ES2288474T3 - Variantes de ayuste de la proteina lim de mineralizacion. - Google Patents

Abstract

Molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:37 o la SEC ID NO:39.

Description

Variantes de ayuste de la proteína LIM de mineralización.

1. Campo de la invención

El campo de la invención hace referencia a las células osteogénicas y a la formación de hueso y tejido óseo en especies de mamíferos. Específicamente, la invención hace referencia a una nueva familia de proteínas y a los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas que incrementan la eficacia de la mineralización ósea in vivo e in vitro. La invención proporciona procedimientos para el tratamiento de diversas patologías asociadas con el hueso y el tejido óseo, como por ejemplo, la fusión de columna vertebral, la reparación de la fractura de columna vertebral y la osteoporosis.

2. Descripción de materias relacionadas

Los osteoblastos se diferencian a partir de células madre mesenquimales. La maduración de un osteoblasto da como resultado la secreción de una matriz extracelular que puede mineralizarse y formar hueso. La regulación de este proceso complejo no se conoce del todo pero se cree que implica un grupo de glicoproteínas de señalización conocidas como las proteínas morfogenéticas del hueso (BMPs). Se ha demostrado que estas proteínas están implicadas con el desarrollo del patrón dorso-ventral, el desarrollo de nódulos límbicos y la reparación de fracturas en los animales adultos. B.L. Hogan, Genes & Develop., 10:1580 (1996). Este grupo de proteínas de la superfamilia de factores beta del crecimiento tiene un amplio espectro de actividades en una gran variedad de tipos celulares en distintos estadios de diferenciación. Aunque, las diferencias en la actividad fisiológica entre estas moléculas estrechamente relacionadas no son del todo conocidas. D.M. Kingsley, Trends Genet. 10:16 (1994).

Para mejor comprender el papel fisiológico único de las distintas proteínas BMP, se comparó recientemente la potencia del BMP-6 con la del BMP-2 y el BMP-4, para inducir la diferenciación de osteoblastos calváricos. Boden y col., Endocrinology, 137:3401 (1996). Se estudió el proceso en cultivos (secundarios) de primer pasaje de hueso de calvario de rata fetal que requerían BMP o glucocorticoides para iniciar la diferenciación. En este modelo de formación de hueso membranoso, el glucocorticoide (GC) o una BMP iniciarán la diferenciación de los nódulos óseos mineralizados capaces de secretar osteocalcina, la proteína específica de osteoblastos. Este sistema de cultivo secundario es distinto de los cultivos de osteoblastos de rata primarios en donde se lleva a cabo una diferenciación espontánea. En este sistema secundario, el glucocorticoide produjo una inducción de la expresión de mRNA y proteína de BMP-6 del orden de diez veces, lo que fue responsable de un aumento en la diferenciación de osteoblastos. Boden y col., Endocrinology, 138:2920 (1997).

Además, las señales extracelulares, como los BMPs, las señales intracelulares o las moléculas reguladoras pueden desempeñar un papel en la cascada de eventos que conducen a la formación de nuevo hueso. Una amplia gama de moléculas reguladoras intracelulares son las proteínas LIM, denominadas así por poseer motivos estructurales característicos conocidos como el dominio LIM. El dominio LIM es un motivo estructural rico en cisteínas compuesto de dos dedos de zinc que están unidos por un espaciador de 2 aminoácidos. Algunas proteínas sólo tienen dominios LIM, mientras que otras contienen diversos dominios funcionales adicionales. Las proteínas LIM forman un grupo diverso, que incluye factores de transcripción y proteínas del citoesqueleto. El papel principal de los dominios LIM parece hallarse en favorecer las interacciones proteína-proteína, gracias a la formación de dímeros con dominios LIM idénticos o distintos, o mediante la unión de proteínas distintas.

En las proteínas de homeodominio LIM, es decir, proteínas que tienen tanto dominios LIM como una secuencia de homeodominio, los dominios LIM funcionan como elementos reguladores negativamente. Las proteínas de homeodominio LIM están implicadas en el control de la determinación del linaje celular y en la regulación de la diferenciación, aunque las proteínas únicamente LIM pueden tener funciones similares. Las proteínas únicamente LIM están también implicadas en el control de la proliferación celular ya que diversos genes que codifican dichas proteínas están asociados con las translocaciones cromosómicas oncogénicas.

Las especies humanas y de otros mamíferos son propensos a dichas enfermedades o lesiones que requieren procesos de reparación y/o regeneración del hueso. Por ejemplo, el tratamiento de fracturas se mejoraría mediante regímenes de tratamiento nuevos que pudieran estimular los mecanismos naturales de reparación del hueso, y en consiguiente reducir el tiempo requerido para la curación del hueso fracturado. En otro ejemplo, los individuos con trastornos óseos sistémicos, como la osteoporosis, se beneficiarían de los regímenes de tratamiento que pudieran dar como resultado la formación sistémica de nuevo hueso. Dichos regímenes de tratamiento que reducirían la incidencia de fracturas que se originan tras la pérdida de hueso, característica de esta enfermedad.

En parte por las razones mencionadas anteriormente, se han investigado factores extracelulares como los BMPs con el propósito de utilizarlos para estimular la formación de hueso nuevo in vivo. A pesar de los primeros logros con los BMPs y otras moléculas de señalización extracelular, su utilización conlleva ciertas desventajas. Por ejemplo, son necesarias dosis relativamente importantes de BMPs purificados para aumentar la producción de hueso nuevo, con lo que se aumenta el gasto de dichos procedimientos de tratamiento. Además, las proteínas extracelulares son susceptibles de degradarse después de su introducción en un animal huésped. Y además, debido a que son típicamente inmunogénicas, no se puede descartar la posibilidad de provocar una respuesta inmune contra las proteínas administradas.

Debido a todo ello, sería deseable disponer de regímenes de tratamiento que utilicen una molécula de señalización intracelular para inducir la formación de hueso nuevo. Avances en el campo de la terapia génica posibilitan hoy en día la introducción en las células precursoras osteogénicas, es decir, células implicadas en la formación de hueso, o en los leucocitos de sangre periférica fragmentos nucleotídicos que codifiquen señales intracelulares que forman parte del proceso de formación del hueso. La terapia génica para la formación de hueso ofrece numerosas ventajas: (1) costes de producción inferiores; (2) eficacia mayor, comparada con los regímenes de tratamiento extracelular, debido a la capacidad de lograr una expresión más prolongada de la señal intracelular; (3) de este modo se obvia la posibilidad de que el tratamiento con las señales extracelulares se vea obstaculizado por la presencia de un número limitante de receptores para dichas señales; (4) lo que permite la liberación de las células osteoprogenitoras potenciales transfectadas directamente al sitio en donde se requiere la formación de hueso; y (5) se permitiría la formación de hueso nuevo, proporcionándose de este modo un régimen de tratamiento para la osteoporosis y otras enfermedades metabólicas del hueso.

Resumen de la invención

La presente invención intenta superar los inconvenientes de sus predecesoras al proporcionar composiciones y procedimientos nuevos para inducir la formación de hueso mediante la utilización de una molécula de señalización intracelular que participa tempranamente en la cascada de los sucesos que conducen a la formación de hueso. Los solicitantes han descubierto 10-4/RMLP (SEC ID NO:1, SEC ID:2), un gen LIM nuevo con una secuencia aislada originalmente del cultivo de osteoblastos calváricos de rata estimulados. El gen se ha clonado, secuenciado y analizado por su capacidad para aumentar la eficacia de la mineralización ósea in vitro. La proteína RMLP afecta la mineralización de la matriz ósea, así como la diferenciación de las células en la línea osteoblástica. Al contrario que otras citoquinas conocidas, por ejemplo, BMPs, la RLMP no es una proteína secretada, sino una molécula de señalización intracelular. Esta característica presenta la ventaja de proporcionar una amplificación de la señalización intracelular así como facilitar la valoración de las células transfectadas. También es adecuada para aplicaciones más eficientes y específicas in vivo. Las aplicaciones clínicas adecuadas incluyen el incremento de la reparación ósea en las fracturas, los defectos óseos, el injerto óseo y la homeostasis normal en pacientes con osteoporosis.

Los solicitantes también han clonado, secuenciado y deducido la secuencia aminoacídica de una proteína humana correspondiente, denominada LMP-1 humana. La proteína humana demuestra un aumento en la eficacia de mineralización ósea in vitro e in vivo.

Además, los solicitantes han caracterizado una versión truncada (corta) de LMP-1, denominada HLMP-1s. Esta versión corta se produjo como resultado de una mutación puntual en una fuente de un clon de cDNA, que producía un codón de parada que truncaba la proteína. La versión corta (LMP-1s) es totalmente funcional cuando se expresa en cultivo celular e in vivo.

Mediante análisis por PCR de la librería de cDNA de corazón humano, los solicitantes han identificado dos variantes de ayuste alternativo (referidas como HLMP-2 y HLMP-3) que difieren de la HLMP-1 en una región entre los pares de bases 325 y 444 en la secuencia nucleotídica que codifica HLMP-1. La secuencia HLMP-2 tiene una deleción de 119 pares de bases y una inserción de 17 pares de bases en esta región. En comparación con la HLMP-1, la secuencia nucleotídica que codifica HLMP-3 no tiene deleciones, pero sí presenta los mismas 17 pares de bases que la HLMP-2, que están insertados en la posición 444 en la secuencia HLMP-1.

Las características y ventajas adicionales de la invención se detallan en la descripción siguiente y en parte serán evidentes a partir de la descripción o de la práctica de la invención. Los objetivos y otras ventajas de la invención se realizarán y lograrán por los procedimientos y composiciones de las materias indicadas en la descripción y reivindicaciones.

En un amplio aspecto, la invención hace referencia a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquier proteína de mineralización LIM, en donde la molécula de ácido nucleico hibrida en condiciones estándares con una molécula de ácido nucleico complementaria con la SEC ID NO:25, y en donde la molécula hibrida en condiciones de astringencia elevada con una molécula de ácido nucleico complementaria con la SEC ID NO:26 de longitud completa. En un aspecto específico, la molécula de ácido nucleico aislada codifica HLMP-1, HLMP-1s, RLMP, HLMP-2, o HLMP3. Además, la invención está dirigida a vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, así como las células huésped que comprenden los vectores. En otro aspecto específico, la invención se refiere a las propias proteínas.

En un segundo aspecto, la invención se refiere al anticuerpo específico de la proteína de mineralización LIM, incluyendo HLMP-1, HLMP-1s, RLMP, HLMP-2 y HLMP-3. En un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otro aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de inducción de la formación de hueso en donde las células precursoras osteogénicas se transfectan con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína de mineralización LIM. En un aspecto específico, la molécula de ácido nucleico aislada se halla en un vector, que puede ser un plásmido o un virus, como un adenovirus o retrovirus. La transfección puede tener lugar ex vivo o in vivo mediante inyección directa de la molécula de ácido nucleico aislada. La molécula de ácido nucleico aislada transfectada puede codificar HLMP-1, HLMP-1s, RMLP, HLMP-2, o HLMP-3.

En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos de fusión de columna vertebral mediante la transfección de células precursoras osteogénicas con una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia nucleotídica que codifica la proteína de mineralización LIM, mezclando las células precursoras osteogénicas transfectadas con una matriz y poniendo en contacto dicha matriz con la columna vertebral.

En otro aspecto, la invención hace referencia a los procedimientos para la inducción de la formación de hueso sistémica mediante la transfección estable de células huésped con los vectores de la invención.

Se debe entender que la descripción general anterior y la descripción detallada siguiente son ejemplos explicativos y que mediante las reivindicaciones se pretende ampliar dicha explicación.

Abreviaturas y definiciones

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Descripción detallada de la invención

La presente invención hace referencia a proteínas de mamífero LIM nuevas, denominadas aquí proteínas de mineralización LIM, o LMP. La invención hace referencia más particularmente a la LMP humana, conocida como HLMP o HLMP-1, o a variantes de ayuste alternativo de la LMP humana, que son conocidas como HLMP-2 o HLMP-3. Los solicitantes han descubierto que dichas proteínas aumentan la mineralización ósea en las células de mamífero que crecen in vitro. Cuando se producen en mamíferos, las LMP también inducen la formación ósea in vivo.

La transfección ex vivo de células óseas, células precursoras osteogénicas, leucocitos se sangre periférica, o células madre mesenquimales con el ácido nucleico que codifica LMP o HLMP, seguido de la reimplantación de las células transfectadas en el donante, es adecuada para el tratamiento de diversos trastornos o lesiones relacionados con el hueso. Por ejemplo, se puede utilizar este procedimiento para: aumentar la reparación de la fractura de huesos largos, generar hueso en defectos segmentales; proporcionar un injerto óseo sustitutivo para las fracturas; facilitar la reconstrucción tumoral o la fusión columna vertebral; y proporcionar un tratamiento local (mediante inyección) para el hueso débil u osteoporótico, como en la osteoporosis de cadera, vértebras o muñecas. La transfección con el ácido nucleico que codifica LMP o HLMP también es útil en: la inyección percutánea de células de médula transfectadas para acelerar la reparación de huesos largos fracturados; el tratamiento de la unión retardada o las no uniones de las fracturas de huesos largos o pseudoartrosis de las fusiones de columna vertebral; y para inducir la formación de hueso nuevo en la necrosis avascular de la cadera o rodilla.

