BG64678B1 - Модулатори на тъканна регенерация - Google Patents

Модулатори на тъканна регенерация Download PDF

Info

Publication number
BG64678B1
BG64678B1 BG102967A BG10296798A BG64678B1 BG 64678 B1 BG64678 B1 BG 64678B1 BG 102967 A BG102967 A BG 102967A BG 10296798 A BG10296798 A BG 10296798A BG 64678 B1 BG64678 B1 BG 64678B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
seq
kim
thr
polypeptide
sir
Prior art date
Application number
BG102967A
Other languages
English (en)
Other versions
BG102967A (bg
Inventor
Michele Sanicola-Nadel
Joseph Bonventre
Catherine Hession
Takaharu Ichimura
Henry Wei
Richard Cate
Original Assignee
Biogen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26690881&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG64678(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen, Inc. filed Critical Biogen, Inc.
Publication of BG102967A publication Critical patent/BG102967A/bg
Publication of BG64678B1 publication Critical patent/BG64678B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до протеини, които се използват за up-регулиране при наранени или регенериращи тъкани, както и до ДНК, кодираща тези протеини. Изобретението се отнася и до терапевтични състави включващи съединенията, както и до методи за лечение.

Description

(54) МОДУЛАТОРИ НА ТЪКАННА РЕГЕНЕРАЦИЯ
Област на техниката
Изобретението се отнася до протеини, които се използват за ир-регулиране при наранени или регенериращи тъкани, както и до ДНК, кодираща тези протеини. Изобретението се отнася и до терапевтични състави и методи за лечение, включващи тези съединения.
Предшестващо състояние на техниката
По време на развитието, както и по време на зарастването на тъканите при увреждане, се осъществява динамично премоделиране на тъканната архитектура.
Бъбрекът е в състояние да поправи разрушенията в епитела на проксималното каналче, посредством сложни серии от събития, включващи смърт на клетките, пролиферация на преживелите епителни клетки на каналчето, образуване на слабо диференцииран регенериращ епител над оголената базална мембрана, и диференцииране на регенериращия епител до образуване на напълно функционални епителни клетки на каналчето (Wallin et al., Lab. Invest. 66 & 474-484,1992; Witzgall et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1933-1942, 1994; Ichimura et al., Am., J. Physiol. 269: F653-662, 1995; Thadhani et al., N. Engl. J. Med. 334: 1448-1460, 1996). В процеса на зарастване взимат участие и растежни фактори като IGF, EGF и HGF, както и молекула ICAM-1 за ендотелна клетъчна адхезия. Въпреки това още не са разбрани механизмите, по които се възстановяват епителните клетки на каналчето.
За да се идентифицират молекулите, включени в процеса на увреждане и заздравяване на епитела на каналчето, бяха анализирани разликите в тРНК популациите между наранени/регенериращи и нормални бъбреци чрез използване на представителен анализ на разликите (RD A). RD А е анализ, основаващ се на PCR метода за изваждане, който води до желаните тъкани или клетъчно специфични сДНК фрагменти, чрез повтарящо се изваждане и амплифициране (Hubank and Schutz, Nucl. Acids Res. 22: 5640-5648, 1994).
Техническа същност на изобретението
Изобретението най-общо се отнася до свързани с увреждане на бъбреците молекули (всяка от които оттук нататък се нарича “KIM” (Kidney Injury-related Molecules), които са upрегулирани в бъбречната тъкан след увреждане на бъбрека. KIM протеините и пептидите на изобретението, така както техните агонисти и антагонисти, и техните съответни, са полезни при много терапевтични интервенции.
Изобретението осигурява пречистена и изолирана ДНК молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, посочена в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Изобретението включва, също така, и комплементарните вериги на тези последователности, ДНК молекули, които хибридизират при строги реакционни условия към гореспоменатите ДНК молекули, които, поради разпада на генетичния код, биха хибридизирали към които и да са дефинирани по-горе ДНК молекули. ДНК молекулите могат да са рекомбинантни и могат да са операционно свързани към експресионна контролна последователност.
Изобретението предоставя, освен това, вектор, включващ пречистена и изолирана ДНК молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, посочена в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, или друга от дефинираните по-горе ДНК молекули. Векторът може да е биологично функционален плазмид или вирусен ДНК-ов вектор. Един вариант за изпълнение на изобретението предоставя прокариотни или еукариотни клетки-гостоприемници, стабилно трансформирани или трансфектирани от вектор, включващ ДНК молекула от SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. При един друг вариант за изпълнение на изобретението се предоставя метод за продуциране на KIM полипептиден продукт, кодиран от ДНК молекула, както е описано по-горе; методът включва култивиране при подходящи културални условия, прокариотни или еукариотни клетки-гостоприемници, трансформирани или трансфектирани с ДНК молекулата по начин, позволяващ експресията на ДНК молекулата, и получаване на полипептидния продукт на посочената експресия.
Пречистен и изолиран човешки KIM протеин по същество лишен от други човешки протеини, е същността на изобретението, както и метод за продуциране на полипептидния продукт, притежаващ част от първичната структурна конформация и биологична активност на KIM протеин. KIM протеините на изобретението могат да притежават аминокиселинна последователност, включваща SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, или варианти на SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, или пречистен и изолиран протеин кодиран от ДНК със SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Тези протеини могат да се предоставят по същество лишени от други човешки протеини. Изобретението се отнася, освен това, до варианти на тези протеини, като например разтворими варианти или сляти протеини. KIM слятите протеини, съгласно изобретението, включват имуноглобулин, токсин, съединения, които могат да се изобразят или радиоактивни нуклеотиди.
Изобретението се отнася, освен това, до специфично моноклонално антитяло към описаните по-горе KIM протеини. Анти-KIM антитялото може да е прикрепено към токсин, съединение способно да бъде изобразено или радиоактивен нуклеотид. Става въпрос и за хибридомна клетъчна линия, продуцираща такова специфично антитяло.
В обхвата на изобретението се включват и фармацевтични състави. Фармацевтичен състав съгласно изобретението може да включва терапевтично ефективно количество от KIM протеина или анти-KIM антитяло, съгласно изобретението, заедно с фармацевтично приемлив носител.
В обхвата на изобретението се включват и методи за диагностика, като например установяване присъствието или причините за липсата на разграничаване на бъбречното увреждане чрез измерване на концентрацията на KIM в урината, серума или седиментите в урината на пациенти, които рискуват или са в рискова група да развият бъбречни заболявания.
Методите за лечение съгласно изобретението включват третиране на пациентите с ефективни количества от KIM, варианти на KIM, аналози на KIM, KIM сляти протеини, KIM агонисти и антитела към KIM или към KIM лиганди. Други терапевтични съединения съгласно изобретението включват KIM лиганди, анти-KIM антитела и сляти протеини на KIM лигандите. Тези съединения могат да са полезни при терапевтичните методи, които или стимулират, или инхибират клетъчните отговори, които зависят от функционирането на KIM.
Други методи съгласно изобретението се отнасят до инхибиране растежа на К1М-експресиращи туморни клетки чрез привеждане на клетките в контакт със слят протеин на KIM лиганд и било то токсин или радиоактивен нуклеотид, било то с анти-KIM антитяло, конюгирано към токсин или към радионуклеотид. Подобно, растежът на туморни клетки, които експресират KIM лиганди, може да се инхибира чрез поставяне на клетките в контакт със слят протеин на KIM и било то токсин или радионуклеотид, било то с анти-KIM лиганд антитяло, конюгиран с токсин или с радионуклеотид.
Изобретението включва, също така, методи на генна терапия. Те включват метод за лечение на пациент с бъбречни нарушения, метод за спомагане растежа на нова тъкан при пациент и метод за спомагаме преживяването на засегнатите от увреждане тъкани при пациент, включващ прилагане върху пациента на вектор, включващ ДНК, която съдържа нуклеотидна последователност от SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6.
Съединенията на изобретението са полезни за изобразяване на тъкани in vitro или in vivo. Един такъв метод включва насочване на едно съединение, което може да се изобрази, към клетка, експресираща протеин от SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 7, включващ привеждане на клетката в контакт с моноклонално антитяло съгласно изобретението или слят протеин, съдържащ протеин, както е описано по-горе, слят със способно да бъде изобразено съединение. При in vivo методите клетката е в пациента, а протеинът или моноклоналното антитяло се прилага върху пациента.
Изобретението включва и методи за диагностика, като например метод за идентифициране на увредените или регенериращи бъбречни клетки в субекта, включващ сравняване на степента на експресия или на SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6 в бъбречните клетки на субекта към контролна степен на експресия на последователността в контролни бъбречни клетки. Друг ме тод на изобретението включва идентифициране на регулацията на SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6 в клетки, включващ привеждане на клетките в контакт с антисенс проба и измерване на хибридизацията на РНК в клетките.
Друг вариант за изпълнение на методите за диагностика на изобретението включва установяване присъствието или концентрацията на молекула съгласно изобретението или в урина, серум или в други телесни течности, или в седименти на урината или тъканни проби. Измереното ниво на свързани с увреждането молекули може да се свърже с присъствието, обхвата или причините за патологичен процес. Корелацията може да се използва за определяне ефикасността на режима на лечение.
Описание на приложените фигури
Фигура 1 е нуклеотидна последователност на клонирана сДНК 3-2 от плъх, с рамка на разчитане от 615 до 1535 на предполагаем протеин;
фигура 2 - списък на ДНК последователностите на клон 1-7 от плъх, на рамка за разчитане от 145 до 1065 на предполагаем протеин;
фигура 3 - списък на ДНК последователностите на клон 4-7 от плъх, на рамка за разчитане от 107 до 1822 на предполагаем протеин;
фигура 4 - списък на сДНК и изведените аминокиселинни последователности от човешки клон Н13-10-85, с предполагаема рамка на разчитане от 1 до 1002. Най-горната линия от списъка е сДНК последователността (SEQ ID NO: 6), а най-долната е изведената аминокиселинна последователност (SEQ ID NO: 7);
фигура 5 - BESTFIT сравнение на нуклеотидната последователност на човешки клон Н13-10-85 с клон 3-2 от плъх.
Подробно описание на изобретението
KIM гените се идентифицираха чрез анализиране на различията в експресията на иРНК между регенериращите и нормалните бъбреци, при използване на анализ на представителните разлики (RDA). RDA е метод, основан на PCR за изваждане и амплификация. сДНК репрезентацията на РНК от бъбрек на 48-часов постисхемичен възрастен плъх се изважда от проба бата на нормален (симулиращ обработка) бъбрек на възрастен плъх. При тази процедура, последователностите, които са общи за двете проби, от постисхемичния и нормалния бъбрек се отстраняват, като се остават тези последователности, които са значително експресирани единствено в увредената бъбречна тъкан. Такива гени кодират протеини, които могат да бъдат терапевтично полезни при бъбречни нарушения или се включват в процеса на увреждане. Получени са няколко клона, секвенирани са и са охарактеризирани. След това клоновете се изследват за техния модел на експресия по време на възстановяването на бъбрека, развитието и тъканното разпределение чрез Northern анализ и in situ РНК хибридизация.
Идентификационни номера на последователностите
Нуклеотидните и аминокиселинните последователности, които се посочват в описанието, са посочени под следните идентификационни номера:
SEQ ID NO: 1 - нуклеотидна последователност на 3-2 сДНК инсърт от плъх
SEQ ID NO: 2 - нуклеотидна последователност на 1 -7 сДНК инсърт от плъх
SEQ ID NO: 3 - аминокиселинна последователност на KIM-1, кодирана от 3-2 и 1-7 сДНК
SEQ ID NO: 4 - нуклеотидна последователност на 4-7 сДНК инсърт от плъх
SEQ ID NO: 5 - аминокиселинна последователност, кодирана от 4-7 сДНК инсърт
SEQ ID N0: 6 - нуклеотидна последователност на човешка сДНК клон Н13-10-8547 сДНК
Дефиниции на термините “KIM протеин”, използван тук като синоним на KIM, представлява протеин кодиран от тРНК, която селективно се регулира след увреждане на бъбрека. Една група от KIM протеини, представляващи интерес, включва тези кодирани от тРНК, която селективно се регулира по всяко време през седмицата, следваща какъвто и да е инсулт, който води до увреждане на бъбречната тъкан. Примери за периоди от време, когато могат да се регулират такива процеси на регулация, включват 10 h, 24 h, 48 h или 96 h след инсулт. Примери за видовете инсулт включват тези, при които се стига до исхемично, токсично или друг вид увреждане.
“KIM агонист” представлява молекула, която специфично може да предизвика клетъчен отговор, нормално предизвикан от взаимодействието на KIM с KIM лиганда. KIM агонист може да е вариант на KIM, или специфично антитяло към KIM, или разтворима форма на KIM лиганда.
“KIM антагонист” представлява молекула, която може специфично да се асоциира с KIM лиганд или KIM, като по този начин блокира, или иначе казано инхибира свързването на KIM към KIM лиганда. Антагонистичното свързване блокира или инхибира клетъчните отговори, които иначе биха били предизвикани от свързването на KIM лиганда с KIM или с KIM агониста. Примери за KIM антагонисти включват някои варианти на KIM, KIM сляти протеини и специфични антитела към KIM лиганда или KIM.
“KIM” лиганд е коя да е молекула, която нековалентно и специфично се свързва към KIM протеина. Такъв лиганд може да е протеин, пептид, стероид, антитяло, производно на аминокиселина или друг тип молекула, в каквато и да е форма, включително срещащи се в природата, получени чрез рекомбинантни техники, или синтетично получени по друг начин. KIM лигандата може да е под каквато и да е форма, включително разтворима, свързана с мембрана, или част от слята структура с имуноглобулин, мастна киселина или други части. KIM лигандата може да е интегрин. Свързана с мембрана KIM лиганда може да действа като рецептор, който когато е свързан със или асоцииран към KIM, предизвиква клетъчен отговор. При някои взаимодействия KIM може да се асоциира с повече от един KIM лиганд, или да се асоциира с KIM лиганд като част от комплекс от една или повече други молекули или фактори. В ситуации, при които и двете, KIM, както и KIM лиганда, са свързани към клетъчните стени, KIM може да асоциира и да реагира с KIM лиганда, която е свързана с втора клетка. Когато се стигне до KIM лигиране между молекули, свързани към различни клетки, двете клетки могат да са еднакви или различни, с оглед на клетъчния тип или произход, фенотипното или метаболитното състояние, или тип или степен на клетъчен отговор (например растеж, диференциация или апоптоза) към дадения стимул. “KIM лигира не” се отнася до контакта и свързването на KIM с KIM лиганд.
Под “подреждане на последователностите” се разбира позиционирането на една последователност, било то нуклеотидна или аминокиселинна, с това на друга последователност, за да стане възможно сравняването на последователността със съответните участъци на едната с тези на другата. Пример за един метод на тази процедура се посочва в Neederleman et al., (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970). Методът може подходящо да се осъществи посредством компютърна програма, като Aligh program (DNAster, Inc.). Както ще бъде ясно за специалистите в областта, хомоложни или функционално еквивалентни последователности включват еквивалентно подреждане на цистеиновите остатъци в запазения цистеинов скелет, включително аминокиселинните инсерти или делеции, които променят линейното подреждане на тези цистеини, но не нарушават материалната връзка в нагънатата структура на протеина. Следователно, вътрешните дупки и аминокиселините инсерти в кандидат последователността се игнорират, с цел да се пресметне хомоложността на аминокиселинната последователност или идентичността между кандидат и сравнителната последователност. Една характеристика, която често се използва при установяването на хомоложност между протеините, е подобието на броя и локализацията на цистеиновите остатъци между единия и другия участък.
“Антисенс ДНК” се отнася до последователността на хромозомална ДНК, която се транскрибира.
“Антисенс проба” представлява проба, която съдържа най-малкото една част от антисенс ДНК за интересуващата ни част от нуклеинова киселина.
Под “клониране” се разбира използването на in vitro рекомбинантни техники за инсериране на определен ген или друга ДНК последователност в молекулата на вектора. С цел успешно да се клонира желаният ген, трябва да се използват методи за генериране на ДНК фрагменти, за да се свържат фрагментите към векторните молекули и за да се подбере клонът, притежаващ гена мишена измежду клетките гостоприемници на реципиента.
