HU226205B1 - Modulators of tissue regeneration - Google Patents

Modulators of tissue regeneration Download PDF

Info

Publication number
HU226205B1
HU226205B1 HU9902770A HUP9902770A HU226205B1 HU 226205 B1 HU226205 B1 HU 226205B1 HU 9902770 A HU9902770 A HU 9902770A HU P9902770 A HUP9902770 A HU P9902770A HU 226205 B1 HU226205 B1 HU 226205B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
seq
kim
thr
ser
antibody
Prior art date
Application number
HU9902770A
Other languages
English (en)
Inventor
Joseph V Bonventre
Richard L Cate
Catherine A Hession
Takaharu Ichimura
Michele Sanicola-Nadel
Henry Wei
Original Assignee
Biogen Idec Ma
Gen Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26690881&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU226205(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Ma, Gen Hospital Corp filed Critical Biogen Idec Ma
Publication of HUP9902770A2 publication Critical patent/HUP9902770A2/hu
Publication of HUP9902770A3 publication Critical patent/HUP9902770A3/hu
Publication of HU226205B1 publication Critical patent/HU226205B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)

Description

HU 226 205 Β1
A találmány tárgyát sérült vagy regenerálódó szövetekben túlszabályozás alá kerülő fehérjék képezik, valamint ezeket a fehérjéket kódoló DNS. A találmány tárgyát képezik továbbá ezen fehérjéket tartalmazó terápiás készítmények és alkalmazásuk.
A szövetszerkezet dinamikusan alakul újjá a fejlődés folyamán és sérülés utáni szövet-helyreállítás alatt. A folyamatot ischaemiareperfúzió által okozott vesesérülés modelljén tanulmányoztuk.
A vese komplex folyamatsorozaton keresztül képes helyreállítani a proximális vesecsatomák epitéliumának károsodását, amely sejtpusztulást, a proximális vesecsatornák túlélő epitél sejtjeinek proliferációját, gyengén differenciálódott regeneratív epitélium kialakulását a lecsupaszított alapmembránon és a regeneratív epitélium differenciálódását foglalja magában, teljesen működőképes proximális vesecsatornákat alkotó epitél sejtek képződésével [Wallin et al., Láb. Invest. 66, 474-484 (1992); Witzgall et al., Mól. Cell. Bioi. 13, 1933-1942 (1994); Ichimura et al., Am. J. Physiol. 269, F653-662 (1995); Thadhani et al., N. Engl. J. Med. 334, 1448-1460 (1996)]. Ebben a helyreállítási folyamatban szerepet játszanak növekedési faktorok, például IGF, EGF és HGF, valamint endotél sejtből származó adhéziós molekula, az ICAM-1. A vesecsatornák epitél sejtjeit helyreállító ezen mechanizmusok azonban még nem tisztázottak.
A vesecsatornák epitéliumának sérülésében és helyreállításában szerepet játszó molekulák azonosítása céljából a sérült/regenerálódó és normálvesékből származó mRNS-populációk közötti különbséget analizáltuk reprezentációs differenciaanalízis (RDA) alkalmazásával. Az RDA egy PCR-re alapuló, kivonásos módszer, amellyel célszövethez vagy sejtspecifikus cDNS-fragmentumokhoz jutunk ismételt kivonással és amplifikációval [Hubánk és Schutz, Nucl. Acids Rés. 22, 5640-5648 (1994)].
A találmány tárgyát általánosságban vesesérüléssel kapcsolatos molekulák („Kidney Injury-related Molecules”, a továbbiakban rövidítve „KIM”) képezik, amelyek a vesét ért sérülés után túlszabályozás alá kerülnek a veseszövetben. A találmány szerinti KIM-fehérjék és -peptidek, valamint agonistáik és antagonistáik, és megfelelőik sokféle terápiás beavatkozásban hasznosak.
A találmány tárgyát képezi olyan tisztított és izolált DNS-molekula, amely az 1., 2., 4. vagy 6. számú nukleotidszekvenciát (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6) tartalmazza. A találmány tárgyát képezik ezekkel a szekvenciákkal komplementer szálak, DNS-molekulák is, amelyek szigorú körülmények között képesek hibridizálni a fentebb említett DNS-molekulákkal, valamint olyan DNS-molekulák, amelyek a genetikai kód degeneráltsága következtében képesek lennének hibridizálni a fentebb definiált bármelyik DNS-molekulához. Ezek a DNS-molekulák lehetnek rekombinánsak, és működőképesen kapcsolódhatnak expressziós kontrollszekvenciához.
A találmány tárgyát képezi továbbá az 1., 2., 4. vagy 6. számú nukleotidszekvenciával (SEQ ID No: 1,
SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6) rendelkező, tisztított és izolált DNS-molekulát vagy a fentebb definiált más DNS-molekulák közül az egyiket tartalmazó vektort. Ez a vektor lehet biológiailag funkcionális plazmid vagy virális DNS-vektor. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely az 1., 2., 4. vagy 6. számú nukleotidszekvenciával (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6) rendelkező DNS-molekulát tartalmazó vektorral van stabilan transzformálva vagy transzfektálva. A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás a fentebb leírt DNS-molekula által kódolt KIM-polipeptid-termék termelésére; az eljárásban a DNS-molekulával transzformált vagy transzfektált prokarióta vagy eukarióta gazdasejteket megfelelő tenyésztési körülmények között növesztjük úgy, hogy lehetővé tegyük a DNS-molekula expresszióját, és kinyerjük az expresszió polipeptidtermékét.
A tisztított és izolált, humán KIM-fehérje speciálisan a találmány szerinti megoldásban lényegében mentes más humán fehérjéktől, mint a KIM-fehérje primer strukturális konformációjának részével vagy egészével és biológiai aktivitásával rendelkező polipeptidtermék termelésére szolgáló eljárás eredménye. A találmány szerinti KIM-fehérjék rendelkezhetnek a 3., 5. vagy 7. számú szekvenciát (SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 vagy SEQ ID No: 7) tartalmazó szekvenciával, vagy a 3., 5. vagy 7. számú szekvenciák (SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 vagy SEQ ID No: 7) variánsaival, vagy lehetnek az 1., 2., 4. vagy 6. számú szekvenciával (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6) rendelkező DNS által kódolt, tisztított és izolált fehérjék. Ezeket a fehérjéket más humán fehérjéktől mentesen állíthatjuk elő. A találmány tárgyát képezik továbbá ezen fehérjék variánsai, például szolúbilis variánsok vagy fúziós fehérjék. A találmány szerinti KLM-fúziós fehérjék tartalmazhatnak immunoglobulint, toxint, leképezhető vegyületet vagy radioaktív nuklidot.
A találmány tárgyát képezi a fentebb leírt KIM-fehérjékre specifikus monoklonális antitest is. Az antiKIM-antitest asszociálódhat toxinnal, leképezhető vegyülettel vagy radioaktív nukliddal. A kitanítás részét képezi továbbá ilyen specifikus antitestet termelő hibridóma-sejtvonal.
A találmány tárgyát képezik gyógyszerkészítmények is. A találmány szerinti gyógyszerkészítmény tartalmazhat terápiásán hatásos mennyiségű, találmány szerinti KIM-fehérjét vagy anti-KIM-antitestet, farmakológiailag elfogadható hordozóval együtt.
A találmány tárgyát képezik diagnosztikai módszerek is, például vesesérülés jelenlétének vagy a felszívódás folyamatának meghatározására, vesebetegségben szenvedő vagy vesebetegség kifejlődésének kockázatát viselő páciensből származó vizeletben, szérumban vagy vizeletüledékben lévő KIM koncentrációjának mérésével.
A találmány szerinti kezelési eljárások során a pácienseket KIM, KIM-variánsok, KIM-analógok, KIM fúziós fehérjék, KIM-agonisták, KIM-re specifikus antites2
HU 226 205 Β1 tek vagy KIM-ligandumok terápiásán hatásos mennyiségével kezeljük. A találmány szerinti, más terápiás készítmények lehetnek KIM-ligandumok, anti-KIM-antitestek és KIM-ligandumok fúziós fehérjéi. Ezek a vegyületek eredményesen alkalmazhatók olyan terápiás eljárásokban, amelyek stimulálnak vagy gátolnak KIMfunkciótól függő celluláris válaszokat.
A találmány szerinti további eljárások KIM-et expresszáló tumorsejtek növekedését gátolják úgy, hogy a sejteket érintkeztetjük KIM-ligandumot tartalmazó fúziós fehérjével, és akár toxinnal vagy radioaktív nukliddal, vagy toxinhoz vagy radioaktív nuklidhoz konjugált anti-KIM-antitesttel, Ehhez hasonlóan, KIM-ligandumot expresszáló tumorsejtek növekedését úgy gátolhatjuk, hogy a sejteket érintkeztetjük KIM-et tartalmazó fúziós fehérjével, és akár toxinnal vagy radioaktív nukliddal, vagy toxinhoz vagy radioaktív nuklidhoz konjugált antiKLM-ligandumra specifikus antitesttel.
A találmány tárgyát képezik génterápiás eljárások is. Idetartozik vese-rendellenességben szenvedő alany kezelésére szolgáló eljárás, új szövet növekedését elősegítő eljárás egy alanyban és egy alany károsodott szövetének túlélését elősegítő eljárás, amelyek során beadunk 1., 2., 4. vagy 6. számú szekvenciát (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6) tartalmazó DNS-t tartalmazó vektort az alanynak.
A találmány szerinti vegyületek alkalmasak szövetek leképezésére is akár in vitro, akár in vivő. Ilyen eljárásban egy leképezhető vegyületet juttatunk egy 3., 5. vagy 7. számú szekvenciával (SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 vagy SEQ ID No: 7) rendelkező fehérjét expresszáló sejtbe, amelynek során a sejtet érintkeztetjük leképezhető vegyülethez fuzionált, találmány szerinti monoklonális antitesttel vagy egy fehérjét tartalmazó fúziós fehérjével a fentebb leírtak szerint. In vivő eljárásokban a sejt a kezelendő alanyban van, és a fehérjét vagy a monoklonális antitestet beadjuk az alanynak.
A találmány tárgyát képezik diagnosztikai eljárások is, például vesesejtek károsodásának vagy regenerálódásának azonosítására szolgáló eljárás egy alanyban, amelyben 1., 2., 4. vagy 6. számú szekvenciával (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6) rendelkező molekulának egy páciens vesesejtjeiben mért expressziójának mértékét hasonlítjuk ilyen szekvenciával rendelkező molekulának kontrollvesesejtekben mért kontrollexpressziójához. A találmány szerinti másik eljárásban az 1., 2., 4. vagy 6. számú szekvenciával (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6) rendelkező molekula túlszabályozottságát azonosítjuk úgy, hogy a sejteket antiszenszpróbával érintkeztetjük, és hibridizációt mérünk RNS-hez a sejtben.
A találmány szerinti diagnosztikai eljárások további előnyös megvalósítási módja szerint meghatározzuk a találmány szerinti molekula vizeletben, szérumban vagy más testfolyadékban vagy vizeletüledékben, vagy szövetmintákban lévő jelenlétét vagy koncentrációját. A mért, sérüléssel kapcsolatos molekula összefüggést mutathat egy patológiai folyamat jelenlétével, kiterjedésével vagy lefolyásával. Ezt az összefüggést szintén felhasználhatjuk a terápiás kezelés hatékonyságának megítélésében.
Az 1. ábrán a patkányból származó 3-2 jelű cDNSklón nukleotidszekvenciája látható, 615. és 1535. helyzet közötti feltételezett fehérjeleolvasási fázissal.
A 2. ábrán a patkányból származó 1-7 jelű cDNSklón nukleotidszekvenciája látható, 145. és 1065. helyzet közötti feltételezett fehérjeleolvasási fázissal.
A 3. ábrán a patkányból származó 4-7 jelű cDNSklón nukleotidszekvenciája látható, 107. és 1822. helyzet közötti feltételezett fehérjeleolvasási fázissal.
A 4. ábrán a humán H13-10-85 jelű cDNS-klón nukleotidszekvenciája és a levezetett aminosavszekvencia látható, 1. és 1002. helyzet között feltételezett fehérjeleolvasási fázissal. Az ábra felső sora a cDNS-szekvencia (SEQ ID No: 6), és az alsó sora a levezetett aminosavszekvencia (SEQ ID No: 7).
Az 5. ábrán a humán H13-10-85 jelű és a patkányból származó 3-2 jelű cDNS-klón nukleotidszekvenciájának BESTFITösszehasonlítása látható.
KIM-géneket azonosítottunk úgy, hogy analizáltuk a mRNS-expresszióban lévő különbségeket regenerálódó és normálvesék között reprezentációs differenciaanalízis (RDA) alkalmazásával. Az RDA egy PCR-re alapuló kivonásos módszer, amely célszövetre vagy sejtre specifikus cDNS-fragmentumokat hoz létre ismételt kivonással és amplifikációval. Ischaemia után 48 órával, kifejlett patkányveséböl származó RNS cDNS-reprezentációjából kivontuk a normál (áloperált), kifejlett patkányveséből származó mintának megfelelő cDNS-reprezentációt. Ebben az eljárásban eltávolítjuk azokat a szekvenciákat, amelyek általánosan előfordulnak mind posztischaemiás, mind normálvesemintákban, és megmaradnak azok a szekvenciák, amelyek szignifikánsan csak sérült veseszövetben expresszálódnak. Ilyen gének olyan fehérjéket kódolnak, amelyek terápiásán jótékony hatásúak lehetnek vese-rendellenességek esetén, vagy a károsodási folyamatban játszanak szerepet. Számos kiónhoz jutottunk, szekvenáltuk és jellemeztük azokat. Azután a kiónok expressziós mintázatát vizsgáltuk a vese gyógyulása, fejlődése folyamán, és szöveteloszlásukat Northern-analízis és in situ RNS-hibridizáció alkalmazásával.
Szekvenciaazonosító számok (SEQ ID No)
A leírásban az alábbi szekvenciaazonosító számokat használjuk nukleotid- és aminosavszekvenciák azonosítására:
SEQ ID No: 1 - patkányból származó, 3-2 jelű cDNSinszertum nukleotidszekvenciája;
SEQ ID No: 2 - patkányból származó, 3-2 jelű cDNSinszertum nukleotidszekvenciája.
HU 226 205 Β1
SEQ ID No: 3 - patkányból származó KIM-1 aminosavszekvenciája, melyet a patkányból származó 3-2 jelű és 1-7 jelű cDNS-ek kódolnak.
SEQ ID No: 4 - patkányból származó, 3-2 jelű cDNSinszertum nukleotidszekvenciája.
SEQ ID No: 5 - 4-7 jelű cDNS-inszert által kódolt aminosavszekvencia.
SEQ ID No: 6 - humán H13-10-85 jelű cDNS-inszertum nukleotidszekvenciája.
SEQ ID No: 7 - H13-10-85 jelű humán cDNS-klón által kódolt aminosavszekvencia.
A „KIM-fehérje” (szinonimájaként a leírásban „KIMként használjuk) olyan fehérje, amelyet kódoló mRNS vesesérülést követően szelektíven túlszabályozás alá kerül. A kérdéses KIM-fehérjék egy csoportját olyan mRNS kódolja, amely bármilyen, veseszövetben károsodást okozó sérülés után egy héten belüli időpontban kerül túlszabályozás alá szelektíven. Ilyen túlszabályozást azonosíthatunk például 10 órával, 24 órával, 48 órával vagy 96 órával a sérülés után. A sérülések típusai lehetnek például ischaemiás, toxikus vagy más típusú károsodások.
A „KIM-agonista olyan molekula, amely képes specifikusan celluláris választ indítani KIM és KIM-ligandum közötti kölcsönhatás által. KIM-agonista lehet KIM-variáns vagy KIM-re specifikus antitest, vagy a KIM-ligandum szolúbilis formája.
A „KIM-antagonista” olyan molekula, amely KIM-ligandummal vagy KIM-mel képes specifikusan asszociálódni, ezáltal a KIM-et blokkolja vagy más módon gátolja a KIM-ligandumhoz való kötődésben. Az antagonista kötődése blokkolja vagy gátolja azokat a celluláris válaszokat, amelyek máskülönben aktiválódnának KIMligandum és KIM vagy KIM-agonista között kialakuló ligálódás hatására. KIM-antagonisták közé tartoznak például bizonyos KIM-variánsok, KIM fúziós fehérjék és KIM-ligandumra vagy KIM-re specifikus antitestek.
A „KIM-ligandum” lehet bármilyen olyan molekula, amely nemkovalensen, és specifikusan képes kötődni KIM-fehérjéhez. Ilyen ligandum lehet fehérje, peptid, szteroid, antitest, aminosavszármazék vagy más típusú molekula, bármilyen formában, például természetesen előforduló, rekombinánsan előállított vagy más módon szintetikusan előállított formában. KIM-ligandum lehet bármilyen formájú, például szolúbilis, membránkötött, vagy immunglobulinnal, zsírsavval vagy más csoporttal kialakított fúziós konstrukció része. A KIM-ligandum lehet egy integrin. Membránkötött KIM-ligandum hathat receptorként, amely ha KIM-hez kötődik vagy azzal asszoclálódik, celluláris választ indít. Néhány kölcsönhatásban a KIM egynél több KIM-ligandummal asszociálódhat, vagy olyan KIM-ligandummal asszociálódhat, amely egy vagy több más molekulával vagy kofaktorral kialakított komplex része. Abban a szituációban, ha mind a KIM, mind a KIM-ligandum sejtmembránokhoz kötődik, a KIM olyan KIM-ligandummal asszociálódhat vagy reagálhat, amely ugyanahhoz a sejthez kötődött, mint a KIM, vagy olyan KIM-ligandummal asszociálódhat vagy reagálhat, amely egy második sejthez kötődött. Ha a KIM-ligáció különböző sejtekhez kötődött molekulák között jön létre, a két sejt lehet azonos vagy különböző, celluláris típusára vagy eredetére, fenotípusára vagy metabolikus állapotára, vagy egy adott stimulusra adott celluláris válasz (például növekedés, differenciálódás vagy apoptózis) típusára vagy fokára nézve. A „KIM-ligáció kifejezés a KIM és KIM-ligandum közötti érintkezésre és kötődésre utal.
A „szekvenciák egymás alá rendezése” kifejezés egy (akár nukleotid, akár aminosav) szekvencia elhelyezését jelenti egy másik alá, lehetővé téve az egyik szekvencia kérdéses szakaszának összehasonlítását a másik kérdéses szakaszával. Ezen eljárásra szolgál példaként Needleman és munkatársai módszere [J. Mól. Bioi. 48, 443-453 (1970)]. Az eljárást kényelmesen végrehajthatjuk számítógépes program, például „Align program” (DNAstar, Inc.) alkalmazásával. Szakember képes megérteni, hogy homológ vagy funkcionálisan ekvivalens szekvenciák funkcionálisan ekvivalens módon elrendezett ciszteineket tartalmaznak a konzervatív císzteinvázban, beleértve olyan aminosavinszerciókat vagy -deléciókat, amelyek ugyan megváltoztatják ezen ciszteinek lineáris elrendeződését, de lényegesen nem befolyásolják viszonylagos helyzetüket a konformációt felvett fehérjestruktúrában. Ennélfogva a vizsgált szekvenciában lévő belső réseket és aminosavinszerciókat figyelmen kívül hagyjuk, ha az eljárást a vizsgált és a referenciaszekvencia közötti aminosavszekvencia-homológia vagy -azonosság mértékének számítása céljából végezzük. Fehérjék homológiájának meghatározásához gyakran alkalmazott jellemző tulajdonság a ciszteinek számának és helyzetének hasonlósága az egyik és a másik fehérje között.
