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Technisches Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft neuartige, mit Kinesin verwandte, menschliche
Gene, Proteine, für
welche die Gene kodieren und ihre Verwendung zur Behandlung von
Krebs oder zum Diagnostizieren der Prognose von Krebs.
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Stand der Technik
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Substanztransport in Neuronen
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Verschiedene
Substanzen werden von spezifischen Systemen in neuronalen Axonen
transportiert und ein derartiger Transport wird abhängig von
der Geschwindigkeit in zwei Arten eingeteilt, entweder in „schnellen Transport" oder in „langsamen
Transport". „Schneller
Transport" beinhaltet
sowohl den anterograden Transport in Richtung vom Zellkörper zum
Axonende als auch den retrograden Transport in der entgegengesetzten
Richtung. „Schneller
Transport" ist eine
gerichtete Bewegung, im Allgemeinen innerhalb der Zelle, und wird
durch die Bewegung von intrazellulären, an Organellen anhaftenden,
molekularen Motoren (Motorproteinen) auf Mikrotubuli bewirkt.
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Rolle von Kinesin beim axonalen Transport
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Kinesin
befördert
intrazelluläre
Organellen in Richtung des Plus-Endes von Mikrotubuli, womit ein schneller,
anterograder Transport im neuronalen Axon bewerkstelligt wird. Das
Kinesinmolekül
ist ein Heterotetramer, das zwei schwere Ketten mit 120 kDa und
zwei leichte Ketten mit 64 kDa umfasst. Das N-terminale Ende der
schweren Kette bildet einen kugelförmigen Kopf, der eine Motordomäne, die
mit ATP und Mikrotubuli bindet, darstellt, und dehnt sich aus, um
einen stabförmigen
Stiel und einen fächerförmigen Schwanz
mit einer Gesamtlänge
von etwa 80 nm zu bilden (Hirnkawa N. et al., Cell 56: 867–878, (1989)).
Die leichte Kette kann aus jeder von 3 molekularen Spezies bestehen,
durch Spleißen
entstanden sein (Cyr JL. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
10114–10118,
(1991)) und abhängig
vom jeweiligen Organ unterschiedlich sein. Die leichte Kette haftet
am Schwanz der schweren Kette an und die Bindung an Membran organellen
erfolgt an den Schwanzteilen der schweren Ketten und den Teilen
der leichten Ketten.
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Mit Kinesin verwandte Gene
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In
letzter Zeit wurden verschiedene mit Kinesin verwandte Gene entdeckt
und ihre Proteinstrukturen wurden aufgeklärt. Diese mit Kinesin verwandten
Gene haben in hohem Maße
konservierte Motordomänenstrukturen
(Eyer J. et al., Nature 391: 584–587 (1998)). Mehr als 30 mit
Kinesin verwandte Gene wurden bisher in Mäusen entdeckt, wobei alle Motorstrukturen
haben (Gibbons IR. et al., Cell Motil. Cytoskel. 32: 136–144 (1995)),
und sie sind insgesamt als die Kinesin-Superfamilie bekannt. Vor
kurzem wurde ein phylogenetischer Stammbaum der Kinesin-Superfamilie
veröffentlicht
(Hirnkawa N. et al., Science 279: 519–526 (1998)) und es wurde festgestellt,
dass verschiedene der Mitglieder am axonalen Transport beteiligt
sind.
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Über die
Kinesin-Superfamilie wird derzeit in Mäusen, wo sie als KIF bezeichnet
wird, rege geforscht (Aizawa H. et al., J. Cell Biol. 199: 1287–1296 (1992))
und die Mitglieder werden im Wesentlichen basierend auf der Position
der Motorregion (am N-terminalen Ende, im Zentralbereich oder am
C-terminalen Ende) in drei Gruppen eingeteilt.
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Kinesin-Superfamilie mit N-terminalem
Motor
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Die
Kinesin-Superfamilie mit N-terminalem Motor wird weiter in die Unterfamilien
KNC, Unc104, RP85/95, BimC, MKLP1 und die Chromokinesin–Unterfamilien
unterteilt. Unter diesen wurde die Familie BimC in Säugern nicht
identifiziert.
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Die
KHC-Familie umfasst drei Mitglieder, die in Mäusen identifiziert wurden (KIF5B,
KIF5A, KIF5C), und zwei, die in Menschen identifiziert wurden (HsuKHC,
HsnKHC), während
nur eine in Wirbellosen identifiziert wurde. Diese Familie kann
in die ubiquitären
Mitglieder (KIF5B, HsuKHC) und die für das Nervensystem spezifischen
Mitglieder (KIF5A, KIF5C, HsnKHC) unterteilt werden. HsnKHC ist über den
ganzen Nervenzellkörper
verteilt und HsuKHC wird auch im Axon nachgewiesen (Niclas J. et
al., Neuron 12: 1059–1072
(1994)).
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Die
Familie UNC104 wurde in Menschen nicht identifiziert, aber KIF1A
und KIF1B sind in Mäusen
bekannt. KIF1A ist ein großes
Protein mit 1695 Aminosäuren
und 200 kDa, das mit einem einzigen Kopf arbeitet und Vorläufer von
synaptischen Vesikeln mit einer Geschwindigkeit von 1,2–1,5 μm/s auf das
Plus-Ende von Mikrotubuli zu transportiert (Okada Y. et al., Cell
81: 769–780
(1995)). Gezielte Geninaktivierung (engl.: „gene targeting") hat schwere kinästhetische
Schädigung
zur Folge und führt
kurz nach der Geburt zum Tod.
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KIF1B
umfasst 1150 Aminosäuren
und arbeitet auch mit einem einzigen Kopf, wobei es Mitochondrien mit
einer Geschwindigkeit von 0,5 μm/s
auf das Plus-Ende von Mikrotubuli zu transportiert (Nangaku M. et
al., Cell 79: 1209–1220
(1994)).
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Die
von der Maus stammenden KIF3A und KIF3B aus der Familie RP85/95
liegen als Heterodimer mit zwei Köpfen vor und bilden in Verbindung
mit KAP3 ein Heterotrimer. Diese mit Kinesin verwandten Proteine sind
nicht neuronenspezifisch und befördern
Membranvesikel, die größer als
Synapsenvesikel sind, mit einer Geschwindigkeit von 0,3 μm/s auf das
Plus-Ende von Mikrotubuli zu (Yamazaki H. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93: 8443–8448
(1996)).
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Ein
Mitglied der MKLP-Familie ist bei Menschen bekannt (humanes MKLP).
Humanes MKLP1 übt Funktionen
für die
Spindelelongation in der Anaphase B, die Bildung von kontraktilen
Ringen und den Abschluss der zytoplasmatischen Teilung aus.
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Von
der Maus stammendes KIF4 der Chromokinesin-Familie umfasst 1231
Aminosäuren
und hat eine Länge
von 116 nm mit zwei Köpfen.
Es bewegt sich mit einer Geschwindigkeit von 0,2 μm/s und transportiert Membranvesikel
zu Wachstumskegeln. Im Körper
von Erwachsenen ist es reichlichst in den Organen des Immunsystems
vorhanden (Shingyoji C. et al., Nature 393: 711–714 (1998)).