Además de los procedimientos ex vivo de terapia génica, la transfección de un vector de DNA recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica LMP o HLMP puede lograrse in vivo. Cuando un fragmento de DNA que codifica LMP o HLMP se inserta en un vector viral adecuado, por ejemplo, un vector adenoviral, la construcción viral puede inyectarse directamente en un sitio del cuerpo determinado en donde se desea la formación ósea endocondral. Mediante la utilización de una inyección percutánea directa para introducir la secuencia LMP o HLMP, es posible lograr la estimulación de la formación de hueso sin necesidad de intervención quirúrgica para obtener las células de médula ósea (para transfectar ex vivo) ni para reimplantarlas en el paciente en el sitio en donde se requiere hueso. Alden y col., Neosurgical Focus (1998), demostraron la utilidad de un procedimiento de inyección directa de
terapia génica mediante utilización de un cDNA que codifica BMP-2, el cual se ha clonado en un vector adenoviral.

También es posible llevar a cabo la terapia génica in vivo mediante inyección directa en un sitio del cuerpo adecuado, de un plásmido recombinante no encapsulado, desnudo, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica HLMP. En esta realización de la invención, la transfección tiene lugar cuando el DNA del plásmido desnudo es incorporado o internalizado por las células diana adecuadas, las cuales ya se han descrito. Al igual que en la terapia génica in vivo que utiliza una construcción viral, la inyección directa del DNA plasmídico desnudo presenta la ventaja de que casi no es necesaria la intervención quirúrgica. La terapia génica directa, mediante la utilización de DNA plasmídico desnudo que codifica el VEGF mitogénico de células endoteliales (factor de crecimiento endotelial vascular), se ha practicado satisfactoriamente en pacientes humanos. Baumgarther y col., Circulation, 97 (12):1114-23 (1998).

Mediante la utilización de un vector adenoviral para liberar LMP en las células osteogénicas, se logra la expresión transitoria de LMP. Ello ocurre debido a que el adenovirus no se incorpora en el genoma de las células diana que se transfectan. La expresión transitoria de LMP, es decir, la expresión que tiene lugar durante la vida de las células diana transfectadas, es suficiente para lograr los objetivos de la presente invención. La expresión estable de LMP, sin embargo, puede tener lugar cuando un vector que se incorpora en el genoma de la célula diana se utiliza con un vehículo de liberación. Los vectores basados en retrovirus, por ejemplo, son adecuados para este propósito.

La expresión estable de LMP es de particular utilidad para el tratamiento de diversos trastornos relacionados con el sistema óseo, como la osteoporosis y la osteogénesis imperfecta. Para esta realización de la invención, además de utilizar un vector que se integre en el genoma de la célula diana para liberar una secuencia nucleotídica que codifica LMP en las células diana, la expresión de LMP se coloca bajo el control de un promotor regulable. Por ejemplo, es adecuado un promotor que se activa por la exposición a un agente inductor exógeno, como la tetraciclina. Mediante la utilización de esta aproximación, se puede estimular la formación de hueso nuevo en una base sistémica mediante la administración de una cantidad efectiva del agente inductor exógeno. Una vez que se ha conseguido una cantidad suficiente de masa ósea, se interrumpe la administración del agente inductor exógeno. Este proceso puede repetirse según se requiera para recolocar la masa ósea perdida, por ejemplo, como consecuencia de la osteoporosis.

Los anticuerpos específicos para HLMP son especialmente adecuados para utilizar en procedimientos de ensayo de la osteoinducción, es decir la formación de hueso, potencial de las células del paciente. De este modo, es posible identificar pacientes con riesgo de una curación lenta o pobre en la reparación del hueso. También, los anticuerpos específicos para HMLP son adecuados para utilizar en ensayos de marcadores para identificar los factores de riesgo en las enfermedades degenerativas del hueso, como por ejemplo, la osteoporosis.

Según procedimientos bien conocidos y convencionales, es posible preparar los genes de la presente invención mediante ligación de segmentos de ácido nucleico que codifican LMP con otras secuencias de ácido nucleico, como los vectores de clonaje y/o expresión. Los procedimientos necesarios para construir y analizar estos vectores recombinantes son los ya descritos, digestiones con enzimas de restricción, protocolos de clonaje, mutagénesis, síntesis orgánica de oligonucleótidos y secuenciación de DNA. Para la secuenciación de DNA, el procedimiento de los didesoxiterminadores es el preferido.

Se han publicado diversos tratados del DNA recombinante, incluyendo Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2ª edición (1988), Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986), y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1988). Estos manuales de referencia se han incorporado aquí específicamente en las referencias.

La amplificación dirigida por cebadores del DNA o del cDNA es una etapa común en la expresión de los genes de la presente invención. Se realiza de forma característica por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se describe en la patente americana U.S. 4.800.159, Mullis y col., y otras publicaciones. El principio básico de la PCR es la replicación exponencial de una secuencia de DNA mediante ciclos sucesivos de extensión del cebador. Los productos de extensión de un cebador, cuando se hibrida con otro cebador, se convierten en un molde para la síntesis de otra molécula de ácido nucleico. Los complejos de cebador-molde actúan como sustrato para la DNA polimerasa, el cual al realizar su función de replicación, extiende los cebadores. La enzima convencional para las aplicaciones de PCR es la DNA polimerasa de Thermus aquaticus, o la Taq DNA polimerasa.

Existen numerosas variaciones del procedimiento de PCR, y cualquier procedimiento particular de elección en cualquier etapa que se requiera para construir los vectores recombinantes de la presente invención puede realizarse fácilmente por un técnico en la materia. Por ejemplo, para cuantificar la expresión celular de 10-4/RLMP, se extrae el RNA y se retro-transcribe según procedimientos estándares y bien conocidos. El cDNA resultante se analiza a continuación para la secuencia de mRNA adecuada mediante PCR.

El gen codificante de la proteína de mineralización LIM se expresa en un vector de expresión en un sistema de expresión recombinante. Desde luego, la secuencia construida no necesita ser la misma que la original, o ser su complementaria, sino que puede ser una secuencia determinada por la degeneración del código del DNA que no obstante expresa un LMP con actividad formadora de hueso. También pueden utilizarse las sustituciones aminoacídicas conservadas, u otras modificaciones, como la presencia de un residuo metionina amino-terminal.

Un sitio de unión a ribosoma en el sistema de expresión del huésped de elección se liga con el extremo 5' de la secuencia codificante LMP quimérica, formando un gen sintético. El gen sintético puede insertarse en cualquier vector de una gran variedad de ellos para la expresión mediante ligación con un plásmido linearizado adecuadamente. Un promotor regulable, por ejemplo, el promotor lac de E. coli, también es adecuado para la expresión de las secuencias codificantes quiméricas. Otros promotores regulables adecuados incluyen los promotores trp, tac, recA, T7 y lambda.

El DNA que codifica LMP se transfectó en las células receptoras mediante uno de los muchos procedimientos estándares publicados, por ejemplo, la precipitación con fosfato cálcico, DEAE-Dextran, la electroporación o la fusión de protoplastos, para formar transformantes estables. La precipitación con fosfato cálcico es preferible, en particular cuando se realiza de la manera siguiente.

Los DNAs se coprecipitan con fosfato cálcico de acuerdo con el procedimiento de Graham y Van Der, Virology, 52:456 (1973), antes de transferirse a las células. Se utiliza una alícuota de 40-50 g de DNA, con DNA de esperma de salmón o de timo de ternera como transportador, para 0,5x10^{6} células sembradas en una placa de Petri de 100 mm de diámetro. El DNA se mezcla con 0,5 ml de solución de Hepes 2X (NaCl 280 mM, Hepes 50 mM y Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM, pH 7,0), a los que se añade un volumen igual de 2X Cl_{2}Ca (CaCl_{2} 250 mM y Hepes 10 mM, pH 7,0). Aparece un precipitado granular blanco al cabo de 30-40 minutos que se distribuye gota a gota sobre las células, y se incuba durante 4-16 horas a 37ºC. El medio se elimina y las células se someten a un choque con glicerol al 15% en PBS durante 3 minutos. Después de eliminar el glicerol, las células se crecen con medio mínimo esencial de Dulbecco (DMEM) que contiene suero bovino fetal al 10%.

El DNA también se puede transferir utilizando: los procedimientos del DEAE-Dextrano de Kimura y col., Virology, 49:394 (1972) y Sompayrac y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:7575 (1981); el procedimiento de electroporación de Potter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7161 (1984); y el procedimiento de fusión de protoplastos de Sandri-Goddin y col., Molec. Cell Biol., 1:743 (1981).

La química de la fosforamidita en fase sólida es el procedimiento preferido para la síntesis orgánica de oligonucleótidos y polidesoxinucleótidos. Además, están disponibles muchos otros procedimientos de síntesis orgánica. Dichos procedimientos pueden adaptarse fácilmente por los técnicos en la materia a las secuencias específicas de la invención.

La presente invención también incluye moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones estándares con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas de mineralización LIM de la invención. Las condiciones de hibridación estándares variarán con el tamaño de la sonda, el ruido de fondo y la concentración de los reactivos de ácido nucleico, así como del tipo de hibridación, por ejemplo, in situ, transferencia de Southern, o hibridación de híbridos DNA-RNA (transferencia de Northern). La determinación de las "condiciones de hibridación estándares" es competencia del técnico en la materia. Por ejemplo, véase la patente americana U.S. 5.580.775, Fremeau y col., incorporados aquí como referencias para dicho propósito. Véase también Southern, E.M. J. Mol. Biol., 98:503 (1975), Alwine y col., Meth. Enzymol., 68:220 (1979), y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición pp. 7.19-7.50, Cold Spring Harbor Press (1989).

Una de las condiciones de hibridación estándares implica una transferencia que se prehibrida a 42ºC durante 2 horas en formamida al 50%, 5XSSPE (NaCl 150 nM, NH_{2}PO_{4} 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM [pH 8,0), solución de 5X Denhardt (20 mg de Ficoll, 20 mg de polivinilpirrolidona y 20 mg de BSA para 100 ml de agua), sulfato de dextrano al 10%, SDS al 1% y 100 g/ml de DNA de esperma de salmón. Se añadió una sonda de cDNA marcada y la prehibridación se continuó durante 14 horas. Al cabo de dicho tiempo, la transferencia se lavó dos veces con 2XSSPE, SDS al 0,1% durante 20 minutos a 22ºC, seguido de un lavado de 1 h a 65ºC en 0,1XSSPE y SDS al 0,1%. La transferencia se secó a continuación y se expuso a una película autorradiográfica de rayos X durante 5 días en presencia de una pantalla intensificadora.

En condiciones de "elevada astringencia", se hibridará una sonda con su secuencia diana si ambas secuencias son esencialmente idénticas. Al igual que en el caso de las condiciones de hibridación estándares, un técnico en la materia puede, dependiendo del grado de competencia en la materia y del experimento en particular, determinar las condiciones en las que sólo las secuencias esencialmente idénticas hibridarán.

Otro aspecto de la invención incluye las proteínas codificadas por las secuencias de ácido nucleico. En otra realización, la invención hace referencia a la identificación de dichas proteínas basadas en anticuerpos anti-MP. En esta realización, las muestras de proteína se preparan para el análisis de transferencia de Western mediante lisado de células y separación de las proteínas mediante SDS-PAGE. Las proteínas se transfieren a nitrocelulosa mediante electrotransferencia tal como se describe por Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons (1987). Después de bloquear el filtro con leche descremada instantánea (1 g en 100 ml de PBS), el anticuerpo anti-MP se añade al filtro y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. El filtro se lava con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incuba con un anticuerpo conjugado con peróxido de rábano (HPRO) durante 1 hora a temperatura ambien-
te. El filtro se lava de nuevo con PBS y se identifican las bandas del antígeno añadiendo diaminobenzimida (DAB).

Los anticuerpos monoespecíficos son el reactivo de elección en la presente invención y se utilizan de forma específica para analizar las células del paciente por sus características asociadas con la expresión del LMP. El "anticuerpo monoespecífico" tal como se utiliza aquí se definió como una sola especie de anticuerpo o múltiples especies de anticuerpo con características de unión homogéneas para LMP.