Az „antiszensz DNS” olyan kromoszomális DNSszekvenciát jelent, amely átíródik.
Az „antiszenszpróba” olyan próba, amely a kérdéses nukleinsavszakasznak megfelelő antiszensz DNS legalább egy részét tartalmazza.
A „klónozás” in vitro rekombinációs technikák alkalmazását jelenti egy adott gén vagy más DNS-szekvencia vektormolekulába való inszertálása céljából. A kívánt gén sikeres klónozása céljából DNS-fragmentumok előállítására szolgáló módszereket szükséges alkalmazni, hogy a fragmentumokat a vektormolekulához kapcsoljuk, az összetett DNS-molekulát bevigyük olyan gazdasejtbe, amelyben az képes replikálódni, és a célgént tartalmazó kiónt kiszelektáljuk a recipiens gazdasejtek közül.
A „cDNS” jelentése RNS-templátról RNS-függő DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) alkalmazásával előállított, komplementer vagy másolt DNS. fgy egy „cDNS-klón” egy klónozóvektor által tartalmazott, dupla szálú DNS-szekvenciát jelent, amely komplementer a kérdéses RNS-molekulával.
A „cDNS-könyvtár” olyan cDNS-inszerteket tartalmazó rekombináns DNS-molekulák gyűjteménye, amelyek együttvéve az egész szervezetben vagy szövetben jelen lévő valamennyi fajta mRNS-molekulát képviselik, az RNS-templát forrásától függően. Ilyen cDNS-könyvtárat előállíthatunk szakember által ismert módszerekkel, és leírásukat lásd Maniatis és munka4
HU 226 205 Β1 társai, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (mint fent). Általában először RNS-t izolálunk a szervezetnek abból a sejtjéből, amelynek genomjába kívánjuk klónozni az adott gént. A találmány szerinti célokra előnyösek emlős-, és különösen humán sejtvonalak. Más módszer szerint, RNS-t izolálhatunk tumorsejtből, amely állati tumorból, és előnyösen humán tumorból származik, fgy a könyvtárat előállíthatjuk például humán mellékvesetumorból, de bármilyen más tumor is felhasználható.
A „DNS-polimorfizmus kifejezés olyan állapotra utal, amelyben két vagy több, különböző nukleotidszekvencia képes létezni a DNS egy adott helyzetében.
Az „expressziós vektor” kifejezésen olyan vektorokat értünk, amelyek az általuk tartalmazott DNS-szekvenciákat képesek expresszálni, azaz a kódolószekvenciák működőképesen kapcsolódnak más olyan szekvenciákhoz, amelyek képesek azok expresszióját befolyásolni. Értelemszerűen következik, bár kifejezetten nem jelentjük ki mindig, hogy ezeknek az expressziós vektoroknak replikálódóknak kell lenniük a gazdaszervezetekben, episzómákként vagy a kromoszomális DNS integrális részeként. Hasznos, de nem szükséges eleme egy hatékony expressziós vektornak egy markert kódoló szekvencia, amely olyan fehérjét kódoló szekvencia, amely az általa tartalmazott sejtben fenotipikus tulajdonságokat (például tetraciklinrezisztenciát) eredményez, amely lehetővé teszi, hogy a sejteket könnyen azonosítsuk, összességében az „expressziós vektor kifejezés funkcionális definíció, és bármilyen olyan DNS-szekvenciát jelenthet, amely képes egy meghatározott, általa tartalmazott DNS-kód expresszióját befolyásolni, ha a meghatározott szekvenciához van kapcsolva. A leírásban ilyen vektorok gyakran plazmidok formájában vannak, tehát a „plazmid” és az „expressziós vektor” kifejezések gyakran felcserélhetőek. A találmány szerinti megoldásban expressziós vektorok ilyen más formáit is szándékozunk alkalmazni, amelyek ekvivalens funkciókat szolgálnak, és amelyek időnként szakember által ismertek.
„Funkcionális származékon” egy molekula „fragmentumát”, „variánsait”, „analógjait” vagy „kémiai származékait” értjük. Egy molekula, például a találmány szerinti bármelyik antigén „fragmentumán” értjük a molekula bármelyik polipeptidalegységét. Ilyen molekulák „variánsa a természetesen előforduló molekulához (vagy az egész molekulához vagy fragmentumához) lényegében hasonló molekulát jelent. Egy molekula „analógján olyan természetesen elő nem forduló, (vagy az egész molekulához vagy fragmentumához) lényegében hasonló molekulát értünk.
A „gén” peptidet kódoló polinukleotidszekvenciát jelent.
A „homogén” kifejezésen azt értjük, ha peptid- vagy DNS-szekvenciára használjuk, hogy a készítményben lévő, lényegében valamennyi molekula primer molekuláris szerkezete (azaz aminosav- vagy nukleotidszekvenciája) kellő mérlegelés után azonos.
Az „izolált kifejezés a találmány szerinti fehérjére, vagy bármilyen ilyen fehérjét kódoló génre utal, amely lényegében mentes más fehérjéktől vagy génektől, vagy más szennyező anyagoktól, amelyek természetes körülmények között, normálisan megtalálhatók, és ezáltal természetes körülmények között nem megtalálható formát jelent.
A „jelölő kifejezés detektálható molekuláris csoportot jelent, például radioaktív izotópokat, enzimeket, lumineszkáló ágenseket és festékeket.
A „próba” kifejezés ismert minőségű ligandumot jelent, amely szelektíven képes kötődni a célantiligandumhoz. Nukleinsavak esetén a próba olyan nukleinsavszálat jelent, amely a célszállal komplementer bázisszekvenciával rendelkezik.
A „rekombináns gazdasejtek kifejezés olyan sejtekre utal, amelyek rekombináns DNS technikák alkalmazásával előállított vektorokkal lettek transzformálva. A leírás szerint, egy rekombináns gazdasejt által termelt antitest vagy annak módosított változata a transzformáció következménye, melyet a nemtranszformált gazdasejt kisebb mennyiségben, vagy általánosabban a detektálható mennyiségnél is kisebb mennyiségben termelne.
A „lényegében tiszta kifejezés a találmány szerinti fehérjére, vagy bármilyen ilyen fehérjét kódoló génre utal, amely lényegében mentes más fehérjéktől vagy génektől, vagy más szennyező anyagoktól, amelyek természetes körülmények között, normálisan megtalálhatók, és ezáltal természetes körülmények között nem megtalálható formát jelent.
Egy molekuláról abban az esetben állítjuk, hogy „lényegében hasonló” egy másik molekulához, ha mindkét molekula aminosavszekvenciája lényegében ugyanaz, és mindkét molekula hasonló biológiai aktivitással rendelkezik. Tehát feltéve, hogy két molekula hasonló aktivitással rendelkezik, akkor azokat variánsoknak tekintjük a leírás szerint definiált értelmezésben még akkor is, ha az egyik molekula olyan további aminosavcsoportokat tartalmaz, amely a másikban nem található meg, vagy ha az aminosavszekvenciák nem azonosak. A találmány szerint egy molekuláról abban az esetben állítjuk, hogy egy másik molekula „kémiai származéka”, ha olyan hozzáadott kémiai csoportokat tartalmaz, amelyek normálisan nem részei a molekulának. Ilyen csoportok javíthatják a molekula oldhatóságát, abszorpcióját, biológiai féléletidejét stb. A csoportok ezzel párhuzamosan csökkenthetik a molekula toxicitását, eliminálhatják vagy gyengíthetik a molekula nemkívánatos mellékhatásait stb. Ilyen hatások mediálására képes csoportok ismertetését lásd például „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 16. kiadás (1980), Mack Publishing Co., Easton, Penn.
A „vektor” egy plazmidból vagy bakteriofágból származó DNS-molekulát jelent, amelybe DNS-fragmentumok lehetnek inszertálva vagy klónozva. Egy vektor egy vagy több egyedi restrikciós hasítóhelyet tartalmaz, és képes lehet autonóm replikációra egy meghatározott gazdaszervezetben vagy hordozómikroorganizmusban, így a klónozott szekvencia reprodukálható.
HU 226 205 Β1
A találmány szerinti vegyületek
A találmány tárgyát képezik az 1., 2., 4. vagy 6. számú szekvenciával (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6) rendelkező cDNS-ek, valamint olyan szekvenciák melyek közé tartozik az 1., 2., 4. vagy 6. számú szekvencia (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6), és ezen szekvenciák származékai. A találmány tárgyát képezik továbbá ezen szekvenciákat vagy származékait tartalmazó vektorok, liposzómák és más hordozó segédanyagok. A találmány tárgyát képezik az 1., 2., 4. vagy 6. számú szekvenciák (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6) átírásával keletkezett fehérjék, például a 3., 5. vagy 7. számú szekvenciával (SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 vagy SEQ ID No: 7) rendelkező fehérjék, valamint származékaik és variánsaik.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint KIM-fehérje olyan szolubilis variánsát alkalmazzuk, amely rendszerint membránasszociált fehérjeként szintetizálódik, és amely sérülés után túlszabályozás alá kerül. A szolubilis variánsokból hiányzik a natív KIM-fehérje transzmembránszakaszának vagy intramembránszakaszának legalább egy része. Néhány esetben a szolubilis variánsból a KIM-fehérje teljes transzmembrán- vagy intramembránszakasza hiányzik. Szolubilis variánsok közé tartoznak fúziós fehérjék, amelyek olyan KIM-fehérje-származékokat tartalmaznak, amelyekből hiányzik a natív KIM-fehérje transzmembránszakaszának vagy intramembránszakaszának legalább egy része. A találmány tárgyát képezi valamennyi típusú KIM-et tartalmazó fúziós fehérje, különösen azok, amelyek a molekula his-toldalékát, Ig-toldalékát és myc-toldalékát tartalmazzák. Ezek a KIM-fúziók terápiásán előnyös, jellemző tulajdonságokkal rendelkezhetnek, például az Ig-toldalék által meghatározott, megnövekedett féléletidő. A találmány tárgyát képezik olyan fúziós fehérjék is, amelyek a KIM-fehérje kiválasztott doménjeiből származó részeket tartalmaznak.
A variánsok a természetesen előforduló KIM-fehérjéktől aminosavszekvenciában különbözhetnek, vagy olyan tulajdonságokban, amelyek nem szekvenciával kapcsolatosak, vagy mindkettőben. Aminosavszekvencia-variánsokat úgy állíthatunk elő, ha egy vagy több, KIM-fehérjében természetesen előforduló aminosavat szubsztituálunk különböző természetű aminosawal, aminosavszármazékkal vagy nem natív aminosawal. Különösen olyan variánsok előnyösek, amelyekben a természetesen előforduló KIM-fehérje, vagy a természetesen előforduló KIM-fehérje biológiailag aktív fragmentumának szekvenciája egy vagy több konzervatív aminosavszubsztitúcióban tér el a vad típusú szekvenciától, amely tipikusan minimális hatással van a másodlagos szerkezetre és a fehérje vagy peptid hidrofób természetére. A variánsok olyan szekvenciával is rendelkezhetnek, amelyek egy vagy több nemkonzervatív szubsztitúcióban, delécióban vagy inszercióban különböznek, amelyek nem szüntetik meg a KIM-fehérje biológiai aktivitását. Konzervatív szubsztitúciók közé tipikusan olyan szubsztitúciók tartoznak, amelyekben egy aminosavat hasonló tulajdonságú aminosawal szubsztituálunk, például az alábbi csoportok között: valin, glicin; glicin, alanin; valin, izoleucin; aszparaginsav, glutaminsav; aszparagin, glutamin; szerin, treonin; lizin, arginin; és fenil-alanin, tirozin. A nempoláros (hidrofób) aminosavak közé tartozik az alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenil-alanin, triptofán és metionin. A poláros, semleges aminosavak közé tartozik a glicin, szerin, treonin, cisztein, tirozin, aszparagin és glutamin. A pozitívan töltött (bázikus) aminosavak közé tartozik az arginin, lizin és hisztidin. A negatívan töltött (savas) aminosavak közé tartozik az aszparaginsav és glutaminsav.
Más konzervatív szubsztitúciót az alábbi táblázatnak megfelelően végezhetünk, és másokat pedig Dayhoff, „Atlas of Protein Sequence and Structure” (1988) alapján.
1. táblázat
Konzervatív aminosavcserék
Aminosav Kód Csere az alábbiak közül bármelyikkel
Alanin A D-Ala, Gly, béta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginin R D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-lle, Orn, D-Orn
Aszparagin N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn
Aszparaginsav D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn
Cisztein C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamin Q D-GIn, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Glutaminsav E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-GIn
Glicin G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Béta-Ala, Acp
Izoleucin I D-lle, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucin L D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lizin K D-Lys, Arg, D-Arg, homoArg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-lle, Orn, D-Orn
Metionin M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-lle, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu
Fenil-alanin F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Transz-3,4- vagy 5-fenil-prolin, cisz-3,4- vagy 5-fenilprolin
Prolin P D-Pro, L-1-tioazolidin-4-karbonsav, D- vagy L-1-oxazolidin-4-karbonsav
HU 226 205 Β1
1. táblázat (folytatás)
Aminosav Kód Csere az alábbiak közül bármelyikkel
Szerin S D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Treonin T D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Tirozin Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valin V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-lle, Met, D-Met
A találmány szerinti más variánsok olyan módosításokkal jönnek létre, amelyek megnövelik a peptid stabilitását. Ilyen variánsok lehetnek például azok, amelyekben egy vagy több nempeptid kötés (amely helyettesíti a peptidkötést) van a peptidszekvenciában. A találmány tárgyát képezik olyan variánsok is, amelyek nem természetesen előforduló L-aminosavakat tartalmaznak, például D-aminosavakat, vagy természetesen nem előforduló vagy szintetikus aminosavakat, például béta- vagy gamma-aminosavakat és ciklikus variánsokat tartalmaznak. D-aminosavak beépülése L-aminosavak helyett a polipeptidbe megnövelheti rezisztenciájukat proteázok felé. Lásd például USP. 5.219.990 számú szabadalmi iratot.
Általában a szubsztitúcióktól azt várjuk, hogy a KIM-polipeptidek funkcionális tulajdonságaiban indukáljanak változásokat, amelyek során (i) hidrofil aminosavat, például szerint vagy treonint szubsztituálunk hidrofób aminosavra, például leucinra, izoleucinra, fenilalaninra vagy alaninra; (ii) ciszteint szubsztituálunk bármilyen más aminosavra; (iii) elektropozitív oldalláncot tartalmazó aminosavat, például lizint, arginint vagy hisztidint szubsztituálunk elektronegatív oldalláncot tartalmazó aminosavra, például glutaminsavra vagy aszparaginsavra; vagy (iv) nagyméretű oldalláncot tartalmazó aminosavat, például fenil-alanint szubsztituálunk ilyen oldallánccal nem rendelkező aminosavra, például glicinre.
A találmány szerinti peptidek módosítva lehetnek olyan különböző változtatásokkal is, mint például inszerciókkal, deléciókkal és szubsztitúciókkal akár konzervatívval, akár nemkonzervatíwal, amely változtatás bizonyos előnyökkel jár alkalmazásukban. „Splicing”varlánsok speciálisan a találmány tárgyát képezik.
A találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint, kevésbé konzervatív aminosavszubsztitúciókkal létrehozott variánsok is kívánt tulajdonságokkal rendelkező származékokat eredményezhetnek, például változást a töltésben, konformációban vagy más biológiai tulajdonságban. Ilyen szubsztitúciók lehetnek például hidrofil aminosavak szubsztitúciója hidrofil aminosavra, cisztein vagy prolin szubsztitúciója más aminosavra, kisméretű oldalláncot tartalmazó aminosavszubsztitúciója nagyméretű oldalláncot tartalmazó aminosavra, vagy nettó pozitív töltéssel rendelkező aminosavszubsztitúciója nettó negatív töltéssel rendelkező aminosavra. Ha az adott szubsztitúció eredményét nem lehet teljes bizonyossággal előre megállapítani, a származékokat könnyen meg lehet vizsgálni a leírásban ismertetett eljárások alkalmazásával, a kívánt tulajdonságok jelenlétének vagy hiányának meghatározása céljából.
A találmány igényelt oltalmi körébe tartozó variánsok közé tartoznak olyan fehérjék és peptidek, amelyek a KIM-fehérjével legalább 80%-os homológiát mutató aminosavszekvenciával rendelkeznek. Előnyösebben a szekvenciahomológia legalább 90% vagy legalább 95%. A homológia meghatározása céljából az összehasonlított szekvenciák hossza általában legalább 8 aminosavból áll, rendszerint legalább 20 aminosavból áll. A találmány szerinti vegyületek variánsai közé tartozik bármilyen olyan fehérje is, amely 1) a találmány szerinti KIM-fehérjével legalább 40% homológiával rendelkező aminosavszekvenciával rendelkezik, és olyan is, amelynek 2) szekvenciáját optimálisan a KIMszekvencia alá rendezve (az 5. ábrán bemutatjuk humán és patkányból származó ΚΙΜ-1-re), ciszteinjeinek helyzete legalább 80%-ban megegyezik a találmány szerinti KIM-fehérje ciszteinjeinek helyzetével.
Ahogyan a váz szubsztituenseit ki lehet cserélni, úgy a vázhoz kötődő funkcionális csoportokat is lehet szubsztituálni hasonló tulajdonságokkal rendelkező csoportokkal. Ezek a szubsztitúciók eredetileg konzervatívak, azaz a helyettesítőcsoport körülbelül ugyanolyan mérettel, alakkal, hidrofoblcitással és töltéssel rendelkezik, mint az eredeti csoport. Nem szekvenciában történő módosítás lehet például a természetesen előforduló KIM-fehérje részeinek in vivő vagy in vitro kémiai származékképzése, valamint változtatás acetilezésben, metilezésben, foszforilálásban, karboxilálásban vagy glikozilálásban.
A találmány tárgyát képezik a fehérjéhez (SEQ ID No: 3, 5 vagy 7) vagy a fehérje fragmentumához specifikusan kötődni képes ágensek is. Ezek az ágensek lehetnek ligandumok és antitestek (beleértve monoklonális, egyláncú, kétláncú antitesteket, Fab-fragmentumokat és másokat, akár natív, humán, humanizált, primatizált vagy kiméraantitesteket). Ezen fogalmak további leírását lásd PCT 95/16709 számú szabadalmi iratban, melyet a kitanítás részének tekintünk.