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Kinesin-Superfamilie mit zentralem Motor
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Die
Kinesin-Superfamilie mit zentralem Motor wurde in Menschen nicht
ermittelt. Von der Maus stammendes KIF2 ist ein Protein mit zwei
Köpfen
und 81 kDa, das sich mit einer Geschwindigkeit von 0,4 μm/s auf das
Plus-Ende von Mikrotubuli zu bewegt. Dieses mit Kinesin verwandte
Protein ist nicht neuronenspezifisch, wird aber im jugendlichen
Nervensystem exprimiert, wo es den Transport von Membranvesikeln
zu Wachstumskegeln durchführt
(Noda Y. et al., J. Cell Biol. 129: 157–167 (1995)).
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Kinesin-Superfamilie mit C-terminalem
Motor
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Auch
die Kinesin-Superfamilie mit C-terminalem Motor wurde in Menschen
nicht ermittelt. In dieser Superfamilie sind drei verschiedene,
von der Maus stammende Kinesine (KIFC1, KIFC2 und KIFC3) bekannt. KIFC2
fehlt in den peripheren Nerven, liegt in Dendriten reichlich vor
und befördert
hauptsächlich
multivesikuläre
Körper
auf die Enden von Dendriten zu (Saito N. et al., Neuron 18: 425–438 (1997)).
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Klonierung von neuen, mit Kinesin verwandten
Genfragmenten vom Menschen
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cDNA
für KIAA0591
(GenBank-Zugangsnummer: AB011163) wurde aus einer nach dem Molekulargewicht
fraktionierten cDNA-Bibliothek aus Gehirn vom Menschen kloniert
(Nagase T. et al., DNA Res. 5: 31–39 (1998)).
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Die
cDNA bestand aus 5368 Basen und ist ein Teilfragment eines neuen
Gens, das in hohem Maße homolog
zum Gen für
den Synapsenvesikeltransporter in neuronalen Axonen vom Menschen
ist. Da das 5'-Ende
der cDNA für
KIAA0591 über
kein Initiationscodon für
die Transkription verfügte
und kürzer
als das entsprechende, ungefähr
9,5 kb lange Transkriptionsprodukt war, deutete dies auf die Existenz
einer längeren
cDNA mit voller Länge
hin.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung suchten daher eine cDNA-Bibliothek
aus Substantia nigra vom Menschen ab, um die cDNA, welche die volle
Länge hatte
und KIAA0591 beinhaltete, zu erhalten, jedoch ohne Erfolg beim Aufklären der
cDNA mit der vollen Länge.
Ihre Funktion bleibt somit unbekannt.
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Im
Lauf der Bestrebungen, die cDNA mit der vollen Länge für KIAA0591 aufzuklären, entdeckten
die Erfinder der vorliegenden Erfindung jedoch auch ein mit Kinesin
verwandtes Gen ohne einen Teil, welcher der Motordomäne, die
in der Kinesin- Superfamilie
ubiquitär
angetroffen wird, entspricht. Die Rasensequenz für die Translationsregion dieses
Gens ist in SEQ ID NO: 3 im Sequenzprotokoll dargelegt, beziehungsweise
das Protein, das aus dieser Region translatiert wird, ist in SEQ
ID NO: 1 dargelegt.
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Es
wurde auch entdeckt, dass das Gen bei 36,2–36,3 auf dem kurzen Arm des
humanen Chromosoms 1, von dem festgestellt wurde, dass es in Neuroblastomen
und Ähnlichem
oft fehlerhaft ist, lokalisiert ist, dass in 8 Typen eines Neuroblastoms
und in 15 Typen von Zelllinien, die von einem Neuroblastom abstammen,
keine Mutationen in der Region, die für dieses Gen kodiert, gefunden
werden und dass es in einer Vielzahl von adulten Geweben exprimiert
wird und in Gehirn, Niere, Skelettmuskel und Pankreas, besonders
im Gehirn von einem menschlichen Fötus stark exprimiert wird ((Nakagawara
A. et al., International Journal of Oncology 16: 907–916 (2000)).
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Gleichwohl
blieb die Funktion des mit Kinesin verwandten Gens, dem die Motordomäne fehlt,
und seines Proteins unklar.
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WO 00/63375 betrifft Polynukleotide,
die für
ein dem Kinesin ähnliches
Polypeptid beim Menschen, das sich von jeder der Sequenzen der vorliegenden
Erfindung unterscheidet, kodieren.
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Von Verankerung unabhängiges Wachstum und Krebs
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Normale
adhärente
Zellen benötigen
ein Anhaften an einem festen Anker, um zu proliferieren. Wenn sie
auf einer nicht haftfähigen
Materialoberfläche
kultiviert werden, werden die Zellen für eine ausgedehnte Dauer überleben,
werden aber nicht proliferieren. Zum Beispiel wird, wenn normale
Zellen in einem nicht verankernden, halbfesten Medium wie zum Beispiel
einem Agarosegel suspendiert werden, der lebenserhaltende Stoffwechsel
stattfinden, aber das Wachstum ist supprimiert. Andererseits fehlt
maligne transformierten Zellen wie zum Beispiel Krebszellen (oder
Onkozyten) im Allgemeinen der Bedarf nach Adhäsion und somit bilden sie,
auch wenn sie in einem nicht verankernden, halbfesten Medium suspendiert
werden, Kolonien und wachsen. Dieses Merkmal ist sehr stark mit
der Fähigkeit
von maligne transformierten Zellen, Tumore zu bilden, verbun den.
Besonders Zellen, die in einer von Verankerung unabhängigen Weise
proliferieren, sind beim Bilden von Tumoren effizient, wenn sie
in Tiere injiziert werden (siehe Darnell et al., Molecular Cell
Biology, zweite Auflage 24: 963–967
(1993)).
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Zelladhäsion und Infiltration/Metastasierung
durch Krebs
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Krebs
ist wegen seiner Fähigkeit
zu infiltrieren und zu metastasieren bösartig. Obwohl auf das Aufklären des
Mechanismus gerichtete Forschung bis jetzt aktiv betrieben wurde,
sind Infiltration und Metastasierung komplexe Erscheinungen, die
als Ergebnis von Konflikten zwischen Krebszellen und Wirtszellen
auftreten, und das vollständige
Bild wird noch nicht in vollem Umfang verstanden. Hämatogene
Metastasierung ist durch Infiltration von Krebszellen aus Primärläsionen,
Intravasation, Transport, Kolonisierung, Extravasation und Wachstum
im Initialstadium begründet.
Man nimmt an, dass auch lymphogene Metastasierung, disseminierte Metastasierung
und intrakanalikuläre
Metastasierung mit ähnlichen
Prozessen einhergehen. Adhäsion
und Dissoziation zwischen Krebszellen und Krebszellen, Krebszellen
und normalen Zellen und Krebszellen und extrazellulärer Matrix
treten während
all dieser Prozesse auf.
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Da
bei vielen Arten von Krebs eine verminderte Adhäsion zwischen Krebszellen beobachtet
wird, gab es eine Konzentration auf ihre Verbindung mit der Fähigkeit
der Zellen zur Infiltration und Metastasierung. Krebszellen treten
mit vielen und verschiedenen Zellen während des Verlaufs ihrer Metastasierung
in Kontakt. Die Krebszellen, die an endothelialen Zellen anhaften,
schließen
diejenigen, die von endothelialen Zellen verkapselt sind, diejenigen,
die an der apikalen Oberfläche
der Endothelzellen anhaften, und diejenigen, die von der basalen
Oberfläche
epithelialer Zellen bedeckt sind, ein und diese Zellen sind mit
der Intravasation und der Extravasation von Krebszellen eng verbunden.