Под “сДНК” се разбира комплементарна или копие на ДНК, продуцирана от матрица
РНК под действието на РНК-зависима ДНК полимераза (обратна траскриптаза). Следователно “сДНК клон” означава двойна ДНК последователност комплементарна на интересуваща ни РНК молекула, пренасяна от клониращ вектор.
Под “сДНК библиотека” се разбира колекция от рекомбинантни ДНК молекули, съдържащи сДНК инсерти, които всички заедно са представителни за тРНК молекулата, присъстваща в един цял организъм или тъкан, в зависимост от източника на РНК матриците. Една такава сДНК библиотека може да се изготви чрез методи, известни на специалистите в областта и описани, например от Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, виж по-горе. Обикновено, РНК се изолира първо от клетките на организъм, от чийто геном желаем да клонираме определен ген. Предпочетени за целите на настоящото изобретение са клетъчни линии от бозайници, по-специално от човек. Алтернативно, РНК може да се изолира от туморна клетка, произхождаща от животински тумор, за предпочитане от човешки тумор. По този начин може да се изготви библиотека от например човешки надбъбречен тумор, но може да се използва който и да е тумор.
Терминът “ДНК полиморфизъм”, както се използва тук, се отнася до състоянието, при което две или повече различни нуклеотидни последователности могат да съществуват при един определен сайт в ДНК.
“Експресионен вектор” включва вектори, които са способни да експресират ДНК последователности, които са включени в тях, т.е. кодиращите последователности са операционно свързани към други последователности, способни да осъществят експресията. Подразбира се, въпреки че не винаги ясно се установява, че тези експресионни вектори трябва да са способни на репликация в организма гостоприемник или чрез епизоми, или като интегрална част от хромозомалната ДНК. Необходим, но не задължителен, елемент на ефективната експресия на вектора е маркерна кодираща последователност, която е последователност, кодираща протеин, който води до фенотипни свойства (като например резистентност на тетрациклин) на клетките съдържащи протеина, който позволява тези клетки точно да бъдат идентифицирани. В обобщение, “експресионният вектор” дава функционална дефиниция, и която и да е ДНК последователност, която е в състояние да осъществи експресия на определен съдържащ се ДНК код се включва в този термин, както се прилага към определената последователност. Както е в настоящия случай, такива вектори често са под формата на плазмиди, така че “плазмидите” и “експресионните вектори” често се използват като взаимозаменяеми. Въпреки това, изобретението има претенциите да включва такива други форми на експресионни вектори, които имат еквивалентни функции и които могат отвреме на време да са известни от предшестващото състояние на техниката.
Под “функционални производни” се разбира “фрагменти”, “варианти”, “аналози” или “химични производни” на молекула. Под “фрагмент” на молекула, като всеки антиген от настоящото изобретение, се разбира, че се отнася до всеки полипептиден комплект от молекули. Под “вариант” на такива молекули се разбира, че се отнася до естествено съществуващи в природата молекули, по същество подобни или на цялата молекула, или на неин фрагмент. Под “аналог” на молекула се разбира, че се отнася до несъществуващи естествено в природата молекули, по същество подобни или на цялата молекула или на неин фрагмент.
Терминът “ген” се отнася до полинуклеотидна последователност, кодираща пептид.
Под “хомоложен” се разбира, когато се отнася до пептид или ДНК последователност, че първичната молекулярна структура (т.е. аминокиселинна или нуклеотидна последователност) на по същество всички молекули, присъстващи във въпросния състав, са идентични.
“Изолиран” се отнася до протеин от настоящото изобретение или който и да е ген кодиращ такъв протеин, който по същество е лишен от други протеини или гени, съответно, или от други онечиствания, с които нормално може да се открие в природата, а като такъв съществува под форма, която не се открива в природата.
Терминът “маркер” се отнася до молекулярна част, която е в състояние да бъде открита, включително, като пример, без ограничения, радиоактивни изотопи, ензими, луминесцентни средства и багрила.
Терминът “проба” се отнася до лиганд с известни качества, способен на селективно свързване към антилиганд мишена. Когато се прилага към нуклеинови киселини, терминът “проба” се отнася до верига на нуклеинова киселина, притежаваща последователност от бази комплементарни на веригата мишена.
Под “рекомбинантни клетки мишени” се разбира клетки, които са трансформирани с вектори, конструирани чрез използване на техниките на рекомбинантната ДНК. Както е дефинирано тук, антитялото или негова модификация, продуцирано от рекомбинантни клетки гостоприемници, е вследствие на трансформациите в толкова по-малки количества, или попросто, с толкова по-малко от количествата, които могат да се определят, както биха били продуцирани от нетрансформиран гостоприемник.
Под “чист по същество” се разбира който и да е протеин от настоящото изобретение или който и да е ген, кодиращ който и да е такъв протеин, който изцяло е лишен от други протеини или гени, съответно, или от други онечиствания с които нормално може да се открие в природата, и като такъв съществува под форма, несрещаща се в природата.
Една молекула се нарича “подобна по същество” на друга молекула, когато аминокиселинната последователност и в двете молекули е изцяло същата и когато и двете молекули притежават подобна биологична активност. Така, при положение, че две молекули притежават подобна активност, те се считат като варианти, както се използва терминът тук, даже когато едната молекула притежава допълнителни аминокиселинни остатъци, които не се откриват в другата, или когато аминокиселинната последователност не е идентична. Както се използва тук, за една молекула се казва, че е “химическо производно” на друга молекула, когато притежава допълнителни химически частици, които нормално не са част от молекулата. Такива частици могат да подобрят разтворимостта на молекулата, абсорбцията, биологичния полуживот и т.н. Частиците могат, алтернативно, да намаляват токсичността на молекулата, да намалят силата или да елиминират някой нежелан ефект. Частици, способни да медиират такива ефекти, са описани, например в Remongton’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co.
Под “вектор” се има предвид ДНК мо лекула, произлязла от плазмид или от бактериофаг, в която могат да се инсерират или клонират фрагменти от ДНК. Векторът съдържа един или повече уникални рестрикционни сайта и може да е способен на автономна репликация в определен гостоприемник или организъм носител, така че клонираната последователност да може да бъде репродуцирана.
Съединения на изобретението
Изобретението включва сДНК от SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:4 или SEQ ID NO: 6, така както и последователности, включващи последователността от SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, и производни на тези последователности. Изобретението включва, също така, вектори, липозоми и други носители, които включват тези последователности или техни производни. Изобретението включва освен това, протеини, транскрибирани от SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, включително, но без да се ограничават до SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, както и техните производни и варианти.
Един вариант за осъществяване на изобретението включва разтворими варианти на KIM протеин, който обикновено се синтезира като протеин, асоцииран с мембраната и който е ир-регулиран след увреждане. При разтворимите варианти липсва най-малкото част от трансмембранния или интрамембранния участък от нативния KIM протеин. При някои примери, при разтворимия вариант липсва целият трансмембранен или интрамембранен участък от нативния KIM протеин. Разтворимите варианти включват сляти протеини, особено тези, които включват производни на KIM протеини, при които липсва поне една част от трансмембранния или интрамембранния участък от нативния KIM протеин. Включват се всички типове сляти KIM протеини, а особено тези, които инкорпорират his-tag, Ig-tag и myc-tag молекулярни форми. Тези сляти KIM протеини могат да притежават характеристики, които имат терапевтични качества, като например увеличен полуживот, който се придава от Igtag. Включват се, също така, и сляти протеини, които инкорпорират участъци от избрани домени от KIM протеина.
Вариантите могат да се различават от естествено съществуващия в природата KIM протеин по аминокиселинната последователност или по начин, който не включва последователност, или по двете. Вариантите в аминокиселинната последователност се продуцират, когато една или повече аминокиселини от нормално срещания в природата KIM протеин се замести от друга нормално срещана в природата аминокиселина, производно на аминокиселина или ненативна аминокиселина. Предпочитаните варианти включват естествено срещан в природата KIM протеин или биологично активен фрагмент от естествено срещан в природата KIM протеин, чиито последователности се различават от последователността на дивия тип по една или повече консервативни аминокиселинни замествания, които типично имат минимално влияние върху вторичната структура и хидрофобното естество на протеина или пептида.
Вариантите могат да притежават, също така, и последователности, които се различават по една или повече неконсервативни аминокиселинни замествания, делеции или инсерции, които не разрушават биологичната активност на KIM протеина. Консервативните замествания типично включват заместване на една аминокиселина с друга, притежаваща подобни характеристики, като например заместване в следните групи: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолевцин; аспартат, глутамат; аспаргин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. Неполярни (хидрофобни) аминокиселини включват аланин, левцин, изолевцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярните неутрални аминокиселини включват глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспаргин и глутамин. Положително заредените (основни) аминокиселини включват аргинин, лизин и хистидин. Отрицателно заредените (киселинни) аминокиселини включват аспартат и глутамат.
Други консервативни замествания могат да се вземат от приложената таблица, като други са описани също от Dayhoff в Atlas of Protein Sequence and Structure (1988).
Таблица 1.
Конирвативни аминокиселинни замествания
за аминокиселина код заменена е коя да е от
аланин А 1Ala, Gly, beta-Ala, L Cys, 1) Cys
араинин R Г)· Arg, Lys, homo-Arg, 1 ) homo· Arg, Met, 1)Mci, He, 1) He, Orn, 1)Orn
аспараин N I)· Asn, Asp, I)-Asp, Glu, 1)-Glu, Gin, I)· Gin
аспартагп D D-Asp,1)- Asn, Asn, Gin, i) Glu, Gin, l>· Gin
цистсин С I)· Cys, $· Mc-Cys, Met, D· Met, Thr, D'Hir
алутамин Q 1) Gin, Asn, I) Asn. Glu, I)-Glu. Asp, 1)-Asp
алутамат Е I) Glu, I)-Asp, Asp, Asn, Asn, !)· Asn, Gin, 1)-Gin
алици+1 G Ala, J)-Ala, Pro, D-Pro, Rota-Ala, Acp
изолсВцин 1 I)-lie, Val, 1)-Val, Leu, 1)1 .cm, Mel, I)- Met
левцин L I) J .eu, Val, D-Val, Met, J) · Met
лизин К 1)-Lys, Arg, DArg, h (an (>· A rg, 1) homo- Arg, Mei, 1) Mei, He, D-llc, Orn, I) Orn
Memuoi нш Μ фснилалинии F ηρΟΛΙΠΙ серии rnpeonun тирозин Υ
Калии V
D· Mui, S McCys, He, D Jk'., Leu, DLcu, Val, I)· Val, Norlcu
D Phe, Tyr, D Thr, LDopa, Mis, D His, Trp, D-Trp, Trans 3,4 или 5фенилпролин, cis 3,4 или .S фенилпролин D Pro, 1,-1гш1оазолщ]ии-4k a pi)() k си л 11 a k 11 ccai ш a, I) или I, Iоксазолидин-4' карбоксилна киселина D Ser, Thr, D-Thr, alloThr, Met, D Met, Mct(O), D-Mct(O), Val, D· Val
D Thr, Ser, D Ser, alloThr, Met, D Met, Mct(O), D- MetO), Val, D Val
D· Tyr, Phe, D-Phe, 1 .,1 )opa, J1 is, D-1 Iis D Val, Leu, D J.cu, He, D- lie. Met, D-Mct io
Други варианти на изобретението са тези, с модификации, които повишават стабилността на пептида. Такива варианти могат да съдържат, например, една или повече непептидни връзки (които заместват пептидните връзки) в пептидната последователност. Включват се също така и: варианти, които включват варианти, различни от естествено срещаните в природата L-аминокиселини, като D- аминокиселини или несрещани в природата или синтетични аминокиселини, като бета или гама аминокиселини и циклични варианти. Инкорпорирането на D-вместо L-аминокиселини в полипептида може да увеличи устойчивостта му към протеази. Виж например US 5 291 990.
Обикновено, заместванията, от които се очаква да индуцират промени във функционалните качества на KIM полипептидите, са тези, в които: (1) хидрофилен остатък, например серии или треонин, се замества с хидрофобен остатък, например левцин, изолевцин, фенилаланин, или аланин; (2) цистеинов остатък се замества с който и да е друг остатък; (3) остатък, притежаващ електропозитивна странична верига, например лизин, арнинин или хистидин, се замества с остатък, притежаващ електронегативен товар, например алутамат или аспартат; или (4) остатък, притежаващ обемиста странична верига, например фенилаланин се замества с аминокиселина, непритежаваща обемиста странична верига, например глицин.
Пептидът съгласно изобретението може също така да се модифицира чрез многообразни промени като инсерции, делеции и замествания, консервативни или неконсервативни, когато такива промени могат да осигурят предимства при използването им. Варианти на снаждане специално се включват в изобретението.
При един друг вариант за изпълнение на изобретението варианти с аминокиселинни замествания, които са по-малко консервативни, могат също да дадат желаните производни, например чрез причиняване на промяна в заряда, конформационни и други биологически способности. Такива замествания включват, например, заместване на хидрофилен остатък с хидрофобен остатък, заместване на цистеина или пролина с друг остатък, заместване на остатък,притежаващ къса странична верига с остатък, притежаващ обемиста странична вери га. Когато не могат предварително да се предвидят със сигурност резултатите от даденото заместване, производното може веднага да се изследва съгласно методи, описани в настоящото изобретение, за определяне наличието или отсъствието на желаните характеристики.
Варианти, включени в обхвата на изобретението, включват протеини и пептиди с последователности, притежаващи най-малко 80% хомоложност с KIM протеин. За предпочитане хомоложността на последователностите е наймалко 90% или най-малко 95%. С цел да се определи хомоложността, дължината на последователностите за сравнение обикновено трябва да е най-малко 8 аминокиселинни остатъка, обикновено най-малко 20 аминокиселинни остатъка. Варианти на съставите на изобретението включват, също така, който и да е протеин, който 1) притежава аминокиселинна последователност, която поне в 40% е хомоложна на KIM протеина от изобретението, и който 2) след като е приведен в оптимален вид на подреждане с последователността на KIM (както е изобразено на фигура 5 за човешки и плъши KIM-1), има поне 80% от цистеиновите остатъци,подредени срещу цистеидите на KIM протеина от изобретението.
Така, както е възможно да се заместят заместители от скелета, възможно е също така да се заместят функционални групи, които са свързани със скелета с характеризиращи се с подобни качества. Първоначално заместването е консервативно, т.е. заместващата група е с приблизително същия размер, форма, хидрофобно ст и заряд, както изходната група. Модификации на последователностите могат да включват, например, in vivo или in vitro създаване на химически производни на участъци от съществуващия в природата KIM протеин, така както и промяна в ацетилирането, метилирането, фосфорилирането, карбоксилирането и гликолизата.
В изобретението се включват също така и агенти, които се свързват специфично към протеина (SEQ ID N0:3 или 7). Тези агенти включват лиганди и антитела (включително моноклонални, едноверижни, двуверижни, Fab фрагменти други, било то нативни, човешки, хуманизирани, приматизирани или химерни). Допълнителни описания на тези категории агенти могат да се намерят в РСТ заявка 95/16709, чието описание е включено тук за справка.
Примери за изпълнение на изобретението
1. Генериране на РНК от исхемични и нормални бъбреци от възрастен плъх
Исхемични увредени бъбреци от плъх се получават както е описано от Wizgall at al., (J.Clin Invast. 93:2175-2188, 1994). Накратко, бъбречната артерия и вена от един бъбрек на възрастен плъх се стягат за 40 min и после отново се обливат. Взимат се наранените бъбреци от плъховете на 24-ия час и на 48-ия час след обливането. Бъбреци от наужким оперирани възрастни Sparague-Dawley плъхове също се взимат.
Общата РНК се приготвя от органи, на основата на протокол на Glisin et al., (Biochemistry 13:2633,1974). Бързо, отделените органи се слагат веднага в GNC буфер (4 М гуанизин тиоцианат, 0,5%; 808, 25 тМ натриев цитрат, 0,1% протимопенител от Sigma) и се разрушават върху лед с политрон. Клетъчните отломки се отстраняват с нискооборотна клинична центрофуга и супернатантната течност се поставя върху възглавница от 5,7 М CsCl, 25 mM натриев цитрат, 1 mM EDTA. РНК се утаява през възглавницата в SW40Ti ротор при 22К за 15 h. РНК отново се суспендира в стерилна третирана с DEPC вода, утаява се двукратно с 1/10 обем ЗМ натриев ацетат и 2,5 обема EtOH. Poly A + РНК се изолира чрез използване на комплект за тРНК пречистване (Pharmacia, catalog No. 27-9258-02).