1. példa
RNS előállítása kifejlett patkányok ischaemiás és normálveséiből
Ischaemiás patkányvesékhez Witzgall és munkatársai [J. Clin. Invest. 93, 2175-2188 (1994)] leírása szerint jutottunk. Röviden összefoglalva, kifejlett Sprague-DawIey-féle patkány veséjében a veseartériát és visszeret 40 percre csíptetővel elzárjuk, és azután újra perfúziónak (reperfúzió) vetjük alá. A sérült veséket a patkányokból a perfúzió megindítása után 24 órával és 48 órával kivesszük. Normál- (áloperált) veséket is kiveszünk kifejlett, normál Sprague-DawIeyféle patkányokból.
Totál-RNS-t preparálunk a szervekből Glisin és munkatársai eljárása szerint [Biochemistry 13, 2633
HU 226 205 Β1 (1974)]. Röviden összefoglalva, a kivett szerveket rögtön GNC-pufferbe (4 M guanidium-tiocianát, 0,5% SDS, 25 mM nátrium-citrát, 0,1% Sigma habzásgátló) helyezzük, és jégen szétroncsoljuk „polytron” alkalmazásával. A sejttörmeléket klinikai centrifugában, alacsony fordulatszámon eltávolítjuk, és a felülúszó folyadékot 5,7 M cézium-kloridot, 25 mM nátrium-acetátot és 1 mM EDTA-t tartalmazó párnára helyezzük. Az RNS-t a párnán keresztül ülepítjük SW40Ti-rotorban, 22K-n, 15 óra hosszáig. Az RNS-t felszuszpendáljuk steril DEPC-vel kezelt vízben, kétszer kicsapjuk 1/10 térfogat 3 M nátrium-acetáttal és 2,5 térfogat etanollal. (PoliA+RNS)-t mRNS tisztítókészlet (Pharmacia katalógusszám: 27-9258-02) alkalmazásával izolálunk.
2. példa
Reprezentációs differenciaanalízis (RDA) módszere 1-7, 3-2 és 4-7 jelű RDAfragmentumok előállítására Dupla szálú cDNS-t szintetizálunk áloperált (normál) és 48 órával ischaemia utáni veséből származó (poliA+RNS)-ből, Gibco BRL „Superscript Choice™ System cDNA Synthesis Kit” (kat.sz. 18090) alkalmazásával. Az első szál szintetizálásához oligo-dT primereket és „Superscript II™” reverz transzkriptázt alkalmazunk. A második szálhoz E. coliból származó DNSpolimeráz-l és Rnáz-H, azután T4-DNS-polimeráz (BRL által ajánlott körülmények között) alkalmazásával jutunk.
Az RNS-analízist lényegében Hubánk és Schatz [Nucleic. Acid. Research 22, 5640-48 (1994)] által leírtak szerint végezzük. Röviden összefoglalva, 48 órával ischaemia utáni veséből származó cDNS-t emésztünk Dpnll-restrikciós enzimmel, és R-BgL-12/24 oligonukleotidokhoz ligáljuk (a pontos szekvenciát lásd a hivatkozásban). A linkerrel ligáit cDNS PCR-ampifikációját (Perkin-Elmer Taq-polimeráz alkalmazásával, a megfelelő pufferben végezzük) használjuk a kezdeti reprezentáció előállítására. A PCR-termék elnevezése „tester amplicon”. Ugyanezt az eljárást alkalmazzuk a „driver amplicon” előállítására az áloperált (normál) patkány veséjéből származó cDNS esetén.
A „tester” és a „driver amplicon-ok hibridizációját szelektív amplifikáció követi, melyet háromszor hajtunk végre az első (DPI), második (DP2) és harmadik (DP3) differenciatermék előállítása céljából. A DPI-termék előállítását Hubánk és Schatz [Nucleic Acid Research 22, 5640-48 (1994)] által leírtak szerint végezzük. A DP2 és DP3 előállítását szintén Hubánk és Schatz [mint fent] által leírtak szerint végezzük, kivéve azt, hogy a „driver:tester arányt 5,333:1-re változtatjuk DP2 esetén, és 40,000:1- vagy 4,000:1-re DP3 esetén.
Három RDA-terméket klónozunk DP3-ból pUC18 jelű klónozóvektorba. Az 1-7 jelű (252 bp méretű) RDA-terméket kapjuk, ha a DP3-at 40,000:1 arány alkalmazásával állítjuk elő, és 3-2 jelű (445 bp méretű) és 4-7 jelű (483 bp) méretű RDA-terméket kapjuk, ha a DP3-at 4,000:1 arány alkalmazásával állítjuk elő. A DNS-fragmentumokat szubklónozzuk Pharmacia „Sureclone™ kit (katalógusszám: 27-9300-01) alkalmazásával, hogy a PCR-fragmentumok végeit kijavítsuk Klenow-enzimmel, és hogy elősegítsük a fragmentumok tompa végű ligálását a pUC18-vektorba.
3. példa
Northern-analízis
Kifejlett normál- (áloperált) patkány, ischaemia után 48 órával kivett, sérült, kifejlett patkány veséjéből és 18 napos embrionális veséből származó, 2,5 pg (poIÍA+RNS)-t elektroforetizálunk és Northern-blotolunk [Cate, Cell 45, 685 (1986)] GeneScreen™-membránra (Dupont). A hibridizációt 10% dextrán-szulfátot és 100 pg/ml tRNS-t tartalmazó PBS-pufferben (50 mM TRIS pH=7,5, 1 M NaCI, 0,1% nátrium-pirofoszfát, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% BSA, 1% SDS) végezzük 65 °C-on, három különböző próba alkalmazásával: 1-7-RDA-termék, 3-2-termék és 4-7-RDA-termék. Valamennyit radioaktívan jelöljük Pharmacia „Ready to Go™”, random láncindítást alkalmazó jelölőkészlet (katalógusszám: 27-9251-01) alkalmazásával. Az 1-7-, 3-2- és 4-7-RDA-termékek mindhárom mintában lévő mRNS-hez hibridizálnak, de a legintenzívebben a ischaemia után 48 órával kivett, sérült veséből származó RNS-mintákkal.
A kifejlett patkányból származó szövetek Northernblot-analízise azt indikálja, hogy az 1-7-gén nagy kismértékben expresszálódik normál, kifejlett vesében, herében, lépben és tüdőben. A 3-2-gén májban, vesében, lépben és agyban expresszálódik. A4-7-gén lépben, vesében, tüdőben, herében, szívben, agyban, májban és vázizomban expresszálódik. Az 1-7- és 3-2-blotban, néhány szövet esetében eltérő méretű mRNS-ek jelenléte azt indikálja, hogy az 1-7-gén és a 3-2-gén primer transzkripciós termékében alternatív splicing és/vagy poliadenilálás mehet végbe.
4. példa
3-2 és 4-7 jelű cDNS-klónok izolálása cDNS-könyvtárat állítunk elő ischaemia után órával kivett, sérült veséből származó 4 g (poHA+RNS)-ből, cDNS szintézisére szolgáló „BRL Superscript Choice™ rendszer és „Stratagene™ Lambda Zapll cloning kit” (katalógusszám: 236201) alkalmazásával, a gyártók által ajánlott recept szerint.
105 kiónt szűrünk az 3-2-RDA-terméket alkalmazva próbaként (random láncindítással jelölve a fentebb leírtak szerint). Nyolc pozitív kiónt szelektálunk, és négyet random választunk ki a második analízishez, tiszta fág-plakkok előállítása céljából. A harmadik szűrés után négy tiszta fág-klónt izolálunk. A klónozott inszertumokat in vivő kivágással izoláljuk a fágból, „Stratagene™ Lambda Zapll cloning kit” szerinti eljárással. A körülbelül 2,6 kb méretű legnagyobb inszertumot (3-2 jelű cDNS-klón) DNS-szekvenálásnak vetjük alá. Az inszertum szekvenciáját (SEQ ID No: 1) bemutatjuk az 1. ábrán. A 3-2-cDNS-klónt (E. coli K-12, SOLR/p3-2#5-1) deponáltuk ATCC No. 98061 nyilvántartási szám alatt. A 3-2-cDNS-klón szekvenciája megegyezik az 1-7-cDNS-klón szekvenciájával (SEQ
HU 226 205 Β1
ID No: 2), kivéve azt, hogy az 1. számú szekvencia (SEQ ID No: 1) 136-605. nukleotidjai egy inszerciónak felelnek meg. Tehát a 2. számú szekvencia (SEQ ID No: 2) az 1. számú szekvencia (SEQ ID No: 1) egy splicingvariánsa. Az 1—7-klónt (E. coli K-12, SOLR/pl7#3—1) deponáltuk ATCC No. 98060 nyilvántartási szám alatt.
105 kiónt szűrünk az 1-7-RDA-terméket alkalmazva próbaként (random láncinditással jelölve a fentebb leírtak szerint). Nyolc pozitív kiónt szelektálunk, és négyet random választunk ki a második analízishez, tiszta fág-plakkok előállítása céljából. A harmadik szűrés után négy tiszta fág-klónt izolálunk. A klónozott inszertumokat in vivő kivágással izoláljuk a fágból, „Stratagene™ Lambda Zapll cloning kit szerinti eljárással. A körülbelül 2,0 kb méretű legnagyobb inszertet (1-7 jelű cDNS-klón) DNS-szekvenálásnak vetjük alá. Az inszert szekvenciáját (SEQ ID No: 2) bemutatjuk a
2. ábrán.
105 kiónt szűrünk a 4-7-RDA-terméket alkalmazva próbaként (random láncindítással jelölve a fentebb leírtak szerint). Nyolc pozitív kiónt szelektálunk, és négyet random választunk ki a második analízishez, tiszta fágplakkok előállítása céljából. A második szűrés után két tiszta fág-klónt izolálunk. A klónozott inszerteket in vivő kivágással izoláljuk a fágból, „Stratagene™ Lambda Zapll cloning kit” szerinti eljárással. A körülbelül 2,4 kb méretű legnagyobb inszertumot (4-7 jelű cDNS-klón) DNS-szekvenálásnak vetjük alá. Az inszert szekvenciáját (SEQ ID No: 4) bemutatjuk a 3. ábrán. A 4-7klónt (E. coli K-12, SOLR/p4-7#1-1) deponáltuk ATCC No. 98062 nyilvántartási szám alatt.
5. példa
Az 1-7, 3-2 és 4-7 jelű cDNS-klónok jellemzése
A) DNS- és fehérjeszekvenciák
A 3-2-cDNS szekvenciája (1. ábra; SEQ ID No: 1) egy 307 aminosavból álló nyitott leolvasási fázist tartalmaz (1. ábra; SEQ ID No: 3). Von Heijne-analízis [Von Heijne et al., Nucl. Acid. Rés. 14, 14683 (1986)] alapján egy 21 aminosavból álló szignálszekvenciára lehet következtetni, és körülbelül 235-237 aminosavból álló transzmembránrégió azt jelzi, hogy a 3-2-termék sejtfelszíni fehérje.
Az 1-7-cDNS szekvenciája (2. ábra; SEQ ID No: 2) egy 307 aminosavból álló nyitott leolvasási fázist tartalmaz, amely azonos a 3-2-cDNS által tartalmazott nyitott leolvasási fázissal (SEQ ID No: 3). A 4-7-cDNS szekvenciája (3. ábra; SEQ ID No: 4) egy 572 aminosavból álló nyitott leolvasási fázist tartalmaz (SEQ ID No: 5). A transzmembránrégió körülbelül a 501-521. aminosavak között helyezkedik el.
6) Kifejlett patkányok kontralaterális és posztischaemiás veséiből származó 1-7-, 3-2- és 4-7-mRNS in situ analízise
Az in situ hibridizációt Finch és munkatársai [Dev. Dynamics 203, 223-240 (1995)] által leírt eljárás szerint végezzük. Röviden összefoglalva, kontralaterális és posztischaemiás veséket perfúziófixáljuk 4%-os paraformaldehiddel PBS-ben. A veséket tovább fixáljuk egy éjszakán át 4 °C-on és processzáljuk. A paraffinos metszetekről eltávolítjuk a paraffint és rehidratáljuk, 4%-os paraformaldehiddel PBS-ben fixáljuk, proteinázK-val emésztjük, újra fixáljuk, azután ecetsavanhidriddel acetilezzük trietanol-amin-pufferben. A metszeteket azután újra dehidratáljuk, és 32P-jelölt ribopróbákkal hibridizáltatjuk 55 °C-on, egy éjszakán át, a 32P-jelölt ribopróbákat a pGEM-11Z BamHI-helyére szubklónozott 3-2-RDA-vagy 1-7-RDA-termékböl állítjuk elő. Hibridizáció után a metszeteket erősen sztringens körülmények között (2xSSC, 50% formamid 65 °C) mossuk. A metszeteket végül dehidratáljuk, emulzióval (NBT-2) burkoljuk az autoradiográfiához, és legalább egy hétre autoradiográfiának vetjük alá. Az ezüstszemcséket előhívjuk, és a metszeteket utánszínezzük toluidinkékkel, és mikrofilmre fényképezzük.
Az 1-7- és 3-2-mRNS-expresszió analízise in situ hibridizációval azt indikálja, hogy ezek a gének nagymértékben túlszabályozottak sérült vesesejtekben, ha azokat normálvesemetszeteken lévő expresszióhoz hasonlítjuk. Az expresszió a kéreg és a külső velő regeneratív sejtjeiben látható, amelyek többsége proximális vesecsatornasejtnek tűnik.
A 4-7 in situ RNS-expressziós mintázatának analízise szintén kimutatta, hogy a gén expressziója fokozott mértékű sérült, ischaemiás vesében, normál, kifejlett veséhez hasonlítva. Az expresszió az infiltratív sejteknél látszódik.
6. példa
Patkányból származó 3-2-cDNS-hez kereszthibridizáló humán cDNS-klón izolálása Az 1. ábrán bemutatott, 3-2-klón inszertjének
546-969. nukleotidjait tartalmazó, 32P-jelölt DNS-próbát állítunk elő, és alkalmazzuk humán embrionális májból származó, lambda-gt10-cDNS-könyvtár (Clontech kat.sz. HL5003a) szűrésére. 1*10® plakkot szűrünk két párhuzamossal, a fentebb leírtak szerinti standard körülményeket alkalmazva, de a szűrésnél alkalmazott hőmérséklet 55 °C. Erősen sztringens körülmények között végzett mosáshoz a szűrőket 2*SSC-ben mossuk, 55 °C-on. Ötven pozitív fágot azonosítunk és plakktisztítjuk, és DNS-t preparálunk. A fág-DNS-eket Southern-analízisnek vetjük alá, a fentebb leírt próbát alkalmazva. A Southern-blot-szűrőt egy utolsó mosásnak vetjük alá 0,5><SSC-ben, 55 °C-on. Két kiónt azonosítunk pozitívként. A H13-10-85-klón inszertjét szekvenáljuk, és egy olyan régiót találunk, amely a
3. ábrán bemutatott, 3-2-fehérjével nagymértékben azonos fehérjét kódol.
A humán 3-2-nek megfelelő fehérje nukleotidszekvenciáját (SEQ ID No: 6) és az előre látható aminosavszekvenciáját (SEQ ID No: 7) bemutatjuk a 4. ábrán. Az 5. ábrán bemutatott „bestfif-analízis kimutatta, hogy a humán 3-2-nek megfelelő fehérje 43,8%-ban azonos, és 59,1%-ban hasonló a patkányból származó 3-2-fehérjével. Mindkettő tartalmaz IgG-, mucin-, transzmembrán- és citoplazmatikus domént. Mindkét fehérjében, az IgG-doménben lévő hat cisztein konzervatív.
HU 226 205 Β1
7. példa
ΚΙΜ-1-lg fúziós fehérje előállítása
A KIM extracelluláris doménjéből és immmunoglobulin (lg) Fc-régiójából álló fúziós fehérje hasznos eszköz sérült/regenerálódó vese molekuláris és celluláris biológiájának tanulmányozására, valamint terápiás molekulaként alkalmazható. Humán és patkányból származó KIM-1-fehérje extracelluláris doménjével rendelkező KIM-lg fúziós fehérje előállítása céljából KIM-1 cDNS extracelluláris doménjének egy fragmentumát PCR alkalmazásával amplifikáljuk, és pCA125 jelű Biogén expressziós vektorba klónozzuk, COS-sejtek tranziens expressziója céljából. A pCA125 expressziós vektor olyan fúziós fehérjét termel, amelynek szerkezetét az N-terminálisnál klónozott gén és a C-terminálisnál klónozott humán Ig-Fc-régió alakítja ki. COS-sejteket transzfektálunk SJR 103 vagy 104 plazmiddal; ezek a plazmidok olyan fúziós fehérjét expresszálnak, amelyek az extracelluláris doménből származó, humán KIM 263-1147. (SEQ ID No: 6; SJR 103) vagy patkányból származó KIM 599-1319. (SEQ ID No: 1; SJR 104) pozíciók közötti szekvenciákat humán Ig-Fc-régióhoz fuzionálva tartalmaznak. A sejteket 10% FBS-el kiegészített DMEM-ben növesztjük a „sejtgyárban (Nunc, Naperville, IL). Két-három nappal a transzfekció után a tápközeget elkülönítjük, Amicon töményítő alkalmazásával koncentráljuk, és a fúziós fehérjét Protein-A Sepharose oszlopon tisztítjuk. Tisztítás után a fúziós fehérje tisztaságát SDS-PAGE-val vizsgáljuk.
A találmány szerinti vegyületek diagnosztikai alkalmazása
A találmány szerinti, 3., 5. vagy 7. számú (SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 vagy SEG ID No: 7) fehérjékhez vagy fragmentumaikhoz specifikusan kötődni képes anti-KIM-antitestek számos diagnosztikai eljárásban hasznosak. Ezeket az ágenseket detektálható markerekkel jelölhetjük, például fluoreszcenciás vagy radioaktív eljárással detektálható anyagokkal, és beadjuk az alanynak, hogy lehetővé tegyük a KIM-fehérjét expresszáló szöveteket leképezését. Az ágenseket olyan anyagokhoz, például tormából származó peroxidázhoz is köthetjük, amelyeket immunocitokémiai festőanyagként alkalmazhatunk, hogy lehetővé tegyük a KIM-fehéije-pozitív sejtek láthatóvá tételét hisztológiai metszeteken. A specifikus antitestet alkalmazhatjuk egymagában a fenti módon, és azokat a helyeket, ahol az megkötődött, láthatóvá tehetjük szendvicseljárásban a detektálható markerhez kötődő antiimmunglobulin-antitest alkalmazásával.
KIM-fehérjére specifikus antitesteket szintén alkalmazhatunk testszövet- és testfolyadékmintákban lévő KIM kimutatására, vagy koncentrációjának meghatározására szolgáló immunológiai vizsgálati eljárásokban. A koncentrációk összhangban lehetnek különböző betegállapotokkal. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás vesesérülés diagnosztizálására vagy vesegyógyulás követésére egy páciens vizeletében, plazmájában vagy szérumában lévő KIM vagy KIM-fragmentumok koncentrációjának mérésével. Ehhez hasonlóan KIM-et mérhetünk vizeletüledékben, különösen a vizeletüledékben lévő sejttörmelékben. A vesecsatornák sejtjeinek maradványai, amelyek jelen lehetnek vesebetegség előrehaladott állapotában lévő páciensek vizeletüledékében, emelkedett mennyiségben tartalmazhatnak KIM-fehérjét és mRNS-t.
KIM-fehérjére specifikus antitesteket szilárd hordozóhoz, például gyöngyökhöz vagy mikrotitertálcákhoz is köthetünk, és a ligandum oldatból való eltávolítására alkalmazhatjuk, akár a fehérje vagy módosított változatainak (például poszttranszlációs módosítások) mérése, akár tisztítása és jellemzése céljából. Egy páciensben lévő KIM-fehérje ilyen jellemzése hasznos lehet olyan káros mutánsok vagy detektív folyamatok azonosítására, amelyek megzavarják a KIM-funkciót és abnormális páciensfenotípusokkal asszociáltak. Immunológiában járatos szakember számára ezen technikák mindegyike rutinfeladatot jelent.
További olyan leképezőmódszerekben alkalmazunk KIM-et vagy KIM-fragmentumokat, amelyekben azok leképezhető csoportokhoz vannak fuzionálva, olyan szövetek, különösen tumorok diagnosztikai célú leképezése céljából, amelyek KIM-ligandumokat expresszálnak.
További diagnosztikai technikák túlszabályzott KIMmRNS kimutatására alapulnak, a sérüléssel kapcsolatos folyamatok indikációjaként. Ezeket a technikákat az alábbiak szerint, ischaemiás sérülést szenvedett patkányokban létrehozott modellben teszteltük és működőképesnek találtuk.
Annak meghatározása céljából, hogy a KIM-1-fehérje mennyisége megnövekszik-e a sérülés után, kontralaterális és posztischaemiás vesékből származó vesehomogenizátumokat vizsgáltunk 24 és 48 órával azután, hogy az egyes patkányok egyik veséjében a veseartériát és visszeret 40 percre csiptetővel elzártuk. A vesehomogenizátumban meghatároztuk a KIM-1-fehérjét. Az ischaemiás sérülés utáni mintában Westemblot-anal Ízissei három olyan fehérjét azonosítottunk két különböző antitest alkalmazásával, amelyek nem voltak detektálhatok azokban a homogenizátumokban, amelyek ischaemiás sérülésnek nem alávetett, kontralaterális vesékből származtak. A sávok látszólagos molekulatömege körülbelül 40 kDa, 50 kDa és 70-80 kDa volt. A Western-blotolással detektált három típusú fehérje ugyanannak a fehérjének glikozilált formáit képviselheti, amely adott, potenciális N- és O-glikozilálási helyekkel rendelkezik. Az a tény, hogy ezen fehérjék mindegyike két különböző készlet poliklonális antitesttel reagál, alátámasztja azt az elméletet, hogy azok KIM-1gyei rokon szerkezetűek, és nem keresztreagáló sávok. Ezen feltételezést a fehérjék részleges CNBr-os hasításának eredményei igazolták, amely kimutatta, hogy közös CNBr-fragmentumokkal rendelkeznek. Mivel az előzetes feltételezés szerint a KIM-1-fehérje citoplazmatikus doménje nem tartalmaz jelentős poszttranszlációs módosítást, az emésztmény (KIM-1 citoplazmatikus doménjére specifikus antitestekkel detektált) két kisebb termékének (4,7 kDa és 7,4 kDa) ugyanolyan mé10