Die Adhäsion
zwischen Krebszellen und der extrazellulären Matrix wird auch ubiquitär beobachtet.
Andere Beobachtungen ließen
darauf schließen,
dass es nach der Adhäsion
von Krebszellen an normale Zellen zur Zellfusion und zum Tod normaler
Zellen kommt (Turuo, T. et al.: „Ganten'i no Bunshikiko" [Molecular Mechanisms of Cancer Metastasis],
Medical View Publishing (1993)).
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Wie
oben erwähnt
ist die Funktion des neuen, mit Kinesin verwandten Gens, dem die
Motordomäne fehlt,
und des Proteins, für
das es kodiert, die früher
von den Erfindern der vorliegenden Erfindung entdeckt wurden, unbekannt
geblieben. Zusätzlich
wurde, obwohl die Existenz der cDNA mit der vollen Länge einschließlich KIAA0591
prognostiziert war, diese noch nicht bestätigt oder identifiziert.
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Offenbarung der Erfindung
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Diese
Erfindung wurde angesichts der oben beschriebenen Umstände zustande
gebracht. Es ist eine Aufgabe der Erfindung, die Daten der Basensequenz
für ein
neues, mit Kinesin verwandtes Gen vom Menschen, das eine Motordomäne hat,
bereitzustellen. Die Erfindung stellt ferner Information bereit,
welche die Funktion des Proteins, für welches das neue, mit Kinesin
verwandte Gen vom Menschen mit einer Motordomäne kodiert, betrifft und erläutert das
neue, mit Kinesin verwandte Gen ohne Motordomäne.
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Als
Ergebnis von umfangreicher, sorgfältiger Forschung gelang es
den Erfindern der vorliegenden Erfindung, durch schnelle Amplifikation
von cDNA-Enden, (RACE, engl. „Rapid
Amplification of cDNA Ends")
ein neues Gen zu klonieren, das ein längeres 5'-Ende als das mit Kinesin verwandte
Gen ohne Motordomäne (SEQ
ID NO: 3) hat, und die cDNA dieses mit Kinesin verwanden Gens mit
der vollen Länge
zu sequenzieren. Zur Einfachheit wurde das neue, mit Kinesin verwandte
Gen mit einer Motordomäne
als KIF1b-β bezeichnet und
seine cDNA-Sequenz (Basensequenz) ist in SEQ ID NO: 4 im Sequenzprotokoll
dargestellt.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten auch, dass die Expression
des KIF1b-β-Gens
nur in Neuroblastomgewebe mit einer günstigen klinischen Prognose
gesteigert ist.
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Es
wurde weiterhin entdeckt, dass ein Supprimieren der Expression des
KIF1b-β-Gens
und des mit Kinesin verwandten Gens ohne Motordomäne unter
Einsatz von Antisense-RNA
ein von Verankerung unabhängiges
Wachstum normaler Zellen, die inhärent nur in einer von Verankerung
abhängigen
Weise wachsen, erlaubt, oder in anderen Worten, dass diese Gene
als Kontrolle der Entartung normaler Zellen in Krebszellen fungieren.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten noch weiter, dass
normale Zellen eine Tumorentstehung durchmachen, wenn die Expression
des KIF1b-β-Gens
und des neuen, mit Kinesin verwandten Gens ohne Motordomäne unter
Einsatz von Antisense-RNA
supprimiert werden. Somit fördert
der Verlust dieser Gene die Tumorentstehung bei normalen Zellen.
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Ausführungsformen
der Erfindung sind:
- 1. Eine Nukleinsäure, die
a)
eine Nukleinsäure
mit der in SEQ ID NO: 4 dargelegten Basensequenz ist oder
b)
eine Nukleinsäure
ist, die für
ein Protein, das die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz
umfasst, kodiert.
- 2. Eine Nukleinsäure
nach Ausführungsform
1 zur diagnostischen oder therapeutischen Verwendung.
- 3. Eine Nukleinsäure
mit der in SEQ ID NO: 7 dargelegten Basensequenz.
- 4. Ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 dargelegten Aminosäuresequenz
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
- 5. Verwendung eines Proteins mit der in SEQ ID NO: 2 dargelegten
Aminosäuresequenz
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln
von Neuroblastom.
- 6. Verwendung einer Nukleinsäure
mit der in SEQ ID NO: 4 dargelegten Basensequenz zur Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von Neuroblastom.
- 7. Verfahren zum Bestimmen der Prognose von humanem Neuroblastom,
wobei es das Verfahren umfasst, das Expressionsniveau des Proteins,
für das
die Nukleinsäure
von SEQ ID NO: 4 kodiert, in einer vorher von einem Patienten gewonnenen,
klinischen Gewebeprobe aus Neuroblastom zu ermitteln, wobei eine günstige Prognose
mit einer im Vergleich zu einer klinischen Gewebeprobe mit einer
ungünstigen
Prognose erweiterten Expression des Proteins, für das die Nukleinsäure von
SEQ ID NO: 4 kodiert, korreliert.
- 8. Verfahren nach Ausführungsform
7, wobei die Expression des Proteins, für das die Nukleinsäure von SEQ
ID NO: 4 kodiert, unter Verwendung von Nukleinsäuresonden oder von PCR Primern
ermittelt wird.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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1A und 1B sind
beide Darstellungen, die Elektrophorese-Fotografien entsprechen,
welche die Ergebnisse des Untersuchens der Genexpression von KIF1b-β in Neuroblastomen
vom Menschen mit günstiger
Prognose beziehungsweise mit ungünstiger
Prognose durch semiquantitative RT-PCT zeigen. In den Figuren stellen
die Bahnen 1–16
klinische Gewebeproben von Neuroblastomen vom Menschen mit günstiger
Prognose dar und die Bahnen 17–32
stellen klinische Gewebeproben von Neuroblastomen vom Menschen mit
günstiger
Prognose dar.
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2 ist
eine schematische Zeichnung der in den Beispielen verwendeten GSE-Methode.
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3A ist
eine Darstellung, die der Fotografie eines Soft-Agarose-Gels entspricht,
das Wachstum als Ergebnis von verankerungsunabhängigem Wachstum von Brustdrüsenzellen
der Maus, in die das KIF1b-β-Gen
und ein mit Kinesin verwandtes Gen, dem die Motordomäne fehlt,
als Antisense (KIFAS) unter Einsatz eines Retrovirus-Vektors eingebracht
wurde, zeigt.
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3B ist
eine Darstellung, die der Fotografie eines Soft-Agarose-Gels entspricht,
das die Ergebnisse von verankerungsunabhängigem Wachstum von Brustdrüsenzellen
der Maus, in die als negative Kontrolle ein Gen für Neomycinresistenz
unter Einsatz eines Retrovirus-Vektors eingebracht wurde, zeigt.
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4 ist
ein Diagramm, das Wachstumskurven für NMuMG-Krebszellen, in die
unter Einsatz eines Adenovirus-Vektors das KIF1b-β-Gen eingebracht
wurde, zeigt.