2. Метод на анализ на представителна разлика (RDA) за изолиране на 1-7, 3-2 и 4-7 RDA фрагменти.
Синтезира се двуверижна сДНК от наужким оперирани бъбреци и от poly А+РНК от 48 h след исхемични бъбреци, при използване на BRL от Gibco “Superscript Choice™”, каталожен номер No. 18090. Първата верига се синтезира чрез праймер от олиго dT и при използване на Superscriptll™ обратна транскриптаза. Втората верига се генерира чрез използване на ДНК полимераза I от Е. coli и РНаза Н следвана от Т4 ДНК полимераза при използване на препоръчаните от BRL условия.
RDA анализът се осъществява основно, както е описано от Hubank and Schatz (Nucleic Acid Research 22:5640-48, 1994). Бързо, сДНК от 48 h следисхемичен бъбрек се смила с рестрикционен ензим Ddp II и се лигира към R-Bgl-12/24 олигонуклеотиди (виж справка за точната последователност). PCR амплификация (осъществена с Perkin-Elmer Taq полимераза и съотвентния PCR буфер) на сДНК, лигирана към линкера, се използва за генериране на първоначалното представяне. PCR продуктът се означава като “тестер ампликон”. Същата процедура се използва за генериране на “драйвър ампликон” от сДНК от бъбрек на наужким опериран плъх.
Хибридизацията на тестер и драйвър ампликоните, следвани от селективна амплификация, се осъществява трикратно за генериране на диференциален продукт едно (DPI), две (DP2) и три (DP3). Генерирането на DPI продукта се осъществява както е описано от Hubank and Schatz (Nucleic Acid Research 22: 5640-48, 1994). DP2 и DP3 продуктите също се генерират както е описано от Hubank and Schatz (виж по-горе), с изключение на това, че отношенията драйвър : тестер се изменят до 5,333:1 за DP2 и до 40,000:1 за DP3.
RD А продуктите се клонират от DP3 във вектор за клониране pUC 18 : RDA продукт 1-7 (252 bp), когато се генерира при използване на отношение от 40,000:1, и продукт RDA
3-2 (445 Ьр) и 4-7 (483 Ьр), когато се генерира DP3 при използване на съотношение 4,000; 1. Фрагментите от ДНК се субклонират чрез използване на Pharmacia Sureclone™ комплект (каталожен номер No. 27-9300-01) за ремонтиране на краищата на PCR фрагментите с ензим на Klenow и за улесняване лигирането на тъпите краища на фрагментите във вектор pUC 18.
3. Northern анализ
Poly A + РНК(2,5 g) от бъбрек на нормален възрастен плъх (привидно опериран), от бъбрек на възрастен 48 h след исхемично увреждане, и от бъбрек на 18-дневен ембрион, се подлагат на електрофореза и Northern блотинг (Cate, Cell 45-685, 1986) върху GeneScreen™ мембрана (Dupont). Хибридизацията в PSB буфер (50 mM Tris 7,5, 1 М NaCl, 0,1% Na пирофосфат, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% BSA, 1% SDS), съдържащ 10% декстран сулфат и 100 g/ml tPHK, се осъществява при 65 °C при използване на три различни проби: 1-7 RDA продукт, 3-2 RDA продукт и 4-7 RD А продукт. Всички те се бележат с радиоактивен изотоп, като се използва Pharmacia’s “Ready to Go™ “ случаен комплект за маркиране на праймер (каталожен но12
MepNo. 27-9251.01). RDA продукти 1-7, 3-2 и
4-7 хибридизира с mPHK-те, присъстващи и в трите проби, но по-интензивно с mPHK-те в РНК пробите от 48 h след исхемичен бъбрек.
Northern блот анализ на тъкани от възрастен плъх показват, че 1 -7 генът се експресира при много ниски нива в нормален бъбрек, тестиси, далак и бели дробове на възрастно животно. 3-2 генът се експресира в черния дроб, бъбреците, далака и мозъка. 4-7 генът се експресира в далака, бъбреците, белите дробове, тестисите, сърцето, мозъка, черния дроб и скелетната мускулатура. Присъствието на различни размери mPHK в някои тъкани в
-7 и 3-2 блот означава, че първоначалният продукт на транскрипцията на 1 -7 гена и на 3- гена може да претърпи променен сплайсинг и/или полиаденилация.
4. Изолиране на 3-2 и 4-7 сДНК клонове
Генерира се сДНК библиотека от 4 pg Poly А+РНК от 48 h следисхемичен увреден бъбрек чрез използване на реагенти от BRL Superscript Choice™ за сДНК синтез, и Stratagene™ комплект за клониране (каталожен номер No. 236201), съгласно протоколите, препоръчани от производителя.
105 клона се скринират с 3-2 RDA продукт като проба (случайно маркиране на праймера, както е описано по-горе). Подбират се осем позитивни клона, а четири се избират случайно за вторичен анализ за получаване на чисти фагови плаки. След третичен скрининг се изолират четири чисти фагови клона. Клонираните инсерти от фага се изолират чрез процедурата на изрязване, съгласно Stratagene™ комплект. Най-големият инсерт, от приблизително 2,6 кЬ, отбелязан като сДНК клон 3-2, се подлага на ДНК секвениране. Последователността на инсерта (SEQ ID No: 1) е показана на фигура 1. сДНК клон 3-2 (Е. coli К-12, SOLR/p3-2#5-l) е депозиран като АТСС N0. 98061. Последователността на сДНК клон 3-2 е идентична на тази на клон 1 -7 сДНК (SEQ ID N0:2), с изключение на това, че нуклеотиди 136-605 от SEQ ID N0:1 представляват една инсерция. Следователно, SEQ ID N0:2 представлява слепена вариантна форма на SEQ ID N0:1. Клонът от 1-7 (Е. coli К-12, SOLR/pl7#3-1) е депозиран като АТСС No. 98060.
105 клонове се скринират с 1-7 RD А продукт като проба (случайно радиомаркиране на праймера, както е описано по-горе). Подбират се осем позитивни клона, а четири се избират случайно за вторичен анализ за получаване на чисти фагови плаки. След третичен стрининг се изолират четири чисти фагови клона. Клонираните инсерти от фага се изолират чрез процедурата на in vivo изрязване съгласно Stratagene™ Lambda Zap II комплект. Най-големият инсерт, от приблизително 2,0 кЬ (отбелязан като сДНК клон 1-7), се подлага на ДНК секвениране; последователността на инсерта (SEQ ID NO: 2) е показана на фигура 2.
105 клона се скринират с 4-7 RDA продукт като проба (случайно маркиране на праймера, както е описано по-горе и се хибридизират в PBS ри 65°С). Подбират се осем позитивни клона, а четири се избират случайно за вторичен анализ за получаване па чисти фагови плаки. След вторичния скрининг се изолират два чисти фагови клона. Клонираните инсерти от фага се изолират чрез процедурата на in vivo изрязване съгласно Stratagene™ Lambda Zap II комплект. Най-големият инсерт, от приблизително 2,4 kb (отбелязан като сДНК клон
4-7), се подлага на ДНК секвениране. Последователността на инсерта, SEQ ID N0:4 е показана на фигура 3. сДНК клон 4-7 (E.coli ΚΙ 2, SOLR/p4-7#l-l) е депозиран като АТСС NO. 98062.
5. Охарактеризиране на 1-7, 3-2 и 4-7 сДНК клоновете
А) Последователности на ДНК на протеина Последователността на 3-2 сДНК (фигура 1; SEQ ID N0:1) съдържа отворена рамка на разчитане от 307 аминокиселини (фигура 1; SEQ ID N0:3). Сигнална последователност от 2SEQ ID N0:1 се подсказва от анализа на Von Heijne (Von Heijne rt al., Nucleic Res. 14:14683 (1986)), и трансмембранна област обхващаща приблизително аа 235-257 означава, че 3-2 продуктът е повърхностен клетъчен протеин.
Последователност 1-7 сДНК (фигура 2; SEQ ID N0:2) съдържа отворена рамка на разчитане от 307 аминокиселини, която е идентична с отворената рамка на разчитане в 3-2 сДНК (SEQ ID N0:3). Последователност 4-7 сДНК (фигура 3; SEQ ID N0:4) съдържа отворена рамка на разчитане от 572 аминокиселини (SEQ ID N0:5). Трансмембранната област е локализирана приблизително при аминокиселини 501-521.
B) In situ анализ на 1-7, 3-2 и 4-7 mPHK в контралатерален и постисхемични бъбреци от възрастен плъх .
In situ хибридизация се осъществява съгласно метода, описан от Finch et al., Dev Dynamics 203:223-240,1995. Бързо и двата, исхемичният и контралатералният бъбрек, се фиксират е 4% параформалдехид в PBS. След това бъбреците се фиксират през нощта при 4°С. Парафинови срезове се депарафинизират и се хидратират отново, фиксират се с 4% параформалдехид в PBS, смилат се е протеиназа Н, отново се фиксират, след което се ацетилират с оцетен анхидрид в триетаноламин буфер. След това срезовете се дехидратират и се хибридизират с 32р_ маркирани рибопроби при 5 5 °C за цяла нощ, с 32р_маркирани проби, генерирани от 32 RD А или 1-7 RD А продукти субклонирани в BamHI сайт на pGEM-11Z. След хибридизация, срезовете се промиват при строги условия (2 х 88С, 50% формамид при 65°С). Срезовете се дехидратират накрая, покриват се с емулсия (NBT-2) за авторадиогафия и се експонират поне за една седмица. Сребърни зрънца се проявяват и срезовете се оцветяват за преброяване с толуидин блу и се микрофотографират.
Анализът на 1-7 и 3-2 mPHK експресията чрез in situ хибридизация показват, че тези ясни са силно ир-регулирани в повредените бъбречни клетки, в сравнение с тяхната експресия в нормалните бъбречни срезове. Показаната експресия е в регенеративни клетки от кортекса и външната медула, повечето от които изглежда са проксимални тубулни клетки.
Анализът in situ на 1-7 РНК модела на експресия също разкрива силна експресия на този гени в увредения исхемичен бъбрек в сравнение с нормален бъбрек от възрастно животно. Изглежда сайт на експресия са филтриращите клетки.
6) Изолиране на клон от човешка сДНК, който хибридизира кръстосано с 3-2 сДНК от плъх
Получават се32_ маркирани РДНК проби, съдържащи нуклеотиди 546-969 от инсерта на клон 3-2, показан на фигура 1 и се използват за скриниране па човешки ембрионален черен дроб ламбда gtlO сДНК библиотека (Clontech Catalog#HL5003a). 1 х 10* плаки се подлагат на скриниране с повторение, чрез използване на стандартни условия, както е описано по-го ре, но температурата при скринирането е 55°С. За промиването при строги условия, филтрите се промиват с 2 х SSC при 55°С. Идентифцирани са петдесет позитивни фага и плаките се пречистват. ДНК от фазите се подлагат на Southern анализ при използване на същите проби както по-горе. Southern блот филтърът се подлага на крайното промиване с 0,5 х SSC при 55°С. Два клона се идентифицират като позитивни. Интересът на клон Н13- 10-85 се подлага на секвениране и е открита област, която кодира за протеин с висока степен на идентичност с 3-2 протеина, показан на фигура 3.
Нуклеотидна последователност (SEQ ID N0:6) и предсказаните аминокиселинни последователности (SEQ ID N0:7) на човешки 32 свързан протеин са показани на фигура 4. Както се вижда от bestfit анализа, посочен на фигура 5, човешки 3-2 свързан протеин е 43,8% идентичен и 59,1% подобен на 3-2 протеина от плъх. И двата съдържат IgG, муцин, траисмембранни и цитоплазмични домени. Шестте цистеина в IgG домените на двата протеина са консервативни.
7) Продуциране на KIM-1 Ig слят протеин
Слят протеин на извънклетъчния домен на KIM и Fc областта на имуноглобулин (Ig) е полезно средство за изучаване на молекулярната и клетъчна биология на увреден/регенериран бъбрек и като терапевтична молекула. За продуциране на KIM Ig слят протеин с изъвънлетъчен домен от KIM-1, сДНК се амплифицира чрез PCR и се клонира в Biogen експресиоиен вектор рСА125, за временна експресия в COS клетки. Експресионният вектор рСА12 продуцира слят протеин, който притежава структура от ген, клониран при N-края и човешка Ig Fc област при С-края. COS клетките се трансфектират с плазмид SJR 1 03 или 1 04; тези плазмиди експресират слят протеин, който съдържа човешки KIM последователности 263-1147 (SEQ ID N0:6; SJR 103) или KIM последователности 599-1319 (SEQ ID N0:1; SJR 104) на извънклетъчния домен слят към човешка Ig Fc област. Клетките се култивират в 10% BS в DMEM в лаборатория за клетки (Nunc, Naperville, II). Два до три дни след трансфектирането се събира средата, концентрира се чрез Amicon концентратор и слетият протеин се пречиства чрез изпол14 зване на Protein-A Sepharose колона.
След пречистването чистотата на слетия протеин се измерва чрез SDS-PAGE.
Диагностична употреба на съединенията от изобретението
Анти-KIM антитела, съгласно изобретението, които специфично се свързват към протеина на SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7 или техни фрагменти са полезни при някои диагностични методи. Тези агенти могат да се бележат с маркери, които могат да се установят, като например флуороскопично или радиографично непрозрачни вещества, и да се приложат върху пациент, за да позволят онагледяването на тъканите, които експресират KIM протеин. Агентите могат, също така, да бъдат свързани към вещества, като пероксидаза от хрян, която може да се използва като имуноцитохимични багрила, което да позволява визуализирането на площите на клетките с положителен KIM протеин върху хистологични срезове. По този начин може самостоятелно да се използва специфично антитяло, и местата, в които то се свързва, се визуализират чрез сандвич метода, чрез използване на антиимуноглобулин антитяло, което е свързано към маркер, който може да се отчете.
Специфичните антитела към KIM протеина са полезни, също така, в имуноизследванията за измерване на присъствието на KIM или концентрацията в пробите от телесни тъкани и течности. Такива концентрации могат да се свържат с различни стадии на заболяване. Като вариант за изпълнение на изобретението от изключителен интерес, изобретението включва метод за диагностицираме на бъбречно увреждане или онагледяване на процес на бъбречно възстановяване, чрез измерване на концентрацията на KIM или фрагменти на KIM в урина, плазма или серум на пациент. Подобно, KIM може да се измери в утайката на урината, а по-точно в клетъчните отломки, на утайката на урината. Изхвърлените бъбречни тубулни клетки, които могат да присъстват в утайката на урината на пациенти с протичащи бъбречни заболявания, могат да съдържат завишени нива на KIM протеин и шРНК.
Специфични антитела за KIM протеина могат да се свържат, също така, към твърда повърхност, като перли или съдове, и да се използват за отстраняване на лиганда от разтвора, било то за измерване, или за пречис тване и охарактеризиране на протеина или неговите характерни качества (като посттранслационни модификации). Такова охарактеризиране на KIM протеина на пациента може да се окаже полезно при идентифициране на вредни мутанти или дефекти, които се застъпват с функциите на KIM и се свързват с ненормалните фенотипове на пациентите. Всяка една от тези техники е добре позната на специалистите в областта от имунологичната литература.
Допълнителни методи за онагледяване използват KIM или фрагменти на KIM, слят с части, които могат да се изобразят, за диагностично изобразяване на тъкани, които експресират KIM лиганди, а по-специално тумори.
Други диагностични техники се основават на ир-регулирането на KIM шРНК. в тъканите, като показател за свързани с увреждане процеси. Тази техника е тествана и приложима за работа в модел на исхемично нараняване в плъхове, както следва.
