leu
Arg Asp Leu Pro 260 He Phe Phe Asp Vai 265 Leu He His Asp Pro 270 Ser His
Phe Leu Asn 275 Tyr Ser Ala He Ser 280 Tyr Lys Trp Asn Phe 285 Gly Asp Asn
Thr Gly 290 Leu Phe Vai Ser Asn 295 Asn His Thr Leu Asn 300 His Thr Tyr Vai
(ο 9
Leu Asn Gly Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val Gin Thr Ala Val Pro
305 310 315 320
Gly Pro cys Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro
325 330 335
Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro Ser
340 345 350
Leu Met Pro Thr Gly His Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp lie Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Cys Arg He Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Ala Thr lie Thr
370 375 3Θ0
lie Vai Asp Gly He Leu Glu Val Asn lie lie Gin Val Ala Asp Val
385 390 395 400
Pro He Pro Thr Pro Gin Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe lie Val
405 410 415
Thr Cys Lys Gly Ala Thr Pro Thr Glu Ala Cys Thr He He Ser Asp
420 425 430
Pro Thr Cys Gin lie Ala Gin Asn Arg Val Cys Ser Pro Val Ala Val
435 440 445
Asp Glu Leu Cys Leu Leu Ser Val Arg Arg Ala Phe Asn Gly Ser Gly
450 455 460
Thr Tyr Cys Vai Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Ala Ser Leu Ala Leu
465 470 1 475 480
Thr Ser Ala Leu He Ser. He Pro Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro Leu
485 490 495
Arg Thr Vai Asn Gly Val Leu He Ser lie Gly Cys Leu Ala Met Phe
500 505 510
Vai Thr Met Vai Thr He Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Thr Tyr Lys
515 520 525
Pro lie Gly Asn Cys Thr Arg Asn Val Val Lys Gly Lys Gly Leu Ser
530 535 540
Vai Phe Leu Ser His Ala Lys Ala Pro Phe Ser Arg Gly Asp Arg Glu
545 550 555 560
Lys Asp Pro Leu Leu Gin Asp Lys Pro Trp Met Leu
565
570 (2). INFORMATION
FOR
SEQ
ID N0:6 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
‘(A) LENGTH: 1795 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 278..1279 (Xi)
SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:6:
GCGGCCGCGT CGACGAAGCT GGGAAGTCAG GGGCTGTTTC TGTGGGCAGC TTTCCCTGTC 60
|CTTTGGAAGG CACAGAGCTC tcagctgcag GGAACTAACA GAGCTCTGAA GCCGTTATAT 120
gtggt'cttct CTCATTTCCA GCAGAGCAGG CTCATATGAA TCAACCAACT GGGTGAAAAG 180
ATAAGTTGCA ATCTGAGATT TAAGACTTGA TCAGATACCA TCTGGTGGAG GGTACCAACC 240
AGCCTGTCTG CTCATTTTCC TTCAGGCTGA TCCCATA ATG CAT CCT CAA GTG GTC 295
Met His Pro Gin Vai Vai 5 .
ATC TTA AGC CTC ATC CTA CAT CTG GCA GAT TCT GTA GCT GGT TCT GTA 343
lie Leu Ser Leu 10 He Leu His Leu Ala 15 Asp Ser Vai Ala Gly 20 Ser Vai
AAG GTT GGT GGA GAG GCA GGT CCA TCT GTC ACA CTA CCC TGC CAC TAC 391
Lys Vai Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Vai Thr Leu Pro Cys His Tyr
25 30 35
AGT GGA GCT GTC ACA TCA ATG TGC TGG AAT AGA GGC TCA TGT TCT CTA 439
Ser Gly Ala Vai Thr Ser Met Cys Trp Asn Arg Gly Ser Cys Ser Leu
40 . 45 50
TTC ACA TGC CAA AAT GGC ATT GTC TGG ACC AAT GGA ACC CAC GTC ACC 487
Phe Thr Cys Gin. Asn' Gly He Vai Trp Thr Asn Gly Thr His Vai Thr
55 60 65 70
TAT CGG AAG GAC ACA CGC TAT AAG CTA TTG GGG GAC CTT TCA AGA AGG 535
Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Asp Leu Ser Arg Arg
75 80 85
GAT GTC TCT TTG ACC ATA GAA AAT ACA GCT GTG TCT GAC AGT GGC GTA 583
Asp Vai Ser Leu Thr lie Glu Asn Thr Ala Vai Ser Asp Ser Gly Vai
90 95 100
TAT TGT TGC CGT GTT GAG CAC CGT GGG TGG TTC AAT GAC ATG AAA ATC 631