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5 ist
ein Diagramm, das Wachstumskurven für NB-C201-Zellen, in die unter
Einsatz eines Adenovirus-Vektors das KIF1b-β-Gen eingebracht wurde, zeigt.
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6 ist eine Darstellung, die einer Fotografie
entspricht, die Tumorentstehung als Ergebnis der Transplantation
von Brustdrüsenzellen
der Maus, in die unter Einsatz eines Retrovirus-Vektors KIFAS eingebracht
wurde, unter die Oberschenkelhaut von nackten Mäusen zeigt.
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6B ist
eine Darstellung, die einer Fotografie entspricht, welche die Ergebnisse
der Transplantation von Brustdrüsenzellen
der Maus, in die als negative Kontrolle ein Gen für Neomycinresistenz
eingebracht wurde, unter die Oberschenkelhaut von nackten Mäusen zeigt.
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7 ist
ein Diagramm der Tumorentstehung bei der Maus, die in 6A gezeigt
ist, in dem die Tumorgröße (das
Tumorvolumen) gegen die Zeit aufgetragen ist.
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Bester Modus zum Ausführen der
Erfindung
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Der
Aufbau und bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung werden nun ausführlich
beschrieben werden.
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Der
Ausdruck „Protein
mit der in SEQ ID NO: 1 dargelegten Aminosäuresequenz", wie er überall in der vorliegenden
Beschreibung verwendet wird, kann sich nicht nur auf ein Protein,
für das
die in SEQ ID NO: 3 dargelegte Nukleinsäure kodiert, beziehen, sondern
auch auf jedes Protein mit einer im Wesentlichen gleichwertigen
Aktivität.
Ein Protein mit einer im Wesentlichen gleichwertigen Aktivität ist ein
Protein mit einer Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen mit der in SEQ ID NO: 1 dargelegten Aminosäuresequenz
identisch ist. Die letztere Aminosäuresequenz kann zum Beispiel
eine Aminosäuresequenz,
die durch die Substitution oder die Deletion von einer oder mehreren
Aminosäuren
in der in SEQ ID NO: 1 dargelegten Aminosäuresequenz oder durch das Hinzufügen von
einer oder mehreren Aminosäuren
zu der in SEQ ID NO: 1 dargelegten Aminosäuresequenz ableitbar ist, sein.
Auch hat der Ausdruck „Protein
mit der in SEQ ID NO: 2 dargelegten Aminosäuresequenz" eine genau entsprechende Bedeutung
und kann sich nicht nur auf ein Protein, für das die in SEQ ID NO: 4 dargelegte
Nukleinsäure
kodiert, beziehen, sondern auch auf jedes Protein mit einer im Wesentlichen
gleichwertigen Aktivität.
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Der
Ausdruck „Nukleinsäure mit
der in SEQ ID NO: 3 dargelegten Basensequenz", wie er überall in der vorliegenden
Beschreibung verwendet wird, kann sich auch auf eine Nukleinsäure mit
einer Basensequenz beziehen, die für ein Protein kodiert, das
eine dem Protein, für
das die in SEQ ID NO: 3 dargelegte Nukleinsäure kodiert, im Wesentlichen
gleichwertige Aktivität
hat. Der Ausdruck „Nukleinsäure mit
der in SEQ ID NO: 4 dargelegten Basensequenz", hat eine genau entsprechende Bedeutung
und kann sich auch auf eine Nukleinsäure mit einer Basensequenz
beziehen, die für
ein Protein kodiert, das eine dem Protein, für das die in SEQ ID NO: 4 dargelegte
Nukleinsäure
kodiert, im Wesentlichen gleichwertige Aktivität hat. Solche Nukleinsäuren und
Proteinvarianten können
gemäß Verfahren,
die Fachleuten bekannt sind, wie zum Beispiel ortsspezifischer Mutation,
auf der Basis der Information über
die Basensequenz der oben erwähnten
Nukleinsäuren
hergestellt werden.
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Der
Begriff „Nukleinsäure", wie er überall in
der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf DNA
oder RNA, die für
ein Protein wie oben definiert oder ein Teilpeptid als funktionell
wirksames Fragment des Proteins kodiert, die zu einer Nukleinsäure, die
für ein
solches Protein oder Teilpeptid kodiert, komplementär ist oder
die unter „stringenten" Bedingungen mit
einer solchen Nukleinsäure
hybridisiert.
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Wenn
die Menge der Expression einer Nukleinsäure dieser Erfindung in Neuroblastomen
mit günstiger Prognose
und mit ungünstiger
Prognose verglichen wird, stellt man fest, dass sie in Neuroblastomen
mit günstiger
Prognose in größeren Mengen
exprimiert wird. Das Einbringen von Antisense (Nukleinsäure) (unten
beschrieben) gegen die Nukleinsäure
in normale Zellen fördert
verankerungsunabhängiges
Wachstum der normalen Zellen und steigert die Tumorentstehung. Aus
diesen Gründen
wird angenommen, dass die Nukleinsäuren der Erfindung zumindest
die Funktion des Aufrechterhaltens biologischer Normalität (zum Beispiel
des Supprimierens der Krebsentwicklung von Zellen) haben.
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(1) Brauchbarkeit zur Diagnostik (siehe
Ausführungsform
7 oben)
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Die
Nukleinsäuren,
Proteine und Teilpeptide dieser Erfindung und auch Antikörper für die Proteine
und Teilpeptide sind für
die Diagnostik nützlich.
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Besonders
können
diese Moleküle
dazu verwendet werden, Krankheiten (wie zum Beispiel Neuroblastom)
oder Funktionsstörungen,
bei denen eine Zunahme oder Abnahme der Expression der Proteine
der Erfindung oder ihrer Teilpeptide eine Rolle spielt, mit einer
jeden von verschiedenen Testmethoden zum Zweck der Prognosenvorhersage,
der Diagnose und der Überwachung
zu erkennen.
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Es
gibt keine speziellen Einschränkungen
von Immunassayverfahren unter Verwendung von Antikörpern für die Proteine
der Erfindung oder ihre Teilpeptide und es können verschiedene kompetitive
und nicht kompetitive Testverfahren angeführt werden, die solche Methoden
wie Western Blotting, Radioimmunassay, ELISA, „Sandwich"-Immunassay, Immunpräzipitation, Präzipitinreaktion,
Geldifferenzierungspräzipitinreaktion,
Immundiffusionstest, Agglutinationstest, Komplementbindungstest,
immunradiometrische Untersuchung, Fluoreszenzimmunassay und Protein-A-Immunassay
einsetzen.
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Wenn
man eine Nukleinsäure
der Erfindung zur Diagnostik einsetzt, kann sie als Hybridisierungssonde oder
als PCR Primer zum Nachweis von gesteigerter Genexpression in Zellproben
verwendet werden, um die Prognose festzulegen. Die gesteigerte Ge nexpression
kann durch jedes Verfahren untersucht werden, das eine Basensequenz,
die mit irgendeiner gewünschten
Sequenz unter den durch die Erfindung offenbarten Basensequenzen
hybridisiert, als Sonde verwendet. Vorzugsweise wird eine mit einem
radioaktiven Isotop markierte Sonde verwendet, um mit Southern oder
Northern Blotting zu untersuchen. Wenn die Menge von Nukleinsäure, die
mit der Sonde in der Zellprobe hybridisiert, erhöht ist, kann die Diagnose einer
günstigen
Prognose gestellt werden. Wenn die Nukleinsäure als Primer zur PCR verwendet
wird, kann RNA aus der Probe (den Zellen) extrahiert werden, um
untersucht zu werden, und die Genexpression kann mittels RT-PCR
semiquantitativ gemessen werden.
