KR100386046B1 - 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 핵산 - Google Patents

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KR100386046B1 KR10-2000-7006008A KR20007006008A KR100386046B1 KR 100386046 B1 KR100386046 B1 KR 100386046B1 KR 20007006008 A KR20007006008 A KR 20007006008A KR 100386046 B1 KR100386046 B1 KR 100386046B1
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Abstract

본 발명은 신규 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주세포, 이질성 폴리펩티드 서열과 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

폴리펩티드 및 이를 암호화하는 핵산 {Polypeptides And Nucleic Acids Encoding The Same}
세포외 단백질은 다세포 유기체의 형성, 분화 및 상태 보존에 중요한 역할을 한다. 많은 개개 세포의 운명(예를 들면, 증식, 이동, 분화 또는 다른 세포와의 상호작용)은 통상 다른 세포 및(또는) 주변 환경으로부터 받은 정보에 의해 결정된다. 상기 정보는 종종 분비 폴리펩티드(예를 들면, 유사분열 인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 신경펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되는데, 바꾸어 말하면 다양한 세포 수용체 또는 막-결합 단백질에 의해 수용 및 해석된다. 상기의 분비 폴리펩티드 또는 신호 분자는 세포 분비 경로를 거쳐 세포외 환경의 활성 부위에 도달한다.
분비 단백질은 제약, 진단, 바이오센서 및 생물반응로를 포함하여 산업적 적용 범위가 넓다. 혈전용해제, 인터페론, 인터루킨, 에리트로포이에틴, 콜로니 자극인자 및 다양한 다른 싸이토카인과 같은, 현재 사용가능한 대부분의 단백질 약물은 분비 단백질이다. 또한, 막단백질인 분비 단백질의 수용체도 치료제 또는 진단제로서 잠재성이 있다. 산업계 및 학계에서는 고유의 분비 단백질을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 상기 노력의 초점은 포유동물의 재조합 DNA 라이브러리를 스크린하여 신규 분비 단백질의 코딩 서열을 동정하는데 모아지고 있다. 스크린 방법 및 기술의 예는 문헌[클라인(Klein) 등,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996)] 및 미국 특허 제5,536,637호에 기재되어 있다.
막-결합 단백질 및 수용체는 다세포 유기체의 형성, 분화 및 상태 보존에 중요한 역할을 할 수 있다. 개개 세포의 운명(예를 들면, 증식, 이동, 분화 또는 다른 세포와의 상호작용)은 통상 다른 세포 및(또는) 주변 환경으로부터 받은 정보에 의해 결정된다. 상기 정보는 종종 분비 폴리펩티드(예를 들면, 유사분열 인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 신경펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되는데, 바꾸어 말하면 다양한 세포 수용체 또는 막-결합 단백질에 의해 수용 및 해석된다. 그러한 막-결합 단백질 및 세포 수용체는, 싸이토카인 수용체, 수용체 키나아제, 수용체 인산화효소, 세포-세포 상호작용에 연관된 수용체 및 셀렉틴(selectin) 및 인테그린(integrin)과 같은 세포성 어드히신(adhesin) 분자를 포함하지만 이에 제한되진 않는다. 예를 들면, 세포의 생장 및 분화를 조절하는 신호의 변환은 다양한 세포성 단백질의 인산화에 의해 부분적으로 조절된다. 또한, 상기 과정을 촉매하는 단백질 티로신 키나아제도 생장 인자 수용체로 기능할 수 있다. 섬유아세포 생장 인자 수용체 및 신경 생장 인자 수용체가 예로 포함된다.
막-결합 단백질 및 수용체 분자는 약제 및 진단제로서의 사용을 포함하여 산업적 적용 범위가 넓다. 예를 들면, 수용체 면역어드히신(immuoadhesin)은수용체-리간드 상호작용을 방해하는 치료제로 사용될 수 있다. 막-결합 단백질은 또한 수용체 및 리간드 상호작용에 적절한 잠재적 펩티드 또는 작은 분자의 억제제를 스크린하는데 사용될 수 있다. 산업계 및 학계에서 고유의 수용체 단백질을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 상기 노력의 초점은 포유동물의 재조합 DNA 라이브러리를 스크린하여 신규 수용체 단백질의 코딩 서열을 동정하는데 모아지고 있다.
본 명세서에는 신규의 분비 폴리펩티드와 막관통 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 암호화하는 신규 핵산의 동정 및 특성화에 대해 기재할 것이다.
1.PRO241
연골은 복잡한 콜라겐 섬유 망상구조 및 높은 함량의 프로테오글리칸을 포함하는 커다란 세포외 매트릭스가 있는 분화된 연결 조직이다. 연골에서 대부분의 프로테오글리칸은, 많은 콘드로이틴 황산 및 케라틴 황산 사슬을 포함하고 연결 단백질에 의해 히알루로난과 결합하여 다중분자성 집합체를 형성하는 어그리칸(aggrecan)이지만, 연골은 또한 저분자량의 프로테오글리칸을 많이 함유하고 있다. 상기 저분자량 프로테오글리칸 중 하나가 비글리칸이라 불리우는 것으로서, 힘줄, 공막, 피부 등을 포함한 다양한 다른 연결 조직의 세포외 메트릭스에 넓게 분포하는 프로테오글리칸이다. 비글리칸은 류신이 풍부한 반복 서열 및 두 개의 콘드로이틴 황산 및 데르마탄 황산 사슬이 있다고 공지되어 있고, 피브로넥틴의 세포-결합 도메인에 결합하여 세포가 그 부위에 결합하는 것을 억제하는 기능을 한다. 비글리칸과 같은 저분자량의 프로테오글리칸은 연골의 생장 및(또는) 교정 및관절염과 같은 퇴행성 질환에 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 비글리칸 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것은 흥미있는 일이다.
본 명세서에서는 PRO241 폴리펩티드라 불리우는, 비글리칸 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
2.PRO243
코딘(Xenopus, Xchd)은 잠재적 등형성 활성이 있는 슈페만의 형성체에 의해 분비되는 가용성 인자([사사이(Sasai) 등,Cell 79: 779-90 (1994)] 및 [사사이(Sasai) 등,Nature 376: 333-36 (1995)])이다. 상기 형성체에 의해 분비되는 다른 등형성 인자는 노긴(noggin)([스미쓰(Smith) 및 할란(Harlan),Cell 70: 829-840 (1992)] 및 [람(Lamb) 등,Science 262: 713-718 (1993)]) 및 폴리스타틴(follistatin)([헤만티-브리반로우(Hemmanti-Brivanlou) 등,Cell 77: 283-295 (1994)])이다. 코딘은 초기 외배엽을 신경 및 비신경 도메인으로 세분하고, 중배엽의 등형성에 의한 척삭 및 근 형성을 유도한다. 코딘은 배형성 BMP-4 신호에 대한 길항제로 기능하여 상기 기능을 수행한다. 상기의 억제는 코딘이 세포외 공간에서 직접 BMP-4에 결합하여 BMP-4에 의한 BMP-4 수용체의 활성을 방해하는 작용으로 매개된다([피콜로(Piccolo) 등,Develop. Biol. 182: 5-20 (1996)]).
BMP-4는 배(embryo)의 배쪽으로부터 구배를 형성하여 발현되는 반면, 코딘은 BMP-4와 상보적인 구배로 발현된다. 코딘은 BMP-4가 낮은 말단 구배를 형성하도록 길항작용을 한다. 따라서, 코딘 및 다른 형성체-유도 인자의 신호 대 BMP 신호의균형은 외배엽성 배엽의 등-배 위치 정보를 제공한다. 또한, 코딘은 중추 신경계의 등-배 형성에 관련될 수 있다([사사이(Sasai) 등,Cell 79: 779-90 (1994)]). 코딘은 배타적으로 전방 신경 조직(전뇌형)을 유도하여 신경형을 전방화할 수도 있다([사사이 (Sasai) 등,Cell 79: 779-90 (1997)]). 신경 유도 및 패턴 형성에서의 역할을 볼 때, 코딘은 외상 또는 화학요법 후에 기인한 것과 같은 신경 퇴행성 질환 및 신경 손상의 치료에 유용할 수 있다.
본 명세서에서는 PRO243 폴리펩티드라 불리우는, 코딘 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
3.PRO299
노치(notch) 단백질은 발생 과정에서 신호 전달에 관련되어 있다. 상기 단백질은 비대칭 발생 잠재성에 영향을 끼치고, 발생에 관련된 다른 단백질의 발현에 대한 신호가 될 수 있다. 이는 문헌 [로베이 이.(Robey, E.),Curr. Opin. Genet. Dev.,7(4):551 (1997)], [심슨 피.(Simpson, P.),Curr. Opin. Genet. Dev.,7(4):537 (1997)], [블로벨 씨피.(Blobel CP.),Cell,90(4):589 (1997)], [나까야마 에이치.(Nakayama, H.) 등,Dev. Genet.,21(1):21 (1997)], [설리반 에스.에이.(Sullivan,S.A.) 등,Dev. Genet.,20(3):208 (1997)] 및 [하야시 에이치.(Hayashi, H.) 등,Int. J. Dev. Biol.,40(6):1089(1996)]을 참고할 수 있다. 세레이트에 의해 매개되는 노치의 활성은 초파리의 날개 성충 디스크(wing imaginal disc)의 등쪽 구획([플레밍(Fleming) 등,Development, 124(15):2973 (1997)])에서 관찰되었다. 노치는 발생 뿐만 아니라 신호 전달 능력에서도 흥미있는 단백질이다. 또한, 발생 및(또는) 신호 전달에 역할을 할 수 있는 신규 폴리펩티드도 흥미가 있다.
본 명세서에서는 PRO299 폴리펩티드라 불리우는, 노치 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
4.PRO323
디펩티다아제는 다양한 디펩티드를 분해하는 기능을 하고, 포유류 및 비포유류 유기체에서 매우 중요한 생물학적 과정에 관련된 효소 단백질이다. 포유류 및 비포유류 유기체의 다양한 디펩티다아제 효소가 동정되고 특성화되었다. 포유동물의 디펩티다아제 효소는 예를 들면, 단백질 소화, 활성화, 불활성화 또는 디펩티드 호르몬의 조절 및 단백질과 효소의 물리적 특성 변화와 같은 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다.
디펩티다아제 효소에 의해 수행되는 중요한 생리학적 역할의 관점에서, 산업계 및 학계에서 고유의 디펩티다아제 상동체를 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 상기 노력의 초점은 포유동물의 재조합 DNA 라이브러리를 스크린하여 신규 분비 단백질 및 막결합 수용체 단백질의 코딩 서열을 동정하는데 모아지고 있다. 스크린 방법 및 기술의 예는 문헌[클라인(Klein) 등,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996)] 및 미국 특허 제5,536,637호에 기재되어 있다.
본 명세서에서는 PRO323 폴리펩티드라 불리우는, 다양한 디펩티다아제 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
5.PRO327
뇌하수체 전엽 호르몬인 프로락틴은 생장 호르몬-프로락틴-태반락토겐 유전자군의 한 유전자에 의해 암호화한다. 포유동물에서 프로락틴은 유선의 발달 및 젖의 분비에 일차적인 책임이 있다. 프로락틴은 유전자의 전사량 및 mRNA의 반감기를 증가시켜 유즙 단백질 유전자의 발현을 자극하는 기능을 한다.
프로락틴 단백질의 생리적 효과는 프로락틴이 세포 표면의 프로락틴 수용체와 결합하는 능력을 통해 매개된다. 프로락틴 수용체는 다양한 세포 유형에서 발견되고, 분자량이 약 40,000 이며, 자기 스스로 또는 다른 서브유니트와 이황결합으로 연결되지 않는다. 프로락틴 수용체의 양은 연구된 조직에 따라 차별적으로 조절된다.
생체내에서 세포 표면 수용체 분자에 의한 생리적 역할의 중요성 때문에, 산업계 및 학계에서는 고유의 막결합 수용체 단백질(프로락틴 수용체와 서열상 상동성이 있는 수용체 단백질)을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 상기 노력의 초점은 포유동물의 재조합 DNA 라이브러리를 스크린하여 신규 막결합 수용체 단백질의 코딩 서열을 동정하는데 모아지고 있다. 스크린 방법 및 기술의 예는 문헌[클라인(Klein) 등,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996)] 및 미국 특허 제5,536,637호에 기재되어 있다.
본 명세서에서는 PRO327 폴리펩티드라 불리우는, 프로락틴 수용체 단백질과 매우 상동성 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
6.PRO233
세포의 운명에 세포의 산화 환원 상태가 중요한 결정 요소라는 것이 연구 결과 밝혀졌다. 게다가, 반응성 산소 종은 세포 독성이 있어서 조직 괴사, 기관의 기능 부전, 아테롬성 동맥 경화증, 불임, 출생 결함, 조기 노화, 돌연변이 및 악성 종양을 포함하는 염증 질환을 유발하는 것으로 보고되었다. 따라서, 산화 및 환원의 제어는 뇌졸중, 심장 마비, 산화 스트레스 및 고혈압의 제어 및 예방을 포함한 다양한 이유때문에 중요하다.
산소 유리 라디칼 및 산화방지제는 대뇌의 국소 빈혈 및 재관류 이후의 중추 신경계에 중요한 역할을 하는 것 같다. 게다가, 국소 빈혈 및 재관류와 연관된 심장 손상은 유기 라디칼의 활성으로 인해 유발된다고 보고되었다. 상기 관점에서, 환원 효소, 특히 산화환원 효소는 중요하다. 부가로, 전사 인자(NF-κB 및 AP-1)은 산화 환원 상태를 조절하고, AIDS, 암, 에테롬성 동맥 경화증 및 당뇨 합병증의 병원성에 관련된 것으로 생각되는 다양한 유전자의 발현에 영향을 끼치는 것으로 공지되어 있다. 상기 주제의 문제를 추가로 기재하는 문헌에는 [켈시(Kelsey) 등,Br. J. Cancer, 76(7):852-854 (1997)], [프리드리히(Friedrich) 및 바이스(Weiss),J. Theor. Biol., 187(4):529-540 (1997)] 및 [피율레(Pieulle) 등,J. Bacteriol., 179(18):5684-5692 (1997)]이 있다. 생체내에서 산화환원 반응의 생리적 중요성 때문에, 산화환원 반응에 관련된 고유의 단백질을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 본 명세서에서는 PRO233 폴리펩티드라 불리우는, 환원 효소와 상동성 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고있다.
7.PRO344
많은 혈청 단백질(어떤 단백질은 효소 연쇄반응에서 기능함)을 포함하는, 효과기 분자를 만들어 내는 보체 단백질은 염증반응과 관련되어 있다. 보체 단백질은 염증반응과 관련된 세포의 활동 및 기능을 조절하는데 있어서 생리적으로 특히 중요하다. 생체내에서 염증반응 및 이와 관련된 기작의 생리적 중요성 때문에, 염증에 관련된 고유의 단백질을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 본 명세서에서는 PRO344 폴리펩티드라 불리우는, 보체 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
8.PRO347
시스테인이 풍부한 단백질은 통상 복잡한 삼차원 구조를 갖고(거나) 이황결합을 형성할 수 있는 많은 시스테인 잔기가 있어서 다량체 형태로 존재한다. 시스테인이 풍부한 단백질로 다른 조직보다는 간에서 발현되는 만노오스 수용체가 공지되어 있으며, 상기 수용체는 만노오스에 결합하여 이를 간세포로 수송하는 역할을 한다. 시스테인이 풍부한 다른 단백질은 다양한 생리적 과정 및 생화학적 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 시스테인이 풍부한 신규 단백질을 동정하는 것은 흥미가 있다. 상기 관점에서, 본 명세서에서는 PRO347 폴리펩티드라 불리우는, 시스테인이 풍부한 분비 단백질-3과 상동성이 있는 신규 시스테인-풍부 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
9.PRO354
인터-알파-트립신 억제제(inter-alpha-trypsin inhibitor: ITI)는 많은 포유동물 종의 혈장에서 발견되는, 분자량이 크고(약 240,000) 순환하는 단백질 분해효소의 억제제이다. 상기 억제제는 원래 당단백질이고, 강한 글리코사미노글리칸 결합을 통해 상호작용하는 세 개의 글리코실화된 서브유니트로 구성되어 있다. ITI의 트립신 억제 활성은 복합체에서 현재 비쿠닌이라는 단백질로 공지된 가장 작은 서브유니트(즉, 경쇄)에 위치해 있다. 성숙한 경쇄는 N-말단의 21-아미노산, 글리코실화된 10번째 세린에 이어서, 두 개의 나란한 쿠니츠형(Kuniz-type) 도메인(첫 번째 도메인은 45번 째 아스파라긴에서 글리코실화되고, 두 번째 도메인은 트립신, 키모트립신 및 플라스민을 억제할 수 있음)으로 구성되어 있다. ITI 복합체의 남은 두 사슬은 복합체에서 효소적으로 활성이 있는 경쇄와 상호작용하는 중쇄이다.
산업계 및 학계에서는 고유의 단백질을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 상기 노력의 초점은 포유동물의 재조합 DNA 라이브러리를 스크린하여 신규 분비 및 막결합 수용체 단백질의 코딩 서열을 동정하는데 모아지고 있다. 스크린 방법 및 기술의 예는 문헌[클라인(Klein) 등,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996)] 및 미국 특허 제5,536,637호에 기재되어 있다. 본 명세서에서는 PRO354 폴리펩티드라 불리우는, ITI 중쇄와 매우 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
10.PRO355
분자 또는 "CRTAM" 단백질과 결합한 세포 독성 또는 조절 T세포는 면역글로불린 상과(上科)와 구조적으로 관련되어 있다. CRTAM 단백질은 다양한 면역 반응을 매개할 수 있어야 한다. CRTAM 단백질에 결합하는 통상의 항체는 친화도가 매우 높다([즐로트닉 에이.(Zlotnik, A.),Faseb, 10(6): A1037, Abr. 216, 1996년 6월]). 생체내에서 T세포 항원 및 면역 반응의 생리적 중요성 때문에, 면역 반응과 관련된 고유의 단백질을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 예를 들면, 케네디(Kennedy) 등의 미국 특허 제5,686,257호(1997)를 참조할 수 있다. 본 명세서에서는 PRO355 폴리펩티드라 불리우는, CRTAM과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정 및 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
11.PRO357
단백질-단백질 상호작용은 수용체와 항원 복합체 및 신호 전달 기작을 포함한다. 단백질-단백질 상호작용에 대한 기본적인 구조적 및 기능적 기작이 더 많이 밝혀질수록, 단백질-단백질 상호작용의 결과가 특정 상태로 조절되도록 더 쉽게 조작할 수 있다. 따라서, 단백질-단백질 상호작용의 기본적인 기작은 과학 및 의학 분야에서 관심이 많다.
류신이 풍부한 반복 서열을 포함하는 단백질은 단백질-단백질 상호작용에 관련되어 있다고 생각된다. 류신이 풍부한 반복 서열은 많은 단백질에서 나타나는 짧은 서열의 모티프로서, 다양한 기능을 하고 세포의 다양한 위치에 존재한다. 리보핵산 분해 효소에 대한 억제제의 결정 구조로 인해 류신이 풍부한 반복 서열이 베타-알파 구조 단위와 일치함을 알았다. 상기 단위는 한쪽 표면이 용매에 노출되는 수평 베타-쉬이트 구조를 형성하도록 배열되어, 단백질은 특이한 비구형(non-globular)이 된다. 상기 두 가지 특성으로 인하여 류신-풍부 반복 서열을 갖는 단백질의 단백질-결합 기능이 생긴다([코브(Kobe) 및 다이센호퍼(Deisenhofer), Trends Biochem. Sci., 19(10):415421 (1994년 10월)]).
조직 형성체인 류신-풍부 프로테오글리칸이 개체 발생시 콜라겐 원섬유를 생성하게 하고, 상처 치료, 조직 회복 및 종양 스트로마의 형성과 같은 병리적 과정에 관련되어 있다고 연구 결과 밝혀졌다([이오조 알. 브이.(Iozzo, R. V.),Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 32(2):141-174 (1997)]). 상처 치료 및 조직 회복에 관한 류신-풍부 단백질의 연구로, 문헌[드 라 살르 쎄.(De La Salle, C.) 등,Vouv. Rev. Fr. Hematol.(Germany), 37(4):215-222 (1995)]에서는 복합체에서 류신이 풍부한 모티프의 돌연변이가 버나드-소울리어(Bernard-Soulier) 증후군이라는 출혈 장애와 관계있다고 보고하였고, 문헌[클레메트슨 케이. 제이.(Chlemetson, K. J.),Thromb. Haemost.(Germany), 74(1):111-116 (1995년 7월)]에서는 혈소판에 류신이 풍부한 반복서열의 단백질이 존재한다고 보고하였으며, 루오슬라티 이. 아이.(Ruoslahti, E. I.) 등의 라 졸라 암 연구 기금(La Jolla Cancer Research Foundation)에 의한 WO9110727-A호에서는 형질전환 생장 인자 β에 데코린(decorin)이 결합하는 것은 암, 상처 및 흉터의 치료에 관련되어 있다고 보고하였다. 이와 기능상 관련된 단백질군으로 인슐린과 유사한 생장 인자(insulin like gorwth factor: IGF)가 있는데, 상기 인자는 연결 조직, 피부 및 뼈와 같은 조직의 재생과 연관된 복합 치료요법 및 상처 치료에 유용하고, 인간 및 동물에서 신체 발육을 촉진하며, 생장과 관련된 다른 과정을 촉진하는 기능을 한다. 또한, IGF의 산 불안정 서브유니트(acid labile subunit: ALS)도 IGF의 반감기를 증가시키고 생체내에서 IGF 복합체의 일부분이므로 관심의 대상이다.
류신이 풍부한 반복 서열을 갖는 것으로 보고되는 다른 단백질로 SLIT 단백질이 있는데, 이는 알츠하이머 질환, 신경 손상(예를 들면, 파킨슨 질환)과 같은 신경 퇴행성 질환의 치료 및 암진단용으로 유용함이 보고되었다(아타바니스트사코나스 에스.(Artavanistsakonas, S.) 및 로쓰버그 제이. 엠.(Rothberg, J. M.)의 WO9210518-A1호, 예일 대학교). 또한, 생쥐 뇌의 신경교세포에서 특이적으로 별현되고, 류신이 풍부한 반복 서열 및 면역글로불린과 유사한 도메인을 갖는 LIG-1이라는 막 당단백질도 관심의 대상이다([스즈끼(Suzuki) 등, J. Biol. Chem.(U.S.), 271(37):22522 (1996)]). 류신이 풍부한 반복 서열을 갖는 단백질의 생물학적 기능에 관해 보고한 연구에는 [테이아 엔.(Tayar, N.) 등,Mol. Cell Endocrinol., (아일랜드), 125(1-2):65-70 (1996년 12월)](고나도트로핀 수용체 관련), [미우라 와이.(Miura, Y.) 등,Nippon Rinsho(일본), 54(7):1784-1789 (1996년 7월)](아팝토시스 관련) 및 [해리스 피. 씨.(Harris, P. C.) 등,J. Am. Soc. Nephrol., 6(4):1125-1133 (1995년 10월)](신장 질환 관련)이 포함된다.
단백질-단백질 상호작용을 더 잘 이해하기 위해 류신-풍부 반복 서열을 갖는 새로운 단백질을 동정하려고 산업계와 학계에서 노력하고 있다. 인슐린과 유사한 생장 인자의 산 불안정 서브유니트와 같은 류신-풍부 반복 서열을 갖는 공지된 단백질과 상동성이 있는 류신-풍부 반복 서열을 갖는 단백질에 특히 관심이 있다. 상기 노력의 초점은 포유동물의 재조합 DNA 라이브러리를 스크린하여 신규 분비 및 막-결합 단백질의 코딩 서열을 동정하는데 모아지고 있다. 스크린 방법 및 기술의예는 문헌[클라인(Klein) 등,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996)] 및 미국 특허 제5,536,637호에 기재되어 있다.
본 명세서에서는 PRO357 폴리펩티드라 불리우는, 인슐린과 유사한 생장 인자의 산 불안정 서브유니트와 상동성 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
12.PRO715
포유동물에서 세포 수의 조절은 세포 증식 및 세포 사멸 사이의 균형에 의해 부분적으로 결정된다고 믿고 있다. 종종 괴사적 세포 사멸이라 불리우는 세포 사멸의 한 가지 형태는, 통상 외상 또는 세포 손상에서 기인한 병리적 형태의 세포가 죽는 것을 말한다. 반대로, 순차적 또는 제어된 방식으로 진행되는 세포 사멸의 다른 "생리적" 형태가 있다. 상기 순차적 또는 제어된 방식의 세포 사멸은 "아팝토시스"라 불리운다(예를 들면, [바르(Barr) 등,Bio/Technology,12:487493 (1994)] 및 [스텔러(Steller) 등,Science,267:1445-1449 (1995)] 참조). 아팝토시스에 의한 세포 사멸은 배 발생 및 면역계의 클론 선택을 포함하는 많은 생리적 과정에서 일어난다([이또(Itoh) 등,Cell,66:233-243 (1991)]). 암, 낭창 및 허피스(herpes) 바이러스 감염을 포함하는 다양한 병리적 상태로 인해 아팝토시스에 의한 세포 사멸은 감소된다([톰슨(Thompson),Science 267:1456-1462 (1995)]). AIDS, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 근위축성 측삭경화증, 다발성 경화증, 색소성 망막염, 소뇌 퇴화증, 재생불량성 빈혈, 심근경색증, 뇌졸중, 재관류 손상 및 독소에 의해 유도된 간 질환을 포함하는 다양한 병리적 상태로 인해 아팝토시스에의한 세포 사멸은 증가될 수 있다(상기 톰슨(Thompson)의 문헌 참조).
통상 아팝토시스에 의한 세포 사멸은 세포에서 하나 이상의 독특한 형태적 또는 생화학적 변화(세포질의 응축, 세포막 미세융모의 유실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아의 기능 상실)를 수반한다. 다양한 외재 또는 내재적 신호에 의해 상기 형태적 및 생화학적 세포 변화가 촉진 또는 유도된다고 생각된다([라프(Raff),Nature,356:397400 (1992)], 스텔러(Steller)의 상기 문헌], 및 [삭스(Sachs) 등,Blood,82:15 (1993)]). 예를 들면, 상기의 변화는 미성숙 흉선세포에 대한 당질코르티코이드 호르몬과 같은 호르몬 자극 뿐만 아니라 특정 생장 인자의 분비 중단에 의해 촉진될 수 있다([와따나베-후꾸나가(Watanabe-Fukunaga) 등,Nature,356:314-317 (1992)]). 또한,myc, rel및E1A와 같은 공지된 종양 유전자 및p53과 같은 종양 억제 유전자가 아팝토시스에서 기능하는 것으로 보고되었다. 특정 화학요법용 약물 및 특정 형태의 방사능도 유사하게 아팝토시스를 유도하는 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(톰슨(THompson)의 상기 문헌).
종양 괴사 인자-α("TNF-α"), 종양 괴사 인자-β("TNF-β" 또는 "림포톡신-α"), 림포톡신-β("LT-β"), CD30 리간드, CD27 리간드, CD40 리간드, OX-40 리간드, 4-1BB 리간드, Apo-1 리간드(Fas 리간드 또는 CD95 리간드라고도 불리움) 및 Apo-2 리간드(TRAIL이라고도 불리움)와 같은 다양한 분자들이 싸이토카인의 종양 괴사 인자("TNF")군의 구성원으로 알려졌다(예를 들면, [그러스(Gruss) 및 다우어(Dower),Blood 85:3378-3404 (1995)], [피티(Pitti) 등,J. Biol. Chem.,271:12687-12690 (1996)], [와일리(Wiley) 등,Immunity,3:673-682 (1995)], [브라우닝(Browning) 등,Cell 22:847-856 (1993)] 및 [아미타지(Armitage) 등,Nature 357:80-82 (1992)] 참조). 상기 분자 중에서, TNF-α, TNF-β, CD30 리간드, 4-1BB 리간드, Apo-1 리간드 및 Apo-2 리간드(TRAIL)은 아팝토시스에 의한 세포 사멸에 관련된 것으로 보고되었다. TNF-α 및 TNF-β 모두 종양이 발생하기 쉬운 세포에서 아팝토시스에 의한 사멸을 유도한다고 보고되었다([슈미드(Schmid) 등,Proc. Natl. Acad. Sci.,83:1881 (1986)] 및 [딜트리(Dealtry) 등,Eur. J. Immunol.,17:689 (1987)]). 젱(Zheng) 등은 TNF-α가 CD8-양성 T 세포의 후자극 아팝토시스와 관련되어 있다고 보고하였다([젱(Zheng) 등,Nature,377:348-351(1995)]). 다른 연구자들은 CD30 리간드가 흉선에서 자가반응성 T 세포의 제거에 관련되어 있다고 보고하였다([아마카와(Amakawa) 등, Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, 초록 번호 10, (1995)]).
생쥐의 Fas/Apo-1 수용체 또는 리간드 유전자(각각lpr및gld라 불리움)의 돌연변이는 자가면역 질환과 관련되어 있었고, 따라서 Apo-1 리간드는 세포 표면에서 자가반응성 림프구의 클론 제거를 조절할 수 있다([크라머(Krammer) 등,Curr. Op. Immunol.,6:279-289 (1994)] 및 [나가타(Nagata) 등,Science 267:1449-1456 (1995)]). Apo-1 리간드는 또한 CD4-양성 T 림프구 및 B 림프구에서 후자극 아팝토시스를 유도하는 것으로 보고되었고, 림프구의 기능이 필요하지 않은 경우에 활성 림프구를 제거하는데 관련될 수 있다(크라머(Krammer) 등의 상기 문헌 및 나가타(Nagata) 등의 상기 문헌). Apo-1 수용체에 특이적으로 결합하는 쥐의 모노클론 항체에 대한 효능제가 TNF-α와 유사하게 세포를 죽이는 활성이 있다고보고되었다([요네하라(Yonehara) 등,J. Exp. Med.,169:1747-1756 (1989)]).
상기의 TNF군 싸이토카인에 의해 매개되는 다양한 세포 반응의 유도는 특이적인 세포 수용체의 결합으로 시작된다고 믿고 있다. 약 55-kDa(TNFR1) 및 75-kDa(TNFR2)의 두 가지 독특한 TNF 수용체([호만(Hohman) 등,J. Biol. Chem.,264:14927-14934 (1989)], [브로크하우스(Brockhaus) 등,Proc. Natl. Acad. Sci.,87:3127-3131(1990)] 및 1991년 3월 20일에 출원된 EP 417,563호)가 발견되었고, 상기 두 가지 유형의 수용체에 상응하는 인간 및 쥐의 cDNA가 단리 및 특성화([뢰쳐(Loetscher) 등,Cell,61:351 (1990)], [쉘(Schall) 등,Cell,61:361 (1990)], [스미쓰(Smith) 등,Science,248:1019-1023 (1990)], [루이스(Lewis) 등,Proc. Natl. Acad. Sci.,88:2830-2834 (1991)] 및 [굿윈(Goodwin) 등,Mol. Cell. Biol.,11:3020-3026 (1991)])되었다. 림포톡신-α를 제외하고 현재까지 알려진 TNF군 리간드는 C-말단이 세포 밖으로 노출된 유형 Ⅱ의 막관통 단백질이다. 반대로, 현재까지 알려진 대부분의 TNF군 수용체(TNFR)군은 유형 Ⅰ의 막관통 단백질이다. 그러나 TNF 리간드 및 수용체군 모두에서, 세포외 도메인(extracellular domain: "ECD")이 주로 상동성을 나타내었다. TNF-α, Apo-1 리간드 및 CD40 리간드를 포함하는 몇 가지 TNF군 싸이토카인은 세포 표면에서 단백질 분해에 의해 분리되고, 그 결과의 단백질은 가용성 싸이토카인으로 기능하는 동종 삼량체 분자를 형성한다. 또한, TNF 수용체군의 단백질은 단백질 분해에 의해 분리되어 동족 싸이토카인을 억제하는 기능의 가용성 수용체 ECD를 방출한다.
최근, TNFR군의 다른 물질이 동정되었다. 상기 새로이 동정된 TNFR군의 물질은 CAR1, HVEM 및 오스테오프로테게린(osteoprotegerin: OPG)을 포함한다([브로야취 (Brojatsch) 등,Cell,87:845-855 (1996)], [몬트고머리(Montgomery) 등,Cell 87:427436 (1996)], [마스터스(Masters) 등,J. Biol. Chem.,272:14029-14032 (1997)] 및 [시모넷(Simonet) 등,Cell,89:309-319 (1997)]). 시모넷(Simonet) 등의 상기 문헌에서는 다른 종의 공지된 TNFR-유사 분자와는 달리 OPG에는 소수성 막관통 부분의 서열이 없다고 보고하였다.
싸이토카인 중 TNF군 및 그의 수용체에 대해 자세히 알고 싶으면 그러스(Gruss) 및 다우어(Dower)의 상기 문헌을 참조할 수 있다.
본 명세서에서는 PRO715 폴리펩티드라 불리우는, 종양 괴사 인자군의 폴리펩티드와 상동성 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
13.PRO353
효소 연쇄반응에서 활성을 나타내고, 효과기 분자를 생산하는 많은 혈청 단백질을 포함하는 보체 단백질은 염증반응과 관련되어 있다. 보체 단백질은 염증반응과 관련된 세포의 활동 및 기능을 조절하는데 특히 중요하다. 생체내에서 염증반응 및 이와 관련된 기작의 생리적 중요성 때문에, 염증에 관련된 고유의 단백질을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 본 명세서에서는 PRO353 폴리펩티드라 불리우는, 보체 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
14.PRO361
뮤신은 발암과 관계된 당단백질의 군을 포함한다. 뮤신 및 뮤신과 유사한 단백질은 정상 세포 및 형질전환 세포 모두에서 분비된다. 다양한 유형의 암에서 뮤신의 질적 및 양적 변화가 나타난다. 암의 의학적 중요성 때문에, 암의 진단 또는 치료에 유용한 고유의 단백질을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다.
키티나아제 단백질은 식물의 발병기전과 관련된 단백질군을 포함한다. 키티나아제 단백질은 식물 및 미생물에서 만들어지고, 식물이 손상되는 것을 방어하는 역할을 한다. 식물 방어 기작의 중요성 때문에, 식물에서 발병기전-관련 조절에 유용한 고유의 단백질을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 본 명세서에서는 PRO361 폴리펩티드라 불리우는, 뮤신 및 키티나아제와 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
15.PRO365
인간 2-19 단백질과 같은 폴리펩티드는 싸이토카인으로서 기능할 수 있다. 싸이토카인은 저분자량의 단백질로 분화, 증식 또는 면역 세포의 기능을 자극 및 억제하는 역할을 한다. 종종 싸이토카인은 세포내 전달자 역할을 하고, 복합적인 생리적 효과를 나타낸다. 생체내 면역 기작의 중요성 때문에, 면역계에 영향을 주는 고유의 단백질을 새로이 동정하기 위해 노력하고 있다. 본 명세서에서는 PRO365 폴리펩티드라 불리우는, 인간 2-19 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기술하고 있다.
발명의 요약
1.PRO241
본 출원인은 비글리칸 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO241"이라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO241 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 2(서열 번호 2)의 잔기 1-379 아미노산을 갖는 PRO241 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO241 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 2(서열 번호 2)의 잔기 1-379 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO241 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 PRO241의 전체 아미노산 서열(서열 번호 2) 중 약 16-379 아미노산을 포함하는, N-말단의 신호 펩티드가 결여된 PRO241 폴리펩티드를 제공한다.
2.PRO243
본 출원인은 비글리칸 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론(DNA35917-1207)을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO243"이라 칭하였다.