Tyr Cys Cys Arg Vai Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met Lys He
115
105
110
679
ΎΊ
ACC GTA TCA TTG GAG ATT GTG CCA CCC AAG GTC ACG ACT ACT CCA ATT
Thr Vai Ser Leu Glu lie Vai Pro Pro Lys Vai Thr Thr Thr Pro He
120 125 130
GTC ACA ACT GTT CCA ACC GTC ACG ACT GTT CGA ACG AGC ACC ACT GTT
Vai Thr Thr Vai Pro Thr Vai Thr Thr Vai Arg Thr Ser Thr Thr Vai
135 140 145 150
CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCA ACG ACA ACT GTT CCA ACA ACA ATG AGC
Pro Thr Thr Thr Thr Vai Pro Thr Thr Thr Vai Pro Thr Thr Met Ser
155 160 165
ATT CCA ACG ACA ACG ACT GTT' CCG ACG ACA ATG ACT GTT TCA ACG ACA
He Pro Thr Thr Thr Thr Vai' Pro Thr Thr Met Thr Vai Ser Thr Thr
] 170 175 180
ACG AGC .GTT CCA ACG ACA ACG AGC ATT CCA ACA ACA ACA AGT GTT CCA
Thr Ser Vai Pro Thr Thr Thr Ser He Pro Thr Thr Thr Ser Vai Pro
185 190 195
GTG ACA ACA ACG GTC ТСГ ACC TTT GTT CCT CCA ATG CCT TTG CCC AGG
Vai Thr Thr Thr Vai Ser Thr Phe Vai Pro Pro Met Pro Leu Pro Arg
200 205 210
CAG AAC CAT GAA CCA GTA GCC ACT TCA CCA TCT TCA CCT CAG CCA GCA
Gin Asn His Glu Pro Vai Ala Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gin Pro Ala
215 220 225 230
GAA ACC CAC CCT ACG ACA CTG CAG GGA GCA ATA AGG AGA GAA CCC ACC
Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gin Gly Ala He Arg Arg Glu Pro Thr
I 235 240 245
1 AGC TCA CCA TTG TAC TCT TAC ACA ACA GAT GGG AAT GAC ACC GTG ACA
Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr Vai Thr
250 255 260
GAG TCT TCA GAT GGC CTT TGG AAT AAC AAT .CAA ACT CAA CTG TTC CTA
Glu Ser Ser Asp Gly Leif Trp Asn Asn Asn Gin Thr Gin Leu Phe Leu
265 - 270 J 275
GAA CAT AGT CTA CT.G ACG GCC AAT ACC ACT AAA GGA ATC TAT GCT GGA
Glu His Ser Leu Leu .Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly lie Tyr Ala Gly
280 285 290
GTC TGT ATT TCT GTC TTG GTG CTT CTT GCT CTT TTG GGT GTC ATC ATT
Vai Cys He Ser Vai Leu Vai Leu Leu Ala Leu Leu Gly Vai He He
295 300 305 310
GCC AAA AAG TAT TTC TTC AAA AAG GAG GTT CAA CAA CTA AGA CCC CAT
Ala Lys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Vai Gin Gin Leu Arg Pro His
325
320
315
727
775
823
871
919
967
1015
1063
1111
1159
1207
1255
AAA Lys
TCC
Ser
TGT Cys
ATA lie 330
CAT His
CAA Gin
AGA Arg
GAA Glu
TAGTCCCTGG AAACATAGCA AATGAACTTC
1309
TATCTTGGCC ATCACAGCTG TCCAGAAGAG GGGAATCTGT CTTAAAAACC AGCAAATCCA 1369
ACGTGAGACT TCATTTGGAA GCATTGTATG ATTATCTCTT GTTTCTATGT TATACTTCCA 1429
AATGTTGCAT TTCCTATGTT TTCCAAAGGT TTCAAATCGT GGGTTTTTAT TTCCTCCGTG 14S9
GGGAAACAAA GTGAGTCTAA CTCACAGGTT TAGCTGTTTT CTCATAACTC TGGAAATGTG 1549
ATGCATTAAG TACTGGATCT CTGAATTGGG GTAGCTGTTT TACCAGTTAA AGAGCCTACA 1609
ATAGTATGGA ACACATAGAC ACCAGGGGAA GAAAATCATT TGCCAGGTGA TTTAACATAT . 1669
TTATGCAATT TTTTTTTTTT TTTTTGAGAT GGAGCTTTGC TCTTGTTGCC CAGGCTGGAG 1729
TGCGATGGTG AAATCTCGGC TCACTGTAAC CTCCACCTTC CGGGTTCAAG CAATTCTCCC 1789
kGTCGAC 1795
(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:7:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 334 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
Hii) MOLECULE TYPE: protein (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:7:
Met 1 His Pro Gin Vai 5 Val He Leu Ser Leu 10 lie Leu His Leu Ala 15 Asp
Ser Vai Ala Gly 20 Ser Val Lys Val Gly Gly 25 Glu Ala Gly Pro 30 Ser Val
