DE60035107T2

DE60035107T2 - Spleiss-varianten des lim mineralisierungsproteins

Info

Publication number: DE60035107T2
Application number: DE60035107T
Authority: DE
Inventors: Scott D. Atlanta BODEN; Gregory A. Atlanta HAIR
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2020-04-29
Also published as: KR100697403B1; DE60035107D1; ES2288474T3; US7517866B2; EP1181056A4; HK1045939A1; EP1808182A1; NZ515584A; US20070116689A1; AU765516B2; CN1355714A; EP1181056B1; JP2002542802A; CN1908170A; WO2000066178A1; US7045614B1; HK1045939B; CN1315537C; KR20020033615A; AU4683100A

Description

1. Gebiet der Erfindung
Das Gebiet der Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf osteogene Zellen sowie die Bildung von Knochen und knöchernem Gewebe in Säugetierspezies. Im Speziellen betrifft die Erfindung eine neue Familie von Proteinen sowie Nukleinsäuren, die diese Proteine kodieren, welche die Effizienz der Knochenmineralisation in vitro und in vivo verstärken. Die Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung vielfältiger pathologischer Zustände zur Verfügung, die mit Knochen und knöchernem Gewebe assoziiert sind, wie z.B. der Fusion der Wirbelsäule, Frakturheilung und Osteoporose.
2. Beschreibung des zugehörigen Standes der Technik
Es wird angenommen, dass Osteoblasten aus pluripotenten mesenchymalen Stammzellen differenzieren. Die Reifung eines Osteoblasten führt zur Sekretion einer extrazellulären Matrix, die mineralisieren und Knochen bilden kann. Die Regulation dieses komplexen Ablaufes ist nicht genau verstanden: es wird aber angenommen, dass eine Gruppe von Signal-gebenden Glykoproteinen beteiligt ist, die unter der Bezeichnung Knochen-morphogenetische Proteine (bone morphogenetic proteins, BMPs) bekannt ist. Es wurde gezeigt, dass diese Proteine an der dorso-ventralen Musterbildung im Embryo, der Entwicklung der Extremitätenknospe und der Frakturheilung in adulten Tieren beteiligt sind. B. L. Hogan, Genes & Develop., 10: 1580 (1996). Diese Gruppe der sezernierten Proteine aus der Superfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren-beta (transforming growth factor-beta) verfügt über ein Spektrum an Wirkungen in einer Vielzahl von Zelltypen zu unterschiedlichen Stadien der Differenzierung; die Unterschiede in der physiologischen Aktivität zwischen diesen nah verwandten Molekülen wurden nicht aufgeklärt. D. M. Kingsley, Trends Genet., 10: 16 (1994).
Um die einzelnen physiologischen Rollen der verschiedenen Signal-gebenden BMP-Proteine besser zu unterscheiden, verglichen wir kürzlich die Potenz von BMP-6 bei der Induktion der Differenzierung von Osteoblasten der Schädelkalotte der Ratte mit der von BMP-2 und BMP-4. Boden et al., Endocrinology, 137: 3401 (1996). Wir untersuchten diesen Vorgang in Kulturen nach der ersten Passage (sekundäre Kulturen) von fetalen Schädelkalotten der Ratte, die BMP oder Glucokorticoide benötigen, um die Differenzie rung einzuleiten. In diesem Modell der membranösen Knochenbildung wird ein Glucokorticoid (GC) oder ein BMP die Differenzierung zu mineralisierten Knochenknötchen einleiten, die fähig sind, Osteocalcin, das Osteoblasten-spezifische Protein, zu sezernieren. Dieses sekundäre Kultursystem unterscheidet sich von primären Kulturen der Osteoblasten der Ratte, die eine spontane Differenzierung durchlaufen. In diesem sekundären System führte das Glucokorticoid zu einer zehnfachen Induktion der mRNA- und Proteinexpression von BMP-6, die für die Verstärkung der Osteoblastendifferenzierung verantwortlich war. Boden et al., Endocrinology, 138: 2920 (1997).
Zusätzlich zu extrazellulären Signalen, wie die BMPs, können auch intrazelluläre Signale oder regulatorische Moleküle eine Rolle in der Kaskade von Ereignissen spielen, die zur Bildung neuen Knochens führen. Eine umfangreiche Klasse von intrazellulären regulatorischen Molekülen sind die LIM-Proteine, die so genannt werden, da sie ein charakteristisches Strukturmotiv enthalten, das unter der Bezeichnung LIM-Domäne bekannt ist. Die LIM-Domäne ist ein cysteinreiches strukturelles Motiv, das aus zwei speziellen Zinkfingern gebildet wird, die durch einen Spacer aus 2-Aminosäuren verbunden sind. Einige Proteine haben ausschließlich LIM-Domänen, während andere eine Vielzahl zusätzlicher funktioneller Domänen enthalten. LIM-Proteine bilden eine mannigfaltige Gruppe, die Transkriptionsfaktoren und Proteine des Zytoskeletts beinhalten. Die primäre Aufgabe der LIM-Domänen scheint die Vermittlung von Protein-Protein-Interaktionen durch die Bildung von Dimeren mit identischen oder unterschiedlichen LIM-Domänen oder durch Bindung verschiedener Proteine zu sein.
In LIM-Homöodomänproteinen, d. h. in Proteinen, die sowohl LIM-Domänen als auch eine Homöodomänsequenz aufweisen, wirken die LIM-Domänen als negative regulatorische Elemente. LIM-Homöodomänproteine sind an der Kontrolle der Determinierung der Entwicklungsreihe der Zellen (cell lineage determination) und der Regulation der Differenzierung beteiligt, obwohl reine LIM-Proteine (LIM-only proteins) ähnliche Funktionen haben können. LIM-only Proteine sind auch an der Kontrolle der Zellproliferation beteiligt, da verschiedene Gene, die derartige Proteine kodieren, mit onkogenen Chromosomentranslokationen assoziiert sind.
Menschen und andere Säugetierspezies sind anfällig für Krankheiten oder Verletzungen, die die Vorgänge der Knochenreparatur und/oder -regeneration erfordern. Zum Beispiel würde die Behandlung von Frakturen durch neue Behandlungsregime verbessert werden, die die natürlichen Knochenreparaturmechanismen stimulieren könnten, wodurch die Zeit reduziert würde, die für die Heilung des frakturierten Knochens benötigt wird. In einem anderen Beispiel würden Individuen, die unter systemischen Knochenkrankheiten, wie z.B. Osteoporose, leiden, von Behandlungsregimen profitieren, die zur systemischen Bildung von neuem Knochen führen. Derartige Behandlungsregime würden die Inzidenz von Frakturen reduzieren, die sich aus dem Verlust von Knochenmasse ergeben, der ein Charakteristikum für diese Krankheit ist.
Zumindest wegen dieser Gründe wurden extrazelluläre Faktoren, wie die BMPs, mit der Absicht untersucht, sie zu nutzen, um die Bildung von neuem Knochen in vivo zu stimulieren. Trotz der frühen Erfolge, die mit BMPs und anderen extrazellulären Signalgebenden Molekülen erreicht wurden, bedingt ihre Verwendung eine Reihe von Nachteilen. Zum Beispiel werden relativ hohe Dosen von gereinigten BMPs benötigt, um die Produktion neuen Knochens zu steigern, wodurch die Kosten derartiger Behandlungsverfahren steigen. Außerdem sind extrazelluläre Proteine anfällig für den Abbau, nachdem sie in ein Wirtstier eingebracht wurden. Da sie üblicherweise immunogen sind, besteht darüberhinaus immer die Möglichkeit der Stimulation einer Immunantwort auf die verabreichten Proteine.
Aufgrund derartiger Bedenken wäre es wünschenswert, über ein verfügbares Behandlungsregime zu verfügen, das ein intrazelluläres Signal-gebendes Molekül verwendet, um die Bildung neuen Knochens zu induzieren. Fortschritte auf dem Gebiet der Gentherapie machen es nun möglich, Nukleotidfragmente, die intrazelluläre Signalmoleküle kodieren, die einen Teil des Knochenbildungsprozesses bilden, in osteogene Vorläuferzellen, d. h. Zellen, die an der Knochenbildung beteiligt sind, oder in Leukozyten des peripheren Blutes einzubringen. Die Gentherapie zur Knochenbildung bietet eine Reihe potenzieller Vorteile: (1) geringere Produktionskosten; (2) höhere Effizienz verglichen mit extrazellulären Behandlungsregimen aufgrund der Fähigkeit, eine anhaltende Expression des intrazellulären Signalmoleküls zu erreichen; (3) sie würde die Möglichkeit umgehen, dass die Behandlung mit extrazellulären Signalmolekülen aufgrund der Gegenwart einer begrenzten Anzahl von Rezeptoren für diese Signale behindert wird; (4) sie erlaubt die Lieferung/Zuführung transfizierter potenzieller Osteoprogenitor-Zellen direkt an den Ort, an dem die lokalisierte Knochenbildung erforderlich ist; und (5) sie würde eine systemische Knochenbildung erlauben, wodurch ein Behandlungsregime für Osteoporose und andere metabolische Knochenkrankheiten zur Verfügung gestellt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung erstrebt, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden, indem neue Zusammensetzungen und Verfahren zur Verfügung gestellt werden, um die Knochenbildung unter Verwendung eines intrazellulären Signal-gebenden Moleküls zu induzieren, das früh in der Kaskade der Ereignisse, die zur Knochenbildung führt, beteiligt ist. Die Anmelder haben 10-4/RLMP (SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2) entdeckt, ein neuartiges LIM-Gen mit einer Sequenz, die ursprünglich aus stimulierten Osteoblastenkulturen von Schädelkalotten der Ratte isoliert wurde. Das Gen wurde kloniert, sequenziert und auf seine Fähigkeit untersucht, die Effizienz der Knochenmineralisierung in vitro zu steigern. Das Protein RLMP beeinflusst sowohl die Mineralisierung der Knochenmatrix als auch die Differenzierung von Zellen in die Osteoblasten-Entwicklungsreihe. Im Unterschied zu anderen bekannten Zytokinen, wie z.B. BMPs, ist RLMP kein sezerniertes Protein, sondern stattdessen ein intrazelluläres Signal-gebendes Molekül. Diese Eigenschaft hat den Vorteil, sowohl eine Verstärkung der intrazellulären Signalgebung zur Verfügung zu stellen als auch eine leichtere Untersuchung der transfizierten Zellen. Es ist außerdem für effizientere und spezifischere in vivo-Anwendungen geeignet. Geeignete klinische Anwendungen schließen die Verbesserung der Knochenheilung bei Frakturen, Knochendefekten, Knochentransplantation und normale Homöostase bei Patienten, die eine Osteoporose aufweisen, ein.
Die Anmelder haben außerdem die Aminosäuresequenz eines korrespondierenden humanen Proteines, das als humanes LMP-1 bezeichnet wird, kloniert, sequenziert und abgeleitet. Das humane Protein zeigt eine verbesserte Effizienz der Knochenmineralisierung in vitro und in vivo.
Außerdem haben die Anmelder eine trunkierte (kurze) Version von LMP-1, die HLMP-1s genannt wurde, charakterisiert. Diese kurze Version resultierte aus einer Punktmutation in einer Quelle eines cDNA-Klons, die ein Stoppkodon zur Verfügung stellt, das das Protein trunkierte. Die kurze Version (LMP-1s) ist vollständig funktional, wenn es in einer Zellkultur und in vivo exprimiert wird.
Unter Verwendung einer PCR-Analyse einer humanen Herz-cDNA-Bibliothek haben die Anmelder zwei alternative Spleißvarianten (als HLMP-2 und HLMP-3 bezeichnet) identifiziert, die sich von HLMP-1 in einer Region zwischen den Basenpaaren 325 und 444 in der Nukleotidsequenz, die HLMP-1 kodiert, unterscheiden. Die HLMP-2-Sequenz weist eine Deletion von 119 Basenpaaren und eine Insertion von 17 Basenpaaren in dieser Region auf. Verglichen mit HLMP-1 weist die Nukleotidsequenz, die HLMP-3 kodiert, keine Deletionen auf, aber es hat die gleichen 17 Basenpaare wie HLMP-2, die an Position 444 in der HLMP-1-Sequenz insertiert sind.
Zusätzliche Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung dargelegt und werden teilweise aus der Beschreibung ersichtlich sein oder können durch die Anwendung der Erfindung erfahren werden. Die Ziele und weitere Vorteile der Erfindung werden durch die Verfahren und Zusammensetzungen des Gegenstandes, die insbesondere in der Beschreibung und den Ansprüchen dargelegt werden, realisiert und erkannt.
Gemäß einem umfassenden Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die irgendein LIM Mineralisierungsprotein kodiert, wobei das Nukleinsäuremolekül unter Standardbedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das komplementär zu der Gesamtlänge der SEQ ID NR. 25 ist, hybridisiert und wobei das Molekül unter hoch stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das komplementär zu der Gesamtlänge der SEQ ID NR. 26 ist, hybridisiert. In einem besonderen Aspekt kodiert das isolierte Nukleinsäuremolekül HLMP-1, HLMP-1s, RLMP, HLMP-2 oder HLMP-3. Außerdem ist die Erfindung sowohl auf Vektoren gerichtet, die diese Nukleinsäuremoleküle umfassen, als auch auf Wirtszellen, die die Vektoren umfassen. In einem weiteren besonderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf die Proteine selbst.
Gemäß einem zweiten umfassenden Aspekt bezieht sich die Erfindung auf einen Antikörper, der spezifisch für ein LIM Mineralisierungsprotein einschließlich HLMP-1, HLMP-1s, RLMP, HLMP-2 und HLMP-3 ist. In einem besonderen Aspekt ist der Antikörper ein polyklonaler Antikörper. In einem anderen besonderen Aspekt ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
Gemäß einem dritten umfassenden Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Induzieren der Knochenbildung, indem osteogene Vorläuferzellen mit einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz, die ein LIM Mineralisierungsprotein kodiert, umfasst, transfiziert werden. In einem besonderen Aspekt ist das isolierte Nukleinsäuremolekül in einem Vektor, der ein Plasmid oder ein Virus sein kann, wie z.B. ein Adenovirus oder Retrovirus. Die Transfektion kann ex vivo oder in vivo durch direkte Injektion des isolierten Nukleinsäuremoleküls erfolgen. Das transfizierte isolierte Nukleinsäuremolekül kann HLMP-1, HLMP-1s, RLMP, HLMP-2 oder HLMP-3 kodieren.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zum Fusionieren einer Wirbelsäule, indem osteogene Vorläuferzellen mit einem isolierten Nukleinsäuremolekül transfiziert werden, das eine Nukleotidsequenz enthält, die ein LIM Mineralisierungsprotein kodiert, die transfizierten osteogenen Vorläuferzellen mit einer Matrix vermischt werden und die Matrix in Kontakt mit der Wirbelsäule gebracht wird.
In noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zum Induzieren einer systemischen Knochenbildung durch stabile Transfektion von Wirtszellen mit den Vektoren der Erfindung.
Es versteht sich, dass sowohl die vorangehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft und erklärend sind und eine weitere Erklärung der Erfindung zur Verfügung stellen sollen.
Abkürzungen und Definitionen

BMP

Knochen-morphogenetisches Protein (bone morphogenetic protein)

HLMP-1

humanes LMP-1, auch als humanes LIM-Protein oder HLMP bezeichnet

HLMP-1s

kurzes (trunkiertes) humanes LMP-1-Protein

HLMPU

einzigartige Region des humanen LIM-Proteins (Human LIM Protein Unique Region)