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(2) Brauchbarkeit zur Therapie (siehe
Ausführungsform
5 oben)
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Die
Nukleinsäuren,
Proteine und Teilpeptide der Erfindung sind nützliche Wirkstoffe für die Behandlung von
Krankheiten und Funktionsstörungen,
mit denen eine(s) davon verbunden ist.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein
oder Teilpeptid der Erfindung umfasst, gegen eine Krankheit (besonders
einen malignen Tumor) oder eine Funktionsstörung, die mit einer verminderten
Expression des Proteins oder des Teilpeptids einhergeht, verabreicht
werden. Es kann auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche
eine Nukleinsäure
der Erfindung in ihrer Gesamtheit oder als Teil umfasst, verabreicht
werden.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Antisense, neutralisierende
Antikörper
oder einen kompetitiven Hemmstoff für ein Protein oder Teilpeptid
der Erfindung umfasst, gegen eine Krankheit oder Funktionsstörung, die
mit einer gesteigerten Expression des Proteins oder Peptids einhergeht,
verabreicht werden, um entweder die Expression zu supprimieren oder
die Funktion des Proteins oder Peptids zu hemmen.
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Besonders
dann, wenn eine Nukleinsäure
der Erfindung zur Gentherapie für
den oben beschriebenen Zweck eingesetzt wird, kann die Nukleinsäure in einen
Vektor, der zum Gentransfer verwendet wird, eingebracht werden,
und das eingebrachte Gen kann im Körper des Patienten unter jedem
gewünschten
Expressionspromotor zum Beispiel zur Behandlung von Krebs exprimiert
werden.
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Der
Vektor zur Insertion der Nukleinsäure wird vorzugsweise auf Basis
eines DNA- oder RNA-Virus konstruiert. Es gibt keine speziellen
Einschränkungen
für die
Art des Virusvektors und es können
MoMLV-Vektor, Herpesvirus-Vektor, Adenovirus-Vektor, AAV-Vektor, HIV-Vektor,
SIV-Vektor, Sendaivirus-Vektor und Ähnliche verwendet werden.
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Alternativ
kann ein pseudotypisierter Virusvektor, in dem ein oder mehrere
der grundlegenden Proteine des Virusvektors mit einem grundlegenden
Protein einer anderen Virusart ersetzt ist oder in dem ein Teil
der Nukleinsäuresequenz
der genetischen Information mit einer Nukleinsäuresequenz einer anderen Virusart
ersetzt ist, verwendet werden. Als Beispiel kann ein pseudotypisierter
Virusvektor, in dem das Protein Env, das Hüllenprotein von HIV, mit dem
Protein VSV-G, dem Hüllenprotein
des Vesicular Stomatitis Virus (VSV) ersetzt ist (Naldini L. et
al., Science 272: 263–267
(1996)), angeführt
werden.
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Solange
das Virus eine therapeutische Wirkung hat, kann es als Virusvektor
eingesetzt werden, auch wenn sein Wirtsbereich ein anderer als der
Mensch ist. Es können
auch Vektoren, die nicht von Viren stammen, verwendet werden, wie
zum Beispiel Calciumphosphat-Nukleinsäure-Komplexe, Liposomen, kationische
Lipidkomplexe, Sendaivirus-Liposomen,
Polymerträger
mit polykationischem Rückgrat
und Ähnliches.
Bei dem verwendeten System zum Gentransfer kann es sich um Elektroporation,
eine Genkanone und Ähnliches
handeln.
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Für die Genexpression
der Nukleinsäure
der Erfindung, die in das vorher erwähnte Virus eingebracht wurde,
wird eine Expressionskassette, die einen Expressionspromotor umfasst,
bevorzugt.
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Die
eingesetzte Expressionskassette kann von jeder Art sein, welche
die Expression des Gens in Zielzellen ohne spezielle Einschränkungen
zulässt.
Ein Fachmann kann leicht eine solche Expressionskassette auswählen, bei
der es sich vorzugsweise um eine Ex pressionskassette handelt, die
Genexpression in Zellen, die von Tieren stammen, zulässt, bevorzugter
um eine Expressionskassette, die Genexpression in Zellen, die von
Säugern
stammen, zulässt
und noch bevorzugter um eine Expressionskassette, die Genexpression
in menschlichen Zellen zulässt.
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Zusätzlich zur
Nukleinsäure
der Erfindung kann die Expressionskassette verschiedene Sequenzen wie
zum Beispiel einen Promotor oder einen Enhancer für die Gentranskription,
ein Poly-A-Signal, ein Markergen zum Markieren und/oder Selektieren
der Zellen, in die ein Gen eingebracht wurde, eine Virusgensequenz zur
wirksamen Insertion des Gens in die genomische DNA-Sequenz der Zelle
und eine Signalsequenz für
die extrazelluläre
Sekretion und/oder die lokale, intrazelluläre Anreicherung der als Arzneimittel
wirkenden Substanz, die von dem Gen hergestellt wurde, umfassen.
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Als
Promotorsequenzen, die in der Expressionskassette zu verwenden sind,
können
Promotoren, die von solchen Viren wie Adenovirus, Zytomegalie-Virus,
Humanem Immundefizienz-Virus, Affenvirus 40, Rous-Sarkom-Virus,
Herpes Simplex-Virus, Maus-Leukämie-Virus,
Sindbis-Virus, Hepatitis A-Virus, Hepatitis B-Virus, Hepatitis C-Virus,
Papilloma-Virus, Humanem T-Zell-Leukämie-Virus, Grippevirus, Japanische
Encephalitis-Virus, JC-Virus, Parvovirus B19 und Poliovirus abgeleitet
sind, Säuger-Promotoren
wie zum Beispiel Albumin, SRα,
Hitzeschockprotein und Promotoren für Elongationsfaktoren, chimäre Promotoren
wie zum Beispiel der CAG-Promotor und Promotoren, deren Aktivität durch
Tetrazykline, Steroide und Ähnliches
induziert wird, angeführt
werden.
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(3) Pharmazeutische Zusammensetzung
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Die
Nukleinsäuren,
Proteine und Teilpeptide dieser Erfindung werden in Form von geeigneten
pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung eingesetzt. Die
Nukleinsäuren
oder Ähnliches
werden daher gemäß dem unten
beschriebenen Formulierungsverfahren hergestellt, ein bevorzugter
Verabreichungsweg wird festgelegt und die Dosierung wird so festgesetzt,
dass die erwünschte
therapeutische Wirkung erreicht wird.
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(Formulierungsverfahren)
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Die
eine Nukleinsäure,
ein Protein oder Peptid umfassende pharmazeutische Zusammensetzung
gemäß der Erfindung
ist nicht spezifisch eingeschränkt
und ein Arzneimittel kann durch Verkapselung in Liposomen, feinen
Partikeln oder Mikrokapseln, Expression in rekombinanten Zellen,
Rezeptor-vermittelte Aufnahme oder als Retrovirus oder Teil einer
anderen Vektorart konstruiert werden.