Thr Leu Pro 35 Cys His Tyr Ser Gly 40 Ala Val Thr, Ser Met 45 Cys Trp Asn
Arg Gly 50 Ser Cys Ser Leu Phe 55 Thr Cys Gin Asn Gly 60 lie Val Trp Thr
Asn 65 Gly Thr His val Thr 70 Tyr Arg Lys Asp Thr 75 Arg Tyr Lys Leu Leu 80
Gly Asp Leu Ser Arg 85 Arg Asp Val Ser Leu 90 Thr He Glu Asn Thr 95 Ala
Vai Ser Asp Ser 100 Gly Val Tyr Cys Cys 105 Arg Val Glu His Arg 110 Gly Trp
Phe Asn Asp 115 Met Lys lie Thr Val 120 Ser Leu Glu He Val 125 Pro Pro Lys
Vai Thr 130 Thr Thr Pro lie Vai 135 Thr Thr Vai Pro Thr 140 Vai Thr Thr Val
Arg Thr Ser Thr Thr Vai Pro Thr Thr Thr Thr Vai Pro Thr Thr Thr
145. 150 155 160
Vai Pro Thr Thr Met Ser He Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr
165 170 175
Met Thr Vai Ser Thr Thr Thr Ser Vai Pro Thr Thr Thr Ser He Pro
1Θ0 185 190
Thr Thr Thr Ser Vai Pro Vai Thr Thr Thr Vai Ser Thr Phe Val Pro
195 200 205
Pro Met Pro Leu Pro Arg Gin Asn His Glu Pro Vai Ala Thr Ser Pro
210 215 220
Ser Ser Pro Gin Pro Ala Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gin Gly Ala
225 I 230 235 240
He Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp
245 250 255
Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser
260 265
Gin Thr Gin Leu Phe Leu Glu His Ser
275 28p
Lys Gly He Tyr Ala Gly Val Cys He
290 295
Leu Leu Gly Val He He Ala Lys Lys
305 310
Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn
270
Leu Leu Thr Ala Asn Thr Thr · ’· * '
285 · .-1 ir ЖЖ
Ser Vai Leu Vai Leu Leu Ala
300
Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Vai
315 320
Gin Gin Leu Arg Pro His Lys Ser Cys
325
Ile-His Gin Arg Glu

Claims (42)

  1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
    1. Пречистена и изолирана ДНК кодираща молекула от наранен бъбрек (ΚΙΜ), като тази ΚΙΜ е клетъчно повърхностен антиген селективно експресиран в постизехемична бъбречна тъкан на бозайници, като ДНК кодира :
    а) KIM (ΚΙΜ-l) полипептид от 307 аминокиселини, притежаващ един IgG домен, муцинов домен, трансмембранен домен и цитоплазматичн домен, като IgG домена включва шест консервативни цистеина; или
    б) KIM полипептид от 572 аминокиселини, притежаващ трансмембранен домен.
  2. 2. ДНК, съгласно претенция 1(a), характеризираща се е това, че кодира полипептид кодиран от инсерта на клон 3-2 (АТСС No. 98061), инсерта на клон 1-7 (ATCC No. 98060), или инсерта на клон Н13-10-85.
  3. 3. ДНК, съгласно претенция 1(6), характеризираща се с това, че кодира полипептид кодиран от инсерта на клон 4-7 (АТСС No. 98062).
  4. 4. ДНК, съгласно претенция 1(a), характеризираща се с това, че притежава нуклеотидна последователност избрана измежду:
    а) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 u SEQ ID NO: 6; или
    б) слепени варианти на SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 u SEQ ID NO: 6; или
    в) разпадни варианти на SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2 u SEQ ID NO: 6.
  5. 5. ДНК, притежаващка последователност комплементарна на SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 u SEQ ID NO: 6.
  6. 6. ДНК съгласно претенция 1 (б), характеризираща се с това, че притежава нуклеотидна последователност избрана измежду :
    • a) SEQ ID NO: 4; или
    б) слепен вариант на SEQ ID NO: 4; или
    в) разпаден вариант на SEQ ID NO: 4.