La "unión homogénea" tal como se utiliza aquí hace referencia a la capacidad de las especies del anticuerpo para unirse a un antígeno específico o epitopo, como los asociados con el LMP, tal como se describió anteriormente. Los anticuerpos monoespecíficos contra el LMP se purifican de antisueros de mamíferos que contienen anticuerpos reactivos contra el LMP o se preparan como anticuepros monoclonales reactivos con el LMP mediante la utilización de la técnica de Kohler y Milstein, Nature 256:495-97 (1975). Los anticuerpos específicos del LMP se generan mediante inmunización de animales como por ejemplo ratones, ratas, cobayas, cerdos, conejos, cabras o caballos, con una concentración adecuada de LMP con o sin un adyuvante inmune.

En este proceso, el suero preinmune se recolecta antes de la primera inmunización. Cada animal recibe entre 0,1 mg y 1000 mg de LMP asociado con un adyuvante inmune aceptable si se requiere. Dichos adyuvantes aceptables incluyen, pero no se limitan a, el completo de Freund, el incompleto de Freund, el precipitado con alumbre, agua en una emulsión oleosa que contiene adyuvantes de Conrynebacterium parvum y tRNA. La inmunización inicial consiste en LMP en, preferentemente, adyuvante completo de Freund inyectado en múltiples sitios bien subcutáneamente (SC), intraperitonealmente (IP) o ambos. Cada animal se sangra a intervalos regulares, preferentemente cada semana, para determinar el título del anticuerpo. Los animales pueden o no recibir inyecciones de recuerdo después de la inmunización inicial. A aquellos animales que recibieron inyecciones de recuerdo se les proporciona una misma cantidad del antígeno en adyuvante incompleto de Freund por la misma vía. Las inyecciones de recuerdo se proporcionan a intervalos de aproximadamente 3 semanas hasta obtener una titulación máxima. Al cabo de 7 días de la inmunización de recuerdo o de una semana después de una sola inmunización, se sangran los animales, se recoge el suero, y se almacenan las alícuotas a aproximadamente -20ºC.

Los anticuerpos (mAb) que reaccionan con LMP se preparan mediante ratones endogámicos, preferentemente ratones Balb/c con LMP. Los ratones se inmunizan por la vía IP o SC con aproximadamente 0,1 mg a 10 mg aproximadamente, preferentemente 1 mg de LMP en 0,5 ml de tampón o solución salina incorporada en un mismo volumen de un adyuvante aceptable, tal como se describió anteriormente. El adyuvante completo de Freund es el preferido. Los ratones reciben una inmunización inicial el día 0 y luego se les deja descansar durante aproximadamente 3-30 semanas. A los ratones inmunizados se les administra una o más inmunizaciones de recuerdo de aproximadamente 0,1 a 10 mg de LMP en una solución tampón como la solución tamponada de fosfato por vía intravenosa (IV). Los linfocitos de ratones positivos para el anticuerpo, preferentemente linfocitos del bazo, se obtienen mediante extracción del bazo de los ratones inmunizados mediante procedimientos estándares conocidos en la materia. Las células de hibridomas se producen mediante mezcla de los linfocitos del bazo con una pareja de fusión adecuada, preferentemente células de mieloma, en condiciones que permiten la formación de hibridomas estables. Las parejas de fusión pueden incluir, pero no se limitan a: mielomas de ratón P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 y Sp2/0, siendo Sp 2/0 la preferida. Las células productoras de anticuerpo y las células de mieloma se fusionan en polietilén glicol, aproximadamente 1000 mol. a concentraciones del 30 al 50%. Las células del hibridoma fusionadas se seleccionan mediante crecimiento en hipoxantina, timidina y aminopterina en medio Eagle Modificado por Dulbecco suplementado (DMEM) mediante procedimientos conocidos en la materia. Los fluidos del sobrenadantes se recogen de pocillos con crecimiento positivo en los días 14, 18 y 21 y se criban para la producción de anticuerpo mediante un inmunoensayo como el radioinmunoensayo en fase sólida (SPIRA) utilizando LMP como el antígeno. Los fluidos de cultivos se analizan también en el ensayo de precipitación de Ouchterlony para determinar el isotipo del mAb. Las células de hibridoma de los pocillos positivos para el anticuerpo se clonan mediante una técnica como la del agar blando de MacPherson, "Soft Agar Techniques", en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse y Paterson (eds.), Academic Press (1973). Véase también Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory (1988).

Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir in vivo mediante inyección de ratones Balb/c cebados con pristane, aproximadamente 0,5 ml por ratón, con aproximadamente 2x10^{6} a 6x10^{6} células de hibridoma unos 4 días después del cebado. Se recoge el fluido ascítico a aproximadamente 8-12 días después de la transferencia celular y se purifican los anticuerpos monoclonales mediante técnicas conocidas en la materia.

La producción in vivo de mAb anti-LMP se lleva a cabo mediante el crecimiento de la línea celular en DMEM que contiene aproximadamente suero de ternera fetal al 2% para obtener cantidades suficientes del mAb específico. El mAb se purifica mediante técnicas conocidas en la materia.

Los títulos de anticuerpos de ascitas o de fluidos de cultivos de hibridomas se determinan mediante diversos ensayos serológicos o inmunológicos, que incluyen, pero no se limitan a, la precipitación, la aglutinación pasiva, la técnica de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y de radioinmunoensayo (RIA). Ensayos similares se utilizan para detectar la presencia de LMP en fluidos corporales o tejidos y en extractos celulares.

Es evidente para los expertos en la materia que los procedimientos anteriormente descritos para la producción de anticuerpos monoespecíficos pueden utilizarse para producir anticuerpos específicos contra fragmentos de polipéptidos de LMP, el polipéptido LMP naciente de longitud completa, o variantes o alelos de lo mismo.

En otra realización, la invención se dirige a variantes de ayuste alternativo de HLMP-1. El análisis por PCR del cDNA de corazón humano demostró mRNA para dos variantes de ayuste alternativo de HLMP, denominadas HLMP-2 y HLMP-3, que difieren de HLMP-1 en una región entre las bases 325 y 444 en la secuencia hLMP-1. La secuencia HLMP-2 tiene una deleción de 119 pares de bases y una inserción de 17 pares de bases en esta región. Estos cambios preservan la pauta de lectura dando como resultado una proteína de 423 aminoácidos, que comparada con HLMP-1 tiene una pérdida de 34 aminoácidos (40 aminoácidos delecionados más 6 aminoácidos insertados). El HLMP-2 contiene el extremo C-terminal de los dominios LIM que están presentes en HLMP-1.

En comparación con HLMP-1, HMLP-3 no tiene deleciones, pero no tiene la misma inserción de 17 bases en la posición 444. Esta inserción desplaza la pauta de lectura, y causa un codón de parada en las bases 459-461. Como resultado, HLMP-3 codifica una proteína de 153 aminoácidos. Esta proteína carece de los dominios LIM extremo C-terminales presentes en HLMP-1 y HLMP-2. El tamaño predicho de las proteínas codificadas por HLMP-2 y HLMP-3 se confirmó mediante transferencia de western.

El análisis de PCR de la distribución tisular de las tres variantes de ayuste demostró que se expresan de forma distinta, con isoformas específicas predominantemente en tejidos distintos. HLMP-1 es predominante en leucocitos, bazo, pulmón, placenta e hígado fetal. HLMP-2 parece ser la isoforma predominante en el músculo esquelético, médula ósea y tejido de corazón. HMLP-3, sin embargo, no es la forma predominante en ningún tejido examinado.

En la valoración de los ácidos nucleicos, o anticuerpos de la invención, se utilizan ensayos enzimáticos, purificación de proteínas y otros procedimientos bioquímicos convencionales. El DNA y el RNA se analizan mediante transferencia de Southern y técnicas de transferencia de Northern, respectivamente. De forma característica, las muestras analizadas se fraccionan por tamaño en una electroforesis en gel. El DNA o el RNA en los geles se transfieren a las membranas de nitrocelulosa o nylon. Las transferencias son réplicas de los patrones de las muestras en los geles, en donde se hibridan las sondas. Las sondas se marcan isotópicamente con, preferentemente, P^{32}, aunque se pueden marcar con otras moléculas generadoras de señal conocidas en la materia. Bandas específicas de interés pueden visualizarse mediante sistemas de detección, como la autorradiografía.

Para los propósitos de las realizaciones preferidas de la presente invención, se incluyen los siguientes ejemplos no limitantes. Estos resultados demuestran la viabilidad de inducir o incrementar la formación de hueso mediante la utilización de proteínas de mineralización LIM de la invención, y de moléculas de ácido nucleico que codifican dichas proteínas.

Ejemplo 1 Cultivo de células óseas del calvario, también conocidas como osteoblastos de rata ("ROB"), se obtuvieron de

Ratas pre-parto de 20 días tal como se describe en Boden y col., Endocrinology, 137(8):3401-07 (1996). Los cultivos primarios se crecieron a confluencia (7 días), se tripsinizaron y se pasaron a placas de 6 pocillos (1x105 células/pocillo de 35 mm) como células del primer subcultivo. Las células del subcultivo, que fueron confluentes el día 0, se crecieron durante un tiempo adicional de 7 días. Empezando el día 0, el medio se cambió y se aplicaron los tratamientos (Trm y/o BMPs), en una campana de flujo laminar, cada 3 o 4 días. El protocolo de cultivo estándar fue el siguiente: días 1-7, MEM, FBS al 10%, 50 g/ml de ácido ascórbico, \pm estímulos; días 8-14, medio BGJb, FBS al 10%, -GlyP 5 mM (como fuente de fosfato inorgánico para permitir la mineralización). El análisis último de la formación de nódulo óseo y la secreción de oesteocalcina se realizó el día 14. La dosis de BMP se eligió de 50 ng/ml según experimentos pilotos en este sistema que demostraban un efecto a medio plazo en la curva dosis-respuesta para las BMPs estudiadas.

Ejemplo 2 Tratamiento con oligonucleótidos antisentido y cultivo celular

Para explorar la función potencial de LMP-1 durante la formación de hueso membranoso, se sintetizó un oligonucleótido antisentido para bloquear la traducción del mRNA de LMP-1 y se trataron los cultivos de osteoblastos secundarios que iniciaron la diferenciación con un oligonucleótido antisentido específico (sin homologías significativas con las secuencias de rata) correspondiendo con una secuencia de 25 pb que abarca el sitio probable de inicio de la traducción (SEC ID NO:42). Los cultivos control recibieron un oligonucleótdo sentido o no recibieron ninguno. Los experimentos se realizaron en presencia (preincubación) y ausencia de lipofectamina. En resumen, 22 g de oligonucleótido RMLP sentido o antisentido se incubaron en MEM durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación en MEM durante 45 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, se añadió o bien más MEM o lipofectamina/MEM preincubados (7% v/v, incubados 45 minutos a temperatura ambiente) para lograr una concentración de oligonucleótido de 0,2 M. La mezcla resultante se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las mezclas de oligonucleótidos se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y a continuación se mezclaron con el
medio adecuado, es decir, MEM/ascorbato/\pmTrm, para lograr una concentración de oligonucleótidos final de 0,1 M.

Las células se incubaron con el medio adecuado (\pmestímulo) en presencia o ausencia de los oligonucleótdos adecuados. Al cabo de 4 horas de incubación, en los cultivos incubados en un principio con lipofectamina, se cambió el medio por otro sin lipofectamina ni oligonucleótidos. A todos los cultivos, especialmente los cultivos que recibieron oligonucleótidos, se les añadió oligonucleótido cada 24horas para mantener los niveles de oligonucleótido.

El oligonucleótido antisentido LMP-1 inhibió la formación de nódulo mineralizado y la secreción de osteolcalcina de forma dependiente de la dosis, de modo similar al efecto de l oligonucleótido BMP-6. El bloqueo la diferenciación de osteoblastos por el oligo antisentido LMP-1 no pudo ser revertido mediante adición de BMP-6 exógeno, mientras que la inhibición del oligonucleótido antisentido BMP-6 fue revertida por adición de BMP-6. Este experimento confirma además la posición cadena arriba de LMP-1 en relación con BMP-6 en la vía de diferenciación de osteoblastos. El oligonucleótido antisentido también inhibió la diferenciación de osteoblastos espontánea en cultivos de osteroblastos de rata primarios.

Ejemplo 3 Cuantificación de la formación de nódulo óseo mineralizado

Los cultivos de ROBs preparados de acuerdo con los Ejemplos 1 y 2 se fijaron durante toda la noche en etanol al 70% y se tiñeron con tinción de plata de von Kossa. Se utilizó un sistema de análisis de imagen por vídeo automatizado por ordenador para cuantificar el contaje de nódulos y el área nodal en cada pocillo. Boden y col., Endocrinology, 137(8):3401-07 (1996). Estos valores se dividieron para calcular el área por los valores del nódulo. Este proceso automatizado se validó con una técnica de contaje manual, obteniéndose un coeficiente de correlación de 0,92 (p<0,000001). Todos los resultados se expresaron como la media +error estándar de la media (SEM) calculada a partir de 5 o 6 pocillos en cada condición. Cada experimento se confirmó al menos dos veces con células de preparaciones del calvario.