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Spezieller
kann ein rekombinanter Virusvektor, der eine Nukleinsäure der
Erfindung umfasst, in einem geeigneten Lösungsmittel wie zum Beispiel
Wasser, physiologischer Salzlösung
oder einer isotonisierten Pufferlösung gelöst werden, um eine Zusammensetzung,
welche die Nukleinsäure
der Erfindung enthält,
herzustellen. Alternativ kann ein Protein oder Teilpeptid der Erfindung
in einem geeigneten Lösungsmittel
wie zum Beispiel in Wasser, physiologischer Salzlösung oder
in einer isotonisierten Pufferlösung
gelöst
werden, um eine Zusammensetzung, welche das Protein oder Teilpeptid
der Erfindung enthält,
herzustellen. Polyethylenglykol, Glucose, verschiedene Aminosäuren, Kollagen,
Albumin und Ähnliches
können
als Schutzmaterialien für
die Herstellung zugegeben werden.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann in neutralisierter
Form oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes formuliert
werden. Pharmazeutisch annehmbare Salze schließen diejenigen, die mit der
freien Aminogruppe von einem Protein oder Peptid gebildet werden,
wie zum Beispiel diejenigen, die von Hydrochlorsäure, Phosphorsäure, Ethansäure, Oxalsäure, Weinsäure oder Ähnlichem
abgeleitet sind, oder diejenigen, die mit der freien Carboxylgruppe
von einem Protein oder Peptid gebildet werden, wie zum Beispiel
diejenigen, die von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Eisen(II)-hydroxid,
Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain
oder Ähnlichem
abgeleitet sind, ein
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(Verfahren der Verabreichung und Dosierung)
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Wenn
eine pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung dem Körper verabreicht
wird, gibt es keine spezifischen Beschränkungen des Verfahrens der
Verabreichung. Es kann zum Beispiel vorzugsweise durch intradermale,
intramuskuläre,
intrape ritoneale, intravenöse,
subcutane oder intranasale Injektion ausgeführt werden. Die Dosierung der
pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung wird vom Verabreichungsweg
und dem Zustand, dem Alter, dem Körpergewicht, dem Geschlecht
etc. des Patienten, an den verabreicht wird, abhängen und die optimale Dosis
für einen
bestimmten Patienten kann vom praktizierenden Arzt festgelegt werden.
Im Falle der Injektion beträgt
zum Beispiel die Dosierung vorzugsweise etwa 0,1 μg/kg bis 1000
mg/kg pro Tag, bevorzugter etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg pro Tag.
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(4) Zielerkrankungen und Zielfunktionsstörungen
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Es
gibt keine spezifischen Beschränkungen
der Zielerkrankungen und Zielfunktionsstörungen, die mit einer Nukleinsäure, einem
Protein oder Teilpeptid der Erfindung als Arzneimittel zu behandeln
sind, solange die Funktion der Nukleinsäure etc. direkt oder indirekt
in einem Zusammenhang mit dem Zustand steht. Wie oben erwähnt, fördert das
Einbringen von Antisense zur Nukleinsäure der Erfindung in normale
Zellen das von einer Verankerung unabhängige Wachstum der normalen
Zellen und steigert die Tumorentstehung. Folglich supprimieren die
Nukleinsäuren,
Proteine und Teilpeptide der Erfindung klar die Entwicklung normaler
Zellen zu Krebszellen und sind besonders gegen maligne Tumoren nützlich.
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Es
gibt keine spezifischen Beschränkungen
von malignen Tumoren als Ziele der Behandlung mit den Nukleinsäuren etc.
der Erfindung und es können
akute Leukämie,
chronische Leukämie,
Lymphom, Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Leberzellkarzinom,
Choriokarzinom, Seminom, embryonales Karzinom, Wilms Tumor, Gallengangskarzinom,
Hodenkarzinom, Zervixkarzinom, Bronchialkarzinom, kleinzelliges
Bronchialkarzinom, Blasenkarzinom, epitheliales Karzinom, Gliazellkarzinom,
Medulloblastom, Epithelzellkarzinom, Angioblastom, Melanom, Neuroblastom,
Retinoblastom, Chondrosarkom, Angiosarkom, endotheliales Sarkom,
Lymphangiosarkom, Colonkarzinom, Mammakarzinom, Ovarialkarzinom,
Prostatakarzinom, Plattenepithelkarzinom, papilläres Adenom, Zystadenokarzinom
und Nierenzellkarzinom angeführt
werden. Wenn die Nukleinsäuren
etc. der Erfindung für
die Behandlung von malignen Tumoren eingesetzt werden, erlaubt es ihre
Funktion, dass sie auch als Arzneimittel zum Supprimieren von Metastasen
von malignen Tumoren eingesetzt werden.
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(5) Antisense (Nukleinsäure)
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Es
wird eine Antisense-Nukleinsäure
verwendet, welche die Expression eines Gens, das von der Erfindung
offenbart wird (einschließlich
der Nukleinsäuren
der Erfindung) supprimiert, um eine therapeutische oder prophylaktische
Wirkung zu erzielen. Hier bezieht sich „Antisense-Nukleinsäure" auf eine Nukleinsäure, die
aufgrund eines bestimmten Maßes
an Sequenzkomplementarität
an einen Teil von RNA (vorzugsweise mRNA) eines Gens der Erfindung
hybridisieren kann.
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Die
Antisense-Nukleinsäure
kann in Form einer doppelsträngigen
oder einer einzelsträngigen
Nukleinsäure
und entweder als RNA oder als DNA (welche für die RNA kodiert) Oligonukleotid
oder als chimäres Gemisch
davon verwendet werden. Die Antisense-Nukleinsäure ist nicht spezifisch eingeschränkt und
kann aus einem Oligonukleotid von vorzugsweise 5–500 und bevorzugter von 200–500 Basen
bestehen. Das Oligonukleotid kann auch in seinem Basenteil, Riboseteil
oder Phosphat-Rückgrat
modifiziert sein.
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Die
Antisense-Nukleinsäure
kann in Form von katalytischer RNA, Ribozym oder chimärem RNA-DNA-Analogon
verwendet werden.
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Die
Antisense-Nukleinsäure
kann mit einem Verfahren, das einem Fachmann bekannt ist, synthetisiert werden,
zum Beispiel unter Einsatz eines automatisierten DNA-Synthesizers.
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Wenn
die Antisense-Nukleinsäure
für den
Zweck der Behandlung oder Vorbeugung eingesetzt wird, kann sie einem
Patienten in derselben Art und Weise, wie oben für andere Nukleinsäuren beschrieben,
als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden, wird aber
höchst
bevorzugt speziellen Zellen (zum Beispiel Krebszellen) direkt verabreicht.
Zellen können
auch mit einem Vektor, der DNA, die für RNA-Antisense-Nukleinsäure kodiert,
umfasst, transformiert oder transfiziert werden, um die Antisense-Nukleinsäure durch Transkription
in den Zellen herzustellen.
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(6) Antikörper
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Antikörper gegen
ein Protein oder ein Teilpeptid der Erfindung oder Fragmente davon
einschließlich der
Bindungsdomänen
können
als therapeutische oder diagnostische Wirkstoffe verwendet werden.