한 가지 실시양태에서, 본 발명은 (a) 도 4(서열 번호 7)의 24-954 아미노산 서열을 포함하는 PRO243 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자 또는 (b) (a)에 상보적인 DNA 분자와 80% 이상 상동성이 있는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 서열의 상동성이 바람직하게는 약 85%, 더 바람직하게는 약 90%, 가장 바람직하게는 약 95%이다. 한 가지 면에서, 단리된 핵산은 도 4(서열 번호 7)의 잔기 1-954 아미노산을 갖는 폴리펩티드와 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성이 있다. 바람직하게, 가장 높은 서열 상동성은 도 4(서열 번호 7)의 보존성 시스테인 단편 4개(아미노산 51-125, 아미노산 705-761, 아미노산 784-849 및 아미노산 897-931)에서 나타난다. 추가의 실시양태에서 단리된 핵산은, 도 4(서열 번호 7)의 잔기 24-954 아미노산을 갖는 PRO243 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다. 다른 면에서, 본 발명은 ATCC에 ATCC 209508호로 기탁된 DNA35917-1207 클론에서 발현되는 전체 길이 단백질에 해당하는 핵산, 다른 표현으로는 ATCC 209508호로 기탁된 DNA35917-1207 클론의 코딩 서열을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO243 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 4(서열 번호 7)의 잔기 24-954 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO241 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다. 원래의 신호 펩티드(도 4(서열 번호 7)의 잔기 1-23 아미노산) 및 개시 메티오닌의 포함 여부에 관계없이 고유의 PRO243 폴리펩티드를 특이적으로 포함한다. 다른 표현으로, 본 발명은 ATCC 209508호로 기탁된 핵산에 의해 암호화되는 PRO243 폴리펩티드를 제공한다.
3.PRO299
본 출원인은 비글리칸 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO299"라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO299 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 9(서열 번호 15)의 잔기 1-737 아미노산을 갖는 PRO299 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO299 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 9(서열 번호 15)의 잔기 1-737 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO299 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 PRO299 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인에 관한 것이다.
4.PRO323
본 출원인은 미립체의 디펩티다아제 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO323"이라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO323 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 13(서열 번호 24)의 잔기 1-433 아미노산을 갖는 PRO323 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO323 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 13(서열 번호 24)의 잔기 1-433 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO323 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다.
5.PRO327
본 출원인은 프로락틴 수용체 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO327"이라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO327 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 17(서열 번호 32)의 잔기 1-422 아미노산을 갖는 PRO327 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO327 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 17(서열 번호 32)의 잔기 1-422 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO327 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다.
6.PRO233
본 출원인은 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO233"이라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO233 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 19(서열 번호 37)의 잔기 1-300 아미노산을 갖는 PRO233 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO233 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 19(서열 번호 37)의 잔기 1-300 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO233 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다.
7.PRO344
본 출원인은 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO344"라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO344 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은 도 21(서열 번호 42)의 잔기 1-243 아미노산을 갖는 PRO344 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO344 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 21(서열 번호 42)의 잔기 1-243 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO344 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다.
8.PRO347
본 출원인은 시스테인이 풍부한 분비 단백질-3과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO347"이라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO347 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 23(서열 번호 50)의 잔기 1-455 아미노산을 갖는 PRO347 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO347 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 23(서열 번호 50)의 잔기 1-455 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO347 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다.
9.PRO354
본 출원인은 인터-알파-트립신 억제제(ITI)의 중쇄와 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO354"라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO354 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 25(서열 번호 55)의 잔기 1-694 아미노산을 갖는 PRO354 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO354 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 25(서열 번호 55)의 잔기 1-694 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO354 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다.
10.PRO355
본 출원인은 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO355"라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO355 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 27(서열 번호 61)의 잔기 1-440 아미노산을 갖는 PRO355 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO355 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 27(서열 번호 61)의 잔기 1-440 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO355 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 PRO355 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인에 관한 것이다.
11.PRO357
본 출원인은 인슐린과 유사한 생장인자(IGF)의 산 불안정 서브유니트(ALS)와 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO357"이라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO357 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 29(서열 번호 69)의 잔기 1-598 아미노산을 갖는 PRO357 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO357 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 29(서열 번호 69)의 잔기 1-598 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO357 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 PRO357 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인에 관한 것이다.
12.PRO715
본 출원인은 종양 괴사 인자군 폴리펩티드와 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO715"라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO715 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 31(서열 번호 76)의 잔기 1-250 아미노산을 갖는 PRO715 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO715 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 31(서열 번호 76)의 잔기 1-250 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO715 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 PRO715 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인에 관한 것이다.
13.PRO353
본 출원인은 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO353"이라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO353 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 35(서열 번호 86)의 잔기 1-281 아미노산을 갖는 PRO353 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO353 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 35(서열 번호 86)의 잔기 1-281 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO353 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다.
14.PRO361
본 출원인은 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO361"이라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO361 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 37(서열 번호 91)의 잔기 1-431 아미노산을 갖는 PRO361 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다. 단리된 핵산 서열은 PRO361을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ATCC 209621호로 1998년 2월 5일 기탁된 벡터 중의 cDNA 삽입부를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO361 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 37(서열 번호 91)의 잔기 1-431 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO715 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 도 37(서열 번호 91)에 나타난 잔기 1-379 아미노산을 갖는 PRO361 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인에 관한 것이다. 임의로, PRO361 폴리펩티드는 ATCC 209621호로 1998년 2월 5일 기탁된 벡터 중의 cDNA 삽입부에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현시켜 수득할 수 있다.
15.PRO365
본 출원인은 신규 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 클론을 동정하고, 그의 폴리펩티드를 "PRO365"라 칭하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRO365 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 가지 면에서 단리된 핵산은, 도 39(서열 번호 99)의 잔기 1-235 아미노산을 갖는 PRO365 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 암호화 핵산 서열에 상보적인 DNA이고, 최소한 적당한 엄격 조건에서(임의로 고도의 엄격 조건에서도) 상보적 핵산과 안정하게 결합된 상태로 존재한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 단리된 PRO365 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 실시양태의 도 39(서열 번호 99)의 잔기 1-235 아미노산을 포함하는 고유 서열의 PRO715 폴리펩티드를 단리된 상태로 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 도 39(서열 번호 99)의 잔기 21-235를 포함하는 아미노산 서열에 관한 것이다.
16.부가의 실시양태
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 임의의 상기 또는 하기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 실시예에서, 숙주세포는 CHO 세포, 대장균 또는 효모일 수 있다. 임의의 상기 또는 하기 폴리펩티드의 제조 방법은 추가로 제공되고, 원하는 폴리펩티드를 발현시키는 적합한 조건에서 숙주 세포를 배양하여 배양된 세포에서 원하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 임의의 상기 또는 하기 폴리펩티드(이질성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 융합됨)를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 상기 키메라 분자의 예로는 에피토프 태그(epitope tag) 서열 또는 면역글로불린의 Fc 부분과 융합된 임의의 상기 또는 하기 폴리펩티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 임의의 상기 또는 하기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 상기 항체는 모노클론 항체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기 뉴클레오티드 서열에서 유래되어 게놈 및 cDNA 뉴클레오티드 서열의 단리에 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe)를 제공한다.
본 발명은 신규 DNA의 동정과 단리 및 상기 DNA가 암호화하는 신규 폴리펩티드의 재조합 제조에 관한 것이다.
도 1은 본 명세서에 "UNQ215" 및(또는) "DNA34392-1170이라 불리우는 PRO241 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 1)이다.
도 2는 도 1(서열 번호 1)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 2)이다. 또한, 도 2에는 신호 펩티드로 추정되는 부위, 잠재적 류신 지퍼 부위 및 잠재적 N-글리코실화 부위가 표시된다.
도 3은 본 명세서에 "UNQ217" 및(또는) "DNA35917-1207이라 불리우는 PRO243 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 6)이다.
도 4는 도 3(서열 번호 6)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 7)이다.
도 5는 인간 염색체 3q27-q28의 THPO 부위에 대한 게놈의 클론을 조직화시킨 것이다.
도 6의 A 및 B는 성인 및 태아 조직에서 PRO243의 발현을 보여준다. 도 6의 A는 인간의 코딘 cDNA(PRO243)을 프로브로 혼성화시킨 성인 및 태아 조직의 노던 블랏(northern blot) 결과이다. 아래쪽 패널은 실험 대조구로서 액틴을 보여준다.도 6의 B는 인간의 코딘 cDNA(PRO243)를 나타내는 모식도로, 보존성 시스테인을 암호화하는 코돈의 위치는 블록형으로 표시되고 사용된 프로브의 범위는 두꺼운 선으로 표시되었다.
도 7은 성인 조직의 PRO243에 대한 원래 위치에서의 혼성화 결과로, 대퇴 두부와 관골구 사이에 나타나는 발생중인 활액관절 분열선에 양성 신호가 나타난다.
도 8은 본 명세서에 "UNQ262" 및(또는) "DNA39976-1215라 불리우는 PRO299 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 14)이다.
도 9는 도 8(서열 번호 14)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 15)이다.
도 10은 본 명세서에 DNA28847(서열 번호 18)이라 불리우는 뉴클레오티드 서열이다.
도 11은 본 명세서에 DNA35877(서열 번호 19)이라 불리우는 뉴클레오티드 서열이다.
도 12는 본 명세서에 "UNQ284" 및(또는) "DNA35595-1228이라 불리우는 PRO323 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 23)이다.
도 13은 도 12(서열 번호 23)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 24)이다.
도 14는 PRO323에서 유도된 폴리펩티드와 IgG 불변 도메인이 융합된 키메라 단백질(본 명세서에서 "PRO454"라 불리움)의 뉴클레오티드 서열(뉴클레오티드 79-1416)를 포함하는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열(서열 번호 29)이다. PRO323 및IgG 융합 단백질을 암호화하는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열(서열 번호 29)은 본 명세서에 "DNA35872"라 불리운다.
도 15는 도 14의 뉴클레오티드 서열 중 79-1416 뉴클로오티드에서 유래된 아미노산 서열(서열 번호 30)이다. PRO323에서 유래한 서열 및 IgG에서 유래한 서열 사이에 존재하는 PRO454 아미노산 서열의 연결부가 415-416 아미노산에서 나타난다.
도 16은 본 명세서에 "UNQ327" 및(또는) "DNA38113-1230이라 불리우는 PRO327 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 31)이다.
도 17은 도 16(서열 번호 31)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 32)이다.
도 18은 본 명세서에 "UNQ207" 및(또는) "DNA34436-1238이라 불리우는 PRO233 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 36)이다.
도 19는 도 18(서열 번호 36)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 37)이다.
도 20은 본 명세서에 "UNQ303" 및(또는) "DNA40592-1242라 불리우는 PRO344 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 41)이다.
도 21은 도 20(서열 번호 41)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 42)이다.
도 22는 본 명세서에 "UNQ306" 및(또는) "DNA44176-1244라 불리우는 PRO347 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 49)이다.
도 23은 도 22(서열 번호 49)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 50)이다.
도 24는 본 명세서에 "UNQ311" 및(또는) "DNA44192-1246이라 불리우는 PRO354 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 54)이다.
도 25는 도 24(서열 번호 54)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 55)이다.
도 26은 본 명세서에 "UNQ312" 및(또는) "DNA39518-1247이라 불리우는 PRO355 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 60)이다.
도 27은 도 26(서열 번호 60)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 61)이다.
도 28은 본 명세서에 "UNQ314" 및(또는) "DNA44804-1248이라 불리우는 PRO357 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 68)이다.
도 29는 도 28(서열 번호 68)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 69)이다.
도 30은 본 명세서에 "UNQ383" 및(또는) "DNA52722-1229라 불리우는 PRO715 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 75)이다.
도 31은 도 30(서열 번호 75)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 76)이다.
도 32는 인간의 종양 괴사 인자-α(TNFA_인간)(서열 번호 77)를 DNA52722-1229의 114-863 뉴클레오티드에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 76)과 비교한것이다. 동일한 아미노산은 박스로 표시된다.
도 33은 DNA52722-1229의 114-863 뉴클레오티드에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 76)을 다양한 종양 괴사 인자군 중 하나인 단백질(서열 번호 78-84)의 아미노산 서열과 비교한 것이다. 동일한 아미노산은 박스로 표시된다.
도 34는 본 명세서에 "UNQ310" 및(또는) "DNA41234-1242라 불리우는 PRO353 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 85)이다.
도 35는 도 34(서열 번호 85)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 86)이다.
도 36은 본 명세서에 "UNQ316" 및(또는) "DNA45410-1250이라 불리우는 PRO361 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 90)이다.
도 37은 도 36(서열 번호 90)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 91)이다.
도 38은 본 명세서에 "UNQ320" 및(또는) "DNA46777-1253이라 불리우는 PRO365 cDNA 뉴클레오티드의 고유 서열(서열 번호 98)이다.
도 39는 도 38(서열 번호 98)의 코딩 서열에서 유래한 아미노산 서열(서열 번호 99)이다.
Ⅰ.정의
"PRO 폴리펩티드" 및 "PRO"란 본 명세서에 사용된 바와 같이 바로 뒤에 숫자가 붙어서 다양한 폴리펩티드를 의미하는데, 완전한 명칭(즉, PRO/숫자)은 본 명세서에 기재된 특이적 폴리펩티드를 의미하는 용어이다. 본 명세서에 사용된 "PRO/숫자 폴리펩티드"는 고유 서열의 폴리펩티드 및 변형된 폴리펩티드(본 명세서에 추가로 정의됨)를 포함하는 용어이다. 본 명세서에 기재된 PRO 폴리펩티드는 인간의 조직 또는 다른 숙주와 같은 다양한 출처에서 단리되거나 재조합 또는 합성에 의해 제조될 수 있다.
"고유 서열의 PRO 폴리펩티드"는 자연에서 유래한 PRO 폴리펩티드와 일치하는 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 고유 서열의 PRO 폴리펩티드는 자연에서 단리되거나 재조합 또는 합성에 의해 제조될 수 있다. "고유 서열의 PRO 폴리펩티드"란 자연적으로 발생하는 불완전하거나 선택된 형태의 특이적 PRO 폴리펩티드(예를 들면, 세포외 도메인 서열), 자연적으로 발생하는 변형체(예를 들면, 스플라이스(splice)된 형태) 및 자연적으로 발생하는 대립유전자의 변형체 폴리펩티드를 특이적으로 포함한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, PRO241 폴리펩티드의 고유 서열은 도 2(서열 번호 2)의 1-379 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO241 폴리펩티드 고유 서열이고, PRO243 고유 서열은 N-말단의 신호 서열(잔기 1-23 정도) 및 개시 메티오닌(위치 1의 아미노산)의 포함 여부에 관계 없이 도 4(서열 번호 7)의 24-954 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO241 폴리펩티드 고유 서열이고, PRO299 폴리펩티드의 고유 서열은 도 9(서열 번호 15)의 1-737 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO299 고유 서열이거나, 또는 PRO299 폴리펩티드의 고유 서열이 전체 길이의 PRO299 단백질의 막관통 도메인으로 추정되는 도메인이 도 8의 뉴클레오티드 2022에서 시작되는 뉴클로오티드에 의해 암호화하는 전체 길이 PRO299 단백질의 세포외 도메인이고, PRO323 폴리펩티드의 고유 서열은 도 13(서열 번호24)의 1-433 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO323 폴리펩티드의 고유 서열이고, PRO327 폴리펩티드의 고유 서열은 도 17(서열 번호 32)의 1-422 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO327 폴리펩티드의 고유 서열이고, PRO233 폴리펩티드의 고유 서열은 도 19(서열 번호 37)의 1-300 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO233 폴리펩티드의 고유 서열이고, PRO344 폴리펩티드의 고유 서열은 도 21(서열 번호 42)의 1-243 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO344 폴리펩티드의 고유 서열이고, PRO347 폴리펩티드의 고유 서열은 도 23(서열 번호 50)의 1-455 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO347 폴리펩티드의 고유 서열이고, PRO354 폴리펩티드의 고유 서열은 도 25(서열 번호 55)의 1-694 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO354 폴리펩티드의 고유 서열이고, PRO355 폴리펩티드의 고유 서열은 도 27(서열 번호 61)의 1-440 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO355 폴리펩티드의 고유 서열이거나, 또는 PRO355 폴리펩티드의 고유 서열이 전체 길이의 PRO355 단백질의 막관통 도메인으로 추정되는 도메인이 도 26의 뉴클레오티드 1138에서 시작되는 뉴클로오티드에 의해 암호화하는 전체 길이 PRO355 단백질의 세포외 도메인이고, PRO357 폴리펩티드의 고유 서열은 도 29(서열 번호 69)의 1-598 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO357 폴리펩티드의 고유 서열이거나, 또는 PRO357 폴리펩티드의 고유 서열이 전체 길이의 PRO357 단백질의 막관통 도메인으로 추정되는 도메인이 서열 번호 68의 뉴클레오티드 1518-1572 또는 1491-1572에 의해 암호화하는 전체 길이 PRO357 단백질의 세포외 도메인이고, PRO715 폴리펩티드의 고유 서열은 도 31(서열 번호 76)의 1-250 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO715 폴리펩티드의 고유 서열이고, PRO353 폴리펩티드의 고유 서열은 도 35(서열 번호 86)의 1-281 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO353 폴리펩티드의 고유 서열이거나 전체 길이 PRO353 단백질의 세포외 도메인이고, PRO361 폴리펩티드의 고유 서열은 도 37(서열 번호 91)의 1-431 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO361 폴리펩티드의 고유 서열이거나, 또는 PRO361 폴리펩티드의 고유 서열이 전체 길이의 PRO361 단백질의 막관통 도메인으로 추정되는 도메인이 도 36의 뉴클레오티드 1363에서 시작되는 뉴클로오티드에 의해 암호화하는 전체 길이 PRO361 단백질의 세포외 도메인이며, PRO365 폴리펩티드의 고유 서열은 도 39(서열 번호 99)의 1-235 아미노산을 포함하는 성숙된 또는 전체 길이의 PRO365 폴리펩티드의 고유 서열이다.
"세포외 도메인" 또는 "ECD"란 막관통 또는 세포질 도메인이 아닌 PRO 폴리펩티드의 형태를 의미한다. PRO 폴리펩티드의 ECD는 통상 막관통 및(또는) 세포질 도메인이 1% 미만 포함되고, 바람직하게 상기 도메인이 0.5% 미만 포함된다. 본 발명의 PRO 폴리펩티드에 나타나는 막관통 도메인은 당업계에서 소수성 도메인을 나타내기 위해 사용된 기준에 준거하여 확인되었다. 막관통 도메인의 정확한 경계선은 다를 수 있지만, 대부분은 최초 확인된 도메인의 끝에서 5개 아미노산 범위 내에 존재한다.
"PRO 폴리펩티드 변형체"란 상기 또는 하기에 정의된 바와 같이 본 명세서에개시된 PRO 폴리펩티드의 고유 서열 전체 길이와 80% 이상 서열이 동일한 활성 PRO 폴리펩티드를 의미한다. 상기 PRO 폴리펩티드 변형체는 예를 들면, 고유 서열의 아미노산 전체 길이의 N- 또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 제거된 PRO 폴리펩티드를 포함한다. PRO 폴리펩티드 변형체는 본 명세서에 공개된 고유 서열의 아미노산 전체 길이에 대한 아미노산 서열이 통상 80% 이상 동일하고, 바람직하게는 85% 이상 동일하고, 더 바람직하게는 90% 이상 동일하고, 더더욱 바람직하게는 95% 이상 동일하며, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일하다.
"PRO243 변형체"란 (a) 고유의 신호 서열의 유무와 관계 없이 PRO243 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자 또는 (b) (a)와 상보적인 DNA 분자의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한, 상기 정의된 바와 같은 활성 PRO243을 의미한다. 특별한 실시양태에서, PRO243 변형체는 전체 길이의 PRO243 고유 서열에 대해 도 4(서열 번호 7)에 나타나는 추정된 아미노산 서열을 갖는 PRO243과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성이 있다. 예를 들면, 상기의 PRO243 변형체는 도4(서열 번호 7)의 서열 중 N- 또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 제거된 PRO243 폴리펩티드를 포함한다. 핵산 또는 아미노산 서열의 동일성은 바람직하게 85% 이상, 더 바람직하게 90% 이상, 더더욱 바람직하게 95% 이상이다.
본 명세서에서 동정한 PRO 폴리펩티드 서열에 관한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"란 후보 서열 및 특정 PRO 폴리펩티드 서열을 배열(필요한 경우, 서열 동일성의 최대값을 얻기 위해 갭(gap)을 허용)한 후 상기 두 서열간에 나타나는 동일한 아미노산 잔기의 비율로 정의되며, 이 경우 보존성 치환체는 동일한 서열의부분으로 고려하지 않는다. 아미노산 서열의 동일성 퍼센트를 측정하기 위한 서열의 배열은 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공공연하게 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에서 다양한 방법으로 수행할 수 있다. 배열 프로그램으로 바람직한 소프트웨어는 BLAST이다. 당업계 숙련자들은 비교되는 전체 길이의 서열에서 최대의 배열을 성취하기 위해 필요한 적합한 매개변수(예를 들면, 알고리즘의 선택)를 결정할 수 있다.
본 명세서에서 동정한 PRO-암호화 핵산 서열에 관한 "핵산 서열 동일성 퍼센트(%)"란 후보 서열 및 관심있는 PRO 핵산 서열을 배열(필요한 경우, 서열 동일성의 최대값을 얻기 위해 갭(gap)을 허용)한 후 상기 두 서열간에 나타나는 동일한 뉴클레오티드의 비율로 정의된다. 핵산 서열 동일성 퍼센트를 측정하기 위한 서열의 배열은 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공공연하게 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에서 다양한 방법으로 수행할 수 있다. 배열 프로그램으로 바람직한 소프트웨어는 BLAST이다. 당업계 숙련자들은 비교되는 전체 길이의 서열에서 최대의 배열을 성취하기 위해 필요한 적합한 매개변수(예를 들면, 알고리즘의 선택)를 결정할 수 있다.
본 명세서에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용되는 "단리된"이란 동정 후 자연 환경의 요소로부터 분리 및(또는) 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 자연 환경의 오염물 성분은 통상 진단 또는 치료용으로 폴리펩티드를 사용시효능을 방해할 수 있는 물질로, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵(spinning cup) 서열 분석기로 N-말단 또는 내부의 아미노산 중 15개 이상을 읽기에 충분한 정도, 또는 (2) 비환원 또는 환원 조건에서 SDS-PAGE 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색(바람직하게는 실버 염색(silver stain))시 한 종류의 밴드만 보이는 정도로 정제된다. 하나 이상의 PRO 폴리펩티드 성분이 자연 상태에서는 나타나지 않기 때문에, 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 원래 위치의 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 단리된 폴리펩티드는 통상 한 가지 이상의 정제 과정에 의해 제조된다.
"단리된" PRO 폴리펩티드-암호화 핵산이란 자연 상태에서 PRO 폴리펩티드 핵산의 천연 물질과 결합된 하나 이상의 핵산 분자 오염물로부터 상기 핵산을 동정 및 분리시킨 핵산 분자이다. 단리된 PRO 폴리펩티드 핵산 분자는 자연 상태에서 발견된 그대로의 형태는 아니다. 따라서, 단리된 PRO 폴리펩티드 핵산 분자는 자연 상태의 세포에 존재하는 특이적 PRO 폴리펩티드 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 단리된 PRO 폴리펩티드 핵산 분자는, 본래 세포의 염색체 위치가 아닌 다른 위치의 염색체에서 PRO 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 함유된 PRO 폴리펩티드 핵산 분자를 포함한다.
"제어 서열"이란 용어는 특정한 숙주 세포에서 코딩 서열과 작동적으로 연결된, 단백질의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은 예를 들면, 프로모터, 임의로 작동 유전자 및 리보솜 결합 부위(ribosomebinding site)를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서(enhancer)를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
어느 핵산 서열이 다른 핵산 서열과 기능적인 관계에 놓여 있을 때, 핵산이 "작동적으로 연결된" 상태라고 한다. 예를 들어, 어떤 DNA에서 발현되는 폴리펩티드가 분비되는 상태의 예비 단백질인 경우, 예비서열 또는 분비 리더용 DNA가 폴리펩티드 발현용 DNA와 작동적으로 연결되어 있고, 서열의 전사에 영향을 주는 프로모터 또는 인핸서도 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있으며, 번역을 촉진하는 리보솜 결합 부위도 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 통상, "작동적으로 연결된"이란 DNA가 인접하여 연결되어 있는 것을 의미하고, 분비 리더의 경우 인접해 있으면서 동일한 ORF 상에 존재한다. 그러나, 인핸서는 인접하지 않을 수도 있다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션(ligation)으로 수행한다. 상기 제한 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker)를 종래의 방법대로 사용한다.
"항체"란 단일 항-PRO 폴리펩티드 모노클론 항체(효능제, 길항제 및 중화 항체 포함) 및 폴리에피토프에 특이적인 항-PRO 폴리펩티드 항체를 포함하는 넓은 의미로 사용되는 용어이다. "모노클론 항체"란 본 명세서에서 사용된 바와 같이 실질적인 동종 항체의 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 포함한 개개의 항체가 소수로 존재할 수 있는 자발 돌연변이를 제외하고는 동일한 항체를 말하는 용어이다.
본 명세서의 "활성이 있는" 또는 "활성"이란 자연 발생적인 고유의 PRO 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 포함하는 PRO 폴리펩티드의 형태를 의미한다. PRO243의 경우, 척삭 및 근육 형성에 관련된 코딘에 결합하여 활성에 영향(방해 또는 변화)을 끼치는 활성을 가지고 있다.
"치료" 또는 "치료하는"이란 치료상의 처치 및 예방 또는 예방 대책을 의미한다. 치료를 요하는 사람이란 이미 질병에 걸린 사람 뿐만 아니라 예방할 질병을 가진 것으로 판명된 사람을 포함한다.
치료 목적의 "포유동물"이란 포유류로 분류된 임의의 동물(인간 포함), 길들인 사육동물 및 양, 개, 말, 고양이, 젖소 등과 같은 동물원 동물, 스포츠용 동물 또는 애완동물을 의미한다. 본 명세서의 포유동물은 인간이 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 "담체"란 투여시 사용하는 양 및 농도에 노출되더라도 세포 또는 포유동물에 독성이 없는, 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 통상 생리적으로 허용되는 담체는 pH가 완충되는 수용액이다. 생리적으로 허용되는 담체의 예로는 완충액(인산염 완충액, 시트르산염 완충액 및 다른 유기산 완충액), 산화방지제(아스코브산), 저분자량(10개 잔기 미만) 폴리펩티드, 단백질(혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린), 아미노산(글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신), 일탄당이나 이탄당 및 다른 탄수화물(포도당, 만노오스 또는 덱스트린), 킬레이트화제(EDTA), 당 알코올(만니톨 또는 소르비톨), 염-형성 카운터이온(counterion)(나트륨) 및(또는) 비이온성 계면활성제(트윈(등록상표)(TWEENTM), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 플루로닉스(등록상표)(PLURONICSTM))를포함한다.
"효능제"란 하나 이상의 생물학적 활성이 있는 고유의 PRO 폴리펩티드(고유의 PRO 폴리펩티드란 프로(pro)-PRO 폴리펩티드, 프리(pre)-PRO 폴리펩티드, 프리프로(prepro)-PRO 폴리펩티드 또는 성숙된 PRO 폴리펩티드를 의미함) 및 상기 PRO 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 펩티드 유사체 또는 펩티드가 아닌 유사체를 의미하는 용어이다. 바람직하게, 본 발명의 효능제는 고유의 PRO 폴리펩티드가 갖는 질적 결합 인지 특성 및 수용체 활성화 특성이 있다.
"길항제"란 프로(pro)-PRO 폴리펩티드, 프리(pre)-PRO 폴리펩티드, 프리프로(prepro)-PRO 폴리펩티드 또는 성숙된 PRO 폴리펩티드를 의미하는 본 발명의 고유 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 분자를 의미한다. 바람직하게, 본 명세서의 길항제는 본 발명의 고유 PRO 폴리펩티드가 그의 결합 상대에 결합하는 것을 억제한다. PRO 폴리펩티드의 "길항제"란 PRO 길항제의 작동체 기능을 방해하는 분자(예를 들면, PRO 폴리펩티드에 의한 PRO 폴리펩티드 수용체의 결합 및(또는) 활성화를 방해하는 분자)를 의미한다. 예를 들면, 시험 길항제 분자의 유무에 따라 고유의 PRO 폴리펩티드가 PRO 폴리펩티드 수용체에 결합하는 능력이 경쟁적으로 억제되는 현상을 모니터하여 상기 분자를 스크린할 수 있다. 또한, 본 발명의 길항제는 PRO 폴리펩티드의 전사 또는 번역을 방해하여 단백질의 발현 및 생물학적 활성을 억제하는 안티센스(antisense) 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"엄격 조건"이란 (1) 이온강도가 낮고 온도가 높은 상태(예를 들면, 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산 나트륨 및 0.1% 황산 도데실 나트륨, 50℃)의 세척또는 (2) 혼성화 반응시 42℃에서 포름아미드(0.1% 소의 혈청 알부민, 0.1% 피콜(Ficoll), 0.1% 폴리비닐 피롤리돈 및 50nM 인산나트륨 완충액(pH 6.5) 중의 포름아미드 50%(부피/부피))와 같은 변성화제를 750mM 염화 나트륨 및 75mM 시트르산 나트륨과 함께 사용하는 것을 의미한다. 다른 예는 50% 포름아미드, 5x SSC(0.75M NaCl, 0.075M 시트르산 나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하트 용액(Denhardt's solution), 초음파로 분해된 연어의 정자(salmon sperm) DNA(50㎍/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트로 42℃에서 혼성화시키고, 0.2x SSC 및 0.1% SDS로 42℃에서 세척하는 것이다. 또 다른 예는 완충액(10% 덱스트란 설페이트, 2x SSC 및 50% 포름아미드)으로 55℃에서 혼성화시키고, 이어서 EDTA를 포함한 0.1x SSC로 구성된 매우 과도한 용액으로 세척하는 것이다.
"적당한 엄격 조건"이란 상기 샘브루크(Sambrook) 등의 문헌에 기재된 것으로, 세척 용액 및 혼성화 조건(예를 들면, 온도, 이온 강도 및 SDS의 %)이 상기에 기재된 것보다 덜 엄격한 조건을 의미한다. 적당한 엄격 조건의 예는 37℃의 용액(20% 포름아미드, 5x SSC(150mM NaCl, 15mM 시트르산 나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x 덴하트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20mg/ml의 분해된 연어 정자 DNA를 포함)에서 밤새 반응시키고, 필터를 1xSSC로 37 내지 50℃에서 세척하는 조건이다. 당업계 숙련자는 프로브의 길이 등과 같은 인자에 순응하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 어떻게 조절하는지 알고 있을 것이다.
"써던 분석(Southern analysis)" 또는 "써던 블라팅(Southern blotting)"이란 이미 알고 있는 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 단편을 표지시키고, 이를 프로브로 혼성화하여, 제한효소로 잘려진 DNA 중의 DNA 서열 또는 그 DNA를 포함한 조성물의 존재를 확인하는 방법이다. 써던 분석은 통상 잘려진 DNA를 아가로오스 겔에서 전기영동으로 분리하는 단계, 상기 분리된 DNA를 변성화시키는 단계 및 상기 DNA를 니트로셀룰로오스, 나일론 또는 다른 적합한 막 지지체(방사능 표지, 바이오틴 표지 또는 효소 표지된 프로브로 분석함)에 옮기는 단계(샘브루크(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 중 9.37-9.52 부분에 기재됨)를 포함한다.
"노던 분석(Northern analysis)" 또는 "노던 블라팅(Northern blotting)"이란 이미 알고있는 올리고뉴클레오티드, DNA 단편, cDNA나 그의 단편 또는 RNA 단편과 같은 프로브로 혼성화시켜 RNA 서열을 확인하는데 사용하는 방법이다. 프로브는32P와 같은 방사성동위원소, 바이오틴 또는 효소로 표지된다. 분석할 RNA는 아가로오스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스, 나일론 또는 다른 적합한 막에 옮긴 후, 상기의 샘브루크(Sambrook) 등의 문헌 중 7.39-7.52 부분에 기재된 방법과 같은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 프로브로 혼성화시킨다.
Ⅱ.본 발명의 구성 및 방법
1.전체 길이의 PRO241 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO241이라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO241 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO241 폴리펩티드가 다양한 비클리칸 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO241 폴리펩티드는 새로이 동정된 비글리칸 상동성 폴리펩티드이고, 비글리칸 단백질의 활성이 있다고 생각된다.
2.전체 길이의 PRO243 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO243이라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO243 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST, BLAST-2 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 전체 길이의 PRO243 고유 서열(도 4의 서열 번호 7)이 아프리카 발톱 개구리(African clawed frog) 및 제노푸스(Xenopus)의 코딘과 50%의 아미노산 동일성을 갖고, 생쥐의 코딘과 77%의 상동성이 있음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO243 폴리펩티드는 새로이 동정된 코딘 단백질군의 한 단백질로서 중배엽의 등형성 작용에 의한 척삭 및 근육 형성에 영향을 끼칠 수 있을거라 생각된다.
3.전체 길이의 PRO299 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO299라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO299 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다.BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO299 폴리펩티드의 여러 부분이 노치 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO299 폴리펩티드는 새로이 동정된 노치 단백질군의 한 단백질로서 노치 단백질군에서 통상 나타나는 신호 전달 특성이 있을거라 생각된다.
4.전체 길이의 PRO323 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO323이라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO323 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO323 폴리펩티드의 여러 부분이 다양한 디펩티다아제 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO323 폴리펩티드는 새로이 동정된 디펩티다아제 상동체로서 디펩티다아제 활성이 있다고 생각된다.
5.전체 길이의 PRO327 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO327이라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO327 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO327 폴리펩티드가 다양한 프로락틴 수용체 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO327 폴리펩티드는 새로이 동정된 프로락틴 상동체로서 프로락틴 수용체 단백질의 활성이 있다고 생각된다.
6.전체 길이의 PRO233 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO233이라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO233 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO233 폴리펩티드의 여러 부분이 다양한 환원효소 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 또한, PRO233 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 세노르하브디티스 엘레강스 (Caenorhabditis elegans)의 해당 DNA와 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO233 폴리펩티드는 새로이 동정된 환원효소군의 한 효소로서, 환원효소군이 통상 나타내는 세포의 산화환원 상태 조절 능력이 있다고 생각된다.
7.전체 길이의 PRO344 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO344라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO344 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO344 폴리펩티드의 여러 부분이 인간 및 생쥐의 보체 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO344 폴리펩티드는 새로이 동정된 보체 단백질군의 한 단백질로서, 보체 단백질군이 통상 나타내는 바와 같이 염증반응에 영향을 줄 것이라고 생각된다.
8.전체 길이의 PRO347 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO347이라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO347 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO347 폴리펩티드가 시스테인이 풍부한 여러 분비 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO347 폴리펩티드는 새로이 동정된 시스테인이 풍부한 분비 단백질로서, 시스테인이 풍부한 단백질이 통상 나타내는 활성이 있다고 생각된다.
9.전체 길이의 PRO354 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO354라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO354 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO354 폴리펩티드가 인터-알파-트립신 억제제의 중쇄 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO354 폴리펩티드는 새로이 동정된 인터-알파-트립신 억제제의 중쇄 상동체라고 생각된다.
10.전체 길이의 PRO355 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO355라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO355 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다.BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO355 폴리펩티드의 여러 부분이 CRTAM 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 또한, PRO355 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 흉선세포 활성화 및 발생 단백질, H20A 수용체, H20B 수용체, 폴리오바이러스(poliovirus) 수용체 및 세르코피테쿠스 애티오프스 (Cercopithecus aethiops)의 AGM 델타 1 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO355 폴리펩티드는 새로이 동정된 CRTAM 단백질군의 한 단백질이라고 생각된다.