За да се определи дали се е покачило нивото на KIM-1 протеина след увреждане, се разграждат хомогенати от бъбрек на контралатерални и постисхемични бъбреци 24 и 48 h след 40-минутно стягане на бъбречната артерия и вена на единия бъбрек за всеки плъх. Бъбречният хомогенат се изследва за присъствие на KIM-1 протеин. Western блот анализът идентифицира три протеина, определени чрез две различни антитела след исхемично нараняване, които не могат да се установят в хомогенатите от контралатералните бъбреци, които не са изложени на исхемично нараняване. Явните молекулни тегла на ивиците са приблизително 40 kDa, 50 kDa и 70-80 kDa. Установените три вида протеини чрез western блотинг биха могли да представляват потенциални N или О свързани сайтове на гликозилиране. Фактът, че всеки от тези протеини реагира с два различни комплекта поликлонални антитела поддържа идеята, че те са свързани към KIM-1 и не са кръстосано реагиращи ивици. Потвърждението на това предсказание дойде от резултатите от частично CNBr разцепване на трите протеина, които разкриха, че те делят общи СНВг фрагменти на разцепване. Тъй като не е предсказано, че цитоплазматичният домен на KIM-1 съдържа каквато и да е голяма посттранслационна модификация, двата наймалки продукта от смилането (4,7 kDa и 7,4 kDa), определени c антитела срещу цитоплазматичния домен на KIM-1, би трябвало да са със същия размер за трите различни ивици на KIM-1 протеина, ако те произлизат от един и същ протеин. Наблюдаваме, че KIM-1 40 kDa и 70-80 kDa протеините носят фрагменти, които мигрират като предсказания размер. Смилането на ивицата на 50 kDa протеина дава също ивица на същия С-краен пептид.
KIM-1 последователността представя два предполагаеми сайта за N-гликозилиране и муцинов домен, където О-гликозилирането може да покрие полипептидната верига. Установените три KIM-1 ивици в постисхемичен бъбрек, могат да съответстват на гликозилирани варианти на същия протеин на сърцевината. De-Nгликозилиране на PNG-аза F води до преместване на всичките три ивици към по-ниско молекулно тегло, което съответства на загуба на около 3 kDa, което означава, че всичките три протеина са N-гликозилирани. Разликите при О-гликозилирането може да обясни разликите в размера на тези три ивици.
Терапевтична употреба на съединенията от изобретението
Терапевтичните методи от изобретението включват селективно спомагаме или инхибиране на клетъчните отговори, които зависят от KIM лигирането. Когато KIM и KIM лиганда са свързани мембаранно и двата, и се експресират от различни клетки, траисдукцията на сигнала може да се прояви в експресираща KIM клетка в KIM лиганд-експресираща клетка, или и двете.
KIM лигиране-бързо реагиращ отговор в KIM лиганд-експресиращи клетки може да се генерира при влизането на клетките в контакт с екзогенни KIM, KIM слята протеини или чрез активизиране на антитела срещу KIM лиганд, било то in vitro, или in vivo. По-нататък, отговорите на KIM лиганд-екпресираща клетка, която иначе щеше бързо да бъде задействана от ендогенен KIM, би могла да се блокира чрез влизането в контакт на KIM лиганд-екпресираща клетка с KIM лиганд антагонист (например, антитяло антагонист, което се свързва с KIM лиганд), или чрез влизането в контакт на ендогенния KIM с анти-KIM антитяло или друга свързваща KIM молекула, която предпазва действителното лигиране на KIM с KIM лиганда.
Подобно, отговорите, които се задействат от KIM лигиране в KIM експресираща клетка, могат за се спомогнат или да се инхибират от екзогенни съединения. KIM лигиране задействащият отговор в KIM експресиращата клетка може да се генерира чрез поставяне на клетката в контакт с разтворим KIM лиганд, или в някои анти-KIM активиращи антитела. По-нататък, отговорите на KIM експресираща клетка, която иначе щеше бързо да бъде задействана от взаимодействието с ендогенен KIM лиганд, би могла да се блокира чрез влизането в контакт на KIM експресираща клетка с един антагонист на KIM (например, блокиращо антитяло, което се свързва с KIM по начин, предотвратяващ действителното генериращо-сигнал KIM лигиране), или чрез влизането в контакт на ендогенния KIM лиганд с анти-лиганд антитяло или друга свързваща KIM лиганд молекула, която предпазва действителното лигиране на KIM с KIM лиганда.
Изборът на описаните начини на действие, който да е полезен за определено терапевтична употреба, зависи от проявения етиологичен механизъм или на патологичния процес, който трябва да бъде инхибиран, или от желания медицински процес, който трябва да бъде спомогнат, както става ясно на специалистите в областта на медицината. Например, когато KIM лигирането води до желан клетъчен растеж, под държане на диференцииран фенотип, устойчивост на апоптозис, индуциран от различни инсулти или други полезни от медицинска гледна точка отговори, може да се използва един от описаните начини на действие, спомагащ лигиране - задействащ отговор. Алтернативно, един от инхибиращите начини на действие може да е полезен, когато KIM лигиране се придружава от нежелани последствия, като неопластичеи растеж, вредна загуба на клетъчните функции, предразположение към апоптозис или спомагаме на възпалителни и състояния.
Следват примери за описаните терапевтични методи на изобретението. Едно терапевтично приложение на свързаните с KIM съединения съгласно изобретението е за лечение на субект с бъбречно заболяване, спомагаме растежа на нови тъкани в субекта или спома16 гане преживяването на наранената тъкан в субекта, и включва етапа на прилагане върху субекта на терапевтично ефективно количество от KIM протеин съгласно изобретението или на фармацевтичен състав, който включва протеин, съгласно изобретението. Използваният в тези методи протеин може да бъде фрагмент от KIM протеин в пълен размер, разтворим KIM лиганд протеин или слят фрагмент или KIM агонист. Тези методи могат, също така, да се практикуват чрез прилагане върху субекта на терапевтично ефективно количество антитяло агонист съгласно изобретението. KIM протеинът може да се прилага конкурентно с терапевтично ефективно количество второ съединение, което проявява терапевтично желан помощен ефект. Тъй като интересуващите ни тъкани за тези методи могат да включват каквато и да е тъкан, предпочитаните тъкани включват бъбречна тъкан, чернодробна, нервна тъкан, сърце, стомах, тънките черва, гръбначния мозък или бял дроб. Особени бъбречни състояния, които могат благоприятно да се лекуват със съединенията на изобретението, включват остра бъбречна недостатъчност, остър нефрит, хронична бъбречна недостатъчност, нефротичен синдром, дефекти на бъбречните тубули, бъбречни трансплантанти, токсични наранявания, хипоксично (с намалено съдържание на кислород) нараняване и травми. Дефектите на бъбречните тубули включват тези с наследствена или придобита същност, като например полицистично бъбречно заболяване, медуларно цистично заболяване и медуларен гъбест бъбрек. Този списък не е ограничен и може да включва още много други бъбречни нарушения (виж например, Medicin, 13th ed., 1994, което се включва тук за справка). Субект на методите може да бъде човек.
Терапевтична интервенция за инхибиране растежа на нежелана KIM лиганд-експресираща тъкан в пациент включва етапа на прилагане върху субекта на терапевтично ефективно количество KIM антагонист (например, антитяло антагонист, което може да се свърже към KIM лиганда), или чрез прилагане на терапевтично ефективно количество анти-KIM антитяло или друга KIM-свързваща молекула, която блокира свързването на KIM към KIM лиганд-експресиращата тъкан. В един вариант за изпълнение на изобретението, представляващ интерес, KIM антагониста или анти-KIM анти тялото може да се използва терапевтично за инхибиране или блокиране растежа на туморите, чийто растеж зависи от KIM протеина.
Други методи на изобретението включват убиване на KIM лиганд-експресиращи туморни клетки или инхибиране на растежа им чрез поставянето на клетките в контакт със слят протеин на KIM и токсин или радионуклеид, или анти-KIM лиганд антитяло конюгирано с токсин или радионуклеотид. Клетката може да е в пациента, а протеинът или конюгираното антитяло се прилага върху пациента.
В изобретението се включва също метод за насочване на токсин или радионуклеотид в клетка експресираща KIM, който метод включва привеждане на клетката в контакта със слят протеин, съдържащ KIM лиганд и токсин или радионуклеотид, или едно анти-KIM антитяло, конюгирано с токсин или с радионуклеотид. Друг вариант за изпълнение на изобретението включва премахване растежа на туморниата клетка, която експресира KIM, включващ привеждане на клетката в контакт със слят протеин на KIM лиганд и токсин или радионуклеотид или с анти-KIM антитяло, конюгирано с токсин или радионуклеотид; клетката може да е в субекта, и протеинът се прилага върху субекта.
Терминът “субект”, както се използва в описанието, се отнася до който и да е бозайник, на който може да се приложи KIM. Субектите, изключително подходящи за третиране по метода на изобретението, включват хора и нечовешки примати, овце, коне, рогат добитък, кози, прасета, кучета, котки, зайци, морски свинчета, хамстери, плъхове и мишки, както и органи, тумори и клетки, произлизащи от тези гостоприемници.
Използване на съединенията на изобретението при генната терапия
KIM гените съгласно изобретението се въвеждат в увредената тъкан или в тъкан, където е желана стимулация на растеж. Такава генна терапия стимулира продуцирането на KIM протеин от трансфектираните клетки, спомагайки клетъчния растеж и/или преживяването на клетките, които експресират KIM протеин.
В един специфичен вариант за изпълнение на метода на генна терапия, ген кодиращ за KIM протеин може да се въведе в бъбречната тъкан мишена. KIM протеинът ще се експресира стабилно и ще стимулира тъканния растеж, деленето или диференциацията, или би подсилил клетъчната преживяемост. KIM генът може, освен това, да се въведе в клетка мишена чрез използване на голям брой добре известни методи, при които се използва вирусна или невирусна основана стратегия.
Невирусните методи включват електропорация, мембранно сливане с липозоми, бомбардиране с висока скорост с микроснаряди, покрити с ДНК, инкубиране с калциево-фосфатна ДНК утайка, DEAE-декстран медиирана трансфекция и директно микроинжектиране в единични клетки. KIM ген може, например, да бъде въведен в клетка чрез калциево фосфатно ко-утаяване (Pillicer et al., Science, 209:14ΜΙ 422 (1980); механично микроинжектиране и/ или ускоряване на частици (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5399-54-3 (1980); основаващ се на липозоми ДНК трансфер (например, LIPOFECTIN-медиирано трансфектиране-Fefgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 471-477, 1987; Gao and Huang, Biophys. Res. Comm., 179: 280-285,1991; DEAE Dextran-медиирана трансфекция; електропорация (патент на US 4 956 288); или методи основаващи се на полилизина, при които ДНК се конюгира, така че ДНК за предпочитане да бъде доставена в чернодробните хепатоцити (Wilff et al., Science, 247: 465-468, 1990; Curiel et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992).
Клетки мишени могат да бъдат трансфектирани с гените на изобретението чрез директен генен трансфер. Виж например Wolff et al., “Direct Gene Transfer Into Moose Muscle in vivo”, Sciemce 247:1465-68,1990. В много случаи, вектор-медиираните трансфекции са желани. Може да се използва който и да е метод, известен от състоянието на техниката за инсериране на полинуклеотидни последователности във вектор (Виж например Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; и Ausbel te al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992, като и двата източника се включват тук за справка). Активирането на промотора може да бъде тъканно специфично или индуцируемо от метаболитен продукт или приложено съединение. Такива промотори/енхансери включват, на без да се ограничават до, нативен c-ret лиганд протеин промотор, цитомегаловирус непосредствен-бърз промотор/ енхансер (Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 1.3, 1989); бета-актиhob промотор (Guning et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:4831, 1987; глюкокортикоид-индуцируем промотор присъстващ в дългия краен повтор на миши туморен вирус на млечната жлеза (MMTV LTR) (Kiessig et al., Mol. Cell. Biol., 4: 1354, 1984); последователности на дълги крайни повтори на вируса на миша левкемия (MuL V LTR) (Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1995); SV40 ранен промотор на областта (Bemoist and Chambon, Nature, 290:304, 1981); промотор на вируса на Rous саркомата (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 22:787, 1980); тимидин киназен промотор на вируса на херпес симплекс (HSV) (Wagner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 3567, 1985).
KIM гените могат, също така, да бъдат въведени чрез специфични вирусни вектори за използване при системи на генен трансфер, които вече са добре утвърдени. Виж например: Medzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533-36, 1992 (паповавирус SV40); Berkner et al., Curr. Rop. Microbiol. Immunol., 158: 39-61, 1992 (аденовирус); Hofman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 10099-10103, 1995 (бакуловирус); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Ummunol., 158:25-38, 1992 (вакциния вирус); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123 (адено-асоцииран вирус); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93, 1992 (херпес симплекс вирус (HSV) и Epstein-Barr virus (HBV); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24, 1992 (ретровирус); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol. 4: 749754, 1984 (ретровирус); Miller et al., Nature, 357: 455-450. 1992 (ретровирус); Anderson, Science, 256: 808-813, 1992 (ретровирус); Current Protocols in Moleculdr Biology: Sections 9.10-9.14 (Ausubel et al., Eds.), Green Publishing Associcates, 1989, всички които са включени тук за справка.
Предпочитани вектори са ДНК-овите вируси, които включват аденовируси (за предпочитане вектор, основаващ се на вируса на херпес симплекс и паповавирус, за предпочитане “дефектен” или неавтономен паповавирус, по-предпочитано вектори на основата на адено-асоцииран вирус, още по-предпочитано вектори, базирани на AVV-2). Виж например, Ali et al., Gene Therapy 1: 365-384, 1994; патент па US 4 797 368 и 5 399 346, както и следващите разисквания.
Изборът на определена векторна система за трансфер, например, KIM последователност, ще зависи от голям брой фактори. Един важен фактор е естеството на популацията от клетки мишени. Въпреки че ретровирусните вектори нашироко са били изследвани и използвани в голям брой генно-терапевтичпи приложения, те не са подходящи за инфектиране на клетки, които не се делят, но могат да са използват в противораковата терапия, тъй като те само интегрират и експресират техните гени в реплициращите се клетки. Те са полезни при in vivo подход и са подходящи, в това отношение, поради факта на тяхното интегриране в генома на клетката мишена.
Аденовирусите са ДНК-ови вируси, които могат да бъдат модифицирани, така че ефикасно да доставят терапевтичен или репортер трансген на голямо разнообразие от типове клетки. Обикновените аденовируси тип 2 и 5 (Ad2 и Ad5, съответно), които причиняват дихателни заболявания при хората, са разработени най-общо за генна терапия на Duchenne мускулна атрофия (DMA) и цистична фиброза (CF). Ad2 както и Ad5 принадлежат на подклас аденовируси, които не са асоциирани към злокачествени заболявания при хора. Аденовирусните вектори са способни да доставят изключително високи нива на трансгени до практически всички видови клетки, без значение от миотичното състояние. Лесно могат да се генерират високи титри (103 плака образуваща единица/ml) на рекомбинантен вирус в 293 клетки (аденовирус-трансформирана, комплементарна ембрионална бъбречна клетъчна линия : ATCC CRL573) и могат да се съхраняват замразени за продължителни периоди без значителни загуби. Ефикасността на тази система при доставянето на терапевтичен трапезен in vivo, който допълва генетичния дисбаланс, е демонстрирана при животински модели с различни разстройства. Виж Watanabe, Athereoschlerosis, 36: 261-268, Tanzawa et al., FEBS Letters 118 (1): 81-84, 1980; Golasten et al., New Engl. J. Med. 309: 288-296, 1983; Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 92: 883-893, 1993; и Ishibshi et al., J. Clin. Invest.. 93: 18891893,1994, като всичките източници са включени тук за справка. Действително, рекомбинантни с дефектна репликация аденовируси кодиращи сДНК за трансмембранния регулатор на цистична фиброзна (CFTR) са били одобрени за използване при поне две човешки CF клинични изпитания. Виж например, Wilon, Nature, 365: 691-692, 1993. Друг факт в поддръжка на безопасността на рекомбинантните аденовируси за генна терапия е широкия опит да се поддържа жива аденовирусна ваксина в човешки популации.