LMP

LIM Mineralisierungsprotein

MEM

Minimalmedium

Trm

Triaminchinolon

-GlyP

Beta-Glycerinphosphat

RACE

rasche Amplifikation von cDNA-Enden (Rapid Amplification of cDNA Ends)

RLMP

LIM Mineralisierungsprotein der Ratte (Rat LIM mineralization protein), auch als RLMP-1 bezeichnet

RLMPU

einzigartige Region des LIM-Proteins der Ratte (Rat LIM Protein Unique Region)

RNAsin

RNase-Inhibitor

ROB

Osteoblast der Ratte (Rat Osteoblast)

10-4

Klon, der die cDNA-Sequenz für RLMP (SEQ ID NR. 2) enthält

UTR

untranslatierte Region

HLMP-2

humane LMP-Spleißvariante 2

HLMP-3

humane LMP-Spleißvariante 3

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neuartige LIM-Proteine von Säugetieren, die hierin als LIM Mineralisierungsproteine oder LMP bezeichnet werden. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf humanes LMP, bekannt als HLMP oder HLMP-1 oder auf alternative Spleißvarianten des humanen LMP, die als HLMP-2 oder HLMP-3 bekannt sind. Die Anmelder haben entdeckt, dass diese Proteine die Knochenmineralisierung in Säugetierzellen, die in vitro kultiviert werden, verstärken. Wenn es in Säugetieren produziert wird, induziert LMP die Knochenbildung auch in vivo.
Eine ex vivo-Transfektion von Knochenmarkzellen, osteogenen Vorläuferzellen, Leukozyten des peripheren Blutes oder mesenchymalen Stammzellen mit einer Nukleinsäure, die LMP oder HLMP kodiert, gefolgt von einer Reimplantation der transfizierten Zellen in den Spender, ist für die Behandlung einer Vielzahl von Knochen-assoziierten Krankheiten oder Verletzungen geeignet. Zum Beispiel kann man dieses Verfahren verwenden, um: die Frakturheilung der langen Knochen zu verbessern; Knochen in segmentalen Defekten zu erzeugen; einen Ersatz für ein Knochentransplantat für Frakturen zur Verfügung zu stellen; die Tumorrekonstruktion oder Fusion der Wirbelsäule zu ermöglichen; und eine lokale Behandlung (durch Injektion) für schwache oder osteoporotische Kno chen, wie bei Osteoporose der Hüfte, der Wirbelkörper oder des Handgelenks zur Verfügung zu stellen. Eine Transfektion mit LMP- oder HLMP-kodierender Nukleinsäure ist ebenfalls nützlich bei: der perkutanen Injektion transfizierter Markzellen, um die Heilung von frakturierten langen Knochen zu beschleunigen; bei der Behandlung von verzögerter Vereinigung oder Nicht-Vereinigung von Frakturen der langen Knochen oder Pseudarthrosis einer Fusion der Wirbelsäule; und um die Bildung neuen Knochens bei avaskulärer Nekrose der Hüfte oder des Knies zu induzieren.
Zusätzlich zu ex vivo-basierten Gentherapie-Verfahren kann die Transfektion eines rekombinanten DNA-Vektors, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die LMP oder HLMP kodiert, in vivo erreicht werden. Wird ein DNA-Fragment, das LMP oder HLMP kodiert, in einen geeigneten viralen Vektor, z.B. einen Adenovirusvektor, insertiert, kann das virale Konstrukt direkt in eine Körperstelle injiziert werden, wo endochondrale Knochenbildung gewünscht ist. Unter Verwendung einer direkten, perkutanen Injektion, um die LMP- oder HLMP-Sequenz einzubringen, kann die Stimulation der Knochenbildung ohne das Erfordernis eines chirurgischen Eingriffs erreicht werden, entweder, um Knochenmarkzellen für die ex vivo-Transfektion zu erhalten, oder sie in den Patienten an die Stelle, wo der neue Knochen erforderlich ist, zu reimplantieren Alden et al., Neurosurgical Focus (1998) haben den Nutzen eines direkten Injektionsverfahrens der Gentherapie unter Verwendung einer cDNA, die BMP-2 kodiert, die in einen Adenovirusvektor kloniert war, demonstriert.
Es ist außerdem möglich, die in vivo-Gentherapie durch direkte Injektion eines nackten, d. h. nicht-verkapselten, rekombinanten Plasmids, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die HLMP kodiert, in eine geeignete Körperstelle durchzuführen. In dieser Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Transfektion, wenn die nackte Plasmid-DNA durch die geeigneten Zielzellen, die beschrieben wurden, aufgenommen oder internalisiert wird. Wie in dem Fall der In vivo-Gentherapie unter Verwendung eines viralen Konstruktes bietet die direkte Injektion der nackten Plasmid-DNA den Vorteil, dass ein geringer oder kein chirurgischer Eingriff notwendig ist. Direkte Gentherapie unter Verwendung nackter Plasmid-DNA, die das endotheliale Zellmitogen VEGF (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, vascular endothelial growth factor) kodiert, wurde erfolgreich in menschlichen Patienten gezeigt. Baumgartner et al., Circulation, 97 (12): 1114-23 (1998).
Unter Verwendung eines Adenovirusvektors, um LMP osteogenen Zellen zuzuführen, wird eine transiente Expression von LMP erreicht. Dies geschieht, da ein Adenovirus nicht in das Genom der Zielzellen, die transfiziert werden, eingebaut wird. Eine transiente Expression von LMP, d. h. eine Expression, die während der Lebensdauer der transfizierten Zielzellen stattfindet, ist ausreichend, um die Ziele der Erfindung zu erreichen. Eine stabile Expression von LMP kann jedoch stattfinden werden, wenn ein Vektor als Vehikel verwendet wird, der in das Genom der Zielzelle eingebaut wird. Retrovirus-basierte Vektoren sind z.B. für diesen Zweck geeignet.
Eine stabile Expression von LMP ist besonders nützlich, um verschiedene systemische Knochen-assoziierte Krankheiten, wie z.B. Osteoporose und Osteogenesis imperfecta zu behandeln. Für diese Ausführungsform der Erfindung wird zusätzlich zur Verwendung eines Vektors, der in das Genom der Zielzelle eingebaut wird, um eine LMP-kodierende Nukleotidsequenz der Zielzelle zuzuführen, die LMP-Expression unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gebracht. Zum Beispiel ist ein Promotor geeignet, der durch die Exposition mit einem exogen induzierenden Agens, wie z.B. Tetracyclin, eingeschaltet wird. Unter Verwendung dieser Methode kann man die Bildung neuen Knochens auf einer systemischen Basis durch Verabreichen einer wirksamen Menge des exogenen induzierenden Agens stimulieren. Sobald eine ausreichende Menge der Knochenmasse erreicht wurde, wird die Verabreichung des exogenen induzierenden Agens abgesetzt. Dieser Vorgang kann so häufig wie nötig wiederholt werden, um Knochenmassenverlust, z.B. als Folge einer Osteoporose, zu ersetzen.
Antikörper, die spezifisch für HLMP sind, sind besonders geeignet für die Verwendung in Verfahren zum Untersuchen des osteoinduktiven, d. h. Knochen-bildenden, Potenzials von Patientenzellen. Auf diese Weise kann man Patienten identifizieren, die ein Risiko für eine langsame oder schlechte Heilung bei Knochenreparaturen tragen. Außerdem sind HLMP-spezifische Antikörper zur Verwendung in Marker-Assays geeignet, um Risikofaktoren für degenerative Knochenkrankheiten, wie z.B. Osteoporose, zu identifizieren.
In Anlehnung an bekannte und konventionelle Methoden werden die Gene der vorliegenden Erfindung durch Ligation von Nukleinsäuresegmenten, die LMP kodieren, mit anderen Nukleinsäuresequenzen, wie Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren hergestellt. Verfahren, die zum Herstellen und Analysieren dieser rekombinanten Vektoren benötigt werden, z.B. Restriktionsendonuklease-Verdaue, Klonierungsprotokolle, Muta genese, organische Synthese von Oligonukleotiden und DNA-Sequenzierung, wurden beschrieben. Für die DNA-Sequenzierung wird das Dideoxyterminations-Verfahren bevorzugt.
Viele Abhandlungen über rekombinante DNA-Verfahren wurden publiziert, einschließlich Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2. Edition (1988), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986), und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1988). Diese Referenz-Handbücher sind hierin durch Referenz spezifisch eingeschlossen.
Die Primer-gesteuerte Amplifikation der DNA oder cDNA ist ein gewöhnlicher Schritt bei der Expression der Gene dieser Erfindung. Sie wird üblicherweise durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Die PCR wird im US-Patent Nr. 4,800,159 von Mullis et al. und anderen veröffentlichen Quellen beschrieben. Das grundlegende Prinzip der PCR ist die exponenzielle Replikation von DNA-Sequenzen durch aufeinanderfolgende Zyklen einer Primer-Extension. Die Extensions-Produkte eines Primers werden, wenn sie an einen anderen Primer hybridisieren, ein Template für die Synthese eines weiteren Nukleinsäuremoleküls. Die Primer-Template-Komplexe wirken als Substrat für die DNA-Polymerase, die bei Durchführung ihrer Replikationsfunktion die Primer verlängert. Das herkömmliche Enzym für PCR-Anwendungen ist die thermostabile DNA-Polymerase, die aus Thermus aquaticus isoliert wurde oder „Taq DNA-Polymerase".
Es existieren zahlreiche Variationen des grundlegenden PCR-Verfahrens, und eine besondere Methode der Wahl für jeden bestimmten Schritt, der erforderlich ist, um die rekombinanten Vektoren dieser Erfindung herzustellen, kann leicht durch einen Fachmann durchgeführt werden. Zum Beispiel wird RNA durch Standardmethoden und gut bekannte Methoden extrahiert und revers-transkribiert, um die zelluläre Expression von 10-4/RLMP zu messen. Die resultierende cDNA wird dann durch PCR auf die geeignete mRNA-Sequenz analysiert.
Das Gen, das das LIM Mineralisierungsprotein kodiert, wird in einem Expressionsvektor in einem rekombinanten Expressionssystem exprimiert. Natürlich muss die hergestellte Sequenz nicht die gleiche wie das Original oder seine komplementäre Sequenz sein, sondern kann stattdessen jede Sequenz sein, die durch die Degeneration des DNA-Codes bestimmt wird, die dennoch ein LMP exprimiert, das Knochen-bildende Aktivität aufweist. Konservative Aminosäuresubstitutionen oder andere Modifikationen, wie das Vorkommen eines Amino-terminalen Methionin-Restes, können auch verwendet werden.
Eine Ribosomen-Bindungsstelle, die in dem Wirts-Expressionssystem der Wahl aktiv ist, wird an das 5'-Ende der chimären LMP-kodierenden Sequenz ligiert, so dass ein synthetisches Gen gebildet wird. Das synthetische Gen kann durch Ligation an ein geeignetes, linearisiertes Plasmid in einen der zahlreichen Vektoren zur Expression insertiert werden. Ein regulierbarer Promotor, z.B. der E. coli Lac-Promotor, ist auch für die Expression einer chimären kodierenden Sequenz geeignet. Andere geeignete regulierbare Promotoren schließen trp, tac, recA, T7 und Lambda-Promotoren ein.
DNA, die LMP kodiert, wird in Empfängerzellen durch eine von mehreren publizierten Standardmethoden, z.B. Calciumphosphat-Präzipitation, DEAE-Dextran, Elektroporation oder Protoplastfusion, transfiziert, um stabile Transformanten zu erzeugen. Die Calciumphosphat-Präzipitation ist bevorzugt, insbesondere, wenn sie wie folgt durchgeführt wird.
DNAs werden entsprechend dem Verfahren von Graham und Van Der, Virology, 52: 456 (1973) vor dem Transfer in die Zellen mit Calciumphosphat co-präzipitiert. Ein Aliquot von 40–50 g der DNA, mit Lachssperma oder Kälberthymus-DNA als Träger, wird für 0,5 × 10⁶-Zellen, die auf eine 100 mm-Platte plattiert wurden, verwendet. Die DNA wird mit 0,5 ml einer 2 × Hepeslösung (280 mM NaCl, 50 mM Hepes und 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,0) zu der eine gleiche Menge von 2 × CaCl₂ (250 mM CaCl₂ und 10 mM Hepes, pH 7,0) hinzugefügt wird, vermischt. Ein weißes granulares Präzipitat, das nach 30–40 Minuten auftritt, wird gleichmäßig tropfenweise auf den Zellen verteilt, die für 4–16 Stunden bei 37°C inkubiert werden. Das Medium wird entfernt, und die Zellen einem 15% Glycerin-Schock in PBS für 3 Minuten unterworfen. Nach Entfernung des Glycerins werden die Zellen mit Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM), das 10% fetales Rinderserum enthält, gefüttert.
Die DNA kann auch unter Verwendung des: DEAE-Dextranverfahrens von Kimura et al., Virology, 49: 394 (1972) und Sompayrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7575 (1981); Elektroporationsverfahrens von Potter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 7161 (1984); und Protoplast-Fusionsverfahrens von Sandri-Goddin et al., Molec. Cell. Biol., 1: 743 (1981) transfiziert werden.
Phosphoramiditchemie in der festen Phase ist das bevorzugte Verfahren für die organische Synthese von Oligodeoxynukleotiden und Polydeoxynukleotiden. Zusätzlich sind viele weitere organische Syntheseverfahren verfügbar. Diese Verfahren können von den Fachleuten auf dem Gebiet leicht an die besonderen Sequenzen der Erfindung angepasst werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem Nukleinsäuremoleküle, die unter Standardbedingungen an eine der Nukleinsäuresequenzen, die die LIM Mineralisierungsproteine der Erfindung kodieren, hybridisieren. Die "Standardhybridisierungsbedingungen" werden sowohl abhängig von der Größe der Probe, dem Hintergrund und der Konzentration der Nukleinsäurereagenzien, als auch von der Art der Hybridisierung, z.B. in situ, Southernblot, oder Hybrisierung von DNA-RNA-Hybriden (Northernblot) variieren. Die Festlegung der "Standardhybridisierungsbedingungen" ist innerhalb des Fachwissens auf dem Gebiet. Siehe z.B. US-Patent 5,580,775 von Fremeau et al., das hierin durch Referenz für diesen Zweck eingeschlossen ist. Siehe auch Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98: 503 (1975), Alwine et al., Meth. Enzymol., 68: 220 (1979) und Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edition, Seiten 7.19–7.50, Cold Spring Harbor Press (1989).
Ein bevorzugter Satz von Standardhybridisierungsbedingungen beinhaltet einen Blot, der bei 42°C für 2 Stunden in 50% Formamid, 5 × SSPE (150 nM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ [pH 7,4), 1 mM EDTA [pH 8,0]), 5 × Denhardtslösung (20 mg Ficoll, 20 mg Polyvinylpyrrolidon und 20 mg BSA pro 100 ml Wasser), 10% Dextransulfat, 1 % SDS und 100 g/ml Lachssperma-DNA, prähybridisiert wird. Eine ³²P-markierte cDNA-Sonde wird hinzugefügt und die Hybridisierung für 14 Stunden fortgesetzt. Anschließend wird der Blot zweimal mit 2 × SSPE, 0,1 % SDS für 20 Minuten bei 22°C gewaschen, gefolgt von einem 1-stündigen Waschschritt bei 65°C in 0,1 × SSPE, 0,1 % SDS. Der Blot wird anschließend getrocknet und ein Röntgenfilm in Gegenwart eines Verstärkungs-Schirms für 5 Tage belichtet.