Speziell zur Verwendung als therapeutischer Wirkstoff kann ein Antikörper an
eine spezifische Region eines Proteins der Erfindung gebunden werden,
um als Antagonist oder als Agonist zu wirken. Zur Verwendung als
diagnostischer Wirkstoff können
Antikörper
in verschiedenen Arten von Immunassays zum Nachweis und zur Messung eines
Proteins der Erfindung wie oben erwähnt verwendet werden.
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Die
Antikörper
können
unter Verwendung des Proteins oder Teilpeptids der Erfindung oder
eines Fragments, Analogons oder Derivats davon als Immunogen in Übereinstimmung
mit Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden.
Als solche Antikörper
können
polyklonale Antikörper,
monoklonale Antikörper,
chimäre
Antikörper,
einzelsträngige
Antikörper,
Fab-Fragmente oder Antikörper,
die aus einer FAB-Expressionsbibliothek
stammen, angeführt
werden.
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(7) Knockout-Tiere
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Gemäß noch einer
anderen Ausführungsform
der Erfindung können
eine Nukleinsäuresequenz,
welche die Expression eines Gens der Erfindung ausschaltet, und
Knockout-Tiere,
welche diese Sequenz als Transgen in sich eingebracht haben, bereitgestellt
werden. Basierend auf dieser Information können Tiere für Krebsmodelle
konstruiert werden.
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Die
Erfindung wird nun ausführlicher
durch Beispiele beschrieben werden. Diese Beispiele sind jedoch ein
keiner Weise für
die Erfindung einschränkend.
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Beispiele
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(Beispiel 1) Klonierung der cDNA mit der
vollen Länge
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Ausgehend
von der Aminosäuresequenz
für das
mit Kinesin verwandte Protein, dem die Motordomäne fehlt (SEQ ID NO: 1), wurde
das 5'-Ende aus
einer humanen, embryonischen Gehirnbibliothek (Clontech) unter Verwendung
eines SMART RACE cDNA Amplifikationskits (Clontech) kloniert. Die
Basensequenz des klonierten DNA-Fragments wurde in Übereinstimmung
mit einem etablierten Protokoll (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74: 5463–5467
(1977)) bestimmt. Die gesamten Basensequenzen von beiden Strängen wurden
untersucht.
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Die
Ergebnisse der Untersuchung identifizierten ein DNA-Fragment für das bekannte,
mit Kinesin verwandte Protein, dem die Motordomäne fehlt, und weitere 1390
Basenpaare am 5'-Ende.
Eine Suche nach der translatierten Region des Fragments erbrachte
eine Region von 85 Basenpaaren am 5'-Ende, die nicht translatiert wird,
eine Region von 5472 Basenpaaren, die translatiert wird und eine
Region von 1353 Basenpaaren am 3'-Ende,
die nicht translatiert wird. Das translatierte Protein bestand aus
1824 Aminosäuren
und hatte ein Molekulargewicht von 205.065 Dalton. Die Aminosäuresequenz
des translatierten Proteins wird in SEQ ID NO: 2 dargelegt und die
Rasensequenz der translatierten Region wird in SEQ ID NO: 4 dargelegt.
Dieses neue, mit Kinesin verwandte Protein wurde als KIF1b-β bezeichnet.
Die in SEQ ID NO: 4 dargelegte Basensequenz wurde bei DDBJ, GenBank
und EMBL (Zugangsnummer: AB017133) registriert.
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(Beispiel 2) Messung der Genexpression
in Neuroblastomen vom Menschen mit günstiger und ungünstiger Prognose
durch semiquantitative PCR
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Aus
Teilen des KIF1b-β-Gens
wurden PCR-Primer synthetisiert und für eine vergleichende Messung von
Expression in klinischen Gewebeproben aus Neuroblastom mit günstiger
Prognose und mit ungünstiger Prognose
verwendet. Die Sequenzen der synthetisierten PCR-Primer sind in
SEQ ID NO: 5 (Vorwärts-Primer) und
in SEQ ID NO: 6 (reverser Primer) dargelegt. Aus klinischen Gewebeproben
von Neuroblastom vom Menschen wurde mRNA extrahiert und einer PCR-Reaktion
unter Einsatz von rTaq (Takara Shuzo) unterzogen. Genau bezeichnet
wurden 5 μl
steriles, destilliertes Wasser, 2 μl der mRNA, 1 μl von 10 × rTaq-Puffer,
1 μl der 2
mM dNTPs, 0,5 μl
von jedem synthetisierten Primerset und 0,5 μl rTaq kombiniert. Das Gemisch
wurde 2 Minuten lang bei 95°C
denaturiert und dann wurde ein Zyklus von 15 Sekunden lang 95°C, 15 Sekunden
lang 63°C
und 20 Sekunden lang 72°C über 35 Zyklen
wiederholt. Dem folgten 6 Minuten Stehen bei 72°C, um die PCR-Reaktion zu vervollständigen.
Die Reaktionslösung
wurde einer Elektrophorese auf einem 2,5%-Agarosegel unterzogen.
Die Ergebnisse sind in 1A und 1B dargestellt.
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Die
Ergebnisse in 1 bestätigten eine
gesteigerte Expression des KIF1b-β-Gens
nur in Neuroblastom vom Menschen mit günstiger Prognose.
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(Beispiel 3) Untersuchungen der Wirkungen
von KIF1b-β-Gen
und mit Kinesin verwandtem Gen, dem die Motordomäne fehlt, auf das Tumorwachstum
mit der „Genetic
Suppressor Element" (GSE)
Methode (1) „GSE" bezieht sich auf
ein kurzes, biologisch aktives Genfragment, das für ein dominant
-
agierendes
Peptid oder eine hemmende Antisense-RNA kodiert. Die Methode, die
GSE als Instrument in der molekularen Onkologie einsetzt, ist als
GSE-Methode bekannt und ihr Konzept und ihre Strategie sind in Roninson
IB et al., Cancer Res. 55: 4023–4028
(1995) zusammengefasst. Speziell kann die GSE-Methode zur funktionellen
Untersuchung von jedem Gen in Verbindung mit Tumorwachstum angewandt
werden. Die Technik umfasst Gentransfer in eine Empfängerzelle
unter Verwendung eines Retrovirurs-Vektors und einer Verpackungszelle
und das Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens von Tumorentstehung. 2 zeigt
eine Übersicht
dieser Technik in der Abfolge. Spezieller wird Antisense gegen das
Gen von Interesse in die Empfängerzellen
eingebracht, was zur Suppression der Genfunktion in den Zellen führt. Konsequenterweise
kann, wenn die Zellen, in die Antisense eingebracht wurde, tumorbildende
Qualität
wie zum Beispiel von Verankerung unabhängiges Wachstum erlangen, der
Schluss gezogen werden, dass die ursprüngliche Funktion des Gens eine
negative Kontrolle auf die Tumorentstehung ausübt.
-
Dem
Protokoll von Garkavtsev et al. (Garkavtsev I. et al., Nature Genet.
4, 415–420
(1996)) folgend wurde ein Retrovirus-Vektor konstruiert, um Antisense
gegen das KIF1b-β-Gen
(KIF1b-β)
und das mit Kinesin verwandte Gen, dem die Motordomäne fehlt
(auch als „KIFAS" bezeichnet) zu exprimieren,
und wurde zur Transfektion von Brustdrüsenzellen der Maus verwendet.