HU 226 205 Β1 retűnek kell lennie a három különböző KIM-1-fehérjesáv esetén, ha ugyanabból a fehérjéből származnak. Megfigyeltük, hogy a 40 kDa és 70-80 kDa méretű KIM-1-fehérjékből keletkezett fragmentumok az előzetesen feltételezett méret szerint vándoroltak. Az 50 kDa méretű fehérjesáv emésztménye ugyanolyan C-terminális mintázatú peptidet eredményezett.
A ΚΙΜ-1-szekvencia két feltételezett N-glikozilációs helyet és egy mucin-domént tartalmaz, ahol O-glikozilálás fedheti a polipeptidláncot. A posztischaemiás vesében detektált három KIM-1-sáv ugyanazon magfehérje glikozilációs variánsainak felel meg. N-deglikozilálás PNG-áz-F-fel végezve mindhárom sáv eltolódását eredményezte alacsonyabb molekulatömeg felé, ami körülbelül 3 kDa veszteségnek felel meg, azt indikálva, hogy mindhárom fehérje N-glikozilált. Az O-glikoziláltságban lévő különbségek magyarázhatják a három sáv méretbeli különbségét.
A találmány szerinti vegyületek terápiás alkalmazása
A találmány szerinti terápiás eljárásokban KIM-ligációtól függő, celluláris válaszokat szelektíven elősegítünk vagy gátiunk. Ha a KIM és a KIM-ligandum, mindkettő, membránkötött, és különböző sejtek expresszálják azokat, a szignáltranszdukció végbemehet a KIM-et expresszáló sejtben, a KIM-ligandumot expresszáló sejtben, vagy mindkettőben.
A KIM-ligációval keltett válasz KIM-ligandumot expresszáló sejtben előidézhető, ha a sejtet exogén KIMmel, KIM-fúziós fehérjékkel vagy KIM-ligandumra specifikus aktiválóantitestekkel érintkeztetünk, in vitro vagy in vivő. Továbbá KIM-ligandumot expresszáló sejtek válaszai (amelyek egyébként endogén KIM-mel elindíthatok) úgy blokkolhatok, hogy a KIM-ligandumot expresszáló sejteket KIM-ligandum-antagonistával (például antagonista antitesttel, amely KIM-ligandumhoz képes kötődni) érintkeztetünk, vagy endogén KIM-et érintkeztetünk anti-KIM-antitesttel vagy más KIM-et kötni képes molekulával, amely megakadályozza a KIM és KIM-ligandum közötti hatékony ligációt.
Ehhez hasonlóan, a KIM-et expresszáló sejtekben, KIM-ligációval keltett válaszokat elősegíthetünk vagy gátolhatunk exogén vegyületekkel. Például KIM-ligációval keltett választ KIM-et expresszáló sejtben úgy hozhatunk létre, hogy a sejtet érintkeztetjük szolubilis KIM-ligandummal, vagy bizonyos anti-KIM aktiválóantitesttel. Továbbá KIM-ligandumot expresszáló sejtek válaszai (amelyeket egyébként endogén KIM-ligandummal való kölcsönhatás elindíthat) úgy blokkolhatok, hogy a KIM-et expresszáló sejteket KIM-antagonistával (például blokkolóantitesttel, amely KIM-hez képes kötődni úgy, hogy megakadályozza a hatékony, jelkeltésre képes KIM-ligációt) érintkeztetünk, vagy endogén KIM-ligandumot érintkeztetünk KIM-ligandumra specifikus antitesttel vagy más KIM-ligandumot kötni képes molekulával, amely megakadályozza a KIM és KIM-ligandum közötti hatékony ligációt.
A fentebb leírt beavatkozások különösen a tárgyhoz tartozó, gátolandó patológiai folyamat vagy orvosilag kívánatos, elősegítendő folyamat kóroktani mechanizmusára épülő terápiás alkalmazásokban hatékonyak, amint orvosi gyakorlatban jártas szakember számára ez nyilvánvaló. Például ha a KIM-ligáció kívánt celluláris növekedést, differenciált fenotípus fenntartását, különböző behatásokra indukálódó apoptózissal szembeni rezisztenciát vagy más, orvosilag előnyös választ eredményez, a fentebb leírt egyik beavatkozást alkalmazhatjuk, amely elősegíti a ligáció hatására beinduló választ. Más módszer szerint, egy gátlóhatású beavatkozás lehet hatásos akkor, ha a KIM-ligáció nemkívánatos következményeket von maga után, például neopláziás növekedést, a celluláris funkció káros elvesztését, apoptózissal szembeni érzékenységet, vagy gyulladásos folyamatok elősegítését.
Az alábbiakban példákat ismertetünk a fentebb leírt, találmány szerinti eljárásokra. A találmány szerinti, KIM-mel kapcsolatos vegyületek egyik terápiás alkalmazása vesebetegségben szenvedő alany kezelésére szolgál, amelynek során új szövet növekedését segítjük elő az alanyban, vagy a károsodott szövet túlélését segítjük elő az alanyban, amely eljárásban a találmány szerinti KIM-fehérje vagy a találmány szerinti fehérjét tartalmazó gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét beadjuk az alanynak. Az eljárásokban alkalmazott fehérje lehet teljes hosszúságú KIM-fehérje egy fragmentuma, szolubilis KIM-ligandum-fehérje vagy fúziós fragmentum, vagy KIM-agonista. Ezeket az eljárásokat úgy is kivitelezhetjük, hogy beadunk az alanynak találmány szerinti agonista antitest vagy találmány szerinti agonista antitestet tartalmazó gyógyszerkészítmény terápiásán hatásos mennyiségét. KIM-fehérjét beadhatunk olyan, második vegyület terápiásán hatásos mennyiségével együtt, amely orvosilag kívánatos kiegészítőhatást fejt ki. Míg ezek az eljárások bármilyen szövet kezelésére alkalmazhatók, előnyösen például veseszövet, máj-, idegszövet, szív, gyomor, vékonybél, gerincvelő vagy tüdő szövete kezelhető. Különösen rendellenes állapotban lévő vese kezelhető jótékonyan a találmány szerinti vegyületekkel, például akut veseelégtelenség, akut vesegyulladás, krónikus veseelégtelenség, nefrotikus szindróma, vesecsatorna-defektusok, veseátültetések, toxikus sérülés, hipoxiás sérülés és trauma esetén. A vesecsatoma-elégtelenség lehet öröklött vagy szerzett természetű, például policisztás vese, cisztás vesevelő és szivacsvesevelő. A felsorolás nem teljes, és tartalmazhat sok más vese-rendellenességet [lásd például „Harrison’s Principles of Internál Medicine”, 13. kiadás (1994), melyet a kitanítás tárgyának tekintünk]. Az eljárásokban a kezelést embereken is végezhetjük.
KIM-ligandumot expresszáló szövet nemkívánatos növekedésének egy alanyban történő gátlására szolgáló terápiás beavatkozás során az alanynak beadunk terápiásán hatásos mennyiségű KIM-antagonistát (például antagonista antitestet, amely KIM-ligandumhoz képes kötődni), vagy beadunk terápiásán hatásos mennyiségű anti-KIM-antitestet vagy más KIM-et kötni képes molekulát, amely blokkolja a KIM kötődését a KIM-ligandumot expresszáló szövethez. A találmány
HU 226 205 Β1 egy előnyös megvalósítási módja szerint, a KIM-antagonistát vagy az anti-KIM-antitestet terápiásán olyan tumorok növekedésének gátlására vagy blokkolására alkalmazhatjuk, amelyek növekedésükben KIM-fehérjétől függenek.
A találmány szerinti más eljárásokban elpusztítunk KIM-ligandumot expresszáló tumorsejteket, vagy gátoljuk növekedésüket úgy, hogy a sejteket KIM-et tartalmazó fúziós fehérjével és egy toxinnal vagy radioaktív nukliddal, vagy toxinhoz vagy radioaktív nuklidhoz konjugált KIM-ligandumra specifikus antitesttel érintkeztetjük. A sejt lehet az alanyban, és a fehérjét vagy a konjugált antitestet beadhatjuk az alanynak.
Szintén a találmány tárgyát képezi eljárás toxin vagy radioaktív nuklid célba juttatására KIM-et expresszáló sejtekbe, amelyben a sejtet KIM-ligandumot tartalmazó fúziós fehérjével és egy toxinnal vagy radioaktív nukliddal, vagy toxinhoz vagy radioaktív nuklidhoz konjugált KIM-re specifikus antitesttel érintkeztetjük. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás KIM-et expresszáló tumorsejt növekedésének szuppresszálására, amelyben a sejtet KIM-ligandumot tartalmazó fúziós fehérjével és egy toxinnal vagy radioaktív nukliddal, vagy toxinhoz vagy radioaktív nuklidhoz konjugált KIM-re specifikus antitesttel érintkeztetjük; a sejt lehet az alanyban, és a fehérjét beadhatjuk az alanynak.
Az „alany” kifejezés jelenthet bármilyen emlőst, amelynek beadunk KIM-et. A találmány szerinti eljárással kezelt adott alanyok lehetnek emberek, valamint nem emberfőemlősök, juh, lovak, szarvasmarha, kecskék, sertések, kutyák, macskák, nyulak, tengerimalacok, hörcsögök, versenyegerek, patkányok és egerek, valamint szervek, tumorok és ezen gazdaszervezetekből származó vagy eredő sejtek.
A találmány szerinti vegyületek alkalmazása génterápiában
A találmány szerinti KIM-géneket bevisszük károsodott szövetbe vagy olyan szövetbe, amelynek kívánatos a stimulált növekedése. Ilyen génterápia a KIMfehérjék termelését stimulálja a transzfektált sejtek által, elősegítve sejtnövekedést és/vagy a KIM-fehérjét expresszáló sejtek túlélését.
A találmány előnyös, génterápiás eljárást alkalmazó megvalósítási módja szerint, KIM-fehérjét kódoló gént bevihetünk vesecélszövetbe, A KIM-fehérje stabilan expresszálódhat, és sejtnövekedést, -osztódást vagy -differenciálódást stimulál, vagy lehetővé teszi a sejt túlélését. Továbbá KIM-gént jutatthatunk be a célsejtbe sokféle ismert módszer, virális vagy nemvirális alapú stratégiák alkalmazásával.
Nemvirális módszerek például elektroporáció, membránfúzió liposzómákkal, nagy sebességű részecskebombázás DNS-sel burkolt mikrorészecskékkel, inkubáció kalcium-foszfát-DNS-csapadékkal, DEAE-dextrán-közvetített transzfekció és közvetlen mikroinjektálás egyetlen sejtbe. A KIM-gén bevihető egy sejtbe például kalcium-foszfáttal való együttkicsapással [Pillicer et al., Science 209, 1414-1422 (1980)];
mechanikai mikroinjektálással és/vagy részecskegyorsítással [Anderson et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77, 5399-5403 (1980)]; liposzómára alapuló DNS-transzferrel [például LIPOFEKTIN-közvetített transzfekcióval, Fefgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 471-477 (1987); Gao és Huang, Biochim. Biophys. Rés. Comm. 179, 280-285 (1991)]; DEAE-dextrán-közvetített transzfekcióval; elektroporációval (USP 4.956.288 számú szabadalmi irat); vagy polilizinalapú eljárásokkal, amelyben a DNS célba juttató DNS-hez van konjugálva, amely előnyösen májhepatocitákba való célba juttatásra alkalmas [Wolff et al., Science 247, 465-468 (1990); Curie) et al., Humán Gene Therapy 3, 147-154 (1992)].
A célsejteket a találmány szerinti génekkel közvetlen géntranszferrel transzfektálhatjuk, lásd például Wolff és munkatársai: „Direct Gene Transfer Intő Moose Muscle In Vivő”, Science 247, 1465-68 (1990). Sok esetben vektorközvetített transzfekció kívánatos. Szakember által ismert bármilyen módszer alkalmazható, amely polinukleotidszekvenciák vektorba való inszertálására szolgál [lásd például Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); és Ausubel et al., „Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley&Sons, NY (1992), mindkettőt a kitanítás részének tekintjük], A promoteraktiváció lehet szövetspecifikus, vagy metabolikus termék, vagy beadott anyag által indukálható. Promoter/enhanszerek például natív c-ret-ligandumfehérjéből származó promoter, citomegalovírusból származó azonnali korai promoter/enhanszer [Karasuyama et al., J. Exp. Med. 169, 13 (1989)]; humán béta-aktinból származó promoter [Gunning et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4831 (1987)]; egéremlőtumor-vírusban lévő glükokortikoid-indukálható promoter hosszú terminális ismétlődő szekvenciája (MMTV LTR) [Weiss et al., „RNA Tumor Viruses”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1985)]; SV40 korai régió promotere [Bernoist és Chambon, Natúré 290, 304 (1981)]; Rous-szarkóma-vírus promotere (RSV) [Yamamoto et al., Cell 22, 787 (1980)]; herpes simplex vírus (HSV) timidin-kináz promotere [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1441 (1981)]; adenovíruspromoter [Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3567 (1985)].
A KIM-géneket specifikus vírusvektorokkal is bevihetjük géntranszferrendszerekben való alkalmazáshoz, amelyek szakember által jól ismertek. Lásd például Madzak és munkatársai, J. Gén. Virol. 73, 1533-36 (1992) (papovavírus SV40); Berkner és munkatársai, Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158, 39-61 (1992) (adenovírus); Hofmann és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10099-10103 (1995) (baculovírus); Moss és munkatársai, Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158, 25-38 (1992) (tehénhimlővírus); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 758, 97-123 (1992) (adenoasszociált vírus); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158, 67-93 (1992) [herpes simplex vírus és Epstein-Barr-féle vírus (HBV)]; Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158, 1-24 (1992) (retrovírus); Brandyopad12
HU 226 205 Β1 hyay és munkatársai, Mól. Cell. Bioi. 4, 749-754 (1984) (retrovírus); Miller és munkatársai, Natúré 357, 455-450 (1992) (retrovírus); Anderson, Science 256, 808-813 (1992) (retrovírus); „Current Protocols in Molecular Biology: Sectlons 9.10-9.14” (szerk. Ausubel et al.), Greene Publishing Associcates (1989), valamennyit a kitanítás részének tekintjük.
Előnyös vektorok a DNS-vírusok, például adenovírusok (előnyösen Ad-2- vagy Ad-5-alapú vektorok), baculovírus, herpeszvírusok (előnyösen herpes simplex vírusra alapuló vektor) és parvovírusok (előnyösen „defektív vagy nem autonóm parvovírusra alapuló vektorok, előnyösebben adenoasszociált vírusra alapuló vektorok, legelőnyösebben AAV-2-alapú vektorok). Lásd például Ali és munkatársai, Gene Therapy 1, 367-384 (1994); USP 4.797.368 és 5.399.346 számú szabadalmi iratok és az alábbi tárgyalás.
Egy bevitelre, például KIM-szekvencia bevitelére szolgáló adott vektorrendszer kiválasztása különféle faktoroktól függ. Fontos faktor a célsejt-populáció természete. Bár a retrovirális vektorokat alaposan vizsgálták, és számos génterápiában alkalmazták, általában nem alkalmasak olyan sejtek fertőzésére, amelyek nem osztódnak, de rákterápiában alkalmazhatók, mert csak integrálják és expresszálják génjeiket replikálódó sejtekben. Hasznosak ex vivő megközelítésekre, és ebben a vonatkozásban alkalmazásuk vonzó, mert a célsejtgenomba stabilan integrálódnak.
Az adenovírusok eukarióta DNS-vírusok, amelyeket módosítani lehet terápiás hatású vagy riportertranszgén hatékony célba juttatására különféle sejttípusokba. Az általánosan előforduló, 2. és 5. típusú adenovírusok (Ad2 és Ad5, sorrendben) a légzési rendszer betegségét váltják ki emberekben, és jelenleg a Duchenne-féle izomdisztrófia (DMD) és a cisztás fibrózis (CF) génterápiájára fejlesztik azokat. Az Ad2 és Ad5, mindkettő olyan adenovírus-alosztályba tartozik, amely nincs összefüggésben emberi malignitásokkal. Az adenovírusvektorok kimagaslóan nagy hatékonysággal képesek transzgént célba juttatni jóformán valamennyi sejttípusba, függetlenül attól, az milyen mitotikus állapotban van. Nagy titerű (1013 plakkformáló egység/ml) rekombináns vírus könnyen előállítható 293sejtekben (adenovírussal transzformált, humán embrionális vesesejtvonalat komplementál: ATCC CRL1573) és kriosztátban tárolható hosszabb ideig számottevő veszteség nélkül. A rendszer hatékonyságát állatmodelleken szemléltették terápiás hatású transzgén genetikai hiány komplementálását szolgáló, in vivő célba juttatásában, különböző rendellenességek esetén. Lásd Watanabe, Atherosclerosis 36, 261-268 (1986); Tanzawa és munkatársai, FEBS Letters 118 (1), 81-84 (1980); Golasten és munkatársai, New Engl. J. Med. 309, 288-296 (1983); Ishibashi és munkatársai, J. Clin. Invest. 92, 883-893 (1993); és Ishibashi és munkatársai, J. Clin. Invest. 93, 1889-1893 (1994), valamennyit a kitanítás részének tekintjük. Valóban, cisztás fibrózis transzmembrán szabályozó (CFTR) cDNS-ét kódoló, rekombináns, replikációdeficiens adenovírus megfelelőnek bizonyult legalább két humán CF-et kezelő klinikai kísérletben. Lásd Wilson, Natúré 365, 691-692 (1993). A rekombináns adenovírusok génterápiában való alkalmazhatóságának biztonságát támasztja alá továbbá az élő adenovírusokról emberi populációkban szerzett nagy mennyiségű tapasztalat.
Az első generációs, rekombináns, replikációdeficiens, DMD és más örökölt rendellenesség génterápiájára kifejlesztett adenovírusok az egész E1a- és az E1b-régió egy részének delécióját tartalmazzák. Ezt a replikációdeficiens vírust olyan 293-sejtekben növesztjük, amelyek tartalmazzák az adenovírusból származó funkcionális E1a-gént, amely biztosítja működőképes E1a-fehérje jelenlétét. Az E1-deléciót tartalmazó vírusok képesek replikálódni és fertőző vírusokat előállítani 293-sejtekben, amelyek biztosítják az E1a- és E1b-régió géntermékét „transz’-ban. Az így kapott vírus képes sok sejttípust fertőzni, és képes a bevitt gént expresszálni (feltéve, ha az saját promotert tartalmaz), de nem képes replikálódni olyan sejtben, amely nem tartalmaz E1-régió-DNS-t, hacsak a sejtet nagyon magas kópiaszámmal fertőzzük. Az adenovírusok előnye, hogy gazdaszervezeteik széles körből származhatnak, képesek nyugvó vagy véglegesen differenciálódott sejteket, például neuronokat megfertőzni, és lényegében nem onkogének. Úgy tűnik, az adenovírusok nem integrálódnak a gazdaszervezet genomjába. Mivel extrakromoszomálisan léteznek, az inszerciós mutagenezis kockázata nagymértékben lecsökkent (Ali et al., mint fent 373-nál). A rekombináns adenovírusok (rAdV) nagyon magas titerben termelődnek, a víruspartikulumok tűrhetően stabilak, az expresszió mértéke magas, és széles körből származó sejteket képesek megfertőzni. Természetes gazdasejtjeik a légutak epitéliumában vannak, így tüdőrák terápiájában hasznosak.