Първото поколение рекомбинантни, с дефект в репликацията аденовируси, които са разработени за земна терапия на DMD и други наследствени нарушения, съдържат делеция на цялата Е1а и част от Elb областите. Този вирус с дефект в репликацията се култивира в 293 клетки, съдържащи функционален аденовирусен Е1а ген, който дава възможност за прехвърляне на Е1а протеина. Вируси с делеция на Е1а са способни да се реплицират и да продуцират инфекциозни вируси в 293 клетки, които предоставят генни продукти от Е1а и Elb областите в транс. Полученият вирус е способен да инфектира много типове клетки и може да експресира интродуцирания ген (при положение, че той носи собствен промотор), но не може да се реплицира в клетка, която не носи Е1 областта на ДНК, освен ако клетката не е инфектирана с много висока мултипленоет на инфекцията. Аденовирусите имат предимството, че притежават широк кръг гостоприемници, че могат да инфектират неподвижни или терминално диференциирани клетки, като например неврони, и че се явяват неонкогенни по същество. Аденовирусите изглежда не се интегрират в генома на гостоприемника. Рискът от инсерционеп мутагенез е силно намален поради факта, че те съществуват извънхромозомно. Ali et al., 373 (виж по-горе). Рекомбинантните аденовируси (rAdV) продуцират многото високи титри, вирусните частици са сравнително стабилни, нивата на експресия са високи, и могат да се инфектират широк кръг клетки. Техният естествен гостоприемник е въздухообменния епител, така че те са полезни за терапия на рак на белите дробове.
Бакуловирус-медиираният трансфер притежава някои предимства. Бакуловирусният генен трансфер може да се осъществи в реплициращи и нереплициращи клетки, както също и в бъбречни клетки, така както и в хепатоцити, нервни клетки, клетки на далака, на кожата и мускулите. Бакуловирус не се реплицира и не е патогенен в клетки на бозайни ци. При хората липсват предварително съществуващи антитела за рекомбинантни бакуловируси, които биха могли да блокират инфекцията. Бакуловирус е в състояние, освен това, да инкорпорира и да трансдуцира много големи ДНК инсерти.
Адено-асоциираните вируси (AW) също се използват като вектори за соматична генна терапия. AVV е малък, едноверижен (ss) ДНКов вирус с проста геномна организация (4-7 kb), което го прави идеален субстрат за генно инженерство. Две отворени рамки на разчитане кодират серии от гер и cap полипептиди. Rep полипептидите (гер78, гер68, и гер40) са въвлечени в репликацията, запазването и интегрирането на AVV генома. cap протеините (VP1, VP2 и VP3) образуват капсида на вириона. Заграждайки гер и cap отворените рамки на разчитане при 5' и 3' краищата, се намират 145Ьр обратни повтори (ITRs), първият 125 Ьр, от които е способен да образува Y- или Т-образни сдвоени конструкции. За развитието на AVV векторите е от значение целите гер и cap домени да могат да бъдат изрязани и заменени с терапевтичен или репортер трансген. Виж В. J. Carter, in Hanbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser,CRC Press, pp. 155-168 (1990). Показано е, че ITRs представлява минималната последователност, необходима за репликация, запазване, обвиване и интегриране на AVV генома.
Адено-асоциираните вируси (AVV) притежават значителен потенциал при генната терапия. Вирусните частици са много стабилни и рекомбинантите AVVs (rAAV) притежават “лекарствено-подобни” характеристики по това, че rAAV могат да се пречистят чрез утаяване или чрез свързване в градиент на CsCl. Те са термостабилни и могат да се лиофилизират до прахообразно състояние и да се рехидратират до пълна активност. Тяхната ДНК стабилно се интегрира в хромозомата на гостоприемника, така че експресията е дълготрайна. Те имат широк обхват от гостоприемници и AVV не причиняват познати заболявания, така че рекомбинантните вектори не са токсични.
След като веднъж са въведени в клетката мишена, интересуващите ни последователности могат да се идентифицират чрез конвенционнални методи, като например хибридизащш на нуклеинови киселини чрез използване на проби съдържащи последователности, ко ито са хомоложни/комплементарни на инсерираната генна последователност на вектора. Съгласно друг подход, последователностите могат да се идентифицират според присъствието или отсъствието на “маркерен” ген функция (например, тимидин киназна активност, устойчивост на антибиотик, и други подобни), причинена от въвеждането на експресионния вектор в клетката мишена.
Лекарствени форми и приложение
Съединенията съгласно изобретението се привеждат във вид на лекарствени форми съгласно стандартната практика, така както се приготвят и за носител вехикулум. Терминът “фармакологично приемлив носител” означава една или повече органични или неорганични съставки, естествени или синтетични, с които мутантният протоонкоген или мутантен онкопротеин се комбинира, за да се улесни неговото прилагане. Подходящи носители включват стерилен физиологичен разтвор, въпреки че на специалистите в областта са известни други водни или неводни изоточни стерилни разтвори и стерилни суспензии, за които е известно, че са фармацевтично приемливи носители. В този смисъл терминът “носител” включва липизоми и HIV-1 tat протеин (Виж: Chen et al., Anal. Biochem. 227: 168-175, 1995), така както и който и да е плазмид и вирусни екпресионни вектори.
Всеки от новите полипептиди от настоящото изобретение може да се използва под формата на фармацевтично приемлива сол. Подходящи киселини и бази, които са способни да образуват соли с полипептида от настоящото изобретение, са добре известни на специалистите в областта, и включват неорганични и органични киселини и основи.
Съединение съгласно изобретението се прилага върху субект в терапевтично-ефективно количество, което означава такова количество от съединението, което причинява желан медицински резултат или упражнява влияние върху определеното състояние, което се третира. Ефективно количество от съединението на изобретението е способно да подобри или да забави развитието на болестното, дегенеративно или увредено състояние. Ефективното количество може да се определи на индивидуална основа и ще се основава, отчасти, върху наблюденията на лекуващия лекар на субекта, симптомите, които трябва да се третират и постигнатите резултати. Ефективното количество може да се определи от всеки специалист в областта, чрез прилагане на такива фактори и при използване на повече рутинни експерименти.
Липозомната система за доставка на съединение от изобретението може да е който и да е от голямото разнообразие еднослойни везикули, стабилни многослойни везикули, и може да се приготви и да се прилага съгласно методи, добре известни на специалистите в областта, например, съгласно посоченото в US 5 169 637, 4 762 915, 5 000 958 или 5 185 154. Освен това може да се окаже желателно да се експресира новият пептид на изобретението, така както и други избрани полипептиди, като липопротеини, е цел да се засили тяхното прикрепяне към липозомите. Като пример може да се осъществи in vivo третиране на остра бъбречна недостатъчност с капсулиран в липозом KIM протеин, в клетки, които се нуждаят от такова лечение чрез липозоми. Липозомите могат да се доставят до бъбречната артерия чрез катетър. Рекомбинантният KJM протеин се пречиства, например, от СНС клетки чрез имуноафинитетна хроматография или който и да друг подходящ метод, след което се смесва с липозомите и се инкорпорира в тях при висока ефикасност. Инкапсулираният протеин може да се тества in vivo за какъвто и да ефект на стимулиране на клетъчния растеж.
Съединенията съгласно изобретението могат да се прилагат по какъвто и да е медицинско приемлив начин. Това може да включва инжектиране, по парантерален път, като интравенозно, интраваскуларно, интрапарентерално, подкожно, мускулно, интратуморно, интраперитонеално, интравентрикуларно, интраепидурално или друго, така както и орално, назално, офталмично, ректално или локално. Прилагането със забавено действие също се включва специфично в изобретението, по такива начини като инжекции с депо действие, или ерозивни импланти. Локализираното доставяне е изключително подходящо, чрез такива начини за доставяне чрез катетър до една или две артерии, като например бъбречната артерия или мехур, подпомагащ локализацията на тумора.
Въпреки, че изобретението е описано в детайли, за да илюстрира и като пример с цел по-ясно разбиране, на специалистите в областта ще бъде ясно, че могат да се наложат промени и модификации в обхвата на изобретението, който единствено се ограничава от обхвата на прилежащите патентни претенции.
Списък на последователностите (1) Обща информация:
(1) заявител: Michele Sanicola-Nadel Joseph V. Bonventura
Catherine A. Hession Takaharu Ichimura Henry Wei Richard L. Cate (ii) заглавие на изобретението: Модулатори на тъканна регенерация (iii) брой на последователностите: 7 (iv) адрес за кореспонденция:
(A) адрес: Biogen, Inc.
(B) улица: 14 Cambridge Center (C) град: Cambridge (D) щат: МА (E) страна: USA (F) код ZIP: 02142 (ν) компютърна форма за разчитане:
(A) тип на средата: флопи диск (B) компютър: IBM PC съвместим (C) операционно система: PC-DPS/MSDOS (D) програмен продукт: Patentin Release # 1.0, версия # 1.30 (vi) данни за настоящата заявка:
(A) номер на заявката:
(B) датата на заявяване: 23.05.1997 (C) класификация (vii) данни за предшестващи заявки:
(A) номер на заявката: US 60/018 228 (B) датата на заявяване: 24.05.1996 (viii) данни за патентния представител:
(A) име: Levine, Leslie Μ.
(B) регистрационен номер: 35 245 (C) справка: А010 РСТ CIP (ix) телекомуникационна информация:
(A) телефон: (617) 679-2810 (B) факс: (617) 679-2838 (2) информация за SEQ ID NO: 1:
(i) характеристики на последователността:
(A) дължина : 2566 базови двойки (B) тип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (А) топология: линейна (ii) тип на молекулата: сДНК (ix) характеристики:
(A) име/ключ: CDS (B) локализация: 615..1535 (xi) описание на последователността: SEQ ID N0:1:
(2) информация за SEQ ID N0:2:
(1) характеристики на последователност- та:
(A) дължина: 2084 базови двойки (B) тип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (й) тип на молекулата: сДНК (ix) характеристики:
(A) име/ключ: CDS (B) локализация: 145.. 1065 (xi) описание на последователността: SEQ ID N0:2:
(2) информация за SEQ ID N0:3:
(1) характеристики на последователността (A) дължина: 307 базови двойки (B) тип: аминокиселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (й) тип на молекулата: протеин (xi) описание на последователността: SEQ ID N0:3:
(2) информация за SEQ ID N0:4:
(i) характеристики на последователност- та:
(A) дължина: 2303 базови двойки (B) тип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) топология: линейна (й) тип на молекулата: сДНК (ix) характеристики:
(A) име/ключ: CDS (B) локализация: 107.. 1822 (xi) описание на последователността: SEQIDN0:4:
(2) информация за SEQ ID N0:5:
(1) характеристики на последователност- та:
(A) дължина: 572 аминокиселини (B) тип: аминокиселина (В) топология: линейна (й) тип на молекулата: протеин (xi) описание на последователността: SEQIDNO:1:
(2) информация за SEQ ID N0:6:
(1) характеристики на последователност- та:
(A) дължина: 1795 базови двойки (B) тип: нуклеинова киселина (C) верижност: единична (D) тополовия: линейна (й) тип на молекулата: сДНК (ix) характеристики:
(A) име/ключ: CDS (B) локализация: 278.. 1279 (xi) описание на последователността: SEQ ID N0:6:
(2) информация за SEQ ID N0:7:
(i) характеристики на последователност- та:
(A) дължина: 334 аминокиселини (B) тип: аминокиселина (D) топология: линейна (й) тип на молекулата: протеин (xi) описание на последователността: SEQ ID N0:7:
TTG ACA ATA GAG AAC TCT GTT GAT AGT GAT AGT GGT CTG TAT TGT TGC 938
Leu Thr Xie Glu Asn Ser Val Asp Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Cys 105 Cys
95 100
CC A GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG ACC TTT TCA 986
Arg Val Glu Xie Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met Thr Phe Ser
110 115 120
TTG GAA GTT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA AGA CCC ACA 1034
Leu Glu Val Lys Pro Glu He Pro Thr Ser Pro Pro Thr Arg Pro Thr
125 130 135 140 , A ”·· ..Zt
ACT ACA AGA CCC ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA ACA AGA TCC ’ 1082“
Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr He Ser Thr Arg Ser
145 150 155
ACA CAT GTA CCA ACA TCA ACC AGA GTC TCC ACC TCT ACT CCA ACA CCA 1130
Thr His Val Pro Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro
160 165 170
GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC лст ACA TTT TAT GCC CAT 1178
Glu Gin Thr Gin Thr His Lys Pro Glu lie Thr Thr Phe Tyr Ala His
175 180 185
GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT CCT GCA GAC 1226
Glu Thr Thr Ala Glu Val Thr Glu Thr Pro Ser Tyr Thr Pro Ala Asp