    Ί. ДНК притежаваща последователност комплементарна на SEQ ID NO: 4.
  7. 8. Пречистена и изолирана ДНК кодираща KIM-1 полипептид от 307 аминокиселини, притежаващ IgG домен, муцинов домен, трансмембранен домен и цитоплазматичн домен, като последователността на полипептида се избира измежду SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7; или измежду аминокиселишю заместени варианти притежаващи най-малко 40% хомоложност с, и делящи най-малко 80% от цистсиновитс остатъци на SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7.
  8. 9. Пречистена и изолирана ДНК кодираща разтворим вариант на KIM-Ι полипептид от 307 аминокиселини, притежаващ IgG домен, муцинов домен, трансмембранен домен и цитоплазматичн домен, като последователността на noAunenmuga се избира измежду SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7; или измежду аминокиселшшо заместени варианти притежаващи най-малко 40% хомоложност с, и делящи наймалко 80% от цистеиновите остатъци на SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7.
  9. 10. Пречистена и изолирана ДНК кодираща слят протеин съдържащ:
    а) KIM-1 полипептид от 307 аминокиселини, притежаващ един IgG домен, муцинов домен, трансмембранен домен и цитоплазматичн домен, като последователността на посочения полипептид се избира измежду SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7; или измежду аминокиселшшо заместени варианти притежаващи най-малко 40% хомоложност с, и делящи наймалко 80% от цистеиновите остатъци на SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7; и
    б) имуноглобулин, токсин или изобразимо съединение.
  10. 11. Пречистена и изолирана ДНК кодираща KIM полипептид от 572 аминокиселини, притежаваща трансмембранен домен, като последователността на посочения полипептид се избира измежду SEQ ID NO: 5 и измежду аминокиселишю заместени варианти притежаващи най-малко 40% хомоложност с, и делящи най-малко 80% от цистеиновите остатъци на SEQ ID NO: 5.
  11. 12. Пречистена и изолирана ДНК кодираща разтворим вариант на KIM полипептид от 572 аминокиселини, притежаваща трансмембранен домен, като последователността на посочения полипептид се избира измежду SEQ ID NO: 5 и аминокиселинно заместени варианти притежаващи най-малко 40% хомоложност с, и делящи наймалко 80% от цистеиновите остатъци на SEQ ID NO: 5.
  12. 13. Пречистена и изолирана ДНК кодираща слят протеин съдържаща:
    а) К1М полипептид от 572 аминокиселини, притежаващ трансмембранен домен като последователността на посочения полипептид се избира измежду SEQ ID NO: 5 и аминокиселинно заместени варианти притежаващи най-малко 40% хомоложност с, и делящи най-малко 80% от цистеиновите остатъци на SEQ ID NO: 5; и
    б) имуноглобулин, токсин или изобразимо съединение.
  13. 14. Вектор, притежаващ нуклеотидна последователност съгласно претенции 8, 9, 10, 11, 12 или 13, присъстващ като инсерт, като векторът при необходимост може да включва контролна екепресионна последователност операционно свързана с посочения инсерт.
  14. 15. Клетка гостоприемник включваща вектора, съгласно претенция 14.
  15. 16. Метод за продуциране на полипаптид характеризиращ се с това, че включва етапите на култивиране на клетка гостоприемник, съгласно претенция 15, в среда за тъканни
    ГВД ΗιΗίίΓΜίιητΐ > wi.ou.ift ,R.v marrn..,;
    култури и получаване на KIM полипептид експресиран от векторния инсерт в посочената клетка гостоприемник.
  16. 17. Пречистен и изолиран KIM протеин съдържащ :
    а) KIM-1 полипептид от 307 аминокиселини, притежаващ един IgG домен, муцинов домен, трансмембранен домен и цитоплазматичн домен, като последователността на посочения полипептид се избира измежду SEQ ID NO: 3 и SEO ID NO: 7; или
    б) KIM-1 полипептид от 307 аминокиселини, притежаващ един IgG домен, муцинов домен, трансмембранен домен и цитоплазматичн домен, като последователността на посочения полипептид се избира измежду аминокиселинно заместени варианти притежаващи най-малко 40% хомоложност е, и делящи най-малко 80% от цистешювите остатъци на SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7; или,
    в) KIM полипептид от 572 аминокиселини, притежаващ трансмембранен домен като последователността на посочения полипептид е SEQ ID NO: 5; или,
    г) KIM полипептид от 572 аминокиселини, притежаващ трансмембранен домен като последователността на посочения полипептид се избира измежду аминокиселинно заместени варианти притежаващи най-малко 40% хомоложност е, и делящи най-малко 80% от цистеиновите остатъци на SEQ ID NO: 5.