11.전체 길이의 PRO357 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO357이라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO357 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO357 폴리펩티드의 여러 부분이 인슐린과 유사한 생장 인자의 산 불안정 서브유니트와 상동성이 높음을 알아냈다. 또한, DNA44804-1248의 비암호화 부분이 WO 95/14772호에 기재된 인간 유전자 시그너쳐(signature)와 함께 배열됨을 알아냈다. 추가로, DNA44804-1248의 비암호화 부분이 문헌[듀링(Deuring) 및 되플러(Doerfler),Gene, 26:283-289(1983)]에 기재된 아데노바이러스(adenovirus) 유형 12의 인간 재조합 바이러스 DNA와 함께 배열됨을 알아냈다. 코딩 부위의 상동성을 기초로 하여, 본 출원에 개시되는 PRO357 폴리펩티드는 새로이 동정된, 류신이 풍부한 반복 서열을 포함하는 단백질군의 한 단백질이며, 특히 인슐린과 유사한 생장 인자의 산불안정 서브유니트와 관련되었다고 생각된다. 따라서, PRO357은 결합 기작에 관련되고 복합체의 일부일 수 있다.
12.전체 길이의 PRO715 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO715라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO715 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO715 폴리펩티드의 여러 부분이 다양한 종양 괴사 단백질의 군과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO715 폴리펩티드는 새로이 동정된 종양 괴사 인자 단백질군의 한 단백질이라고 생각된다.
13.전체 길이의 PRO353 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO353이라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO353 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO353 폴리펩티드의 여러 부분이 인간 및 생쥐의 보체 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO353 폴리펩티드는 새로이 동정된 보체 단백질군의 한 단백질로서, 보체 단백질군이 통상 나타내는 바와 같이 염증반응에 영향을 줄 것이라고 생각된다.
14.전체 길이의 PRO361 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO361이라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO361 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO361 폴리펩티드의 여러 부분이 뮤신 및 키틴 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO361 폴리펩티드는 새로이 동정된 뮤신 및(또는) 키틴 단백질군의 한 단백질로서, 뮤신 및 키틴 단백질군이 통상 나타내는 바와 같이 각각 암, 식물 병리 또는 수용체 기능과 관련되어 있을 것이라고 생각된다.
15.전체 길이의 PRO365 폴리펩티드
본 발명은 본 출원에서 PRO365라 불리우는 폴리펩티드를 암호화하는, 새로이 동정 및 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 출원인은 하기 실시예에 더 상세히 개시되는 PRO365 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 동정 및 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 배열용 컴퓨터 프로그램을 이용하여, PRO365 폴리펩티드의 여러 부분이 인간의 2-19 단백질과 상동성이 높음을 알아냈다. 따라서, 본 출원에 개시되는 PRO365 폴리펩티드는 새로이 동정된 인간 2-19 단백질군의 한 단백질로 생각된다.
16.PRO 폴리펩티드 변형체
본 명세서에 기재된 전체 길이의 PRO 폴리펩티드 고유 서열 뿐만 아니라, PRO 폴리펩티드의 변형체도 제조될 수 있다. PRO 폴리펩티드의 변형체는 PRO 폴리펩티드의 DNA 내에 적합한 뉴클레오티드를 변화시키거나, 또는 원하는 PRO 폴리펩티드를 합성하여 제조할 수 있다. 당업계 숙련자는 아미노산의 변화로 인해 글리코실화 부위의 수나 위치 변화 또는 세포막 부착성의 변화와 같은 번역후 과정이 달라질 수 있음을 알 것이다.
본 명세서에 기재된 전체 길이의 PRO 폴리펩티드 고유 서열 또는 PRO 폴리펩티드의 다양한 도메인 내에서의 변형체는 임의의 보존성 및 비보존성 돌연변이 기술 및 지침(예: 미국 특허 제5,364,934호)을 사용하여 제조할 수 있다. 변형체는 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 코돈을 치환, 제거 또는 삽입하여 고유 서열의 PRO 폴리펩티드에 비해 아미노산 서열이 변화된 것이다. 임의로, 변형체는 하나 이상의 아미노산을 PRO 폴리펩티드 도메인 내의 하나 이상의 아미노산으로 치환하는 것이다. 원하는 활성에 역효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 제거될 아미노산을 결정하는 방법은, PRO 폴리펩티드 서열을 이미 알려진 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하여 상동성이 높은 영역에서 변화되는 아미노산의 수를 최소화하는 것이다. 아미노산의 치환은 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대치(예를 들면, 류신을 세린으로)하는, 즉 보존적 아미노산 교환일 수 있다. 삽입 또는 제거의 범위는 임의로 1 내지 5개의 아미노산이다. 서열 내의 아미노산을 체계적으로 삽입, 제거 또는 치환하고, 결과로 생긴 변형체를 하기 실시예에 기재된 생체외 분석법으로 활성을 시험하여 허용되는 변형체를 결정할 수 있다.
특별한 실시양태에서, 보존적 치환체는 바람직한 치환체라는 표제로 표 1에 제시된다. 그러한 치환체가 생물학적 활성을 변화시킨다면, 더 실질적인 치환체(표 1에서 예시적 치환체라 명명된 치환체) 또는 하기에 추가로 기재되는 아미노산에 대한 참고자료를 도입하여 생성물을 스크린할 수 있다.
PRO 폴리펩티드의 기능 및 면역학적 동일성에 대한 실질적인 변형은 (a) 치환 범위 내에서 폴리펩티드 골격의 구조(예를 들면, 쉬이트형 또는 나선형 배좌), (b) 목표 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 곁사슬의 크기를 유지시키는 효과가 현저히 다른 치환체를 선택하여 수행한다. 자연 발생 잔기는 통상의 곁사슬 특성에 근거하여 군으로 분류된다.
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile,
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr,
(3) 산성: asp, glu,
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg,
(5) 사슬의 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비보존적 치환체는 한 부류의 아미노산을 다른 부류의 아미노산으로 치환하여 얻을 수 있다. 또한, 상기 치환되는 잔기는 보존적 치환부위 또는 바람직하게 나머지(비보존적) 부위에 도입될 수 있다.
변형체는 올리고뉴클레오티드-매개의(부위 특이적) 돌연변이화, 알라닌 스캐닝(alanine scanning) 및 PCR 돌연변이화와 같은 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 만들 수 있다. 부위 특이적 돌연변이화([카터(Carter) 등,Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986)] 및 [졸러(Zoller) 등,Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이화([웰스 (Wells) 등,Gene,34:315 (1985)]), 제한 선택 돌연변이화([웰스(Wells) 등,Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)]) 또는 다른 공지된 기술이 원하는 PRO 폴리펩티드 변형체 DNA의 제조를 위해 클론 DNA에 사용될 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석(scanning amino acid analysis)도 인접하는 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인하는데 사용할 수 있다. 스캐닝 분석시 아미노산은 상대적으로 작은 중성 아미노산이 바람직하다. 그러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 상기 군에서 통상 알라닌이 스캐닝 분석에 바람직한 아미노산인데, 그 이유는 알라닌이 베타-탄소를 벗어나는 곁사슬을 제거하고 변형체의 주사슬 배좌를 변경시키기 않기 때문이다. 또한, 알라닌은 가장 흔한 아미노산이므로 바람직하다. 추가로, 알라닌은 단백질 구조 내부 및 노출부 모두에서 발견된다([크레이톤(Creighton),The Proteins, (W.H. Freeman Co., N.Y.)] 및 [코티아(Chothia),J. Mol. Biol.,150:1(1976)]). 만약 알라닌 치환으로 적합한 양의 변형체를 수득하지 못하면 동형의 아미노산으로 치환할 수 있다.
17.PRO 폴리펩티드의 변화
PRO 폴리펩티드의 공유결합 변형체는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 공유결합 변화의 한 유형은 PRO 폴리펩티드의 목표 아미노산을, 선택된 곁사슬 또는 N- 또는 C-말단 잔기에 반응하는 유도화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능화제를 사용하여 유도화시키는 것은 PRO 폴리펩티드를 비수용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교시켜 항-PRO 폴리펩티드 항체를 정제하거나 반대 상태로 정제하는데 유용하다. 통상 사용되는 가교제는 1, 1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, 4-아지도살리실산을 포함한 에스테르와 같은 N-히드로옥시숙신이미드 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능화 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1 ,8-옥탄과 같은 이관능화 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 제제를 포함한다.
다른 변화에는, 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기를 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록시화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 곁사슬의 α-아미노기의 메틸화([티.이. 크레이톤(T.E. Creighton),Proteins: Structure and Molecular Properties, 샌프란시스코의 더블유. 에이치. 프리만 앤드 캄파니(W.H.Freeman Co.), pp. 79-86 (1983)]), N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화가 포함된다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 PRO 폴리펩티드 공유결합 변형체에 대한 다른 유형은 폴리펩티드 고유의 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. "고유의 글리코실화 패턴의 변화"란 PRO 폴리펩티드의 고유 서열에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 제거하고(거나) PRO 폴리펩티드의 고유 서열에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 가하고(거나) 글리코실화 부위에 부착된 당 잔기의 비율 및(또는) 조성을 변화시키는 것을 의미한다.
PRO 폴리펩티드의 서열에 글리코실화 부위를 가하는 것은 아미노산 서열을 변화시켜 수행할 수 있다. 상기 변화는 예를 들면, PRO 폴리펩티드의 고유 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기(O-결합 글리코실화 부위)를 가하거나 상기 잔기로 치환하여 만들수 있다. PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열은 임의로 DNA 수준, 특히 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 미리 선택된 염기에서 돌연변이(그 결과 코돈은 원하는 아미노산으로 번역됨)에 의해 변화될 수 있다.
PRO 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기 수를 증가시키는 다른 수단은 폴리펩티드에 글리코시드를 화학적 또는 효소적 방법으로 결합시키는 것이다. 상기 방법은 1987년 9월 11일에 출원된 WO 87/05330호 및 [아플린(Aplin) 및 린스톤(Wriston),CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
PRO 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 글리코실화되는 목표 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈의 화학적 치환, 효소적 치환 또는 돌연변이에 의한치환에 의해 수행될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [하키무딘(Hakimuddin) 등,Arch. Biochem. Biophvs.,259:52 (1987)] 및 [에지(Edge) 등,Anal. Biochem.,118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드의 탄수화물 잔기를 효소 분해하는 것은 문헌[토타쿠라(Thotakura) 등,Meth. Enzvmol.,138:350 (1987)]에 기재된 바와 같이 다양한 내부- 및 외부-글리코시다아제를 사용하여 성취될 수 있다.
본 발명의 PRO 폴리펩티드에 대한 다른 유형의 공유결합 변화는 PRO 폴리펩티드를 미국 특허 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 공개된 방법으로 하나 이상의 비단백질성 중합체(폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌)에 결합시키는 것을 포함한다.
본 발명의 PRO 폴리펩티드는 또한, 다른 이질성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 융합된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방법으로 변화될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 키메라 분자는 PRO 폴리펩티드를 태그(tag) 폴리펩티드(항-태그 항체가 선택적으로 결합하는 에피토프를 제공함)와 융합시키는 것을 포함한다. 에피토프 태그는 통상 PRO 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 위치한다. 상기 에피토프-태그된 형태의 PRO 폴리펩티드는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공으로 인하여 PRO 폴리펩티드는, 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 친화 매트릭스를 사용하여 쉽게 정제할 수 있다. 다른 실시양태에서, 키메라 분자는 면역글로불린 또는면역글로불린의 특정 영역과 융합된 PRO 폴리펩티드를 포함한다. 상기 키메라 분자의 항원 결정부를 2개로 만들기 위해, 상기 융합부는 IgG 분자의 Fc 부분일 수 있다.
다양한 태그 폴리펩티드 및 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘(폴리-히스) 또는 폴리-히스티딘-글리신(폴리-히스-글리) 태그, 인플루엔자의 HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5([필드(Field) 등,Mol. Cell. Biol.,8:2159-2165 (1988)]), c-myc 태그 및 그의 항체 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10([에반(Evan) 등,Molecular and Cellular Biology,5:3610-3616 (1985)]) 및 허피스 심플렉스(Herpes Simplex) 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 그의 항체([파보르스키(Paborsky) 등,Protein Engineering,2(6):547-553 (1990)])를 포함한다. 다른 태그 폴리펩티드로는 Flag-펩티드([호프(Hopp) 등,BioTechnology,6:1204-1210 (1988)]), KT3 에피토프 펩티드([마틴(Martin) 등,Science 255:192-194 (1992)]), α-튜불린 에피토프 펩티드([스키너(Skinner) 등,J. Biol. Chem.,266:15163-15166 (1991)]) 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그([루츠-프레이어무쓰(Lutz-Freyermuth) 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:6393-6397 (1990)])를 포함한다.
18.PRO 폴리펩티드의 제조
하기의 기재 내용은 원하는 PRO 폴리펩티드의 핵산이 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하여 PRO 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 물론 당업계에 잘 공지된 다른 방법도 PRO 폴리펩티드의 제조에 사용될 수 있다. 예를 들면, PRO 폴리펩티드 또는 그의 일부는 고체상 기술([스튜어트(Stewart) 등,Solid-Phase Peptide Synthesis, 캘리포니아주 샌프란시스코의 더블유. 에이치. 프리만(W.H. Freeman)사 (1969)] 및 [메리필드(Merrifield),J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)])을 이용한 직접적인 펩티드 합성으로 제조할 수 있다. 생체외 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템스 펩티드 신테사이저(Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(Foster City, CA)를 이용하여 제조자의 지시대로 자동화 합성을 수행할 수 있다. 원하는 PRO 폴리펩티드의 여러 부분이 분리되어 화학적으로 합성되고, 상기 부분을 화학적 또는 효소적 방법으로 결합시켜 전체 길이의 PRO 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
A.PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 단리
PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는, 원하는 PRO 폴리펩티드의 mRNA를 갖고 있고 검출가능한 정도로 발현시키고 있다고 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리에서 수득할 수 있다. 따라서, 인간의 PRO 폴리펩티드 DNA는 실시예에 기재되는 바와 같은 인간의 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리에서 쉽게 수득할 수 있다. PRO 폴리펩티드-암호화 유전자는 또한 게놈 라이브러리에서 수득하거나 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 수득할 수 있다.
연구 대상 유전자 또는 그에 의해 암호화된 단백질을 검출하기 위해 고안된 프로브(원하는 PRO 폴리펩티드에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 염기의 올리고뉴클레오티드)로 라이브러리를 스크린한다. 선택된 프로브로 cDNA 라이브러리 또는게놈 라이브러리를 스크린하는 것은 샘브루크(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 기술을 사용하여 수행한다. 원하는 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 단리하는 다른 방법은 PCR을 사용하는 것이다(샘브루크(Sambrook) 등의 상기 문헌 및 [디펜바크(Dieffenbach) 등,PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]).
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크린하는 기술에 대해 기재한다. 프로브로 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가짜 양성반응체가 최소화되도록 충분히 길고 명확해야 한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 스크린되는 라이브러리에서 혼성화에 의해 DNA를 검출할 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고,32P-표지 ATP의 사용, 바이오티닐화 및 효소 표지법을 포함한다. 적당한 엄격 조건 및 과도한 엄격 조건을 포함하는 혼성화 조건은 샘브루크(Sambrook) 등의 상기 문헌에 제공된다.
라이브러리 스크린 방법에서 확인된 서열은 기탁 및 대중에 공개된 진뱅크(GenBank)와 같은 데이타베이스 또는 다른 비공개 서열 데이타베이스의 서열과 비교 및 배열된다. 제한된 영역 또는 전체 길이의 서열 동일성(아미노산 또는 뉴클레오티드 수준)은, 상동성을 측정하기 위해 다양한 알고리즘을 사용하는 BLAST, ALIGN, DNAstar 및 INHERIT와 같은 컴퓨터 소프트웨어 프로그램으로 배열하여 결정한다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 본 명세서에 최초로 개시되는 추론된 아미노산 서열을 사용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크린으로 수득될수 있고, 필요한 경우 cDNA로 역전사되지 않았을 전구체 및 mRNA의 가공 중간체를 검출하기 위해 상기의 샘브루크(Sambrook) 등의 문헌에 기재된 종래의 프라이머 신장 방법(primer extension procedure)을 이용하여 수득할 수 있다.
B.숙주세포의 선정 및 형질전환
PRO 폴리펩티드의 생산을 위해 숙주세포를 본 명세서에 기재되는 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시킨 후, 프로모터, 형질전환체의 선택 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자의 증폭에 적합하게 변형된 종래의 영양 배지에서 숙주세포를 배양하였다. 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 별다른 작업없이 당업계 숙련자가 선택할 수 있다. 통상, 세포 배양의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 실험 방법 및 실체 기술은 문헌[Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, 엠. 버틀러(M. Butler), ed. (IRL Press, 1991)] 및 샘브루크(Sambrook) 등의 상기 문헌에서 찾을 수 있다.
형질감염 방법은 CaPO4및 일렉트로포레이션(elelctroporation)과 같이 당업계 숙련자에게 통상 공지되어 있다. 사용되는 숙주세포에 따라, 그 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 형질전환시킨다. 상기 샘브루크(Sambrook) 등의 문헌에 기재된 염화칼슘을 사용하는 칼슘처리 또는 일렉트로포레이션은 통상 원핵생물 또는 실질적인 세포벽을 함유하는 다른 세포에 사용된다. 특정 식물 세포에는 아크로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 감염시켜 형질전환시킨다 ([쇼(Shaw) 등,Gene,23:315 (1983)] 및 1989년 6월 29일 출원된 WO 89/05859호). 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 인산칼슘 침전법([그라암(Graham) 및 반 데르 에브(van der Eb),Virology,52:456-457 (1978)])을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템에 대해서는 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모에 형질전환하는 것은 문헌[반 솔링겐(Van Solingen) 등,J. Bact.,130:946 (1977)] 및 [시아오(Hsiao) 등,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),76:3829 (1979)]의 방법을 따라 수행한다. 그러나, 핵 미세주입, 일렉트로포레이션, 정상 세포에 박테리아 원형질체 융합 또는 폴리케타이온(폴리브렌, 폴리오르니틴)과 같이 세포에 DNA를 도입시키는 다른 방법도 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환시키는 다양한 방법은 문헌[권(Keown) 등,Methods in Enzvmology,185:527-537 (1990)] 및 [만서(Mansour) 등,Nature,336:348-352 (1988)]을 참조할 수 있다.
본 명세서의 DNA를 벡터에 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주세포에는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵생물은 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아(예를 들면, 대장균(E. coli)과 같은 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae))와 같은 진균류를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.E. coliK12 균주 MM294(ATCC 31,446호),E. coliX1776(ATCC 31,537호),E. coli균주 W3110(ATCC 27,325호) 및 K5 772(ATCC 53,635호)와 같은 다양한 대장균 균주가 공개적으로 입수가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주세포는 에스케리치아 (Escherichia)(예를 들면, 대장균), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브실라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella)(예를 들면, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)), 세라티아(Serratia)(예를 들면, 세라티아 마르세산스(Serratia marcescans), 및 쉬겔라(Shigella)와 같은 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 뿐만 아니라 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포미스(B. licheniformis)(예를 들면, 1989년 4월 12일 출원된 DD 266,710호에 개시된 비. 리케니포미스(B. licheniformis) 41P)와 같은 바실라이(Bacilli), 피. 아레루기노사(P. aeruginosa)와 같은 슈도모나스 (Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다.E. coliK12 균주 MM294(ATCC 31,446호),E. coliX1776(ATCC 31,537호),E. coli균주 W3110(ATCC 27,325호) 및 K5 772(ATCC 53,635호)와 같은 다양한 E. coli 균주가 공개적으로 입수가능하다. 상기의 예는 발명을 제한하려는 것이 아니라 예시적인 것이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물의 발효용으로 흔히 사용하는 특히 바람직한 숙주 또는 어버이 숙주(parent host)이다. 바람직하게는 숙주세포가 단백질 분해성 효소를 최소로 분비한다. 예를 들면, 균주 W3110은 숙주세포 내의 단백질을 암호화하는 유전자를 유전적으로 돌연변이시켜E. coliW3110 균주 1A2(완전한tonA유전자형을 갖음),E. coliW3110 균주 9E4(완전한tonA ptr3유전자형을 갖음),E. coliW3110 균주 27C7(ATCC 55,244호)(완전한tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompTkan r 유전자형을 갖음),E. coliW3110 균주 37D6(완전한tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP onpT rbs7 ilvG kan r 유전자형을 갖음),E. coliW3110 균주 40B4(카나마이신(kanamycin) 저항성이 없는 degP 결실 돌연변이인 균주 37D6) 및 1990년 8월 7일 출원된 미국 특허 제 4,946,783호에 개시된 세포질 주변의 단백질 분해효소 돌연변이를 갖는E. coli균주와 같은 숙주세포로 변화시킬 수 있다. 다른 방법으로, PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응과 같은 클로닝의 생체외 방법이 적합하다.
원핵생물 뿐만 아니라, 섬유상 곰팡이 또는 효모와 같은 진핵 세균도 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 벡터의 클로닝에 적합하다. 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)는 통상 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 숙주세포로 쉬조사카로마이세스 프로베(Schizosaccharomyces pombe)([비치(Beach) 및 널스(Nurse),Nature,290: 140 (1981)] 및 1985년 5월 2일 출원된 EP 139,383호), 케이. 락티스(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574, [루벤코드(Louvencourt) 등,J. Bacteriol., 737 (1983)]), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424호), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045호), 케이. 위커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178호), 케이 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500호), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906호, [반 덴 베르그 등,Bio/Technology,8:135 (1990)]), 케이. 써모톨러란스(K. thermotolerans) 및 케이 막시아누스(K. marxianus)와 같은 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주(미국 특허 제4,943,529호 및 [플리어(Fleer) 등,Bio/Technology,9: 968-975 (1991)]), 야로위아(yarrowia)(EP 402,226호), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070호 및 [스리크리슈나(Sreekrishna) 등,J. Basic Microbiol.,28: 265-278 (1988)]),캔디다(Candida), 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234호), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)([케이스(Case) 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5259-5263 (1979)]), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)(1990년 10월 31일 출원된 EP 394,538호)와 같은 슈완니오마이세스 (Schwanniomyces), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(1991년 1월 10일 출원된 WO 91/00357호)와 같은 섬유상 곰팡이 및 에이. 니둘란스(A. nidulans)([밸런스(Ballance) 등,Biochem. Biophys. Res. Commun.,112: 284-289 (1983)], [틸번(Tilburn) 등,Gene,26: 205-221 (1983)] 및 [엘톤(Yelton) 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81: 1470-1474 (1984)]) 및 에이. 니거(A. niger)([켈리(Kelly) 및 하이네스(Hynes),EMBO J. 4: 475-479 (1985)])와 같은 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주가 포함된다. 메틸영양성 효모는 본 명세서에서 사용하는 숙주로서 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 캔디다(Candida), 클로에케라(Kloeckera), 피키아(Pichia), 사카로마이세스 (Sccharomyces), 투룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula) 속으로부터 선택된, 메탄올에서 생장할 수 있는 효모를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 부류의 예시적 효모로서 특이적인 종의 목록은 씨. 안토니(C. Anthony)의 문헌[The biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 알아볼 수 있다.
글리코실화 PRO 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주세포는 다세포 유기체에서 유래한 것이다. 무척추 세포의 예로는 초파리 S2(Drosophila S2) 및 스포도프테라 Sf9(Spodoptera Sf9) 뿐만 아니라 식물세포도 포함된다. 유용한 포유동물 세포주에는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 및 COS 세포가 포함된다. 더 특이적인 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배의 신장 세포주(293 세포 또는 현탁배양되도록 클론화된 293 세포, [그라암(Graham) 등,J. Gen. Virol.,36: 59(1977)]), 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, [울라웁(Urlaub) 및 차신(Chasin),Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77: 4216 (1980)]), 생쥐의 세르톨리 세포(TM4, [마더(Mather),Biol. Reprod.,23: 243-251 (1980)]), 인간의 폐 세포(W138, ATCC CCL75호), 인간의 간 세포(HepG2, HB 8065) 및 생쥐의 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51호)이 포함된다. 적합한 숙주세포는 당업계의 기술범위 내에 선택된다.
C.복제가능한 벡터의 선택 및 용도
원하는 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝(DNA의 증폭) 및 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 입수가능하다. 예를 들면, 상기 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파아지(phage)의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법으로 벡터에 삽입할 수 있다. 통상, DNA는 적합한 제한효소 부위에 당업계에 공지된 기술을 사용하여 삽입한다. 벡터의 구성요소는 통상 하나 이상의 신호 서열, 복제 개시점, 하나 이상의 마커(marker) 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종료 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 하나 이상의 상기 요소를 포함하는 적합한 벡터는 당업계에 공지된 표준 라이게이션 기술(standard ligation technique)을 사용하여 구성한다.
관심있는 PRO 폴리펩티드는 재조합에 의해 직접 제조하거나, 또는 신호 서열이거나 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위가 있는 다른 폴리펩티드인 이질성 폴리펩티드와 융합된 상태로 제조할 수 있다. 통상, 신호 서열은 벡터의 구성요소이거나, 또는 벡터에 삽입되는 PRO 폴리펩티드 DNA의 일부분일 수 있다. 신호 서열은 알칼라인 인산화효소, 페니실리나아제, lpp 또는 열-안정 내독소 Ⅱ 리더(leader)로부터 선택되는 원핵생물의 신호서열일 수 있다. 효모에서 분비를 위한 신호 서열은 효모 인버타아제, 알파 인자 리더(사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자를 포함, 후자는 미국 특허 제5,010,182호에 기재됨) 또는 산 인산화효소 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans)의 글루코아밀라아제 리더(1990년 4월 4일 출원된 EP 362,179호) 또는 1990년 11월 15일 출원된 WO 90/13646호에 기재된 신호일 수 있다. 포유동물 세포의 발현에서 포유동물의 신호 서열은, 같은 종 또는 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터 유래한 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스의 분비 리더와 같이 단백질의 직접적인 분비를 목적으로 사용할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터는, 벡터가 1종 이상의 숙주세포에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. pBR322의 복제 개시점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ플라스미드 개시점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스(SV40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)의 개시점은 포유동물 세포의 클로닝 벡터에 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상 선택 유전자(선택 마커라고도 불리움)를 포함한다. 선택 유전자는 통상 (a) 앰피실린(ampicillin), 네오마이신(neomycin), 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 테트라싸이클린(tetracycline)과 같은 항생물질 또는 다른 독성물질에 저항성을 주고, (b) 영양요구성 결핍을 보완하며, (c) 복합 배지로부터 얻을 수 없는 필수 영양소를 공급(예를 들면, 바실라이(Bacilli)에서 D-알라닌 라세마아제(racemase)를 암호화하는 유전자)하는 단백질을 암호화한다.
포유동물 세포에 적합한 선택 마커는 PRO 폴리펩티드의 핵산을 잘 흡입하는 세포를 동정할 수 있게하는 DHFR 또는 티미딘 키나아제와 같은 것이다. 야생형 DHFR이 사용될 경우 적합한 숙주세포는 문헌[울라웁(Urlaub) 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,27:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된, DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이다. 효모에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는trp1유전자([스티노크콤(Stinchcomb) 등,Nature 282:39 (1979)], [킹스만(Kingsman) 등,Gene,2:141(1979)] 및 [쳄퍼(Tschemper) 등,Gene,10:157 (1980)])이다.trp1유전자는 트립토판이 결여된 배지에서 자라지 못하는 돌연변이체 균주(예를 들면, ATCC 44076호 또는 PEP4-1 [존스(Jones),Genetics,85:12(1997)])에 대한 선택 마커이다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상 PRO 폴리펩티드 핵산 서열과 작동적으로 연결되어 mRNA를 합성하는 프로모터를 포함한다. 다양한 잠재적 숙주세포에 인지되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기 적합한 프로모터에는 락토오스 프로모터 시스템([창(Chang) 등,Nature 275:615 (1978)] 및 [괴델(Goeddel)등,Nature,281:544 (1979)]), 알칼라인 인산화효소, 트립토판(trp) 프로모터 시스템([괴델(Goeddel),Nucleic Acids Res.,8:4057 (1980)] 및 EP 36,776호) 및 tac 프로모터와 같은 혼성 프로모터([드보어(deBoer) 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)])가 포함된다. 박테리아 시스템에 사용되는 프로모터도 또한 원하는 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA와 작동적으로 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno, S.D.) 서열을 포함한다.
효모 숙주에 사용되는 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나아제([히츠만(Hitzeman) 등,J. Biol. Chem.,255:2073 (1980)]) 또는 에놀라아제, 3-인산-글리세르알데히드 탈수소효소, 헥소키나아제, 피루브산 탈탄산효소, 포스포프럭토키나아제, 6-인산-포도당 이성질화효소, 3-인산 글리세레이트 돌연변이화효소, 피루브산 키나아제, 트리오스인산 이성질화효소 및 글루코키나아제와 같은 다른 해당효소([헤스(Hess) 등,J. Adv. Enzvme Reg.,7:149 (1968)] 및 [홀란드(Holland),Biochemistry,17:4900 (1978)])가 포함된다.
생장 조건에 의해 전사가 조절되는 부가의 장점을 갖는 유도 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 탈수소효소 2, 이소시토크롬 C, 산 인산염, 질소 동화와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 3-인산-글리세르알데히드 탈수소효소 및 말토오스 및 갈락토오스 이용 효소의 프로모터 영역이다. 효모에서의 발현에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 73,657호에 기재되어 있다.
포유동물 숙주세포에서 PRO 폴리펩티드의 전사는, 폴리오마(polyoma) 바이러스, 포울폭스(fowlpox) 바이러스(1989년 7월 5일 출원된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스(adenovirus)(예를 들면, 아데노바이러스 2), 소의 파필로마(papilloma) 바이러스, 조류의 사코마(sarcoma) 바이러스, 싸이토메갈로바이러스(cytomegalo virus), 레트로바이러스(retrovirus), B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득한 프로모터, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터(상기 프로모터가 숙주세포 시스템과 양립한다는 조건하임)에 의해 조절된다.
고등 진핵생물에 의한, 원하는 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사는 벡터에 인핸서 서열을 삽입하여 증가시킬 수 있다. 인핸서는 DNA의 cis-활성 요소이고, 통상 10 내지 300bp로 프로모터에 의한 전사를 증가시키는 기능을 한다. 포유동물 유전자로부터 유래된 인핸서 서열(글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-페토프로틴 및 인슐린)이 많이 공지되지는 않았다. 그러나 통상, 진핵 세포 바이러스에서 유래된 인핸서를 사용한다. 예들 들면, 복제 개시점 뒤쪽의 SV40 인핸서(100 내지 270bp), 싸이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 초기 프로모터 인핸서, 복제 개시점 뒤쪽의 폴리오마(polyoma) 인핸서 및 아데노바이러스(adenovirus) 인핸서를 포함한다. 인핸서는 PRO 폴리펩티드에 대해 벡터의 5' 또는 3'에 위치할 수 있지만, 프로모터의 5'에 위치하는 것이 바람직하다.
진핵 숙주세포(효모, 곰팡이, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체에서 유래한 핵이 있는 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종료 및 mRNA의 안정화를 위한 서열을 포함한다. 상기 서열은 진핵세포 또는 바이러스의 DNA 또는 cDNA의 통상 5', 가끔은 3'의 번역되지 않는 영역에 존재한다. 상기 영역은 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA의 번역되지 않는 부분에서 폴리아데닐화 절편으로 전사되는 단편을 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO 폴리펩티드의 합성에 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주세포는 [게팅(Gething) 등,Nature 293:620-625 (1981)], [만테이(Mantei) 등,Nature,281:40-46 (1979)] 및 EP 117,060호 및 EP 117,058호에 기재되어 있다.
D.유전자 증폭 및 발현의 검출
유전자의 증폭 및(또는) 발현은 본 명세서에 제공된 서열을 근거로하는 적합하게 표지된 프로브를 사용하여, 종래의 써던 블라팅(Southern blotting), mRNA의 전사를 정량화시키기 위한 노던 블라팅(Northern blotting)([토마스(Thomas),Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)]), 점 블라팅(dot blotting)(DNA 분석) 또는 원래 위치에서의 혼성화 방법으로 직접적으로 간단히 측정하였다. 다른 방법으로, DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 혼성 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하는 이중체를 특이적으로 인식하는 항체를 사용할 수 있다. 다시 말하면, 항체를 표지하고 이중체가 표면에 결합하는 부위에서 분석을 수행하여, 표면에서 이중체가 형성되면 이중체에 결합된 항체를 검출할 수 있다.
다른 방법으로, 유전자 발현은 유전자의 발현 산물을 직접 정량화하는, 세포 또는 조직부의 면역조직화학적(immunohistochemical) 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 분석과 같은 면역학적 방법으로 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료액의 분석에 유용한 항체는 모노클론 항체 또는 폴리클론 항체일 수 있고,임의의 포유동물로부터 제조될 수 있다. 통상 고유 서열의 PRO 폴리펩티드에 대한 항체, 본 명세서에서 제공되는 DNA 서열에 근거한 합성 펩티드에 대한 항체 또는 PRO 폴리펩티드 DNA에 융합되어 특이적인 항체 에피토프를 암호화하는 외래성 서열에 대한 항체가 제조된다.
E.폴리펩티드의 정제
폴리펩티드의 형태는 배양시킨 배지 또는 숙주세포 용해액으로부터 회수될 수 있다. 세포막에 결합되어 있는 폴리펩티드는 적합한 세제 용액(예를 들면, Triton-X 100) 또는 효소에 의한 절단으로 막에서 떼어놓을 수 있다. PRO 폴리펩티드의 발현에 사용된 세포는 냉동-해동의 주기적 순환, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄될 수 있다.
PRO 폴리펩티드를 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 정제하는 단계가 필요하다. 이온-교환 컬럼으로 분별 분리, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환수지상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 세파덱스(Sephadex) G-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물 제거를 위한 단백질 A 세파로오스(Sepharose) 컬럼 및 에피토프-태그된 PRO 폴리펩티드를 결합시키는 금속 킬레이트화 컬럼의 사용은 적합한 정제 과정의 예이다. 단백질 정제의 다양한 방법을 사용할 수 있고, 상기 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌[도이쳐(Deutscher),Methods in Enzvmology,182(1990)] 및 [스코프스(Scopes),Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, 뉴욕 (1982)]에 기재되어 있다. 정제단계는 사용되는 제조 방법의 특성 및 제조될 PRO 폴리펩티드의 특성에 의해 선택한다.
19.PRO 폴리펩티드의 용도
본 발명의 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(또는 그의 상보적 서열)은 혼성화 프로브로 사용, 염색체 및 유전자 지도 작성 및 안티센스(antisense) RNA 및 DNA의 생성을 포함하여, 분자생물학계에서 다양하게 사용될 수 있다. PRO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 또한 본 명세서에 기재되는 재조합 기술에 의한 PRO 폴리펩티드의 제조에 유용할 것이다.