190 195 200
TGG AAT GGC ACT GTG ACA TCC TCA GAG GAG GCC TGG AAT AAT CAC ACT 1274
Trp Asn Gly Thr Val Thr Ser Ser Glu Glu Ala Trp Asn Asn His Thr
205 210 215 220
GTA AGA ATC CCT TTG AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT AAG GGC TTC 1322
Val Arg Xie Pro Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn Pro Thr Lys Gly Phe
I' 225 230 235
TAT 4 GTT GGC ATG TCC GTT GCA GCC CTG CTG CTG CTG CTG CTT GCG AGC 1370
Tyr Val Gly Met Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser
1 240 24S 250
ACC GTG GTT GTC ACC AGG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAG ATG GGC TCT 1418
Thr Val Val Val • Thr Arg Tyr Xie lie lie Arg Lys Lys Met Gly Ser
255 260 265
CTG AGC TTT GTT GCC TTC CAT GTC TCT AAG AGT AGA GCT TTG CAG AAC 1466
Leu Ser Phe Val Ala Phe His Val Ser Lys Ser Arg Ala Leu Gin Asn
270 275 280
GCA GCG ATT GTG CAT CCC CGA GCT GAA GAC AAC ATC TAC ATT ATT GAA 1514
J 4« Ala Xie Val His Pro Arg Ala Glu Asp Asn He Tyr He Xie Glu
285 290 295 300
GAT AGA TCT CGA GGT GCA GAA TGAGTCCCAG AGGCCTTCTG TGGGGCCTTC Asp Arg Ser Arg Gly Ala Glu
30S
1565
TGCCTGGGAT TACAGAGATC GTGACTGATT TCACAGAGTA AAATACCCAT TCCAGCTCCT 1625
GGGAGATTTT GTGTTTTGGT TCTTCCAGCT GCAGTGGAGA GGGTAACCCT CTACCCTGTA 1685
TATGCAAAAC TCGAGGTTAA CATCATCCTA ATTCTTGTAT CAGCAACACC TCAGTGTCTC 1745
CACTCACTGC AGCGATTCTC TCAAATGTGA ACATTTTAGA AGTTTGTGTT TCCTTTTGTC 1805
CATGTAATCA TTGGTAATAC AAGAATTTTA TCTTGTTTAT TAAAACCATT AATGAGAGGG 1865
GAATAGGAAT TAAAAGCTGG TGGGAAGGGC CTCCTGAATT TAGAAGCACT TCATGATTGT 1925
GTTTATCTCT TTTATTGTAA TTTGAAATGT TACTTCTATC CTTCCCAAGG GGCAAAATCA · 1985
TGGGAGCATG GAGGTTTTAA TTGCCCTCAT AGATAAGTAG AAGAAGAGAG TCTAATGCCA 2045
CCAATAGAGG TGGTTATGCT TTCTCACAGC TCTGGAAATA TGATCATTTA TTATGCAGTT 2105
GATCTTAGGA TGAGGATGGG TTTCTTAGGA GGAGAGGTTA CCATGGTGAG TGGACCAGGC 2165
ACACATCAGG GGAAGAAAAC AATGGATCAA GGGATTGAGT TCATTAGAGC CAT iTCCACT 2225
CCACTTCTGT CTTGATGCTC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG AATTAGGTGC 2285
AGGGAGGAGA CGTGCAGAAA CGAAAGAGGA AAGAAAGGAG AGAGAGCAGG ACACAGGCTT 2345
TCTGCTGAGA 1 GAAGTCCTAT TGCAGGTGTG ACAGTGTTTG GGACTACCAC GGGTTTCCTT 2405
CAGACTTCTA AGTTTCTAAA TCACTATCAT GTGATCATAT. TTATTTTTAA AATTATTTCA 2465
GAAAGACACC ACATTTTCAA TAATAAATCA GTTTGTCACA ATTAATAAAA TATTTTGTTT 2525
GCTAAGAAGT AAAAAAAAAA AAAAAAAGTC GACGCGGCCG C 2566
(2) INFORMATION FOR SEQ.ID N0:2:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2*084 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 145..1065 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:2:
GCGGCCGCGT CGACGGTGCC TGTGAGTAAA TAGATCAGGG TCTCCTTCAC AGCACATTCT
CCAGGAAGCC GAGCAAACAT TAGTGCTATT TTACCCAGGA GGAAATCTAG GTGTAGAGAG 120
CTCTACGGAT CTAAGGTCAA CACC ATG GTT CAA CTT CAA GTC TTC ATT TCA Met Vai Gin Leu Gin Vai Phe lie Ser
171
GGC CTC CTG CTG CTT CTT Leu Leu Leu 15 CCA GGC TCT GTA GAT TCT TAT GAA GTA GTG 219
Gly 10 Leu Leu Pro Gly Ser Vai Asp 20 Ser Tyr Glu Val Val 25
AAG GGG GTG GTG GGT CAC CCT GTC ACA ATT CCA TGT ACT TAC TCA ACA 267
Lys Gly Vai Vai Gly His Pro Vai Thr lie Pro Cys Thr Tyr Ser Thr
30 35 40 •
CGT GGA GGA ATC ACA ACG ACA TGT TQG GGC CGG GGG CAA TGC CCA TAT 315
Arg Gly Gly lie Thr Thr Thr Cys Trp Gly Arg Gly Gin Cys Pro Tyr
45 50 55
TCT AGT TGT CAA AAT ATA CTT ATT TGG ACC AAT GGA TAC CAA GTC ACC 363
Ser Ser Cys Gin Asn lie Leu Xie Trp Thr Asn Gly Tyr Gin Val Thr
1 . 60 65 70
TAT CGG AGC AGC GGT CGA TAC AAC ATA AAG Ggg CGT ATT TCA GAA GGA 411
Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Asn Xie Lys Gly Arg lie Ser Glu Gly
75 80 85
GAC GTA TCC TTG ACA ATA GAG AAC TCT GTT GAT AGT GAT AGT GGT CTG 4S9
Asp Vai Ser Leu Thr Xie Glu Asn Ser val Asp Ser Asp Ser Gly Leu
90 95 100 105
TAT TGT TGC CGA GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG S07
Tyr Cys Cys Arg Vai Glu He Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met
110 115 120
ACC TTT TCA TTG GAA GTT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA 555
Ttir Phe Ser Leu Glu Vai Lys Pro Glu Xie Pro Thr Ser Pro Pro Thr
1 1 125 . 130 135
AGA CCC ACA ACT ACA AGA CCC ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA 603
Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr 'Arg Pro Thr Thr He Ser
140 • 145 150
ACA AGA TCC ACA CAT GTA CCA ACA TCA ACC AGA GTC TCC ACC TCT ACT 651
Thr Arg Ser Thr His Vai Pro Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr
155 160 165
CCA ACA CCA GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC ACT ACA TTT 699
Pro Thr Pro Glu Gin Thr Gin Thr His Lys Pro Glu lie Thr Thr Phe
170 175 180 185
TAT GCC CAT GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT 747
Tyr Ala His G1U Thr Thr Ala Glu Vai Thr Glu Thr Pro Ser Tyr Thr
190 195 200
CCT GCA GAC TGG AAT GGC ACT GTG ACA TCC TCA GAG GAG GCC TGG AAT 79S
Pro Ala Asp Trp Asn Gly Thr Val Thr Ser 210 Ser Glu Glu Ala 215 Trp Asn
205
AAT CAC ACT GTA AGA ATC CCT TTG AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT 843
Asn His Thr Val Arg lie Pro Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn Pro Thr
220 225 230
AAG GGC TTC TAT GTT GGC ATG TCC GTT GCA GCC CTG CTG CTG CTG CTG 891
iys Gly Phe Tyr Val Gly Met Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu
235 24 0 245
CTT GCG AGC ACC GTG GTT GTC ACC AGG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAG 939
Leu Ala Ser Thr Val Val Val Thr Arg Tyr He Tie lie Arg Lys Lys
250 255 260 265
pro GGC TCT CTG AGC TTT GTT GCC TTC CAT GTC TCT AAG AGT AGA GCT 987
Met Gly Ser Leu Ser Phe Val Ala Phe His Val Ser Lys Ser Arg Ala
270 275 280
TTG CAG AAC GCA GCG ATT GTG CAT CCC CG« GCT GAA GAC AAC ATC TAC 1035
Leu Gin Asn Ala Ala lie Val His Pro Arg Ala Glu Asp Asn lie Tyr
285 290 295
ATT ATT GAA GAT AGA TCT CGA GGT GCA GAA TGAGTCCCAG . AGGCCTTCTG 1085
lie lie G1U Asp Arg Ser Arg Gly Ala Glu
I 300 305
TGGGGCCTTC TGCCTGGGAT TACAGAGATC GTGACTGATT TCACAGAGTA AAATACCCAT 1145
TCCAGCTCCT GGGAGATTTT GTGTTTTGGT TCTTCCAGCT GCAGTGGAGA GGGTAACCCT 1205
CTACCCTGTA TATGCAAAAC TCGAGGTTAA CATCATCCTA ATTCTTGTAT CAGCAACACC 1265
TCAGTGTCTC CACTCACTGC AGCGATTCTC TCAAATGTGA ACATTTTAGA AGTTTGTGTT 1325,
TCCTTTTGTC CATGTAATCA TTGGTAATAC AAGAATTTTA TCTTGTTTAT TAAAACCATT 1385
AATGAGAGGG GAATAGGAAT TAAAAGCTGG TGGGAAGGGC CTCCTGAATT TAGAAGCACT 1445
TCATGATTGT GTTTATCTCT TTTATTGTAA TTTGAAATGT TACTTCTATC CTTCCCAAGG 1505
GGCAAAATCA TGGGAGCATG GAGGTTTTAA TTGCCCTCAT AGATAAGTAG AAGAAGAGAG 1565
TCTAATGCCA CCAATAGAGG TGGTTATGCT TTCTCACAGC TCTGGAAATA TGATCATTTA 1625
TTATGCAGTT GATCTTAGGA TGAGGATGGG TTTCTTAGGA GGAGAGGTTA CCATGGTGAG 1685
TGGACCAGGC ACACATCAGG GGAAGAAAAC AATGGATCAA GGGATTGAGT TCATTAGAGC 1745
CATTTCCACT CCACTTCTGT CTTGATGCTC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG 1805
AATTAGGTGC AGGGAGGAGA CGTGCAGAAA CGAAAGAGGA AAGAAAGGAG AGAGAGCAGG 1865
ACACAGGCTT TCTGCTGAGA GAAGTCCTAT TGCAGGTGTG ACAGTGTTTG GGACTACCAC 1925
GGGTTTCCTT CAGACTTCTA AGTTTCTAAA TCACTATCAT GTGATCATAT TTATTTTTAA 1985
AATTATTTCA GAAAGACACC ACATTTTCAA TAATAAATCA GTTTGTCACA ATTAATAAAA 2045
TATTTTGTTT GCTAAGAAGT AAAAAGTCGA CGCGGCCGC 2084
(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:3:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 307 amino acids (B> TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: Linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:3:
Met Val Gin Leu Gin Val Phe lie Ser Gly 10 Leu Leu Leu Leu Leu 15 Pro
1 5
Gly Ser Val Asp Ser Tyr Glu Val Val Lys Gly Val Val Gly His Pro
20 25 30
Val Thr He Pro Cys Thr Tyr Ser Thr Arg Gly Gly lie Thr Thr Thr
35 40 45
Cys Trp Gly Arg Gly Gin Cys Pro Tyr Ser Ser Cys Gin Asn lie Leu
50 55 60
He Trp Thr Asn Gly Tyr Gin Val Thr Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Tyr
65 1 70 75 80
Asn lie Lys Gly Arg He Ser Glu Gly Asp Val Ser Leu Thr He Glu
85 90 95
Asn Ser Val Asp Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Arg Val Glu He
100 105 110
Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met Thr Λ Phe Ser Leu Glu Val Lys
115 120 * 125
Pro Glu He Pro Thr Ser Pro Pro Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro
130 135 140
Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr He Ser Thr Arg Ser Thr His Val Pro
145 150 155 160
Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro Glu Gin Thr Gin
165 170 175
Thr His Lys Pro Glu He Thr Thr Phe Tyr Ala His Glu Thr Thr Ala
180 185 190
Glu Val Thr Glu Thr Pro Ser Tyr 200 Thr Pro Ala Asp Trp 205 Asn Gly Thr
195
Val Thr Ser Ser Glu Glu Ala Trp Asn Asn His Thr Val Arg He Pro
210 215 220
Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn Pro Thr Lys Gly Phe Tyr Val Gly Met
225 230 235 240
Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Thr Val Val Val
245 250 255
Thr Arg Tyr He Xie lie Arg Lys Lys Met Gly Ser Leu Ser Phe Val
260 265 270
Ala Phe His Val Ser Lys Ser Arg Ala Leu Gin Asn Ala Ala lie Val
275 280 2B5
His Pro Arg Ala Glu Asp Asn lie Tyr lie lie Glu Asp Arg Ser Arg
290 295 300
Gly Ala Glu
305 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:4:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2303 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear - (ii) MOLECULE TYPE: CDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION:*107..1822 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:4:
GCGGCCGCGT CGACTCGCAG GAGGCCGGCA CTCTGACTCC TGGTGGATGG GACTAGGGAG
TCAGAGTCAA GCCCTGACTG GCTGAGGGCG GGCGCTCCGA GTCAGC ATG GAA AGT Met Glu Ser 1
115
CTC TGC GGG GTC Leu Cys Gly Val 5 CTG GTA TTT CTG Phe Leu 10 CTG CTG GCT GCA GGA CTG CCG Pro CTC Leu 163
Leu Val Leu Leu Ala Ala 15 Gly Leu
CAG GCG GCC AAG CGG TTC CGT:gat GTG CTG GGC CAT GAG CAG TAT CCG 211
Gin Ala Ala Lys Arg Phe Arg Asp Val Leu Gly His Glu Gin Tyr Pro
20 25 30 35
GAT CAC ATG AGG GAG AAC AAC CAA TTA CGT GGC TGG TCT TCA GAT GAA Glu 259
Asp His Met Arg Glu 40 Asn Asn Gin Leu Arg 45 Gly Trp Ser Ser Asp 50
AAT GAA TGG GAT GAA CAG CTG TAT CCA GTG TGG AGG AGG GGA GAG GGC 307
Asn Glu Trp Asp Glu Gin Leu Tyr Pro Val Trp Arg Arg Gly Glu Gly
55 60 65
AGA TGG AAG GAC TCC TGG GAA GGA GGC CGT GTG CAG GCA GCC CTA ACC 355
Arg Trp Lys Asp Ser Trp Glu Gly Gly Arg Val Gin Ala Ala Leu Thr
70 75 80
AGT GAT TCA CCG GCC TTG GTG GGT TCC AAT ATC ACC TTC GTA GTG AAC 403
s^r Asp Ser Pro Ala Leu Val Gly Ser Asn Xie Thr Phe Val Val Asn
I 85 90 95
CTG GTG TTC CCC AGA TGC CAG AAG GAA GAT GCC AAC GGC AAT ATC GTC 451
Leu Val Phe Pro Arg Cys Gin Lys Glu Asp Ala Asn Gly Asn Xie Val
100 105 110 115
TAT GAG AGG AAC TGC AGA AGT GAT TTG GAG CTG GCT TCT GAC CCG TAT 499
Tyr Glu Arg Asn Cys Arg Ser Asp Leu Glu Leu Ala Ser Asp Pro Tyr
120 125 130
GTC TAC AAC TGG ACC ACA GGG GCA GAC GAT GAG GAC TGG GAA GAC AGC 547
Val Tyr Asn Trp Thr Thr Gly Ala Asp Asp Glu Asp Trp Glu Asp Ser
135 140 145
ACC AGC CAA GGC CAG CAC CTC AGG TTC CCC GAC GGG AAG CCC TTC CCT 595
Thr Ser Gin Gly Gin His Leu Arg Phe Pro Asp Gly Lys Pro Phe Pro
150 155 160
CGC CCC CAC GGA CGG AAG AAA TGG AAC TTC GTC TAC GTC TTC CAC ACA 643
Arg Pro His Gly Arg Lys Lys Trp Asn Phe Val Tyr Val Phe His Thr
165 170 175
CTT GGT CAG TAT TTT CAA AAG CTG GGT CGG TGT TCA GCA CGA GTT TCT 691
Leu Gly Gin Tyr Phe Gin Lys Leu Gly Arg .Cys Ser Ala Arg Val Ser
180 185 190 195
ATA AAC ACA GTC AAC TTG ACA GTT GGC CCT CAG GTC ATG GAA GTG ATT 739
lie Asn Thr Val Asn Leu Thr Val Gly Pro Gin Val Met Glu Val lie
' 200 205 210
GTC TTT CGA AGA CAC GGC CGG GCA TAC ATT CCC ATC TCC AAA GTG AAA 787
Val Phe Arg Arg His Gly Arg Ala Tyr Xie Pro Xie Ser Lys Val Lys
215 220 225
GAC GTG TAT GTG ATA ACA GAT CAG ATC CCT ATA TTC GTG ACC ATG TAC 835
Asp Val Tyr Val Xie Thr Asp Gin He Pro Xie Phe Val Thr Met Tyr
230 235 240
CAG AAG AAT GAC CGG AAC TCG TCT GAT GAA ACC TTC CTC AGA GAC CTC 883
Gin Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu Arg Asp Leu
245 250 255
ССС Pro 260 ATT TTC TTC GAT GTC CTC ATT CAC GAT CCC AGT CAT TTC CTC AAC 931
lie Phe Phe Asp Val 265 Leu Xie His Asp Pro 270 Ser His Phe Leu Asn 275
TAC TCT GCC ATT TCC TAC AAG TGG AAC TTT GGG GAC AAC ACT GGC CTG 979
Tyr jSer Ala lie Ser Tyr Lys Trp Asn Phe Gly Asp Asn Thr Gly Leu
280 285 290
TTT GTC TCC AAC AAT CAC ACT TTG AAT CAC ACG TAT GTG CTC AAT GGA 1027
Phe Val Ser Asn Asn His Thr Leu Asn His Thr Tyr Val Leu Asn Gly
295 300 305
ACC TTC AAC TTT AAC CTC ACC GTG CAA ACT GCA GTG CCO GGA CCA TGC 1075
Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val Gin Thr Ala Val Pro Gly Pro Cys
310 315 320
CCC TCA CCC ACA CCT TCG CCT TCT TCT TCG ACT TCT CCT TCG CCT GCA 1123
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser Pro Ala
325 330 335
TCT TCG CCT TCA CCC ACA TTA TCA ACA CCT AGT CCC TCT TTA ATG CCT 1171
Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro Ser Leu Met Pro
340 345 350 355
ACT GGC CAC AAA TCC ATG GAG CTG AGT GAC ATT TCC AAT GAA AAC TGC 1219
Thr Gly His Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp lie Ser Asn Glu Asn Cys
360 365 370
CGA ATA AAC AGA TAT GGT TAC TTC AGA GCC ACC ATC ACA ATT GTA GAT 1267
Arg He Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Ala Thr lie Thr He Val Asp