Unter "hochstringenten Bedingungen" wird die Sonde an ihre Zielsequenz hybridisieren, wenn diese beiden Sequenzen im Wesentlichen identisch sind. Wie in dem Fall der Standardhybridisierungsbedingungen kann der Fachmann auf dem Gebiet in Anbetracht des Fachwissens und der Art des entsprechenden Experiments die Bedingungen bestimmen, unter denen nur im Wesentlichen identische Sequenzen hybridisieren werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst die Proteine, die durch die Nukleinsäuresequenzen kodiert werden. In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf die Identifikation solcher Proteine auf Grundlage von anti-LMP-Antikörpern. In dieser Ausführungsform werden Proteinproben für die Westernblot-Analyse durch Lyse von Zellen und Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE hergestellt. Die Proteine werden, wie von Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1987) beschrieben, durch Elektroblotting auf Nitrocellulose transferiert. Nach dem Blocken des Filters mit fettarmer Trockenmilch (1 g in 100 ml PBS) wird der anti-LMP-Antikörper auf den Filter gegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Filter wird gründlich mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und mit Meerrettichperoxidase (HRPO)-Antikörperkonjugat für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Filter wird nochmals gründlich mit PBS gewaschen und die Antigenbanden durch Hinzufügen von Diaminobenzidin (DAB) identifiziert.
Monospezifische Antikörper sind in der vorliegenden Erfindung das Reagens der Wahl und werden speziell verwendet, um Patientenzellen auf spezifische Eigenschaften, die mit der Expression von LMP assoziiert sind, zu analysieren. Ein "monospezifischer Antikörper", wie hierin verwendet, ist definiert als eine einfache Antikörperspezies oder multiple Antikörperspezies mit homogenen Bindungseigenschaften für LMP. "Homogene Bindung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit der Antikörperspezies, an ein spezifisches Antigen oder Epitop, wie solche, die mit LMP assoziiert sind, wie oben beschrieben, zu binden. Monospezifische Antikörper gegen LMP werden aus Antiseren von Säugetieren, die Antikörper enthalten, die mit LMP reagieren, gereinigt oder werden als monoklonale Antikörper, die mit LMP reagieren, unter der Verwendung der Methode von Kohler und Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975) hergestellt. Die LMP-spezifischen Antikörper werden durch Immunisieren von Tieren, wie z.B. Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen oder Pferden, mit einer geeigneten Konzentration von LMP entweder mit oder ohne ein Immunadjuvans erzeugt.
Bei dieser Methode wird Präimmunserum vor der ersten Immunisierung gesammelt. Jedes Tier erhält zwischen etwa 0,1 mg und etwa 1000 mg LMP, das mit einem annehmbaren Immun-Adjuvans assoziiert ist, falls dies gewünscht ist. Derartige annehmbaren Adjuvantien beinhalten komplettes Freunds-Adjuvans, inkomplettes Freunds-Adjuvans, Alum-Präzipitat, Wasser-in-Öl-Emulsion, die Corynebacterium parvum enthält, und tRNA-Adjuvantien, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Erst-Immunisierung besteht aus LMP, vorzugsweise in komplettem Freunds-Adjuvans, das an verschiedene Stellen entweder subkutan (s.c.), intraperitoneal (i.p.) oder beides injiziert wird. Von jedem Tier wird in regelmäßigen Abständen, vorzugsweise wöchentlich, Blut entnommen, um den Antikörpertiter zu bestimmen. Die Tiere können nach der Erst-Immunisierung entweder Booster-Injektionen erhalten oder nicht. Solchen Tieren, die Booster-Injektionen erhalten, wird im Allgemeinen eine gleiche Menge des Antigens in inkomplettem Freunds- Adjuvans auf dem gleichen Weg der Verabreichung gegeben. Booster-Injektionen werden in etwa dreiwöchigen Intervallen gegeben, bis maximale Titer erreicht werden. Nach etwa 7 Tagen nach jeder Booster-Immunisierung oder etwa wöchentlich nach einer Einfachimmunisierung wird den Tieren Blut entnommen, das Serum gesammelt und Aliquots bei etwa –20°C gelagert.
Monoklonale Antikörper (mAb), die mit LMP reagieren, werden durch Immunisieren von Inzuchtmäuschen, vorzugsweise Balb/c-Mäusen, mit LMP hergestellt. Die Mäuse werden über den i.p. – oder den s.c. – Weg mit etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg, vorzugsweise etwa 1 mg, LMP in etwa 0,5 ml Puffer- oder Salzlösung, enthalten in einer gleichen Menge eines annehmbaren Adjuvans, wie oben diskutiert, immunisiert. Komplettes Freunds-Adjuvans ist bevorzugt. Die Mäuse erhalten eine initiale Immunisierung an Tag 0 und werden für etwa 3–30 Wochen in Ruhe gelassen. Immunisierten Mäusen werden eine oder mehrere Booster-Immunisierungen von etwa 0,1 bis etwa 10 mg LMP in einer Puffer-Lösung, wie Phosphat-gepufferte Salzlösung, über den intravenösen (i.v.) Weg gegeben. Lymphozyten von Antikörper-positiven Mäusen, vorzugsweise Lymphozyten der Milz, werden durch Entfernen der Milzen von immunisierten Mäusen durch Standardmethoden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gewonnen. Hybridomzellen werden durch Mischen der Lymphozyten der Milz mit einem geeigneten Fusionspartner, vorzugsweise Myelomzellen, unter Bedingungen, die die Bildung stabiler Hybridome erlauben, hergestellt. Fusionspartner können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: murine Myelome P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 und Sp 2/0, wobei Sp 2/0 bevorzugt wird. Die Antikörper-produzierenden Zellen und die Myelomzellen werden in Polyethylenglycol, etwa 1000 MW, bei Konzentrationen von etwa 30% bis etwa 50% fusioniert. Fusionierte Hybridomzellen werden durch Wachstum in Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin in ergänztem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) durch Methoden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, selektiert. Die Überstände werden etwa an den Tagen 14, 18 und 21 aus wachstumspositiven Vertiefungen gesammelt und durch ein Immunoassay, wie ein Feste-Phasen-Immunoradioassay (SPIRA) unter Verwendung von LMP als Antigen auf Antikörper-Produktion getestet. Die Kulturüberstände werden außerdem in einem Ouchterlony-Präzpitationsassay getestet, um den Isotyp der mAb zu bestimmen. Hybridomzellen aus Antikörper-positiven Vertiefungen werden durch eine Methode, wie die Weich-Agar-Methode, von MacPherson, "Soft Agar Techniques", in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson (Hrsg.), Academic Press (1973) kloniert. Siehe auch Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory (1988).
Monoklonale Antikörper können auch in vivo durch Injektion von etwa 2 × 10⁶ bis etwa 6 × 10⁶ Hybridomzellen in Pristan-geprimte Balb/c-Mäuse, etwa 0,5 ml pro Maus, etwa 4 Tage nach dem Priming hergestellt werden. Aszitesflüssigkeit wird etwa 8–12 Tage nach dem Zelltransfer gesammelt, und die monoklonalen Antikörper werden durch Methoden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gereinigt.
Die in vitro-Herstellung der anti-LMP mAb wird durch Wachstum der Hybridomzelllinie in DMEM durchgeführt, das etwa 2% fötales Kälberserum enthält, um ausreichende Mengen des spezifischen mAb zu erhalten. Die mAbs werden durch Methoden gereinigt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Die Antikörpertiter des Aszites oder der Hybridomkulturflüssigkeit werden durch verschiedene serologische oder immunologische Assays bestimmt, die Präzipitation, passive Agglutination, Enzym-verknüpftes immunbindendes Antikörperverfahren (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) und Radioimmunoassay (RIA)-Verfahren beinhalten, aber nicht darauf beschränkt sind. Ähnliche Assays werden verwendet, um die Gegenwart von LMP in Körperflüssigkeiten oder Gewebe und Zellextrakten nachzuweisen.
Es ist für die Fachleute auf dem Gebiet leicht zu erkennen, dass die oben beschriebenen Verfahren der Herstellung monospezifischer Antikörper genutzt werden können, um Antikörper herzustellen, die für Polypeptidfragmente von LMP, werdende (nascent) vollständig langes LMP-Polypeptid oder Varianten oder Allele davon spezifisch sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf alternative Spleißvarianten von HLMP-1 gerichtet. Eine PCR-Analyse humaner Herz-cDNA zeigte mRNA für zwei alternative HLMP-Spleißvarianten, die als HLMP-2 und HLMP-3 bezeichnet werden, die sich von HLMP-1 in einer Region zwischen den Basenpaaren 325 und 444 in der hLMP-1-Sequenz unterscheiden. Die HLMP-2-Sequenz hat eine Deletion von 119 Basenpaaren und eine Insertion von 17 Basenpaaren in dieser Region. Diese Veränderungen erhalten den Leserahmen, was ein Protein mit 423 Aminosäuren ergibt, das verglichen mit HLMP-1 einen Nettoverlust von 34 Aminosäuren aufweist (40 deletierte Aminosäuren plus 6 insertierte Aminosäuren). HLMP-2 enthält die C-terminalen LIM-Domänen, die in HLMP-1 vorhanden sind.
Im Vergleich zu HLMP-1 weist HLMP-3 keine Deletionen auf, aber es hat die gleiche Insertion von 17 Basenpaaren an Position 444. Diese Insertion verschiebt den Leserahmen und verursacht ein Stoppkodon bei den Basenpaaren 459 bis 461. Als Ergebnis kodiert HLMP-3 ein Protein mit 153 Aminosäuren. Diesem Protein fehlen die C-terminalen LIM-Domänen, die in HLMP-1 und HLMP-2 vorhanden sind. Die vorhergesagte Größe der Proteine, die durch HLMP-2 und HLMP-3 kodiert werden, wurde durch Westernblot-Analyse bestätigt.
Eine PCR-Analyse der Gewebeverteilung der drei Spleißvarianten zeigte, dass diese unterschiedlich exprimiert werden, wobei spezifische Isoformen in verschiedenen Geweben dominieren. HLMP-1 ist offensichtlich die vorherrschende Form, die in Leukozyten, Milz, Lunge, Plazenta und fötaler Leber exprimiert wird. HLMP-2 scheint die vorherrschende Isoform in Skelettmuskel, Knochenmark und Herzgewebe zu sein. HLMP-3 war jedoch keine vorherrschende Isoform in einem der untersuchten Gewebe.
Die Überexpression von HLMP-3 in sekundären Osteoblastenkulturen der Ratte induzierte die Bildung von Knochenknötchen (287 ± 56) ähnlich dem Effekt, der bei Glucokorticoiden (272 ± 7) und HLMP-1(232 ± 200) beobachtet wurde. Da dem HLMP-3 die C-terminalen LIM-Domänen fehlen, werden diese Regionen nicht für die osteoinduktive Aktivität benötigt. Die Überexpression von HLMP-2 hat jedoch keine Knötchenbildung induziert (11 ± 3). Diese Daten legen nahe, dass die Aminosäuren, die durch die deletierten 119 Basenpaare kodiert werden, für die Osteoinduktion erforderlich sind. Die Daten legen außerdem nahe, dass die Verteilung der HLMP-Spleißvarianten wichtig für die gewebsspezifische Funktion sein kann. Überraschenderweise haben wir gezeigt, dass HLMP-2 die Steroid-induzierte Bildung von Osteoblasten in sekundären Osteoblastenkulturen der Ratte inhibiert. Daher wird HLMP-2 therapeutischen Nutzen in klinischen Situationen haben, in denen Knochenbildung nicht erwünscht ist.
Am 22. Juli 1997 wurde ein Probe von 10-4/RLMP in einem Vektor mit der Bezeichnung pCMV2/RLMP (wobei es sich um den Vektor pRc/CMV2 mit einem 10-4 Klon/RLMP-Insertion handelt) bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt. Die Zugangsnummer der Kultur für diese Hinterlegung ist 209153. Am 19. März 1998 wurde eine Probe des Vektors pHis-A mit einer HLPM-1s-Insertion bei der American Type Culture Collection ("ATCC") hinterlegt. Die Kultur-Zugangsnummer für diese Hinterlegung ist 209698. Am 14. April 2000 wurden Proben der Plasmide pHAhLMP-2 (Vektor pHisA mit einer cDNA-Insertion, die aus hu maner Herzmuskel-cDNA stammt, mit HLMP-2) und pHAhLMP-3 (Vektor pHisA mit einer cDNA-Insertion, die aus humaner Herzmuskel-cDNA stammt, mit HLMP-3) bei der ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209, USA, unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt. Die Zugangsnummern für diese Hinterlegungen sind PTA-1698 bzw. PTA-1699. Diese Hinterlegungen werden, wie es der Budapester Vertrag erfordert, bei der ATCC für mindestens 30 Jahre aufbewahrt und der Öffentlichkeit nach Erteilung eines Patentes, das sie offenbart, zugänglich gemacht werden. Es sollte klar sein, dass die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Lizenz darstellt, den Gegenstand der Erfindung unter Missachtung der Patentrechte, die durch einen Verwaltungsakt erteilt wurden, zu nutzen.
Bei der Bewertung der Nukleinsäuren, Proteine oder Antikörper gemäß der Erfindung wurden Enzym-Assays, Proteinreinigung und andere konventionelle biochemische Verfahren genutzt. DNA und RNA wurden durch Southernblotting- bzw. Northernblotting-Methoden untersucht. Üblicherweise wurden die analysierten Proben durch Gelelektrophorese größenabhängig aufgetrennt. Die DNA oder RNA in den Gelen wurde dann auf Nitrocellulose oder Nylonmembranen transferiert. Die Blots, die Replikas der Probenmuster in den Gelen darstellen, wurde dann mit Sonden hybridisiert. Typischerweise wurden die Sonden radioaktiv-markiert, vorzugsweise mit ³²P, obwohl man die Proben mit anderen Signal-erzeugenden Molekülen markieren könnte, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Spezifische Banden von Interesse können dann durch Detektionssysteme, wie Autoradiografie, sichtbar gemacht werden.
Um die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen, sind die folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele eingeschlossen. Diese Ergebnisse demonstrieren die Durchführbarkeit der Induktion oder Verbesserung der Knochenbildung unter Verwendung der LIM Mineralisierungsproteine gemäß der Erfindung sowie die isolierten Nukleinsäuremoleküle, die solche Proteine kodieren.
Beispiel 1: Kultur der Zellen der Schädelkalotte
Zellen der Schädelkalotte von Ratten, die auch als Osteoblasten der Ratte (rat osteoblasts, "ROB") bekannt sind, wurden wie zuvor beschrieben aus Ratten gewonnen, die 20 Tage präpartal waren. Boden et al., Endocrinology, 137 (8): 3401-07 (1996). Primäre Kulturen wurden bis zur Konfluenz (7 Tage) wachsen gelassen, trypsinisiert und in 6-Well-Platten (1 × 10⁵ Zellen/35 mm Vertiefung) als Zellen der ersten Subkultur passagiert. Die Subkultur-Zellen, die an Tag 0 konfluent waren, wurden für weitere 7 Tage wachsen gelassen. Beginnend an Tag 0 wurde das Medium gewechselt, und unter einer Abzugshaube mit laminarem Fluss wurden Behandlungen (Trm und/oder BMPs) alle 3 oder 4 Tage verabreicht. Das Standardkulturprotokoll war wie folgt: Tage 1–7, MEM, 10% FBS, 50 g/ml Ascorbinsäure, ± Stimulus; Tage 8–14, BGJb-Medium, 10% FBS, 5 mM-GlyP (als eine Quelle anorganischen Phosphates, um die Mineralisierung zu ermöglichen). Die Endpunktanalyse der Knochenknötchenbildung und Osteocalcinsekretion wurde an Tag 14 durchgeführt. Die Dosis des BMP wurde als 50 ng/ml gewählt, basierend auf Pilot-Experimenten in diesem System, die einen mittleren Effekt auf die Dosis-Antwortkurve für alle untersuchten BMPs zeigte.