  17. 18. Разтворим вариант на KIM протеин съгласно претенция 17.
  18. 19. Слят протеин включващ KIM протеин от претенция 17; и имуноглобулин, токсин или изобразимо съединение.
  19. 20. KIM протеин съгласно претенция 17, характеризиращ се е това, че е конюгиран е имуноглобулин, токсин, изобразимо съединение, или радионуклеотид.
  20. 21. Антитяло, което специфично се свързва към К1М протеина от претенция 17.
  21. 22. Антитяло, съгласно претенция 21, характеризиращо се е това, че е конюгорано е токсин, изобразимо съединение или радионуклеотид.
  22. 23. Хибрид ома продуцираща антитялото от претенция 21.
  23. 24. Използуване на вектора от претенция 14 в терапията.
  24. 25. Използуване на К1М протеина от претенция 17 в терапията.
  25. 26. Използуване на разтворим вариант на KIM протеина от претенция 18 в терапията.
  26. 27. Използуване на KIM слят протеин от претенция 19 в терапията.
    .,х
  27. 28. Използуване на KIM конюгат от претенция 20 в терапията.
  28. 29. Използуване на антитяло от претенция 21 в терапията.
  29. 30. Използуване на конюгирано антитяло от претенция 22 в терапията.
  30. 31. фармацевтичен състав, характеризираш, се с това, че включва физологично приемлив носител, в които е диспергиран вектор съгласно претенция 14, при терапевтично ефективна канцентрация.
  31. 32. фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва физологично приемлив носител, в който е диспергиран при терапевтично ефективна канцентрация, KIM протеин от претенция 17, разтворим вариант на KIM протеин от претенция 18, KIM слят протеин от претенция 19, или KIM конюгат от претенция 20.
  32. 33. фармацевтичен състав, характеризираш, се с това, че включва физологично приемлив носител, в който е диспергирано при терапевтично ефективна канцентрация, антитяло от претенция 21 или конюгат на антитялото от претенция 22.
  33. 34. Метод за оценяване присъствието или причината за разлагането на бъбречното увреждане характеризираш, се е това, че вклюючва етапите на измерване концентрацията на
    KIM нуклеиновата киселина от претенция 8 или 11, или на KIM полипептида от претенция 17, в урината, серума, или в утайката на урината на субект страдаш, от, или рискуващ бъбречно уВреждане или заболяване.
  34. 35. Метод за изобразяване на клетки или тъкани продуциращи KIM полипептид от претенция 17.
  35. 36. Метод, съгласно претенция 35, характеризиращ се е това, че клетките или тъканите се поставят в субекта in vivo и изобразимия конюгат се прилага върху субекта.
  36. 37. Метод за насочване на токсин, радионуклеотид или изобразимо съединени към клетки, продуциращи KIM полипептид от претенция 17, характеризиращ се е това, че включва етапа на довеждането на клетките в контакт с KIM конюгираното антитяло от претенция 22.
  37. 38. Метод, съгласно претенция 37, характеризиращ се е това, че клетките са К1М-експресиращи туморни клетки, които се поставят in vivo в субекта, и конюгатът се прилага върху субекта.
  38. 39. Метод за третиране на субект страдащ от или рискуващ развитие на бъбречно заболяване, характеризиращ се с това, че включва етапа на прилагане върху субект на фармацевтичен състав от претенция 31, 32 или 33.
  39. 40. Метод за спомагаме на тъканния растеж В субект, характеризиращ се е това, че Включва етапа на прилагане на върху субект на фармацевтичен състав съгласно претенция 31, 32 или 33.
  40. 41. Метод за спомагане преживяването на пострадалата тъкан на субект, характеризиращ ее е това, че включва етапа на прилагане върху субект на фармацевтичен състав от претенция 31, 32 или 33.
  41. 42. Метод, съгласно претенция 40 или 41, характеризиращ се с това, че т ъканта е бъбречна тъкан.
  42. 43. Метод, съгласно претенция 34, 36, 38, 39, 40 или 41, характеризиращ се е това, че субектът е човек.