A baculovírusközvetített bevitel számos előnnyel rendelkezik. Baculovírus génbevitel történhet replikálódó és nemreplikálódó sejtekbe, és történhet vesesejtekbe, valamint hepatocitákba, idegsejtekbe, lép, bőr és izom sejtjeibe. A baculovírus nem replikálódik és nem patogén emlőssejtekben. Emberek nem rendelkeznek előzetesen meglévő antitestekkel rekombináns baculovírusokkal szemben, amelyek blokkolhatják a fertőzést. Továbbá a baculovírus képes nagyon nagy méretű DNS-inszerteket beépíteni és transzdukálni.
Adenoasszociált vírusokat (AAV) szintén alkalmaznak vektorként szomatikus génterápia céljára. Az AAV kicsi, egyszálú (ss) DNS-vírus egyszerű genomi szerveződéssel (4-7 kb méretű), amely ideálissá teszi génsebészeti eljárásokhoz. Két nyitott leolvasási fázis repés cap-polipeptldek sorozatát kódolja. A rep-polipeptidek (rep78, rep68, rep62 és rep40) az AAV-genom replikációjában, mentésében és integrációjában játszanak szerepet. A cap-fehérjék (VP1, VP2 és VP3) alakítják ki a virionkapszidot. A rap és cap nyitott leolvasási fázisok 5’- és 3'-végi szegélyezőrégiói 145 bp méretű, invertált terminális ismétlődő szekvenciák (ITR-ek), amelyek első 125 bp méretű része képes kialakítani Y vagy T alakú duplex struktúrákat. Az AAV-vektorok kifejlesztésének az a jelentősége, hogy az egész rep- és
HU 226 205 Β1 cap-domén kivágható, és helyettesíthető terápiás hatású vagy riportertranszgénnel. Lásd B. J. Carter, „Handbook of Parvoviruses”, szerk. P. Tijsser, CRC Press, 155-168. old. (1990). Kimutatták, hogy az ITR-ek rendelkeznek azzal a minimális szekvenciával, amely replikációhoz, mentéshez, csomagoláshoz és az AAV-genomba való integrációhoz szükséges.
Az adenoasszociált vírusok (AAV) szignifikáns lehetőséget hordoznak génterápiában. A víruspartikulumok nagyon stabilak, és a rekombináns AAV-k (rAAV) „gyógyszerszerű” jellemzőkkel rendelkeznek, mivel az rAAV centrifugálással vagy cézium-kloridos gradiensen tisztítható. Hőstabilak és por alakúra liofilizálhatók és teljes aktivitásra rehidratálhatók. DNS-ük stabilan integrálódik a gazdaszervezet kromoszómájába, így az expresszió hosszan tartó. Gazdaszervezetük széles körből származhat, és az AAV nem okoz semmilyen ismert betegséget, így a rekombináns vektorok nem toxikusak.
Ha a célsejtbe bevisszük azokat, a kérdéses szekvenciákat szokásos eljárások alkalmazásával azonosíthatjuk, például nukleinsavhibridizációval, próbaként olyan szekvenciákat alkalmazva, amelyek a vektor inszertált génszekvenciáival homológok/komplementerek. Egy másik megközelítés szerint a szekvenciákat „markergén” funkciójának (például timidin-kináz-aktivitás, antibiotikumrezisztencia és hasonlók) meglétével vagy annak hiányával azonosíthatjuk, melyet az expressziós vektor célsejtbe juttatása okozott.
Gyógyszerformák és beadásuk
A találmány szerinti vegyületek a standard gyakorlat szerint formázhatok, például hordozó-segédanyagban preparálva. A „farmakológiailag elfogadható hordozó kifejezés egy vagy több, szerves vagy szervetlen, természetes vagy szintetikus adalék anyagot jelent, amellyel a mutáns protoonkogén vagy mutáns onkoprotein kombinálva van a beadás elősegítése céljából. Megfelelő hordozó steril nátrium-klorid-oldatot tartalmaz, bár szakember számára más vizes vagy nemvizes, izotóniás, steril oldatok és steril szuszpenziók is ismeretesek gyógyászatilag elfogadható hordozóként. Ebben a vonatkozásban a „hordozó kifejezésen liposzómákat és a HIV-1 tat-fehérjét is értünk [lásd Chan et al., Anal. Biochem. 227, 168-175 (1995)], valamint bármilyen plazmidot és virális expressziós vektort.
A találmány szerinti bármelyik új polipeptid alkalmazható gyógyászatilag elfogadható só formájában. A találmány szerinti polipeptidekkel sókat kialakítani képes, megfelelő savak és bázisok ismeretesek szakember számára, például szervetlen és szerves savak és bázisok.
A találmány szerinti vegyületeket terápiásán hatásos mennyiségben adjuk be egy alanynak, ami a vegyületnek azt a mennyiségét jelenti, amely orvosilag kívánatos eredményt ér el vagy hatást fejt ki az adott kezelendő állapotra. A találmány szerinti vegyület hatásos mennyisége képes a betegség, degeneratív vagy károsult állapot előrehaladásának gyengítésére vagy késleltetésére. A hatásos mennyiséget egyedi alapon határozhatjuk meg, és részben az alany fizikai állapotának, a kezelendő szimptómáknak és az elérendő eredmények mérlegelésére alapul. A terápiásán hatá10 sós mennyiséget szakember képes meghatározni, ilyen faktorok és rutinkísérletek felhasználásával.
A találmány szerinti vegyületeket liposzóma alkalmazásával célba juttató rendszer lehet unilamelláris, multilamelláris vagy stabil plurilamelláris vezikulumok bármi15 lyen variációja, és előállítható és beadható szakember által ismert módszerekkel, például az USP 5.169.637, 4.762.915, 5.000.958 vagy 5.185.154 számú szabadalmi iratok kitanítása szerint. Továbbá kívánatos lehet a találmány szerinti, új polipeptidek, valamint más, kivá20 lasztott polipeptidek, például lipoproteinek expresszálása abból a célból, hogy fokozzuk liposzómákhoz való kötődésüket. Például humán, akut veseelégtelenség kezelését liposzómába kapszulázott KIM-fehérjével úgy végezhetjük in vivő, hogy beviszünk KIM-fehérjét ilyen kezelésre szoruló sejtekbe liposzómák alkalmazásával. A liposzómákat katéteren keresztül juttathatjuk a veseartériához. A rekombináns KIM-fehérjét például CHOsejtekből tisztítjuk immunoaffinitáskromatográfiával vagy bármilyen más alkalmas módszerrel, azután összeke30 verjük liposzómákkal és nagy hatékonysággal azokba juttatjuk. A kapszulázott fehérjét in vitro tesztelhetjük sejtnövekedést stimuláló hatására vonatkozóan.
A találmány szerinti vegyületek beadhatók bármilyen orvosilag elfogadható módon. Ez lehet injekció, parenterális úton, például intravénásán, intravaszkulárisan, intraartériásan, szubkután, intramuszkulárisan, intratumorálisan, intraperitoneálisan, intraventrikulárisan, intraepidurálisan vagy másképpen, például orálisan, nazálisán, szembe, rektálisan vagy topikálisan.
A beadás utáni késleltetett felszívódás szintén speciálisan a találmány tárgyát képezi, például tartalékot tartalmazó injekciók vagy lebontható implantátumok. A találmány tárgyát képezi különösen a lokalizált célba juttatás, például katéteren keresztüli célba juttatás egy vagy több artériához, például a veseartériához vagy lokalizált tumort ellátó érhez.
Bár a fenti találmányt szemléltetés céljából írtuk le bizonyos részletességgel, és a példák a világos megértést szolgálják, nyilvánvaló, hogy szakember képes bi50 zonyos változtatásokat és módosításokat végezni, amelyek nem haladják meg a találmány igényelt oltalmi körét, melyet csak a csatolt igénypontok korlátoznak.
Szekvenciák jegyzéke SEQUENCE LISTING (2) INFORMATION FÓR SEQ ID No: 1 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2566 base pairs (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid
HU 226 205 Β1 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 615..1535 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID No: 1
GCGGCCGCGT CGACGGTGCC TGTGAGTAAA TAGATCAGGG TCTCCTTCAC AGCACATTCT 60
CCAGGAAGCC GAGCAAACAT TAGTGCTATT TTACCCAGGA GGAAATCTAG GTGTAGAGAG 120
CTCTACGGAT CTAAGGTTTG GATCTGTACC CAGTGCTTTT TTAGGTGTCT TTAGACATTT 180
CTCAGGAAGA TGTAGTCTCT GTCACCATGT GTGGCTGAAT TCTAGCTCAG TCCATCTTAT 240
TGTGTTTAAG GTAGTTGAAG TTTAGGAACC AACCAGTATG TCTCTGAGCA GAAGAGTACA 300
GTGTCCATCT TGAGGACAAG CTCATCTTTA CCATTAGAGG GCTGGCCTTG GCTTAGATTC 360
TACCGAGAAC ATACTCTCTA ATGGCTGCCC TCAGTTTTCT CTGTTTGCTG TCTTATTTGT 420
GTCATGGCCA GAAGTCATAT GGATGGCTCT ATGTGAGCAA GGACCCAGAT AGAAGAGTGT 480
ATTTGGGGGA ACAGGTTGCC CTAACAGAGA GTCCTGTGGG ATTCATGCAG TCAGGATGAA 540
GACCTGATCA GACAGAGTGT GCTGAGTGCC ACGGCTAACC AGAGTGACTT GTCACTGTCC 600
TTCAGGTCAA CACC ATG Met 1 GTT Val CAA CTT CAA GTC TTC Phe ATT Ile TCA Ser GGC Gly 10 CTC Leu CTG Leu 650
Gin Leu Gin 5 Val
CTG CTT CTT CCA GGC TCT GTA GAT TCT TAT GAA GTA GTG AAG GGG GTG 698
Leu Leu Leu Pro Gly Ser Val Asp Ser Tyr Glu Val Val Lys Gly Val
15 20 25
GTG GGT CAC CCT GTC ACA ATT CCA TGT ACT TAC TCA ACA CGT GGA GGA 746
Val Gly His Pro Val Thr Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Thr Arg Gly Gly
30 35 40
ATC ACA ACG ACA TGT TGG GGC CGG GGG CAA TGC CCA TAT TCT AGT TGT 794
Ile Thr Thr Thr Cys Trp Gly Arg Gly Gin Cys Pro Tyr Ser Ser Cys
45 50 55 60
CAA AAT ATA CTT ATT TGG ACC AAT GGA TAC CAA GTC ACC TAT CGG AGC 842
Gin Asn Ile Leu Ile Trp Thr Asn Gly Tyr Gin Val Thr Tyr Arg Ser
65 70 75
AGC GGT CGA TAC AAC ATA AAG GGG CGT ATT TCA GAA GGA GAC GTA TCC 890
Ser Gly Arg Tyr Asn Ile Lys Gly Arg Ile Ser Glu Gly Asp Val Ser
80 85 90
TTG ACA ATA GAG AAC TCT GTT GAT AGT GAT AGT GGT CTG TAT TGT TGC 938
Leu Thr Ile Glu Asn Ser Val Asp Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cys
95 100 105
CGA GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG ACC TTT TCA 986
Arg Val Glu Ile Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met Thr Phe Ser
110 115 120
TTG GAA GTT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA AGA CCC ACA 1034
Leu Glu Val Lys Pro Glu Ile Pro Thr Ser Pro Pro Thr Arg Pro Thr
125 130 135 140
ACT ACA AGA CCC ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA ACA AGA TCC 1082
Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Ile Ser Thr Arg Ser
145 150 155
HU 226 205 Β1
ACA Thr CAT His GTA Val CCA Pro 160 ACA TCA ACC Thr AGA Arg GTC Val 165 TCC Ser ACC Thr TCT Ser ACT Thr CCA Pro 170 ACA Thr CCA Pro 1130
Thr Ser
GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC ACT ACA TTT TAT GCC CAT 1178
Glu Gin Thr Gin Thr His Lys Pro Glu Ile Thr Thr Phe Tyr Ala His
175 180 185
GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT CCT GCA GAC 1226
Glu Thr Thr Ala Glu Val Thr Glu Thr Pro Ser Tyr Thr Pro Ala Asp
190 195 200
TGG AAT GGC ACT GTG ACA TCC TCA GAG GAG GCC TGG AAT AAT CAC ACT 1274
Trp Asn Gly Thr Val Thr Ser Ser Glu Glu Ala Trp Asn Asn His Thr
205 210 215 220
GTA AGA ATC CCT TTG AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT AAG GGC TTC 1322
Val Arg Ile Pro Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn Pro Thr Lys Gly Phe
225 230 235
TAT GTT GGC ATG TCC GTT GCA GCC CTG CTG CTG CTG CTG CTT GCG AGC 1370
Tyr Val Gly Met Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser
240 245 250
ACC GTG GTT GTC ACC AGG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAG ATG GGC TCT 1418
Thr Val Val Val Thr Arg Tyr Ile Ile Ile Arg Lys Lys Met Gly Ser
255 260 265
CTG AGC TTT GTT GCC TTC CAT GTC TCT AAG AGT AGA GCT TTG CAG AAC 1466
Leu Ser Phe Val Ala Phe His Val Ser Lys Ser Arg Ala Leu Gin Asn
270 275 280
GCA GCG ATT GTG CAT CCC CGA GCT GAA GAC AAC ATC TAC ATT ATT GAA 1514
Ala Ala Ile Val His Pro Arg Ala Glu Asp Asn Ile Tyr Ile Ile Glu
285 290 295 300
GAT AGA TCT CGA GGT GCA GAA TGAGTCCCAG AGGCCTTCTG TGGGGCCTTC 1565
Asp Arg Ser Arg Gly Ala Glu
305
TGCCTGGGAT TACAGAGATC GTGACTGATT TCACAGAGTA AAATACCCAT TCCAGCTCCT 1625 GGGAGATTTT GTGTTTTGGT TCTTCCAGCT GCAGTGGAGA GGGTAACCCT CTACCCTGTA 1685 TATGCAAAAC TCGAGGTTAA CATCATCCTA ATTCTTGTAT CAGCAACACC TCAGTGTCTC 1745 CACTCACTGC AGCGATTCTC TCAAATGTGA ACATTTTAGA AGTTTGTGTT TCCTTTTGTC 1805 CATGTAATCA TTGGTAATAC AAGAATTTTA TCTTGTTTAT TAAAACCATT AATGAGAGGG 1865 GAATAGGAAT TAAAAGCTGG TGGGAAGGGC CTCCTGAATT TAGAAGCACT TCATGATTGT 1925 GTTTATCTCT TTTATTGTAA TTTGAAATGT TACTTCTATC CTTCCCAAGG GGCAAAATCA 1985 TGGGAGCATG GAGGTTTTAA TTGCCCTCAT AGATAAGTAG AAGAAGAGAG TCTAATGCCA 2045 CCAATAGAGG TGGTTATGCT TTCTCACAGC TCTGGAAATA TGATCATTTA TTATGCAGTT 2105 GATCTTAGGA TGAGGATGGG TTTCTTAGGA GGAGAGGTTA CCATGGTGAG TGGACCAGGC 2165 ACACATCAGG GGAAGAAAAC AATGGATCAA GGGATTGAGT TCATTAGAGC CATTTCCACT 2225 CCACTTCTGT CTTGATGCTC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG AATTAGGTGC 2285 AGGGAGGAGA CGTGCAGAAA CGAAAGAGGA AAGAAAGGAG AGAGAGCAGG ACACAGGCTT 2345 TCTGCTGAGA GAAGTCCTAT TGCAGGTGTG ACAGTGTTTG GGACTACCAC GGGTTTCCTT 2405 CAGACTTCTA AGTTTCTAAA TCACTATCAT GTGATCATAT TTATTTTTAA AATTATTTCA 2465 GAAAGACACC ACATTTTCAA TAATAAATCA GTTTGTCACA ΑΤΤΑΑΤΆΑΑΑ TATTTTGTTT 2525 GCTAAGAAGT AAAAAAAAAA AAAAAAAGTC GACGCGGCCG C 2566
HU 226 205 Β1 (2) INFORMATION FÓR SEQ ID No: 2 (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2084 base pairs (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (li) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 145..1065 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID No: 2
GCGGCCGCGT CGACGGTGCC TGTGAGTAAA TAGATCAGGG TCTCCTTCAC AGCACATTCT 60
CCAGGAAGCC GAGCAAACAT TAGTGCTATT TTACCCAGGA GGAAATCTAG GTGTAGAGAG 120
CTCTACGGAT CTAAGGTCAA CACC ATG GTT CAA CTT CAA GTC TTC ATT TCA 171
Met Val Gin Leu Gin Val Phe Ile Ser
5
GGC Gly 10 CTC Leu CTG CTG CTT Leu CTT Leu 15 CCA Pro GGC Gly TCT Ser GTA Val GAT Asp 20 TCT Ser TAT Tyr GAA Glu GTA Val GTG Val 25 219
Leu Leu
AAG GGG GTG GTG GGT CAC CCT GTC ACA ATT CCA TGT ACT TAC TCA ACA 267
Lys Gly Val Val Gly His Pro Val Thr Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Thr
30 35 40
CGT GGA GGA ATC ACA ACG ACA TGT TGG GGC CGG GGG CAA TGC CCA TAT 315
Arg Gly Gly Ile Thr Thr Thr Cys Trp Gly Arg Gly Gin Cys Pro Tyr
45 50 55
TCT AGT TGT CAA AAT ATA CTT ATT TGG ACC AAT GGA TAC CAA GTC ACC 363
Ser Ser Cys Gin Asn Ile Leu Ile Trp Thr Asn Gly Tyr Gin Val Thr
60 65 70
TAT CGG AGC AGC GGT CGA TAC AAC ATA AAG GGG CGT ATT TCA GAA GGA 411
Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Asn Ile Lys Gly Arg Ile Ser Glu Gly
75 80 85
GAC GTA TCC TTG ACA ATA GAG AAC TCT GTT GAT AGT GAT AGT GGT CTG 459
Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Ser Val Asp Ser Asp Ser Gly Leu
90 95 100 105
TAT TGT TGC CGA GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG 507
Tyr Cys Cys Arg Val Glu Ile Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met
110 115 120
ACC TTT TCA TTG GAA GTT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA 555
Thr Phe Ser Leu Glu Val Lys Pro Glu Ile Pro Thr Ser Pro Pro Thr
125 130 135
AGA CCC ACA ACT ACA AGA CCC ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA 603
Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Ile Ser
140 145 150
HU 226 205 Β1
ACA AGA Thr Arg TCC Ser ACA Thr CAT His GTA Val CCA Pro 160 ACA TCA ACC AGA Arg GTC Val 165 TCC Ser ACC Thr TCT Ser ACT Thr 651
Thr Ser Thr
155
CCA ACA CCA GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC ACT ACA TTT 699
Pro Thr Pro Glu Gin Thr Gin Thr His Lys Pro Glu Ile Thr Thr Phe
170 175 180 185
TAT GCC CAT GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT 747
Tyr Alá His Glu Thr Thr Alá Glu Val Thr Glu Thr Pro Ser Tyr Thr
190 195 200
CCT GCA GAC TGG AAT GGC ACT GTG ACA TCC TCA GAG GAG GCC TGG AAT 795
Pro Alá Asp Trp Asn Gly Thr Val Thr Ser Ser Glu Glu Alá Trp Asn
205 210 215
AAT CAC ACT GTA AGA ATC CCT TTG AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT 843
Asn His Thr Val Arg Ile Pro Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn Pro Thr
220 225 230
AAG GGC TTC TAT GTT GGC ATG TCC GTT GCA GCC CTG CTG CTG CTG CTG 891
Lys Gly Phe Tyr Val Gly Met Ser Val Alá Alá Leu Leu Leu Leu Leu
235 240 245
CTT GCG AGC ACC GTG GTT GTC ACC AGG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAG 939
Leu Alá Ser Thr Val Val Val Thr Arg Tyr Ile Ile Ile Arg Lys Lys
250 255 260 265
ATG GGC TCT CTG AGC TTT GTT GCC TTC CAT GTC TCT AAG AGT AGA GCT 987
Met Gly Ser Leu Ser Phe Val Alá Phe His Val Ser Lys Ser Arg Alá
270 275 280
TTG CAG AAC GCA GCG ATT GTG CAT CCC CGA GCT GAA GAC AAC ATC TAC 1035
Leu Gin Asn Alá Alá Ile Val His Pro Arg Alá Glu Asp Asn Ile Tyr
285 290 295
ATT ATT GAA GAT AGA TCT CGA GGT GCA GAA TGAGTCCCAG AGGCCTTCTG 1085
Ile Ile Glu Asp Arg Ser Arg Gly Alá Glu
300 305
TGGGGCCTTC TGCCTGGGAT TACAGAGATC GTGACTGATT TCACAGAGTA AAATACCCAT 1145 TCCAGCTCCT GGGAGATTTT GTGTTTTGGT TCTTCCAGCT GCAGTGGAGA GGGTAACCCT 1205 CTACCCTGTA TATGCAAAAC TCGAGGTTAA CATCATCCTA ATTCTTGTAT CAGCAACACC 1265 TCAGTGTCTC CACTCACTGC AGCGATTCTC TCAAATGTGA ACATTTTAGA AGTTTGTGTT 1325 TCCTTTTGTC CATGTAATCA TTGGTAATAC AAGAATTTTA TCTTGTTTAT TAAAACCATT 1385 AATGAGAGGG GAATAGGAAT TAAAAGCTGG TGGGAAGGGC CTCCTGAATT TAGAAGCACT 1445 TCATGATTGT GTTTATCTCT TTTATTGTAA TTTGAAATGT TACTTCTATC CTTCCCAAGG 1505 GGCAAAATCA TGGGAGCATG GAGGTTTTAA TTGCCCTCAT AGATAAGTAG AAGAAGAGAG 1565 TCTAATGCCA CCAATAGAGG TGGTTATGCT TTCTCACAGC TCTGGAAATA TGATCATTTA 1625 TTATGCAGTT GATCTTAGGA TGAGGATGGG TTTCTTAGGA GGAGAGGTTA CCATGGTGAG 1685 TGGACCAGGC ACACATCAGG GGAAGAAAAC AATGGATCAA GGGATTGAGT TCATTAGAGC 1745 CATTTCCACT CCACTTCTGT CTTGATGCTC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG 1805 AATTAGGTGC AGGGAGGAGA CGTGCAGAAA CGAAAGAGGA AAGAAAGGAG AGAGAGCAGG 1865 ACACAGGCTT TCTGCTGAGA GAAGTCCTAT TGCAGGTGTG ACAGTGTTTG GGACTACCAC 1925 GGGTTTCCTT CAGACTTCTA AGTTTCTAAA TCACTATCAT GTGATCATAT TTATTTTTAA 1985 AATTATTTCA GAAAGACACC ACATTTTCAA TAATAAATCA GTTTGTCACA ATTAATAAAA 2045 TATTTTGTTT GCTAAGAAGT AAAAAGTCGA CGCGGCCGC 2084
HU 226 205 Β1 (2) INFORMATION FÓR SEQ ID No: 3 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 307 amino acids (Β) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID No:
Met 1 Val Gin Leu Gin 5 Val Phe Ile
Gly Ser Val Asp 20 Ser Tyr Glu Val
Val Thr Ile 35 Pro Cys Thr Tyr Ser 40
Cys Trp 50 Gly Arg Gly Gin Cys 55 Pro
Ile 65 Trp Thr Asn Gly Tyr 70 Gin Val
Asn Ile Lys Gly Arg 85 Ile Ser Glu
Asn Ser Val Asp 100 Ser Asp Ser Gly
Pro Gly Trp 115 Phe Asn Asp Gin Lys 120
Pro Glu 130 Ile Pro Thr Ser Pro 135 Pro
Thr 145 Thr Thr Arg Pro Thr 150 Thr Ile
Thr Ser Thr Arg Val 165 Ser Thr Ser
Thr His Lys Pro 180 Glu Ile Thr Thr
Glu Val Thr 195 Glu Thr Pro Ser Tyr 200
Val Thr 210 Ser Ser Glu Glu Alá 215 Trp
Leu 225 Arg Lys Pro Gin Arg 230 Asn Pro
Ser Val Alá Alá Leu Leu Leu Leu
245
Ser Gly Leu Leu Leu Leu Leu Pro 10 15
Val Lys Gly Val Val Gly His Pro 25 30
Thr Arg Gly Gly Ile Thr Thr Thr 45
Tyr Ser Ser Cys Gin Asn Ile Leu 60
Thr Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Tyr 75 80
Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu 90 95
Leu Tyr Cys Cys Arg Val Glu Ile 105 110
Met Thr Phe Ser Leu Glu Val Lys 125
Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro 140
Ser Thr Arg Ser Thr His Val Pro 155 160
Thr Pro Thr Pro Glu Gin Thr Gin 170 175
Phe Tyr Alá His Glu Thr Thr Alá 185 190
Thr Pro Alá Asp Trp Asn Gly Thr 205
Asn Asn His Thr Val Arg Ile Pro 220
Thr Lys Gly Phe Tyr Val Gly Met 235 240
Leu Leu Alá Ser Thr Val Val Val 250 255
HU 226 205 Β1
Thr Arg Tyr Ile Ile Ile Arg Lys Lys Met Gly Ser Leu Ser Phe Val
260 265 270
Alá Phe His Val Ser Lys Ser Arg Alá Leu Gin Asn Alá Alá Ile Val
275 280 285
His Pro Arg Alá Glu Asp Asn Ile Tyr Ile Ile Glu Asp Arg Ser Arg
290 295 300
Gly Alá Glu
305 (2) INFORMATION FÓR SEQ ID No: 4 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2303 base pairs (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 107..1822 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID No: 4
GCGGCCGCGT CGACTCGCAG GAGGCCGGCA CTCTGACTCC TGGTGGATGG GACTAGGGAG 60
TCAGAGTCAA GCCCTGACTG GCTGAGGGCG GGCGCTCCGA GTCAGC ATG GAA AGT 115
Met Glu Ser 1
CTC Leu TGC Cys 5 GGG GTC Gly Val CTG Leu GTA Val TTT Phe 10 CTG Leu CTG Leu CTG Leu GCT Alá GCA Alá 15 GGA Gly CTG Leu CCG Pro CTC Leu 163
CAG GCG GCC AAG CGG TTC CGT GAT GTG CTG GGC CAT GAG CAG TAT CCG 211
Gin Alá Alá Lys Arg Phe Arg Asp Val Leu Gly His Glu Gin Tyr Pro
20 25 30 35
GAT CAC ATG AGG GAG AAC AAC CAA TTA CGT GGC TGG TCT TCA GAT GAA 259
Asp His Met Arg Glu Asn Asn Gin Leu Arg Gly Trp Ser Ser Asp Glu
40 45 50
AAT GAA TGG GAT GAA CAG CTG TAT CCA GTG TGG AGG AGG GGA GAG GGC 307
Asn Glu Trp Asp Glu Gin Leu Tyr Pro Val Trp Arg Arg Gly Glu Gly
55 60 65
AGA TGG AAG GAC TCC TGG GAA GGA GGC CGT GTG CAG GCA GCC CTA ACC 355
Arg Trp Lys Asp Ser Trp Glu Gly Gly Arg Val Gin Alá Alá Leu Thr
70 75 80
AGT GAT TCA CCG GCC TTG GTG GGT TCC AAT ATC ACC TTC GTA GTG AAC 403
Ser Asp Ser Pro Alá Leu Val Gly Ser Asn Ile Thr Phe Val Val Asn
85 90 95
CTG GTG TTC CCC AGA TGC CAG AAG GAA GAT GCC AAC GGC AAT ATC GTC 451
Leu Val Phe Pro Arg Cys Gin Lys Glu Asp Alá Asn Gly Asn Ile Val
100 105 110 115
HU 226 205 Β1
TAT Tyr GAG AGG AAC Glu Arg Asn TGC Cys 120 AGA Arg AGT Ser GAT Asp TTG Leu GAG Glu 125 CTG Leu GCT Alá TCT Ser GAC Asp CCG Pro 130 TAT Tyr 499
GTC TAC AAC TGG ACC ACA GGG GCA GAC GAT GAG GAC TGG GAA GAC AGC 547
Val Tyr Asn Trp Thr Thr Gly Alá Asp Asp Glu Asp Trp Glu Asp Ser
135 140 145
ACC AGC CAA GGC CAG CAC CTC AGG TTC CCC GAC GGG AAG CCC TTC CCT 595
Thr Ser Gin Gly Gin His Leu Arg Phe Pro Asp Gly Lys Pro Phe Pro
150 155 160
CGC CCC CAC GGA CGG AAG AAA TGG AAC TTC GTC TAC GTC TTC CAC ACA 643
Arg Pro His Gly Arg Lys Lys Trp Asn Phe Val Tyr Val Phe His Thr
165 170 175
CTT GGT CAG TAT TTT CAA AAG CTG GGT CGG TGT TCA GCA CGA GTT TCT 691
Leu Gly Gin Tyr Phe Gin Lys Leu Gly Arg Cys Ser Alá Arg Val Ser
180 185 190 195
ATA AAC ACA GTC AAC TTG ACA GTT GGC CCT CAG GTC ATG GAA GTG ATT 739
Ile Asn Thr Val Asn Leu Thr Val Gly Pro Gin Val Met Glu Val Ile
200 205 210
GTC TTT CGA AGA CAC GGC CGG GCA TAC ATT CCC ATC TCC AAA GTG AAA 787
Val Phe Arg Arg His Gly Arg Alá Tyr Ile Pro Ile Ser Lys Val Lys
215 220 225
GAC GTG TAT GTG ATA ACA GAT CAG ATC CCT ATA TTC GTG ACC ATG TAC 835
Asp Val Tyr Val Ile Thr Asp Gin Ile Pro Ile Phe Val Thr Met Tyr
230 235 240
CAG AAG AAT GAC CGG AAC TCG TCT GAT GAA ACC TTC CTC AGA GAC CTC 883
Gin Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu Arg Asp Leu
245 250 255
CCC ATT TTC TTC GAT GTC CTC ATT CAC GAT CCC AGT CAT TTC CTC AAC 931
Pro Ile Phe Phe Asp Val Leu Ile His Asp Pro Ser His Phe Leu Asn
260 265 270 275
TAC TCT GCC ATT TCC TAC AAG TGG AAC TTT GGG GAC AAC ACT GGC CTG 979
Tyr Ser Alá Ile Ser Tyr Lys Trp Asn Phe Gly Asp Asn Thr Gly Leu
280 285 290
TTT GTC TCC AAC AAT CAC ACT TTG AAT CAC ACG TAT GTG CTC AAT GGA 1027
Phe Val Ser Asn Asn His Thr Leu Asn His Thr Tyr Val Leu Asn Gly
295 300 305
ACC TTC AAC TTT AAC CTC ACC GTG CAA ACT GCA GTG CCG GGA CCA TGC 1075
Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val Gin Thr Alá Val Pro Gly Pro Cys
310 315 320
CCC TCA CCC ACA CCT TCG CCT TCT TCT TCG ACT TCT CCT TCG CCT GCA 1123
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser Pro Alá
325 330 335
TCT TCG CCT TCA CCC ACA TTA TCA ACA CCT AGT CCC TCT TTA ATG CCT 1171
Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro Ser Leu Met Pro
340 345 350 355
HU 226 205 Β1
ACT Thr GGC Gly CAC His AAA Lys TCC Ser 360 ATG Met GAG Glu CTG Leu AGT Ser GAC Asp 365 ATT Ile TCC Ser AAT Asn GAA Glu AAC Asn 370 TGC Cys 1219
CGA ATA AAC AGA TAT GGT TAC TTC AGA GCC ACC ATC ACA ATT GTA GAT 1267
Arg Ile Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Alá Thr Ile Thr Ile Val Asp
375 380 385
GGA ATC CTA GAA GTC AAC ATC ATC CAG GTA GCA GAT GTC CCA ATC CCC 1315
Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gin Val Alá Asp Val Pro Ile Pro
390 395 400
ACA CCG CAG CCT GAC AAC TCA CTG ATG GAC TTC ATT GTG ACC TGC AAA 1363
Thr Pro Gin Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe Ile Val Thr Cys Lys
405 410 415
GGG GCC ACT CCC ACG GAA GCC TGT ACG ATC ATC TCT GAC CCC ACC TGC 1411
Gly Alá Thr Pro Thr Glu Alá Cys Thr Ile Ile Ser Asp Pro Thr Cys
420 425 430 435
CAG ATC GCC CAG AAC AGG GTG TGC AGC CCG GTG GCT GTG GAT GAG CTG 1459
Gin Ile Alá Gin Asn Arg Val Cys Ser Pro Val Alá Val Asp Glu Leu
440 445 450
TGC CTC CTG TCC GTG AGG AGA GCC TTC AAT GGG TCC GGC ACG TAC TGT 1507
Cys Leu Leu Ser Val Arg Arg Alá Phe Asn Gly Ser Gly Thr Tyr Cys
455 460 465
GTG AAT TTC ACT CTG GGA GAC GAT GCA AGC CTG GCC CTC ACC AGC GCC 1555
Val Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Alá Ser Leu Alá Leu Thr Ser Alá
470 475 480
CTG ATC TCT ATC CCT GGC AAA GAC CTA GGC TCC CCT CTG AGA ACA GTG 1603
Leu Ile Ser Ile Pro Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro Leu Arg Thr Val
485 490 495
AAT GGT GTC CTG ATC TCC ATT GGC TGC CTG GCC ATG TTT GTC ACC ATG 1651
Asn Gly Val Leu Ile Ser Ile Gly Cys Leu Alá Met Phe Val Thr Met
500 505 510 515
GTT ACC ATC TTG CTG TAC AAA AAA CAC AAG ACG TAC AAG CCA ATA GGA 1699
Val Thr Ile Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Thr Tyr Lys Pro Ile Gly
520 525 530
AAC TGC ACC AGG AAC GTG GTC AAG GGC AAA GGC CTG AGT GTT TTT CTC 1747
Asn Cys Thr Arg Asn Val Val Lys Gly Lys Gly Leu Ser Val Phe Leu
535 540 545
AGC CAT GCA AAA GCC CCG TTC TCC CGA GGA GAC CGG GAG AAG GAT CCA 1795
Ser His Alá Lys Alá Pro Phe Ser Arg Gly Asp Arg Glu Lys Asp Pro
550 555 560
CTG CTC CAG GAC AAG CCA TGG ATG CTC TAAGTCTTCA CTCTCACTTC 1842
Leu Leu Gin Asp Lys Pro Trp Met Leu
565 570
TGACTGGGAA CCCACTCTTC TGTGCATGTA TGTGAGCTGT GCAGAAGTAC ATGACTGGTA 1902 GCTGTTGTTT TCTACGGATT ATTGTAAAAT GTATATCATG GTTTAGGGAG CGTAGTTAAT 1962 TGGCATTTTA GTGAAGGGAT GGGAAGACAG TATTTCTTCA CATCTGTATT GTGGTTTTTA 2022 TACTGTTAAT AGGGTGGGCA CATTGTGTCT GAAGGGGGAG GGGGAGGTCA CTGCTACTTA 2082
HU 226 205 Β1
AGGTCCTAGG TTAACTGGGA GAGGATGCCC CAGGCTCCTT AGATTTCTAC ACAAGATGTG CCTGAACCCA GCTAGTCCTG ACCTAAAGGC CATGCTTCAT CAACTCTATC TCAGCTCATT GAACATACCT GAGCACCTGA TGGAATTATA ATGGAACCAA GCTTGTTGTA TGGTGTGTGT GTGTACATAA GATACTCATT AAAAAGACAG TCTATTAAAA A (2) INFORMATION FÓR SEQ ID No: 5 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 572 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID No: 5
Met Glu Ser Leu Cys Gly Val Leu Val Phe Leu Leu Leu Alá Alá Gly 15 10 15
Leu Pro Leu Gin Alá Alá Lys Arg Phe Arg Asp Val Leu Gly His Glu 20 25 30
Gin Tyr Pro Asp His Met Arg Glu Asn Asn Gin Leu Arg Gly Trp Ser 35 40 45
Ser Asp Glu Asn Glu Trp Asp Glu Gin Leu Tyr Pro Val Trp Arg Arg 50 55 60
Gly Glu Gly Arg Trp Lys Asp Ser Trp Glu Gly Gly Arg Val Gin Alá 65 70 75 80
Alá Leu Thr Ser Asp Ser Pro Alá Leu Val Gly Ser Asn Ile Thr Phe 85 90 95
Val Val Asn Leu Val Phe Pro Arg Cys Gin Lys Glu Asp Alá Asn Gly 100 105 110
Asn Ile Val Tyr Glu Arg Asn Cys Arg Ser Asp Leu Glu Leu Alá Ser 115 120 125
Asp Pro Tyr Val Tyr Asn Trp Thr Thr Gly Alá Asp Asp Glu Asp Trp 130 135 140
Glu Asp Ser Thr Ser Gin Gly Gin His Leu Arg Phe Pro Asp Gly Lys
145 150 155 160
Pro Phe Pro Arg Pro His Gly Arg Lys Lys Trp Asn Phe Val Tyr Val
165 170 175
Phe His Thr Leu Gly Gin Tyr Phe Gin Lys Leu Gly Arg Cys Ser Alá 180 185 190
Arg Val Ser Ile Asn Thr Val Asn Leu Thr Val Gly Pro Gin Val Met 195 200 205
Glu Val Ile Val Phe Arg Arg His Gly Arg Alá Tyr Ile Pro Ile Ser 210 215 220
Lys Val Lys Asp Val Tyr Val Ile Thr Asp Gin Ile Pro Ile Phe Val 225 230 235 240
2142
2202
2262
2303
HU 226 205 Β1
Thr Met Tyr Gin Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu 245 250 255
Arg Asp Leu Pro Ile Phe Phe Asp Val Leu Ile His Asp Pro Ser His 260 265 270
Phe Leu Asn Tyr Ser Alá Ile Ser Tyr Lys Trp Asn Phe Gly Asp Asn 275 280 285
Thr Gly Leu Phe Val Ser Asn Asn His Thr Leu Asn His Thr Tyr Val 290 295 300
Leu Asn Gly Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val Gin Thr Alá Val Pro
305 310 315 320
Gly Pro Cys Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro
325 330 335
Ser Pro Alá Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro Ser 340 345 350
Leu Met Pro Thr Gly His Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp Ile Ser Asn 355 360 365
Glu Asn Cys Arg Ile Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Alá Thr Ile Thr 370 375 380
Ile Val Asp Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gin Val Alá Asp Val
385 390 395 400
Pro Ile Pro Thr Pro Gin Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe Ile Val
405 410 415
Thr Cys Lys Gly Alá Thr Pro Thr Glu Alá Cys Thr Ile Ile Ser Asp 420 425 430
Pro Thr Cys Gin Ile Alá Gin Asn Arg Val Cys Ser Pro Val Alá Val 435 440 445
Asp Glu Leu Cys Leu Leu Ser Val Arg Arg Alá Phe Asn Gly Ser Gly 450 455 460
Thr Tyr Cys Val Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Alá Ser Leu Alá Leu
465 470 475 480
Thr Ser Alá Leu Ile Ser Ile Pro Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro Leu
485 490 495
Arg Thr Val Asn Gly Val Leu Ile Ser Ile Gly Cys Leu Alá Met Phe 500 505 510
Val Thr Met Val Thr Ile Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Thr Tyr Lys 515 520 525
Pro Ile Gly Asn Cys Thr Arg Asn Val Val Lys Gly Lys Gly Leu Ser 530 535 540
Val Phe Leu Ser His Alá Lys Alá Pro Phe Ser Arg Gly Asp Arg Glu 545 550 555 560
HU 226 205 Β1
Lys Asp Pro Leu Leu Gin Asp Lys Pro Trp Met Leu 565 570 (2) INFORMATION FÓR SEQ ID No: 6 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1795 base pairs (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 278..1279 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID No: 6
GCGGCCGCGT CGACGAAGCT GGGAAGTCAG GGGCTGTTTC TGTGGGCAGC TTTCCCTGTC 60
CTTTGGAAGG CACAGAGCTC TCAGCTGCAG GGAACTAACA GAGCTCTGAA GCCGTTATAT 120
GTGGTCTTCT CTCATTTCCA GCAGAGCAGG CTCATATGAA TCAACCAACT GGGTGAAAAG 180
ATAAGTTGCA ATCTGAGATT TAAGACTTGA TCAGATACCA TCTGGTGGAG GGTACCAACC 240
AGCCTGTCTG CTCATTTTCC TTCAGGCTGA TOCCATA ATG CAT CCT CAA GTG GTC 295
Met His Pro Gin Val Val 1 5
ATC TTA AGC CTC ATC CTA CAT CTG GCA GAT
Ile Leu Ser Leu 10 Ile Leu His Leu Ala 15 Asp
AAG GTT GGT GGA GAG GCA GGT CCA TCT GTC
Lys Val Gly 25 Gly Glu Ala Gly Pro 30 Ser Val
AGT GGA GCT GTC ACA TCA ATG TGC TGG AAT
Ser Gly 40 Ala Val Thr Ser Met 45 Cys Trp Asn
TTC ACA TGC CAA AAT GGC ATT GTC TGG ACC
Phe 55 Thr Cys Gin Asn Gly 60 Ile Val Trp Thr
TAT CGG AAG GAC ACA CGC TAT AAG CTA TTG
Tyr Arg Lys Asp Thr 75 Arg Tyr Lys Leu Leu 80
GAT GTC TCT TTG ACC ATA GAA AAT ACA GCT
Asp Val Ser Leu 90 Thr Ile Glu Asn Thr 95 Ala
TAT TGT TGC CGT GTT GAG CAC CGT GGG TGG
Tyr Cys Cys 105 Arg Val Glu His Arg 110 Gly Trp
ACC GTA TCA TTG GAG ATT GTG CCA CCC AAG
Thr Val 120 Ser Leu Glu Ile Val 125 Pro Pro Lys
TCT GTA GCT GGT TCT GTA 343
Ser Val Ala Gly Ser Val
ACA CTA CCC TGC CAC TAC 391
Thr Leu Pro Cys His Tyr
AGA GGC TCA TGT TCT CTA 439
Arg Gly Ser Cys Ser Leu
AAT GGA ACC CAC GTC ACC 487
Asn Gly Thr His Val Thr
70
GGG GAC CTT TCA AGA AGG 535
Gly Asp Leu Ser Arg Arg
GTG TCT GAC AGT GGC GTA 583
Val Ser Asp Ser Gly Val
100
TTC AAT GAC ATG AAA ATC 631
Phe Asn Asp Met Lys Ile
115
GTC ACG ACT ACT CCA ATT 679
Val Thr Thr Thr Pro Ile
130
HU 226 205 Β1
GTC Val 135 ACA ACT GTT Val CCA Pro ACC Thr 140 GTC Val ACG Thr ACT Thr GTT Val CGA Arg 145 ACG Thr AGC Ser ACC Thr ACT Thr GTT Val 150 727
Thr Thr
CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCA ACG ACA ACT GTT CCA ACA ACA ATG AGC 775
Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Ser
155 160 165
ATT CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCG ACG ACA ATG ACT GTT TCA ACG ACA 823
Ile Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Thr Val Ser Thr Thr
170 175 180
ACG AGC GTT CCA ACG ACA ACG AGC ATT CCA ACA ACA ACA AGT GTT CCA 871
Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser Ile Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro
185 190 195
GTG ACA ACA ACG GTC TCT ACC TTT GTT CCT CCA ATG CCT TTG CCC AGG 919
Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro Pro Met Pro Leu Pro Arg
200 205 210
CAG AAC CAT GAA CCA GTA GCC ACT TCA CCA TCT TCA CCT CAG CCA GCA 967
Gin Asn His Glu Pro Val Alá Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gin Pro Alá
215 220 225 230
GAA ACC CAC CCT ACG ACA CTG CAG GGA GCA ATA AGG AGA GAA CCC ACC 1015
Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gin Gly Alá Ile Arg Arg Glu Pro Thr
235 240 245
AGC TCA CCA TTG TAC TCT TAC ACA ACA GAT GGG AAT GAC ACC GTG ACA 1063
Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr
250 255 260
GAG TCT TCA GAT GGC CTT TGG AAT AAC AAT CAA ACT CAA CTG TTC CTA 1111
Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn Gin Thr Gin Leu Phe Leu
265 270 275
GAA CAT AGT CTA CTG ACG GCC AAT ACC ACT AAA GGA ATC TAT GCT GGA 1159
Glu His Ser Leu Leu Thr Alá Asn Thr Thr Lys Gly Ile Tyr Alá Gly
280 285 290
GTC TGT ATT TCT GTC TTG GTG CTT CTT GCT CTT TTG GGT GTC ATC ATT 1207
Val Cys Ile Ser Val Leu Val Leu Leu Alá Leu Leu Gly Val Ile Ile
295 300 305 310
GCC AAA AAG TAT TTC TTC AAA AAG GAG GTT CAA CAA CTA AGA CCC CAT 1255
Alá Lys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val Gin Gin Leu Arg Pro His
315 320 325
AAA TCC TGT ATA CAT CAA AGA GAA TAGTCCCTGG AAACATAGCAAATGAACTTC 1309
Lys Ser Cys Ile His Gin Arg Glu
330
TATCTTGGCC ATCACAGCTG TCCAGAAGAG GGGAATCTGT CTTAAAAACC AGCAAATCCA 1369 ACGTGAGACT TCATTTGGAA GCATTGTATG ATTATCTCTT GTTTCTATGT TATACTTCCA 1429 AATGTTGCAT TTCCTATGTT TTCCAAAGGT TTCAAATCGT GGGTTTTTAT TTCCTCCGTG 1489 GGGAAACAAA GTGAGTCTAA CTCACAGGTT TAGCTGTTTT CTCATAACTC TGGAAATGTG 1549 ATGCATTAAG TACTGGATCT CTGAATTGGG GTAGCTGTTT TACCAGTTAA AGAGCCTACA 1609 ATAGTATGGA ACACATAGAC ACCAGGGGAA GAAAATCATT TGCCAGGTGA TTTAACATAT 1669 TTATGCAATT TTTTTTTTTT TTTTTGAGAT GGAGCTTTGC TCTTGTTGCC CAGGCTGGAG 1729
HU 226 205 Β1
TGCGATGGTG AAATCTCGGC TCACTGTAAC CTCCACCTTC CGGGTTCAAG CAATTCTCCC GTCGAC (2) INFORMATION FÓR SEQ ID No: 7 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 334 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID No: 7
Met His Pro Gin Val Val Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Alá Asp 15 10 15
Ser Val Alá Gly Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Alá Gly Pro Ser Val 20 25 30
Thr Leu Pro Cys His Tyr Ser Gly Alá Val Thr Ser Met Cys Trp Asn 35 40 45
Arg Gly Ser Cys Ser Leu Phe Thr Cys Gin Asn Gly Ile Val Trp Thr 50 55 60
Asn Gly Thr His Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu
70 75 80
Gly Asp Leu Ser Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Alá
90 95
Val Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp 100 105 110
Phe Asn Asp Met Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys 115 120 125
Val Thr Thr Thr Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val 130 135 140
Arg Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr
145 150 155 160
Val Pro Thr Thr Met Ser Ile Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr
165 170 175
Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser Ile Pro 180 185 190
Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro 195 200 205
Pro Met Pro Leu Pro Arg Gin Asn His Glu Pro Val Alá Thr Ser Pro 210 215 220
Ser Ser Pro Gin Pro Alá Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gin Gly Alá 225 230 235 240
1789
1795
HU 226 205 Β1
Ile Arg Arg Glu Pro 245 Thr Ser Ser Pro
Gly 260 Asn 265 Asp 27 Thr Val Thr Glu Ser Ser
Gin Thr Gin 275 Leu Phe Leu Glu His 280 Ser
Lys Gly 290 Ile Tyr Alá Gly Val 295 Cys Ile
Leu 305 Leu Gly Val Ile Ile 310 Alá Lys Lys
Gin Gin Leu Arg Pro 325 His Lys Ser Cys
Tyr Ser Tyr Thr Thr 255 Asp
Gly Leu Trp Asn Asn Asn
Leu Thr Alá 285 Asn Thr Thr
Val Leu 300 Val Leu Leu Alá
Phe 315 Phe Lys Lys Glu Val 320
His Gin Arg Glu
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (24)