Ejemplo 4 Cuantificación de la secreción de osteocalcina

Los niveles de osteocalcina en el medio de cultivo se cuantificaron utilizando un radioinmunoensayo competitiv con un anticuerpo policlonal monoespecífico (Pab) generado en nuestro laboratorio contra el no-péptido del extremo C-terminal de la osteocalcina de rata tal como se describe en Nanes y col., Endocrinology, 127:588 (1990). En resumen, 1 g de no-péptido se yodó con 1 mCi de I^{125}-Na mediante el procedimiento de la lactoperoxidasa. Los tubos contenían 200 \mul de tampón de ensayo (fosfato sódico 0,02M, EDTA 1 mM, timerosal al 0,001%, BSA al 0,025%) recibieron medio procedente de cultivos celulares o de estándares de osteocalcina (0-12.000 fmoles) a 100 \mul/tubo en tampón de ensayo. A continuación, se añadió PAb (1:40.000; 10), seguido por el péptido yodinado (12.000 rpm; 100 \mul). Las muestras analizadas por su unión inespecífica se prepararon de forma similar pero sin anticuerpo.

Los PAbs unidos o libres se separaron mediante adición de 700 l de anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo, seguido de una incubación durante 18 horas a 4ºC. Después de que las muestras se centrifugaran a 1200 rpm durante 45 minutos, los sobrenadantes se decantaron y los precipitados se contaron con un contador gamma. Los valores de osteocalcina se reportaron en fmoles/100 \mul, lo que se convirtió en pmoles/ml de medio (producción de 3 días) dividiendo los valores por 100. Los valores se expresaron como la media \pm S.E.M. de determinaciones por triplicado de 5-6 pocillos para cada condición. Cada experimento se confirmó al menos dos veces con células de preparaciones de calvario distintas.

Ejemplo 5 Efecto de Trm y RLMP sobre la mineralización in vitro

El efecto fue ligero tanto con los oligonucléotidos sentido como antisentido sobre la producción de nódulos óseos en el sistema de cultivo de células no estimuladas. Cuando se estimularon ROBs con Trm, el oligonucleótido antisentido contra RLMP inhibió la mineralización de nódulos en > 95%. La adición de BMP-6 exógena a los cultivos tratados con oligonucleótidos no rescató la mineralización de los nódulos tratados con antisentido RMLP.

La osteocalcina ha sido durante mucho tiempo sinónimo de mineralización ósea, y los niveles de osteocalcina se han correlacionado con la producción de nódulos y la mineralización. El oligonucleótido antisentido de RMLP disminuye significativamente la producción de osteocalcina, pero el contaje de de nódulos en los cultivos tratados con antisentido no cambió significativamente. En este caso, la adición de BMP-6 exógena sólo rescató la producción de osteocalcina en los cultivos tratados con antisentido RMLP en un 10-15%. Ello sugiere que la acción de RMLP se produce cadena abajo, y más específicamente que la de BMP-6.

Ejemplo 6 Obtención y purificación de RNA

El RNA celular de pocillos duplicados de ROBs (preparados de acuerdo con los Ejemplos 1 y 2 en placas de cultivos de 6 pocillos) se obtuvo con una solución de isotiocianato de guanidina 4M (GIT) para rendir triplicados estadísticos. En resumen, el sobrenadante del cultivo se aspiró de los pocillos, los cuales se recubrieron con 0,6 ml de una solución de GIT por pocillo duplicado. Después de la adición de la solución de GIT, las placas se agitaron espiralmente de forma lo más consistente posible. Las muestras se guardaron a -70ºC durante 7 días antes del posterior procesamiento.

El RNA se purificó mediante una modificación ligera de los procedimientos estándares de acuerdo con Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., capítulo 7.19, cold Spring Harbor Press (1989). En resumen, las muestras descongeladas recibieron 60 \mul de una solución de acetato sódico 2,0M (pH 4,0), 550 \mul de fenol (saturado con agua) y 150 \mul de cloroformo:alcohol isoamílico (49:1). Después de mezclar con ayuda de un vórtex, las muestras se centrifugaron (10000xg; 20 minutos; 4ºC), la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo, se añadieron 600 \mul de isopropanol y el RNA se precipitó durante toda la noche a -20ºC.

Después de la incubación durante toda la noche, las muestras se centrifugaron (10.000xg; 20 minutos) y se aspiró el sobrenadante con cuidado. Los sedimentos se resuspendieron en 400 \mul de agua tratada con DEPC, se extrajeron una vez con fenol:cloroformo (1:1), se extrajeron con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se precipitaron durante toda la noche a -20ºC después de añadir 40 \mul de acetato sódico (3,0 M, pH 5,2) y 1,0 ml de etanol absoluto. Para recuperar el RNA celular, las muestras se centrifugaron (10.000 g; 20 min), se lavaron una vez con etanol al 70%, se secaron al aire durante 5-10 minutos y se resuspendieron en 20 \mul de agua tratada con DEPC. Las concentraciones de RNA se calcularon a partir de las densidades ópticas que se determinaron con un espectrofotómetro.

Ejemplo 7 Reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa

El RNA total (5 \mug en 10,5 \mul de volumen total con H2O- DEPC a 65ºC durante 5 minutos) se añadió a tubos que contenían 4 \mul de tampón 5XMMLV-RT, 2 \mul de dNTPs, 2 \mul de cebador dT17 (10 pmol/ml), 0,5 \mul de RNAsin (40 U/ml) y 1 \mul de RT-MMLV (200 unidades/\mul). Las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 hora, luego a 95ºC durante 5 minutos para inactivar el MMLV-RT. Las muestras se diluyeron mediante adición de 80 \mul de agua.

Las muestras retro-transcritas (5 \mul) se sometieron a la reacción en cadena de la polimerasa mediante metodologías estándares (50 \mul de volumen total). En resumen, se añadieron las muestras a tubos que contenían agua y cantidades adecuadas de tampón de PCR, MgCl2 25 mM, dNTPs, cebadores sentido y antisentido para la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP, un gen housekeeping y/o BMP-6), P^{32}-dCTP y Taq polimerasa. Salvo que se indique lo contrario, los cebadores se estandarizaron para 22 ciclos (94ºC, 30 s; 58ºC, 30 s; 72ºC, 20ºC).

Ejemplo 8 Cuantificación de los productos de RT-PCR mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y análisis en Phosphoimager

Los productos de RT-PCR recibieron 5 \mul/tubo de tampón de carga, se mezclaron, se calentaron a 65ºC durante 10 min y se centrifugaron. 10 \mul de cada reacción se sometieron a PAGE (poliacrilamida:bis al 12%, 15 V/pocillo, corriente constante) en condiciones estándares. Los geles se incubaron en tampón de conservación del gel (glicerol al 10% v/v, ácido acético al 7%, metanol al 40% v/v, agua desionizada) durante 30 minutos, se secaron (80ºC) al vacío durante 1-2 horas y se revelaron con un sistema de imagen fosforescente excitado electrónicamente durante 6-24 horas. Las bandas visualizadas se analizaron. Los contajes por banda se representaron gráficamente.

Ejemplo 9 PCR de expresión diferencial

El RNA se extrajo de las células estimuladas con glucocorticoides (Tm, 1 nM). El RNA total tratado con DNasa se calentó (5 \mug en 10,5 \mul de volumen total en H2O-DEPC a 65ºC durante 5 minutos) se retro-transcribió tal como se describe en el Ejemplo 7, pero se utilizó N-T_{11}M (SEC ID NO:4) como el cebador MMLV-RT. Los cDNAs resultantes se amplificaron por PCR tal como se describió anteriormente, pero con diversos grupos de cebadores comerciales (por ejemplo, H-T_{11}G (SEC ID NO:4) y H-AP-10 (SEC ID NO:5); GenHunter Corp, Nashville, TN). Los productos de PCR marcados isotópicamente se fraccionaron mediante electroforesis en gel en un gel de secuenciación de DNA. Después de la electroforesis, los geles resultantes se secaron al vacío y las autorradiografías se expusieron durante toda la noche. Las bandas que representaban los cDNAs expresados de modo diferencial se recortaron del gel y se reamplificaron mediante PCR mediante el procedimiento de Conner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:278 (1983). Los productos de la reamplificación de PCR se clonaron en el vector de PCR-II (equipo TA Cloning; InVitrogen, Carlsbda, CA).

Ejemplo 10 Cribado de una librería de cDNA de células de osteosarcoma de rata UMR 106

Una librería UMR 106 (2,5x10^{10} pfu/ml) se plaqueó a 5x104 ufc/ml en placas de agar (base de agar LB) y las placas se incubaron durante toda la noche a 37ºC. Las membranas se colocaron sobre las placas durante 2 minutos. Una vez retirados los filtros, éstos se desnaturalizaron, se lavaron, secaron y se fijaron mediante UV. Las membranas se incubaron en tampón de pre-hibridación (2XPIPES, pH 6,5), formamida al 5%, SDS al 1% y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado) durante 2 h a 42ºC. Una sonda marcada isotópicamente de 260 pb (SEC ID NO:3; marcada con P^{32} mediante cebado aleatorio) se añadió a la mezcla de hibridación de los filtros, seguido de una hibridación durante 18 horas a 42ºC. Las membranas se lavaron a temperatura ambiente (10 min, 1xSSC, SDS al 0,1%) y tres veces a 55ºC (15 min, 0,1 XSSC, 0,1% SDS).

Después del lavado, las membranas se analizaron mediante radiografía tal como se describió anteriormente. Los clones positivos se purificaron de las calvas. El procedimiento se repitió con un segundo filtro durante 4 minutos para minimizar falsos positivos. Los clones purificados de las calvas se obtuvieron como fagémidos de lambda SK(-). Los cDNAs clonados se secuenciaron tal como se describe más abajo.

Ejemplo 11 Secuenciación de los clones

Los insertos de cDNA se secuenciaron mediante procedimientos estándares. Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1988). En resumen, concentraciones adecuadas de la mezcla de finalización, molde y mezcla de reacción se sometieron a un protocolo de ciclos adecuado (95ºC, 30 s; 68ºC, 30 s; 72ºC, 60s; x25). Las mezclas de parada se añadieron para finalizar las reacciones de secuenciación. Después de calentar a 92ºC durante 3 minutos, las muestras se cargaron en un gel de secuenciación de poliacrilamida al 6% (29:1 acrilamida:bisacrilamida). Las muestras se migraron en una electroforesis durante 4 horas a 60 voltios, corriente constante. Después de la electroforesis, los geles se secaron al vacío y se autorradiografiaron.

Las autorradiografías se analizaron manualmente. Las secuencias resultantes se cribaron contra bases de datos del National Center for Biotechnology Information (NIH, Bethesda, MD; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) mediante el conjunto de programas BLASTn con los parámetros por defecto. Según los resultados de la secuencia, se prepararon nuevos cebadores de secuenciación y el proceso se repitió hasta secuenciar el gen completo. Todas las secuencias se confirmaron por lo mínimo tres veces en ambas orientaciones.

Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas también se analizaron mediante el paquete de programas PCGENE (versión 16.0). Los valores de homología en porcentaje para las secuencias nucleotídicas se calcularon mediante el programa NALIGN, utilizando los parámetros siguientes: peso de nucleótidos sin concordancia, 10; peso de huecos sin concordancia, 10; número máximo de nucleótidos considerados, 50; y número mínimo de nucleótidos considerados, 50.

Para las secuencias aminoacídicas, los valores de porcentajes de homología se calcularon con PALIGN. Un valor de 10 se seleccionó para el coste de hueco abierto y para el coste de unidad de hueco.

Ejemplo 12 Clonaje del cDNA del RLMP

Los productos de PCR de la expresión diferencial descritos en el Ejemplo 9 contenían una banda principal de aproximadamente 260 pares de bases. Esta secuencia se utilizó para cribar una librería de cDNA de osteosarcoma de rata (UMR 106). Los clones positivos se sometieron a un análisis de cebador anidado para obtener las secuencias cebadoras necesarias para amplificar el cDNA completo. (SEC ID Nos: 11, 12, 29, 30 y 31). Uno de estos clones positivos seleccionados para el estudio posterior fue el clon denominado 10-4.