Die verwendete Antisense-Sequenz ist in SEQ ID NO: 7 dargelegt.
Antisense wurde an einen synthetischen Adapter ligiert und der Sense-Strang
des Adapters wurde als PCR-Primer für die PCR-Amplifikation verwendet.
Die PCR-amplifizierte DNA wurde in einen Retrovirus-Vektor pLXSN
kloniert und die erhaltene Plasmidbibliothek wurde in BOSC23 Virusverpackungszellen transfiziert.
Brustdrüsenzellen
von der Maus (nicht zu Tumorzellen umgewandelte, immortalisierte
Brustdrüsenzellen
der Maus: NMuMG) wurden mit der Flüssigkeit des Kulturüberstands,
die Retrovirus enthielt, infiziert. Die infizierten Brustdrüsenzellen
von der Maus wurden auf Soft-Agar-Medium (Soft-Agarose-Gel) kultiviert
und das Vorliegen von Wachstum, das von Verankerung unabhängig war,
wurde beobachtet. Als (negative) Kontrolle wurden Brustdrüsenzellen
von der Maus, in die ein Gen für
Neomycinresistenz auf die gleiche Weise eingebracht worden war,
verwendet. Das Soft-Agar-Medium bestand aus einer unteren Schicht
(DMEM, 10% FCS, 0,6% Agar) und einer oberen Schicht (DMEM, 10% FCS,
0,3% Agar) und 5 × 104 Zellen wurden auf das Soft-Agar-Medium (10-cm-Platte) übertragen
und man beließ sie
6–7 Wochen
lang bei 37°C.
Die Ergebnisse der Beobachtung sind in 3A (Zellen,
in die KIFAS eingebracht wurde) und 3B (negative
Kontrolle) dargestellt.
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Wie
von den Ergebnissen in 3A und 3B gezeigt
wird, wurde ein im Vergleich mit der negativen Kontrolle merkliches,
von Verankerung unabhängiges
Wachstum in den mit KIFAS transformierten Brustdrüsenzellen
der Maus beobachtet.
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In
gleicher Weise wie oben wurde die cDNA mit voller Länge für das KIF1b-β-Gen (SEQ
ID NO: 4) in einen Adenovirus-Vektor eingebracht und dazu verwendet,
NMuMG Mammakarzinomzellen zu infizieren. Die Zellen wurden in Medium
gezüchtet
und die Wachstumskurve wurde ermittelt, wie in 4 gezeigt.
Als Kontrolle wurden NMuMG Mammakarzinomzellen, die mit einem Vektor,
der nur den LacZ-Promotor enthielt, infiziert waren, verwendet.
In der Abbildung stellt „MOI" die Zahl von Viren
für die
Infektion pro Zelle dar.
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Die
cDNA mit voller Länge
für das
KIF1b-β-Gen
wurde auch in einen Adenovirus-Vektor eingebracht und dazu verwendet,
NB-C201 Zellen (eine homozygot-defiziente oder eine Neuroblastom-Zelllinie,
der das KIF1b-β-Gen
fehlt) zu infizieren. Die Zellen wurden in Medium gezüchtet und
die Wachstumskurve wurde ermittelt, wie in 5 gezeigt.
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4 und 5 zeigen
beide, dass das Einbringen des KIF1b-β-Gens das Wachstum von Krebszellen
supprimiert.
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(Beispiel 4) Untersuchungen der Wirkungen
von KIF1b-β-Gen
und mit Kinesin verwandtem Gen, dem die Motordomäne fehlt, auf das Tumorwachstum
mit der GSE-Methode (2)
-
Unter
Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 3 beschrieben wurden
Brustdrüsenzellen
von der Maus, die mit einem Retrovirusvektor, der KIFAS exprimierte,
infiziert waren, unter die Haut des Oberschenkels einer nackten
Maus transplantiert und das Vorliegen oder Fehlen von Tumorentstehung
wurde bestätigt.
Als (negative) Kontrolle wurden Brustdrüsenzellen von der Maus, in
die auf gleiche Weise wie Beispiel 3 ein Gen für Neomycinresistenz eingebracht
worden war, verwendet und sie wurden auch unter die Haut einer nackten
Maus transplantiert. Die Ergebnisse sind in 6A (KIFAS
eingebracht) und in 6B (negative Kontrolle) gezeigt.
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Wie
durch die Ergebnisse in 6A und 6B gezeigt
wird, wurde eine im Vergleich mit der negativen Kontrolle merkliche
Tumorentstehung beobachtet, wenn die mit KIFAS transformierten Brustdrüsenzellen der
Maus unter die Haut des Oberschenkels der nackten Maus transplantiert
wurden.
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Mit
KIFAS transformierte Brustdrüenzellen
der Maus und Brustdrüsenzellen
der Maus, in die ein Gen für
Neomycinresistenz eingebracht worden war, wurden auch in jeweils
5 nackte Mäuse
einer behandelten Gruppe und einer Kontrollgruppe transplantiert
und die Veränderungen
der Größen der
Tumore, die sich bildeten, wurden gemessen. Die Ergebnisse sind
in 7 dargestellt, die klar eine Zunahme der Tumorgröße während der
5 Wochen nach der Transplantation in der behandelten Gruppe zeigt.
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Industrielle Verwendbarkeit
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Die
Nukleinsäuren
dieser Erfindung sind DNA oder RNA für neue, mit Kinesin verwandte
Gene mit einer Motordomäne,
welche die Basensequenzdaten der mit Kinesin verwandten Gene aufklären.
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Die
Nukleinsäuren
dieser Erfindung oder ihre Fragmente können als Sonden oder Primer
für verschiedene
Arten von Hybridisierung oder PCR, gerichtet auf den Nachweis von
Expression der mit Kinesin verwandten Gene in Gewebe oder Zellen
und auf die Untersuchung ihrer Strukturen und Funktionen, verwendet
werden. Die Kinesin-Proteine, für
welche die Gene kodieren, können
mithilfe der Gentechnologie hergestellt werden.
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Weiterhin
kann, da die Expression der Nukleinsäuren der Erfindung nur in klinischem
Gewebe aus Neuroblastom mit günstiger
Prognose gesteigert ist, die Prognose eines Neuroblastoms auf der
Basis ihres Expressionsniveaus diagnostiziert werden.
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Es
wurde bestätigt,
dass ein Supprimieren der Expression des KIF1b-β-Gens und des mit Kinesin verwandten
Gens, dem die Motordomäne
fehlt, mit Antisense-Nukleinsäuren
gemäß der Erfindung
ein von Verankerung unabhängiges
Wachstum normaler Zellen, die inhärent nur in einer von Verankerung
abhängigen Weise
wachsen, fördert.
Das heißt,
es wurde gezeigt, dass die Gene so wirken, dass sie eine Entartung
normaler Zellen zu Krebszellen supprimieren. Es wurde weiter auch
entdeckt, dass ein Einbringen des KIF1b-β-Gens in Krebszellen das Wachstum
der Zellen supprimiert. Auf der Grundlage dieser Befunde können die
Nukleinsäuren,
Proteine etc. dieser Erfindung als Wirk stoffe gegen Krebs zur Behandlung
von malignen Tumoren zum Zweck des Supprimierens der bösartigen
Entartung von Zellen verwendet werden.
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