1. Polipeptid, amely a 3., 5. vagy 7. számú szekvenciával (SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 vagy SEQ ID No: 7) legalább 90%-ban azonos aminosavszekvenciát tartalmaz, és amely egy vesesérüléssel kapcsolatos molekula (KIM), amely KIM emlősök posztischaemiás veseszöveteiben szelektíven kifejeződő sejtfelületi protein.
2. Az 1. igénypont szerint polipeptid, amelyben az aminosavszekvencia legalább 95%-ban azonos a 3., 5. vagy 7. számú szekvenciával (SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 vagy SEQ ID No: 7), és amely egy vesesérüléssel kapcsolatos molekula (KIM), amely KIM emlősök posztischaemiás veseszöveteiben szelektíven kifejeződő sejtfelületi protein.
3. Az 1. igénypont szerint polipeptid, amely a 3., 5. vagy 7. számú szekvenciát (SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 vagy SEQ ID No: 7) tartalmazza.
4. Az 1. igénypont szerint polipeptid, amely a 3., 5. vagy 7. számú szekvenciából (SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 vagy SEQ ID No: 7) áll.
5. Polipeptid, amely az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid oldható variánsa.
6. Fúziós protein, amely az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid extracelluláris doménjét és egy immunglobulin Fc-régióját tartalmazza.
7. Nukleinsav, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódolja.
8. Nukleinsav, amely a 6. igénypont szerinti fúziós proteint kódol.
9. A 7. igénypont szerinti nukleinsav, amely nukleinsav az 1., 2., 4. vagy 6. számú szekvenciát (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6) tartalmazza, vagy amely nukleinsav szigorú körülmények között hibridizál az 1., 2., 4. vagy 6. számú szekvenciával (SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 vagy SEQ ID No: 6), és amely vesesérüléssel kapcsolatos molekulát (KIM) kódol, amely KIM emlősök posztischaemiás veseszöveteiben szelektíven kifejeződő sejtfelületi protein, és a hibridizációs körülmények
2*SSC-ben 55 °C-on végzett mosást és 0,5*SSC-ben 55 °C-on végzett mosást tartalmaznak.
10. Vektor, amely a 7-9. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavat tartalmaz.
11. Gazdasejt, amely a 10. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
12. Eljárás polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 11. igénypont szerinti gazdasejtet sejttenyésztő táptalajban tenyésztünk, és kinyerjük a gazdasejtben levő vektor által kifejezett polipeptidet.
13. Antitest, amely a 4. igénypont szerinti polipeptidhez kötődik.
14. A 13. igénypont szerinti antitest, amely antitest egy toxinhoz vagy egy radioaktív nuklidhoz konjugált.
15. A 13. igénypont szerinti antitest, amely antitest egy monoklonális antitest.
16. A 13. igénypont szerinti antitest, amely antitest egy humanizált antitest, humán antitest, egyláncú antitest, FAB-fragmentum vagy kiméraantitest.
17. Hibridóma, amely a 13. igénypont szerinti antitestet termel.
18. Gyógyszerkészítmény, amely egy 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet, 6. igénypont szerinti fúziós proteint vagy 13-16. igénypontok bármelyike szerinti antitestet és egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz.
19. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, 6. igénypont szerinti fúziós protein vagy 13-16. igénypontok bármelyike szerinti antitest alkalmazása vesesérüléstől vagy vesebetegségben szenvedő alanyban vesesérülés vagy vesebetegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
20. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, 6. igénypont szerinti fúziós protein vagy 13-16. igénypontok bármelyike szerinti antitest alkalmazása vesesérüléstől vagy vesebetegségben szenvedő alanyban vesesérüiés vagy vesebetegség meglétének vagy kifejlődése folyamatának megállapítására szolgáló diagnosztikai készítmény előállítására.
21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti alkalmazás, amikor az alany ember.
HU 226 205 Β1
22. A 13-16. igénypontok bármelyike szerinti antitest alkalmazása a 4. igénypont szerinti polipeptidet kifejező sejtek vagy szövet leképezésére szolgáló diagnosztikai készítmény előállítására.
23. A 14. igénypont szerinti antitest alkalmazása 5 egy toxinnak vagy radioaktív nuklidnak a 4. igénypont szerinti polipeptidet kifejező sejtekhez való célba juttatására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
24. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, 6. igénypont szerinti fúziós protein vagy 13-16. igénypontok bármelyike szerinti antitest gyógyászatban vagy diagnosztikában való alkalmazásra.
HU9902770A 1996-05-24 1997-05-23 Modulators of tissue regeneration HU226205B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1822896P 1996-05-24 1996-05-24
US2344296P 1996-08-23 1996-08-23
PCT/US1997/009303 WO1997044460A1 (en) 1996-05-24 1997-05-23 Modulators of tissue regeneration