El análisis de secuencia del cDNA completo en el clon 10-4, determinado por el análisis de cebador anidado, mostró que el clon 10-4 contenía el fragmento original de 260 pares de bases identificado por PCR de expresión diferencial. El clon 10-4 (1696 pares de bases; SEC ID NO:2) contiene una pauta abierta de lectura de 1371 pares de bases que codifica una proteína de 457 aminoácidos (SE ID NO:1). El codón de finalización, TGA, se localiza en los nucleótidos 1444-1446. La señal de poliadenilación en los nucleótidos 1675-1680 y la cola poli(A)+ adyacente en la región no codificante 3'. No había sitios de N-glicosilación potencial, Asn-Lys-Thr y Asn-Arg-Thr, en las posiciones aminoacídicas 113-116 y 257-259 en la SEC ID NO:1, respectivamente. Se hallaron dos sitios potenciales de fosforilación de protein quinasa dependiente de cAMP y cGMP, Ser y Thr, en las posiciones aminoacídicas 191 y 349 respectivamente. Se hallaron 5 sitios potenciales de fosforilación de protein quinasa C, Ser o Thr, en las posiciones aminoacídicas 3, 115, 166, 219, 442. Se determinó un motivo A de sitio de unión potencial ATP/GTP (bucle P), Gly-Gly-Ser-Asn-Asn-Gly-Lys-Thr, en las posiciones 272-279.

Además, se hallaron dos dominios LIM putativos altamente conservados en las posiciones aminoacídicas 341-391 y 400-451. Los dominios LIM putativos este clon de cDNA de rata identificado mostraron una homología considerable con los dominios de otras proteínas LIM conocidas. Sin embargo, la homología global con otras proteínas LIM de rata fue inferior al 25%. RLMP (también denominado 10-4) tiene una homología aminoacídica del 78,5% con la proteína enigma humana (véase la patente americana U.S. 5.504.192), pero sólo del 24,5% y del 22,7% de homología aminoacídica con sus homólogos de rata más cercanos, CLP36 y RIT-18, respectivamente.

Ejemplo 13 Análisis de transferencia de Northern de la expresión de RLMP

Treinta \mug de RNA total de ROBs, preparado de acuerdo con los Ejemplos 1 y 2, se fraccionó por tamaño en una electroforesis en gel plano de agarosa al 1% y se transfirió osmóticamente a membranas de nylon. La transferencia se hibridó con un fragmento EcoR1 de 600 pb del cDNA 10-4 completo marcado con dCTP-P^{32} por cebado aleatorio.

Los análisis de transferencia de Northern mostraron una especie de mRNA de 1,7Kb que hibridaba con la sonda de RLMP. La expresión del mRNA de RLMP aumentó unas 3,7 veces en ROBs al cabo de 24 horas de exposición a BMP-6. No se observó un aumento de la expresión de RMLP en ROBs estimulados con BMP-2 o BMP-4 a las 24 horas.

Ejemplo 14 Procedimientos estadísticos

Para cada valor reportado de nódulo/osteocalcina, se utilizaron los resultados de 5-6 pocillos de un experimento representativo para calcular la media\pmS.E.M. Los gráficos pueden mostrarse con los resultados normalizados por el valor máximo para cada parámetro para permitir la representación simultánea de los contajes de nódulos, áreas mineralizadas y osteocalcina.

Para cada ensayo de RT-PCR, protección por la RNasa, o transferencia de Western, se utilizaron resultados de muestras por triplicado de experimentos representativos para determinar la media \pm S.E.M. Los gráficos pueden representarse normalizados respecto al día 0 o a los controles y expresarse como incrementos sobre los valores control.

La significación estadística se evaluó utilizando un análisis univariante con correcciones de comparación múltiple post-hoc de Bonferroni. D.V. Huntsberger, "The Analysis of Variance", in Elements of Statistical Variance, P. Billingsley (ed.), pp. 298-330, Allyn & Bacon Inc., Boston, MA (1977) y Sigmastat, Jandel Scientific, Corte Madera, CA. Los niveles de alfa para significación se definieron como P<0,005.

Ejemplo 15 Detección de la proteína de mineralización LIM de rata mediante análisis de transferencia de western

Los anticuerpos policlonales se prepararon de acuerdo con los procedimientos de England y col., Biochem.
Biophys. Acta, 623:171 (1980) y Timmer y col., J. Biol. Chem., 268:24863 (1993).

Las células HeLa se transfectaron con pCMV2/RLMP. Se recogieron las proteínas de las células transfectadas de acuerdo con el procedimiento de Hair y col., Leukemia Research, 20:1 (1996). El análisis de transferencia de Western de RLMP nativa se realizó tal como se describió por Towbin y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76:4350 (1979).

Ejemplo 16 Síntesis de LMP-Unique de rata (RMLP) derivada del producto de PCR humano

Se sintetizaron cebadores sentido de transcripción 5' y 3' (SEC ID Nos: 15 y 16) a partir de la secuencia del cDNA de LMP-1 de rata y se amplificó por PCR una sola secuencia de 223 pares de bases a partir del cDNA LMP-1 de rata. Un producto de PCR similar se aisló del cDNA de células de osteosarcoma MG63 humano con los mismos cebadores de PCR.

El RNA se recolectó de células de osteosarcoma MG63 que crecían en frascos T-75. Los sobrenadantes del cultivo se eliminaron por aspiración y se añadieron 3 ml de una solución GIT por duplicado, se agitó durante 5-10 segundos y la solución resultante se transfirió a tubos eppendorf de 1,5 ml (5 tubos con 0,6 ml/tubo). El RNA se purificó mediante una modificación ligera de los procedimientos estándares, por ejemplo, véase Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, capítulo 7, pp. 19, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y Boden y col., Endocrinology, 138:2820-28 (1997). En resumen, a las muestras de 0,6 ml se les añadió 60 \mul de acetato sódico 2 M (pH 4,0), 550 \mul de fenol saturado con agua y 150 \mul de cloroformo:alcohol isoamílico (49:1). Después de la adición de estos reactivos, las muestras se mezclaron con ayuda de un vórtex, se centrifugaron (10000xg, 20 min, 4ºC) y la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo. Se añadieron 600 \mul de isopropanol y se precipitó el RNA durante toda la noche a -20ºC. Las muestras se centrifugaron a 10000xg, 20 minutos, y se aspiró el sobrenadante con suavidad. Los sedimentos se resuspendieron en 400 \mul de agua tratada con DEPC, se extrajeron una vez con fenol:cloroformo (1:1), se extrajeron con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se precipitaron durante la noche a -20ºC con 40 \mul de acetato sódico (3,0 M, pH 5,2) y 1 ml de etanol absoluto. Después de la precipitación, las muestras se centrifugaron (10.000xg, 20 min), se lavaron una vez con etanol al 70% y se secaron al aire durante 5-10 minutos y se resuspendieron en 20 \mul de agua tratada con DEPC. Las concentraciones de RNA se derivaron de las lecturas de densidades ópticas.

El RNA total (5 \mug en 10,5 \mul de volumen total de H20 con DEPC) se calentó a 65ºC durante 5 minutos y luego se añadió a los tubos que contenían 4 \mul de tampón MMLV-RT 5X, 2 \mul de dNTPs, 2 \mul del cebador dT17 (10 pmol/ml), 0,5 \mul de RNAsin (40 U/ml) y 1 \mul de MMLV-RT (200 unidades/l). Las reacciones se incubaron a 37ºC durante 1 hora. A continuación, se inactivó la MMLV-RT calentando a 95ºC durante 5 minutos. Las muestras se diluyeron por adición de 80 \mul de agua.

Las muestras transcritas (5 \mul) se sometieron a la reacción en cadena de la polimerasa mediante metodologías estándares (50 \mul del volumen total). Boden y col., Endocrinology, 138:2820-28 (1997); Ausubel y col., "Quantitation of rare DNAs by the polymerase chain reaction", en Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 15, 31-1, Wiley & Sons, Trenton, NJ (1990). En resumen, las muestras se añadieron a los tubos que contenían agua y cantidades adecuadas de tampón de PCR (MgCl2 25 mM, dNTPs, cebadores sentido de transcripción 5' y 3' (para RLMP; SEC ID Nos:15 y 16), dCTP-P^{32} y DNA polimerasa. Los cebadores se diseñaron para una amplificación de 22 ciclos para la detección de la banda radioactiva y de 33 ciclos para el producto de PCR para utilizar como sonda de cribado (94ºC, 30 s; 58ºC, 30 s; 72ºC, 20 s).

La secuenciación del producto de PCR derivado de osteosarcoma MG63 purificado en gel de agarosa produjo una secuencia con más del 95% de homología con el producto de PCR de RLMP. Dicha secuencia se denominó región única HLMP (HLMP; SEC ID NO:6).

Ejemplo 17 Cribado del cDNA de MG63 generado con transcriptasa inversa

El cribado se realizó mediante PCR con cebadores específicos (SEC ID Nos:16 y 17) tal como se describió en el Ejemplo 7. Un producto de PCR MG63 de 717 pares de bases se purificó a partir del gel de agarosa y se secuenció con los cebadores proporcionados (SEC ID, Nos: 12, 15, 16, 17, 18, 27 y 28). Las secuencias se confirmaron como mínimo dos veces en ambas direcciones. Las secuencias de MG63 se alinearon unas con otras y luego contra la secuencia del cDNA de LMP de longitud completa para obtener una secuencia de cDNA de LMP humana parcial (SEC ID NO:7).

Ejemplo 18 Cribado de una librería de cDNAs de corazón humano

Basándose en los experimentos de transferencia de Northern, se determinó que el LMP-1 se expresaba a niveles diferentes en tejidos diversos, incluyendo el músculo del corazón humano, por ello se examinó una librería de cDNA de corazón humano. La librería se plaqueó a 5x10^{4} pfu/ml en placas de agar (agar inferior de LB) y las placas se crecieron durante la noche a 37ºC. Encima de las placas se colocaron los filtros de membrana durante dos minutos. A continuación, se desnaturalizaron los filtros, se lavaron, se secaron, se fijaron con UV y se incubaron en tampón de prehibridación (2XPIPES, pH 6,5, formamida al 5%, SDS al 1%, DNA de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml) durante 2 h a 42ºC. Se añadió una sonda de 233 pb LMP-Unique marcada isotópicamente (P^{32}, marcaje por cebado aleatorio; SEC ID NO:6) y se hibridó durante 18 h a 42ºC. Después de la hibridación, las membranas se lavaron una vez a temperatura ambiente (10 min en 1XSSC, SDS al 0,1%) y tres veces a 55ºC (15 min, 0,1XSSC, SDS al 0,1%). Los clones positivos de la librería de corazón purificados dos veces de las calvas se identificaron mediante autoradiografía, se obtuvieron como fagémidos de lambda de acuerdo con los protocolos del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA).

Las digestiones por enzimas de restricción de los clones positivos rindieron insertos de cDNA de tamaños diversos. Los insertos superiores a 600 pb se seleccionaron para el cribado inicial por secuenciación. Aquellos insertos se secuenciaron por procedimientos estándares tal como se describe en el Ejemplo 11.

Un clon, número 7, también se sometió al análisis de secuencia automatizada mediantecebadores que correspondían con la SEC ID NOs:11-14, 16 y 27. Las secuencias obtenidas por estos procedimientos presentaron comúnmente una identidad de secuencia del 97-100%. El clon 7 (cDNA de LMP-1 Humano parcial de una librería de corazón; SEC ID NO:8) contenía la secuencia con más de un 87% de identidad de secuencia con la del cDNA de LMP de rata en la región traducida.

Ejemplo 19 Determinación del cDNA de LMP-1 Humano completo

Las regiones solapantes de la secuencia del cDNA de células de osteosarcoma humano MG63 y la secuencia del clon 7 del cDNA de corazón humano se utilizaron para alinear dos secuencias y derivar una secuencia de cDNA humana completa de 1644 pb. NALIGN, un programa en el paquete del software PCGENE, se utilizó para alineara las dos secuencias. Las regiones solapantes de las dos secuencias constituidas de aproximadamente 360 pb presentaron homología completa excepto para una sustitución de un solo nucleótido en el nucleótido 672 en el cDNA de MG63 (SEC ID NO:7) con el clon 7 con una "A" en lugar de "G" en el nucleótido 516 correspondiente (SEC ID NO:8).

Las dos secuencias alineadas se uniron con SEQIN, otro subprograma de PCGENE, utilizando la sustitución "G" del clon de cDNA de osteosarcoma MG63. La secuencia resultante se muestra en SEC ID NO:9. El alineamiento de la secuencia nueva derivada de la humana con el cDNA de LMP-1 de rata se consiguió con NALIGN. La secuencia del cDNA de LMP-1 humana de longitud completa (SEC ID NO9) tiene un 87,3% de homología con la porción traducida de la secuencia del cDNA de LMP-1 de rata.