375 380 385
GGA ATC CTA GAA GTC AAC ATC ATC CAG GTA GCA GAT GTC CCA ATC CCC 1315
Gly Xie Leu Glu Val Asn Xie .lie Gin Val Ala Asp Val Pro lie Pro
390 395 400
ACA CCG CAG CCT GAC AAC •TCA CTG ATG GAC TTC ATT GTG ACC TGC AAA 1363
Thr Pro Gin Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe He Val Thr Cys Lys
405 410 * 415
GGG GCC ACT CCC ACG GAA GCC TGT ACG ATC ATC TCT GAC CCC ACC TGC 1411
Gly Ala Thr Pro Thr Glu Ala Cys Thr Xie lie Ser Asp Pro Thr Cys
'420 425 430 435
CAG ATC GCC CAG AAC AGG GTG TGC AGC CCG GTG GCT GTG GAT GAG CTG 1459
Gin Xie Ala Gin Asn Arg Val Cys Ser Pro Val Ala Val Asp Glu Leu
440 445 450
TGC CTC CTG TCC GTG AGG AGA GCC TTC AAT GGG TCC GGC ACG TAC TGT 1507
Cys Leu Leu Ser Val Arg Arg Ala Phe Asn Gly Ser Gly Thr Tyr Cys
455 460 465
GTG AAT TTC ACT CTG GGA GAC GAT GCA AGC CTG GCC CTC ACC AGC GCC 1555
Val Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Ala Ser Leu Ala Leu Thr Ser Ala
470 475 480
CTG ATC Leu lie 485 TCT ATC CCT GGC AAA GAC CTA GGC TCC CCT CTG AGA ACA GTG 1603
Ser lie Pro Gly Lys 490 Asp Leu Gly Ser Pro 495 Leu Arg Thr Val
AAT GGT GTC CTG ATC TCC ATT GGC TGC CTG GCC ATG TTT GTC ACC ATG 1651
Asn Gly Val Leu He Ser He Gly Cys Leu Ala Met Phe Val Thr Met
500 505 510 515
GTT ACC ATC TTG CTG TAC AAA AAA CAC AAG ACG TAC AAG CCA ATA GGA 1699
Val Thr He Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Thr Tyr Lys Pro He Gly
520 525 530
AAC TGC ACC AGG AAC GTG GTC AAG GGC AAA GGC CTG AGT GTT TTT CTC - 1747
Asn Cys Thr Arg Asn Val Val Lys Gly Lys Gly Leu Ser Val Phe Leu
535 540 545
AGC CAT GCA AAA GCC CCG TTC TCC CGA GGA GAC CGG GAG AAG GAT CCA 1795
Ser His Ala Lys Ala Pro Phe Ser Arg Gly Asp Arg Glu Lys Asp Pro
550 555 560
•CTG CTC CAG GAC AAG CCA TGG ATG CTC TAAGTCTTCA ' CTCTCACTTC 1842
Leu Leu Gin Asp Lys Pro Trp Met Leu
565 570
TGACTGGGAA CCCACTCTTC TGTGCATGTA TGTGAGCTGT GCAGAAGTAC ATGACTGGTA 1902
GCTGTTGTTT TCTACGGATT ATTGTAAAAT GTATATCATG GTTTAGGGAG CGTAGTTAAT 1962
TGGCATTTTA GTGAAGGGAT GGGAAGACAG TATTTCTTCA CATCTGTATT GTGGTTTTTA 2022
TACTGTTAAT AGGGTGGGCA CATTGTGTCT GAAGGGGGAG GGGGAGGTCA CTGCTACTTA 2082
AGGTCCTAGG TTAACTGGGA GAGGATGCCC CAGGCTCCTT AGATTTCTAC ACAAGATGTG 2142
CCTGAACCCA GCTAGTCCTG ACCTAAAGGC CATGCTTCAT CAACTCTATC TCAGCTCATT 2202
GAACATACCT GAGCACCTGA TGGAATTATA ATGGAACCAA GCTTGTTGTA TGGTGTGTGT 2262
GTGTACATAA GATACTCATT AAAAAGACAG ТСТАТТДААА A 2303
(2) INFORMATION, FOR SEQ ID N0:5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 572 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:5:
Met Glu Ser Leu Cys Gly Val Leu Val Phe Leu Leu Leu Ala Ala Gly
10 15
Leu Pro Leu Gin Ala Ala Lys Arg Phe Arg Asp Val Leu Gly His Glu
20 25 30
Gin Tyr Pro Asp His Met Arg Glu Asn Asn Gin Leu Arg Gly Trp Ser
35 40 45
Ser Asp Glu Asn Glu Trp Asp Glu Gin Leu Tyr Pro Val Trp Arg Arg
50 55 60
Gly Glu Gly Arg Trp Lys Asp Ser Trp Glu Gly Gly Arg Val Gin Ala
65 70 75 80
Ala Leu Thr Ser Asp Ser Pro Ala Leu Val Gly Ser Asn He Thr Phe
85 90 9S
Val Val Asn Leu Val Phe Pro Arg Cys Gin Lys Glu Asp Ala Asn Gly
100 105 110
.Asn lie Val Tyr Glu Arg Asn Cys Arg Ser Asp Leu Glu Leu Ala Ser
115 120 125
Asp Pro Tyr Val Tyr Asn Trp Thr Thr Gly Ala Asp Asp Glu Asp Trp
130 135 140
Glu Asp Ser Thr Ser Gin Gly Gin His Leu Arg Phe Pro Asp Gly Lys
145 150 155 160
Pro Phe Pro Arg Pro His Gly Arg Lys Lys Trp Asn Phe Val Tyr Val
165 170 175
Phe His Thr Leu Gly Gin Tyr Phe Gin Lys Leu Gly Arg Cys Ser Ala
180 185 190
Arg Val Ser lie Asn Thr Val Asn Leu Thr Val Gly Pro Gin Val Met
195 200 205
Glu Val He Val Phe Arg Arg His Gly Arg Alar Tyr He Pro Xie Ser
210 215 220
* Lys Val Lys Asp Val. Tyr Val He Thr Asp Gin He Pro Xie Phe Val
225 230 235 240
Thr Met Tyr Gin Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu
245 250 255
Arg Asp Leu Pro He Phe Phe Asp Val Leu He His Asp Pro Ser His
260 265 270
Phe Leu Asn Tyr Ser Ala He Ser Tyr Lys Trp Asn Phe Gly Asp Asn
275 280 285
Thr Gly Leu Phe Val Ser Asn Asn His Thr Leu Asn His Thr Tyr Val
290 295 300
Leu Asn Gly Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val Gin Thr Ala Val Pro
305 310 315320
Gly Pro Cys Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr SerPro
325 330335
Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro Ser 340 345350
Leu Met Pro Thr Gly His Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp lie Ser Asn . 355 360365
Glu Asn Cys Arg He Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Ala Thr lie Thr 370 375380 lie Val Asp Gly lie Leu Glu Val Asn He lie Gin Val Ala AspVal
385 390 395400
Pro He Pro Thr Pro Gin Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe HeVal
405 410415
Thr Cys Lys Gly Ala Thr Pro Thr Glu Ala Cys Thr lie lie Ser Asp 420 425430
Pro Thr Cys Gin lie Ala Gin Asn Arg Val Cys Ser Pro Val Ala Val 435 440445
Asp Glu Leu Cys Leu Leu Ser Val Arg Arg Ala Phe Asn Gly Ser Gly 450 455460
Thr Tyr Cys Val Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Ala Ser Leu Ala Leu
465 470 t 475 480
Thr Ser Ala Leu He 485 Ser. lie Pro Gly Lys 490 Asp Leu Gly Ser Pro 495 Leu
Arg Thr Val Asn 500 Gly Val Leu lie Ser 505 He Gly Cys Leu Ala 510 Met Phe
Val Thr Met 515 Val Thr He Leu Leu 520 Tyr Lys Lys His Lys 525 Thr Tyr Lys
Pro lie 530 Gly Asn Cys Thr Arg 535 Asn Val Val Lys Gly 540 Lys Gly Leu Ser
Val 545 Phe Leu Ser His Ala 550 Lys Ala Pro Phe Ser 555 Arg Gly Asp Arg Glu 560
Lys Asp Pro Leu Leu 565 Gin Asp Lys Pro Trp 570 Met Leu
(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:6 .
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1795 base pairs (B) . TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 278..1279
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:6:
GCGGCCGCGT CGACGAAGCT GGGAAGTCAG GGGCTGTTTC TGTGGGCAGC TTTCCCTGTC 60
CTTTGOAAGG CACAGAGCTC TCAGCTGCAG GGAACTAACA GAGCTCTGAA GCCGTTATAT 120
GTGGTCTTCT CTCATTTCCA GCAGAGCAGG CTCATATGAA TCAACCAACT GGGTGAAAAG 180
ATAAGTTGCA ATCTGAGATT TAAGACTTGA TCAGATACCA TCTGGTGGAG GGTACCAACC 240
AGCCTGTCTG CTCATTTTCC TTCAGGCTGA TCCCATA ATG CAT CCT CAA GTG GTC 295
Met His Pro Gin Val Val
5
ATC TTA AGC CTC ATC CTA CAT CTG GCA GAT TCT GTA GCT GGT TCT Ser GTA Val 343
Xie Leu Ser Leu 10 He Leu His Leu Ala 15 Asp Ser Val Ala Gly 20
AAG GTT GGT GGA GAG GCA GGT CCA TCT GTC ACA CTA CCC TGC CAC TAC 391
Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val Thr Leu Pro Cys His Tyr
25 30 35
AGT GGA GCT GTC ACA TCA ATG TGC TGG AAT AGA GGC TCA TGT TCT CTA 439
Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn Arg Gly Ser Cys Ser Leu
40 . 45 50
TTC ACA TGC CAA AAT GGC ATT GTC TGG ACC AAT GGA ACC CAC GTC ACC 487
Phe Thr Cys Gin Asn' Gly He Val Trp Thr Asn Gly Thr His Val Thr
55 60 65 70
TAT CGG AAG GAC ACA CGC TAT AAG CTA TTG GGG GAC CTT TCA AGA AGG 535
Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Asp Leu Ser Arg Arg
75 80 85
GAT GTC TCT TTG ACC ATA GAA AAT ACA GCT GTG TCT GAC AGT GGC GTA 583
Asp Val Ser Leu Thr lie Glu Asn Thr Ala Val Ser Asp Ser Gly Val
90 95 100
TAT TGT TGC CGT GTT GAG CAC CGT GGG TGG TTC AAT GAC ATG AAA ATC 631
Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met Lys He
105 110 115
.CC GTA TCA TTG GAG ATT GTG CCA CCC AAG GTC ACG ACT ACT CCA ATT 679
‘hr Val 120 Ser Leu Glu He Val 125 Pro Pro Lys Val Thr Thr Thr 130 Pro lie
iTC ACA ACT GTT CCA ACC GTC ACG ACT GTT CGA ACG AGC ACC ACT GTT 727
tai Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr *Val Arg Thr Ser Thr Thr Val
.35 140 145 150
:ca ACG ACA ACG ACT GTT CCA ACG ACA ACT GTT CCA ACA ACA ATG AGC 775
?ro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Ser
155 160 165
\TT CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCG ACG ACA ATG ACT GTT TCA ACG ACA 823
lie Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Thr Val Ser Thr Thr
170 175 180
ACG AGC .GTT CCA ACG ACA ACG AGC ATT CCA ACA ACA ACA AGT GTT CCA 871
Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser He Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro
185 190 195
GTG ACA ACA ACG GTC ТСГ ACC TTT GTT CCT CCA ATG CCT TTG CCC AGG 919
Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro Pro Met Pro Leu Pro Arg
200 205 210
CAG AAC CAT GAA CCA GTA GCC ACT TCA CCA TCT TCA CCT CAG CCA GCA 967
Gin Asn His Glu Pro Val Ala Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gin Pro Ala
215 220 225 230
GAA ACC CAC CCT ACG ACA CTG CAG GGA GCA ATA AGG AGA GAA CCC ACC 1015
Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gin Gly Ala He Arg Arg Glu Pro Thr
1 235 240 245
AGC TCA CCA TTG TAC TCT TAC ACA ACA GAT GGG AAT GAC ACC GTG ACA 1063
Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr
250 255 260
GAG TCT TCA GAT GGC CTT TGG AAT AAC AAT .CAA ACT CAA CTG TTC CTA 1111
Glu Ser Ser Asp Gly LeU ТГР Asn Asn Asn Gin Thr Gin Leu Phe Leu
265 • 270 J 275
GAA CAT AGT CTA CTJ3 ACG GCC AAT ACC ACT AAA GGA ATC TAT GCT GGA 1159
Glu His Ser Leu Leu.Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly He Tyr Ala Gly
280 285 290
GTC TGT ATT TCT GTC TTG GTG CTT CTT GCT CTT TTG GGT GTC ATC ATT 1207
Val Cys lie Ser Val Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Val lie He
295 300 305 310
GCC AAA AAG TAT TTC TTC AAA AAG GAG GTT CAA CAA CTA AGA CCC CAT 1255
Ala Lys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val Gin Gin Leu Arg Pro His
315 320 325
AAA . TCC TGT ATA CAT CAA AGA GAA TAGTCCCTGG AAACATAGCA AATGAACTTC 1309
Lys Ser Cys He His Gin Arg Glu
330
TATCTTGGCC ATCACAGCTG TCCAGAAGAG GGGAATCTGT CTTAAAAACC AGCAAATCCA 1369
ACGTGAGACT TCATTTGGAA GCATTGTATG ATTATCTCTT GTTTCTATGT TATACTTCCA 1429
AATGTTGCAT TTCCTATGTT TTCCAAAGGT TTCAAATCGT GGGTTTTTAT TTCCTCCGTG 1489
GGGAAACAAA GTGAGTCTAA CTCACAGGTT TAGCTGTTTT CTCATAACTC TGGAAATGTG 1549
AtgcattAag TACTGGATCT CTGAATTGGG GTAGCTGTTT TACCAGTTAA AGAGCCTACA 1609
ATAGTATGGA ACACATAGAC ACCAGGGGAA GAAAATCATT TGCCAGGTGA TTTAACATAT . 1669
TTATGCAATT TTTTTTTTTT TTTTTGAGAT ggagctttgc TCTTGTTGCC CAGGCTGGAG 1729
TGCGATGGTG AAATCTCGGC TCACTGTAAC СТССАССТТС CGGGTTCAAG CAATTCTCCC 1709
GTCGAC 17 95 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:7:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 334 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear i (ii) MOLECULE TYPE: protein (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:7:
Met 1 His Pro Gin Val 5 Val He Leu Ser Leu 10 He Leu His Leu Ala IS Asp
Ser Val Ala Gly 20 Ser Val Lys Val Gly Gly 25 Glu Ala Gly Pro 30 Ser Val
Thr Leu Pro 35 Cys His Tyr Ser • Gly 40 Ala Val Thr, Ser Met 45 Cys Trp Asn
Arg Gly 50 Ser Cys Ser Leu Phe 55 Thr Cys Gin Asn Gly 60 He Val Trp Thr
Asn 6S Gly Thr His Val Thr 70 Tyr Arg Lys Asp Thr 75 Arg Tyr Lys Leu Leu 80
Gly Asp Leu Ser Arg 85 Arg Asp Val Ser Leu 90 Thr lie Glu Asn Thr 95 Ala
Val Ser Asp Ser 100 Gly Val Tyr Cys Cys 105 Arg Val Glu His Arg 110 Gly Trp
Phe Asn Asp Met Lys lie Thr Val Ser Leu Glu He Val Pro Pro Lys
115 120 125
Val Thr Thr Thr 130 Pro lie Val 135 Thr Thr Val Pro Thr 140 Val Thr Thr Val
Arg Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr
145 150 155 160
Val Pro Thr Thr Met Ser lie Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr
165 170 175
Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser lie Pro
100 185 190
Thr Thr Thr Ser val Pro val Thr Thr Thr val Ser Thr Phe Val Pro
195 200 205
Pro Met Pro Leu Pro Arg Gin Asn His Glu Pro Val Ala Thr Ser Pro
210 215 220
Ser Ser Pro Gin Pro Ala Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gin Gly Ala
225 230 235 240
Xie Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp
245 250 255
Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn
260 265 270
Gin Thr Gin Leu Phe Leu Glu His Ser Leu Leu Thr Ala Asn Thr Thr
275 28p 285
Lys Gly Xie Tyr Ala Gly Val Cys lie Ser Val Leu Val Leu Leu Ala
290 295 300
Leu Leu Gly Val lie Xie Ala Lys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val
305 310 315 320
Gin Gin Leu Arg Pro His Lys Ser Cys lie • His Gin Arg Glu
325 330

Claims (24)

  1. Патентни претенции
    1. Изолиран полипептид, притежаващ аминокиселинна последователност, която е най-малко 90% идентична на последователността SEQ ID N0:3 ; SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7.
  2. 2. Полипептид съгласно претенция 1, където аминокиселинната последователност е най-малко 95% идентична на SEQ ID N0:3; SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7.
  3. 3. Полипептид съгласно претенция 1, където полипептидът съдържа последователност SEQ ID N0:3; SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7.
  4. 4. Полипептид съгласно претенция 1, където полипептидът се състои от SEQ ID N0:3; SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7.
  5. 5. Изолиран полипептид, съдържащ аминокиселини 21-290 на SEQ ID N0:7.
  6. 6. Изолиран полипептид, съдържащ разтворим вариант на полипептид от всяка от претенциите 1-4.
  7. 7. Слят протеин, съдържащ полипептид съгласно претенциите 5 или 6 и Fc област на имуноглобулин.