BG102967A 1996-05-24 1998-11-30 Модулатори на тъканна регенерация BG64678B1 (bg)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1822896P 1996-05-24 1996-05-24
US2344296P 1996-08-23 1996-08-23
PCT/US1997/009303 WO1997044460A1 (en) 1996-05-24 1997-05-23 Modulators of tissue regeneration

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG102967A true BG102967A (bg) 2000-05-31
BG64678B1 BG64678B1 (bg) 2005-11-30

Family

ID=26690881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG102967A BG64678B1 (bg) 1996-05-24 1998-11-30 Модулатори на тъканна регенерация

Country Status (27)

Country Link
US (4) US6664385B1 (bg)
EP (2) EP1655367A1 (bg)
JP (3) JP4602482B2 (bg)
CN (1) CN1147584C (bg)
AT (1) ATE318903T1 (bg)
AU (1) AU712289B2 (bg)
BG (1) BG64678B1 (bg)
BR (1) BR9709115A (bg)
CA (1) CA2257851C (bg)
CZ (1) CZ295936B6 (bg)
DE (1) DE69735364T3 (bg)
DK (1) DK0907735T5 (bg)
EA (1) EA004402B1 (bg)
EE (1) EE04817B1 (bg)
ES (1) ES2258793T5 (bg)
HK (1) HK1021746A1 (bg)
HU (1) HU226205B1 (bg)
IL (1) IL127162A (bg)
IS (1) IS2636B (bg)
NO (2) NO327597B1 (bg)
NZ (1) NZ336467A (bg)
PL (1) PL188826B1 (bg)
PT (1) PT907735E (bg)
SI (1) SI0907735T2 (bg)
SK (1) SK285461B6 (bg)
TR (1) TR199802421T2 (bg)
WO (1) WO1997044460A1 (bg)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1147584C (zh) * 1996-05-24 2004-04-28 拜奥根有限公司 组织再生调节物
EP0983357A1 (en) * 1997-05-23 2000-03-08 Biogen, Inc. Modulators of tissue regeneration
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
CZ295108B6 (cs) 1998-03-20 2005-05-18 Benitec Australia Ltd Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1160321A1 (en) * 2000-05-31 2001-12-05 Sanofi-Synthelabo Kidney Injury Novel Gene-1: Isolation and therapeutic applications
EP1305409B1 (en) 2000-06-16 2009-03-11 Biogen Idec MA Inc. Renal regulatory elements and methods of use thereof
US6812002B2 (en) * 2000-08-30 2004-11-02 Pfizer Inc. Osteoactivin protein and nucleic acids encoding the same, compositions and methods of stimulating bone differentiation
JP4527394B2 (ja) * 2001-06-01 2010-08-18 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｋｉｍ−１の分断を阻害するための分子および方法
US8709412B2 (en) 2001-06-29 2014-04-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modulation of TIM receptor activity in combination with cytoreductive therapy
NZ530451A (en) 2001-06-29 2008-04-30 Univ Leland Stanford Junior TIM gene sequences and their use in immunological disorders and cancer
AU2003228336B2 (en) * 2002-03-19 2009-07-30 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
SI1585546T1 (sl) * 2002-12-30 2008-12-31 Biogen Idec Inc KIM-1 antagonisti in uporaba za moduliranje imunskega sistema
WO2004084823A2 (en) 2003-03-19 2004-10-07 Abgenix, Inc. Antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen and uses thereof
ES2739463T3 (es) * 2003-03-27 2020-01-31 Childrens Hospital Med Ct Un método y kit para la detección de la instauración precoz de la lesión de células tubulares renales
US20050272101A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-08 Prasad Devarajan Method for the early detection of renal injury
JP2007536260A (ja) 2004-05-06 2007-12-13 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 虚血性および腎毒性障害の軽減および改善用ｎｇａｌ
RU2283666C9 (ru) * 2004-05-14 2007-03-10 Бизяев Алексей Вячеславович Средство для активации восстановления структуры и функции поврежденных тканей и органов
US20060003345A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 Pfizer Inc RNA bioassay
ES2818028T3 (es) * 2004-12-20 2021-04-09 Antibodyshop As Determinación de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) como marcador diagnóstico para trastornos renales
CN103751780A (zh) 2005-03-02 2014-04-30 比奥根艾迪克Ma公司 用于治疗th2介导的疾病的kim-1抗体
WO2007059082A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Curagen Corporation Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen
US20070037232A1 (en) * 2005-03-31 2007-02-15 Barasch Jonathan M Detection of NGAL in chronic renal disease