전체 길이의 PRO 폴리펩티드 고유 서열을 암호화하는 핵산 및 그의 일부분은 전체 길이의 PRO 폴리펩티드 유전자의 단리 또는 PRO 폴리펩티드 핵산 서열에 원하는 서열 동일성을 갖는 또다른 유전자(예를 들면, 자연 발생적인 PRO 폴리펩티드의 변형체 또는 다른 종에서 유래한 PRO 폴리펩티드)의 단리를 위한 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 임의로, 프로브의 길이는 약 20 내지 50 염기이다. 혼성화 프로브는 본 명세서에 개시된 임의의 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 고유의 PRO 폴리펩티드 DNA의 프로모터, 인핸서 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 스크린 방법은 약 40염기의 선택된 프로브의 합성을 위해 공지된 DNA서열을 사용하여 PRO 폴리펩티드의 암호화 영역을 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 혼성화 프로브는32P 또는35S와 같은 방사성동위원소 표지, 아비딘 및 바이오틴 결합 시스템을 통해 프로브와 결합된 알칼라인 인산화효소와 같은효소 표지를 포함하는 다양한 방법에 의해 표지될 수 있다. 어떤 라이브러리에 프로브가 혼성화되는지 결정하기 위해 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA 라이브러리를 스크린하는데 본 발명의 PRO 폴리펩티드 유전자에 특이적인 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브를 사용할 수 있다. 혼성화 기술은 하기의 실시예에 더 상세하게 기재된다.
본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 본 출원에 개시된 EST를 프로브로 사용할 수 있다.
상기 프로브는 PRO 폴리펩티드 서열과 밀접하게 관련된 서열을 동정하기 위한 서열의 풀(pool)을 생성하기 위한 PCR 기술에서 프로브로 사용할 수 있다.
PRO 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 또한 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 지도 작성 및 유전적으로 무질서한 개체의 유전 분석을 위한 혼성화 프로브로 사용할 수도 있다. 본 명세서에 제공되는 뉴클레오티드 서열로 원래 위치에서의 혼성화, 공지된 염색체 마커에 대한 연관 분석 및 라이브러리의 혼성화 스크린과 같은 공지된 방법을 사용하여 염색체 및 염색체의 특이적 영역의 지도를 작성할 수 있다.
PRO 폴리펩티드의 코딩 서열이 다른 단백질에 결합하는 단백질을 암호화하는 경우, PRO 폴리펩티드는 그의 리간드를 찾는 분석에 사용할 수 있다. 유사하게, 수용체 및 리간드 결합 상호작용에 대한 억제제를 동정할 수 있다. 상기의 결합 상호작용에 관계된 단백질은 또한 그 상호작용에 대한 펩티드 억제제, 작은 분자의 억제제 또는 효능제를 스크린하는데 사용할 수 있다. 스크리닝 분석법은 PRO 폴리펩티드 고유의 생물학적 활성 또는 PRO 폴리펩티드에 대한 리간드를 모방하는 선도 화합물을 찾도록 고안할 수 있다. 상기 스크리닝 분석법은 고효율로 화합물 라이브러리를 스크린하는 분석을 포함하여 작은 분자의 약물 후보자를 찾아내는데 적합할 것이다. 작은 분자에는 합성 유기 화합물 또는 합성 무기 화합물이 포함된다. 상기 분석법은 당업계에 잘 알려진 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역 분석 및 세포 기재의 분석을 포함하는 다양한 형식으로 수행할 수 있다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 변형된 형태를 암호화하는 핵산은 유전자 이식 동물 또는 "녹아웃(knock out)" 동물의 생성에 사용, 즉 치료상 유용한 제제의 개발 및 스크리닝에 사용할 수 있다. 유전자 이식 동물(예: 생쥐 또는 쥐)은 이식 유전자를 함유하는 세포를 갖는 동물로서, 상기 이식 유전자는 동물 또는 그 동물의 어버이 세대 조상(예: 배(embryo) 시기)에 도입시킨다. 이식 유전자는 세포의 게놈에 삽입된 DNA로 유전자 이식 동물의 발생에 영향을 끼친다. 한 실시양태에서, PRO 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 공지된 기술로 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 게놈 DNA의 클로닝에 사용하고, PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 발현시키는 세포가 함유된 유전자 이식 동물을 생성하는데 상기 게놈 서열을 사용할 수 있다. 유전자 이식 동물(특히, 생쥐 또는 쥐)의 생성 방법은 당업계에서 흔히 사용하는 기술이고, 미국 특허 제4,736,866호 및 제4,870,009호에 기재되어 있다. 통상, 특별한 세포가 조직-특이적 인핸서와 함께 PRO 폴리펩티드 이식 유전자 삽입의 목표가 된다. 배(embryo) 단계에서 생식세포에 도입된 PRO 폴리펩티드를 암호화하는이식 유전자를 포함하는 유전자 이식 동물은 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 증가된 발현효과를 관찰하는데 사용할 수 있다. 상기 동물은 상기 유전자의 과다 발현과 관계된 병리적 상태로부터 보호할 수 있는 제제에 대한 시험 동물로 사용할 수 있다. 본 발명의 한 면에서, 동물에 어떤 제제를 처리했을 때, 이식 유전자를 가지고 있으면서 제제를 처리하지 않은 동물에 비해 병리적 상태가 감소하면, 상기 제제는 병리적 상태를 조절하는 잠재적 치료제임을 알 수 있다.
다른 방법으로, 인간이외의 생물에서 유래한 PRO 폴리펩티드 유사체를 사용하여, PRO 폴리펩티드를 암호화하는 내부의 유전자와 동물의 배(embryo) 세포에 도입된 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 변화된 게놈 DNA 사이의 동형 재조합의 결과로 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 유전자가 불완전하거나 변화된 PRO 폴리펩티드 "녹아웃" 동물을 만들 수 있다. 예를 들면, PRO 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA는 공지된 기술을 사용하여 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. PRO 폴리펩티드를 암호화하는 게놈 DNA의 일부를 삭제하거나, 또는 삽입된 상태를 모니터하기 위해 사용되는 선택 마커를 암호화하는 유전자와 같은 다른 유전자로 대체할 수 있다. 통상, 수 kb의 변화되지 않은 DNA(5' 및 3' 말단 모두)가 벡터에 포함된다([토마스(Thomas) 및 카페치(Capecchi),Cell,51:503 (1987)]의 동형 재조합 벡터에 대한 기술 참조). 벡터는 배의 간세포에 도입(예를 들면 일렉트로포레이션에 의해)되고, 도입된 DNA가 내부 DNA와 동형 재조합된 세포를 선택한다([리(Li) 등,Cell,69:915 (1992)]). 선택된 세포는 동물(예: 생쥐 또는 쥐)의 배반포에 주입하여 집합체 키메라를 형성한다([브래들리(Bradley),Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987)]의 pp.113-152 참조). 적합한 가임신 암컷 양모(foster)에 키메라 배를 이식하면 그 배는 "녹아웃" 동물이라 불리우게 된다. 생식세포에 동형 재조합 DNA를 품고있는 자손은 표준 기술로 동정하여 모든 세포가 동형 재조합 DNA인 동물을 사육하는데 사용할 수 있다. 녹아웃 동물은 특정 병리 상태로부터 방어하는 능력 및 PRO 폴리펩티드의 부재로 인한 병리 상태의 진전과 같은 특성화에 사용할 수 있다.
PRO 폴리펩티드를 생체내에 투여하였을 때, 정상 투여량은 하루에 포유 동물 체중 kg 당 약 10ng 내지 100mg으로 다양하고, 투여 경로에 따라 약 1㎍/kg/일 내지 10mg/kg/일이 바람직하다. 특별한 투여량 및 전달 방법에 대한 안내는 미국 특허 제4,657,760호, 제5,206,344호 또는 5,225,212호에서 제공한다. 상이한 치료 화합물 및 상이한 질병에는 상이한 제형이 유효하리라 예상되고, 어느 기관 또는 조직이 목표인 투여는 다른 기관 또는 조직에 투여하는 것과는 상이한 전달 방법이 필요하리라 예상된다.
PRO 폴리펩티드의 투여를 요하는 질병 또는 장애의 치료에서 PRO 폴리펩티드가 지속적으로 방출되는 투여가 요구될 경우, PRO 폴리펩티드의 미세캡슐화를 생각할 수 있다. 재조합 단백질의 미세캡슐화에 의한 지속 방출은 인간 성장 호르몬(rhGH), 인터페론-(rhIFN-), 인터루킨-2 및 MN rgpl20에서 성공적으로 수행되어 왔다. 문헌 [존슨(Johnson) 등,Nat. Med.,2: 795-799 (1996) 및Yasuda. Biomed. Ther.,27:1221- 1223 (1993)], [호라(Hora) 등,Bio/Technoloy. 8: 755-758 (1990)], [클레란드(Cleland), "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems,"Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995)]의 pp. 439-462, WO 97/03692호, WO 96/40072호, WO 96/07399호 및 미국 특허 제5,654,010호를 참조할 수 있다.
단백질의 지속 방출 제형은 생체적합성 및 다양한 범위의 생물 분해 특성때문에 폴리-락틱-코글리콜 산(PLGA) 중합체를 사용하여 개발하였다. PLGA의 분해 산물인 젖산 및 글리콜산은 인체 내에서 빠르게 제거될 수 있다. 게다가, 상기 중합체의 분해능은 분자량 및 조성에 따라 수 개월 내지 수 년으로 조절될 수 있다. 문헌[루이스(Lewis), "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker: New York, 1990)]의 1-41 페이지를 참조할 수 있다.
예를 들면, 최대 체중 85kg의 포유동물에 약 80㎍/kg/일의 투여량을 제공하는 제형에서, PRO 폴리펩티드의 최대 투여량은 하루에 약 6.8mg이다. 상기 투여 수준을 달성하기 위해, 가능한 최대의 단백질 함량 및 최소의 초기 방출(<20%)을 포함하는 지속-방출 제형이 필요하다. 미세입자에서 1 내지 2주 동안 PRO 폴리펩티드가 연속(제로-오더(zero-order)) 방출되는 것도 바람직하다. 부가로, 방출될 캡슐화 단백질은 방출되는 기간 동안 상태 보전 및 안정을 유지해야 한다.
내부의 비글리칸 단백질과 관련된 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 PRO241폴리펩티드는 치료목적의 생체내 및 생체외에서 사용할 수 있다. 당업계 통상의 기술을 이용하여 본 발명의 PRO241 폴리펩티드를 상기 목적에 사용할 수 있다.
코딘은 독특한 안면 생김새(낮은 전방 헤어라인, 미모밀생, 비강 기형, 상악돌출증, 긴 인중, '잉어'입), 태아기 및 출생후 성장 지체, 정신 지체 및 항상 그렇지는 않지만 가끔 상지의 기형으로 특성화되는 코르넬리아 드 랑즈 증후군(Cornelia de Lange Syndrome)(CDL)으로 공지된 형태장애 증후군에 대한 후보 유전자이다. 또한, CDL이 혈소판 감소증과 연합하여 나타나는 드문 경우도 있다. CDL 유전자는 3q26.3(OMIM #122470)에 위치하는 것으로 지도가 작성되었다. 제노푸스(Xenopus)의 초기 패턴형성 및 신경계 발생에 Xchd가 연관되어 있다는 사실로 인해 CHD는 흥미있는 후보 유전자가 되었다. CHD는 염색체 3번의 적합한 영역에 지도가 작성된다. 이는 THPO와 매우 근접해 있고, THPO 및 CHD를 제거하면 드물게 혈소판 감소증 및 발생상 기형을 유발한다. 원래 위치에서의 CD 분석 결과, 대부분의 성인 조직은 CHD가 발현되지 않고, 대퇴 두부와 관골구(둔부 관절) 사이에 나타나는 발생중인 활액관절의 분열선에서만 발현되는 것으로 보아 발생 및 긴 뼈의 성장에 CHD의 기능을 관련시킬 수 있다. 상기 기능이 붕괴되면 성장 지체를 초래할 수 있다.
cDNA에서 예측한 인간의 CHD 아미노산 서열은 Xchd와 50% 상동성(및 66% 보존성)이 있다. 4개의 시스테인이 풍부한 도메인에 있는 40개의 모든 시스테인이 보존적이다. 상기 시스테인이 풍부한 도메인은 트롬보스폰딘(thrombospondin), 프로콜라겐(procollagen) 및 윌브랜드 인자(von Willebrand factor)에서 발견되는 것과 유사하다([본스타인 피.(Bornstein, P.),FASEB J 6: 3290-3299 (1992)] 및 [헌트 엘.(Hunt, L.) 및 베이커 더블유(Barker, W.),Biochem. Biophys. Res. Commun. 144: 876-882 (1987)] 참조).
인간 CHD의 유전자좌(게놈의 PRO243)는 9.6kb의 게놈 DNA 내에 23개의 엑손을 포함한다. 개시 메티오닌은 1번 엑손에 있고 종료 코돈은 23번 엑손에 있다. CpG 도는 유전자의 5'에 위치하고, 1번 엑손 5'의 약 100bp 위치에서 시작하여 첫번째 엑손을 통해 연장되다가 첫번째 인트론에서 종료된다. THPO 및 CHD 유전자좌는 전사 개시 부위가 약 2.2kb 떨어진 상태로 머리와 머리가 마주보는 형태로 구성된다. 단백질 수준에서, PRO243은 제노푸스의 코딘(Xchd)과 51% 동일하다. 아미노 말단에 1개 및 카르복시 말단에 3개인 시스테인이 풍부한 단편에 존재하는 40개의 모든 시스테인은 보존적이다.
PRO243은 잔기 1-23에 신호 서열을 갖는 954 아미노산의 폴리펩티드이다. PRO243에는 4개의 시스테인 단편이 있는데, (1) 대략 잔기 51-125, (2) 대략 잔기 705-761, (3) 대략 잔기 784-849 및 (4) 대략 잔기 897-931에 위치한다. 대략 잔기 315-396에 잠재적 류신 지퍼(leucine zipper)가 있고, 대략 잔기 217, 351 및 434에 N-글리코실화 부위가 있다.
노치 단백질과 상동성이 있는 PRO299 폴리펩티드 및 그의 부분은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 다른 다양한 적용에 유용할 수 있다. 노치 단백질 및 그와 관련된 분자의 동정은 발생에 영향을 끼치는 것과 같은 많은 인간 질병과 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 신규 노치 단백질 및 그와 유사한 분자의 동정은, 상기 단백질이 다양한 인간 질병의 잠재적 치료제가 될 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생명공학 및 의학연구 뿐만 아니라 산업상의 다양한 적용에서 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO299와 같은 새로운 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
하나 이상의 내부 디펩티다아제와 관련된 생물학적 활성이 있는 본 발명의 PRO323 폴리펩티드는 치료목적의 생체내 및 생체외에서 사용할 수 있다. 당업계 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 PRO323 폴리펩티드를 상기 목적으로 사용할 수 있다.
내부 프로락틴 수용체 단백질과 관련된 생물학적 활성이 있는 본 발명의 PRO327 폴리펩티드는 치료목적의 생체내 및 생체외에서 사용할 수 있다. 당업계 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 PRO327 폴리펩티드를 상기 목적으로 사용할 수 있다. 프로락틴에 결합할 수 있는 PRO327 폴리펩티드는 프로락틴 길항제로서 생체외 및 생체내에서 기능할 수 있다.
환원효소와 상동성이 있는 PRO233 폴리펩티드 및 그의 부분은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 다른 다양한 적용에 유용할 수 있다. 신규 환원효소 단백질 및 그와 관련된 분자의 동정은 염증 질환, 기관의 기능 부전, 아테롬성 동맥경화증, 심장 손상, 불임, 출생 결함, 초기 노화, AIDS, 암, 당뇨 합병증 및 통상의 돌연변이와 같은 많은 인간 질병과 관련되어 있을 수 있다. 산소 유리 라디칼 및 산화방지제가 많은 질병의 진행에 중요한 역할을 한다는 관점에서 신규 환원효소 단백질 및 그와 유사한 분자의 동정은, 상기 단백질이 다양한 인간 질병의 잠재적 치료제가 될 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생명공학 및 의학연구 뿐만 아니라 산업상의 다양한 적용에서 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO233와 같은 새로운 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
보체 단백질과 상동성이 있는 PRO344 폴리펩티드 및 그의 부분은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 다른 다양한 적용에 유용할 수 있다. 신규 보체 단백질 및 그와 관련된 분자의 동정은 면역계 세포의 염증반응에 영향을 끼치는 것과 같은 많은 인간 질병과 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 신규 보체 단백질 및 그와 유사한 분자의 동정은, 상기 단백질이 다양한 인간 질병의 잠재적 치료제가 될 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생명공학 및 의학연구 뿐만 아니라 산업상의 다양한 적용에서 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO344와 같은 새로운 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
시스테인이 풍부한 분비 단백질과 관련된 생물학적 활성이 있는 본 발명의 PRO347 폴리펩티드는 치료목적의 생체내 및 생체외에서 사용할 수 있다. 당업계 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 PRO347 폴리펩티드를 상기 목적으로 사용할 수 있다.
인터-알파-트립신 억제제 단백질의 중쇄와 관련된 생물학적 활성이 있는 본 발명의 PRO354 폴리펩티드는 치료목적의 생체내 및 생체외에서 사용할 수 있다. 당업계 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 PRO354 폴리펩티드를 상기 목적으로 사용할 수 있다.
CRTAM과 상동성이 있는 PRO355 폴리펩티드 및 그의 부분은 생체내 치료 목적뿐만 아니라 다른 다양한 적용에 유용할 수 있다. T세포와 관련된 신규 분자의 동정은 통상의 면역계와 관계된 증상과 같은 많은 인간 질병과 관련되어 있을 수 있다. CRTAM 단백질이 다양한 질병의 진행에 중요한 역할을 하는 항체에 결합한다는 관점에서, 신규 CRTAM 단백질 및 그와 유사한 분자의 동정은, 상기 단백질이 다양한 인간 질병의 잠재적 치료제가 될 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생명공학 및 의학연구 뿐만 아니라 산업상의 다양한 적용에서 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO355와 같은 새로운 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
PRO357 폴리펩티드는 ALS에 대한 활성을 측정하기 위해 ALS와의 경쟁적 결합 분석에 사용할 수 있다. 게다가, PRO357이 복합체를 형성하는 폴리펩티드를 연장시켜 생체내에서 더 긴 반감기를 갖는지 측정하는 분석에 사용할 수 있다. PRO357은 역시 상동성을 갖는 카르복시펩티다아제의 분석에 유사하게 PRO357을 사용할 수 있다. 결과는 그에 알맞게 분석한다.
종양 괴사 인자군의 단백질과 관련된 생물학적 활성이 있는 본 발명의 PRO715 폴리펩티드는 치료목적의 생체내 및 생체외에서 사용할 수 있다. 당업계 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 PRO715 폴리펩티드를 상기 목적으로 사용할 수 있다. PRO715 폴리펩티드는 자신의 특이적 수용체와 결합하여 그 수용체를 활성화시킬 것으로 기대된다. 본 발명의 PRO715 폴리펩티드의 변형체는 그의 특이적 수용체 활성에 대한 효능제 및 길항제로서 기능할 수 있다.
보체 단백질과 상동성이 있는 PRO353 폴리펩티드 및 그의 부분은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 다른 다양한 적용에 유용할 수 있다. 신규 보체 단백질 및 그와 관련된 분자의 동정은 면역계 세포의 염증반응에 영향을 끼치는 것과 같은 많은 인간 질병과 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 신규 보체 단백질 및 그와 유사한 분자의 동정은, 상기 단백질이 다양한 인간 질병의 잠재적 치료제가 될 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생명공학 및 의학연구 뿐만 아니라 산업상의 다양한 적용에서 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO353과 같은 새로운 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
뮤신 및(또는) 키티나아제 단백질과 상동성이 있는 PRO361 폴리펩티드 및 그의 부분은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 다른 다양한 적용에 유용할 수 있다. 신규 뮤신 및(또는) 키티나아제 단백질 및 그와 관련된 분자의 동정은 암 또는 세포 표면의 분자 또는 수용체와 관련된 질병과 같은 많은 인간 질병과 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 신규 뮤신 및(또는) 키티나아제 단백질의 동정은, 상기 단백질이 다양한 인간 질병의 잠재적 치료제가 될 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생명공학 및 의학연구 뿐만 아니라 산업상의 다양한 적용에서 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO361과 같은 새로운 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
종양 괴사 인자군의 단백질과 관련된 생물학적 활성이 있는 본 발명의 PRO715 폴리펩티드는 치료목적의 생체내 및 생체외에서 사용할 수 있다. 당업계 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 PRO715 폴리펩티드를 상기 목적으로 사용할 수 있다. PRO715 폴리펩티드는 자신의 특이적 수용체와 결합하여 그 수용체를 활성화시킬 것으로 기대된다. 본 발명의 PRO715 폴리펩티드의 변형체는 그의 특이적 수용체 활성에 대한 효능제 및 길항제로서 기능할 수 있다.
인간 2-19 단백질과 상동성이 있는 PRO365 폴리펩티드 및 그의 부분은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 다른 다양한 적용에 유용할 수 있다. 신규 인간 2-19 단백질 및 그와 관련된 분자의 동정은 면역계 세포의 결합 또는 활성을 변화시키는 것과 같은 많은 인간 질병과 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 신규 인간 2-19 단백질 및 그와 유사한 분자의 동정은, 상기 단백질이 다양한 인간 질병의 잠재적 치료제가 될 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생명공학 및 의학연구 뿐만 아니라 산업상의 다양한 적용에서 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO365와 같은 새로운 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
20.항-PRO 폴리펩티드 항체
본 발명은 추가로 항-PRO 폴리펩티드 항체를 제공한다. 예시적인 항체로 폴리클론 항체, 모노클론 항체, 인간화 항체, 이중특이성 항체 및 이종접합 항체를 포함한다.
A.폴리클론 항체
항-PRO 폴리펩티드 항체는 폴리클론 항체를 포함할 수 있다. 폴리클론 항체의 제조 방법은 당업계 숙련자에게 공지되어 있다. 폴리클론 항체는 포유동물에서 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 포유동물에 다중성 피하 주사 또는 복강내 주사로 주입한다. 면역화제는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역성 단백질의 예로는 열쇠구멍형 삿갓조개의 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소의 티로글로불린 및 콩의 트립신 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 사용할 수 있는 면역보강제에는 프로인트 완전 면역보강제 (Freund's complete adjuvant) 및 MPL-TDM 면역보강제(모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl Lipid A), 합성 트레할로오스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 면역화 방법은 별다른 작업없이 당업계 숙련자가 선택할 수 있다.
B.모노클론 항체
대안으로, 항-PRO 폴리펩티드 항체는 모노클론 항체일 수 있다. 모노클론 항체는 문헌[콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein),Nature,256:495 (1975)]에 기재된 방법과 같은 하이브리도마(hybridoma) 방법을 사용하여 제조한다. 하이브리도마 방법에서, 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 만들거나 만들 수 있는 림프구를 유도하는 상기 면역화제로 생쥐, 햄스터 또는 다른 적합한 숙주 동물을 면역화시킨다. 다른 방법으로, 림프구는 생체외에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 통상 PRO 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함한다. 통상 인간에서 유래한 세포가 요구되면 말초 혈관 림프구(peripheral blood lymphocyte: "PBL")를 사용하고, 인간이 아닌 포유류가 요구되면 지라세포 또는 림프절을 사용한다. 이어서, 상기 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합화제를 사용하여 불사화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다([고딩(Goding),Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]). 불사화 세포주는 통상 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간에서 유래한 골수종 세포이다. 통상 쥐 또는 생쥐의 골수종 세포를 사용한다. 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 불사화 세포의 생장 또는 생존을 억제하는 물질을 바람직하게 1종 이상 포함하는 적합한 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모세포에 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라이제(HGPRT 또는 HPRT)라는 효소가 부족하면, 하이브리도마 세포의 배지는 통상 HGPRT가 부족한 세포의 생장을 방해하는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 포함할 것이다.
바람직한 불사화 세포주는 효과적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 높은 수준의 항체를 안정하게 만들어내며, HAT 배지와 같은 배지에 감응성이 있는 것이다. 더 바람직한 불사화 세포주는 캘리포니아주 새디에고 소재의 <Salk Institute Cell Distribution Center> 및 메릴랜드주 로크빌 소재의 <American Type Culture Collection>에서 수득할 수 있는 생쥐의 골수종 세포이다. 또한, 인간의 골수종 세포 및 생쥐-인간 이종골수종 세포도 인간 모노클론 항체 생성에 사용되었다 ([코즈보(Kozbor),J. Immunol.,133:3001 (1984)] 및 [브로드어(Brodeur) 등,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., 뉴욕, (1987)]의 51-63 페이지 참조).
하이브리도마 세포를 배양하는 배지를 사용하여 원하는 PRO 폴리펩티드에 의해 유도된 모노클론 항체의 존재 여부를 분석할 수 있다. 하이브리도마 세포에서생성된 모노클론 항체의 결합 특이성은 면역 침강 또는 방사성면역분석(radioimmunoassay: RIA)이나 효소-결합 면역결합 분석(enzyme-linked immunoabsorbent assay: ELISA)와 같은 생체외 결합 분석으로 측정할 수 있다. 상기 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클론 항체의 결합 친화도는 스케쳐드(Scatchard) 분석([먼슨(Munson) 및 폴라드(Pollard),Anal. Biochem. 107:220 (1980)] 참조)에 의해 측정할 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 찾아낸 후, 그 클론을 한계 희석 방법으로 서브클론(subclone)하여 표준 방법(고딩(Goding)의 상기 문헌)으로 배양한다. 상기 목적에 적합한 배지는 둘벨코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 다른 방법으로, 하이브리도마 세포는 포유동물의 복수(ascites)로서 생체내에서 배양할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클론 항체는 종래의 면역글로불린 정제 방법(예를 들면, 단백질 A-세파로오스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피)에 의해 배지 또는 복수에서 단리 또는 정제할 수 있다.
모노클론 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법으로 만들어질 수 있다. 본 발명의 모노클론 항체를 암호화하는 DNA는 쉽게 단리할 수 있고, 종래의 방법(쥐의 항체에 대한 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)을 사용하여 서열 분석을 할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 출처로사용된다. 일단 분리된 DNA를 발현 벡터로 클로닝하고 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포(평상시에는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않음)에 형질감염시킨 후, 재조합 세포에서 합성된 모노클론 항체를 수득할 수 있다. 쥐의 중쇄 및 경쇄의 불변부를 이와 상동성 있는 인간의 사슬에 대한 코딩 서열로 치환(미국 특허 제4,816,567호 및 모리슨(Morrison) 등의 상기 문헌 참조)하거나, 또는 비-면역글로불린 코딩 서열의 전체 또는 일부분을 면역글로불린 코딩 서열과 공유결합으로 연결하는 것과 같이 상기 DNA를 변화시킬 수 있다. 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명 항체의 불변 도메인으로 치환하거나, 또는 항원 결정부가 2개인 키메라 항체의 생성을 위해 본 발명 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인으로 치환할 수 있다.
상기 항체는 항원 결정부가 1개일 수 있다. 상기 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 한 가지 방법은 면역글로불린의 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현과 관련되어 있다. 중쇄의 가교를 방해하기 위해 통상 Fc 부분의 임의의 지점에서 중쇄의 끝을 자른다. 다른 방법으로, 적절한 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하거나 제거하여 가교를 방해한다.
또한, 생체외 방법도 항원 결정부가 1개인 항체의 제조에 적합하다. 항체를 분해하여 그 단편, 특히 Fab 단편을 제조하는 것은 당업계에 공지된 흔한 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
C.인간화 항체
본 발명의 항-PRO 폴리펩티드 항체는 추가로 인간화 항체 또는 인간 항체를포함할 수 있다. 인간이외의 생물(예: 쥐과)에서 제조한 항체의 인간화 형태는 상기 생물의 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는, 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편(Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원-결합 하위 서열)이다. 인간화 항체는 수용체의 상보성 결정 영역(complementary determining region: CDR)의 잔기가, 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간이 아닌 종(공여 항체)의 CDR 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용 항체)를 포함한다. 어떤 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 잔기가 상응하는 인간이 아닌 종의 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 및 수용된 CDR 또는 골격 서열 어디에도 나타나지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 인간이 아닌 종의 면역글로불린과 일치하거나, 또는 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 서열인, 하나 이상(통상, 두 개)의 가변 도메인을 실질적으로 포함한다. 또한, 최적의 인간화 항체는 인간의 면역글로불린 불변부(Fc)를 한 부분 이상 포함한다([존스(Jones) 등,Nature 321: 522-525 (1986), 리크만(Riechmann) 등,Nature,332:323-329 (1988)] 및 [프레스타(Presta),Curr. Op. Struct. Biol.,2:593-596 (1992)]).
인간이 아닌 생물에서 제조한 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 통상, 인간화 항체는 인간이 아닌 생물에서 제조한 항체에서 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가지고 있다. 상기 아미노산 잔기는 통상 "외래성"잔기라 불리우며, "외래성" 가변 도메인에서 유래된 것이다. 인간화 과정은 윈터(Winter) 및 그 동료들의 방법([존스(Jones) 등,Nature,321: 522-525 (1986)], [리크만(Riechmann) 등,Nature,332:323-327 (1988)] 및 [버회엔(Verhoeyen) 등,Science 239:1534-1536 (1988)] 참조)에 따라 설치류의 CDR 또는 인간 항체에서 이에 상응하는 CDR 서열을 치환하여 수행한다. 따라서, "인간화" 항체는 인간 항체의 가변 도메인이 인간이 아닌 종에서 유래한 상응하는 서열에 의해 실질적으로 치환된 키메라 항체(미국 특허 제4,816,567호)이다. 사실상, 인간화 항체는 특정 CDR 잔기 및 어쩌면 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위에서 유래한 잔기로 치환된 인간 항체이다.
또한, 인간 항체는 파아지 디스플레이(phage display) 라이브러리([후겐붐 (Hoogenboom) 및 윈터(Winter),J. Mol. Biol.,227:381(1991)] 및 [막스(Marks) 등,J. Mol. Biol.,222:581(1991)])를 포함하는, 당업계에 공지된 여러 가지 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 콜(Cole) 등의 기술 및 뵈르너(Boerner) 등의 기술도 인간 당항체의 제조에 유용하다([콜(Cole) 등,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [뵈르너(Boerner) 등,J. Immunol.,147(1):86-95 (1991)]).
D.이중특이성 항체
이중특이성 항체는 상이한 두 가지 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 모노클론 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 상기의 경우, 결합 특이성 중 하나는 PRO 폴리펩티드에 결합하고, 다른 하나는 세포-표면 단백질 또는 수용체나 수용체 서브유니트와 같은 임의의 다른 항원에 결합한다.
이중특이성 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합 제조 방법은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 짝 2개(2개의 중쇄는 서로 상이한 특이성을 갖음)를 함께 발현하는 것에 기초를 두고 있다([밀스타인(Milstein) 및 쿠엘로(Cuello),Nature,305:537-539 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적 짜맞춤으로 인하여, 하이브리도마(쿠아드로마: quadroma)는 10종의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하고, 이 중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 통상 친화 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 과정이 1993년 5월 13일 출원된 WO 93/08829호 및 트로네커(Traunecker) 등의 문헌[EMBO J.,10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체의 가변 도메인은 면역글로불린의 불변 도메인 서열과 융합될 수 있다. 바람직한 융합체는 힌지부, CH2 및 CH3 영역을 일부분 이상 포함하는 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인을 갖는 것이다. 하나 이상의 융합체에 나타나는 경쇄 결합에 필수적인 부위를 포함하는 첫 번째 중쇄 불변부(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체(및 필요한 경우, 면역글로불린 경쇄)를 암호화하는 DNA는 분리된 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주에 함께 형질감염시킨다. 이중특이성 항체 생성에 대해 더 상세한 사항은 문헌[수레시(Suresh) 등,Methods in Enzymology,121:210 (1986)]을 참조할 수 있다.
E.이종접합 항체
또한, 이종접합 항체도 본 발명의 범위 내에 있다. 이종접합 항체는 공유결합으로 연결된 두 개의 항체로 구성된다. 상기 항체는 예를 들면, 원하지 않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화(미국 특허 제4,676,980호) 및 HIV 감염의 치료(WO 91/00360호, WO 92/200373호 및 EP 03089호)용으로 제안되어 왔다. 상기 항체는 가교제와 관련된 방법을 포함하는, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 생체외에서 제조할 수 있다. 예를 들면, 면역독소는 이황 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 구성할 수 있다. 상기 목적에 적합한 제제로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티리미데이트를 포함하고, 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 제제를 포함한다.
21.항-PRO 폴리펩티드 항체의 용도
본 발명의 항-PRO 폴리펩티드 항체는 용도가 다양하다. 예를 들면, 항-PRO 폴리펩티드 항체는 PRO 폴리펩티드에 대한 진단 분석(특이성 세포, 조직 또는 혈청에서의 발현 조사)에 사용할 수 있다. 경쟁 결합 분석, 직접 또는 간접 샌드위치 분석 및 이질상 또는 동질상에서 수행되는 면역 침강 분석[졸라(Zola),Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]과 같은 당업계에 공지된 다양한 진단 분석 기술을 사용할 수 있다. 진단 분석에 사용하는 항체는 검출가능한 잔기로 표지할 수 있다. 검출가능한 잔기는 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있어야 한다. 예를 들면, 검출가능한 잔기는 방사선동위원소(3H,14C,32P,35S, 또는125I), 형광 또는 화학광 화합물(플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린) 또는 효소(알칼라인 인산화효소, 베타-갈락토시다아제 또는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제)일 수 있다. 항체에 검출가능한 잔기를 접합시키는, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다([헌터(Hunter) 등,Nature 144:945 (1962)], [데이비드(David) 등,Biochemistry,13:1014 (1974)], [패인(Pain) 등,J. Immunol. Meth.,40:219 (1981)] 및 [니그렌(Nygren),J. Histochem. and Cytochem.,30:407 (1982)] 참조).
또한, 항-PRO 폴리펩티드 항체는 재조합 세포 배양물 또는 천연 자원으로부터 PRO-폴리펩티드를 친화에 의해 정제하는데 유용하다. 상기 과정에서, PRO-폴리펩티드에 대한 항체를 당업계에 공지된 방법으로 적합한 지지체(세파덱스 수지 또는 여과지)에 고정시킨다. 고정된 항체를 정제될 PRO-폴리펩티드가 포함된 시료에 접촉시킨 후, 고정된 항체에 결합한 PRO-폴리펩티드를 제외한 모든 물질을 실질적으로 제거할 수 있는 적합한 용매로 세척한다.
코딘(CHD)은 독특한 안면 생김새(낮은 전방 헤어라인, 미모밀생, 비강 기형, 상악돌출증, 긴 인중, '잉어'입), 태아기 및 출생후 성장 지체, 정신 지체 및 항상 그렇지는 않지만 가끔 상지의 기형으로 특성화되는 코르넬리아 드 랑즈 증후군(Cornelia de Lange Syndrome)(CDL)으로 공지된 형태장애 증후군에 대한 후보 유전자이다. 또한, CDL이 혈소판 감소증과 연합하여 나타나는 드문 경우도 있다. CDL 유전자는 3q26.3(OMIM #122470)에 위치하는 것으로 지도가 작성되었다. 제노푸스(Xenopus)의 초기 패턴형성 및 신경계 발생에 Xchd가 연관되어 있다는 사실로 인해 CHD는 흥미있는 후보 유전자가 되었다. CHD는 염색체 3번의 적합한 영역에 지도가 작성된다. 이는 THPO와 매우 근접해 있고, THPO 및 CHD를 제거하면 드물게 혈소판 감소증 및 발생상 기형을 유발한다. 원래 위치에서의 CD 분석 결과, 대부분의 성인 조직은 CHD가 발현되지 않고, 대퇴 두부와 관골구(둔부 관절) 사이에 나타나는 발생중인 활액관절의 분열선에서만 발현되는 것으로 보아 발생 및 긴 뼈의 성장에 CHD의 기능을 관련시킬 수 있다. 상기 기능이 붕괴되면 성장 지체를 초래할 수 있다.
cDNA에서 예측한 인간의 CHD 아미노산 서열은 Xchd와 50% 상동성(및 66% 보존성)이 있다. 4개의 시스테인이 풍부한 도메인에 있는 40개의 모든 시스테인이 보존적이다. 상기 시스테인이 풍부한 도메인은 트롬보스폰딘(thrombospondin), 프로콜라겐(procollagen) 및 윌브랜드 인자(von Willebrand factor)에서 발견되는 것과 유사하다([본스타인 피.(Bornstein, P.),FASEB J 6: 3290-3299 (1992)] 및 [헌트 엘.(Hunt, L.) 및 베이커 더블유(Barker, W.),Biochem. Biophys. Res. Commun. 144: 876-882 (1987)] 참조).