Ejemplo 20 Determinación de la secuencia aminoacídica del LMP-1 humano

La secuencia aminoacídica putativa del LMP-1 humano se determinó con el subprograma de PCGENE, TRANSl. La pauta abierta de lectura en SEC ID NO:9 codifica una proteína que comprende 457 aminoácidos (SEC ID NO:10). Mediante la utilización del subprograma de PCGENE Palign, la secuencia aminoacídica de LMP-1 humana presentaba una homología del 94,1% con la secuencia aminoacídica del LMP-1 de rata.

Ejemplo 21 Determinación de la región no traducida 5' del cDNA de LMP humano

La porción 5' del cDNA MG65 se amplificó mediante RT-PCR anidada a partir del RNA total de MG63 utilizando el protocolo de amplificación rápida de los extremos 5'del cDNA (5' RACE). Este procedimiento incluyó la síntesis de la primera cadena del cDNA utilizando un cebador oligo(dT) de cerradura-acoplamiento con dos posiciones nucleotídicas degeneradas en el extremo 3' (Chenchik y col., CLONTECHniques, X:5 (1995); Borson y col., PC Methods Applic., 2:144 (1993)). La síntesis de la segunda cadena se realizó de acuerdo con el procedimiento de Gubler y col., Gene, 25:263 (1983), con un cóctel de DNA polimerasa I de Escherichia coli, RNasa H, DNA ligasa de E. coli. Después de generar extremos romos con la T4 DNA polimerasa, el cDNA de doble cadena se ligó al fragmento (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3') (SEC ID NO:19). Antes de realizar el RACE, el cDNA ligado a un adaptador se diluyó a una concentración adecuada para la maratón de reacciones RACE (1:50). El cDNA de doble cadena ligado al adaptador se hallaba de este modo preparado para ser clonado específicamente.

Se realizó una primera PCR con el oligonucleótido específico para el adaptador, 5'-CCATCCTAATACGACTCAC
TATAGGGC-3' (AP1) (SEC ID NO:20) como cebador de sentido de transcripción 5' y un cebador específico del gen (GSP) a partir de la región única descrita en el Ejemplo 16 (1hLMPU). La segunda PCR se realizó utilizando cebadores anidados GSP1-HLMPU (cebadore antisentido/inverso) (SEC ID NO:23) y GSP2-HLMPUF (SEC ID NO:24) (véase el Ejemplo 16; cebador sentido/directo). La PCR se realizó utilizando un equipo comercial (equipo de Advantage cDNA PCR core; Clone Tech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) que utiliza un protocolo de inicio en caliente mediado por un anticuerpo, o de lo contrario un protocolo estándar. Las condiciones de PCR para el cDNA de MG63 incluyeron una desnaturalización con el inicio en caliente (94ºC, 60 s), seguido de 30 ciclos de: 94ºC, 30s; 60ºC, 30 s; 68ºC, 4 min. El primer producto de PCR fue de aproximadamente 750 pb mientras que el producto de la PCR anidada fue de aproximadamente 230 pb. El primer producto de PCR se clonó en un vector de pCR2.1 linearizado (3,9 Kb). Los insertos se secuenciaron en ambas direcciones mediante la utilización de cebadores directo e inverso de M13 (SEC ID NO:11; SEC IDNO:12).

Ejemplo 22 Determinación del cDNA de LMP-1 humano de tamaño completo con el extremo 5' UTR

La secuencia 5'UTR del cDNA de células de osteosarcoma humano MG63 (SEC ID NO:21), la secuencia de 717 pares de bases de MG63 (Ejemplo 17:SEC ID NO:8) y el clon 7 del cDNA de corazón humano (Ejemplo 18) se alinearon para derivar una nueva secuencia de cDNA humana de 1704 pares de bases (SEC ID NO:22). El alineamiento se logró con NALIGN, (tanto con PCGENE como Omiga 1.0; Intelligenetics). Las secuencias solapantes constituyeron casi toda la región de 717 pb (Ejemplo 17) con una homología del 100%. La unión de las secuencias alineadas se logró con SEQIN.

Ejemplo 23 Construcción del vector de expresión de la proteína LIM

La construcción del vector de expresión pHIS-5ATG LMP-1s se llevó a cabo con las secuencias descritas en los Ejemplos 17 y 18. El clon de 717 pb (Ejemplo 17; SEC ID NO:7) se digirió con ClaI y EcoRV. Un pequeño fragmento (\sim250 pb) se purificó por gel. El clon (Ejemplo 18, SEC ID NO:8) se digirió con ClaI e XbaI y un fragmento de 1400 pb se purificó por gel. Los fragmentos de restricción de 250 pb y 1400 pb aislados se ligaron para formar un fragmento de \sim1650 pb.

Debido a la sustitución de un solo nucleótido en el clon 7 (en relación con la secuencia de PCR de 717 pb y la secuencia original de rata) se generó un codón de parada en la base traducida 672. Debido a este codón de parada, se codificó una proteína truncada (corta), denominada LMP-1s. Esta fue la construcción utilizada en el vector de expresión (SEC ID NO:32). La secuencia del cDNA de tamaño completo con el 5'UTR (SEC ID NO:33) se generó por alineamiento de la SEC ID NO:32 con la secuencia 5'RACE (SEC ID NO:21). La secuencia aminoacídica de LMP-1s (SEC ID NO:34) se dedujo como una proteína de 223 aminoácidos y se confirmó por transferencia de Western (como en el Ejemplo 15) al migrar a un peso molecular predicho de \sim23,7 KD.

Este vector pHis-ATG (InVitrogen, Carlsbad, CA) se digirió con EcoRV e XbaI. El vector se recuperó y el fragmento restricción de 1650 pb se ligó en un pHis-ATG linearizado. El producto ligado se clonó y amplificó. Este vector de expresión pHis-ATG-LMP-1s, también denominado pHIS-A con el inserto HLMP-1s, se purificó mediante procedimientos estándares.

Ejemplo 24 Inducción de la formación de nódulos óseos y mineralización in vitro con el vector de expresión LMP

Las células calváricas de rata se aislaron y crecieron en un cultivo secundario de acuerdo con el Ejemplo 1. Los cultivos fueron estimulados o no con glucocorticoides (GC) tal como se describe en el Ejemplo 1. Una modificación del protocolo de transfección del Reactivo Superfect (Qiagen, Valencia, CA) se utilizó para transfectar 3 g/pocillo de cada vector en cultivos secundarios de osteoblastos calváricos de rata según el Ejemplo 25.

Los nódulos mineralizados se visualizaron mediante tinción de von Kossa, tal como se describe en el Ejemplo 3. La sobreexpresión del producto del gen LMP-1s humano solo indujo la formación del nódulo óseo (\sim203 nódulos/pocillo) in vitro. Los niveles de los nódulos fueron aproximadamente del 50% de los inducidos por el control positivo (\sim412 nódulos/pocillo). Otros controles positivos incluyeron el vector de expresión de pHisA-LMP-Rata (\sim206 nódulos/pocillo), mientras que los controles negativos incluyeron el pCMV2/LMP-Rata-Rev. El vector de expresión (\simnódulos/pocillo) y las placas no tratadas (NT) (\sim4 nódulos/pocillo). Estos resultados demuestran que el cDNA humano fue por lo menos tan osteoinductivo como el cDNA de rata. El efecto fue inferior al observado con la estimulación por GC, más probablemente debida a dosis subóptimas del vector de expresión.

Ejemplo 25 Diferenciación celular inducida por LMP in vitro e in vivo

El cDNA de LMP en el clon 10-4 (véase el Ejemplo 12) se separó del vector mediante doble digestión del clon con NotI y ApaI durante la noche a 37ºC. El vector pCMV2 MCS (InVitrogen, Carlsbad, CA) se digirió con las mismas enzimas de restricción. Tanto el fragmento del cDNA linear del clon 10-4 como el pCMV2 se purificaron por gel, se extrajeron y ligaron con T4 ligasa. El DNA ligado se purificó por gel, se extrajo y se utilizó para transformar las células E.coli JM109 para su amplificación. Las colonias en agar positivas se picaron, digirieron con NotI y ApaI y las digestiones por restricción se examinaron por electroforesis en gel. Los cultivos madre se prepararon a partir de los clones positivos.

Se preparó un vector inverso de forma análoga excepto que las enzimas de restricción utilizadas fueron XbaI e HindIII. Debido a la utilización de las mencionadas enzimas de restricción, el fragmento del cDNA de LMP del clon 10-4 se insertó en pRc/CMV2 en la orientación inversa (es decir, la notraducida). El vector recombinante producido se denominó pCMV2/RLMP.

Un volumen adecuado de pCMV10-4 (concentración final 60 nM es la óptima [3 g]; para este experimento es preferible utilizar un intervalo de concentración final de 0-600 nM/pocillo [0-30 g/pocillo]) se resuspendió en medio de Eagle Mínimo (MEM) hasta 450 \mul de volumen final y se agitó durante 10 segundo. Se añadió el Superfect (7,5 \mul/ml de solución final), la solución se mezcló con ayuda de un vórtex durante 10 s y luego se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esta incubación, se añadió MEM suplementado con FBS al 10% (1 ml/pocillo; 6 ml/placa) y se mezcló por pipeteo.

La solución resultante se pipeteó rápidamente (1 ml/pocillo) en los cultivos ROB lavados. Los cultivos se incubaron durante 2 h a 37ºC en una atmósfera de humedad con 5% de CO2. A continuación, las células se lavaron con cuidado una vez PBS estéril y se añadió el medio de incubación adecuado.

Los resultados demostraron una formación de nódulos óseos significativa en todos los cultivos celulares de rata que se indujeron con pCMV10-4. Por ejemplo, células transfectadas con pCMV10-4 produjeron 429 nódulos/pocillo. Los cultivos control positivos, que fueron expuestos a Trm, produjeron 460 nódulos/pocillo. Por el contrario, los controles negativos, que no recibieron tratamiento, produjeron 1 nódulo/pocillo. De forma similar, cuando se transfectaron los cultivos con pCMV10-4 (inverso), no se observaron nódulos.

Para demostrar la formación de novo de hueso in vivo, se aspiró médula ósea de las patas traseras de ratas normales de 4-5 semanas (mu/+; heterocigotas para la condición atímica recesiva). Las células de la médula ósea aspiradas se lavaron con MEM alfa, se centrifugaron, y se lisaron los RBCs mediante resuspensión del sedimento en NH_{4}CL al 0,83% en Tris 10 mM (pH 7,4). Las células de la médula ósea restantes se lavaron 3x con MEM y se transfectaron durante 2 horas con 9 g de pCMV-LMP-1s (orientación directa e inversa) para 3x10^{8} células. Las células transfectadas se lavaron a continuación 2X con MEM y se resuspendieron a una concentración de 3x10^{7} células/ml.

La suspensión celular (100 \mul) se aplicó mediante una pipeta estéril a un disco de colágeno bovino de tipo I de 2x5 mm estéril (Sulzer Orthopaedics, Wheat Ridge, CO). Los discos se implantaron quirúrgicamente en el cráneo, pecho, abdomen o columna dorsal de las ratas atímicas de 4-5 semanas de edad (mu/mu). Los animales se sacrificaron a las 3-4 semanas, y se extrajeron los discos o áreas quirúrgicas y se fijaron en etanol al 70%. Los especímenes se analizaron por radiografía y se realizó un examen histológico sin descalcificación en secciones de 5 \mum de grosor y se tiñeron con tricrómico de Goldner. Los experimentos también se realizaron utilizando matriz ósea desmineralizada (extraída con guanidinio) (Osteotech, Shrewsbury, NJ) en lugar de discos de colágeno.

La radiografía demostró un elevado nivel de formación ósea mineralizada que se ajustó a la forma del disco de colágeno original que contenía las células de médula ósea transformadas con LMP-1s. La formación de hueso mineralizado se observó en el control negativo (células transfectadas con una versión inversamente orientada del cDNA de LMP-1s que no codifica para proteína traducida), y la absorción del vehículo parece estar bien avanzada.

El análisis histológico demostró trabéculas óseas nuevas alineadas con osteoblastos en los implantes transfectados con LMP-1. No se observó hueso junto con la resorción del vehículo en los controles negativos.

La radiografía de un experimento posterior en el que 18 grupos (9 controles negativos pCMV-LMP-REV & 9 experimentos con pCMV-LMP-1s) de implantes se añadieron a sitios alternativamente entre la médula lumbar y la torácica en las ratas atímicas demostraron que 0/9 implantes controles negativos presentaron formación ósea (fusión medular) entre los vertebrados. Los 9 implantes tratados con pCMV-LMP-1s presentaron fusiones óseas sólidas entre los vertebrados.