US20080090304A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Barasch Jonathan Matthew Diagnosis and monitoring of chronic renal disease using ngal
PL2035835T3 (pl) 2006-05-30 2012-05-31 Antibodyshop As Sposoby szybkiej oceny ciężkości urazu
EP2064553B2 (en) * 2006-08-07 2023-06-07 Antibodyshop A/S Diagnostic test to exclude significant renal injury
WO2008113363A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-25 Bioporto Diagnostics A/S Diagnostic test for renal injury
US8846036B2 (en) 2007-10-19 2014-09-30 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian NGAL and uses thereof
US20090297479A1 (en) * 2008-03-28 2009-12-03 Kiyoshi Ariizumi Dc-hil conjugates for treatment of t-cell disorders
CN102187220B (zh) * 2008-08-28 2015-08-19 阿斯图特医药公司 用于诊断和预后肾损伤和肾衰竭的方法和组合物
JP5947544B2 (ja) * 2008-08-29 2016-07-06 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後のための方法および組成物
NZ619918A (en) * 2008-10-21 2015-04-24 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CA2740788C (en) * 2008-10-21 2023-03-14 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
AU2009313189B2 (en) 2008-11-10 2014-10-23 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
ES2528799T3 (es) * 2008-11-22 2015-02-12 Astute Medical, Inc. Métodos para el pronóstico de insuficiencia renal aguda
BRPI1007483B1 (pt) * 2009-01-28 2021-11-30 Bio Preventive Medicine Corporation Método de diagnóstico de nefropatia in vitro, método in vitro para o monitoramento de progresso de nefropatia, método in vitro para o monitoramento da eficácia de um tratamento de nefropatia, método in vitro de avaliação de toxicidade renal de um agente e kit para diagnóstico de nefropatia
US9229010B2 (en) 2009-02-06 2016-01-05 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2462440B1 (en) 2009-08-07 2017-05-17 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US20120264148A1 (en) * 2009-08-07 2012-10-18 Dashurie Nezieri Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
JP2013510322A (ja) 2009-11-07 2013-03-21 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後診断のための方法ならびに組成物
CN104698161A (zh) 2009-12-20 2015-06-10 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
CN102791885B (zh) 2010-02-05 2015-09-09 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
US9029093B2 (en) 2010-02-26 2015-05-12 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
JP2013529907A (ja) 2010-05-24 2013-07-25 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク Ｎｇａｌタンパク質変異体及びその使用
AU2011269775B2 (en) 2010-06-23 2015-01-15 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP3339859A1 (en) 2010-06-23 2018-06-27 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
DK2672980T3 (en) * 2011-02-09 2018-02-26 Lavivo Ab SYNBIOTIC COMPOSITIONS FOR GETTING UP AND RECONSTITUTING GAS MICROFLORA
WO2013086359A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2925337B1 (en) 2012-11-21 2019-07-03 The Trustees of Columbia University in the City of New York Mutant ngal proteins and uses thereof
EP3361255B1 (en) 2013-01-17 2020-03-11 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US10420337B2 (en) * 2013-03-15 2019-09-24 Lifeline Scientific, Inc. Transporter with a glucose sensor for determining viability of an organ or tissue
WO2015134671A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Targeson, Inc. Molecular imaging contrast agents and uses thereof
CA3026502A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Astute Medical, Inc. Management of acute kidney injury using insulin-like growth factor-binding protein 7 and tissue inhibitor of metalloproteinase 2

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2003A (en) * 1841-03-12 Improvement in horizontal windivhlls
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB9122820D0 (en) * 1991-10-28 1991-12-11 Wellcome Found Stabilised antibodies
EP0640094A1 (en) * 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
WO1995021922A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Abbott Laboratories Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
US5622861A (en) * 1994-08-05 1997-04-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA encoding hepatitis A virus receptor