PRO243 코딘에 대한 항체는 PRO243의 과다 발현에 의해 특성화되는 조건에서 폴리펩티드에 결합하도록 만들 수 있다.
하기의 실시예는 예시적 목적으로 제공되는 것이고, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
참조로 인용된 모든 특허 및 문헌은 참고문헌으로서 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
다른 지시가 없는 한, 제조자의 지시에 따라 하기 실시예 중에 언급된 시판되는 시약을 사용하였다. 메릴랜드주 로크빌(Rockville) 소재 ATCC(American Type Culture Collection)의 기탁 번호로 하기 실시예 및 본 명세서 중의 세포의 출처를 확인하였다.
<실시예 1>:신규 폴리펩티드 및 그를 암호화하는 cDNA를 확인하는 세포외 도메인의 상동성 스크리닝
스위스-프로트(Swiss-Prot) 공개 데이타베이스 출처의 공지된 약 950가지 분비 단백질의 세포외 도메인(ECD) 서열(분비 신호 서열이 존재하면 이를 포함함)을 이용하여 EST 데이타베이스를 조사하였다. 상기 EST 데이타베이스는 공개 데이타베이스(예를 들면, 데이호프(Dayhoff), 진뱅크(GenBank)) 및 비공개 데이타베이스(예를 들면, LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함한다. 컴퓨터 프로그램 블라스트(BLAST) 또는 블라스트2(BLAST2)를 이용하여 ECD 단백질 서열을 상기 EST 서열에 대한 6개 프레임의의 번역과 비교하는 조사를 수행하였다([알츠컬(Altschul) 및 기쉬(Gish),Methods in Enzymology 266: 460-480(1996)]). 공지된 단백질을 암호화하지 않을 경우 나타나는 블라스트 스코어 70(또는, 어떤 경우에는 90) 이상인 서열 단편을 모아서 "프랩(phrap)"이라는 프로그램을 이용하여 컨센서스(consensus) DNA 서열로 조립하였다(필 그린(Phil Green), 워싱턴주 시애틀 소재의 워싱턴대학교 (http://bozeman.mbt.washington. edu/phrap.docs/phrap.html)).
세포외 도메인의 상동성 스크린을 이용하여 확인된 다른 EST 서열에 관련하는 컨센서스 DNA 서열을 프랩으로 조립하였다. 또한, 상기 언급된 EST 서열 정보를 이용하여 가능한 컨센서스 서열을 합성하기 위해 블라스트 및 프랩의 주기를 반복 이용하여 수득된 컨센서스 DNA 서열을 여러번(항상은 아님) 확장시켰다.
상기 기재된 바와 같이 수득된 컨센서스 서열을 기준으로, 올리고뉴클레오티드를 합성하고 이를 사용하여 PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하고 PRO 폴리펩티드 전체 길이의 코딩 서열 클론을 단리하는 프로브로 사용하였다. 통상 순방향(.f) 및 역방향(.r) PCR 프라미어의 길이는 20 내지 30 뉴클레오티드이고, 종종 약 100 내지 1000bp 길이의 PCR 생성물을 제공하도록 설계되었다. 대체로 프로브(.p) 서열의 길이는 40 내지 55bp였다. 어떤 경우에는, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5kbp 이상이면 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전체 길이 클론의 여러 가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해, PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다 ([오수벨(Ausubel) 등,Current Protocols in Molecular Biology]. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 한쌍의 프라이머를 사용하여 관심있는 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다.
시판되는 시약, 예를 들면, 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로젠 (Invitrogen)사에서 시판하는 시약을 사용하여 표준 방법에 의해 cDNA 클론을 단리하는데 사용되는 cDNA 라이브러리를 만들었다. NotⅠ 부위를 포함하는 올리고 dT를 사용하여 cDNA를 프라이밍(priming)하고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 블런트로 연결하고, NotⅠ으로 자르고, 겔 전기영동에 의해 적당한 크기로 분류하고, 적합한 클로닝 벡터 내의 유일한 XOhⅠ 및 NotⅠ부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다(예를 들면, pRKB 또는 pRKD로, pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임, [홈스(Holmes) 등,Science,253:1278-1280 (1991)] 참조).
<실시예 2>: 아밀라아제 스크리닝에 의한 cDNA 클론의 단리
1. 올리고 dT로 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제조
캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로젠사에서 시판하는 시약 및 프로토콜(Fast Track 2)을 사용하여 관심있는 인체 조직으로부터 mRNA를 단리하였다. 메릴랜드주 게티스버그 소재의 라이프 테크놀로지(Life Technology)에서 시판하는 시약 및 프로토콜을 사용하고 상기 RNA를 사용하여 올리고 dT로 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성하고 벡터 pRK5D에 삽입하였다. 상기 과정에서, 크기가 1000bp 이상인 두가닥 cDNA를 분류하고, 상기 cDNA에 SalI 및 NotI 링커를 연결 후, XhoI 및 NotI이 잘린 벡터에 클로닝하였다. pRK5D는 sp6 전사 개시 부위 뒤에 SfiI 제한 효소 부위가 있고 그 뒤에 XhoI/NotI cDNA 클로닝 부위가 있는 클로닝 벡터이다.
2. 무작위로 프라이밍된 cDNA 라이브러리 제조
실질적으로 일차 cDNA 클론의 5' 말단을 나타내는 이차 cDNA 라이브러리를 생성하였다. 일차 라이브러리로부터 Sp6 RNA를 생성하였고(상기 기재됨), 상기 RNA를 사용하고 라이프 테크놀로지에서 시판하는 시약 및 프로토콜(슈퍼 스크립트 플라스미드 시스템(Super Script Plasmid System), 상기 참조)을 사용하여 벡터pSST-AMY.0에 삽입된 무작위로 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성하였다. 상기 방법에서, 두 가닥 cDNA를 500 내지 1000bp 크기로 분류하고 NotⅠ 어댑터에 블런트로 연결하고 SfiⅠ으로 자른 후, SfiⅠ 및 NotI으로 잘린 벡터에 클로닝하였다. pSST-AMY.0은 효모의 알콜 탈수소효소 프로모터 뒤에 cDNA 클로닝 부위 및 생쥐 아밀라아제 서열이 있고(분비 신호가 없는 성숙 서열), 상기 클로닝 부위 뒤에 효모 알콜 탈수소효소 종결자가 있는 클로닝 벡터이다.
3. 형질전환 및 검출
상기 2절에 기재된 라이브러리의 DNA를 얼음에서 냉각하고 여기에 일렉트로포레이션용 감응세포인 DH1OB 박테리아(라이프 테크놀로지(Life Technology), 20ml)를 가하였다. 그 후에 제조자가 추천한 방법으로 박테리아 및 벡터 혼합물을 전기영동하였다. 그 후에, SOC 배지(라이프 테크놀로지, 1ml)를 가하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 후에, 앰피실린(ampicillin) 함유 표준 150mm LB 플레이트 20개에 형질전환체를 도말하고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 플레이트에서 양성 콜로니를 긁어내고 표준 프로토콜, 예를 들면 CsCl-농도 구배 원심분리를 이용하여 박테이라 펠릿에서 DNA를 단리하였다. 그 후에, 정제된 DNA는 하기 효모 프로토콜에서 계속 사용하였다.
상기 효모 프로토콜을 ⑴ 플라스미드와 cDNA의 결합 벡터로 효모를 형질전환하는 단계, ⑵ 아밀라아제를 분비하는 효모 클론의 검출 및 단리 단계, 및 ⑶ 서열 분석 및 추가 분석을 위해 효모 콜로니에서 직접 삽입체를 PCR 증폭하는 단계의 세 단계로 분류하였다.
사용된 효모 균주는 HD56-5A(ATCC-90785호)였다. 상기 효모의 유전자형은 MAT alpha, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL+, SUC+, GAL+이다. 바람직하게는, 전사후 경로가 불완전한 효모 돌연변이체를 사용할 수 있다. 상기 돌연변이체는 sec71, sec72, sec62가 끝이 잘린 sec71로 전좌된 불완전한 대립 유전자를 갖는 것이 가장 바람직하였다. 다른 방법으로, 이러한 유전자의 정상적인 작동을 방해하는 길항제(안티센스 뉴클로오티드 및(또는) 리간드 포함), 번역 후의 경로에 포함된 다른 단백질(예를 들면, SEC6lp, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJlp 또는 SSAlp4p) 또는 이 단백질의 복합체를 바람직하게 아밀라아제 발현 효모와 공동으로 사용할 수 있다.
문헌[기쯔(Gietz) 등,Nucl. Acid. Res.,20:1425(1992)]에 기재된 프로토콜을 기초로 형질전환을 수행하였다. 그 후에, 형질전환된 세포를 아가에서 YEPD 복합 액체 배지(100ml)에 접종하고 30℃에서 밤새 배양하였다. 문헌 [카이저(Kaiser) 등,Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p.207 (1994)]에 개시된 바와 같이 YEPD 액체 배지를 제조하였다. 그 후에, 밤새 배양한 것을 새 YEPD 액체 배지(500ml) 중에 약 2 x 106세포/ml(약 OD600=0.1)로 희석하여 접종하고 1 x 107세포/ml(OD600은 약 0.4 내지 0.5였음)로 재배양하였다.
그 후에, 세포를 채취하고 소발(Sorval) GS3 로우터의 GS3 로우터 병에서 형질전환시키고 5000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하여 멸균수에 재현탁시키고 베크만(Beckman) GS-6KR 원심분리기로 3500rpm에서 50ml 팔콘(falcon) 튜브 중에서 다시 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 세포를 LiAc/TE(10ml, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH 7.5), 100mM Li2OOCCH3)로 세척 후, LiAc/TE(2.5ml)로 재현탁시켰다.
상기 제조된 세포(100㎕)를 새로 분해된 단일 가닥의 연어 정자 DNA(메릴랜드주 게티스버그 소재의 로프스트랜드(Lofstrand) 실험실)를 DNA(1㎍, 10㎕ 이하의 부피)와 미세원심분리 튜브 중에 혼합하여 형질전환시켰다. 이 혼합물을 잠깐 볼텍싱(vortexing)한 후에, 40% PEG/TE(600㎕, 40% 폴리에틸렌 글리콜-4000, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 100mM Li2OOCCH3(pH 7.5))를 가하였다. 이 혼합물을 서서히 혼합하고 30분 동안 교반시키면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 그 후에, 42℃에서 15분 동안 세포에 열 충격을 가하고 반응 용기를 12000rpm에서 5 내지 10초 동안 미세원심분리하여 상층액을 버리고 TE(500㎕, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH 7.5))로 재현탁시키고 재원심분리하였다. 그 후에, 세포를 TE(1ml)로 희석시키고 분획(200㎕)을 미리 준비된 150mm 배양 플레이트(VWR)의 선별 배지에 도말하였다.
다른 방법으로, 많은 소규모 반응 대신 대규모의 단일 반응을 이용하여 형질전환을 수행하였고, 따라서 시약의 양은 비례적으로 증가하였다.
사용된 선별 배지는 문헌[카이저(Kaiser) 등,Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p.208-210 (1994)]에 개시된바와 같이 제조된 우라실이 결핍된 합성의 완전 덱스트로스 아가(SCD-Ura)였다. 30℃에서 2 내지 3일 동안 형질전환체를 배양하였다.
선별 배지 중에 붉은색 녹말을 포함시켜 아밀라아제를 분비하는 콜로니를 검출하였다. 문헌[빌리(Biely) 등,Anal. Biochem.,172:176-179(1988)]에 개시된 방법으로 붉은색 염료에 녹말을 결합시켰다. 최종 농도 0.15%(중량/부피)로 결합된 녹말을 SCD-Ura 아가 플레이트에 넣어주고 인산칼륨으로 pH를 7.0(최종 농도 50-100mM)으로 완충시켰다.
잘 단리되고 확인가능한 단일 콜로니를 얻기 위해, 양성 콜로니를 선택하여 새 선별 배지(150mm 플레이트)에 스트리크(streak)하였다. 완충시킨 SCD-Ura 아가에 붉은색 녹말을 직접 혼합하여 아밀라아제를 분비하는 잘 단리된 단일 콜로니를 검출하였다. 녹말을 분해하여 콜로니 주위에 직접 보이는 투명한 둥근 무늬를 생성하면 양성 콜로니로 결정하였다.
4.PCR 증폭에 의한 DNA 단리
양성 콜로니를 단리했을 때, 그의 일부를 이쑤시개로 수획하여 96 웰 플레이트 중에 멸균수(30㎕)로 희석 배양하였다. 이 때, 이후의 분석을 위해 양성 콜로니를 동결시켜 보관하거나 또는 즉시 증폭시켰다. 클렌택(Klentaq: Clontech, Palo Alto, CA) 0.5㎕, 10mM dNTP(Perkin Elmer-Cetus) 4.0㎕, 클렌택 완충액(Clontech) 2.5㎕, 순방향 올리고 1 0.25㎕, 역방향 올리고 2 0.25㎕ 및 증류수 12.5㎕를 포함하는 25㎕의 반응 부피 중에 세포 분획 5㎕를 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 순방향 올리고뉴클레오티드 1의 서열은
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' (서열 번호 16)이고,
역방향 올리고뉴클레오티드 2의 서열은
5 '-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3' (서열 번호 17)이었다.
그 후에, 하기와 같이 PCR을 수행하였다.
a. 변성 92℃, 5분
b. 변성 92℃, 30초
어닐링 59℃ 30초
합성 72℃ 60초
(상기 모두 3회)
c. 변성 92℃ 30초
어닐링 57℃ 30초
합성 72℃ 60초
(상기 모두 3회)
d. 변성 92℃ 30초
어닐링 55℃ 30초
합성 72℃ 60초
(상기 모두 25회)
e. 4℃로 반응물의 온도를 유지.
올리고뉴클레오티드의 밑줄 그은 부분은 각각 ADH 프로모터 영역 및 아밀라아제 영역에 어닐링되어 있었고, 삽입체가 없으면 벡터 pSST-AMY.0에서 307bp 영역을 증폭시켰다. 통상, 이 올리고뉴클레오티드 5' 말단의 첫 18 뉴클레오티드는 서열 분석 프라이머에 대한 어닐링 부위를 포함하였다. 따라서, 빈 벡터에서 PCR 반응의 전체 생성물은 343bp였다. 그러나, 신호 서열이 융합된 cDNA는 상당히 긴 뉴클레오티드 서열을 생성하였다.
PCR 후에, 샘브루크(Sambrook) 등의 상기 문헌에 개시된 Tris-Borate-EDTA (TBE) 완충 시스템을 이용하여 1% 아가로오스 겔 상에서 아가로오스 겔 전기영동에 의해 반응물 분획(5㎕)을 검사하였다. 400bp 이상의 강한 단일 PCR 생성물인 클론을 96 퀴아퀵(Qiaquick) PCR 클린업 컬럼(Qiagen Inc., Chatsworth, CA)으로 정제한 후에 추가로 DNA 서열 분석에 의해 분석하였다.
<실시예 3>: 인간 PRO241을 암호화하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 다른 EST 서열에 관련되는 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 본 명세서에서 상기 컨센서스 서열을 DNA30876라 칭하였다. DNA30876 컨센서스 서열을 기준으로, 1) 관심 있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하는 단계 및 2) PRO241 전체 길이를 암호화하는 서열의 클론을 단리하는데 프로브로 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머(순방향 및 역방향)를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 5'-GGAAATGAGTGCAAACCCTC-3' (서열 번호 3)
역방향 PCR 프라이머 5'-TCCCAAGCTGAACACTCATTCTGC-3' (서열 번호 4)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 서열 DNA30876으로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
5'-GGGTGACGGTGTTCCATATCAGAATTGCAGAAGCAAAACTGACCTCAGTT-3' (서열 번호 5)
전체 길이 클론의 정보에 대한 여러 가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 기재된 PCR 프라이머 쌍으로 PCR 증폭하여 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머 1개를 사용하여 PRO241 유전자를 코팅하는 클론을 단리하였다. cDNA 라이브러리를 만드는 RNA는 인간 태아의 신장 조직(LIB29)에서 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열은 PRO241의 전체 길이 DNA 서열(본 명세서에서는 UNQ215(DNA34392-1170)라 칭함)(서열 번호 1) 및 PRO241에서 유래한 단백질 서열을 제공한다.
UNQ215(DNA34392-1170)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 1(서열 번호 1)에 나타나있다. 클론 UNQ215(DNA34392-1170)는 뉴클레오티드 위치 234-236에서 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1371-1373(도 1)에서 종결 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함한다. 예상되는 폴리펩티드 전구체는 379개의 아미노산 길이였다(도 2). 도 2에 나타나 있는 전체 길이의 PRO241 단백질은 약 43,302달톤의 예상 분자량 및 약 7.30의 pI 값을 갖는다. 클론 UNQ215(DNA343921170)는 ATCC에 기탁되어 있고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209526호를 배정받았다.
전체 길이의 PRO244 폴리펩티드의 아미노산 서열을 분석한 결과, 다양한 비글리칸 프로테오글리칸 단백질과 상동성이 높았고, 이는 PRO241이 신규 비글리칸유사 폴리펩티드임을 제안하였다.
<실시예 4>: 게놈 워킹에 의한 인간 PRO243을 암호화하는 cDNA 클론의 단리
도입: 인간 트롬보포이에틴(THPO)은 2개의 도메인으로 이루어진 352개 아미노산의 글리코실화 호르몬이다. 에리쓰로포이에틴과 50%의 상동성이 있는 N-말단 도메인은 생물 활성을 수행한다. C-말단은 분비하는데 필요하다. 트롬보포이에틴(THPO)의 유전자는 인간 염색체 3q27-q28에 있고, 이 유전자의 6개 엑손은 게놈 DNA의 7킬로베이스 염기 쌍에 걸쳐 있다([거니(Gurney) 등,Blood 85: 981-988 (1995)]). THPO 가까이 위치하는 THPO 상동 염색체를 암호화하는 임의의의 유전자가 있는지를 결정하기 위해, 이 지역의 게놈 DNA 단편을 확인하고 서열 분석을 하였다. PCR을 이용하여 갭을 채우는 연구와 순차적 샷건 전략(ordered shotgun strategy)을 병행하여, THPO 유전자좌를 포함하는 P1 클론 3개 및 PAC 클론 1개(Genome Systems Inc., St. Louis, MO, 카탈로그 번호 P1-2535 및 PAC-6539)를 단리하고 140kb 지역을 서열 분석하였다. 분석 결과, 이 지역은 THPO에 매우 가까이 위치하는 부가적인 유전자 4개(종양 괴사 인자 수용체 유형 1과 관련된 단백질 2(TRAP2), 신장 개시 인자 감마(elF4g), 클로라이드 채널 2(CLCN2) 및 RNA 중합효소 2 서브유니트 hRP17)를 갖는, 유전자가 풍부한 지역인 것으로 나타났다. THPO 상동 염색체가 이 지역에서 발견되지 않아도, 4개의 신규 유전자가 컴퓨터-보조 유전자 검출(GRAIL) ([수(Xu) 등,Gen. Engin. 16: 241-253 (1994)]), CpG 도([크로스 에스.(Cross, S.) 및 버드 에이.(Bird, A.),Curr. Opin. Gene. Devel. 5:109-314 (1995)]) 및 공지된 유전자의 상동체(WU-BLAST2.0에 의해 검출된 바와 같음)([알츠컬(Altschul)및 기쉬(Gish),Methods Enzymol. 266: 460-480 (1996)])에 의해 예견되었다(http://blast.wustl.edu/blast/README.html).
P1 및 PAC 클론THPO 게놈 서열에서 설계한 PCR 프라이머로 스크리닝된 게놈 P1 라이브러리로부터 최초의 인간 P1 클론을 단리하였다([에이. 엘. 거니(A.L.Gurney) 등,Blood 85: 981-88 (1995)]). 상기 P1 클론에서 유래한 말단 서열로부터 PCR 프라이머를 설계한 후에, P1 및 PAC 라이브러리를 스크리닝하는데 사용하여 중복되는 클론을 확인하였다(Genome Systems, 카탈로그 번호 P1-2535 및 PAC-6539).
순차적 샷건 전략순차적 샷건 전략(OSS)([첸(Chen) 등,Genomics 17: 651-656 (1993))])은 체계적인 연구로 큰 게놈 DNA 클론의 지도 작성 및 서열 분석하는 것을 포함한다. P1 또는 PAC 클론을 초음파처리하여 분해하고 단편을 람다 벡터(λBluestar)에 서브클로닝하였다(Novagen, Inc., Madison, WI, 카탈로그 번호 69242-3). 긴 길이의 PCR에 의해 람다 서브클론 삽입체를 단리하고 그 말단을 서열 분석하였다([반스 더블유.(Barnes, W.),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2216-2220 (1994)]). 람다-말단 서열을 중복시켜 최초 클론의 부분적인 지도를 작성하였다. 중복 말단-서열을 갖는 이 람다 클론을 확인하고, 삽입체를 플라스미드 벡터(pUC9 or pUC18)에 서브클로닝하고 조립하여 인접하는 서열을 생성하였다. 이렇게 유도된 서열 전략은 관심있는 지역을 조사하고 집중하는 동안 필요한 여분의 실험을 최소화한다.
THPO 유전자좌를 더 잘 정의하고 헤마토포이에틴 종류에 관련된 다른 유전자를 연구하기 위해, 인간 P1 및 PAC 라이브러리를 PCR 스크리닝하여 4개의 게놈 클론을 이 지역으로부터 단리하였다(Genome System, Inc., 카탈로그 번호 Pl-2535 및 PAC6539). 게놈 단편의 크기가 Pl.t는 40kb이고, Pl.g는 70kb이고, Pl.u는 70kb이며, PAC.z는 200kb이었다. 이들 4개의 게놈 클론 사이의 관계는 도 5에 나타나있다. 200kb 게놈 DNA의 약 80%가 순차적 샷건 전략(OSS)([첸(Chen) 등,Genomics17: 651-56 (1993)])에 의해 서열 분석하였고 오토어셈블러 (AutoAssembler, 등록상표)(Applied Biosystems, Perkin Elmer, Foster City, CA, 카탈로그 번호 903227)를 이용하여 콘티그(contig)로 조립하였다. 수동 분석에 의해 상기 콘티그의 예비 순서를 결정하였다. 콘티그는 46종 이었고 갭을 채우는 방법을 사용하였다. 표 2에는 갭의 수 및 크기가 요약되어 있다.
140kb 지역 내의 갭 요약
갭의 크기 수
< 50bp 13
50 - 150bp 7
150 - 300bP 7
300 - 1000bp 10
1000 - 5000bp 7
5000bp 2(15,000bp)
DNA 서열 분석ABI DYE-프라이머(등록상표) 화학(PE Applied Biosystems, Foster City, CA; 카탈로그 번호 402112)을 사용하여 람다 및 플라스미드 서브클론의 말단을 서열 분석하였다. ABI DYE-터미네이터(등록상표) 화학(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, 카탈로그 번호 403044)을 사용하여 그의 각 PCR 프라이머를 가진 PCR 생성물을 서열 분석하였다. 이 서열을 ABI377 장치를 사용하여 수집하였다. 1kb 이상의 PCR 생성물에는, 워킹 프라이머를 사용하였다. 서열의 중복 확인 및 편집을 위해, 오토어셈블러(등록상표)(PE Applied Biosystems,Foster City, CA, 카탈로그 번호 903227)의 OSS 전략에 의해 생성된 콘티그의 서열 및 갭을 채우는 서열 흔적 파일을 시퀀서(Sequencher, 등록상표)(Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI)에 넣었다.
PCR-을 이용한 갭 삽입 전략반복적이고 질이 낮은 서열 지역을 피해 각 콘티그의 5'- 및 3'- 말단 서열을 기준으로 프라이머를 설계하였다. 모든 프라이머가 50 내지 70% G/C 함량을 가진 19 내지 24머가 되도록 설계하였다. 올리고를 합성하고 표준 방법으로 겔-정제하였다.
콘티그의 방향과 순서를 모르기 때문에, 증폭 반응에서 프라이머의 조합을 순차적으로 사용하였다. 두 PCR 키트를 사용하였다. 즉, 합성 시간이 약 10분인 XL PCR 키트(Perkin Elmer, Norwalk, CT, 카탈로그 번호 N8080205) 및 엄격 조건하에 XL PCR 키트로는 PCR 생성물의 밴드가 끌리거나 다수의 생성물이 관찰되는 경우 사용하는 택(Taq) 중합효소 PCR 키트(Qiagen Inc., Valencia, CA, 카탈로그 번호 201223). 상기 두 반응 중 결과가 잘 나온 반응의 주요 PCR 생성물을 0.9%의 저온 용융 아가로오스 겔로부터 추출하고 서열 분석에 앞서 진클린(Geneclean) DNA 정제 키트로 정제하였다.
분석코딩 지역의 동정 및 특성화를 하기와 같이 수행하였다. 먼저, 반복 요소의 라이브러리에 대해 파스타(FastA) 포맷의 DNA 서열을 스크리닝하고 차폐된 질의 서열을 회복시키는 리피트마스커(RepeatMasker)(A.F.A. Smit P. Green, http://ftp.genome.washington.edu/RM/RM_details.html)를 이용하여 반복 서열을 차폐하였다. 우블라스트(WUBLAST)([알츠컬 에스.(Altschul, S.) 및 기쉬더블유.(Gish, W.),Methods Enzymol.266: 460-480 (1996)])를 이용하여 이 서열과 진뱅크(Genbank) 데이타베이스를 비교하여 차폐되지 않은 반복 서열을 확인하고 수동으로 차폐시켰다.
다음에, 우블라스트(WUBLAST)2.0 알고리즘을 이용하여 제넨테크(Genentech)의 단백질 데이타베이스에 대해 게놈 지역을 비교하여 공지된 유전자를 밝혀낸 후에, 게놈 및 각 유전자에 대한 cDNA 서열을 각각 배열하여 주석을 달고, Needleman-Wunch 알고리즘([Needleman and Wunsch,J. Mol. Biol.48: 443453 (1970)])을 사용하여 거의 유사하지 않은 서열 사이의 국소적으로 동일한 지역을 발견하였다. 상기 전략으로 이 지역의 다섯가지 공지된 유전자인 THPO, TRAP2, elF4g, CLCN2 및 hRPB17 (표 3)의 모든 엑손을 검출하였다.
분석된 140kb 지역에 위치한 공지된 유전자 요약
공지된 유전자 지도상 위치
진핵생물 번역 개시 인자 4 감마 3q27-qter
트롬보포이에틴 3q26-q27
클로라이드 채널 2 3q26-qter
TNF 수용체 관련 단백질 2 종래에 지도화되지 않음
RNA 중합효소 2 서브유니트 hRPB17 종래에 지도화되지 않음
마지막으로, 많은 연구를 통해 신규 전사 유니트를 예견하였다. CpG 도([에스. 크로스(S. Cross) 및 버드 에이.(Bird, A.),Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 109-314 (1995)])을 사용하여 프로모터 지역을 정의하였고, 이 지역은 GC가 풍부한, 6 내지 8-머 회문구조 서열을 인식하는 효소에 의한 절단 부위의 절편으로 확인되었다. 진뱅크에 대해 짧은 게놈 지역(10 내지 20kb)을 우블라스트2.0으로 분석한 결과 EST에 상응하는 부분을 밝혀냈다. 각 EST 서열(또는 가능한 그의 서열 크로마토그램 파일)을 회복하고 시퀀서로 조립(10 내지 20kb)하여 이론상의 cDNA 서열(본 명세서에서 DNA3M15라 칭함)을 제공하였다. 그레일(GRAIL)2(ApoCom Inc., Knoxville, TN, DEC 알파용 명령 라인(command line) 버전)를 사용하여 신규 엑손을 예측하였다. 이 지역의 다섯가지 공지된 유전자는 그레일 알고리즘의 수행에 있어서의 내부 대조군 역할을 한다.
단리올리고 dT로 시작되는 인간 태아의 폐 라이브러리로부터 코딘 cDNA 클론을 단리하였다. 인간 태아 폐의 폴리아데닐화 RNA를 클론테크(Clontech)(카탈로그 번호 6528-1, 로트 번호 43777)에서 구입하여 pKR5B(Genentech, LIB26)의 cDNA 라이브러리를 만들기 위해 5mg을 사용하였다. SalI 및 NotI 제한 부위를 도입하도록 3'-프라이머(pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCT)(서열 번호 8) 및 5'-링커(pCGGACGCGTGGGGCCTGCGCACCCAGCT)(서열 번호 9)를 설계하였다. 유전자의 제안된 게놈 엑손과 함께 수동 "스플라이싱"에 의해 추론되는 추정의 인간 코딘 cDNA 서열(DNA3M15)로부터 설계된 올리고뉴클레오티드 프로브로 클론을 스크리닝하였다. 프로브를 합성하는 PCR 프라이머를 사용하여 서열 분석에 앞서 cDNA 클론의 동일성을 확인하였다.
스크리닝 올리고뉴클레오티드 프로브는은 하기와 같다.
OLI5640 34415.pl 5'-GCCGCTCCCCGAACGGGCAGCGGCTCCTTCTCAGAA-3' (서열 번호 10) 및
OLI5642 34415.p2 5'-GGCGCACAGCACGCAGCGCATCACCCCGAATGGCTC-3' (서열 번호 11).
사용된 합성용 프로브는 하기와 같다.
OLI5639 34415.fl 5'-GTGCTGCCCATCCGTTCTGAGAAGGA-3' (서열 번호 12) 및
OLI5643 34415.r 5'-GCAGGGTGCTCAAACAGGACAC-3' (서열 번호 13).
<실시예 5>: PRO243의 노던 블랏 및 원래 위치에서의 RNA 혼성화 분석
노던 블랏 분석에 의해 인체 조직으로부터 유래한 PRO243 mRNA를 분석하였다. 인간 태아 및 성인의 조직으로부터 유래한 폴리 아데닐화 RNA 블랏(Clontech, Palo Alto, CA, 카탈로그 번호 7760-1 및 7756-1)을 전체 길이의 PRO243 cDNA를 기재로 하는32P-표지된 cDNA 단편에 혼성화하였다. 혼성화 완충액(5X SSPE, 2X 덴하트 용액, 100mg/mL의 변성 분해된 연어 정자 DNA, 50% 포름아미드 및 2% SDS)에서 프로브를 42℃에서 60시간 동안 블랏 위에서 인큐베이션하였다. 2X SSC로 몇 차례 블랏을 세척하고, 상온에서 1시간 동안 0.05% SDS로 세척한 후에, 0.1X SSC 중에 30분 동안 엄격 조건으로 세척하고, 50℃에서 0.1% SDS로 세척하였으며 오토라디오그래피하였다. 밤새 노출시킨 후에, 포스포이미저 분석(phosphorimager analysis)(Fuji)에 의해 블랏을 생성하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, PRO243 mRNA 전사체를 검출하였다. 발현 패턴 분석 결과, 성인 및 태아의 간에 예상된 4.0kb 전사체의 강한 신호 및 성인 신장에 매우 희미한 신호가 나타났다.
인간 성인 조직 중의 PRO243의 원래 위치에서의 혼성화로 대퇴 두부 및 관골구 사이에 나타나는 발생중인 활액관절 분열선에 양성 신호가 나타났다. 모든 다른 조직은 음성이었다. 인간 태아의 안면, 머리, 사지 및 생쥐 배(embryo)의 다른 부분을 검사하였다. 인간 태아 조직은 간충직의 사지 및 안면부의 뼈가 발생하는부위 주변에서 PRO243이 발현되는 것을 관찰하였다.
이 발현은 고도로 특이적이고 종종 혈관 형성을 수행하는 부위 주변에서 관찰되었다. 또한, 태아 뇌의 발생중인 측두엽 및 후두엽에서 발현되지만, 뇌의 다른 곳에서는 발현되지 않는 것을 관찰하였다. 또한, 발생중인 내이의 신경절에서도 발현을 관찰하였다. 인간 프로브로 임의의의 생쥐 조직을 조사한 결과, 어떤한 발현도 관찰하지 못했다(도 7).
최적의 프로토콜을 이용하고, PCR로 생성한32P-표지된 리보프로브를 이용하여 원래 위치에서의 혼성화를 수행하였다([루(Lu) 및 질레트(Gillett),Cell Vision 1:169-176 (1994)). 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 묻힌 인간 태아 및 성인 조직을 절단하고, 파라핀을 제거 후, 37℃에서 15분 동안 단백질 분해효소 K로 단백질을 분해하고, 루(Lu) 및 질레트(Gillett)(1994)에 의해 개시된 원래 위치에서의 혼성화로 추가 처리하였다. PCR 생성물로부터 [33P]-UTP로 표지된 안티센스 리보프로브를 생성하고 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 상기 슬라이드를 코닥(Kodak) NTB2 핵 트랙 에멀젼(nuclear track emulsion) 중에 담그고 4주 동안 노출시켰다.
<실시예 6>: 인간 PRO299을 암호화하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 2에 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 DNA28847(도 10, 서열 번호 18)이라 불리우는 cDNA를 단리하였다. 추가 분석 후에, DNA28847의 3' 절단된 형태를 발견하고 DNA35877(도 11, 서열 번호 19)이라 칭하였다. DNA35877 서열을기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO299의 전체 길이를 암호화하는 서열의 클론을 단리하는 프로브로 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 통상 순방향 및 역방향 PCR 프라이머는 뉴클레오티드수 20 내지 30의 범위이고 종종 약 100 내지 1000bp 길이의 PCR 생성물을 제공하도록 설계하였다. 어떤 경우에는, 컨센서스 서열이 1 내지 1.5kbp 이상이면, 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전체 길이 클론의 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브리로부터의 DNA를 스크린하였다([오수벨(Ausubel) 등,Current Protocols in Molecular Biology]). 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 프라이머 쌍을 사용하여 관심있는 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다.
하기의 순방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머(35877.f1) 5'-CTCTGGAAGGTCACGGCCACAGG-3' (서열 번호 20)
역방향 PCR 프라이머(35877.rl) 5'-CTCAGTTCGGTTGGCAAAGCTCTC-3' (서열 번호 21)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA35877로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브(35877.p1)
5 '-CAGTGCTCCCTCATAGATGGACGAAAGTGTGACCCCCCTTTCAGGCGAGAGCTTTGCCAACCGAACTGA-3' (서열 번호 22)
전체 길이 클론 정보의 여러 가지 라이브러리를 얻기 위해, 상기 확인된 1개의 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 PRO299 서열을 암호화하는 클론을 단리하였다. 인간 태아 뇌조직으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 쓰이는 RNA를 단리하였다. 시판되는 시약, 예를 들면, 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로젠(Invitrogen)사의 시약을 사용하는 표준 방법에 의해 cDNA를 단리하는데 사용되는 cDNA 라이브러리를 만들었다. NotⅠ 부위를 포함하고 SalⅠ 헤미키나아제 어탭터에 블런트로 연결된 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍하고, NotⅠ으로 절단 후, 겔 전기영동하여 대략적인 크기로 분류하고, 적합한 클로닝 벡터 중의 유일한 XhoⅠ 및 NotⅠ부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다(예를 들면, pRKB 또는 pRKD로, pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임, [홈스(Holmes) 등,Science,253:1278-1280 (1991)] 참조).