Ejemplo 26 La síntesis del vector de expresión pHIS-5' ATG LMP-1s a partir de las secuencias expuestas en los Ejemplos 2 y 3

El clon de 717 pb (Ejemplo 17) se digirió con ClaI y EcoRV (New England Biologicals, city, MA). Se purificó un fragmento pequeño (\sim250 pb). El clon 7 (Ejemplo 18) se digirió con ClaI e XbaI. Un fragmento de 1400 pb se purificó en gel a partir del producto de digestión. Los fragmentos del cDNA aislados de 250 pb y 1400 pb se ligaron mediante procedimientos estándares para formar un fragmento de \sim1650 pb. El vector pHis-A (InVitrogen) se digirió con EcoRV e XbaI. El vector linearizado se recuperó y ligó al fragmento de cDNA quimérico de 1650 pb. El producto ligado se clonó y amplificó mediante procedimientos estándares y el vector de expresión pHis-A-5' ATG LMP-1s, también denominado vector pHis-A con el inserto HLMP-1s, se depositó en el ATCC tal como se describió anteriormente.

Ejemplo 27 La inducción de formación de nódulo óseo y la mineralización in vitro con el vector de expresión pHis-5' ATG LMP-1s

Se aislaron células calváricas de rata y se crecieron en cultivos secundarios de acuerdo con el Ejemplo 1. Los cultivos se estimularon o no con glucocorticoidees (GC) según el Ejemplo 1. Los cultivos se transfectaron con 3 g del DNA del vector pHis-A/pocillo tal como se describe en el Ejemplo 25. Los nódulos mineralizados se visualizaron por la tinción de Von Kossa según el Ejemplo 3.

La sobreexpresión del producto del gen LMP-1s humano sola (es decir, sin estimulación GC) indujo una formación de nódulos óseos significativa (\sim203 nódulos/pocillo) in vitro. Ello es aproximadamente el 50% de la cantidad de nódulos producidos por las células expuestas a los controles positivos GC (\sim412 nódulos/pocillo). Se obtuvieron resultados similares con cultivos transfectados con vector de expresión pHisA-LMP-Rata (\sim152 nódulos/pocillo) y pCMV2/LMP-Rata-Directo (\sim206 nódulos/pocillo). Por el contrario, el control negativo pCMV2/LMP-Rata-Inverso rindió (\sim2nódulos/pocillo), mientras que aproximadamente se observaron 4 nódulos/pocillo en las placas no tratadas. Estos resultados demuestran que el cDNA de LMP-1 humano fue por lo menos tan osteoinductivo que el cDNA de LMP-1 de rata en este sistema modelo. El efecto en este experimento fue menor que en el observado con estimulación GC; pero en cierto modo el efecto fue comparable.

Ejemplo 28 LMP induce la secreción de un factor osteoinductivo soluble

La sobreexpresión de RLMP-1 o HLMP-1s en los cultivos de osteoblastos calváricos según se describió en el Ejemplo 24 dio como resultado una formación de nódulos significativamente superior que la observada en el control negativo. Para estudiar el mecanismo de acción de la proteína de mineralización LIM, el medio condicionado se recogió a diferentes tiempos, se concentró 10x, se filtró estérilmente y se diluyó a su concentración original en medio que contenía suero fresco y se aplicó durante 4 días a las células transfectadas.

Medio condicionado recogido de células transfectadas con RMLP-1 o HLMP-1s el día 4 fue aproximadamente tan efectivo para la inducción de la formación de nódulos que la sobreexpresión directa de RLMP-1 en células transfectadas. El medio condicionado de células transfectadas con RLMP-1 o HLMP-1 en la orientación inversa no tuvo un efecto aparente en la formación de nódulos. Tampoco el medio condicionado recogido de cultivos transfectados con LMP-1 antes del día 4 indujo la formación de nódulos. Estos resultados sugieren que la expresión de LMP-1 causó la síntesis y/o la secreción de un factor soluble, que no aparece en el medio de cultivo en cantidades efectivas hasta el día 4 después de la transfección.

Ya que la sobreexpresión de rLMP-1 dió como resultado la secreción de un factor osteoinductivo en el medio, el análisis por transferencia de western se utilizó para determinar si la proteína LMP-1 estaba presente en el medio. La presencia de la proteína rLMP-1 se confirmó con un anticuerpo específico para LMP-1 (QDPDEE) y se detectó mediante medios convencionales. La proteína LMP-1 se halló únicamente en la capa celular del cultivo y no se detectó en el medio.

La purificación del factor soluble osteoinductivo se logró mediante reducción con 25% y 100% de sulfato amónico seguido de una cromatografía de intercambio aniónico DE-52 (NaCl 100 mM o 500 mM). Toda la actividad se observó en las fracciones con elevada concentración de sulfato amónico y NaCl. Dicha localización es consistente con la posibilidad de que un único factor sea responsable del acondicionamiento del medio.

Ejemplo 29 Terapia génica en la fusión de columna lumbar mediada por adenovirus a dosis bajas

Este estudio evidencia la dosis óptima de liberación adenoviral del cDNA de LMP-1 (SEC ID NO:2) para promover la fusión de la columna vertebral en conejos normales, es decir en conejos inmunocompetentes.

Se construyó un adenovirus humano deficiente en la replicación con el cDNA de LMP-1 (SEQ ID NO:2) dirigido por un promotor de CMV utilizando el equipo Adeno-Quest^{TM} (Quantum Biotechnologies, Inc., Montreal). Un adenovirus recombinante disponible comercialmente (Quantum Biotechnologies, Inc., Montreal) que contiene el gen de la beta-galactosidasa se utilizó como control.

Inicialmente, se realizó un experimento de dosis-respuesta in vitro para determinar la concentración óptima del LMP-1 liberado por el adenovirus ("Adv-LMP-1") para inducir la diferenciación del hueso en los cultivos de osteoblastos calváricos utilizando una transducción de 60 minutos con una multiplicidad de infección ("MOI") de 0,025, 0,25, 2,5 o 25 unidades formadoras de calvas (ufc) de virus por célula. Los cultivos controles positivos se diferenciaron por una exposición de 7 días a glucorticoides 10^{9}M ("GC").

Los cultivos controles negativos no se trataron. El día 14, el número de nódulos de hueso mineralizado se contó mediante tinción de von Kossa de los cultivos, y se cuantificó el nivel de osteocalcina secretada en el medio (pmol/ml) mediante radioinmunoensayo (media\pmSEM).

Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla I. Esencialmente, no se formaron nódulos espontáneamente en los cultivos controles negativos no tratados. Los resultados muestran que una MOI igual a 0,25 ufc/célula es más eficaz para la osteoinducción de nódulos óseos, logrando un nivel comparable a los controles positivos (GC).

Dosis inferiores y superiores de adenovirus fueron menos eficaces.

TABLA I

2

Los experimentos in vivo se realizaron para determinar si la dosis in vitro óptima era capaz de promover el proceso intertransverso de las fusiones medulares en los conejos blancos New Zealand con un esqueleto maduro. Nueve conejos se anestesiaron y se aspiraron 3 cc de médula ósea del fémur distal a través de un corte intercondilar con una aguja de calibre 18. La capa leucocitaria se aisló, se realizó una transducción de 10 min con AdV-LMP-1 y las células se devolvieron al quirófano para su reimplantación. Se realizó una artrodesis de la columna lumbar posterolateral a un sólo nivel con decorticación de procesos transversos e inserción de vehículo (matriz ósea desvitalizada de conejo o esponja de colágeno) que contiene 8-15 millones de células de capa leucocitaria nucleadas autólogas transducidas con AdV-LMP-1 (MOI=0,4) o AdV-BGal (MOI=0,4). Se practicó la eutanasia al cabo de 5 semanas y se valoraron las fusiones de columna mediante exploración manual, rayos X, escáner CT e histología sin descalcificar.

Los sitios de fusión de la columna que recibieron AdV-LMP-1 indujeron masas de fusión de columna continuas y sólidas en todos los conejos. Por el contrario, los sitios que recibieron AdV-BGal o una dosis inferior de AdV-LMP-1 (MOI=0,04) no produjeron o muy poco hueso y dieron como resultado una fusión de columna a una tasa comparable a la del vehículo solo (<40%). Estos resultados fueron consistentes con los evaluados por exploración manual, escáner CT e histología. Las radiografías totales, sin embargo, a veces sobreestiman la cantidad de hueso que estaba presente, especialmente en los sitios control. La liberación de cDNA de LMP-1 y la inducción de hueso fue satisfactoria con ambos materiales de vehículo analizados. No hubo evidencias de respuesta inmune sistémica o local al vector adenovirus.

Estos resultados demuestran la inducción de hueso consistente en un modelo de fusión de columna de conejo validado anteriormente, lo cual es bastante alentador. Además, el protocolo de utilización de células de médula ósea autógenas con transducción génica intraoperativa ex vivo (10 minutos) es un procedimiento clínicamente más factible que otros procedimientos ya que requiere la transducción durante toda la noche o la expansión celular durante semanas en cultivo. Además, la dosis más eficaz de adenovirus recombinantes (MOI=0,25) fue esencialmente inferior a la dosis descritas en otras aplicaciones de terapia génica (MOI=40-500). Se cree que ello es debido a que el hecho de que LMP-1 sea una molécula de señalización intracelular y puede provocar cascadas de amplificación de señal potentes. Además, la observación de que la misma concentración de AdV-LMP-1 que indujo hueso en el cultivo celular fue eficaz in vivo también fue sorprendente dado el aumento requerido en dosis de otros factores de crecimiento cuando se traslada del cultivo celular a los experimentos con animales. Teniendo en cuenta estas observaciones, ello es indicativo de que la terapia génica con adenovirus para liberar el cDNA de LMP-1 es posible y la dosis baja requerida minimizará probablemente los efectos negativos de la respuesta inmune hacia el vector de adenovirus.

Ejemplo 30 Utilización de células nucleadas de sangre periférica (capa leucocitaria) para la terapia génica con el cDNA de LMP-1 para generar hueso

En cuatro conejos se realizó una cirugía de fusión de columna vertebral como antes (Ejemplo 29) excepto que las células transducidas fueron las de la capa leucocitaria de sangre venosa en lugar de médula ósea. Estas células se transfectaron con Adeno-LMP o el plásmido pHIS-LMP con resultados satisfactorios equivalentes a los obtenidos con células de médula ósea. El descubrimiento de utilizar células de sangre venosa para la liberación génica favorece que la terapia génica sea más accesible clínicamente ya que evita la obtención dolorosa de médula con anestesia general y proporciona rendimientos dos veces más células por ml de material de partida.

Ejemplo 31 Aislamiento de variantes de ayuste de LMP-1 humana

Las variantes de ayuste intrón/exón de transcritos de mRNA son un mecanismo regulador relativamente común en la transducción de señal y el desarrollo celular/tisular. Las variantes de ayuste de varios genes han demostrado que alteran las interacciones proteína-proteína, proteína-DNA, proteína-RNA y proteína-sustrato. Las variantes de ayuste pueden también controlar la especificidad tisular para la expresión génica, lo que permite la expresión de formas diferentes (y en consecuencia de funciones) en tejidos diversos. Las variantes de ayuste son un fenómeno regulador común en las células. Es posible que las variantes de ayuste puedan resultar en efectos en otros tejidos como la regeneración nerviosa, la regeneración muscular, o el desarrollo de otros tejidos.

Para cribar una librería de cDNA de corazón humano por sus variantes de ayuste de la secuencia HLMP-1, se prepararon dos cebadores de PCR correspondientes con las secciones de la SEC ID NO:22. El cebador de PCR directo, que se sintetizó utilizando técnicas estándares, corresponde a los nucleótidos 35-54 de la SEC ID:22. Tiene la secuencia siguiente:

5'-GAGCCGGCATCATGGATTCC-3' \hskip5.05cm (SEC ID NO:35)

El cebador de PCR inverso, que es complementario inverso de los nucleótidos 820-839 en la SEC ID NO:22, tiene la secuencia siguiente:

5'-GCTGCCTGCACAATGGAGGT-3' \hskip5cm (SEC ID NO:36)

Los cebadores directo e inverso se utilizaron para cribar el cDNA de corazón humano (ClonTech, CAt. NO. 7404-1) para las secuencias similares a HLMP-1 mediante técnicas estándares, utilizando un protocolo de ciclos de 94ºC, 30s; 64ºC, 30 s; y 72ºC, 1 min, repetido 30 veces y seguido de una incubación durante 1 minuto a 72ºC. La amplificación de secuencias de cDNA se purificó en gel y se sometieron a un proceso de Emory DNA Sequence Core Facility para secuenciación. Los clones se secuenciaron mediante técnicas estándares y las secuencias se examinaron con PCGENE (Intelligenetics; Programs SEQUIN y ALIGN) para determinar la homología para la SEQ IDD NO:22. Dos secuencias de nucleótidos homólogas con sitios probables de ayuste alternativo se compararon con la SEQ ID NO:22 y luego se tradujeron a sus productos de proteínas respectivos con el programa de Intelligenetics TRANSL.