EP0804547A4 (en) * 1994-08-18 1999-11-03 Univ Columbia ASSOCIATED SINGLE SEQUENCES OF KAPOSI DISEASE VIRUSES AND USE OF SAID SEQUENCES
US6069230A (en) * 1994-11-10 2000-05-30 Promega Corporation High level expression and facile purification of proteins, peptides and conjugates for immunization, purification and detection applications
US6066322A (en) * 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
CN1147584C (zh) * 1996-05-24 2004-04-28 拜奥根有限公司 组织再生调节物
EP1305409B1 (en) * 2000-06-16 2009-03-11 Biogen Idec MA Inc. Renal regulatory elements and methods of use thereof
JP4527394B2 (ja) * 2001-06-01 2010-08-18 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｋｉｍ−１の分断を阻害するための分子および方法
US7838220B2 (en) * 2001-06-29 2010-11-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes associated with immune disease
NZ530451A (en) * 2001-06-29 2008-04-30 Univ Leland Stanford Junior TIM gene sequences and their use in immunological disorders and cancer
US7215871B2 (en) * 2001-07-27 2007-05-08 Thomson Licensing Changing a playback speed for video presentation recorded in a field structure format
US7687454B2 (en) * 2001-12-03 2010-03-30 The University Of British Columbia Effectors of innate immunity determination
EP1467759A4 (en) * 2002-01-30 2006-05-31 Brigham & Womens Hospital COMPOSITIONS AND METHODS ASSOCIATED WITH TIM-3, TH1-SPECIFIC CELL SURFACE MOLECULE
AU2003228336B2 (en) * 2002-03-19 2009-07-30 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
SI1585546T1 (sl) * 2002-12-30 2008-12-31 Biogen Idec Inc KIM-1 antagonisti in uporaba za moduliranje imunskega sistema
TW200539890A (en) * 2004-03-12 2005-12-16 Brigham & Womens Hospital Methods of modulating immune responses by modulating tim-1, tim-2 and tim-4 function
AU2005231685A1 (en) * 2004-03-24 2005-10-20 Telos Pharmaceuticals Llc Compositions as adjuvants to improve immune responses to vaccines and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009039111A (ja) 2009-02-26
US20050089868A1 (en) 2005-04-28
ES2258793T3 (es) 2006-09-01
ES2258793T5 (es) 2010-01-25
HUP9902770A3 (en) 2001-09-28
JP2001505761A (ja) 2001-05-08
CN1223685A (zh) 1999-07-21
JP4316640B2 (ja) 2009-08-19
NO985427D0 (no) 1998-11-20
DK0907735T5 (da) 2010-06-14
BG64678B1 (bg) 2005-11-30
EE9800409A (et) 1999-06-15
AU3567697A (en) 1997-12-09
CZ295936B6 (cs) 2005-12-14
PL330313A1 (en) 1999-05-10
EP0907735B9 (en) 2010-05-19
ATE318903T1 (de) 2006-03-15
US20070141590A1 (en) 2007-06-21
IS2636B (is) 2010-06-15
EA004402B1 (ru) 2004-04-29
IL127162A (en) 2007-07-24
WO1997044460A1 (en) 1997-11-27
EP0907735B2 (en) 2009-10-07
AU712289B2 (en) 1999-11-04
CN1147584C (zh) 2004-04-28
SK160998A3 (en) 1999-07-12
EP0907735B1 (en) 2006-03-01
NO327597B1 (no) 2009-08-31
DE69735364D1 (de) 2006-04-27
PL188826B1 (pl) 2005-04-29
BR9709115A (pt) 1999-08-03
DE69735364T3 (de) 2010-05-06
EP1655367A1 (en) 2006-05-10
US20060286031A1 (en) 2006-12-21
SI0907735T1 (sl) 2006-08-31
TR199802421T2 (xx) 1999-02-22
SK285461B6 (sk) 2007-02-01
JP2008067701A (ja) 2008-03-27
HK1021746A1 (en) 2000-06-30
EE04817B1 (et) 2007-04-16
NO985427L (no) 1999-01-25
SI0907735T2 (sl) 2010-01-29
EA199801044A1 (ru) 1999-04-29
HUP9902770A2 (hu) 1999-12-28
DK0907735T3 (da) 2006-06-26
IS4902A (is) 1998-11-20
NZ336467A (en) 2000-10-27
DE69735364T2 (de) 2006-11-30
NO20090945L (no) 1999-01-25
US6664385B1 (en) 2003-12-16
IL127162A0 (en) 1999-09-22
DK0907735T4 (da) 2009-12-21
CZ381398A3 (cs) 1999-05-12
JP4602482B2 (ja) 2010-12-22
PT907735E (pt) 2006-06-30
HU226205B1 (en) 2008-06-30
CA2257851A1 (en) 1997-11-27
CA2257851C (en) 2011-11-15
EP0907735A1 (en) 1999-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG102967A (bg) Модулатори на тъканна регенерация
KR100587556B1 (ko) 신경 및 신장 증식을 자극하기 위한 ＲＥＴ리간드（ＲｅｔＬ)
US6861509B1 (en) Antibodies to Ret and RetL3
WO2001016169A2 (en) RET LIGAND 5 (Retl5) FROM HUMAN AND MOUSE
KR100498530B1 (ko) 조직재생조절물질
KR100554901B1 (ko) 신경및신장증식을자극하기위한RET리간드(RetL)
MXPA98009812A (en) Modulators of the regeneration of the tej