Beispiel 2: Antisense-Behandlung und Zellkultur
Um die mögliche funktionelle Rolle von LMP-1 während der membranösen Knochenbildung zu untersuchen, synthetisierten wir ein Antisense-Oligonukleotid, um die LMP-1-mRNA-Translation zu blockieren und behandelten sekundäre Osteoblastenkulturen, die eine Differenzierung durchliefen, die durch Glucokorticoide initiiert wurde. Eine Inhibition der RLMP-Expression wurde mit einem hochspezifischen Antisense-Oligonukleotid (das keine signifikanten Homologien zu bekannten Sequenzen der Ratte hatte) erreicht, das einer 25-Basenpaarsequenz, die die mögliche Translations-Startstelle (SEQ ID NR. 42) umfasst, entsprach. Kontrollkulturen erhielten entweder kein Oligonukleotid oder sie erhielten ein Sense-Oligonukleotid. Die Experimente wurden in Gegenwart (Präinkubation) und Abwesenheit von Lipofectamin durchgeführt. Kurz beschrieben wurden 22 g eines Sense- oder Antisense-RLMP-Oligonukleotides in MEM für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an diese Inkubation wurde entweder mehr MEM oder präinkubiertes Lipofectamin/MEM (7% Vol./Vol.; inkubiert für 45 Minuten bei Raumtemperatur) hinzugeben, um eine Oligonukleotidkonzentraton von 0,2 M zu erreichen. Das resultierende Gemisch wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Oligonukleotid-Gemische wurden dann mit dem geeigneten Medium gemischt, d. h. MEM/Ascorbat/± Trm, um eine Endkonzentration des Oligonukleotids von 0,1 M zu erreichen.
Die Zellen wurden mit dem geeigneten Medium (± Stimulus) in Gegenwart oder Abwesenheit der geeigneten Oligonukleotide inkubiert. Die Kulturen, die ursprünglich mit Lipofectamin inkubiert wurden, wurden nach 4 Stunden Inkubation (37°C; 5% CO₂) erneut mit Medium, das weder Lipofectamin noch Oligonukleotid enthielt, gefüttert. Alle Kulturen, insbesondere die Kulturen, die ein Oligonukleotid enthielten, wurden alle 24 Stunden erneut gefüttert, um die Oligonukleotid-Konzentrationen aufrecht zu erhalten.
Das LMP-1-Antisense-Oligonukleotid inhibierte die Bildung mineralisierter Knötchen und die Osteocalcinsekretion in einer dosisabhängigen Weise, ähnlich dem Effekt des BMP-6-Oligonukleotides. Die Blockierung der Osteoblastendifferenzierung durch LMP-1-Antisense konnte nicht durch Hinzufügen von exogenem BMP-6 verhindert werden, während die Inhibition durch das BMP-6-Antisense-Oligonukleotid durch die Zugabe von BMP6 aufgehoben werden konnte. Dieses Experiment bestätigte weiter die relativ zu BMP-6 stromaufwärts liegende Position von LMP-1 im Osteoblasten-Differenzierungs-Pathway. Das LMP-1-Antisense-Oligonukleotid inhibierte außerdem die spontane Osteoblastendifferenzierung in primären Osteoblastenkulturen der Ratte.
Beispiel 3: Quantifizierung der Bildung der mineralisierten Knochenknötchen
Kulturen von ROBs, die entsprechend der Beispiele 1 und 2 hergestellt wurden, wurden über Nacht in 70% Ethanol fixiert und mit Kossa-Silberfärbung gefärbt. Ein halbautomatisches computerisiertes Videobild-Analyse-System wurde genutzt, um die Knötchenzahl und die Knötchenfläche in jeder Vertiefung zu quantifizieren. Boden et al., Endocrinology, 137 (8): 3401-07 (1996). Diese Werte wurden dann dividiert, um die Werte für die Fläche pro Knötchen zu berechnen. Dieses automatisierte Verfahren wurde gegen ein manuelles Zählverfahren validiert und zeigte einen Korrelations-Koeffizienten von 0,92 (p < 0,000001). Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (standard error of the mean, S. E. M.) angegeben, der aus 5 oder 6 Vertiefungen für jede Bedingung berechnet wurde. Jedes Experiment wurde mindestens zweimal unter Verwendung von Zellen verschiedener Schädelkalottenpräparationen bestätigt.
Beispiel 4: Quantifizierung der Osteocalcinsekretion
Die Osteocalcinspiegel in dem Kulturmedium wurden unter Verwendung eines kompetitiven Radioimmunoassays mit einem monospezifischen polyklonalen Antikörper (Pab), der in unserem Labor gegen das C-terminale Nonapeptid des Rattenosteocalcins, wie in Nanes et al., Endocrinology, 127: 588 (1990) beschrieben, gezüchtet wurde, gemessen. Kurz beschrieben wurde 1 g des Nonapeptids mit 1 mCi ¹²⁵I-Na durch das Lactoperoxidase-Verfahren iodiniert. Probenröhrchen, die 200 l des Assay-Puffers (0,02 M Natriumphosphat, 1 mM EDTA, 0,001 % Thimerosal, 0,025% BSA) enthielten, erhielten Medium, das von Zellkulturen oder Osteocalcinstandards (0 bis 12000 fmol) entnommen wurde, mit 100 l/Probenröhrchen in Assay-Puffer. Der Pab (1:40000; 100 l) wurde danach hinzugefügt, gefolgt von dem iodinierten Peptid (12000 cpm;100 l). Die auf nicht- spezifische Bindung getesteten Proben wurden ähnlich vorbereitet, enthielten aber keinen Antikörper.
Gebundene und freie PAbs wurden durch Hinzufügen von 700 l Ziegen-anti-Kaninchen-IgG separiert, gefolgt von einer Inkubation für 18 Stunden bei 4°C. Nachdem die Proben bei 1200 Upm für 45 Minuten zentrifugiert wurden, wurden die Überstände dekantiert und die Präzipitate in einem Gammazähler gezählt. Die Osteocalcin-Werte wurden in fmol/100 l angegeben, was anschließend durch Division der Werte durch 100 in pmol/ml Medium (3-Tages-Produktion) umgerechnet wurde. Die Werte wurden als Mittelwert ± S. E. M. der dreifachen Bestimmung für 5–6 Vertiefungen für jede Bedingung angegeben. Jedes Experiment wurde mindestens zweimal unter Verwendung von Zellen unterschiedlicher Schädelkalottenpräparationen bestätigt.
Beispiel 5: Effekt vom Trm und RLMP auf die Mineralisierung in vitro
Es gab kaum einen offensichtlichen Effekt des Sense- oder des Antisense-Oligonukleotids auf die Gesamt-Produktion von Knochenknötchen in dem nicht-stimulierten Zellkultursystem. Wenn ROBs mit Trm stimuliert wurden, inhibierte das Antisense-Oligonukleotid gegen RLMP jedoch die Mineralisierung von Knötchen um > 95%. Das Hinzufügen von exogenem BMP-6 zu den Oligonukleotid-behandelten Kulturen konnte die Mineralisierung der mit RLMP-Antisense behandelten Knötchen nicht wiederherstellen.
Osteocalcin war lange Zeit synonym mit Knochenmineralisierung, und Osteocalcinspiegel wurden mit Knötchenbildung und Mineralisierung korreliert. Das RLMP-Antisense-Oligonukleotid verringert die Osteocalcinproduktion signifikant, aber die Anzahl der Knötchen in den mit Antisense behandelten Kulturen ändert sich nicht signifikant. In diesem Fall konnte das Hinzugeben von exogenem BMP-6 die Produktion von Osteocalcin in mit RLMP-Antisense behandelten Kulturen nur um 10–15% wiederherstellen. Dies legt nahe, dass die Wirkung von RLMP stromabwärts von BMP-6 liegt und spezifischer als die von BMP-6 ist.
Beispiel 6: Ernte und Reinigung der RNA
Zelluläre RNA aus Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung (Duplikat-Vertiefung) von ROBs (hergestellt gemäß den Beispielen 1 und 2 in 6-Well-Kulturplatten) wurde unter Verwendung von 4 M Guanidinisothiocyanat (GIT)-Lösung geerntet, um statistische Triplikate zu erhalten. Kurz beschrieben wurden die Überstände der Kulturen aus den Vertiefungen aspiriert, die anschließend mit 0,6 ml der GIT-Lösung pro Ernte einer Duplikat-Vertiefung bedeckt wurden. Nach Hinzufügen der GIT-Lösung wurden die Platten für 5–10 Sekunden (so genau wie möglich) geschüttelt. Die Proben wurden bei –70°C für bis zu 7 Tage aufbewahrt, bevor sie weiterverarbeitet wurden.
Die RNA wurde durch eine leichte Modifikation der Standardverfahren gemäß Sambrook of al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ed., Kapitel 7.19, Cold Spring Harbor Press (1989) gereinigt. Kurz beschrieben erhielten die aufgetauten Proben 60 l 2,0 M Natriumacetat (pH 4,0), 550 l Phenol (in Wasser gesättigt) und 150 l Chloroform:Isoamylalkohol (49:1). Nach dem Vortexen wurden die Proben zentrifugiert (10000 × g; 20 Minuten; 4°C), die wässrige Phase in ein neues Probenröhrchen transferiert, 600 l Isopropanol hinzugefügt und die RNA über Nacht bei –20°C präzipitiert.
Im Anschluss an die Übernacht-Inkubation wurden die Proben zentrifugiert (10000 × g; 20 Minuten) und der Überstand vorsichtig aspiriert. Die Pellets wurden in 400 l DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert, einmal mit Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert, mit Chloroform:Isoamyl-Alkohol (24:1) extrahiert und nach Hinzugabe von 40 l Natriumacetat (3,0 M; pH 5,2) und 1,0 ml Absolutethanol über Nacht bei –20°C präzipitiert. Um die zelluläre RNA wiederzugewinnen, wurden die Proben zentrifugiert (10000 × g; 20 min), einmal mit 70% Ethanol gewaschen, für 5–10 Minuten luftgetrocknet und in 20 l DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert. Die RNA-Konzentrationen wurden aus den optischen Dichten, die mit einem Spektrofotometer bestimmt wurden, berechnet.
Beispiel 7: Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion
Erhitzte Gesamt-RNA (5 g in 10,5 l Gesamtvolumen DEPC-H₂O bei 65°C für 5 Minuten) wurde in Probenröhrchen gegeben, die 4 l 5 × MMLV-RT-Puffer, 2 l dNTPs, 2 l dT17-Primer (10 pmol/ml), 0,5 l RNAsin (40 U/ml) und 1 l MMLV-RT (200 Units/l) enthielten. Die Proben wurden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und dann bei 95°C für 5 Minuten, um die MMLV-RT zu inaktivieren. Die Proben wurden durch Hinzugeben von 80 l Wasser verdünnt.
Revers-transkribierte Proben (5 l) wurden unter Verwendung der Standardverfahren einer Polymerasekettenreaktion (50 l Gesamtvolumen) unterzogen. Kurz beschrieben wurden die Proben in Probenröhrchen gegeben, die Wasser und geeignete Mengen von PCR-Puffer, 25 mM MgCl₂, dNTPs, Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die Glycerinal dehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH, ein Haushaltsgen, und/oder BMP-6), ³²P-dCTP und Taq-Polymerase enthielten. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Primer standardisiert, um über 22 Zyklen (94°C, 30''; 58°C, 30''; 72°C, 20'') zu laufen.
Beispiel 8: Quantifizierung der RT-PCR-Produkte durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Phosphorimager-Analyse
Die RT-PCR-Produkte erhielten 5 l Beladungsfarbstoff/Probenröhrchen, wurden gemischt, auf 65°C für 10 min erhitzt und zentrifugiert. Zehn l jeder Reaktion wurden einer PAGE (12% Polyacrylamid:bis; 15 v/Vertiefung; konstanter Fluss) unter Standardbedingungen unterzogen. Die Gele wurden anschließend in Gelkonservierungspuffer (10% v/v Glycerol, 7% v/v Essigsäure, 40% v/v Methanol, 43% deionisiertes Wasser) für 30 Minuten inkubiert, für 1–2 Stunden in vacuo getrocknet (80°C) und mit einem elektronisch verstärkten Phosphoreszenzimaging-System für 6–24 Stunden entwickelt. Die sichtbar gemachten Banden wurden analysiert. Die Counts pro Bande wurden grafisch dargestellt.
Beispiel 9: Differential display PCR
Die RNA wurde aus Zellen extrahiert, die mit Glucokorticoid (Trm, 1 nM) stimuliert wurden e. Erhitzte, DNase-behandelte Gesamt-RNA (5 g in 10,5 l Gesamtvolumen in DEPC-H₂O bei 65°C für 5 Minuten) wurde revers-transkribiert, wie in Beispiel 7 beschrieben, jedoch wurde H-T₁₁ (SEQ ID. NR. 4) als der MMLV-RT-Primer verwendet. Die resultierenden cDNAs wurden wie oben beschrieben mittels PCR amplifiziert, jedoch mit verschiedenen kommerziellen Primer-Sets (z.B. H-T₁₁G (SEQ ID NR. 4) und H-AP-10 (SEQ ID. NR. 5); GenHunter Corp., Nashville, TN). Radioaktiv-markierte PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese auf einem DNA-Sequenzierungsgel aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die resultierenden Gele in vacuo getrocknet und die Autoradiografien wurden über Nacht belichtet. Banden, die differenziell-exprimierte cDNAs repräsentieren, wurden aus dem Gel ausgeschnitten und durch PCR unter der Verwendung des Verfahrens von Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 278 (1983) reamplifiziert. Die Produkte der PCR-Reamplifikation wurden in den PCR-II-Vektor (TA-Klonierungskit; InVitrogen, Carlsbad, CA) kloniert.
Beispiel 10: Screenen einer UMR 106-Osteosarkomzell cDNA-Bibliothek der Ratte
Eine UMR 106-Bibliothek (2,5 × 10¹⁰ pfu/ml) wurde auf 5 × 10⁴ pfu/ml auf Agarplatten (LB-Bottom-Agar) plattiert, und die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
Filtermembranen wurden für zwei Minuten auf die Platten gelegt. Sobald sie entfernt wurden, wurden die Filter denaturiert, gespült, getrocknet und UV-kreuzvernetzt. Die Filter wurden dann in Prähybridisierungspuffer (2 × PIPES [pH 6,5), 5% Formamid, 1 % SDS und 100 g/ml denaturierte Lachssperma-DNA) für 2 Stunden bei 42°C inkubiert. Eine radioaktiv-markierte 260 Basenpaar-Sonde (SEQ ID NR. 3; ³²P-markiert durch Zufalls-Priming) wurde dem gesamten Hybridisationsmix/Filter zugegeben, gefolgt von einer Hybridisierung für 18 Stunden bei 42°C. Die Membranen wurden einmal bei Raumtemperatur gewaschen (10 min, 1 × SSC, 0,1% SDS) und dreimal bei 55°C (15 min, 0,1 × SSC, 0,1 % SDS).
Nachdem sie gewaschen wurden, wurden die Membranen wie oben beschrieben durch Autoradiografie analysiert. Positive Klone wurden Plaque-gereinigt. Der Vorgang wurde mit einem zweiten Filter für fünf Minuten wiederholt, um Falsch-Positive zu minimieren. Plaque-gereinigte Klone wurde als Lamda-SK(–)-Phagemide gewonnen. Klonierte cDNAs wurden wie unten beschrieben sequenziert.
Beispiel 11: Sequenzierung der Klone
Klonierte cDNA-Insertionen wurden durch Standardverfahren sequenziert. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1988). Kurz beschrieben, wurden geeignete Konzentrationen des Gemisches zur Terminierung, des Templates und des Reaktionsgemisches einem geeigneten Zyklus-Protokoll (95°C, 30 s; 68°C, 30 s; 72°C, 60 s; × 25) unterzogen. Das Terminierungsgemisch wurde hinzugegeben, um die Sequenzierungsreaktionen zu beenden. Nach dem Erhitzen auf 92°C für 3 Minuten wurden die Proben auf ein denaturierendes 6% Polyacrylamid-Sequenzierungsgel (29:1 Acrylamid:Bis-Acrylamid) geladen. Die Proben wurden für etwa 4 Stunden bei 60 Volt und konstantem Strom einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in vacuo getrocknet und autoradiografiert.