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열은 PRO299의 전체 길이의 DNA 서열(본 명세서에서는 UNQ262(DNA39976-1215)라 칭함)(서열 번호 14) 및 PRO299로부터 유래한 단백질 서열을 제공하였다. UNQ262(DNA39976-1215)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 8(서열 번호 14)에 나타나있다. 클론 UNQ262(DNA39976-1215)는 뉴클레오티드 위치 111 내지 113에 분명한 전사 개시 부위가 있고 뉴클레오티드 위치 2322 내지 2324(도 8)에 종결 코돈으로 끝나는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 737개의 길이였다(도 9). 클론 UNQ262(DNA39976-1215)에 의해 암호화되는 폴리펩티드 서열의 중요한 지역이 확인되었고 각각 하기 서열을 포함하였다. 아미노산 1 내지 28에 상응하는 단일 펩티드 서열, 아미노산 638-662에 상응하는 추정의 막통과 영역, 각각 아미노산 80-106, 121-203, 336-360, 378-415, 416-441, 454-490, 491-528, 529-548, 567-604, 605-622에 상응하는 EGF 반복 및 각각 아미노산 107-120, 204-207, 208-222, 223-285, 286-304, 361-374, 375-377, 442-453, 549-563 및 564-566에 상응하는 10 군데 잠재적인 N-글리코실화화 부위를 포함한다. 클론 UNQ262(DNA39976-1215)를 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209524호를 배정받았다.
전체 길이 PRO299 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그의 일부가 노치(notch) 단백질과 상동성이 높아 PRO299는 신규 노치 상동 단백질일 수 있고, 노치 단백질의 전형적인 활성을 가질 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 7>: 인간 PRO323을 암호화하는 cDNA의 단리
실시예 1에 기재된 바와 같이 다른 EST 서열과 관련되는 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 본 명세서에서는 이 컨센서스 서열을 DNA30875라 칭하였다. DNA30875 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO323 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머(순방향 2개 및 역방향 1개)를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 1 5'-AGTTCTGGTCAGCCTATGTGCC-3' (서열 번호 25)
순방향 PCR 프라이머 2 5'-CGTGATGGTGTCTTTGTCCATGGG-3' (서열 번호 26)
역방향 PCR 프라이머 5' -CTCCACCAATCCCGATGAACTTGG-3' (서열 번호 27)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA30875 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브
5'-GAGCAGATTGACCTCATACGCCGCATGTGTGCCTCCTATI'CTGAGCTGGA-3' (서열 번호 11)
전체 길이 클론의 정보에 대한 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 PCR 프라이머를 사용하여 PRO323 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다. 인간 태아의 간조직(LIB6)으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 필요한 RNA를 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열은 PRO323의 전체 길이 DNA 서열 및 PRO323에서 유래한 단백질 서열을 제공하였다(본 명세서에는 UNQ284(DNA35595-1228)라 칭함)(서열 번호 23).
UNQ284(DNA35595-1228)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 12(서열 번호 23)에 나타나있다. 클론 UNQ284(DNA35595-1228)는 뉴클레오티드 위치 110 내지 112에서 분명한 전사 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 1409 내지 1411에서 끝나는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다(도 12). 예상된 폴리펩티드 전구체는 433 아미노산 길이였다(도 13). 도 13에 나타나 있는 전체 길이의 PRO323 단백질은 약 47,787의 예상 분자량 및 약 6.11의 pI 값을 갖는다. 클론 UNQ284(DNA35595-1228)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 209528호를 배정받았다.
전체 길이의 PRO323 폴리펩티드의 서열 분석 결과, 그의 일부는 여러 가지 디펩티다아제 단백질과 상동성이 높아, PRO323은 신규 디펩티다아제 단백질임을 알 수 있었다.
<실시예 8>: 인간 PRO327을 암호화하는 cDNA 클론의 단리
발현되는 서열 태그(EST) DNA 데이타베이스(IEEESEQTM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 조사하고 인간 프로락틴 수용체 단백질과 어느 정도 상동성을 나타내는 여러 가지 EST 서열을 확인하였다. 그 후에, 블라스트 및 프랩 주기를 반복하고 상기 기재된 EST 서열의 정보를 이용하여 상기 컨센서스 DNA 서열을 가능한대로 합성하였다. 본 명세서에서는 이 합성된 조립 서열을 DNA38110이라 칭하였다. 컴퓨터 프로그램 블라스트 또는 블라스트2를 이용하여 상기 연구를 수행하였다([알츠컬(Altshul) 등,Methods in Enzymology266:460-480 (1996)]). 상기 비교 결과, 블라스트 스코어는 70(또는, 어떤 경우 90) 또는 그 이상이었고 공지된 단백질을 암호화하지 않는 것들이 밀집되어 있었으며 프로그램 "프랩"을 가지고 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다(필 그린(Phil Green), 워싱턴주 시애틀 소재의 워싱턴대학교 (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/ phrap.html)).
상기 기재된 바와 같이 얻은 DNA38110 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO327 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머(순방향 및 역방향)를 하기와 같이 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 5'-CCCGCCCGACGTGCACGTGAGCC-3' (서열 번호 33)
역방향 PCR 프라이머 5'-TGAGCCAGCCCAGGAACTGCTTG-3' (서열 번호 34)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA38110 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브
5'-CAAGTGCGCTGCAACCCCTTTGGCATCTATGGCTCCAAGAAAGCCGGGAT-3' (서열 번호 35)
전체 길이 클론 정보의 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 PCR 프라이머를 사용하여 PRO327을 암호화하는 클론을 단리하였다. 인간 태아의 허파 조직(LIB26)으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 사용되는 RNA를 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열은 PRO327(본 명세서에서는 UNQ288(DNA38113-1230)이라 칭함)(서열 번호 16)의 전체 길이 DNA 서열 및 PRO327로부터 유래하는 단백질 서열을 제공한다.
UNQ288(DNA38113-1230)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 16(서열 번호 31)에 나타나있다. 클론 UNQ288(DNA38113-1230)은 뉴클레오티드 위치 119 내지 121에서 분명한 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 1385 내지 1387(도 16)에서 종결 코돈으로 끝나는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는422개 길이의 아미노산이었다(도 17). 도 17에 나타나 있는 전체 길이의 PRO327 단백질은 약 46,302달톤의 예상 분자량 및 약 9.42의 pI 값을 갖는다. 클론 UNQ288(DNA38113-1230)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209530호를 배정받았다.
전체 길이 PRO327 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그가 인간 프로락틴 수용체 단백질과 상동성이 높아 PRO327이 신규 프로락틴 결합 단백질일 수도 있음을 알 수 있었다.
<실시예 9>: 인간 PRO233를 암호화하는 cDNA 클론의 단리
실시예 1에 기재된 바와 같이 다른 EST 서열과 관계있는 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 본 명세서에서 상기 컨센서스 서열을 DNA30945라 칭하였다. DNA30945 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO233 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
하기 PCR 프라이머를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 5'-GGTGAAGGCAGAAATTGGAGATG-3' (서열 번호 38)
역방향 PCR 프라이머 5'-ATCCCATGCATCAGCCTGTTTACC-3' (서열 번호 39)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA30945 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브
5 ' -GCTGGTGTAGTCTATACATCAGATTTGTTTGCTACACAAGATCCTCAG-3 ' (서열 번호 40)
전체 길이 클론의 정보에 대한 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PRO233 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다. 인간 태아의 뇌조직으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 필요한 RNA를 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 PRO233의 전체 길이 DNA 서열(본 명세서에는 UNQ207(DNA34436-1238)이라 칭함)(서열 번호 36) 및 PRO233에서 유래한 단백질 서열을 제공하였다.
UNQ207(DNA34436-1238)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 18(서열 번호 36)에 나타나있다. 클론 UNQ207(DNA34436-1238)은 뉴클레오티드 위치 101 내지 103에서 분명한 전사 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 1001 내지 1003에서 끝나는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다(도 18). 예상된 폴리펩티드 전구체는 300 아미노산 길이였다(도 19). 도 19에 나타나 있는 전체 길이의 PRO233 단백질은 약 32,964의 예상 분자량 및 약 9.52의 pI 값을 갖는다. 또한, 단일 펩티드 및 추정의 산화환원효소 활성 부위를 포함하는 관심있는 지역이 도 19에 나타나있다. 클론 UNQ207(DNA34436-1238)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 209523호를 배정받았다.
전체 길이의 PRO233 아미노산 서열 분석 결과, 그의 일부는 여러 가지 환원효소 단백질과 상동성이 높아, PRO233은 신규 환원효소일 수도 있다.
<실시예 10>: 인간 PRO344을 암호화하는 cDNA 클론의 단리
실시예 1에 기재된 바와 같이 다른 EST 서열과 관계있는 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 본 명세서에서는 이 컨센서스 서열을 DNA34398이라 칭하였다. DNA34398 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO344 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
DNA34398 컨센서스 서열을 기준으로, 하기 순방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 (34398.f1) 5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3' (서열 번호 43)
순방향 PCR 프라이머 (34398.f2) 5'-AGCCAGCCTCGCTCTCGG-3' (서열 번호 44)
순방향 PCR 프라이머 (34398.f3) 5'-GTCTGCGATCAGGTCTGG-3' (서열 번호 45)
역방향 PCR 프라이머 (34398.r1) 5'-GAAAGAGGCAATGGATTCGC-3' (서열 번호 46)
역방향 PCR 프라이머 (34398.r2) 5'-GACTTACACTTGCCAGCACAGCAC-3' (서열 번호 47)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA34398 컨센서스 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브(34398.p1)
5 '-GGAGCACCACCAACTGGAGGGTCCGGAGTAGCGAGCGCCCCGAAG-3' (서열 번호 48)
전체 길이 클론의 정보에 대한 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 1개의 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 PCR 프라이머를 사용하여 PRO344 유전자를 암호화하는클론을 단리하였다. 인간 태아의 신장 조직으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 필요한 RNA를 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 PRO344의 전체 길이 DNA 서열(본 명세서에는 UNQ303(DNA40592-1242)이라 칭함)(서열 번호 41) 및 PRO344에서 유래한 단백질 서열을 제공하였다.
UNQ303(DNA40592-1242)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 20(서열 번호 41)에 나타나있다. 클론 UNQ303(DNA40592-1242)은 뉴클레오티드 위치 227 내지 229에서 분명한 전사 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 956 내지 958에서 끝나는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다(도 18). 예상된 폴리펩티드 전구체는 243 아미노산 길이였다(도 21). PRO344의 뉴클레오티드 1 내지 729에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 중요한 지역은 도 21에 나타난 바와 같이 단일 펩티드, 성숙 단백질의 개시 및 2 군데의 잠재적인 N-미리스토일화 부위를 포함한다. 클론 UNQ303(DNA40592-1242)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209492호를 배정받았다.
전체 길이의 PRO344 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그의 일부는 여러 가지 인간 및 쥐의 보체 단백질과 상동성이 높아, PRO344는 신규 보체 단백질일 수도 있다.
<실시예 11>: 인간 PRO347을 암호화하는 cDNA의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 다른 EST 서열과 관계있는 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 본 명세서에서는 이 컨센서스 서열을 DNA39499라 칭하였다. DNA39499 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO347 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
하기 PCR 프라이머(순방향 및 역방향)를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 5'-AGGAACTTCTGGATCGGGCTCACC-3' (서열 번호 51)
역방향 PCR 프라이머 5'-GGGTCTGGGCCAGGTGGAAGAGAG-3' (서열 번호 52)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA39499 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브
5'-GCCAAGGACTCCTTCCGCTGGGCCACAGGGGAGCACCAGGCCTTC-3' (서열 번호 53)
전체 길이 클론의 정보에 대한 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 PCR 프라이머를 사용하여 PRO347 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다. 인간 태아의 신장 조직(LIB328)으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 필요한 RNA를 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 PRO347의 전체 길이 DNA 서열(본 명세서에는 UNQ306(DNA44176-1244)이라 칭함)(서열 번호 49) 및 PRO347에서 유래한 단백질 서열을 제공하였다.
UNQ306(DNA44176-1244)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 22(서열 번호 49)에 나타나있다. 클론 UNQ306(DNA44176-1244)은 뉴클레오티드 위치 123 내지 125에서분명한 전사 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 1488 내지 1490에서 끝나는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다(도 22). 예상된 폴리펩티드 전구체는 455 아미노산 길이였다(도 23). 도 23에 나타나 있는 전체 길이 PRO347 단백질은 약 50,478달톤의 추정 분자량 및 약 8.44의 pI값을 가졌다. 클론 UNQ306(DNA44176-1244)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209532호를 배정받았다.
전체 길이의 PRO347 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그의 일부는 시스테인이 풍부한 여러 가지 분비 단백질과 상동성이 높아, PRO347은 시스테인이 풍부한 신규 분비 단백질일 수도 있다.
<실시예 12>: 인간 PRO354를 암호화하는 cDNA 클론의 단리
발현되는 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 조사하고 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 및 서로 어느 정도 상동성을 나타내는 여러 가지 EST 서열을 확인하였다. 그 후에, 이 상동의 EST 서열을 배열하고 컨센서스 서열을 찾아냈다. 그 후에, 블라스트 및 프랩의 반복 주기를 이용하여 찾아낸 컨센서스 서열을 공개 EST 데이타 베이스(예를 들면, GenBank) 및 비공개 EST DNA 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) 모두로부터 유래하는 상동 EST 서열을 이용하여 가능한 최대로 컨센서스 서열을 합성하였다. 본 명세서에서는, 상기 합성된 조립 서열을 DNA39633이라 칭하였다. 컴퓨터 프로그램 블라스트 또는 블라스트2를 이용하여 상기 연구를 수행하였다([알츠컬(Altshul) 등,Methods in Enzymology266:460-480 (1996)]). 상기 비교 결과, 블라스트 스코어는 70(또는, 어떤 경우90) 또는 그 이상이었고 공지된 단백질을 코딩하지 않는 것들이 밀집되어 있었으며 프로그램 "프랩"을 가지고 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다(필 그린(Phil Green), 워싱턴주 시애틀 소재의 워싱턴대학교 (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap. docs/phrap.html)).
이 DNA39633 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO354 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 순방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 20 내지 30 뉴클레오티드 범위이고 종종 약 100 내지 1000bp 길이의 PCR 생성물을 공급하도록 설계되었다. 통상 이 프로브 서열은 40 내지 55bp길이였다. 어떤 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5kbp 이상이면 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전체 길이 클론의 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다([오수벨(Ausubel) 등,Current Protocols in Molecular Biology]). 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 프라이머 쌍을 사용하여 관심있는 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다.
하기 PCR 프라이머를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 1 (39633.fl) 5'-GTGGGAACCAAACTCCGGCAGACC-3' (서열 번호 56)
순방향 PCR 프라이머 2 (39633.f2) 5'-CACATCGAGCGTCTCTGG-3' (서열 번호 57)
역방향 PCR 프라이머 (39633.rl) 5'-AGCCGCTCCTTCTCCGGTTCATCG-3' (서열 번호 58)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA39633 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브
5'-TGGAAGGACCACTTGATATCAGTCACTCCAGACAGCATCAGGGATGGG-3' (서열 번호 59)
전체 길이 클론 정보의 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 PCR 프라이머를 사용하여 PRO354를 암호화하는 클론을 단리하였다.
인간 태아의 신장 조직(LIB227)으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 사용되는 RNA를 단리하였다. 시판되는 시약, 예를 들면 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로젠사에서 시판하는 시약을 사용하여 cDNA 클론을 단리하는데 사용되는 cDNA 라이브러리를 만들었다. NotⅠ부위를 포함하는 올리고 dT로 이 cDNA를 프라이밍하고, SalⅠ 헤미키나아제 어댑터에 블런트로 연결하였으며 NotⅠ을 가지고 절단하고, 겔 전기영동에 의해 적당하게 크기를 분류하였으며 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD로 pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임, [홈스(Holmes) 등,Science,253:1278-1280 (1991)] 참조) 중의 유일한 XhoⅠ 및 NotⅠ부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열은 PRO354(본 명세서에서는 UNQ311(DNA44192-1246)이라 칭함)(서열 번호 54)의 전체 길이 DNA 서열 및 PRO354로부터 유래하는 단백질 서열을 제공한다.
UNQ311(DNA44192-1246)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 24(서열 번호 54)에 나타나있다. 클론 UNQ311(DNA44192-1246)은 뉴클레오티드 위치 72 내지 74에서 분명한 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 2154 내지 2156에서 종결 코돈으로 끝나는 오픈 리딩 프레임을 포함한다(도 24). 예상된 폴리펩티드 전구체는 694개 길이의 아미노산이었다(도 25). 도 25에 나타나 있는 전체 길이의 PRO354 단백질은 약 77,400달톤의 예상 분자량 및 약 9.54의 pI 값을 갖는다. 클론 UNQ311(DNA44192-1246)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209531호를 배정받았다.
전체 길이 PRO354 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그가 인터-알파-트립신 중쇄 단백질과 상동성이 높아 PRO354가 신규 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 상동 단백질일 수도 있음을 알 수 있었다.
<실시예 13>: 인간 PRO355를 암호화하는 cDNA의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 블라스트 및 프랩을 이용하여 다른 EST 서열과 관계있는 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 본 명세서에서는 상기 컨센서스 서열을 DNA35702라 칭하였다. 이 DNA35702 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO355 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
하기 순방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 (.fl) 5'-GGCTTCTGCTGITGCTCTTCTCCG-3' (서열 번호 62)
순방향 PCR 프라이머 (.f2) 5'-GTACACTGTGACCAGTCAGC-3' (서열 번호 63)
순방향 PCR 프라이머 (.f3) 5'-ATCATCACAGATTCCCGAGC-3' (서열 번호 64)
역방향 PCR 프라이머 (.rl) 5'-TTCAATCTCCTCACCTTCCACCGC-3' (서열 번호 65)
역방향 PCR 프라이머 (.r2) 5'-ATAGCTGTGTCTGCGTCTGCTGCG-3' (서열 번호 66)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA35702 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브
5 '-CGCGGCACTGATCCCCACAGGTGATGGGCAGAATCTGTTTACGAAAGACG-3' (서열 번호 67)
전체 길이 클론의 정보에 대한 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PRO355 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다. 인간 태아의 간조직으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 필요한 RNA를 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 PRO355의 전체 길이 DNA 서열(본 명세서에는 UNQ312(DNA39518-1247)라 칭함)(서열 번호 60) 및 PRO355에서 유래한 단백질 서열을 제공하였다.
UNQ312(DNA39518-1247)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 26(서열 번호 60)에 나타나있다. 클론 UNQ312(DNA39518-1247)는 뉴클레오티드 위치 22 내지 24에서 분명한 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 1342 내지 1344에서 끝나는 단일오픈 리딩 프레임을 포함한다(도 26). 예상된 폴리펩티드 전구체는 440 아미노산 길이였다(도 27). 도 27에 나타나 있는 전체 길이 PRO355 단백질은 약 48,240달톤의 예상 분자량 및 약 4.93의 pI값을 갖는다. 또한, 단일 펩티드, 세포외부 도메인의 Ig 반복, 잠재적인 N-글리콜레이션 부위 및 잠재적인 막통과 도메인을 포함하는 관심있는 지역이 도 27에 나타나있다. 클론 UNQ312(DNA39518-1247)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209529호를 배정받았다.
전체 길이의 PRO355 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그의 일부는 CRTAM 단백질과 상동성이 높아, PRO355는 CRTAM 단백질일 수도 있다.
<실시예 14>: 인간 PRO357을 암호화하는 cDNA의 단리
캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬(Incyte Pharmaceutical)사에서 시판하는 서열 발현 태그 클론 번호 "2452972"를 사용하여 데이타베이스를 조사하였다. 발현되는 서열 태그(EST) 데이타 베이스를 조사하기 위해 스위스-프로트 공개 데이타 베이스 출처의 공지된 약 950가지 분비 단백질의 세포외 도메인(ECD) 서열(분비 신호 서열이 존재한다면 이를 포함함)을 사용하였는데, 이는 인사이트 EST 클론 번호 "2452927"의 일부와 중복되었다. 상기 EST 데이타 베이스는 공개 데이타 베이스(예를 들면, GenBank) 및 비공개 데이타베이스(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 포함하였다. ECD 단백질 서열과 EST 서열의 6가지 프레임으로 번역된 서열을 비교하면서 컴퓨터 프로그램 블라스트 또는 블라스트2를 이용하여 상기 연구를 수행하였다([알츠컬(Altshul) 등,Methods in Enzymology266:460-480 (1996)]).상기 비교 결과, 블라스트 스코어는 70(또는, 어떤 경우 90) 또는 그 이상이었고 공지된 단백질을 코딩하지 않는 것들이 밀집되어 있었으며 프로그램 "프랩"을 가지고 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다(필 그린(Phil Green), 워싱턴주 시애틀 소재의 워싱턴대학교 (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)).
그 후에, 프랩을 이용하여 다른 EST 서열에 상대적인 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 이 경우, 블라스트 및 프랩의 반복 주기를 이용하고 상기 기재된 EST 서열의 정보를 이용하여 가능한 최대로 컨센서스 서열을 합성하였다.
이 DNA37162 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO357 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 순방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 20 내지 30 뉴클레오티드 범위이고 종종 약 100 내지 1000bp 길이의 PCR 생성물을 공급하도록 설계되었다. 통상 이 프로브 서열은 40 내지 55bp길이였다. 어떤 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5kbp 이상이면 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전체 길이 클론의 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다([오수벨(Ausubel) 등,Current Protocols in Molecular Biology]). 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 프라이머 쌍을 사용하여 관심있는 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다.
하기 PCR 프라이머를 합성하였다.
순방향 프라이머 1:5'-CCCTCCACTGCCCCACCGACTG-3' (서열 번호 70),
역방향 프라이머 1:5'-CGGTTCTGGGGACGTTAGGGCTCG-3' (서열 번호 71) 및
순방향 프라이머 2:5'-CTGCCCACCGTCCACCTGCCTCAAT-3' (서열 번호 72).
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA37162 서열로부터 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브 1
5' -AGGACTGCCCACCGTCCACCTGCCTCAATGGGGGCACATGCCACC-3'(서열 번호 73) 및
혼성화 프로브 2
5'-ACGCAAAGCCCTACATCTAAGCCAGAGAGAGACAGGGCAGCTGGG-3'(서열 번호 74).
전체 길이 클론 정보의 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 PCR 프라이머를 사용하여 PRO357을 암호화하는 클론을 단리하였다.
인간 태아의 간조직으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 사용되는 RNA를 단리하였다. 시판되는 시약, 예를 들면, 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로젠사에서 시판하는 시약을 사용하여 cDNA 클론을 단리하는데 사용되는 cDNA 라이브러리를 만들었다. NotⅠ부위를 포함하는 올리고 dT로 상기 cDNA를 프라이밍하고, SalⅠ 헤미키나아제 어댑터에 블런트로 연결하였으며 NotⅠ을 가지고 절단하고, 겔 전기영동에 의해 적당한 크기로 분류하였으며 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD로 pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임, [홈스(Holmes)등,Science,253:1278-1280 (1991)] 참조)) 중의 유일한 XhoⅠ 및 NotⅠ부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열은 PRO357(본 명세서에서는 UNQ314(DNA44804-1248)라 칭함)(서열 번호 68)의 전체 길이 DNA 서열 및 PRO357로부터 유래하는 단백질 서열을 제공한다.
UNQ314(DNA44804-1248)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 28(서열 번호 68)에 나타나있다. 클론 UNQ314(DNA44804-1248)은 뉴클레오티드 위치 137 내지 139에서 분명한 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 1931 내지 1933에서 종결 코돈으로 끝나는 오픈 리딩 프레임을 포함한다(도 29). 예상된 폴리펩티드 전구체는 598개 길이의 아미노산이었다(도 29). 클론 UNQ314(DNA44804-1248)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209527호를 배정받았다.
추가 분석 결과 도 29에 나타난 바와 같이 많은 특성이 나타났다. 도 29에는 서열 번호 68의 137 내지 1930의 뉴클레오티드로부터 유래하는 아미노산 서열(서열 번호 69)이 나타나있다. 분자량은 63,030이고, pI는 7.24였으며 NX/(S/T)는 3이었다. 추정의 막통과 도메인은 도 29중에 아미노산 506 내지 524에 나타나있다. 또한, 막통과 영역은 아미노산 497에서 "G"로 시작한다. 잠재적인 N-글리코실화 부위는 도 29에 강조되어 있다. EGF-유사 도메인 시스테인 패턴 번호는 아미노산 355 내지 366에서 나타난다. 또한, 이 지역은 쥐의 유지방 구형 단배질, 노치 또는 단백질분해효소를 변하게 하는 간세포 성장 인자 중에도 나타날 수 있다. 또한, 단일 펩티드는 도 29의 아미노산 1 내지 22에 나타나있다. 세포외 도메인중에 ALS 및 다른 류신 반복이 많은 단백질의 시작부는 아미노산 위치 24에서 시작하였다.
따라서, 전체 길이 PRO357의 아미노산 서열 분석 결과, 그의 일부가 ALS와 상동성이 높아 PRO357은 ALS에 관련된 신규 류신 반복이 많은 단백질일 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 15>: 인간 PRO715을 암호화하는 cDNA의 단리
인간 TNF-α와 유사한 폴리펩티드를 암호화하는 EST 서열을 찾기 위해 비공개 EST DNA 데이타베이스(LIFESEQTM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 조사하였다. 상기 조사 결과, 인사이트 발현 서열 태그(Incyte Expressed Sequence Tag) 번호 2099855가 확인되었다.
그 후에, 시퀘스트(seqext) 및 "프랩"을 이용하여 다른 EST 서열에 관련된 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다(필 그린(Phil Green), 워싱턴주 시애틀 소재의 워싱턴대학교 (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)). 본 명세서에서는 이 컨센서스 서열을 DNA52092라 칭하였다. 상기 조립체 중에 확인된 여러 가지 EST 클론의 배열을 기준으로, 머크 워싱턴 대학 EST 세트로부터 단일 EST 클론을 수득하고 그의 삽입체 서열을 분석하였다. 그 후에, EST 클론 번호 725887로부터 삽입체 DNA의 서열을 분석하여 전체 길이 DNA52722-1229 서열을 수득하였다.
UNQ383(DNA52722-1229)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 30(서열 번호 75)에 나타나있다. 클론 UNQ383(DNA52722-1229)은 뉴클레오티드 위치 114 내지 116에서분명한 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 864 내지 866에서 종결 코돈으로 끝나는 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 예상된 폴리펩티드는 250개의 아미노산 길이였다(도 31). 도 31에 나타나 있는 전체 길이 PRO715 단백질은 약 27,433달톤의 예상 분자량 및 약 9.85의 pI 값을 갖는다.
전체 길이 PRO715의 아미노산의 분석 결과, 그가 단백질의 종양 괴사 인자군의 일원과 상동성이 높아 PRO715가 신규 종양 괴사 인자 단백질임을 알 수 있었다.
<실시예 16>: 인간 PRO353을 암호화하는 cDNA의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 프랩을 이용하여 다른 EST 서열과 관련된 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 본 명세서에서는 이 컨센서스 서열을 DNA36363이라 칭하였다. 블라스트 및 프랩의 반복 주기를 이용하고 상기 기재된 EST 서열의 정보를 이용하여 가능한 최대로 컨센서스 DNA 서열을 합성하였다. 이 DNA36363 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO353 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
DNA36363 컨센서스 서열을 기준으로, 하기 순방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 (36363.f1) 5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3' (서열 번호 87)
역방향 PCR 프라이머 (36363.r1) 5'-CTGAAGAAGTAGAGGCCGGGCACG-3' (서열 번호 88).
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA36363 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브36363.p1
5 '-CCCGGTGCTTGCGCTGCTGTGACCCCGGTACCTCCATGTACCCGG-3' (서열 번호 89)
전체 길이 클론의 정보에 대한 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 PCR 프라이머를 사용하여 PRO353 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다. 인간 태아의 신장조직으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 필요한 RNA를 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 PRO353의 전체 길이 DNA 서열(본 명세서에는 UNQ310(DNA41234-1242)이라 칭함)(서열 번호 85) 및 PRO353에서 유래한 단백질 서열을 제공하였다.
UNQ310(DNA41234-1242)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 34(서열 번호 85)에 나타나있다. 클론 UNQ310(DNA41234-1242)는 뉴클레오티드 위치 305 내지 307에서 분명한 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 1148 내지 1150에서 종결 코돈으로 끝나는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다(도 34). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 281개 길이였다(도 35). PRO353에 의해 코딩된 아미노산 서열의 중요한 지역은 아미노산 1 내지 26에 상응하는 단일 펩티드, 아미노산 위치 27의 성숙 단백질의 시작부, 아미노산 93 내지 98에 상응하는 잠재적인 N-글리코실화 부위 및 아미노산 99 내지 281에 상응하는 30kd 지방세포 보체-관련 단백질 전구체와 유사한 영역을 포함하였다. 클론 UNQ310(DNA41234-1242)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209618호를 배정받았다.
전체 길이 PRO355 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그의 일부는 인간 및 쥐의 보체 단백질과 상동성이 높아, PRO353은 신규 보체 단백질일 수도 있음을 알 수 있었다.
<실시예 17>: 인간 PRO361을 암호화하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 프랩을 이용하여 다른 EST 서열과 관련된 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 본 명세서에서는 이 컨센서스 서열을 DNA40654라 칭하였다. 상기 DNA40654 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO361 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
하기 순방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 (.f1) 5'-AGGGAGGATTATCCTTGACCTTTGAAGACC-3' (서열 번호 92)
순방향 PCR 프라이머 (.f2) 5'-GAAGCAAGTGCCCAGCTC-3' (서열 번호 93)
순방향 PCR 프라이머 (.f2) 5'-CGGGTCCCTGCTCTTTGG-3' (서열 번호 94)
역방향 PCR 프라이머 (.r1) 5'-CACCGTAGCTGGGAGGGCACTCAC-3' (서열 번호 95)
역방향 PCR 프라이머 (.r2) 5'-AGTGTAAGTCAAGCTCCC-3' (서열 번호 96)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA40654 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브
5'-GCTTCCTGACACTAAGGCTGTCTGCTAGTCAGAATTGCCTCAAAAAGAG-3' (서열 번호 97)
전체 길이 클론의 정보에 대한 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PRO361 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다. 인간 태아의 신장조직으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 필요한 RNA를 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 PRO361의 전체 길이 DNA 서열(본 명세서에는 UNQ316(DNA45410-1250)이라 칭함)(서열 번호 90) 및 PRO361에서 유래한 단백질 서열을 제공하였다.
UNQ316(DNA45410-1250)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 36(서열 번호 90)에 나타나있다. 클론 UNQ316(DNA45410-1250)은 뉴클레오티드 위치 226 내지 228에서 분명한 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 1519 내지 1521에서 끝나는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다(도 37). 예상된 폴리펩티드 전구체는 431 아미노산 길이였다(도 37). 도 37에 나타나 있는 전체 길이 PRO361 단백질은 약 46,810달톤의 예상 분자량 및 약 6.45의 pI값을 가졌다. 또한, 막통과 도메인(아미노산 380 내지 409) 및 아르기나아제 종류 단백질(아미노산 3 내지 14 및 39 내지 57)의 전형적인 서열을 포함하는 관심있는 지역이 도 37에 나타나 표시되어 있다. 클론 UNQ316(DNA45410-1250)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209621호를 배정받았다.
전체 길이의 PRO361 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그의 일부는 뮤신 및(또는) 키티나아제 단백질과 상동성이 높아 PRO361은 신규 뮤신 및(또는) 키티나아제 단백질일 수도 있음을 알 수 있었다.
<실시예 18>: 인간 PRO365을 암호화하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 프랩을 이용하여 다른 EST 서열과 관련된 컨센서스 DNA 서열을 조립하였다. 본 명세서에서는 이 컨센서스 서열을 DNA35613이라 칭하였다. 이 DNA35613 컨센서스 서열을 기준으로, 1) PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하는 단계 및 2) PRO365 전체 길이의 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브를 사용하는 단계를 따라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
하기 순방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성하였다.
순방향 PCR 프라이머 (.fl-35613) 5'-AATGTGACCACTGGACTCCC-3' (서열 번호 100)
순방향 PCR 프라이머 (.f2-35613) 5'-AGGCTTGGAACTCCCTTC-3' (서열 번호 101)
역방향 PCR 프라이머 (.r1-35613) 5'-AAGATTCTTGAGCGATTCCAGCTG-3' (서열 번호 102)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA35613 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브
5'-AATCCCTGCTCTTCATGGTGACCTATGACGACGGAAGCACAAGACTG-3' (서열 번호 103)
전체 길이 클론의 정보에 대한 여러 가지 라이브러리를 스크린하기 위해, 상기 확인된 1개의 PCR 프라이머 쌍을 가지고 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크린하였다. 그 후에, 양성 반응을 나타낸 라이브러리를 이용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 1개의 PCR 프라이머를 사용하여 PRO365 유전자를 암호화하는 클론을 단리하였다. 인간 태아의 신장조직으로부터 cDNA 라이브러리를 만드는데 필요한 RNA를 단리하였다.
상기 기재된 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석은 PRO365의 전체 길이 DNA 서열(본 명세서에는 UNQ320(DNA46777-1253)이라 칭함)(서열 번호 98) 및 PRO365에서 유래한 단백질 서열을 제공하였다.
UNQ320(DNA46777-1253)의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 38(서열 번호 98)에 나타나있다. 클론 UNQ320(DNA46777-1253)은 뉴클레오티드 위치 15 내지 17에서 분명한 번역 개시 부위를 가지고 뉴클레오티드 위치 720 내지 722에서 끝나는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 38). 예상된 폴리펩티드 전구체는 235 아미노산 길이였다(도 39). 클론 320(DNA46777-1253)에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열의 중요한 지역이 확인되었고, 하기 서열을 포함하였다. 아미노산 1 내지 20에 상응하는 신호 펩티드, 아미노산 21에 상응하는 성숙 단백질의 시작부 및 도 39에 나타난 바와 같이 잠재적인 다수의 글리코실화 부위를 포함하였다. 클론 320(DNA46777-1253)을 ATCC에 기탁하고 ATCC 기탁 번호 ATCC 209619호를 배정받았다.
전체 길이의 PRO365 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그의 일부는 인간 2-19 단백질과 상동성이 높아 PRO365는 신규 인간 2-19 단백질의 상동체일 수도 있음을 알 수 있다.
<실시예 19>: PRO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 혼성화 프로브로의 용도
하기 방법에는 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 프로브로의 용도가 기재되어 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이 PRO 폴리펩티드의 관심있는 코딩 서열을 포함하는 DNA를 프로브로 사용하거나 또는 인체 조직 cDNA 라이브러리 또는 인체 조직 게놈 라이브러리 중의 상동 DNA(예를 들면, PRO 폴리펩티드의 자연 발생하는 변종을 암호화하는 DNA)를 스크린하는 프로브 제조의 기재로 사용할 수 있다.
하기의 엄격 조건하에, 라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척을 수행하였다. 42℃에서 20시간 동안 50% 포름아미드, 5xSSC, 0.1% SDS, 0.1% 피로인산나트륨, 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 2x 덴하트(Denhart's) 용액 및 10% 덱스트란 술페이트의 용액 중에 방사능표지된 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산-유도 프로브 필터에 혼성화시켰다. 42℃에서 0.1xSSC 및 0.1% SDS 수용액 중에 필터를 세척하였다.
그 후에, 당업계의 표준 기술을 이용하여 전체 길이의 고유 서열 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA와 원하는 서열 동일성이 있는 DNA를 확인하였다.
<실시예 20>: 대장균에서 PRO 폴리펩티드의 발현
본 실시예는 원하는 PRO 폴리펩티드의 글리코실화 되지 않은 형태를 대장균 재조합 발현에 의해 제조하는 방법에 관한 설명이다.