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(Secuencia pasa a página siguiente)

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Una de estas 2 secuencias de cDNA humano (SEQ ID NO:37) comprende 1456 pb:

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3

4

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(Secuencia pasa a página siguiente)

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Desplazamientos de lectura causados por la deleción de un fragmento de 119 pb (entre *) y la adición de un fragmento de 17 pb (subrayado) dio como resultado un producto del gen truncado que tiene la secuencia aminoacídica siguiente:

5

Esta proteína de 423 aminoácidos presenta un 100% de homología con la proteína que se muestra en la SEC ID NO:10, excepto para la secuencia en el área realzada (aminoácidos 94-99), que corresponde con los cambios nucleotídicos indicados anteriormente.

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(Secuencia pasa a página siguiente)

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La segunda secuencia de cDNA de corazón humano nueva (SEC ID NO:39) comprende 1575 pb:

6

7

Los desplazamientos en la pauta de lectura causados por la adición de un fragmento de 17 pb (en negrita, cursiva y subrayado) dan como resultado un codón de parada de la traducción temprano en la posición 565-567 (subrayado).

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La secuencia aminoacídica derivada (SEC ID NO:40) consiste en 153 aminoácidos:

8

Esta proteína presente un 100% de homología con la SEC ID NO:10 hasta el aminoácido 94, en donde la adición del fragmento de 17 pb indicado en la secuencia nucleotídica da como resultado un desplazamiento de la pauta de lectura. En los aminoácidos 94-153, la proteína no es homóloga a la SEC ID NO:10. Los aminoácidos 154-457 en la SEC ID NO:10 no está presentes debido a la aparición de un codón de parada temprano en la secuencia nucleotídica.

Ejemplo 32 Secuencia nucleotídica de HLMP-1 genómica

Los solicitantes han identificado la secuencia de DNA genómica que codifica HLMP-1, incluyendo los elementos reguladores putativos asociados con la expresión de HLMP-1. La secuencia genómica completa se muestra en la SEC ID NO:41. Esta secuencia se derivó de ACO23788 (clon RP11-564G9), Genome Sequencing Center, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO.

La región promotora putativa para HLMP-1 abarca desde el nucleótido 2.600 al 8.733 en la SEC ID NO:41. Esta región comprende, entre otras cosas, al menos diez elementos de respuesta a glucocorticoides potenciales ("GREs") (nucléotidos 6148-6153, 6226-6231, 6247-6252, 6336-6341, 6510-6515, 6552-6557, 6727-6732, 6752-6757, 7738-7743 y 8255-8260), doce sitios de elementos de unión potenciales Sma-2 homólogos a Mothers contra Drosophila decapentaplegic ("SMAD") (nucleótidos 3569-3575, 4552-4558, 4582-4588, 5226-5232, 6228-6234, 6649-6655, 6725-6731, 6930-6936, 7379-7384, 7738-7742, 8073-8079 y 8378-8384), y tres cajas TATA (nucleótidos 5910-5913, 6932-6935 y 7380-7383). Las tres cajas TATA, todas las GREs y 8 elementos de unión SMAD ("SBEs") se agruparon en la región que se expande por los nucleótidos 5.841-8.733 en SEC ID NO:41. Estos elementos reguladores pueden utilizarse, por ejemplo, para regular la expresión de secuencias nucleotídicas exógenas que codifican proteínas implicadas en el proceso de formación de hueso. Ello permitirá la administración sistémica de factores terapéuticos o de genes relacionados con la formación y la reparación de hueso, así como factores o genes asociados con la diferenciación tisular y el desarrollo.

Además de los elementos reguladores putativos, se han identificado 13 exones correspondientes con la secuencia nucleotídica que codifica HLMP-1. Estos exones se expanden por los nucleótidos siguientes en la SEC ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

Exón 1: 8733-8767

Exón 2: 9790-9895

Exón 3: 13635-13787

Exón 4: 13877-13907

Exón 5: 14387-14502

Exón 6: 15161-15297

Exón 7: 15401-15437

Exón 8: 16483-16545

Exón 9: 16689-16923

Exón 10: 18068-18248

Exón 11: 22117-22240

Exón 12: 22323-22440

Exón 13: 22575-22911

\vskip1.000000\baselineskip

En HMLP-2 existe otro exón (Exon 5A), que comprende los nucleótidos 14887-14904.

\global\parskip1.000000\baselineskip

9

11

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Boden M.D., Scott D

\hskip1,05cmHair Ph.D., Gregory A

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Variantes de ayuste de proteína de mineralización LIM

\vskip0.400000\baselineskip

<130> variante de ayuste LMP

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 6248.0222-00304

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2000-04-28

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/132.021

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-04-30

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 457

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1696

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagctttttt tttttg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcttggct atg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 717

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1488

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1644

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 457

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccagggttt tcccagtcac ga

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccagggttt tcccagtcac ga

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttagcaga gcccagcctg ct

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatgaactc tgtgcccgtg ag

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atccttgctc acctcacggg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcactgtgct ggttttgtct gg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catggattcc ttcaaggtag tgc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttgtctg gggcagagcg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: adaptador para las reacciones de Marathon Race

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaatatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<219> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR específico para el adaptador de Marathon RACE

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatcctaat acgactcact atagggc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 765

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1689

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcactgtgct cgttttgtcc gg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccttgctca cctcacgggc a

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctcatccg ggtcttgcat gaactcggtg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccccgcc gctgacgcg ccccgcaa

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccttgctca cctcacgggc accg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaatacgac tcactatagg gc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggctgatg gagaatactg aag

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcttgtggc actggtggca tac

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Tgtgtcgggt cagcactgtg ct

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1620

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1665

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

29

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<210> 35

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 35

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gagccggcat catggattcc

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<210> 36

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 36

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gctgcctgca caatggaggt

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<210> 37

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<211> 1456

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 37

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30

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<210> 38

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<211> 423

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 38

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31

32

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<210> 39

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<211> 1575

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 39

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33

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<210> 40

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<211> 153

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 40

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34

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<210> 41

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<211> 24740

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 41

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35

36

37

38

39

40

41

42

43

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<210> 42

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Ratus norvegicus

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<400> 42

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gcactacctt gaaggaatcc atggt

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Claims (41)

1. Molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:37 o la SEC ID NO:39.

2. Proteína de mineralización LIM humana aislada codificada por la SEC ID NO:37 o la SEC ID NO:39.

3. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1.

4. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 3.

5. Célula huésped según la reivindicación 4, en donde la célula huésped se selecciona a partir del grupo consistente en células procariotas, células de levadura y células de mamífero.

6. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, que además comprende un marcaje.

7. Proteína de mineralización LIM humana que comprende una secuencia de aminoacídica seleccionada de entre el grupo consistente en la SEC ID NO:38 y la SEC ID NO:40.

8. Anticuerpo monoclonal específico para HLMP-2 (SEC ID NO:38) o HLMP-3 (SEC ID NO:40).

9. Utilización de una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:39, o las células precursoras osteogénicas o los leucocitos de sangre periférica transfectados con el mencionado ácido nucleico para la preparación de un medicamento para inducir la formación de hueso.

10. Utilización según la reivindicación 9, en donde la molécula de ácido nucleico se halla en un vector.

11. Utilización según la reivindicación 10, en donde el vector es un vector de expresión.

12. Utilización según la reivindicación 11, en donde el vector es un plásmido.

13. Utilización según la reivindicación 11, en donde el vector es un virus.

14. Utilización según la reivindicación 13, en donde el virus es un adenovirus.

15. Utilización según la reivindicación 13, en donde el virus es un retrovirus.

16. Utilización según la reivindicación 9, en donde la célula precursora osteogénica o los leucocitos de sangre periférica se transfectan ex vivo.

17. Utilización según la reivindicación 9, en donde las células precursoras osteogénicas se transfectan in vivo mediante inyección directa de la molécula de ácido nucleico aislada.

18. Utilización según la reivindicación 9, en donde la proteína de mineralización LIM es HLMP3 (SEC ID NO:40).

19. Utilización de una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la SEC ID NO:39, o las células precursoras osteogénicas o los leucocitos de sangre periférica transfectados con el mencionado ácido nucleico para la preparación de un medicamento para la fusión de columna vertebral, en donde,

(a)

las células precursoras osteogénicas transfectadas o los leucocitos de sangre periférica se mezclan con una matriz; y

(b)

la matriz se pone en contacto con la columna vertebral,

y en donde la expresión de la secuencia nucleotídica provoca la formación de hueso mineralizado en la matriz.

20. Utilización según la reivindicación 19, en donde las células precursoras osteogénicas o las células de sangre periférica se transfectan ex vivo.

21. Utilización de un vector que comprende la SEC ID NO:39 unida operativamente a un promotor regulable, o células precursoras osteogénicas o leucocitos de sangre periférica transfectados con el mencionado vector para la preparación de un medicamento para la inducción de la formación de hueso in vivo en un huésped mamífero, en donde,

(a) el vector se mantiene establemente en las células precursoras osteogénicas o en los leucocitos de sangre periférica, en donde el promotor regulable responde a un compuesto control exógeno; y

(b) se administra al huésped, según se necesite, una cantidad de una sustancia control exógena efectiva para causar la expresión de la SEC ID NO:39.

22. Procedimiento de preparación de células precursoras osteogénicas o de leucocitos de sangre periférica, que comprende las etapas de transfección ex vivo de células precursoras osteogénicas o de leucocitos de sangre periférica con una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:39.

23. Utilización de una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la SEC ID NO:39, o las células precursoras osteogénicas o los leucocitos de sangre periférica transfectados con el mencionado ácido nucleico para preparar un medicamento para estimular la producción de una proteína soluble osteogénica por una célula osteogénica, en donde la molécula de ácido nucleico aislada se sobreexpresa en las células precursoras o en los leucocitos de sangre periférica.

24. Utilización de una proteína soluble osteogénica, obtenida por aislamiento a partir de células osteogénicas inducidas por la sobreexpresión de una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:39 en las células precursoras osteogénicas, o en leucocitos de sangre periférica para la preparación de un medicamento para inducir la formación de hueso.

25. Utilización de una molécula antisentido dirigida contra HLMP-2 o HLMP-3, o contra una célula que exprese HLMP-2 o HLMP-3 y que se transfecta con dicha molécula antisentido, en la preparación de un medicamento para inhibir la expresión de HLMP-2 o HLMP-3.

26. Utilización según la reivindicación 17, en donde la molécula de ácido nucleico aislada se halla en un vector seleccionado del grupo que consiste en un plásmido y un virus.

27. Utilización según la reivindicación 26, en donde el vector es un plásmido, el cual se inyecta directamente en el tejido muscular.

28. Utilización de una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la SEC ID NO:37, o las células precursoras osteogénicas, o los leucocitos de sangre periférica transfectados con el mencionado ácido nucleico para preparar un medicamento para inhibir la formación de hueso.

29. Utilización según la reivindicación 28, en donde la molécula de ácido nucleico aislada es un vector.

30. Utilización según la reivindicación 29, en donde el vector es un vector de expresión.

31. Utilización según la reivindicación 30, en donde el vector es un plásmido.

32. Utilización según la reivindicación 30, en donde el vector es un virus.

33. Utilización según la reivindicación 32, en donde el virus es un adenovirus.

34. Utilización según la reivindicación 32, en donde el virus es un retrovirus.

35. Utilización según la reivindicación 28, en donde las células precursoras osteogénicas o los leucocitos de sangre periférica se transfectan ex vivo.

36. Utilización según la reivindicación 28, en donde las células precursoras osteogénicas se transfectan in vivo mediante inyección directa de la molécula de ácido nucleico.

37. Utilización según la reivindicación 28, en donde la proteína de mineralización LIM es la HLMP-2 (SEC ID NO:38).

38. Utilización de una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:39, o las células precursoras osteogénicas o los leucocitos de sangre periférica transfectados con el mencionado ácido nucleico para la preparación de un medicamento para tratar las fracturas de huesos largos, los defectos óseos, la osteoporosis de cadera, de vértebras o de muñecas.

39. Utilización de una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:39, o las células precursoras osteogénicas o los leucocitos de sangre periférica transfectados con el mencionado ácido nucleico para la preparación de un medicamento para facilitar la reconstrucción tumoral o la fusión de columna vertebral.

40. Utilización de una molécula antisentido dirigida contra HLMP-2 o HLMP-3, o contra una célula que exprese HLMP-2 o HLMP-3 y que se transfecta con la mencionada molécula antisentido para la preparación de un medicamento para tratar las fracturas de huesos largos, los defectos óseos, la osteoporosis de cadera, de vértebras, o de muñecas.

41. Utilización de una molécula antisentido dirigida contra HLMP-2 o HLMP-3, o contra una célula que exprese HLMP-2 o HLMP-3 y que se transfecta con la mencionada molécula antisentido para la preparación de un medicamento para facilitar la reconstrucción tumoral o la fusión de columna vertebral.