Die Autoradiografien wurden manuell analysiert. Die resultierenden Sequenzen wurden gegen eine Datenbank, die von dem National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, MD; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ betreut wird, unter der Verwendung des BLASTn-Programmsets mit Standardparametern gescreent. Basierend auf den Sequenz-Daten wurden neue Sequenzierungsprimer hergestellt, und der Vorgang wurde wiederholt, bis das gesamte Gen sequenziert wurde. Alle Sequenzen wurden mindestens dreimal in beiden Richtungen bestätigt.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen wurden außerdem unter Verwendung des PCGENE-Softwarepaketes (Version 16.0) analysiert. Prozentuale Homologie-Werte für Nukleotidsequenzen wurden mit dem Programm NALIGN unter Verwendung der folgenden Parameter berechnet: Gewichtung der nicht passenden Nukleotide, 10; Gewichtung der nicht passenden Lücken (gaps), 10; maximale Anzahl der berücksichtigten Nukleotide, 50; und minimale Anzahl der berücksichtigten Nukleotide, 50.
Für Aminosäuresequenzen wurden die prozentualen Homologiewerte unter Verwendung von PALIGN berechnet. Ein Wert von 10 wurde sowohl für die open gap cost als auch für unit gap cost gewählt.
Beispiel 12: Klonierung der RLMP-cDNA
Die Amplifikationsprodukte der differential display PCR, die in Beispiel 9 beschrieben wurde, enthielten eine Hauptbande von etwa 260 Basenpaaren. Diese Sequenz wurde verwendet, um eine Osteosarkom (UMR 106)-cDNA-Bibliothek der Ratte zu screenen. Positive Klone wurden einer Analyse mit nested Primern unterzogen, um die Primersequenzen zu erhalten, die zur Amplifikation der vollständig langen cDNA notwendig sind (SEQ. ID NR. 11, 12, 29, 30 und 31). Einer dieser positiven Klone, der für weitere Untersuchungen ausgewählt wurde, wurde Klon 10-4 genannt.
Die Sequenzanalyse der vollständig langen cDNA in Klon 10-4, die durch Analyse mit nested Primern bestimmt wurde, zeigte, dass Klon 10-4 das originale 260 Basenpaar-Fragment enthielt, das durch die differential display PCR identifiziert wurde. Klon 10-4 (1696 Basenpaare; SEQ ID NR. 2) enthält einen offenen Leserahmen von 1371 Basenpaaren, die ein Protein kodieren, das 457 Aminosäuren hat (SEQ ID NR. 1). Das Terminierungskodon, TGA, befindet sich bei den Nukleotiden 1444-1446. Das Polyadenylierungssignal bei den Nukleotiden 1675-1680 und der angrenzende Poly(A)⁺-Schwanz war in der 3'-nicht-kodierenden Region vorhanden. Es gab zwei mögliche N-Glycosylierungsstellen, Asn-Lys-Thr und Asn-Arg-Thr bei den Aminosäurepositionen 113-116 bzw. 257-259 in der SEQ ID NR. 1. Zwei mögliche cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinase-Phosphorylierungsstellen, Ser und Thr, wurden an den Amino säurepositionen 191 bzw. 349 gefunden. Es gab fünf mögliche Proteinkinase C-Phosphorylisierungsstellen, Ser oder Thr, an den Aminosäurepositionen 3, 115, 166, 219, 442. Ein potenzielles ATP/GTP-Bindungsstellen-Motiv A (P-Schleife), Gly-Gly-Ser-Asn-Asn-Gly-Lys-Thr, wurde bei den Aminosäurepositionen 272-279 bestimmt.
Zusätzlich wurden zwei hoch-konservierte mutmaßliche LIM-Domänen bei den Aminosäurepositionen 341-391 und 400-451 gefunden. Die mutmaßlichen LIM-Domänen in diesem neu identifizierten Ratten-cDNA-Klon zeigten eine beträchtliche Homologie zu den LIM-Domänen anderer bekannter LIM-Proteine. Jedoch betrug die Gesamt-Homologie zu anderen LIM-Proteinen der Ratte weniger als 25%. RLMP (auch als 10-4 bezeichnet) weist eine Aminosäuren-Homologie von 78,5% zu dem humanen Enigma-Protein (siehe US-Patient Nr. 5,504,192) auf, aber nur 24,5 % und 22,7% Aminosäurenhomologie zu seinen nähesten Homologen der Ratte, CLP-36 bzw. RIT-18.
Beispiel 13: Northernblot-Analyse der RLMP-Expression
Dreißig g der Gesamt-RNA von ROBs, die entsprechend den Beispielen 1 und 2 hergestellt wurden, wurden durch Formaldehyd-Gelelektrophorese in 1 %igem Agaroseflachbettgelen größenabhängig fraktioniert und osmotisch auf Nylonmembranen geblottet. Der Blot wurde mit einem 600 Basenpaar EcoR1-Fragment der vollständig langen 10-4 cDNA, das mit ³²P-dCTP durch Zufallspriming markiert war, sondiert.
Die Northernblotanalyse zeigte eine 1,7 kb mRNA-Spezies, die mit der RLMP-Sonde hybridisiert. RLMP mRNA wurde in ROBs nach 24 Stunden Exposition gegen BMP-6 etwa 3,7-fach hochreguliert. Keine Hochregulation der RMLP-Expression wurde nach 24 Stunden in mit BMP-2 oder BMP-4 stimulierten ROBs beobachtet.
Beispiel 14: Statistische Verfahren
Für jedes berichtete Knötchen/Osteocalcinergebnis wurden Daten von 5–6 Vertiefungen aus einem repräsentativen Experiment genutzt, um den Mittelwert ± S.E.M. zu berechnen. Die Grafiken können mit Daten gezeigt werden, die auf die Maximalwerte für jeden Parameter normalisiert sind, um die gleichzeitige Darstellung der Knötchenanzahl, der mineralisierten Fläche und Osteocalcin zu erlauben.
Für jede berichtete RT-PCR, jeden RNaseprotektions-Assay oder jede Westernblot-Analyse wurden Daten von Proben in dreifacher Ausfertigung aus repräsentativen Experimenten genutzt, um den Mittelwert ± S.E.M. zu bestimmen. Die Grafiken können ent weder normalisiert auf Tag 0 oder auf negative Kontrollen gezeigt werden und werden als Vielfaches des Anstiegs über den Kontrollwerten ausgedrückt.
Die Statistische Signifikanz wurde unter Verwendung einer Varianzanalyse (one-way analysis of variance) mit Posthoc-Korrekturen des multiplen Vergleichs nach Bonferroni wie geeignet bewertet. D. V. Huntsberger, "The Analyse of Variance," in Elements of Statistical Variance, P. Billingsley (ed.), Seiten 298–330, Allyn & Bacon Inc., Boston, MA (1977) und Sigmastat, Jandel Scientific, Corte Madera, CA. Die Alpha-Level der Signifikanz wurden als p < 0,05 definiert.
Beispiel 15: Detektion des LIM Mineralisierungsproteins der Ratte mittels Westernblot-Analyse
Polyklonale Antikörper wurden entsprechend den Verfahren von England et al., Biochim. Biophys. Acta, 623: 171 (1980) und Timmer et al., J. Biol. Chem., 268: 24863 (1993) hergestellt.
HeLa-Zellen wurden mit pCMV2/RLMP transfiziert. Das Protein wurde entsprechend dem Verfahren von Hair et al., Leukemia Research, 20: 1 (1996) aus den transfizierten Zellen geerntet. Eine Westernblot-Analyse des nativen RLMP wurde wie von Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350 (1979) beschrieben durchgeführt.
Beispiel 16: Synthese des humanen PCR-Produktes, das von dem LMP-Unique der Rate (RLMPU) abgeleitet wurde
Auf Grundlage der Sequenz der LMP-1 cDNA der Ratte wurden Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer (SEQ ID NR. 15 und 16) synthetisiert, und eine einzigartige Sequenz mit 223 Basenpaaren wurde mittels PCR von der LMP-1 cDNA der Ratte amplifiziert. Ein ähnliches PCR-Produkt wurde mit den gleichen PCR-Primern aus humaner MG63-Osteosarkomzell-cDNA isoliert.
Die RNA wurde aus MG63-Osteosarkomzellen geerntet, die in T-75-Flaschen kultiviert wurden. Der Überstand der Kultur wurde durch Aspiration entfernt, und die Flaschen wurden mit 3,0 ml einer GIT-Lösung pro Duplikat bedeckt, für 5–10 Sekunden geschwenkt, und die resultierende Lösung wurde in 1,5 ml Eppendorf-Probenröhrchen (5 Probenröhrchen mit 0,6 ml/Probenröhrchen) transferiert. Die RNA wurde mittels einer geringfügigen Modifikation des Standardverfahrens, z.B. siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Kapitel 7, Seite 19, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) sowie Boden et al., Endocrinology, 138: 2820-28 (1997) gereinigt. Kurz beschrieben erhielten die 0,6 ml Proben 60 l M Natriumacetat (pH 4,0), 550 l Wasser-gesättigtes Phenol und 150 l Chloroform:Isoamylalkohol (49:1). Nach Hinzufügen dieser Reagenzien wurden die Proben gevortext, zentrifugiert (10000 × g; 20 min; 4°C), und die wässrige Phase wurde in ein frisches Probenröhrchen transferiert. Isopropanol (600 l) wurde hinzugegeben, und die RNA über Nacht bei –20°C präzipitiert. Die Proben wurden zentrifugiert (10000 × g; 20 Minuten), und der Überstand wurde vorsichtig aspiriert. Die Pellets wurden in 400 l DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert, einmal mit Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert, mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert und über Nacht bei –20°C in 40 l Natriumacetat (3,0 M; pH 5,2) und 1,0 ml absolutem Ethanol präzipitiert. Nach der Präzipitation wurden die Proben zentrifugiert (10000 × g; 20 min), einmal mit 70% Ethanol gewaschen, für 5–10 Minuten luftgetrocknet und in 20 l von DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert. Die RNA-Konzentrationen wurden aus den optischen Dichten abgeleitet.
Die Gesamt-RNA (5 g in 10,5 l Gesamtvolumen in DEPC-H₂O) wurde für 5 Minuten auf 65°C erhitzt und dann in Probenröhrchen gegeben, die 4 l 5 × MMLV-RT-Puffer, 2 l dNTPs, 2 l dT17-Primer (10 pmol/ml), 0,5 l RNAsin (40 U/ml) und 1 l MMLV-RT (200 Units/l) enthielten. Die Reaktionsgemische wurden für 1 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die MMLV-RT durch Erhitzen auf 95°C für 5 Minuten inaktiviert. Die Proben wurden durch Hinzugeben von 80 l Wasser verdünnt.
Die transkribierten Proben (5 l) wurden einer Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Standardverfahren (50 l Gesamtvolumen) zugeführt. Boden et al., Endocrinology, 138: 2820-28 (1997); Ausubel et al., "Quantitation of rare DNAs by the polymerase chain reaction", in Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 15.31-1, Wiley & Sons, Trenton, NJ (1990). Kurz beschrieben wurden die Proben in Probenröhrchen gegeben, die Wasser und geeignete Mengen PCR-Puffer (25 mM MgCl₂, dNTPs, Vorwärts- und Rückwärtsprimer (für RLMPU; SEQ ID NR. 15 und 16), ³²P-dCTP und DNA-Polymerase enthielten. Die Primer wurden entworfen, um gleichmäßig über 22 Zyklen zur Detektion radioaktiver Banden und über 33 Zyklen zur Amplifikation des PCR-Produktes für die Verwendung als Screening-Sonde zu laufen (94°C, 30 s; 58°C, 30 s; 72°C, 20 s).
Die Sequenzierung des Agarosegel-gereinigten MG63-PCR-Produktes, das aus Osteosarkom stammte, ergab eine Sequenz, die mehr als 95% homolog zu dem RLMPU- PCR-Produkt war. Diese Sequenz wird als einzigartige Region des humanen LIM-Proteins bezeichnet (HLMP-Unique-Region, HLMPU; SEQ ID NR. 6).
Beispiel 17: Screenen der MG63-cDNA, die mittels reverser Transkriptase hergestellt wurde
Das Screening wurde mittels PCR unter Verwendung spezifischer Primer (SEQ ID NR. 16 und 17) wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt. Ein 717-Basenpaar-Produkt der MG63-PCR wurde mittels Agarose-Gel gereinigt und mit den genannten Primern sequenziert (SEQ. ID NR. 12, 15, 16, 17, 18, 27 und 28). Die Sequenzen wurden mindestens zweimal in beiden Richtungen bestätigt. Die MG63-Sequenzen wurden miteinander aligned und anschließend mit der vollständig langen LMP cDNA-Sequenz der Ratte aligned, um eine partielle humane LMP-cDNA-Sequenz zu erhalten (SEQ ID NR. 7).
Beispiel 18: Screenen einer humanen Herz-cDNA-Bibliothek
Auf Grundlage der Northernblot-Experimente wurde nachgewiesen, dass LMP-1 in unterschiedlicher Konzentration von mehreren verschiedenen Geweben einschließlich dem humanen Herzmuskel exprimiert wird. Eine humane Herz-cDNA-Bibliothek wurde daher untersucht. Die Bibliothek wurde mit 5 × 10⁴ pfu/ml auf Agarplatten (LB-Bottom-Agar) plattiert, und die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Filtermembranen wurden für zwei Minuten auf die Platten gelegt. Anschließend wurden die Filter denaturiert, gespült, getrocknet, UV-kreuzvernetzt und in Prähybridisierungspuffer (2 × PIPES [pH 6,5]; 5% Formamid, 1 % SDS, 100 g/ml denaturierte Lachssperma-DNA) für 2 Stunden bei 42°C inkubiert. Eine radioaktiv-markierte LMP-Unique, 223 Basenpaar-Sonde (³²P, markiert durch Zufallspriming; SEQ ID NR. 6) wurde hinzugegeben und für 18 Stunden bei 42°C hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen einmal bei Raumtemperatur (10 min; 1 × SSC; 0,1% SDS) und dreimal bei 55°C (15 min; 0,1 × SSC; 0,1% SDS) gewaschen. Doppelt positive Plaque-gereinigte Klone der Herzbibliothek, die durch Autoradiografie identifiziert wurden, wurden als Lambda-Phagemide entsprechend dem Protokoll des Herstellers (Stratagene, La Jolla, CA) gewonnen.
Restriktionsverdaue der positiven Klone ergaben cDNA-Insertionen verschiedener Größe. Insertionen, deren Länge 600 Basenpaare überschritt, wurden für ein initiales Screening durch Sequenzierung ausgewählt. Solche Insertionen wurden durch Standardverfahren, wie in Beispiel 11 beschrieben, sequenziert.
Ein Klon, Nummer 7, wurde außerdem einer automatisierten Sequenzanalyse unter Verwendung von Primern unterzogen, die den SEQ ID NR. 11–14, 16 und 27 entsprachen. Die Sequenzen, die durch diese Verfahren erhalten wurden, waren regelmäßig zu 97–100% homolog. Der Klon 7 (partielle humane LMP-1 cDNA aus einer Herzbibliothek; SEQ. ID NR. 8) enthielt eine Sequenz, die in der translatierten Region mehr als 87% homolog zu der LMP-cDNA-Sequenz der Ratte war.
Beispiel 19: Bestimmung der vollständig langen cDNA des humanen LMP-1
Überlappende Regionen der humanen MG63 Osteosarkomzell-cDNA-Sequenz und der humanen Herz-cDNA-Klon 7-Sequenz wurden verwendet, um diese beiden Sequenzen zu alignen und eine vollständige humane cDNA-Sequenz mit 1644 Basenpaaren abzuleiten. NALIGN, ein Programm aus dem PCGENE-Softwarepaket, wurde verwendet, um die zwei Sequenzen zu alignen. Die überlappenden Regionen der zwei Sequenzen bildeten etwa 360 Basenpaare, die eine vollständige Homologie aufweisen, mit der Ausnahme einer einzelnen Nukleotidsubstitution bei Nukleotid 672 in der MG63 cDNA (SEQ ID NR. 7), wobei Klon 7 ein "A" anstelle eines "G" an dem korrespondierenden Nukleotid 516 (SEQ ID NR. 8) hat.
Die beiden alignten Sequenzen wurden unter Verwendung von SEQIN, einem weiteren Unterprogramm von PCGENE, unter Verwendung der "G"-Substitution des MG63-Osteosarkom-cDNA-Klons zusammengefügt. Die sich ergebende Sequenz ist in der SEQ ID NR. 9 gezeigt. Ein Alignment der neuen Sequenz, die vom Menschen abgeleitet wurde, mit der LMP-1 cDNA der Ratte wurde mit NALIGN durchgeführt. Die vollständig lange cDNA-Sequenz des humanen LMP-1 (SEQ. ID NR. 9) ist zu 87,3% homolog zu dem translatierten Anteil der LMP-1 cDNA-Sequenz der Ratte.
Beispiel 20: Bestimmung der Aminosäuresequenz des humanen LMP-1
Die mutmaßliche Aminosäuresequenz des humanen LMP-1 wurde mit dem PCGENE-Unterprogramm TRANSL bestimmt. Der offene Leserahmen in SEQ ID NR. 9 kodiert ein Protein, das 457 Aminosäuren umfasst (SEQ. ID NR. 10). Unter Verwendung des PCGENE-Unterprogramms Palign wurde festgestellt, dass die humane LMP-1-Aminosäuresequenz zu 94,1 % homolog mit der Aminosäuresequenz des LMP-1 der Ratte ist.