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9902770A2 HUP9902770A2 (hu) 1999-12-28
HUP9902770A3 HUP9902770A3 (en) 2001-09-28
HU226205B1 true HU226205B1 (en) 2008-06-30

Family

ID=26690881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9902770A HU226205B1 (en) 1996-05-24 1997-05-23 Modulators of tissue regeneration

Country Status (27)

Country Link
US (4) US6664385B1 (hu)
EP (2) EP1655367A1 (hu)
JP (3) JP4602482B2 (hu)
CN (1) CN1147584C (hu)
AT (1) ATE318903T1 (hu)
AU (1) AU712289B2 (hu)
BG (1) BG64678B1 (hu)
BR (1) BR9709115A (hu)
CA (1) CA2257851C (hu)
CZ (1) CZ295936B6 (hu)
DE (1) DE69735364T3 (hu)
DK (1) DK0907735T5 (hu)
EA (1) EA004402B1 (hu)
EE (1) EE04817B1 (hu)
ES (1) ES2258793T5 (hu)
HK (1) HK1021746A1 (hu)
HU (1) HU226205B1 (hu)
IL (1) IL127162A (hu)
IS (1) IS2636B (hu)
NO (2) NO327597B1 (hu)
NZ (1) NZ336467A (hu)
PL (1) PL188826B1 (hu)
PT (1) PT907735E (hu)
SI (1) SI0907735T2 (hu)
SK (1) SK285461B6 (hu)
TR (1) TR199802421T2 (hu)
WO (1) WO1997044460A1 (hu)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1147584C (zh) * 1996-05-24 2004-04-28 拜奥根有限公司 组织再生调节物
EP0983357A1 (en) * 1997-05-23 2000-03-08 Biogen, Inc. Modulators of tissue regeneration
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
CZ295108B6 (cs) 1998-03-20 2005-05-18 Benitec Australia Ltd Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1160321A1 (en) * 2000-05-31 2001-12-05 Sanofi-Synthelabo Kidney Injury Novel Gene-1: Isolation and therapeutic applications
EP1305409B1 (en) 2000-06-16 2009-03-11 Biogen Idec MA Inc. Renal regulatory elements and methods of use thereof
US6812002B2 (en) * 2000-08-30 2004-11-02 Pfizer Inc. Osteoactivin protein and nucleic acids encoding the same, compositions and methods of stimulating bone differentiation
JP4527394B2 (ja) * 2001-06-01 2010-08-18 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｋｉｍ−１の分断を阻害するための分子および方法
US8709412B2 (en) 2001-06-29 2014-04-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modulation of TIM receptor activity in combination with cytoreductive therapy
NZ530451A (en) 2001-06-29 2008-04-30 Univ Leland Stanford Junior TIM gene sequences and their use in immunological disorders and cancer
AU2003228336B2 (en) * 2002-03-19 2009-07-30 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
SI1585546T1 (sl) * 2002-12-30 2008-12-31 Biogen Idec Inc KIM-1 antagonisti in uporaba za moduliranje imunskega sistema
WO2004084823A2 (en) 2003-03-19 2004-10-07 Abgenix, Inc. Antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen and uses thereof
ES2739463T3 (es) * 2003-03-27 2020-01-31 Childrens Hospital Med Ct Un método y kit para la detección de la instauración precoz de la lesión de células tubulares renales
US20050272101A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-08 Prasad Devarajan Method for the early detection of renal injury
JP2007536260A (ja) 2004-05-06 2007-12-13 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 虚血性および腎毒性障害の軽減および改善用ｎｇａｌ
RU2283666C9 (ru) * 2004-05-14 2007-03-10 Бизяев Алексей Вячеславович Средство для активации восстановления структуры и функции поврежденных тканей и органов
US20060003345A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 Pfizer Inc RNA bioassay
ES2818028T3 (es) * 2004-12-20 2021-04-09 Antibodyshop As Determinación de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) como marcador diagnóstico para trastornos renales
CN103751780A (zh) 2005-03-02 2014-04-30 比奥根艾迪克Ma公司 用于治疗th2介导的疾病的kim-1抗体
WO2007059082A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Curagen Corporation Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen
US20070037232A1 (en) * 2005-03-31 2007-02-15 Barasch Jonathan M Detection of NGAL in chronic renal disease
US20080090304A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Barasch Jonathan Matthew Diagnosis and monitoring of chronic renal disease using ngal
PL2035835T3 (pl) 2006-05-30 2012-05-31 Antibodyshop As Sposoby szybkiej oceny ciężkości urazu
EP2064553B2 (en) * 2006-08-07 2023-06-07 Antibodyshop A/S Diagnostic test to exclude significant renal injury
WO2008113363A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-25 Bioporto Diagnostics A/S Diagnostic test for renal injury
US8846036B2 (en) 2007-10-19 2014-09-30 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian NGAL and uses thereof
US20090297479A1 (en) * 2008-03-28 2009-12-03 Kiyoshi Ariizumi Dc-hil conjugates for treatment of t-cell disorders
CN102187220B (zh) * 2008-08-28 2015-08-19 阿斯图特医药公司 用于诊断和预后肾损伤和肾衰竭的方法和组合物
JP5947544B2 (ja) * 2008-08-29 2016-07-06 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後のための方法および組成物
NZ619918A (en) * 2008-10-21 2015-04-24 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CA2740788C (en) * 2008-10-21 2023-03-14 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
AU2009313189B2 (en) 2008-11-10 2014-10-23 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
ES2528799T3 (es) * 2008-11-22 2015-02-12 Astute Medical, Inc. Métodos para el pronóstico de insuficiencia renal aguda
BRPI1007483B1 (pt) * 2009-01-28 2021-11-30 Bio Preventive Medicine Corporation Método de diagnóstico de nefropatia in vitro, método in vitro para o monitoramento de progresso de nefropatia, método in vitro para o monitoramento da eficácia de um tratamento de nefropatia, método in vitro de avaliação de toxicidade renal de um agente e kit para diagnóstico de nefropatia
US9229010B2 (en) 2009-02-06 2016-01-05 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2462440B1 (en) 2009-08-07 2017-05-17 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US20120264148A1 (en) * 2009-08-07 2012-10-18 Dashurie Nezieri Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
JP2013510322A (ja) 2009-11-07 2013-03-21 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後診断のための方法ならびに組成物
CN104698161A (zh) 2009-12-20 2015-06-10 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
CN102791885B (zh) 2010-02-05 2015-09-09 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物
US9029093B2 (en) 2010-02-26 2015-05-12 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
JP2013529907A (ja) 2010-05-24 2013-07-25 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク Ｎｇａｌタンパク質変異体及びその使用
AU2011269775B2 (en) 2010-06-23 2015-01-15 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP3339859A1 (en) 2010-06-23 2018-06-27 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
DK2672980T3 (en) * 2011-02-09 2018-02-26 Lavivo Ab SYNBIOTIC COMPOSITIONS FOR GETTING UP AND RECONSTITUTING GAS MICROFLORA
WO2013086359A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2925337B1 (en) 2012-11-21 2019-07-03 The Trustees of Columbia University in the City of New York Mutant ngal proteins and uses thereof
EP3361255B1 (en) 2013-01-17 2020-03-11 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
US10420337B2 (en) * 2013-03-15 2019-09-24 Lifeline Scientific, Inc. Transporter with a glucose sensor for determining viability of an organ or tissue
WO2015134671A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Targeson, Inc. Molecular imaging contrast agents and uses thereof
CA3026502A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Astute Medical, Inc. Management of acute kidney injury using insulin-like growth factor-binding protein 7 and tissue inhibitor of metalloproteinase 2

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2003A (en) * 1841-03-12 Improvement in horizontal windivhlls
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB9122820D0 (en) * 1991-10-28 1991-12-11 Wellcome Found Stabilised antibodies
EP0640094A1 (en) * 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
WO1995021922A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Abbott Laboratories Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
US5622861A (en) * 1994-08-05 1997-04-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA encoding hepatitis A virus receptor
EP0804547A4 (en) * 1994-08-18 1999-11-03 Univ Columbia ASSOCIATED SINGLE SEQUENCES OF KAPOSI DISEASE VIRUSES AND USE OF SAID SEQUENCES
US6069230A (en) * 1994-11-10 2000-05-30 Promega Corporation High level expression and facile purification of proteins, peptides and conjugates for immunization, purification and detection applications
US6066322A (en) * 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
CN1147584C (zh) * 1996-05-24 2004-04-28 拜奥根有限公司 组织再生调节物
EP1305409B1 (en) * 2000-06-16 2009-03-11 Biogen Idec MA Inc. Renal regulatory elements and methods of use thereof
JP4527394B2 (ja) * 2001-06-01 2010-08-18 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｋｉｍ−１の分断を阻害するための分子および方法
US7838220B2 (en) * 2001-06-29 2010-11-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes associated with immune disease
NZ530451A (en) * 2001-06-29 2008-04-30 Univ Leland Stanford Junior TIM gene sequences and their use in immunological disorders and cancer
US7215871B2 (en) * 2001-07-27 2007-05-08 Thomson Licensing Changing a playback speed for video presentation recorded in a field structure format
US7687454B2 (en) * 2001-12-03 2010-03-30 The University Of British Columbia Effectors of innate immunity determination
EP1467759A4 (en) * 2002-01-30 2006-05-31 Brigham & Womens Hospital COMPOSITIONS AND METHODS ASSOCIATED WITH TIM-3, TH1-SPECIFIC CELL SURFACE MOLECULE
AU2003228336B2 (en) * 2002-03-19 2009-07-30 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
SI1585546T1 (sl) * 2002-12-30 2008-12-31 Biogen Idec Inc KIM-1 antagonisti in uporaba za moduliranje imunskega sistema
TW200539890A (en) * 2004-03-12 2005-12-16 Brigham & Womens Hospital Methods of modulating immune responses by modulating tim-1, tim-2 and tim-4 function
AU2005231685A1 (en) * 2004-03-24 2005-10-20 Telos Pharmaceuticals Llc Compositions as adjuvants to improve immune responses to vaccines and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009039111A (ja) 2009-02-26
US20050089868A1 (en) 2005-04-28
ES2258793T3 (es) 2006-09-01
ES2258793T5 (es) 2010-01-25
HUP9902770A3 (en) 2001-09-28
JP2001505761A (ja) 2001-05-08
CN1223685A (zh) 1999-07-21
JP4316640B2 (ja) 2009-08-19
NO985427D0 (no) 1998-11-20
DK0907735T5 (da) 2010-06-14
BG64678B1 (bg) 2005-11-30
EE9800409A (et) 1999-06-15
AU3567697A (en) 1997-12-09
CZ295936B6 (cs) 2005-12-14
PL330313A1 (en) 1999-05-10
EP0907735B9 (en) 2010-05-19
ATE318903T1 (de) 2006-03-15
US20070141590A1 (en) 2007-06-21
IS2636B (is) 2010-06-15
EA004402B1 (ru) 2004-04-29
IL127162A (en) 2007-07-24
WO1997044460A1 (en) 1997-11-27
EP0907735B2 (en) 2009-10-07
AU712289B2 (en) 1999-11-04
CN1147584C (zh) 2004-04-28
SK160998A3 (en) 1999-07-12
EP0907735B1 (en) 2006-03-01
NO327597B1 (no) 2009-08-31
DE69735364D1 (de) 2006-04-27
PL188826B1 (pl) 2005-04-29
BR9709115A (pt) 1999-08-03
DE69735364T3 (de) 2010-05-06
EP1655367A1 (en) 2006-05-10
US20060286031A1 (en) 2006-12-21
SI0907735T1 (sl) 2006-08-31
TR199802421T2 (xx) 1999-02-22
SK285461B6 (sk) 2007-02-01
JP2008067701A (ja) 2008-03-27
HK1021746A1 (en) 2000-06-30
EE04817B1 (et) 2007-04-16
NO985427L (no) 1999-01-25
SI0907735T2 (sl) 2010-01-29
EA199801044A1 (ru) 1999-04-29
HUP9902770A2 (hu) 1999-12-28
DK0907735T3 (da) 2006-06-26
IS4902A (is) 1998-11-20
NZ336467A (en) 2000-10-27
DE69735364T2 (de) 2006-11-30
NO20090945L (no) 1999-01-25
US6664385B1 (en) 2003-12-16
IL127162A0 (en) 1999-09-22
DK0907735T4 (da) 2009-12-21
CZ381398A3 (cs) 1999-05-12
JP4602482B2 (ja) 2010-12-22
PT907735E (pt) 2006-06-30
BG102967A (bg) 2000-05-31
CA2257851A1 (en) 1997-11-27
CA2257851C (en) 2011-11-15
EP0907735A1 (en) 1999-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU226205B1 (en) Modulators of tissue regeneration
KR100587556B1 (ko) 신경 및 신장 증식을 자극하기 위한 ＲＥＴ리간드（ＲｅｔＬ)
US6677135B1 (en) Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
WO2001016169A2 (en) RET LIGAND 5 (Retl5) FROM HUMAN AND MOUSE
KR100498530B1 (ko) 조직재생조절물질
KR100554901B1 (ko) 신경및신장증식을자극하기위한RET리간드(RetL)
MXPA98009812A (en) Modulators of the regeneration of the tej
PL191248B1 (pl) Izolowane kwasy nukleinowe, wektor, komórka gospodarza, (54) sposób wytwarzania polipeptydu, polipeptyd, izolowane przeciwciało monoklonalne, kompozycja, białko fuzyjne

Legal Events

Date Code Title Description
HC9A Change of name, address

Owner name: THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION, US

Free format text: FORMER OWNER(S): BIOGEN INC., US; BIOGEN INC., US

Owner name: BIOGEN IDEC MA, INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): BIOGEN INC., US; BIOGEN INC., US