먼저, 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 원하는 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위를 포함하고 있다. 여러 가지 발현 벡터를 사용할 수 있었다. 적합한 벡터의 예는 앰피실린 및 테트라싸이클린에 저항성이 있는 유전자를 포함하는 pBR322(대장균에서 유래함, [볼리바(Bolivar) 등,Gene,2:95 (1977)] 참조)이다. 제한효소로 벡터를 자르고 탈인산화하였다. 그 후에, PCR에 의해 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션시켰다. 바람직하게는 벡터가 항생제 저항성이 있는 유전자, trp 프로모터, 폴리히스 리더(처음 6개의 STⅡ 코돈, 폴리히스 서열 및 엔테로키나아제 절단 부위 포함), 특정 PRO 폴리펩티드 코딩 영역, 람다 전사 종결자 및 argU 유전자를 암호화하는 서열을 포함하였다.
그 후에, 결합 혼합물을 사용하고 샘부르크 등의 상기 문헌에 개시된 방법을 이용하여 선택된 대장균 균주를 형질전환시켰다. LB 플레이트 상의 그의 생존 능력에 의해 형질전환체를 확인한 후에, 항생제 저항성 콜로니를 선택하였다. 제한 분석 및 DNA 서열 분석에 의해 플라스미드 DNA를 단리하고 확인하였다.
선택된 콜로니를 액체 배지, 예를 들면 항생제를 첨가한 LB 액체 배지에 밤새 배양하였다. 그 후에, 밤새 배양한 것을 사용하여 큰 규모의 배양에 접종할 수 있었다. 그 후에, 세포를 원하는 광밀도로 배양하였고, 이 기간 동안 발현 프로모터를 작동시켰다.
여러 시간 동안 세포를 배양한 후에, 원심분리하여 세포를 수획할 수 있었다. 당업계에 공지된 여러 가지 제제를 사용하여 원심분리에 의해 수득된 세포 펠릿을 용해시킨 후에, 단백질을 단단히 결합시키는 조건 하에 금속 킬레이트 컬럼을 이용하여 용해된 PRO 폴리펩티드를 정제하였다.
하기 방법을 이용하여 폴리-히스 표지 형태의 PRO241을 대장균에서 잘 발현시켰다. 먼저, 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 PRO241을 암호화하는 DNA를 증폭시켰다. 이 프라이머는 선택된 발현 벡터의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위 및 효과적이고 정확한 번역 개시, 금속 킬레이트화 컬럼 상의 급속 정제 및 엔테로키나아제로 단백질 분해 제거를 공급하는 다른 유용한 서열에 상응하는 제한 효소 부위를 포함한다. 그 후에, 발현 벡터에 PCR 증폭물 및 폴리-히스 표지 서열을 결합시켰고, 이를 사용하여 균주 52 기재(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))의 대장균 숙주를 형질전환시켰다. 먼저, 형질전환체를 진탕하면서 30℃에서 50mg/ml 카르베니실린을 포함하는 LB 배지에서 배양하여 O.D.600이 3 내지 5까지 이르렀다. 그 후에, CRAP 배지(3.57g (NH4)2SO4, 0.71g 시트르산나트륨·2H20, 1.07g KCl, 5.36g Difco 효모 추출물, 물 500mL 중의 Sheffield hycase SF 5.36g 뿐만 아니라 110mM MPOS(pH 7.3), 0.55% (중량/부피) 포도당 및 7mM MgSO4를 혼합하여 제조함)에 50 내지 100배로 배양물을 희석시켰다. 샘플을 채취하여 SDS-PAGE 분석에 의해 발현을 확인하고, 이 배양물을 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. 정제 및 재폴딩 실험시까지 세포 펠릿을 동결시켰다.
7M 구아니딘, 20mM Tris(pH 8) 완충액 10 볼륨(w/v)에 0.5 내지 1L 배양물(6 내지 10g 펠릿)의 대장균 페이스트를 재현탁시켰다. 고형 아황산나트륨 및 테트라티온산나트륨을 가하여 최종 농도가 각각 0.1M 내지 0.02M이 되도록 하고, 이 용액을 4℃에서 밤새 교반시켰다. 그 결과, 술피톨리화에 의해 차단된 시스테인 잔기를 가진 변성된 단백질이 나타났다. 베크만 초원심분리기로 30분 동안 40,000rpm에서 상기 용액을 원심분리시켰다. 상층액을 3 내지 5 볼륨의 금속 킬레이트 컬럼 완충액(6M 구아니딘, 20mM Tris(pH 7.4))으로 희석하고 0.22㎛ 필터를 통해 투명하게 여과시켰다. 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형을 이룬 퀴아젠(Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼 5ml에 투명한 추출물을 로딩하였다. pH 7.4인 50mM 이미다졸(칼바이오켐, Utrol 등급)을 포함하는 추가 완충액으로 컬럼을 세척하였다. 250mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 이 단백질을 용출시켰다. 원하는 단백질을 포함하는 분획을 모아 4℃에서 동결시켰다. 이 단백질의 아미노산 서열을 기초로 계산된 흡광 계수를 이용하여 280nm에서의 그의 흡광도에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 20mM Tris(pH 8.6), 0.3M NaCl, 2.5M 요소, 5mM 시스테인, 20mM 글리신 및 1mM EDTA로 이루어진 새로 제조한 재폴딩 완충액에 샘플을 천천히 희석하여 상기 단백질을 재폴딩시켰다. 최종 단백질 농도가 50 내지 100㎍/ml이 되도록 재폴딩 부피를 선택하였다. 4℃에서 12 내지 36시간 동안 재폴딩 용액을 천천히 교반하였다. 최종 농도 0.4%(pH 약 3)의 TFA를 가하여 반응을 끝냈다. 상기 단백질의 추가 정제 전에, 상기 용액을 0.22㎛ 필터로 여과하고 아세토니트릴을 가하여 최종 농도가 2 내지 10%가 되게 하였다. 0.1% TFA의 이동상 완충액을 사용하고 10 내지 80%의 아세토니트릴 농도 구배로 용출하는 포로스(Poros) R1/H 역상 컬럼을 통해 상기 재폴딩 단백질을 크로마토그래피하였다. A280흡광도가 측정된 분획의 일부를 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하고, 재폴딩된 균질의 단백질을수집하였다. 통상, 역상 수지와의 작용을 차단하는 소수성 내부를 가지고 매우 밀집되어있기 때문에 가장 낮은 아세토니트릴 농도에서 적당히 재폴딩된 대부분의 단백질 종이 용출된다. 일반적으로 높은 아세토니트릴 농도에서는 집합체를 이루는 종이 용출된다. 잘못 폴딩된 단백질 형태를 원하는 형태에서 분리하는 것 외에도, 역상 단계에서는 시료로부터 내독소를 제거하였다.
원하는 폴딩 단백질 PRO241을 포함하는 분획을 수집하고 상기 용액에 질소의 완만한 흐름을 이용하여 아세토니트릴을 제거하였다. 투석 또는 제제화 완충액 중에 평형을 이루고 멸균 여과된 G25 슈퍼파인(Superfine)(Pharmacia) 수지를 이용한 겔 여과에 의해 0.14M 염화나트륨 및 4% 만니톨을 갖는 pH 6.8의 20mM Hepes 중에 단백질을 제제화하였다.
<실시예 21>: 포유류 세포에서 PRO 폴리펩티드의 발현
본 실시예는 원하는 PRO 폴리펩티드의 글리코실화된 형태를 포유류 세포의 재조합 발현에 의해 제조하는 방법에 관한 설명이다.
발현 벡터로서 벡터 pRK5(1989년 3월 15일 출원된 유럽 특허 제307,247호 참조)를 사용하였다. 임의로, 선택된 제한효소를 가지고 pRK5에 샘부르크(Sambrook) 등의 상기 문헌에 개시된 것과 같은 라이게이션을 이용하여 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 삽입하였다. 이렇게 생성된 벡터를 pRK5-PRO 폴리펩티드라 칭하였다.
한 실시양태에서, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 예를 들면, 송아지 태아 혈청 및 경우에 따라 영양 성분 및(또는) 항생제를 보충한 DMEM 배지의조직 배양 플레이트에 인간 293 세포(ATCC CCL 1573호)를 플레이트 가득 배양하였다. 약 10㎍의 pRK5-PRO 폴리펩티드 DNA를 VA RNA 유전자([팀마파야(Thimmappaya) 등,Cell,31:543(1982)])를 암호화하는 약 1㎍의 DNA와 혼합하고 1mM의 Tris-HCl, 0.1mM EDTA, 0.227M CaCl2중에 용해시켰다. 상기 혼합물에 500㎕의 50mM HEPES (pH 7.35), 280mM NaCl, 1.5mM NaPO4를 적가하여 25℃에서 10분 동안 침전물을 형성시켰다. 이 침전물을 현탁시키고 293 세포에 가하여 37℃에서 약 4시간 동안 가라앉도록 하였다. 배지를 제거하고 PBS 중의 20% 글리세롤 2ml을 30초 동안 가하였다. 그 후에, 혈청 없는 배지를 가지고 293 세포를 세척하고 새 배지를 첨가한 후에, 약 5일 동안 세포를 배양하였다.
형질감염 약 24시간 후에, 상기 배지를 제거하고 배양용 배지(단독) 또는 200μCi/ml35S-시스테인 및 200μCi/ml35S-메티오닌을 포함하는 배양용 배지를 넣어주었다. 12시간 배양 후, 조절된 배지를 수획하고 회전 필터로 농축하여 15% SDS 겔 상에 로딩하였다. 상기 겔을 건조시키고 일정 기간 동안 필름에 노출시켜 PRO 폴리펩티드가 존재함을 알아냈다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양물을 추가로 배양하고 선택된 생물분석으로 배지를 시험하였다.
다른 기술로, 문헌[솜파리락(Somparyrac) 등,Proc. Natl. Acad. Sci 12:7575 (1981)])에 개시된 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PRO 폴리펩티드를 293 세포에 일시적으로 도입할 수 있었다. 회전 플라스크 중에 최대 밀도로 293 세포를 배양하고 700㎍ pRK5-PRO 폴리펩티드 DNA를 가하였다. 먼저, 원심분리에의해 이 세포를 회전 플라스크에서 농축하고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 세포 펠릿에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포를 90초 동안 20% 글리세롤로 처리하고 조직 배양용 배지로 세척 후, 조직 배양용 배지, 5㎍/ml의 소 인슐린 및 0.1㎍/ml 소 트랜스페린을 포함하는 회전 플라스크에서 다시 배양하였다. 약 4일 후에, 조절된 배지를 원심분리 및 여과하여 세포 및 찌꺼기를 제거하였다. 그 후에, 발현된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 농축하고 임의의 선택된 방법, 예를 들면 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
다른 실시양태에서, CHO 세포에서 PRO 폴리펩티드를 발현시킬 수 있었다. CaPO4또는 DEAE-덱스트란과 같은 공지된 시약을 사용하여 CHO 세포로 pRK5-PRO 폴리펩티드 DNA를 형질감염시킬 수 있었다. 상기 기재된 바와 같이, 세포 배양물을 배양하고 배양용 배지(단독) 또는35S-메티오닌과 같은 방사능표지를 포함하는 배지로 대체하였다. PRO 폴리펩티드의 존재를 측정한 후에, 혈청 없는 배지로 배양용 배지를 대체할 수 있었다. 바람직하게는, 6일 동안 배양물을 배양한 후에, 조절된 배지를 수획하였다. 그 후에, 발현된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 배지를 임의의 선택된 방법으로 농축하고 정제하였다.
또한, 숙주 CHO 세포 중에 에피토프 태그된 PRO 폴리펩티드를 발현시킬 수 있었다. pRK5 벡터에서 PRO 폴리펩티드를 서브클로닝하였다. PCR을 수행하여 베큘로바이러스 발현 벡터에 폴리-히스 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 서브클론 삽입체를 동일한 프레임에 융합시켰다. 그 후에, 선택 마커, 예를 들면 안정한 클론을 선택하는 DHFR을 포함하는 SV40에서 유래한 벡터에 폴리-히스 태그 PRO 폴리펩티드 삽입체를 서브클로닝하였다.
결국, SV40에서 유래한 벡터로 CHO 세포를 형질감염시켰다. 상기 기재된 바와 같이 표지를 이용하여 발현을 확인하였다. 그 후에, 임의의 선택된 방법, 예를 들면 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피에 의해 발현된 폴리-히스 태그 PRO 폴리펩티드를 포함하는 배양용 배지를 농축하고 정제하였다.
일시적이면서 안정한 발현 방법에 의해 CHO 세포 중에 PRO241을 발현시켰다. 또한, CHO 세포 중에 PRO243, PRO323 및 PRO233을 일시적으로 잘 발현시켰다.
하기 방법을 이용하여 CHO 세포에서 안정하게 발현시켰다. IgG 면역어드히신(immunoadhesin)과 같은 단백질이 발현되었고, 여기서 용해가능한 형태(세포외 도메인)의 코딩 서열은 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1의 불변부 서열에 융합되고(되거나) 폴리-히스 태그 형태이었다.
PCR 증폭 후에, 문헌[오수벨(Ausuble) 등,Current Protocols of Molecular Biology,Unit 3.16, John Wiley 및 Sons(1997)]에 개시된 바와 같은 표준 기술을 이용하여 CHO 발현 벡터 중에 각 DNA를 서브클로닝하였다. cDNA의 편리한 셔틀링을 가능케 하는 관심있는 DNA의 5' 및 3'의 호환성 제한 부위를 갖는 CHO 발현 벡터를 만들었다. CHO 세포의 발현에 사용되는 벡터는 문헌[루카스(Lucas) 등,Nucl. Acids Res.24:9(1774-1779)(1996)]에 개시되어 있고 SV40 초기 프로모터 및 인핸서를 사용하여 관심있는 cDNA 및 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 발현시켰다. DHFR 발현으로 형질감염 후, 플라스미드를 안정하게 유지하는 세포의 선택이 가능하였다.
시판되는 형질감염 시약, 예를 들면 슈퍼펙트(Superfect)(Quiagen), 도스퍼 (Dosper) 또는 퓨진(Fugene)(Boehringer Mannheim)을 사용하여 거의 천만개 CHO 세포에 원하는 플라스미드 DNA 12㎍을 도입하였다. 루카스(Lucas) 등의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 세포를 배양하였다. 하기 기재된 바와 같은 추가의 배양 및 생산을 위해 앰플 중에 약 3 x 10-7세포를 동결시켰다.
수조에 놓아 플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 해빙시키고 볼텍싱으로 혼합하였다. 배지 10mL을 포함하는 원심분리 튜브 중에 상기 혼합물을 넣고 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 10mL의 선별 배지(5% 0.2㎛ 통과하여 여과된 송아지 태아 혈청을 갖는 0.2㎛ 여과된 PS20)에 재현탁시켰다. 그 후에, 90mL 선별 배지를 포함하는 100mL 회전 플라스크 중에 세포를 나누어 넣었다. 1 내지 2일 후에, 150mL 선별 배지로 채워진 250mL 회전 플라스크에 세포를 옮기고 37℃에서 배양하였다. 2 내지 3일 후에, 250mL, 500mL 및 2000mL 회전 플라스크에 3 x 105세포/ml을 접종하였다. 원심분리하여 상기 세포 배지를 새 배지로 교환하고 생산 배지 중에 재현탁하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수도 있지만, 실제로는 1992년 6월 16일에 출원된 미국 특허 제5,122,469호에 개시된 생산 배지를 사용하였다. 1.2 x 106세포/ml을 3L 생산 회전 플라스크에 접종하였다. 0일째, 세포의 pH를 측정하였다. 1 일째, 회전 플라스크 1개를 선택하고 여과된 공기를 살포하였다. 2일째, 회전 플라스크를 선택하고 온도를 33℃로 전환하여 30mL의 500g/L 포도당 및 0.6mL의 10% 포말제거제(예를 들면, 35% 폴리디메틸실록산 에멀젼, 다우 코닝(Dow Corning) 365 메디칼 그레이드 에멀젼). 폴리펩티드를 생산하는 동안 pH를 조절하여 7.2 부근으로 맞추었다. 10일 후에, 또는 생존력이 70%이하로 떨어질 때까지, 원심분리 및 0.22㎛ 필터로 여과하여 세포 배양물을 수획하였다. 여액을 4℃에 보관하거나 또는 바로 정제용 컬럼에 로딩하였다.
폴리-히스 태그된 단백질은 Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 정제하기 전에, 조절된 배지에 5mM의 농도로 이미다졸을 가하였다. 4℃에서 분당 4 내지 5ml의 유속으로, 0.3M NaCl 및 5mM 이미다졸을 포함하는 완충액인 pH 7.4의 20mM Hepes로 평형을 이룬 6ml Ni-NTA 컬럼에 조절된 배지를 넣어주었다. 로딩 후에, 부가의 평형 완충액으로 컬럼을 세척하고 0.25M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 그 후에, 25ml G25 슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼을 가지고 10mM Hepes, 0.14M NaCl 및 4% 만니톨(pH 6.8)을 포함하는 저장 완충액으로 상기 고도로 정제된 단백질을 탈염하고 -80℃에 보관하였다.
하기 조절된 배지로부터 면역어드히신(Fc 포함)을 정제하였다. 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)과 평형을 이루는 5ml의 단백질 A 컬럼(Pharmacia)에 조절된 배지를 넣어주었다. 로딩 후에, 평형 완충액으로 전체를 세척하고 100mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 275mL의 1M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1ml 분획을 수집하여 용출 단백질을 즉시 중화시켰다. 그 후에, 상기 기재된 폴리-히스 태그된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액에 고도로 정제된 단백질을 탈염하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 에드만(Edman) 분해에 의한 N-말단 서열 분석으로 균질성을 평가하였다.
또한, COS 세포 중에 PRO241, PRO243, PRO299, PRO323, PRO327, PRO233, PRO344, PRO347, PRO354, PRO355, PRO357, PRO353, PRO361 및 PRO365을 일시적으로 발현시켰다.
<실시예 22>: 효모에서 PRO 폴리펩티드의 발현
하기에는 원하는 PRO 폴리펩티드를 효모에서 재조합 발현시키는 방법이 기재되어 있다.
먼저, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO 폴리펩티드의 세포 내부 생산 또는 분비를 위해 효모 발현 벡터를 만들었다. 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 PRO 폴리펩티드의 세포 내부 발현을 지시하도록 원하는 PRO 폴리펩티드, 선택된 신호 서열 및 프로모터를 암호화하는 DNA를 끼워 넣었다. 분비용으로는, 발현을 위해 선택된 플라스미드 중에 ADH2/GAPDH 프로모터, 효모 알파-인자 분비 신호와 리더 서열 및 링커 서열(필요시)을 암호화하는 DNA와 함께 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 클로닝할 수 있었다.
그 후에, 상기 기재된 발현 플라스미드를 가지고 효모 균주 AB110와 같은 효모 세포를 형질전환시키고 선택 발효 배지 중에 배양하였다. 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE에 의해 분리시킨 후에, 쿠마시 블루 염색으로 겔을 염색하여 형질전환된 효모의 상층액을 분석할 수 있었다.
그 후에, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 분리하여 재조합PRO 폴리펩티드를 단리 및 정제한 후, 선택 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켰다. 또한, 선택 컬럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 이 PRO 폴리펩티드를 포함하는 농축물을 정제할 수 있었다.
<실시예 23>: 베큘로바이러스에 감염된 곤충 세포에서 PRO 폴리펩티드의 발현
하기에는 베큘로바이러스에 감염된 곤충 세포에서 PRO 폴리펩티드를 재조합 발현 시키는 방법이 기재되어 있다.
원하는 PRO 폴리펩티드가 베큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합되어 있다. 상기 에피토프 태그는 폴리-히스 태그(IgG의 Fc 영역과 유사)를 포함하였다. 시판되는 플라스미드, 예를 들면, pVL1393(Novagen)으로부터 유래한 플라스미드를 포함한 여러 가지 플라스미드를 사용할 수 있었다. 요컨데, PCR에 의해 5' 및 3' 지역에 상보적인 프라이머를 가지고 PRO 폴리펩티드 또는 PRO 폴리펩티드의 원하는 부분(예를 들면, 막통과 단백질의 세포외 도메인을 암호화하는 서열)을 증폭시켰다. 5' 프라이머는 합성되는(선택) 제한 효소 부위에 혼입될 수 있다. 그 후에, 상기 선택 제한 효소로 생성물을 자르고 발현 벡터 중에 서브클로닝하였다.
리포펙틴(GIBCO-BRL에서 시판함)을 이용하여Spodoptera frugiperda("Sf9")세포(ATCC CRL 1711호)에 상기 플라스미드 및 베큘로골드(BaculoGold, 등록상표) 바이러스 DNA(Phartingen)를 동시 형질감염시켜 재조합 베큘로바이러스를 생성하였다. 28℃에서 4 내지 5일 동안 배양 후에, 방출된 바이러스를 수획하여 추가로 증폭하는데 사용하였다. 레일리(O'Reilley)등의 문헌[Baculovirus expressionvectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 기재된 바와 같이 바이러스 감염 및 단백질 발현을 수행하였다.
그 후에, 예를 들면 하기 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피에 의해 발현된 폴리-히스 태그 PRO 폴리펩티드를 정제할 수 있었다. 문헌[루퍼트(Rupert) 등,Nature,362: 175-179 (1993)]에 개시된 바와 같이 재조합 바이러스에 감염된 Sf9 세포로부터 추출물을 제조할 수 있었다. 요컨대, Sf9 세포를 세척하고, 초음파처리 완충액(25mL Hepes(pH 7.9), 12.5mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.1% NP40 및 0.4M KCl)에 재현탁시켜 얼음 위에서 20초 동안 2회 초음파처리하였다. 원심분리에 의해 초음파처리한 것을 맑게 하고 로딩 완충액(50mM 인산염, 300mM NaCl, 10% 글리세롤(pH 7.8)) 중에 50배로 희석시켜 0.45㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 수지만의 부피 5mL로 Ni2+-NTA 아가로오스 컬럼(Qiagen에서 시판함)을 제조하고 25mL의 로딩 완충액으로 평형을 이루게 하였다. 분당 0.5mL로 여과된 세포 추출물을 컬럼에 로딩하였다. 로딩 완충액으로 기준선 A280까지 컬럼을 세척하고, 이 지점에서 분획 수집을 시작하였다. 다음에, 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시키는 두 번째 세척 완충액(50mM 인산염, 300mM NaCl, 10% 글리세롤(pH 6.0))으로 컬럼을 세척하였다. 다시 A280기준선에 도달한 후에, 두 번째 세척 완충액 중에 0 내지 500mM의 이미다졸 농도 구배로 컬럼을 처리하였다. SDS-PAGE 및 실버 염색(silver staining) 또는 웨스턴 블랏(western blot)에 의해 알칼라인 인산화효소에 결합된 Ni2+-NTA(Qiagen)를 가지고 1mL 분획을 수집 및 분석하였다. 용출된 His10-태그 PRO 폴리펩티드를 포함하는 분획을 수집하고 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
다른 경우에, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공지된 크로마토그래피 기술을 사용하여 IgG 태그(또는 Fc 태그) PRO 폴리펩티드의 정제를 수행하였다.
베큘로바이러스에 감염된 Sf9 곤충 세포에서 PRO241, PRO327 및 PRO344를 잘 발현시켰다. 실제로 0.5내지 2L 규모로 발현을 수행하였지만, 보다 큰 규모(예를 들면, 8L)로 용이하게 증가시켜 제조할 수 있었다. 상기 단백질은 IgG 구성물(면역어드히신)과 융합된 상태로 발현시켰는데, 여기서 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하고(하거나) 폴리-히스 태그 형태로 IgG1 불변부 서열을 세포외 단백질 영역에 융합시켰다.
베큘로바이러스에 감염된 Sf9 세포에서의 발현을 위해, PCR 증폭 후에, 베큘로바이러스 발현 벡터(IgG 융합용 pb.PH.IgG 및 폴리-히스 태그된 단백질 융합용 pb.PH.His.c)에 각 코딩 서열을 서브클로닝하고, 리포펙틴(Gibco BRL)을 사용하여 105Spodoptera fugiperda("Sf9") 세포(ATCC CRL 1711호)에 상기 벡터 및 베큘로골드(등록상표) 베큘로바이러스 DNA(Pharmingen)를 동시에 형질전환하였다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His는 시판되는 베큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393(Pharmingen)의 변형체로서, 변형된 폴리링커 지역은 His 또는 Fc 태그 서열을 포함하고 있다. 10% FBS(Hyclone)가 제공되는 힝크(Hink's) TNM-FH 배지에서 세포를 배양하였다. 28℃에서 5일 동안 세포를 배양하였다. 상층액을 수획하고, 이어서 10% FBS가 제공되는 힝크 TNM-FH 배지의 세포를 감염 다중성(multiplicity of infection, MOI) 10으로 감염시켜 1차 바이러스 증복에 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 히스티딘 태그된 단백질은 Ni-NTA 비드(QIAGEN) 25mL로, IgG 태그된 단백질은 단백질-A 세파로스 CL4B 비드(Pharmacia) 25mL로 상층액 1ml을 배치 결합시켜 베큘로바이러스 발현 벡터의 구성물의 발현을 측정한 후에, SDS-PAGE 분석에 이은 쿠마시 블루 염색에 의해 공지된 농도의 표준 단백질과 비교하였다.
1차로 바이러스 증폭된 상층액을 사용하여 약 0.1 MOI로 ESF-921 배지(Expression Systems LLC)에서 배양한 Sf9 세포의 회전 플라스크 배양물(500ml)을 감염시켰다. 28℃에서 3일 동안 세포를 배양하였다. 상층액을 수획 및 여과하였다. 필요시에는 회전 플라스크 배양물의 발현이 확인될 때까지 배치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 반복하였다.
형질감염 세포(0.5 내지 3L)로부터 상기 조절된 배지를 원심분리에 의해 수획하여 세포를 제거하고 0.22㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-히스 태그된 구성물용으로, Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 사용하여 상기 단백질 구성물을 정제하였다. 정제하기 전에, 조절된 배지에 5mM 농도의 이미다졸을 가하였다. 4℃에서 분당 4 내지 5ml의 유속으로 0.3NaCl 및 5mM 이미다졸을 포함하는 완충액인 pH 7.4의 20mM Hepes와 평형을 이루는 6ml Ni-NTA 컬럼에 조절된 배지를 넣어주었다. 로딩 후에, 부가의평형 완충액으로 컬럼을 세척하고 0.25M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출시켰다. 그 후에, 25ml G25 슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼으로 10mM Hepes, 0.14M NaCl 및 4% 만니톨을 포함하는 저장 완충액(pH 6.8)으로 고도로 정제된 단백질을 탈염하고 -80℃에서 보관하였다.
면역어드히신(Fc 포함) 단백질 구성물을 하기와 같이 조절된 배지로부터 정제하였다. pH 6.8인 20mM 인산나트륨 완충액 중에 평형에 도달한 5mL 단백질 A 컬럼(Pharmacia)에 넣어주었다. 로딩 후에, 평형 완충액으로 컬럼을 모두 세척하고 pH 3.5의 시트르산 100mM로 용출하였다. pH 9의 1M Tris 완충액 275mL를 포함하는 튜브에 분획 1ml을 수집하여 용출 단백질을 즉시 중화시켰다. 그 후에, 상기 기재된 폴리-히스 태그된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액으로 고도로 정제된 단백질을 탈염하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔(PEG) 전기영동에 의해 단백질의 균질성을 확인하고 에드만(Edman) 분해에 의해 N-말단 아미노산 서열 분석을 하였다.
베큘로바이러스에 감염된 Hi5 곤충 세포에서 PRO241, PRO327 및 PRO344를 잘 발현시켰다. 실제로 0.5내지 2L 규모로 발현을 수행하였지만, 보다 큰 규모(예를 들면, 8L)로 용이하게 증가시켜 제조할 수 있었다.
베큘로바이러스에 감염된 Hi5 곤충 세포에서의 발현용으로, 적합한 시스템(예를 들면, Pfu(Stratagene) 또는 베큘로바이러스 발현 벡터의 5' 상류에 에피토프 태그가 융합된 시스템)으로 PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 증폭시켰다. 상기 에피토프 태그는 폴리-히스 태그 및 이뮤노글로불린 태그(IgG의 Fc 영역과 유사함)를 포함하였다. pVL1393(Novagen)과 같은 시판되는 플라스미드로부터 유래한 플라스미드를 포함하는 여러 가지 플라스미드를 사용할 수 있었다. 요컨데, PCR에 의해 5' 및 3' 지역에 상보적인 프라이머를 가지고 PRO 폴리펩티드 또는 PRO 폴리펩티드의 원하는 부분(예를 들면, 막통과 단백질의 세포외 도메인을 암호화하는 서열)을 증폭시켰다. 5' 프라이머는 합성되는(선택) 제한 효소 부위에 혼입될 수 있다. 그 후에, 상기 선택 제한 효소로 생성물을 자르고 발현 벡터 중에 서브클로닝하였다. 예를 들면, pVL1393의 유도체는 인간 IgG의 Fc 지역(pb.PH.IgG) 또는 NAME 서열 3' 하류의 8 히스티딘(pb.PH.His)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 서열 확인을 위해 벡터 구성물을 서열 분석하였다.
27℃의 온도, CO2가 없고, 펜/스트렙(pen/strep) 조건 하에서 플레이트의 50%까지 Hi5 세포를 배양하였다. 각 150mm 플레이트에 1ml Ex-Cell 배지(배지: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences #14401-78P(주의: 상기 배지는 빛에 민감함))에 PRO 폴리펩티드를 포함하는 pIE 기초의 벡터 30ug을 혼합하였고, 별도의 튜브에 1ml의 엑스-셀(Ex-Cell) 배지에 셀펙틴(CellFECTIN, GibcoBRL #10362-010)(볼텍스로 혼합)) 100㎕를 혼합하였다. 상기 두 용액을 혼합하여 상온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. DNA 및 CellFECTIN 혼합물 2ml에 엑스-셀 배지 8ml을 가하고, 엑스-셀 배지로 1회 세척한 Hi5 세포에 상기 혼합물을 올려놓았다. 그 후에, 상온에서 1시간 동안 어두운 상태로 배양하였다. 그 후에, DNA/셀펙틴(CellFECTIN) 혼합물을 제거하고 Ex-Cell로 1회 세포를 세척하여 과량의 셀펙틴을 제거하였다. 새로운 엑스-셀 배지 30ml을 가하고 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 수획하고, 히스티딘 태그된 단백질은 Ni-NTA 비드(QIAGEN) 25mL로, IgG 태그된 단백질은 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드(Pharmacia) 25mL로 상층액 1ml을 배치 결합시켜 베큘로바이러스 발현 벡터의 구성물의 발현을 측정한 후에, SDS-PAGE 분석에 이은 쿠마시 블루 염색에 의해 공지된 농도의 표준 단백질과 비교하였다.
형질감염 세포(0.5 내지 3L)로부터 상기 조절된 배지를 원심분리에 의해 수획하여 세포를 제거하고 0.22㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-히스 태그된 구성물용으로, Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 사용하여 상기 단백질 구성물을 정제하였다. 정제하기 전에, 조절된 배지에 5mM 농도의 이미다졸을 가하였다. 4℃에서 분당 4 내지 5ml의 유속으로 0.3NaCl 및 5mM 이미다졸을 포함하는 완충액인 pH 7.4의 20mM Hepes와 평형을 이루는 6ml Ni-NTA 컬럼에 조절된 배지를 넣어주었다. 로딩 후에, 부가의 평형 완충액으로 컬럼을 세척하고 0.25M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출시켰다. 그 후에, 25ml G25 슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼으로 10mM Hepes, 0.14M NaCl 및 4% 만니톨을 포함하는 저장 완충액(pH 6.8)으로 고도로 정제된 단백질을 탈염하고 -80℃에서 보관하였다.
면역어드히신(Fc 포함) 단백질 구성물을 하기와 같이 조절된 배지로부터 정제하였다. pH 6.8인 20mM 인산나트륨 완충액 중에 평형에 도달한 5mL 단백질 A 컬럼(Pharmacia)에 넣어주었다. 로딩 후에, 평형 완충액으로 컬럼을 모두 세척하고 pH 3.5의 시트르산 100mM로 용출하였다. pH 9의 1M Tris 완충액 275mL를 포함하는 튜브에 분획 1ml을 수집하여 용출 단백질을 즉시 중화시켰다. 그 후에, 상기 기재된 폴리-히스 태그된 단백질의 경우와 같이 저장 완충액으로 고도로 정제된 단백질을 탈염하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔(PEG) 전기영동에 의해 단백질의 균질성을 확인하고 에드만(Edman) 분해에 의해 N-말단 아미노산 서열 분석을 하였다.
<실시예 24>: PRO 폴리펩티드에 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 PRO 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 제조에 관한 설명이다.
단일클론 항체 제조 기술은 당업계에 공지되고 고딩(Goding)의 상기 문헌에 개시되어 있다. 사용될 수 있는 면역원은 정제된 PRO 폴리펩티드, PRO 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 세포 표면 상에 재조합 PRO 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 포함한다. 당업계 숙련자는 별다른 실험없이 면역원을 선택할 수 있었다.
완전한 프로인트의 면역보강제 중에 에멀젼화된 PRO 폴리펩티드 면역원을 1 내지 100㎍ 양으로 피하적으로 또는 복강내로 주사하여 Balb/c와 같은 생쥐를 면역화시켰다. 또한, 생쥐 족후부 패드 내로 MPL-TDM 면역보강제(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) 중에 에멀젼화된 면역원을 주사하였다. 10 내지 12일 후에, 선택 면역보강제 중에 에멀젼화된 부가의 면역원으로 상기 면역화된 생쥐의 면역을 증강시켰다. 이후, 몇주 동안, 추가 면역제 삽입으로 생쥐의 면역을 증강시킬 수 있었다. 항-PRO 폴리펩티드 항체를 검출하는 ELISA 분석법으로 시험하는 동안 레트로-오르비탈 블리딩(retro-orbital bleeding)에 의해 생쥐로부터 혈청 샘플을 주기적으로 얻을 수 있었다.
적합한 항체 적정 농도의 검출 후에, 항체가 "양성"인 동물에는 최종 정맥 주사로 PRO 폴리펩티드를 주사하였다. 3 내지 4일 후에, 생쥐를 도살하여 비장 세포를 수획하였다. 그 후에, 선택적인 쥐과 골수 세포주(예를 들면, ATCC CRL 1597호로부터 입수가능한 P3X63AgU.1)에 비장 세포를 융합시켰다(35% 폴리에틸렌 글리콜을 사용함). 상기 융합으로 생성된 하이브리도마 세포를 미융합 세포, 골수 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 분열을 억제하는 HAT배지(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘)를 들어있는 96 웰 조직 배양 플레이트에 접종하였다.
PRO 폴리펩티드에 대한 하이브리도마 세포의 활성은 ELISA로 스크린하였다. PRO 폴리펩티드에 대한 원하는 단일클론 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포의 결정은 당업계 기술 범위 내에 있다.
유전적으로 동계의 Balb/c 생쥐의 복강내로 양성 하이브리도마 세포를 주입하여 항-PRO 폴리펩티드 단일클론 항체를 포함하는 복수가 나타났다. 다른 방법으로, 조직 배양 플라스크 또는 롤러 보틀(roller bottle)에서 하이브리도마 세포를 배양하였다. 황산암모늄 침전으로 복수에서 생산된 단일클론 항체를 정제하고 겔 배제 크로마토그래피하였다. 또한, 단백질 A 또는 단백질 G에 항체를 결합시키는 친화 크로마토그래피를 사용할 수도 있다.