Beispiel 21: Bestimmung der 5-untranslatierten Region der humanen LMP cDNA
Die MG63 5'-cDNA wurde durch nested-RT-PCR der Gesamt-RNA von MG63 unter Verwendung eines Protokolls zur 5' raschen Amplifikation der cDNA-Enden (5' RACE) amplifiziert. Dieses Verfahren beinhaltete die Synthese eines ersten cDNA-Stranges unter Verwendung eines Lock-Docking-Oligo (dT)-Primers mit zwei degenerierten Nukleotidpositionen an dem 3'-Ende (Chenchik et al., CLONTECHniques. X: 5 (1995); Borson et al., PC Methods Applic., 2: 144 (1993)). Die Synthese des zweiten Stranges wird entsprechend dem Verfahren von Gubler et al., Gene, 25: 263 (1983) mit einem Gemisch aus DNA-Polymerase 1 von Escherichia coli, RNase H und DNA-Ligase von E. coli durchgeführt. Nach der Erzeugung stumpfer Enden mit der T4-DNA-Polymerase wurde die doppelsträngige cDNA mit dem Fragment (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3') (SEQ. ID Nr. 19) ligiert. Vor der RACE wurde die Adapter-ligierte cDNA auf eine Konzentration verdünnt, die für Marathon-RACE-Reaktionen (1:50) geeignet ist. Die Adapter-ligierte doppelsträngige cDNA war dann bereit, spezifisch kloniert zu werden.
Der erste PCR-Durchgang wurde mit dem Adapter-spezifischen Oligonukleotid 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (AP1) (SEQ. ID NR. 20) als Sense-Primer und einem Gen-spezifischen Primer (GSP) aus der einzigartigen Region, die in Beispiel 16 beschrieben wurde (HLMPU), durchgeführt. Der zweite PCR-Durchgang wurde unter Verwendung von nested-Primern GSP1-HLMPU (Antisense/Rückwärtsprimer) (SEQ. ID NR. 23) und GSP2-HLMPUF (SEQ. ID NR. 24) (siehe Beispiel 16; Sense/Vorwärtsprimer) durchgeführt. Die PCR wurde unter Verwendung eines kommerziellen Kits durchgeführt (Advantage cDNA PCR core kit; CloneTech Laboratories Inc., Palo Alto, CA), das ein Antikörper-vermitteltes, aber ansonsten standardisiertes, Hot-Start-Protokoll verwendet. Die PCR-Bedingungen für die MG63 cDNA beinhalten eine initiale Hot-Start-Denaturierung (94°C, 60 s), gefolgt von: 94°C, 30 s; 60°C, 30 s; 68°C, 4 min; 30 Zyklen. Das Produkt des ersten PCR-Durchganges war etwa 750 Basenpaare lang, während das Produkt der nested-PCR etwa 230 Basenpaare war. Das Produkt des ersten PCR-Durchganges wurde in einen linearisierten pCR 2.1-Vektor (3,9 Kb) kloniert. Die Insertionen wurden unter Verwendung von M13-Vorwärts- und Rückwärtsprimern (SEQ ID NR. 11; SEQ. ID NR. 12) in beiden Richtungen sequenziert.
Beispiel 22: Bestimmung der vollständig langen cDNA des humanen LMP-1 mit 5-UTR
Die überlappende humane MG63 Osteosarkom-Zell-cDNA-5'-UTR-Sequenz (SEQ ID NR. 21), die 717 Basenpaar-Sequenz des MG63 (Beispiel 17; SEQ ID NR. 8) und die humane Herz-cDNA-Klon 7-Sequenz (Beispiel 18) wurden aligned, um eine neue humane cDNA-Sequenz mit 1704 Basenpaaren abzuleiten (SEQ. ID NR. 22). Das Alignment wurde mit NALIGN durchgeführt (sowohl PCGENE als auch Omiga 1.0; Intelligenetics). Die überlappenden Sequenzen bildeten fast die gesamte 717 Basenpaar-Region (Beispiel 17) mit 100%iger Homologie. Das Zusammenfügen der alignten Sequenzen wurde mit SEQIN durchgeführt.
Beispiel 23: Herstellung eines LIM-Protein Expressionsvektors
Die Herstellung des pHIS-5ATG LMP-1s Expressionsvektors wurde mit den Sequenzen durchgeführt, die in den Beispielen 17 und 18 beschrieben wurden. Der 717 Basenpaarklon (Beispiel 17; SEQ ID NR. 7) wurde mit ClaI und EcoRV verdaut. Ein kleines Fragment (~ 250 Basenpaare) wurde über ein Gel gereinigt. Der Klon 7 (Beispiel 18; SEQ ID NR. 8) wurde mit ClaI und XbaI verdaut, und ein 1400 Basenpaar-Fragment wurde über ein Gel gereinigt. Die isolierten Restriktionsfragmente mit 250 Basenpaaren und 1400 Basenpaaren wurden ligiert, um ein Fragment mit ~ 1650 Basenpaaren zu bilden.
Aufgrund der einzelnen Nukleotidsubstitution in Klon 7 (relativ zu der 717 Basenpaar-PCR-Sequenz und der originalen Rattensequenz) ergab sich ein Stoppkodon an dem translatierten Basenpaar 672. Wegen dieses Stoppkodons wurde ein trunkiertes (kurzes) Protein kodiert, daher der Name LMP-1s. Dies war das Konstrukt, das in dem Expressionsvektor verwendet wurde (SEQ ID NR. 32). Die vollständig lange cDNA-Sequenz mit einer 5'-UTR (SEQ ID NR. 33) wurde durch Alignment der SEQ ID NR. 32 mit der 5' RACE-Sequenz (SEQ ID NR. 21) hergestellt. Die Aminosäuresequenz von LMP-1s (SEQ ID NR. 34) wurde dann aus einem Protein mit 223 Aminosäuren hergeleitet und durch einen Westernblot wurde bestätigt (wie in Beispiel 15), dass es mit dem vorhergesagten Molekulargewicht von ~ 23,7 kD läuft.
Der pHis-ATG-Vektor (InVitrogen, Carlsbad, CA) wurde mit EcoRV und XbaI verdaut. Der Vektor wurde wiedergewonnen, und das Restriktionsfragment mit 1650 Basenpaaren wurde dann in den linearisierten pHis-ATG ligiert. Das ligierte Produkt wurde kloniert und amplifiziert. Der pHis-ATG-LMP-1s-Expressionsvektor, der auch als pHIS-A mit Insertion HLMP-1s bezeichnet wird, wurde mittels Standardverfahren gereinigt.
Beispiel 24: Induktion der Knochenknötchenbildung und Mineralisierung in vitro mit dem LMP-Expressionsvektor
Schädelkalotten-Zellen der Ratte wurden isoliert und in Übereinstimmung mit dem Beispiel 1 in Sekundärkultur gezüchtet. Die Kulturen waren entweder unstimuliert oder mit Glucokorticoid (GC) stimuliert wie in Beispiel 1 beschrieben. Eine Abwandlung des Superfect Reagens (Qiagen, Valencia, CA)-Transfektionsprotokolls wurde verwendet, um 3 g/Vertiefung von jedem Vektor in Sekundärkulturen der Schädelkalotten-Osteoblasten der Ratte entsprechend dem Beispiel 25 zu transfizieren.
Mineralisierte Knötchen wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, durch Von Kossa-Färbung sichtbar gemacht. Die Überexpression des humanen LMP-1s Genproduktes allein induzierte eine Knochenknötchenbildung in vitro (~ 203 Knötchen/Vertiefung). Der Grad der Knötchen betrug etwa 50% von solchen, die durch die GC-positive Kontrolle induziert wurden (~ 412 Knötchen/Vertiefung). Weitere positive Kontrollen beinhalteten den pHisA-LMP Expressionsvektor der Ratte (~ 152 Knötchen/Vertiefung) und den pCMV2/LMP Vorwärts-Expressionsvektor der Ratte (~ 206 Knötchen/Vertiefung), während die negativen Kontrollen den pCMV2/LMP Rückwärts-Expressionsvektor der Ratte (~ 2 Knötchen/Vertiefung) und unbehandelte (NT)-Platten (~ 4 Knötchen/Vertiefung) beinhalteten. Diese Daten zeigen, dass die humane cDNA mindestens ebenso osteoinduktiv war wie die cDNA der Ratte. Dieser Effekt war geringer als der, der bei der GC-Stimulation beobachtet wurde, am wahrscheinlichsten aufgrund von suboptimalen Dosen des Expressionsvektors.
Beispiel 25: LMP-induzierte Zelldifferenzierung in vitro und in vivo
Die LMP cDNA der Ratte in Klon 10-4 (siehe Beispiel 12) wurde durch Doppel-Verdau des Klones mit NotI und ApaI bei 37°C über Nacht aus dem Vektor ausgeschnitten. Der Vektor pCMV2 MCS (InVitrogen, Carlsbad, CA) wurde mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut. Sowohl das lineare cDNA-Fragment aus dem Klon 10-4 als auch pCMV2 wurden über ein Gel gereinigt, extrahiert und mit T4-Ligase ligiert. Die ligierte DNA wurde über ein Gel gereinigt, extrahiert und verwendet, um E. coli JM109-Zellen zur Amplifikation zu transformieren. Positive Agarkolonien wurden ausgewählt, mit NotI und ApaI verdaut, und die Restriktionsverdaue wurden mittels Gelelektrophorese untersucht. Aus positiven Klonen wurden Stammkulturen hergestellt.
Ein Rückwärtsvektor wurde in analoger Weise hergestellt, außer dass die verwendeten Restriktionsenzyme XbaI und HindIII waren. Da diese Restriktionsenzyme verwendet wurden, wurde das LMP cDNA-Fragment aus dem Klon 10-4 in reverser (d. h. nicht-translatierbarer) Orientierung in den pRc/CMV2 insertiert. Der hergestellte rekombinante Vektor wird als pCMV2/RLMP bezeichnet.
Eine geeignete Menge pCMV 10-4 (eine Endkonzentration von 60 nM [3 g] ist optimal; für dieses Experiment wird eine Endkonzentration in dem Bereich von 0–600 nM/Vertiefung [0–30 g/Vertiefung] bevorzugt) wurde in Minimal Eagle Media (MEM) auf ein Endvolumen von 450 l resuspendiert und für 10 Sekunden gevortext. Superfect wurde hinzugegeben (7,5 l/ml endgültige Lösung), die Lösung wurde für 10 Sekunden gevortext und dann bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde MEM hinzugegeben, dem 10% FBS (1 ml/Vertiefung; 6 ml/Platte) zugesetzt wurde, und durch Pipettieren vermischt.
Die resultierende Lösung wurde dann sofort auf gewaschene ROB-Kulturen pipettiert (1 ml/Vertiefung). Die Kulturen wurden für 2 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, inkubiert. Anschließend wurden die Zellen einmal vorsichtig mit sterilem PBS gewaschen und das geeignete normale Inkubationsmedium wurde zugegeben.
Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Knochenknötchenbildung in allen Rattenzellkulturen, die mit pCMV10-4 induziert wurden. Zum Beispiel produzierten mit pCMV10-4 transfizierte Zellen 429 Knötchen/Vertiefung. Positive Kontrollkulturen, die mit Trm exponiert wurden, produzierten 460 Knötchen/Vertiefung. Im Gegensatz dazu produzierten negative Kontrollen, die keine Behandlung erhielten, 1 Knötchen/Vertiefung. Ähnlich dazu wurden, wenn Kulturen mit pCMV10-4 (rückwärts) transfiziert wurden, keine Knötchen beobachtet.
Um eine de novo-Knochenbildung in vivo nachzuweisen, wurde Mark aus den hinteren Gliedmaßen von 4–5 Wochen alten normalen Ratten (rnu/+; heterozygot für den rezessiven athymischen Zustand) aspiriert. Die aspirierten Markzellen wurden in Alpha-MEM gewaschen, zentrifugiert, und die RBCs wurden durch Resuspension des Pellets in 0,83% NH₄Cl in 10 mM Tris (pH 7,4) lysiert. Die verbleibenden Markzellen wurden drei mal mit MEM gewaschen und für 2 Stunden mit 9 g pCMV-LMP-1s (Vorwärts- oder Rückwärtsorientierung) pro 3 × 10⁶ Zellen transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden danach zweimal mit MEM gewaschen und mit einer Konzentration von 3 × 10⁷ Zellen/ml resuspendiert.
Die Zellsuspension (100 l) wurde mittels einer sterilen Pipette auf eine sterile 2 × 5 mm-Typ I-Kollagen-Scheibe des Rindes gegeben (Sulzer Orthopaedics, Wheat Ridge, CO). Die Scheiben wurden chirurgisch subkutan auf Schädel, Brust, Abdomen oder dorsale Wirbelsäule von 4–5 Wochen alten athymischen Ratten (rnu/rnu) implantiert. Die Tiere wurden nach 3–4 Wochen getötet, und zu diesem Zeitpunkt wurden die Scheiben oder chirurgischen Bereiche ausgeschnitten und in 70% Ethanol fixiert. Die fixierten Proben wurden mittels Radiografie analysiert und eine unentkalkte histologische Untersuchung wurde auf 5 m dicken Schnitten durchgeführt, die mit Goldner Trichrome gefärbt waren. Die Experimente wurden außerdem mit devitalisierter (Guanidin-extrahierter) demineralisierter Knochenmatrix (Osteotech, Shrewsbury, NJ) anstelle von Kollagenscheiben durchgeführt.
Die Radiografie zeigte einen hohen Grad an mineralisierter Knochenbildung, die der Form der ursprünglichen Kollagenscheibe entsprach, die LMP-1s transfizierte Markzellen enthielt. Keine mineralisierte Knochenbildung wurde in den negativen Kontrollen (Zellen, die mit einer Rückwärts-orientierten Version der LMP-1s cDNA, die nicht ein translatiertes Protein kodierte, transfiziert waren) beobachtet, und die Absorption des Trägers schien gut vonstatten zu gehen.
Die Histologie ergab neue Knochentrabeculae in den mit LMP-1s transfizierten Implantaten, die mit Osteoblasten gesäumt waren. Kein Knochen wurde zusammen mit partieller Resorption des Trägers in den negativen Kontrollen gesehen.
Die Radiografie eines weiteren Experimentes, in dem 18 Sätze von Implantaten (9 negative Kontrollen pCMV-LMP-Rückwärts- & 9 experimentelle pCMV-LMP-1s) an wechselnden Stellen zwischen Lenden- und Brustwirbelsäule in athymischen Ratten gegeben wurde, zeigte 0/9 negative Kontrollimplantate, die Knochenbildung Wirbelsäulenfusion) zwischen den Wirbelkörpern zeigte. Alle neun der mit pCMV-LMP-1s behandelten Implantate zeigten feste Knochenfusionen zwischen den Wirbelkörpern.
Beispiel 26: Die Synthese des pHIS-5' ATG LMP-1s-Expressionsvektors von den Sequenzen, die in den Beispielen 2 und 3 gezeigt wurden
Der Klon mit 717 Basenpaaren (Beispiel 17) wurde mit ClaI und EcoRV (New England Biologicals, City, MA) verdaut. Ein kleines Fragment (~ 250 Basenpaare) wurde über ein Gel gereinigt. Klon Nr. 7 (Beispiel 18) wurde mit ClaI und XbaI verdaut. Ein Fragment mit 1400 Basenpaaren aus diesem Verdau wurde über ein Gel gereinigt. Die isolierten cDNA-Fragmente mit 250 Basenpaaren und 1400-Basenpaaren wurden mittels Standardverfahren ligiert, um ein Fragment von ~ 1650 bp zu bilden. Der pHis-A-Vektor (In-Vitrogen) wurde mit EcoRV und XbaI verdaut. Der linearisierte Vektor wurde wiedergewonnen und mit dem chimären 1650-Basenpaar-cDNA-Fragment ligiert. Das ligierte Produkt wurde durch Standardverfahren kloniert und amplifiziert, und der pHis-A-5' ATG LMP-1s-Expressionsvektor, der auch als der Vektor pHis-A mit HLMP-1s-Insertion bezeichnet wird, wurde wie zuvor beschrieben bei der ATCC hinterlegt.
Beispiel 27: Die Induktion der Knochenknötchenbildung und -mineralisierung in vitro mit dem pHis-5' ATG LMP-1s Expressionsvektor
Schädelkalotten-Zellen der Ratte wurden isoliert und in Sekundärkulturen gemäß dem Beispiel 1 gezüchtet. Die Kulturen waren entweder unstimuliert oder mit Glucokorticoid (GC) entsprechend dem Beispiel 1 stimuliert. Die Kulturen wurden wie in Beispiel 25 beschrieben mit 3 g rekombinanter pHis-A Vektor-DNA/Vertiefung transfiziert. Mineralisierte Knötchen wurden entsprechend dem Beispiel 3 mittels Von Kossa-Färbung sichtbar gemacht.
Die Überexpression des humanen LMP-1s Genproduktes (d. h. ohne GC-Stimulation) allein induzierte eine signifikante Knochenknötchenbildung (~ 203 Knötchen/Vertiefung) in vitro. Dies sind etwa 50% der Menge an Knötchen, die von Zellen produziert werden, die mit der GC-positiven Kontrolle exponiert waren (~ 412 Knötchen/Vertiefung). Ähnliche Ergebnisse wurden bei Kulturen erhalten, die mit pHisA-LMP der Ratte-Expressionsvektor (~ 152 Knötchen/Vertiefung) und pCMV2/LMP-Vorwärts der Ratte (~ 206 Knötchen/Vertiefung) transfiziert waren. Im Gegensatz dazu erzielte die negative Kontrolle pCMV2/LMP-Rückwärts der Ratte (~ 2 Knötchen/Vertiefung), während etwa 4 Knötchen/Vertiefung bei den unbehandelten Platten beobachtet wurden. Diese Daten zeigen, dass die humane LMP-1 cDNA in diesem Modellsystem mindestens ebenso osteoinduktiv war wie die LMP-1 cDNA der Ratte. Der Effekt in diesem Experiment war geringer als der, der bei GC-Stimulation beobachtet wurde; aber in manchen war der Effekt vergleichbar.