  8. 8. Слят протеин, съдържащ извънклетъчен домен на полипептид съгласно всяка от претенциите 1-4 и Fc област на имуноглобулин.
  9. 9. Изолирана нуклеидна киселина, която е кодираща пептида съгласно всяка от претенциите 1-5.
  10. 10. Нуклеидна киселина, която е кодираща слетия протеин съгласно претенция 7 или 8.
  11. 11. Нуклеидна киселина съгласно претенция 9, съдържаща SEQ ID N0:1; SEQ ID N0:2; SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6.
  12. 12. Нуклеидна киселина, хибрид взираща при строги условия до SEQ ID NO: 1; SEQ ID N0:2; SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6.
  13. 13. Вектор, съдържащ нуклеидна киселина съгласно всяка от претенциите 9-12.
  14. 14. Клетка гостоприемник, включваща вектора съгласно претенция 13.
  15. 15. Метод за продуциране на полипептид, характеризиращ се с това, че включва ета пите на култивиране на клетка гостоприемник съгласно претенция 14, в среда за тъканни култури и получаване на полипептид, експресираи от вектора в посочената клетка гостоприемник.
  16. 16. Антитяло, което се свързва към полипептид съгласно претенция 4.
  17. 17. Антитяло съгласно претенция 16, при което антитялото е конюгирано с токсин или радионуклеотид.
  18. 18. Хибридома, продуцираща антитялото съгласно претенция 16.
  19. 19. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва (1) полипептид съгласно всяка от претенциите 1-6, слят протеин съгласно претенция 7 или 8 или антитяло съгласно претенция 16 или 17 и (ii) фармакологично приемлив носител.
  20. 20. Използване на полипептид съгласно всяка от претенциите 1-6, слят протеин съгласно претенция 7 или 8 или антитяло съгласно претенция 16 или 17 за получаване на фармацевтичен състав за лечение на бъбречно увреждане или заболяване в субект, страдащ от бъбречно увреждане или заболяване.
  21. 21. Използване на полипептид съгласно всяка от претенциите 1-6, слят протеин съгласно претенция 7 или 8 или антитяло съгласно претенция 16 или 17 за получаване на състав за оценяване на присъствието или причината за разлагането на бъбречно увреждане или заболяване в субект, страдащ от или рискуващ развитие на бъбречно увреждане или заболяване.
  22. 22. Използване съгласно претенция 20 или 21, където субектът е човек.
  23. 23. Използване на антитяло съгласно претенция 16 или 17 за получаване на състав за маркиране на клетки или тъкани, продуциращи пептид съгласно претенция 4.
  24. 24. Използване на антитяло съгласно претенция 17 за получаване на фармацевтичен състав за насочване на токсин или радионуклеотид към клетки, продуциращи полипептид съгласно претенция 4.
BG102967A 1996-05-24 1998-11-30 Модулатори на тъканна регенерация BG64678B1 (bg)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1822896P 1996-05-24 1996-05-24
US2344296P 1996-08-23 1996-08-23
PCT/US1997/009303 WO1997044460A1 (en) 1996-05-24 1997-05-23 Modulators of tissue regeneration

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG102967A BG102967A (bg) 2000-05-31
BG64678B1 true BG64678B1 (bg) 2005-11-30

Family

ID=26690881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG102967A BG64678B1 (bg) 1996-05-24 1998-11-30 Модулатори на тъканна регенерация

Country Status (27)

Country Link
US (4) US6664385B1 (bg)
EP (2) EP1655367A1 (bg)
JP (3) JP4602482B2 (bg)
CN (1) CN1147584C (bg)
AT (1) ATE318903T1 (bg)
AU (1) AU712289B2 (bg)
BG (1) BG64678B1 (bg)
BR (1) BR9709115A (bg)
CA (1) CA2257851C (bg)
CZ (1) CZ295936B6 (bg)
DE (1) DE69735364T3 (bg)
DK (1) DK0907735T5 (bg)
EA (1) EA004402B1 (bg)
EE (1) EE04817B1 (bg)
ES (1) ES2258793T5 (bg)
HK (1) HK1021746A1 (bg)
HU (1) HU226205B1 (bg)
IL (1) IL127162A (bg)
IS (1) IS2636B (bg)
NO (2) NO327597B1 (bg)
NZ (1) NZ336467A (bg)
PL (1) PL188826B1 (bg)
PT (1) PT907735E (bg)
SI (1) SI0907735T2 (bg)
SK (1) SK285461B6 (bg)
TR (1) TR199802421T2 (bg)
WO (1) WO1997044460A1 (bg)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1147584C (zh) * 1996-05-24 2004-04-28 拜奥根有限公司 组织再生调节物
EP0983357A1 (en) * 1997-05-23 2000-03-08 Biogen, Inc. Modulators of tissue regeneration
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
CZ295108B6 (cs) 1998-03-20 2005-05-18 Benitec Australia Ltd Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1160321A1 (en) * 2000-05-31 2001-12-05 Sanofi-Synthelabo Kidney Injury Novel Gene-1: Isolation and therapeutic applications
EP1305409B1 (en) 2000-06-16 2009-03-11 Biogen Idec MA Inc. Renal regulatory elements and methods of use thereof
US6812002B2 (en) * 2000-08-30 2004-11-02 Pfizer Inc. Osteoactivin protein and nucleic acids encoding the same, compositions and methods of stimulating bone differentiation
JP4527394B2 (ja) * 2001-06-01 2010-08-18 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｋｉｍ−１の分断を阻害するための分子および方法
US8709412B2 (en) 2001-06-29 2014-04-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modulation of TIM receptor activity in combination with cytoreductive therapy
NZ530451A (en) 2001-06-29 2008-04-30 Univ Leland Stanford Junior TIM gene sequences and their use in immunological disorders and cancer
AU2003228336B2 (en) * 2002-03-19 2009-07-30 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
SI1585546T1 (sl) * 2002-12-30 2008-12-31 Biogen Idec Inc KIM-1 antagonisti in uporaba za moduliranje imunskega sistema
WO2004084823A2 (en) 2003-03-19 2004-10-07 Abgenix, Inc. Antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen and uses thereof
ES2739463T3 (es) * 2003-03-27 2020-01-31 Childrens Hospital Med Ct Un método y kit para la detección de la instauración precoz de la lesión de células tubulares renales
US20050272101A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-08 Prasad Devarajan Method for the early detection of renal injury
JP2007536260A (ja) 2004-05-06 2007-12-13 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 虚血性および腎毒性障害の軽減および改善用ｎｇａｌ
RU2283666C9 (ru) * 2004-05-14 2007-03-10 Бизяев Алексей Вячеславович Средство для активации восстановления структуры и функции поврежденных тканей и органов
US20060003345A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 Pfizer Inc RNA bioassay
ES2818028T3 (es) * 2004-12-20 2021-04-09 Antibodyshop As Determinación de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) como marcador diagnóstico para trastornos renales
CN103751780A (zh) 2005-03-02 2014-04-30 比奥根艾迪克Ma公司 用于治疗th2介导的疾病的kim-1抗体
WO2007059082A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Curagen Corporation Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen
US20070037232A1 (en) * 2005-03-31 2007-02-15 Barasch Jonathan M Detection of NGAL in chronic renal disease
US20080090304A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Barasch Jonathan Matthew Diagnosis and monitoring of chronic renal disease using ngal
PL2035835T3 (pl) 2006-05-30 2012-05-31 Antibodyshop As Sposoby szybkiej oceny ciężkości urazu
EP2064553B2 (en) * 2006-08-07 2023-06-07 Antibodyshop A/S Diagnostic test to exclude significant renal injury
WO2008113363A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-25 Bioporto Diagnostics A/S Diagnostic test for renal injury
US8846036B2 (en) 2007-10-19 2014-09-30 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian NGAL and uses thereof
US20090297479A1 (en) * 2008-03-28 2009-12-03 Kiyoshi Ariizumi Dc-hil conjugates for treatment of t-cell disorders
CN102187220B (zh) * 2008-08-28 2015-08-19 阿斯图特医药公司 用于诊断和预后肾损伤和肾衰竭的方法和组合物
JP5947544B2 (ja) * 2008-08-29 2016-07-06 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後のための方法および組成物
NZ619918A (en) * 2008-10-21 2015-04-24 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CA2740788C (en) * 2008-10-21 2023-03-14 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
AU2009313189B2 (en) 2008-11-10 2014-10-23 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
ES2528799T3 (es) * 2008-11-22 2015-02-12 Astute Medical, Inc. Métodos para el pronóstico de insuficiencia renal aguda
BRPI1007483B1 (pt) * 2009-01-28 2021-11-30 Bio Preventive Medicine Corporation Método de diagnóstico de nefropatia in vitro, método in vitro para o monitoramento de progresso de nefropatia, método in vitro para o monitoramento da eficácia de um tratamento de nefropatia, método in vitro de avaliação de toxicidade renal de um agente e kit para diagnóstico de nefropatia
US9229010B2 (en) 2009-02-06 2016-01-05 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2462440B1 (en) 2009-08-07 2017-05-17 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US20120264148A1 (en) * 2009-08-07 2012-10-18 Dashurie Nezieri Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
JP2013510322A (ja) 2009-11-07 2013-03-21 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後診断のための方法ならびに組成物
CN104698161A (zh) 2009-12-20 2015-06-10 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
CN102791885B (zh) 2010-02-05 2015-09-09 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
US9029093B2 (en) 2010-02-26 2015-05-12 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
JP2013529907A (ja) 2010-05-24 2013-07-25 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク Ｎｇａｌタンパク質変異体及びその使用
AU2011269775B2 (en) 2010-06-23 2015-01-15 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP3339859A1 (en) 2010-06-23 2018-06-27 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
DK2672980T3 (en) * 2011-02-09 2018-02-26 Lavivo Ab SYNBIOTIC COMPOSITIONS FOR GETTING UP AND RECONSTITUTING GAS MICROFLORA
WO2013086359A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2925337B1 (en) 2012-11-21 2019-07-03 The Trustees of Columbia University in the City of New York Mutant ngal proteins and uses thereof
EP3361255B1 (en) 2013-01-17 2020-03-11 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US10420337B2 (en) * 2013-03-15 2019-09-24 Lifeline Scientific, Inc. Transporter with a glucose sensor for determining viability of an organ or tissue
WO2015134671A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Targeson, Inc. Molecular imaging contrast agents and uses thereof
CA3026502A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Astute Medical, Inc. Management of acute kidney injury using insulin-like growth factor-binding protein 7 and tissue inhibitor of metalloproteinase 2

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2003A (en) * 1841-03-12 Improvement in horizontal windivhlls
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB9122820D0 (en) * 1991-10-28 1991-12-11 Wellcome Found Stabilised antibodies
EP0640094A1 (en) * 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
WO1995021922A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Abbott Laboratories Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
US5622861A (en) * 1994-08-05 1997-04-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA encoding hepatitis A virus receptor
EP0804547A4 (en) * 1994-08-18 1999-11-03 Univ Columbia ASSOCIATED SINGLE SEQUENCES OF KAPOSI DISEASE VIRUSES AND USE OF SAID SEQUENCES
US6069230A (en) * 1994-11-10 2000-05-30 Promega Corporation High level expression and facile purification of proteins, peptides and conjugates for immunization, purification and detection applications
US6066322A (en) * 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
CN1147584C (zh) * 1996-05-24 2004-04-28 拜奥根有限公司 组织再生调节物
EP1305409B1 (en) * 2000-06-16 2009-03-11 Biogen Idec MA Inc. Renal regulatory elements and methods of use thereof
JP4527394B2 (ja) * 2001-06-01 2010-08-18 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｋｉｍ−１の分断を阻害するための分子および方法
US7838220B2 (en) * 2001-06-29 2010-11-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes associated with immune disease
NZ530451A (en) * 2001-06-29 2008-04-30 Univ Leland Stanford Junior TIM gene sequences and their use in immunological disorders and cancer
US7215871B2 (en) * 2001-07-27 2007-05-08 Thomson Licensing Changing a playback speed for video presentation recorded in a field structure format
US7687454B2 (en) * 2001-12-03 2010-03-30 The University Of British Columbia Effectors of innate immunity determination
EP1467759A4 (en) * 2002-01-30 2006-05-31 Brigham & Womens Hospital COMPOSITIONS AND METHODS ASSOCIATED WITH TIM-3, TH1-SPECIFIC CELL SURFACE MOLECULE
AU2003228336B2 (en) * 2002-03-19 2009-07-30 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
SI1585546T1 (sl) * 2002-12-30 2008-12-31 Biogen Idec Inc KIM-1 antagonisti in uporaba za moduliranje imunskega sistema
TW200539890A (en) * 2004-03-12 2005-12-16 Brigham & Womens Hospital Methods of modulating immune responses by modulating tim-1, tim-2 and tim-4 function
AU2005231685A1 (en) * 2004-03-24 2005-10-20 Telos Pharmaceuticals Llc Compositions as adjuvants to improve immune responses to vaccines and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009039111A (ja) 2009-02-26
US20050089868A1 (en) 2005-04-28
ES2258793T3 (es) 2006-09-01
ES2258793T5 (es) 2010-01-25
HUP9902770A3 (en) 2001-09-28
JP2001505761A (ja) 2001-05-08
CN1223685A (zh) 1999-07-21
JP4316640B2 (ja) 2009-08-19
NO985427D0 (no) 1998-11-20
DK0907735T5 (da) 2010-06-14
EE9800409A (et) 1999-06-15
AU3567697A (en) 1997-12-09
CZ295936B6 (cs) 2005-12-14
PL330313A1 (en) 1999-05-10
EP0907735B9 (en) 2010-05-19
ATE318903T1 (de) 2006-03-15
US20070141590A1 (en) 2007-06-21
IS2636B (is) 2010-06-15
EA004402B1 (ru) 2004-04-29
IL127162A (en) 2007-07-24
WO1997044460A1 (en) 1997-11-27
EP0907735B2 (en) 2009-10-07
AU712289B2 (en) 1999-11-04
CN1147584C (zh) 2004-04-28
SK160998A3 (en) 1999-07-12
EP0907735B1 (en) 2006-03-01
NO327597B1 (no) 2009-08-31
DE69735364D1 (de) 2006-04-27
PL188826B1 (pl) 2005-04-29
BR9709115A (pt) 1999-08-03
DE69735364T3 (de) 2010-05-06
EP1655367A1 (en) 2006-05-10
US20060286031A1 (en) 2006-12-21
SI0907735T1 (sl) 2006-08-31
TR199802421T2 (xx) 1999-02-22
SK285461B6 (sk) 2007-02-01
JP2008067701A (ja) 2008-03-27
HK1021746A1 (en) 2000-06-30
EE04817B1 (et) 2007-04-16
NO985427L (no) 1999-01-25
SI0907735T2 (sl) 2010-01-29
EA199801044A1 (ru) 1999-04-29
HUP9902770A2 (hu) 1999-12-28
DK0907735T3 (da) 2006-06-26
IS4902A (is) 1998-11-20
NZ336467A (en) 2000-10-27
DE69735364T2 (de) 2006-11-30
NO20090945L (no) 1999-01-25
US6664385B1 (en) 2003-12-16
IL127162A0 (en) 1999-09-22
DK0907735T4 (da) 2009-12-21
CZ381398A3 (cs) 1999-05-12
JP4602482B2 (ja) 2010-12-22
PT907735E (pt) 2006-06-30
BG102967A (bg) 2000-05-31
HU226205B1 (en) 2008-06-30
CA2257851A1 (en) 1997-11-27
CA2257851C (en) 2011-11-15
EP0907735A1 (en) 1999-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG64678B1 (bg) Модулатори на тъканна регенерация
KR100587556B1 (ko) 신경 및 신장 증식을 자극하기 위한 ＲＥＴ리간드（ＲｅｔＬ)
KR100386046B1 (ko) 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 핵산
US6861509B1 (en) Antibodies to Ret and RetL3
JPH11513883A (ja) ヒト血管内皮増殖因子２
WO2001016169A2 (en) RET LIGAND 5 (Retl5) FROM HUMAN AND MOUSE
KR100498530B1 (ko) 조직재생조절물질
KR100554901B1 (ko) 신경및신장증식을자극하기위한RET리간드(RetL)
MXPA98009812A (en) Modulators of the regeneration of the tej