<실시예 25>: 키메라 PRO 폴리펩티드
단백질 정제를 촉진시키도록 가한 1개 이상의 추가 폴리펩티드 도메인을 갖는 키메라 단백질로서 PRO 폴리펩티드를 발현시켰다. 상기 정제 촉진 도메인은 금속 킬레이트 펩티드, 예를 들면, 부동성 금속 상에 정제가능한 히스티딘-트립토판 모듈, 부동성 면역글로불린으로 정제가능한 단백질 A 도메인 및 플래그스(등록상표)(FLAGSTM) 신장 및 친화 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle Wash.)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. PRO 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 발현을 촉진시키는데 절단가능한 링커 서열, 예를 들면, 정제 도메인 및 폴리펩티드 서열 사이의 인자 XA(Factor XA) 또는 엔테로키나아제(Invitrogen, San Diego Calif.)가 유용할 수도 있었다.
<실시예 26>: 특이적 항체를 이용하는 PRO 폴리펩티드의 정제
단백질 정제 분야의 여러 가지 표준 기술로 천연 또는 재조합 PRO 폴리펩티드를 정제할 수 있었다. 예를 들면, 관심있는 PRO 폴리펩티드에 특정한 항체를 사용하는 면역친화 크로마토그래피에 의해 pro-PRO 폴리펩티드, 성숙 PRO 폴리펩티드 또는 pre-PRO 폴리펩티드를 정제하였다. 일반적으로, 항-PRO 폴리펩티드 항체를 활성 크로마토그래피 수지에 공유 결합시켜 면역활성 컬럼을 만들었다.
황산암모늄으로 침전시키거나 또는 비고정 단백질 A 상에 정제하여 면역 혈청으로부터 다중클론 면역글로불린을 제조하였다(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). 유사하게, 황산암모늄 침전 또는 단백질 A 상에 크로마토그래피하여 생쥐 골수종으로부터 단일클론 항체를 제조하였다. 크로마토그래피 수지, 예를 들면, CnBr-활성화 세파로오스(등록상표)(SEPHAROSETM)(Pharmacia LKB Biotechnology)에 부분 정제된 면역글로불린을 공유적으로 부착시켰다. 제조자의 지시에 따라, 이 항체를 수지에 결합시키고 수지를 차단하여 유도체 수지를 세척하였다.
가용성 형태의 PRO 폴리펩티드를 포함하는 세포로부터 분획을 제조하여 PRO 폴리펩티드를 정제하는데 상기 면역친화성 컬럼을 이용하였다. 계면활성제 첨가에 의한 분별 원심분리 또는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 전체 세포 또는 아세포 분획을 용해하여 상기 제법을 유도하였다. 다른 방법으로, 세포를 배양하는 배지에 신호 서열을 포함하는 유용한 양의 가용성 PRO 폴리펩티드를 분비할 수 있다.
면역친화성 컬럼에 가용성 PRO 폴리펩티드를 포함하는 제제를 통과시키고 PRO 폴리펩티드의 바람직한 흡광 조건에서 컬럼을 세척하였다(예를 들면, 계면활성제 존재하에 고도의 강한 이온성 완충액). 그 후에, 항체와 PRO 폴리펩티드 결합을 파괴하는 조건(약 pH 2 내지 3과 같은 낮은 pH 완충액, 또는 요소 또는 티오시아네이트 이온과 같은 카오트롭)하에서 컬럼을 용출시키고 PRO 폴리펩티드를 수집하였다.
<실시예 27>: 약물 스크리닝
본 발명은 여러 가지 약물 스크리닝 기술 중 임의로 PRO 폴리펩티드를 이용하거나 또는 그의 단편을 결합하여 화합물을 스크리닝하는데 특히 유용하였다. 상기 시험에 사용된 PRO 폴리펩티드 또는 그 단편은 용액 중 유리되거나 고체 지지체에 고정시키거나 세포 표면에 포함시키거나 세포 내부에 위치시킬 수 있었다. 약물 스크리닝의 한 방법은 PRO 폴리펩티드 또는 단편을 발현시키는 재조합 핵산으로 형질전환시킨 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용하였다. 경쟁 결합 분석으로 형질전환 세포에 대해 약물을 스크리닝하였다. 활동성 또는 고정 형태로 표준 결합 분석에 상기 세포를 이용하였다. PRO 폴리펩티드 또는 단편 사이의 복합체 형성을측정하고 제제를 시험하였다. 다른 방법으로, 제제 시험으로 인해 PRO 폴리펩티드 및 그의 표적 세포 또는 표적 수용체 사이의 복합체 형성의 감소를 검사할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 약물 또는 PRO 폴리펩티드 관련 질병 또는 질환에 영향을 주는 임의의 다른 제제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 (ⅰ) 제제 및 PRO 폴리펩티드 또는 단편 사이 복합체의 존재하에 또는 (ⅱ) PRO 폴리펩티드 또는 단편 및 세포 사이 복합체의 존재하에 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 PRO 폴리펩티드 또는 그의 단편을 가지고 상기 제제를 접촉하거나 분석하는 것을 포함한다. 상기 경쟁 결합 분석 중에, PRO 폴리펩티드 또는 단편은 통상 표지된다. 적합한 배양 후에, 결합된 형태로 존재하는 유리 PRO 폴리펩티드 또는 단편을 분리하였고, 유리 또는 비복합체 표지의 양은 특별한 제제가 PRO 폴리펩티드에 결합하거나 PRO 폴리펩티드와 세포의 복합체를 저해하는 능력으로 측정하였다. 약물을 스크리닝하는 다른 방법은 폴리펩티드에 적합한 결합 친화성을 갖는 화합물의 고도의 스크리닝을 공급하고 1984년 9월 13일에 공개된 WO 84/03564호에 상세히 개시되어 있다. 요컨대, 고형 기재, 예를 들면 플라스틱 핀 또는 몇가지 다른 표면 상에 많은 수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 합성할 수 있었다. PRO 폴리펩티드에 적용한 바와 같이, 상기 펩티드 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드와 반응시키고 세척하였다. 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 결합된 PRO 폴리펩티드를 검출하였다. 또한, 상기 언급된 약물 스크리닝 기술로 정제 PRO 폴리펩티드를 직접 플레이트 상에 코팅하였다. 또한, 비-중화 항체를 사용하여 상기 펩티드를 포획하고 고체 지지체상에 고정시켰다.
또한, 본 발명은 PRO 폴리펩티드와 결합할 수 있는 중화 항체가 특히 PRO 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는 시험 화합물과 경쟁하는 경쟁 약물 스크리닝 분석의 용도에 관한 것이다. 상기 방식으로, 상기 항체를 사용하여 PRO 폴리펩티드와 1개 이상의 항원 결정자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출하였다.
<실시예 28>: 합리적인 약물 설계
합리적인 약물 설계의 목표는 관심있는 생물 활성 폴리펩티드 또는 그가 상호작용하는 작은 분자, 예를 들면 효능제, 길항제 또는 억제제의 구조적 유사체를 생성하는 것이었다. 상기 임의의 실시예를 이용하여 생체내 PRO 폴리펩티드의 보다 더 활성이 있거나 또는 안정한 형태의 약물을 만들 수 있었고 또는 PRO 폴리펩티드의 기능을 강화하거나 또는 저해하는 약물을 만들 수 있었다([허지슨(Hodgson)Bio/Technology,9: 19-21(1991)] 참조).
한 연구에서는, x-선 크리스탈로그래피, 컴퓨터 모델링 또는 통상 두 조사법을 조합하여 PRO 폴리펩티드 또는 PRO 폴리펩티드-억제제 복합체의 3차원 구조를 결정하였다. PRO 폴리펩티드의 형태 및 전하를 확인하여 그 구조를 설명하고 상기 분자의 활성 부위를 결정하였다. 자주는 아니지만, 단백질 상동체의 구조를 기초로 모델링에 의해 PRO 폴리펩티드의 구조에 대한 유용한 정보를 얻을 수 있었다. 두 경우 모두, 관련된 구조 정보를 이용하여 유사한 PRO 폴리펩티드 유사 분자를 설계하고 효과적인 억제제를 확인하였다. 합리적인 약물 설계에 대한 유용한 실시예는 문헌 [브랙스톤(Braxton) 및 웰스(Wells),Biochemistry, 31:7796-7801(1992)]에 나타난 바와 같이 개선된 활성 및 안정성을 가지거나 또는 문헌 [아타우다(Athauda) 등,J. Biochem.,113:742-746 (1993)]에 나타난 바와 같이 고유 펩티드의 억제제, 효능제 또는 길항제로 작용하는 분자를 포함할 수 있었다.
또한 상기 기재된 바와 같이, 기능 분석에 의해 선택된 표적-특이적 항체를 단리하여 그의 결정 구조를 해석하는 것도 가능하였다. 주로, 본 연구는 일련의 약물 설계를 기초로 제약코어를 산출하였다. 항-유전자형 항체(anti-ids)를 기능성 제약 활성 항체로 생성시켜 단백질 크리스탈로그래피를 우회하는 것이 가능하였다. 거울상의 거울상으로서, 항-유전자형 항체의 결합 부위는 원래 수용체와 유사한 것으로 생각되었다. 그 후에, 항-유전자형 항체를 사용하여 화학적 또는 생물학적으로 생성된 펩티드의 뱅크로부터의 펩티드를 동정 및 단리하였다. 그 후에, 이 단리된 펩티드는 제약코어로 작용하였다.
본 발명에 의해, 충분한 양의 PRO 폴리펩티드를 제조하여 x-선 크리스탈로그래피와 같은 분석 연구를 수행할 수 있었다. 또한, 본 명세서에서 제공된 PRO 폴리펩티드 아미노산에 대한 지식은 x-선 크리스탈로그래피를 대신하거나 또는 부가하여 컴퓨터 모델링 기술을 이용하는 지침을 제공할 것이다.
<실시예 29>: 연골로부터 프로테오글리칸의 방출을 촉진하는 PRO241의 능력
하기와 같이 연골로부터 프로테오글리칸의 방출을 촉진하는 PRO241의 능력을 시험하였다. 4 내지 6개월된 피그(pig)의 중수수지 관절을 무균 절개하고, 밑의 뼈를 주의하여 피하면서 프리 핸드 슬라이싱(free hand slicing)에 의해 관절 연골을 제거하였다. 연골을 잘게 썰고 95% 대기 및 5% CO2의 분위기 하에, 0.1% BSA 및 100U/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신를 포함하는 혈청없는(SF) 배지 (DME/F12 1:1)에서 24시간 동안 대량으로 배양하였다. 세번 세척한 후에, 미세 튜브로 관절 연골 약 100mg을 정제하고 상기 SF 배지에 추가로 24시간 동안 배양하였다. 그 후에, 단독으로 또는 18ng/ml 인터루킨-1α와 함께 PRO241 폴리펩티드를 1%로 가하여 관절 조직으로부터 공지된 프로테오클리칸 촉진제가 방출되었다. 그 후에, 상층액을 수획하고 1,9-디메틸-메틸렌 블루(DMB) 색측정 분석을 이용하여 프로테오글리칸의 양을 분석하였다([판달(Farndale) 및 부틀(Buttle),Biochem. Biophys. Acta883:173-177 (1985)]). 이 분석 중에, 양성 반응은 시험 폴리펩티드가 예를 들면, 스포츠 관련 관절 문제, 관절 연골 결핍, 골관절염 또는 류마티스성 관절염 치료에 사용할 수 있음을 나타낸다.
상기 분석에 PRO241 폴리펩티드를 시험했을 때, 상기 폴리펩티드는 기본적으로 모두 연골 조직으로부터 프로테오글리칸의 방출을 촉진시키는 두드러진 능력이 있음이 증명되었고 인터루킨-1α로 촉진 후 및 치료 후 24 및 72시간에 PRO241 폴리펩티드는 연골조직으로부터 프로테오클리칸 방출을 촉진시키는데 유용함이 밝혀졌다.
<실시예 30>: 원래 위치에서의 혼성화
원래 위치에서의 혼성화는 세포 및 조직 표본 내의 핵산 서열을 탐지하고 위치를 파악하게 하는 강력한 다용도 기술이다. 예를 들면, 유전자 발현 부위 확인,전사의 조직 분포, 바이러스 감염 확인 및 위치 파악하는데 유용하므로 특정 mRNA 합성의 변화 및 염색체 지도 작성을 돕는데에도 유용할 수 있다.
PCR-생성33P-표지 리보프로브를 이용하여 문헌[루(Lu) 및 질레트(Gillett),Cell division1:169-176 (1994)]의 최적 버전의 프로토콜으로 원래 위치에서의 혼성화를 수행하였다. 요컨대, 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 묻힌 인간 조직을 절단하고, 파라핀을 제거 후, 37℃에서 15분 동안 단백질 분해효소 K로 단백질을 분해하고, 루(Lu) 및 질레트(Gillett)(1994)의 상기 문헌에 개시된 원래 위치에서의 혼성화로 추가 처리하였다. PCR 생성물로부터 [33P]-UTP로 표지된 안티센스 리보프로브를 생성하고 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 상기 슬라이드를 코닥(Kodak) NTB2 핵 트랙 에멀젼(nuclear track emulsion) 중에 담그고 4주 동안 노출시켰다.
33P-리보프로브 합성
6.0㎕ (125mCi)의33P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000Ci/mmol)을 고속 진공 건조시켰다. 건조33P-UTP를포함하는 각 튜브에, 하기 성분을 가하였다.
2.0㎕ 5x 전사 완충액
1.0㎕ DTT (100mM)
2.0㎕ NTP 혼합물 (2.5mM: 10mM GTP, CTP 및 ATP 각각 10μ+ 10㎕ H2O)
1.0㎕ UTP (50μM)
1.0㎕ RNasin
1.0㎕ DNA 주형 (l㎍)
1.0㎕ H20
1.0㎕ RNA 중합효소 (PCR 생성물로는 통상 T3 = AS, T7 = S)
37℃에서 1시간 동안 상기 튜브를 인큐베이션하였다. 1.0㎕ RQ1 DNase를 첨가한 후에 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 90㎕의 TE(10mM Tris(pH 7.6) 및 lmM EDTA(pH 8.0))를 가하고 상기 혼합물을 DE81 페이퍼에 피펫으로 가하였다. 마이크로콘(Microcon)-50 초미세여과 유니트에 잔류 용액을 로딩하고 프로그램 10을 이용하여 6분 동안 가라앉게 하였다. 제2 튜브로 여과 유니트를 옮기고 프로그램 2를 이용하여 3분 동안 가라앉게 하였다. 최종 회수 가라앉힘 후에, 100㎕ TE를 가하였다. DE81 페이퍼 상에 최종 생성물 1㎕를 피펫으로 가하고 6ml의 바이오플라워(Bioflour) Ⅱ로 계수하였다.
TBE 및 요소 겔 상에 프로브를 전기영동 하였다. 3㎕의 로딩 완충액에 1 내지 3㎕의 프로브 또는 5㎕의 RNA Mrk Ⅲ를 가하였다. 95℃ 가열 블록(heat block)에서 3분 동안 가열한 후에, 즉시 겔을 얼음에 놓았다. 겔의 웰을 세척 후, 샘플을 로딩하고 180 내지 250볼트에서 45분 동안 전기영동 하였다. 사란 랩으로 겔을 싸고, 이를 -70℃ 냉동고에서 1시간 내지 밤새의 시간 동안 신호 증강 스크린 상에서 XAR 필름에 노출시켰다.
33 P-혼성화
A. 동결 단편의 예비처리
냉동고로부터 슬라이드를 제거하고 알루미늄 트레이에 놓고 상온에서 5분 동안 해빙시켰다. 응축 감소를 위해, 트레이를 55℃ 배양기에 5분 동안 놓았다. 발연 후드(fume hood)에 얼음 상 4% 파라포름알데히드 중에 10분 동안 슬라이드를 고정시키고, 상온(25ml 20x SSC + 975ml SQ H2O)에서 0.5x SSC로 5분 동안 세척하였다. 0.5㎍/ml의 단백질분해효소 K로 37℃에서 10분 동안 탈단백질화 후에(250ml의 예열된 RNase가 없는 RNase 완충액 중의 12.5㎕의 10mg/ml 원액), 상온에서 10분 동안 0.5x SSC로 단편을 세척하였다. 70%, 95%, 100% 에탄올로 각각 2분 동안 단편을 탈수화하였다.
B. 파라핀에 묻힌 절편의 예비처리
슬라이드를 탈파라핀화하고 SQ H2O 중에 놓고 상온에서 5분 동안(1회) 2x SSC 로 2회 세척하였다. 20㎕/ml 단백질분해효소 K(250ml RNase가 없는 RNase 완충액 중의 500㎕의 10mg/ml, 37℃, 15분)-인간 배(embryo), 또는 8x 단백질분해효소 K(250ml RNase 완충액 중의 100㎕, 37℃, 30분)-포르말린 조직 중에서 절편을 탈단백질화하였다. 그 후에, 상기 기재된 바와 같이 0.5x SSC로 세척하고 탈단백질화를 수행하였다.
C. 예비혼성화
구획이 나뉜 플라스틱 상자 중에 여과지로 포화된 박스(Box) 완충액(4x SSC, 50% 포름아미드) 중에 슬라이드를 놓았다. 50㎕ 혼성화 완충액(3.75g 덱스트란 설페이트 + 6ml SQ H2O)을 조직 시료에 넣고 볼텍싱 후, 뚜껑을 느슨하게 한 상태로2분 동안 극초단파로 가열하였다. 얼음에서 냉각한 후에, 18.75ml 포름아미드, 3.75ml 20x SSC 및 9ml SQ H2O를 가하고 조직을 잘 볼텍싱한 후, 42℃에서 1내지 4시간 동안 배양하였다.
D. 혼성화
슬라이드마다 1.0 x 106cpm 프로브 및 1.0㎕ tRNA (50mg/ml 원액)를 95℃에서 3분 동안 가열하였다. 얼음에서 상기 슬라이드를 냉각하고 슬라이드마다 48㎕ 혼성화 완충액을 가하였다. 볼텍싱한 후에, 슬라이드 상의 50㎕ 예비혼성화 시료에 50㎕의33P 혼합물을 가하였다. 55℃에서 밤새 이 슬라이드를 배양하였다.
E. 세척
상온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 세척한 후에(400ml 20x SSC + 16ml 0.25M EDTA, 최종 부피=4L), 37℃에서 30분 동안 RNase A로 처리하였다(250ml RNase 완충액 중의 10mg/ml 농도의 RNase 500㎕ = 20㎍/ml). 상온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 슬라이드를 세척하였다. 과도한 세척 조건은 하기와 같다. 55℃, 0.1x SSC 및 EDTA에서 2시간(20ml 20x SSC + 16ml EDTA, 최종 부피 = 4L).
F. 올리고뉴클레오티드
본 명세서에 개시된 여러 가지 DNA 서열에 대한 원래 위치에서의 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다.
(1) DNA44804-1248 (PRO357)
pl 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCCCGCAACCCCTTCAACTG-3' (서열 번호 104)
p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACCGCAGCTGGGTGACCGTGTA-3' (서열 번호 105)
(2) DNA5272-1229 (PRO715)
pl 5 '-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCCCCGCCACCTCCT-3' (서열 번호 106)
p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACTCGAGACACCACCTGACCCA-3' (서열 번호 107)
p3 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAAGGAAGGCAGGAGACTCT-3' (서열 번호 108)
p4 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACTAGGGGGTGGGAATGAAAAG-3' (서열 번호 109)
(3) DNA38113-1230 (PRO327)
pl 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCCCCTGAGCTCTCCCGTGTA-3' (서열 번호 110)
p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAAGGCTCGCCACTGGTCGTAGA-3' (서열 번호 111)
(4) DNA35917-1207 (PR0243)
pl 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGGAGCCGGGACCCAGGAGA-3' (서열 번호 112)
p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGGGCCCTTGGTGCTGAGT-3' (서열 번호 113)
G. 결과
본 명세서에 개시된 여러 가지 DNA 서열 상에 원래 위치에서의 분석을 수행하였다. 상기 분석의 결과는 하기와 같다.
(1) DNA44804-1248 (PRO357)
태아 조직 및 골육종의 악성 세포 중 골형성 부위에서 낮은 수준 내지 적당한 수준으로 발현되었다. 태반 및 인대에서 양성 반응이 나타났다. 모든 다른 조직은 음성 반응이 나타났다.
태아 조직(E12-E16 주)은 중 간, 신장, 부신, 폐, 심장, 주요 혈관, 식도,위, 비장, 생식선, 뇌, 척추 및 체벽을 검사하였다.
성인 인체 조직 중 간, 신장, 위, 비장, 부신, 췌장, 폐, 결장암, 신장 세포암 및 골육종을 검사하였다. 아세트아미노펜은 간 손상 및 간경변을 유도하였다.
침팬지 조직 중 갑상선, 부갑상선, 림프절, 신경, 혀, 흉선, 부신, 위점막 및 침샘을 조사하였다.
벵골 원숭이의 대뇌 및 소뇌를 검사하였다.
(2) DNA52722-1229 (PRO715)
많은 조직에서 일반화된 강한 신호가 나타났다. 태반, 조골세포, 손상된 세뇨관, 손상된 간, 결장직장의 간암전이 및 담낭에서 신호가 가장 강하게 나타났다.
태아 조직(E12-E16 주) 중 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 주요 혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하지를 검사하였다.
성인 인체 조직 중 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 폐, 피부, 연골 육종, 눈, 위, 결장, 결장암, 전립선, 방광 점막 및 담낭을 검사하였다. 아세트아미노펜은 간손상 및 간경변을 유도하였다.
벵골 원숭이 조직 중 대뇌 피질(rm), 뇌의 해마상 융기(rm)를 검사하였다.
침팬지 조직 중 갑상선, 부갑상선, 림프절, 신경, 혀, 흉선, 부신, 위점막 및 침샘을 검사하였다.
(3) DNA38113-1230 (PRO327)
발생중인 생쥐 및 인간 태아의 폐에서 높은 수준의 발현이 관찰되었다. 기관지 표피를 포함하는 정상 성인의 폐에서는 발현되지 않았다. 인간 태아 기관지의 점막하, 가능하게는 평활근 세포에서 발현되었다. 또한, 인간 태반의 확실치 않은 조직발생의 비영양 세포에서 발현을 관찰하였다. 생쥐에서는 발생중인 코 및 발생중인 혀에서 발현을 관찰하였다. 모든 다른 조직은 발현을 관찰할 수 없었다. 기관지 발달에 어떤 역할을 할 것으로 생각하였다.
태아 조직 (E12-E16 주) 중 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 주요 혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈 척수, 체벽, 골반 및 하지를 검사하였다.
성인 조직 중 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 피부, 대뇌 피질(rm), 해마(rm), 소뇌(rm), 음경, 눈, 방광, 위, 위암, 결장, 결장암, 갑상선(침팬지), 부갑상선 (침팬지), 난소 (침팬지) 및 연골 육종을 검사하였다.
(4) DNA35917-1207 (PR0243)
코르넬리아 드 랑즈 증후군(CdLS) 선천성 증후군이다. 즉, 태어날 때부터 증상이 존재함을 의미한다. CdLS는 신체, 정신 및 언어 발달에서 지체를 일으키는 질환이다. CdLS에 걸린 어린이의 대다수가 정신 지체가 있고, 정신 지체는 보통 내지 심한 정도였다. 보고된 IQ는 30 내지 85였다. 평균 IQ는 53이었다. 머리 및 안면부 특징은 작은 머리 크기, 종종 미간이 붙은 얇은 눈썹, 긴 속눈썹, 짧은 들창코, 얇고 처진 입술, 낮게 달린 귀 및 고도의 아치형 구개 또는 언청이를 포함한다. 다른 특징은 언어 지체, 가장 경미한 영향에서 조차, 성장 지체 및 작은 신장, 낮은 음역의 울음소리, 작은 손 및 발, 제5수지 내굴, 시미안선 및 과다한 체모를 포함한다. 진단은 상기 특징이 얼마만큼 복합적으로 나타나는 것에 따라 좌우된다. 상기 많은 특징은 다양한 정도로 나타났다. 어떤 경우에는, 상기 특징이 나타나지 않거나 또는 경미하여 그는 숙련된 유전학자 또는 이 증상을 잘 알고있는 다른 사람만이 구별할 수 있었다. CdLS에 대한 많은 것이 공지되어 있지만, 최근 연구로 배워야 할 것이 더 많음을 알 수 있었다.
상기 연구에서, 인간 태아의 안면, 머리, 사지 및 생쥐 배(embryo)의 추가적 절편을 검사하였다. 어떤 생쥐 조직에서도 발현이 나타나지 않았다. 발현은 안티센스 프로브로만 조사할 때만 나타났다.
발현은 간충직의 발생중인 사지 및 안면부 뼈 부근에서 관찰되었다. 발현은 고도로 특이적이고 종종 혈관신생을 겪는 부위 가까이에서 나타났다. 이 분포는 코르넬리아 드 랑즈 증후군 중에 관찰되는 뼈의 비정상성과 일치하였다. 또한, 발현은 태아 뇌의 발생중인 측두엽 및 후두엽에서 관찰되었으나, 다른 곳에서는 관찰되지 않았다. 또한, 발현은 발달하는 내이의 신경절에서 나타났지만, 이 사실의 의미 분명하지 않다.
상기 데이타가 기능 정보를 제공하지는 않지만, 상기 분포는 증상에서 가장 심한 영향을 받는 것으로 공지된 부위와 일치하였다.
부가로, 대퇴 두부 및 관골구 사이에 나타나는 발생중인 활액관절 분열선에 약간의 발현이 관찰되었다. 다른 관절 형성 부위에서 이 형태의 발현이 관찰되면, 코르넬리아 드 랑즈 증후군 중에 관찰되는 안면 및 사지 비정상을 설명할 수 있다.
<실시예 31>: 제노푸스(Xenopus) 난모세포의 PRO243 mRNA 활성
PRO243을 암호화하는 인간 코딘 클론(DNA35917-1207)은 기능성이 있고 제노푸스chordin및 초파리sog유전자에 의해 예상되는 방식으로 작용한다는 것을 증명하기 위해, 퀴아젠(Quiagen)에 의해 DNA35917-1207로부터의 슈퍼코일 플라스미드 DNA를 제조하고 제노푸스 래비스(Xenopus laevis)의 배(embryo)에 주입하였다. 제노푸스chordinmRNA를 배쪽 식물극 할구에 미세주입하여 제2축(쌍을 이룸)([사사이(Sasai) 등,Cell79:779-790 (1994)])을 유도하고 또한 초파리sog는 제노푸스 배의 복부 측면 상의 정상 위치 이외에서 발현되면 제2축을 유도하였다 ([홀리(Holley) 등,Nature376:249-253 (1995)] 및 [슈미트(Schmidt) 등,Development121:4319-4328 (1995)]). 제노푸스 난모세포 상에 작용하는sog의 능력은 등배 패턴 형성에 관련된 변화가 진화 동안에 보존되었음을 암시한다.
방법
제노푸스 배(embryo) 조작:
사용전 3일에는 임신한 암컷 혈청 200I.U. 으로, 삽입 전날 밤에는 인간 융모막의 생식선자극호르몬 800I.U.으로 암컷 성체 개구리를 추가로 항원자극시켰다. 다음날 아침 암컷 개구리로부터 새 난모세포를 짜내고, 도살한 수컷 개구리의 잘게 썬 고환과 난모세포를 혼합하여 체외수정시켰다. 문헌 [뉴쿠프(Nieuwkoop) 및 파버(Faber), Normal Table of Xenopus laevis, N.-H. P. Co., ed. (Amsterdam, 1967)]에 따라 배 발생을 유지하고 단계를 나누었다.
2% 시스테인(pH 7.8)으로 10분 동안 처리하여 수정란의 젤리층을 벗기고, 증류수로 1회 세척 후, 5% 피콜(Ficoll)을 포함하는 0.1x MBS로 옮겼다. 5% 피콜(Ficoll)을 포함하는 0.1x MBS가 들어있는 삽입 트레이에 수정란을 정렬시켰다. 야생형 코딘(DNA35917-1207)을 포함하는 pRK5 200pg 또는 대조군으로 삽입체 없는 pRK5 200pg를 가지고 2 세포 단계 발생중인 제노푸스 배에 삽입하였다. DNA가 삽입된 배를 추가 6시간 동안 트레이에서 배양한 후에, 뉴쿠프 단계 37 내지 38에 도달할 때까지 젠타마이신 50mg/ml을 포함하는 0.1x MBS에서 배양하였다.
결과:
인간 코딘 cDNA를 한 할구에 삽입시킨 결과 올챙이 배를 발생시켰다. 올챙이의 배 형성은 꼬리의 단축 및 비틀림 및 백악질 선의 확장으로 나타났다. 제노푸스의 베 형성제로 작용하는 인간 코딘의 능력은 인간, 파리 및 개구리 사이의 공통된 메카니즘으로 등배 패턴 형성에 관련된 변화가 진화 동안 보존되어왔음을 암시한다.
재료 기탁
하기 재료를 미국 메릴랜드주 록크빌 파크론 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁하였다.
재료 ATCC 기탁 번호 기탁일
DNA34392-1170 ATCC 209526호 1997년 12월 10일
DNA35917-1207 ATCC 209508호 1997년 12월 3일
DNA39976-1215 ATCC 209524호 1997년 12월 10일
DNA35595-1228 ATCC 209528호 1997년 12월 10일
DNA38113-1230 ATCC 209530호 1997년 12월 10일
DNA34436-1238 ATCC 209523호 1997년 12월 10일
DNA40592-1242 ATCC 209492호 1997년 11월 21일
DNA44176-1244 ATCC 209532호 1997년 12월 10일
DNA44192-1246 ATCC 209531호 1997년 12월 10일
DNA39518-1247 ATCC 209529호 1997년 12월 10일
DNA44804-1248 ATCC 209527호 1997년 12월 10일
DNA52722-1229 ATCC 209570호 1998년 1월 7일
DNA41234-1242 ATCC 209618호 1998년 2월 5일
DNA45410-1250 ATCC 209621호 1998년 2월 5일
DNA46777-1253 ATCC 209619호 1998년 2월 5일
기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙(부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정하에 이루어졌다. 상기는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크.(Genentech Inc.)와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시(이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙(37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
앞서 기술한 명세서는 당업계 숙련자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시양태는 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 기탁된 구성물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업계 숙련자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.

Claims (59)

  1. 도 2(서열 번호 2), 도 4(서열 번호 7), 도 9(서열 번호 15), 도 11(서열 번호 19), 도 13(서열 번호 24), 도 15(서열 번호 30), 도 17(서열 번호 32), 도 19(서열 번호 37), 도 21(서열 번호 42), 도 23(서열 번호 50), 도 25(서열 번호 55), 도 27(서열 번호 61), 도 29(서열 번호 69), 도 31(서열 번호 76), 도 35(서열 번호 86), 도 37(서열 번호 91) 및 도 39(서열 번호 99)에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 1(서열 번호 1), 도 3(서열 번호 6), 도 8(서열 번호 14), 도 10(서열 번호 18), 도 12(서열 번호 23), 도 14(서열 번호 29), 도 16(서열 번호 31), 도 18(서열 번호 36), 도 20(서열 번호 41), 도 22(서열 번호 49), 도 24(서열 번호 54), 도 26(서열 번호 60), 도 28(서열 번호 68), 도 30(서열 번호 75), 도 34(서열 번호 85), 도 36(서열 번호 90) 및 도 38(서열 번호 98)에 기재된 서열 또는 그에 상보적인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 1(서열 번호 1), 도 3(서열 번호 6), 도 8(서열 번호 14), 도 10(서열 번호 18), 도 12(서열 번호 23), 도 14(서열 번호 29), 도 16(서열 번호 31), 도 18(서열 번호 36), 도 20(서열 번호 41), 도 22(서열 번호 49), 도 24(서열 번호 54), 도 26(서열 번호 60), 도 28(서열 번호 68), 도 30(서열 번호 75), 도 34(서열 번호 85), 도 36(서열 번호 90) 및 도 38(서열 번호 98)에 기재된 서열 또는 그에 상보적인 서열의 전체 길이 코딩 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 핵산.
  4. ATCC 209526호, ATCC 209508호, ATCC 209524호, ATCC 209528호, ATCC 209530호, ATCC 209523호, ATCC 209492호, ATCC 209532호, ATCC 209531호, ATCC 209529호, ATCC 209527호, ATCC 209570호, ATCC 209618호, ATCC 209621호 또는 ATCC 209619호로 기탁된 DNA의 전체 길이 코딩 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  5. 제1항의 핵산을 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포에 의해 인지되는 제어 서열과 작동적으로 연결된 벡터.
  7. 제5항의 벡터를 포함하는 비인간 세포인 숙주세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인 숙주세포.
  9. 제7항에 있어서, 상기 세포가 대장균(E. coli)인 숙주세포.
  10. 제7항에 있어서, 상기 세포가 효모인 숙주세포.
  11. 제7항의 숙주세포를 제1항에 정의된 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하고, 세포 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항에 정의된 폴리펩티드의 제조 방법.
  12. 삭제
  13. ATCC 209526호, ATCC 209508호, ATCC 209524호, ATCC 209528호, ATCC 209530호, ATCC 209523호, ATCC 209492호, ATCC 209532호, ATCC 209531호, ATCC 209529호, ATCC 209527호, ATCC 209570호, ATCC 209618호, ATCC 209621호 또는 ATCC 209619호로 기탁된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드.
  14. 이질성 아미노산 서열에 융합된 제1항에 정의된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 이질성 아미노산 서열이 에피토프 태그 서열인 키메라 분자.
  16. 제14항에 있어서, 상기 이질성 아미노산 서열이 면역글로불린의 Fc 영역인 키메라 분자.
  17. 제1항에 정의된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체가 모노클론 항체인 항체.
  19. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 1 (서열 번호 1)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  20. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 3 (서열 번호 6)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  21. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 8 (서열 번호 14)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  22. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 10 (서열 번호 18)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  23. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 12 (서열 번호 23)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  24. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 14 (서열 번호 29)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  25. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 16 (서열 번호 31)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  26. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 18 (서열 번호 36)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  27. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 20 (서열 번호 41)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  28. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 22 (서열 번호 49)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  29. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 24 (서열 번호 54)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  30. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 26 (서열 번호 60)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  31. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 28 (서열 번호 68)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  32. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 30 (서열 번호 75)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  33. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 34 (서열 번호 85)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  34. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 36 (서열 번호 90)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  35. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 38 (서열 번호 98)에 기재된 서열 또는 그에 혼성화될 수 있는 상보체를 포함하는 것인 핵산.
  36. 제2항의 핵산을 포함하는 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 벡터.
  38. 제36항의 벡터를 포함하는 비인간 세포인 숙주 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인 숙주세포.
  40. 제38항에 있어서, 상기 세포가 대장균(E. coli)인 숙주세포.
  41. 제38항에 있어서, 상기 세포가 효모인 숙주세포.
  42. 제38항의 숙주세포를, 제2항에 정의된 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하고, 세포 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 제2항에 정의된 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 제조 방법.
  43. 도 2 (서열 번호 2)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  44. 도 4 (서열 번호 7)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  45. 도 9 (서열 번호 15)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  46. 도 11 (서열 번호 19)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  47. 도 13 (서열 번호 24)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  48. 도 15 (서열 번호 30)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  49. 도 17 (서열 번호 32)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  50. 도 19 (서열 번호 37)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  51. 도 21 (서열 번호 42)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  52. 도 23 (서열 번호 50)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  53. 도 25 (서열 번호 55)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  54. 도 27 (서열 번호 61)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  55. 도 29 (서열 번호 69)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  56. 도 31 (서열 번호 76)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  57. 도 35 (서열 번호 86)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  58. 도 37 (서열 번호 91)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
  59. 도 39 (서열 번호 99)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 폴리펩티드.
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