Beispiel 28: LMP induziert die Sekretion eines löslichen osteoinduktiven Faktors
Die Überexpression von RLMP-1 oder HLMP-1s in Kulturen von Osteoblasten der Ratte wie in Beispiel 24 beschrieben resultierte in signifikant größerer Knötchenbildung als die, die in der Negativkontrolle beobachtet wurde. Um den Wirkmechanismus des LIM Mineralisierungsproteins zu untersuchen, wurde konditioniertes Medium zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnen, 10-fach konzentriert, steril filtriert, in Medium, das frisches Serum enthält, auf die ursprüngliche Konzentration verdünnt und für vier Tage auf untransfizierte Zellen gegeben.
Konditionierte Medien, die an Tag 4 von Zellen, die mit RLMP-1 oder HLMP-1s transfiziert wurden, gewonnen wurden, waren etwa ebenso wirksam bei der Induktion der Knötchenbildung wie die direkte Überexpression von RLMP-1 in transfizierten Zellen. Konditionierte Medien von Zellen, die mit RLMP-1 oder HLMP-1 in der rückwärtigen Orientierung transfiziert waren, hatten keinen offensichtlichen Effekt auf die Knötchenbildung. Ebenso wenig konnten konditionierte Medien, die vor Tag 4 von LMP-1 transfizierten Kulturen gewonnen wurden, eine Knötchenbildung induzieren. Diese Daten legen nahe, dass die Expression von LMP-1 die Synthese und/oder Sekretion eines löslichen Faktors verursacht, der in dem Kulturmedium bis 4 Tage nach der Transfektion nicht in wirksamen Mengen auftritt.
Da die Überexpression von rLMP-1 zu der Sekretion eines osteoinduktiven Faktors in das Medium führte, wurde eine Westernblot-Analyse verwendet, um zu bestimmen, ob das LMP-1 Protein in dem Medium vorhanden war. Die Gegenwart des rLMP-1 Proteins wurde unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für LMP-1 waren (QDPDEE), bewertet und durch konventionelle Mittel detektiert. Das LMP-1 Protein wurde nur in der Zellschicht der Kultur gefunden und nicht im Medium detektiert.
Die partielle Aufreinigung des osteoinduktiven löslichen Faktors wurde mittels Standard-25%- und -100%-Ammoniumsulfatschnitte gefolgt von DE-52-Anionaustauschsäulen-Chromatografie (100 mM oder 500 mM NaCl) durchgeführt. Die gesamte Aktivität wurde in den Fraktionen mit hohen Konzentrationen Ammoniumsulfat und hohen Konzentrationen NaCl beobachtet. Diese Lokalisation ist in Übereinstimmung mit der Möglichkeit, dass ein einzelner Faktor für die Konditionierung des Mediums verantwortlich ist.
Beispiel 29: Gentherapie bei der Fusion der Lendenwirbelsäule mittels Adenovirus in geringer Dosierung
Diese Untersuchung bestimmte die optimale Dosis adenoviraler Lieferung (adenoviral delivery) der LMP-1 cDNA (SEQ ID NR. 2), um die Wirbelsäulenfusion in normalen, d. h. immunkompetenten, Kaninchen zu verbessern.
Ein Replikations-defizientes humanes rekombinantes Adenovirus, bei dem die LMP-1 cDNA (SEQ ID NR. 2) durch einen CMV-Promotor gesteuert wird, wurde unter Verwendung des Adeno-Quest^TM Kit hergestellt (Quantum Biotechnologies, Inc., Montreal). Ein kommerziell erhältliches (Quantum Biotechnologies, Inc., Montreal) rekombinantes Adenovirus, das das Beta-Galactosidase-Gen enthielt, wurde als Kontrolle verwendet.
Zunächst wurde ein In vitro-Dosisantwort-Experiment durchgeführt, um die optimale Konzentration des durch den Adenovirus gelieferten LMP-1 ("AdV-LMP-1") zu bestimmen, um Knochendifferenzierung in Kulturen der Osteoblasten der Ratte zu induzieren, unter Verwendung einer 60-minütigen Transduktion mit einer Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection, "MOI") von 0,025; 0,25; 2,5 oder 25 Plaque-bildenden Einheiten (plaque-forming units, pfu) des Virus pro Zelle. Positive Kontrollkulturen wurden durch eine 7 tägige Exposition mit 10⁹ M Glucokorticoid ("GC") differenziert. Negative Kontrollkulturen wurden unbehandelt belassen. An Tag 14 wurde die Anzahl der mineralisierten Knochenknötchen nach einer Von Kossa-Färbung der Kulturen gezählt, und der Spiegel des Osteocalcins, das in das Medium sezerniert (pmol/ml) wurde, wurde durch einen Radioimmunoassay gemessen (Mittelwert ± SEM).
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle I gezeigt. Im Wesentlichen bildeten sich in den unbehandelten negativen Kontrollkulturen keine spontanen Knötchen. Die Daten zeigen, dass eine MOI entsprechend 0,25 pfu/Zelle am effektivsten ist, um Knochenknötchen zu osteoinduzieren und eine Konzentration zu erreichen, die mit der positiven Kontrolle (GC) vergleichbar ist. Niedrigere und höhere Dosen des Adenovirus waren weniger wirksam.
Tabelle I
Anschließend wurden in vivo-Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob die optimale in vitro-Dosis in der Lage war, Fusionen der intertransversalen spinalen Fortsätze in skelettal ausgereiften weißen Neuseelandkaninchen zu fördern. Neun Kaninchen wurden anästhesiert und 3 cc des Knochenmarks wurde aus dem distalen Femur durch ein interkondylares Loch unter Verwendung einer 18 Gauge-Nadel aspiriert. Der Buffycoat wurde anschließend isoliert, eine 10-minütige Transduktion mit AdV-LMP-1 wurde durchgeführt, und die Zellen wurden zur Implantation in den Operationssaal zurückgebracht. Eine posterolaterale Athrodese in einer Ebene der Lendenwirbelsäule wurde mit Decortikation der transversalen Fortsätze und Insertion des Trägers (entweder devitalisierte Knochenmatrix des Kaninchens oder ein Kollagenschwamm), der 8–15 Millionen autologe kernhaltige Zellen des Buffycoat enthielt, die entweder mit AdV-LMP-1 (MOI = 0,4) oder AdV-BGaI (MOI = 0,4) transduziert waren, durchgeführt. Die Kaninchen wurden nach 5 Wochen eingeschläfert und die Fusionen der Wirbelsäulen wurden durch manuelle Palpation, Röntgen in einer Ebene, CT-Untersuchungen und unentkalkte Histologie bewertet.
Die Stellen der Wirbelsäulenfusion, die AdV-LMP-1 erhielten, induzierten feste, kontinuierliche Wirbelsäulenfusionsmassen in allen neun Kaninchen. Im Gegensatz dazu bildeten die Stellen, die AdV-BGaI oder geringere Dosen AdV-LMP-1 (MOI = 0,04) erhielten, wenig oder keinen Knochen und zeigten in einer Rate eine Wirbelsäulenfusion, die vergleichbar mit dem Träger allein war (< 40%). Diese Ergebnisse waren konsistent, wenn sie durch manuelle Palpation, CT-Untersuchung und Histologie evaluiert wurden. Radiografien in einer Ebene überschätzten jedoch manchmal die Menge des Knochens, der vorhanden war, besonders in den Kontrollstellen. Die LMP-1 cDNA-Lieferung und Knocheninduktion war mit beiden getesteten Trägermaterialien erfolgreich. Es gab keinen Anhalt für systemische oder lokale Immunantworten auf den Adenovirusvektor.
Diese Daten zeigen eine konsistente Knocheninduktion in einem vorher validierten Kaninchen-Wirbelsäulenfusions-Modell, das recht herausfordernd ist. Außerdem ist das Protokoll unter Verwendung autologer Knochenmark-Zellen mit intraoperativer ex vivo-Gentransduktion (10 Minuten) eine klinisch besser zu handhabende Methode als andere Verfahren, die eine Transduktion über Nacht oder eine Zellexpansion über Wochen in Kultur erfordern. Außerdem war die wirksamste Dosis des rekombinanten Adenovirus (MOI = 0,25) wesentlich geringer als Dosen, die von anderen Gentherapieanwendungen (MOI-40-500) berichtet wurden. Wir denken, dass dies auf der Tatsache beruht, dass LMP-1 ein intrazelluläres Signal-gebendes Molekül ist und wirkungsvolle Signalamplifikationskaskaden haben kann. Darüber hinaus war die Beobachtung ebenso erstaunlich, dass die gleiche Konzentration AdV-LMP-1, die Knochen in der Zellkultur induzierte, in vivo wirksam war angesichts der üblichen erforderlichen Erhöhung der Dosis von anderen Wachstumsfaktoren, wenn diese von der Zellkultur auf Tierexperimente übertragen werden. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass eine lokale Gentherapie unter Verwendung eines Adenovirus, um LMP-1 cDNA zuzuführen, möglich ist, und die geringe erforderliche Dosis wird wahrscheinlich die negativen Wirkungen einer Immunantwort gegen den Adenovirusvektor minimieren.
Beispiel 30: Verwendung kernhaltiger Zellen aus dem peripheren venösen Blut (Buffycoat) für die Gentherapie mit LMP-1 cDNA, um Knochen zu bilden
Wir führten in vier Kaninchen die Wirbelsäulenchirurgie wie oben (Beispiel 29) durch, außer dass die transduzierten Zellen der Buffycoat aus venösem Blut anstelle des Knochenmarks waren. Diese Zellen wurden mit Adeno-LMP- oder pHIS-LMP-Plasmid transfiziert und zeigten vergleichbar erfolgreiche Ergebnisse, wie wenn Knochenmarkzellen verwendet wurden. Diese Entdeckung der Verwendung gewöhnlicher venöser Blutzellen zur Genlieferung macht die Gentherapie klinisch leichter handhabbar, da sie eine schmerzhafte Markentnahme unter Vollnarkose vermeidet und zweimal mehr Zellen pro ml Ausgangsmaterial erbringt.
Beispiel 31: Isolierung humaner LMP-1 Spleißvarianten
Intron/Exon-mRNA-Transkript-Spleißvarianten sind ein relativ gewöhnlicher Regulationsmechanismus bei der Signaltransduktion und der Zellentwicklung/Gewebeentwicklung. Es wurde gezeigt, dass Spleißvarianten verschiedener Gene die Protein-Protein-, Protein-DNA-, Protein-RNA- und Protein-Substrat-Interaktionen verändern. Spleißvarianten können außerdem die Gewebespezifität der Genexpression kontrollieren und so ermöglichen, dass verschiedene Formen (und daher Funktionen) in verschiedenen Geweben exprimiert werden. Spleißvarianten sind ein gewöhnliches Regulationsphänomen in Zellen. Es ist möglich, dass die LMP-Spleißvarianten zu Effekten in anderen Geweben führen können, wie Nervenregeneration, Muskelregeneration oder Entwicklung anderen Gewebes.
Um die humane Herz-cDNA-Bibliothek auf Spleißvarianten der HLMP-1-Sequenz zu untersuchen, wurde ein Paar PCR-Primer, die Abschnitten der SEQ ID NR. 22 entsprachen, hergestellt. Der Vorwärts-PCR-Primer, der unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert wurde, entspricht den Nukleotiden 35-54 der SEQ ID NR. 22. Er hat die folgende Sequenz:
5' GAGCCGGCATCATGGATTCC 3' (SEQ ID NR. 35)
Der Rückwärts-PCR-Primer, der das rückwärtige Komplement der Nukleotide 820-839 der SEQ ID NR. 22 ist, hat die folgende Sequenz:
5' GCTGCCTGCACAATGGAGGT 3' (SEQ ID NR. 36)
Die Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer wurden verwendet, um die humane Herz-cDNA (ClonTech, Katalog-Nr. 7404-1) auf Sequenzen, die ähnlich zu HLMP-1 sind, mittels Standardverfahren unter Verwendung eines Zyklusprotokolls von 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute, 30-mal wiederholt und gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 72°C zu screenen. Die Amplifikations-cDNA-Sequenzen wurden über ein Gel gereinigt und bei der Emory DNA Sequence Core Facility zur Sequenzierung eingereicht. Die Klone wurden unter Verwendung von Standardmethoden sequenziert und die Sequenzen mit PCGENE untersucht (Intelligenetics; Programme SEQUIN und NALIGN), um die Homologie zur SEQ ID NR. 22 zu bestimmen. Zwei homologe Nukleotidsequenzen mit mutmaßlichen alternativen Spleißstellen im Vergleich zur SEQ ID NR. 22 wurden dann mit Intelligenetics Programm TRANSL in ihre jeweiligen Proteinprodukte translatiert.
Eine dieser beiden neuen humanen cDNA-Sequenzen (SEQ ID NR. 37) umfasst 1456 bp:
Verschiebungen des Leserahmens, die durch die Deletion eines 119 bp-Fragmentes (zwischen *) und der Addition eines 117 bp-Fragmentes (unterstrichen) verursacht wurden, führen zu einem trunkierten Genprodukt, das die folgende abgeleitete Aminosäuresequenz aufweist (SEQ ID NR. 38):
Dieses Protein mit 423 Aminosäuren zeigt 100% Homologie zu dem Protein, das in SEQ ID Nr. 10 gezeigt ist, bis auf die Sequenz in dem hervorgehobenen Bereich (Aminosäuren 94-99), die aufgrund der oben beschriebenen Nukleotidänderungen bestehen.
Die zweite neue humane Herz-cDNA-Sequenz (SEQ ID NR. 39) umfasst 1575 bp:
Verschiebungen des Leserahmens, die durch die Addition eines 17 bp-Fragmentes (fett, kursiv und unterstrichen) verursacht werden, führen zu einem frühen Translations-Stoppkodon an der Position 565-567 (unterstrichen).
Die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NR. 40) besteht aus 153 Aminosäuren:
Dieses Protein zeigt 100% Homologie zur SEQ ID NR. 10 bis zur Aminosäure 94, wo die Addition des in der Nukleotidsequenz dargestellten Fragmentes mit 17 Basenpaaren ist, die zu einer Verschiebung des Rahmens führt. Jenseits der Aminosäuren 94-153 ist das Protein nicht homolog zur SEQ ID NR. 10. Die Aminosäuren 154-457 in SEQ ID NR. 10 sind wegen des frühen Stoppkodons, das in der Nukleotidsequenz dargestellt ist, nicht vorhanden.
Beispiel 32: Genomische HLMP-1 Nukleotidsequenz
Die Anmelder haben die genomische DNA-Sequenz identifiziert, die HLMP-1 kodiert, einschließlich mutmaßlicher regulatorischer Elemente, die mit der HLMP-1-Expression assoziiert sind. Die gesamte genomische Sequenz ist in SEQ ID NR. 41 gezeigt. Diese Sequenz wurde von AC023788 (Klon RP11-564G9), Genome Sequencing Center, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, abgeleitet.
Die mutmaßliche Promotorregion für HLMP-1 umfasst die Nukleotide 2660-8733 in der SEQ ID NR. 41. Diese Region umfasst neben anderen Dingen mindestens zehn potenzielle „Glucokorticoidantwort-Elemente" (glucocorticoid response elements, "GREs") (Nukleotide 6148-6153, 6226-6231, 6247-6252, 6336-6341, 6510-6515, 6552-6557, 6727-6732, 6752-6757, 7738-7743 und 8255-8260), zwölf potenzielle Sma-2-Homologe zu Mothers against Drosophila decapentaplegic ("SMAD")-Bindungselement-Orte (Nukleotide 3569-3575, 6228-6234, 6649-6655, 6725-6731, 6930-6936, 7379-7384, 7738-7742, 8073-8079 und 8378-8384) und drei TATA-Boxen (Nukleotide 5910-5913, 6932-6935 und 7380-7383). Die drei TATA-Boxen, sämtliche GREs und acht der SMAD-Bindungselemente ("SBEs") sind in der Region gruppiert, die die Nukleotide 5841-8733 in der SEQ ID NR. 41 umfasst. Diese regulatorischen Elemente können z.B. genutzt werden, um die Expression von exogenen Nukleotidsequenzen, die Proteine kodieren, die an dem Vorgang der Knochenbildung beteiligt sind, zu regulieren. Dies würde die systemische Verabreichung von therapeutischen Faktoren oder Genen erlauben, die sich auf die Knochenbildung und -reparatur beziehen ebenso wie von Faktoren oder Genen, die mit der Gewebedifferenzierung und -entwicklung assoziiert sind.

Zusätzlich zu den mutmaßlichen regulatorischen Elementen wurden 13 Exons identifiziert, die der Nukleotidsequenz entsprachen, die HLMP-1 kodiert. Diese Exons umfassen die folgenden Nukleotide in der SEQ ID NR. 41:

Exon 1	8733-8767
Exon 2	9790-9895
Exon 3	13635-13787
Exon 4	13877-13907
Exon 5	14387-14502
Exon 6	15161-15297
Exon 7	15401-15437
Exon 8	16483-16545
Exon 9	16689-16923
Exon 10	18068-18248
Exon 11	22117-22240
Exon 12	22323-22440
Exon 13	22575-22911

In HLMP-2 findet sich ein weiteres Exon (Exon 5A), das die Nukleotide 14887-14904 umfasst.
Sequenzprotokoll

Claims

Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine SEQ ID NR: 37 oder SEQ ID NR: 39 umfasst.
Ein isoliertes humanes LIM Mineralisierungsprotein, das durch die SEQ ID NR: 37 oder SEQ ID NR: 39 kodiert wird.
Ein Vektor, der das isolierte Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 umfasst.
Eine Wirtszelle, die den Vektor gemäß Anspruch 3 umfasst.
Die Wirtszelle gemäß Anspruch 4, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe bestehend aus prokaryontischen Zellen, Hefezellen und Säugerzellen ausgewählt ist.
Das isolierte Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, das weiterhin eine Markierung umfasst.
Ein humanes LIM Mineralisierungsprotein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 38 oder SEQ ID NR: 40 ausgewählt ist.
Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch für ein HLMP-2 (SEQ ID NR: 38) oder HLMP-3 (SEQ ID NR: 40) ist.
Eine Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das die SEQ ID NR: 39 umfasst, oder von osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes, die mit der genannten Nukleinsäure transfiziert wurden, zur Herstellung eines Medikamentes zum Induzieren von Knochenbildung.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin das Nukleinsäuremolekül in einem Vektor befindet.
Die Verwendung gemäß Anspruch 10, worin der Vektor ein Expressionsvektor ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 11, worin der Vektor ein Plasmid ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 11, worin der Vektor ein Virus ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 13, worin das Virus ein Adenovirus ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 13, worin das Virus ein Retrovirus ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin die osteogenen Vorläuferzellen oder die Leukozyten des peripheren Blutes ex vivo transfiziert werden.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin die osteogenen Vorläuferzellen durch direkte Injektion des isolierten Nukleinsäuremoleküls in vivo transfiziert werden.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, worin das LIM Mineralisierungsprotein HLMP-3 (SEQ ID NR: 40) ist.
Eine Verwendung eines isolierten Nukleinsäuremoleküls, das die SEQ ID NR: 39 umfasst oder von osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes, die mit der genannten Nukleinsäure transfiziert wurden, zur Herstellung eines Medikamentes zum Fusionieren einer Wirbelsäule, wobei: (a) die transfizierten osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes mit einer Matrix vermischt werden; und (b) die Matrix mit der Wirbelsäule in Kontakt gebracht wird, und wobei die Expression der Nukleotidsequenz die Bildung von mineralisiertem Knochen in der Matrix verursacht.
Die Verwendung gemäß Anspruch 19, worin die osteogenen Vorläuferzellen oder Zellen des peripheren Blutes ex vivo transfiziert werden.
Eine Verwendung eines Vektors, der die SEQ ID NR: 39 umfasst, die funktionell mit einem regulierbaren Promoter verbunden ist, oder von osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes, die mit dem genannten Vektor transfiziert wurden, zur Herstellung eines Medikaments zum Induzieren einer in vivo Knochenbildung in einem Säugerwirt, wobei: (a) der Vektor in den osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes stabil aufrecht erhalten wird, wobei der regulierbare Promoter auf eine exogene Kontrollverbindung anspricht; und (b) dem Wirt, wie benötigt, eine Menge einer exogenen Kontrollsubstanz verabreicht wird, die effektiv ist, die Expression der SEQ ID NR: 39 zu bewirken.
Ein Verfahren zum Herstellen osteogener Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes, das die Schritte des Transfizierens der osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes ex vivo mit einem Nukleinsäuremolekül, das die SEQ ID NR: 39 umfasst, umfasst.
Eine Verwendung eines isolierten Nukleinsäuremoleküls, das die SEQ ID NR: 39 umfasst, oder von osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes, die mit der genannten Nukleinsäure transfiziert wurden, zur Herstellung eines Medikaments zum Stimulieren der Produktion eines osteogenen löslichen Proteins durch eine osteogene Zelle, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül in den osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes überexprimiert wird.
Eine Verwendung eines osteogenen löslichen Proteins, das durch Isolation aus osteogenen Zellen erhalten wurde, induziert durch Überexpression eines Nukleinsäuremoleküls, das die SEQ ID NR: 39 umfasst, in osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes, zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion von Knochenbildung.
Eine Verwendung eines Antisense-Moleküls, das gegen HLMP-2 oder HLMP-3 gerichtet ist, oder einer Zelle, die HLMP-2 oder HLMP-3 exprimiert und mit dem genannten Antisense-Molekül transfiziert wurde, bei der Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren der Expression von HLMP-2 oder HLMP-3.
Die Verwendung gemäß Anspruch 17, worin sich das isolierte Nukleinsäuremolekül in einem Vektor befindet, der aus der Gruppe bestehend aus einem Plasmid und einem Virus ausgewählt wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 26, worin der Vektor ein Plasmid ist, wobei das Plasmid direkt in Muskelgewebe injiziert wird.
Eine Verwendung eines isolierten Nukleinsäuremoleküls, das die SEQ ID NR: 37 umfasst, oder von osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes, die mit der genannten Nukleinsäure transfiziert wurden, zur Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren der Knochenbildung.
Die Verwendung gemäß Anspruch 28, worin sich das isolierte Nukleinsäuremolekül in einem Vektor befindet.
Die Verwendung gemäß Anspruch 29, worin der Vektor ein Expressionsvektor ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 30, worin der Vektor ein Plasmid ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 30, worin der Vektor ein Virus ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 32, worin das Virus ein Adenovirus ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 32, worin das Virus ein Retrovirus ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 28, worin die osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes ex vivo transfiziert werden.
Die Verwendung gemäß Anspruch 28, worin die osteogenen Vorläuferzellen in vivo durch direkte Injektion des isolierten Nukleinsäuremoleküls transfiziert werden.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, worin das LIM Mineralisierungsprotein HLMP-2 (SEQ ID NR: 38) ist.
Eine Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das die SEQ ID NR: 39 umfasst, oder von osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes, die mit der genannten Nukleinsäure transfiziert wurden, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Frakturen der Röhrenknochen, Knochendefekten, Osteoporose der Hüfte, der Wirbelkörper oder des Handgelenkes.
Eine Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das die SEQ ID NR: 39 umfasst oder von osteogenen Vorläuferzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes, die mit der genannten Nukleinsäure transfiziert wurden, zur Herstellung eines Medikaments zur Erleichterung der Tumorrekonstruktion oder der Wirbelsäulenfusion.
Eine Verwendung eines Antisense-Moleküls, das gegen HLMP-2 oder HLMP-3 gerichtet ist, oder einer Zelle, die HLMP-2 oder HLMP-3 exprimiert und mit dem genannten Antisense-Molekül transfiziert wurde, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Frakturen der Röhrenknochen, Knochendefekten, Osteoporose der Hüfte, der Wirbelkörper oder des Handgelenkes.
Eine Verwendung eines Antisense-Moleküls, das gegen HLMP-2 oder HLMP-3 gerichtet ist, oder einer Zelle, die HLMP-2 oder HLMP-3 exprimiert und mit dem genannten Antisense-Molekül transfiziert wurde, zur Herstellung eines Medikaments zur Erleichterung der Tumorrekonstruktion oder der Wirbelsäulenfusion.