ES2320603T3 - Sistemas de expresion, vectores, adn, proteinas de mineralizacion osea novedosos. - Google Patents
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Abstract
Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de mineralización LIM humana que contiene un dominio LIM y potencia la osificación, hibridándose la molécula de ácido nucleico en condiciones de hibridación convencionales con una molécula de ácido nucleico complementaria a la longitud completa de la SEQ. ID NO: 26.
Description
Sistemas de expresión, vectores, ADN, proteínas
de mineralización ósea novedosos.
El campo de la invención se refiere en general a
células osteogénicas y a la formación de hueso y tejido óseo en
especies de mamífero. Específicamente, la invención se refiere a una
familia novedosa de proteínas, y a ácidos nucleicos que codifican
para esas proteínas, que potencia la eficacia de la mineralización
ósea in vitro e in vivo. La invención proporciona
métodos para tratar una variedad de estados patológicos asociados
con el hueso y el tejido óseo, tales como, por ejemplo, artrodesis
vertebral, reparación de fracturas y osteoporosis.
Se cree que los osteoblastos se diferencian a
partir de células madre mesenquimatosas pluripotentes. La maduración
de un osteoblasto da como resultado la secreción de una matriz
extracelular que puede mineralizarse y formar hueso. La regulación
de este proceso complejo no se comprende bien, pero se cree que
implica un grupo de glicoproteínas de señalización conocidas como
proteínas morfogenéticas óseas (BMP). Se ha demostrado que estas
proteínas están implicadas en la formación del patrón dorsoventral,
desarrollo del blastema de una extremidad y reparación de fracturas
en animales adultos. B. L. Hogan, Genes & Develop., 10:1580
(1996). Este grupo de proteínas secretadas por la superfamilia del
factor de crecimiento transformante beta tiene un espectro de
actividades en una variedad de tipos celulares en diferentes fases
de diferenciación; las diferencias en la actividad fisiológica entre
estas moléculas estrechamente relacionadas no se han aclarado. D.
M. Kingsley, Trends Genet., 10:16 (1994).
Para discernir mejor el papel fisiológico único
de diferentes proteínas de señalización BMP, se comparó
recientemente la potencia de BMP-6 con la de
BMP-2 y BMP-4, para inducir la
diferenciación de osteoblastos calváricos de rata. Boden et
al., Endocrinology, 137:3401 (1996). Se estudió este proceso en
cultivos de primer pase (secundarios) de calvarias de rata fetal
que requieren BMP o glucocorticoide para la iniciación de la
diferenciación. En este modelo de osificación membranosa, el
glucocorticoide (GC) o una BMP iniciará la diferenciación para dar
nódulos óseos mineralizados que pueden secretar osteocalcina, la
proteína específica de los osteoblastos. Este sistema de cultivo
secundario es distinto de los cultivos de osteoblastos de rata
primarios que experimentan diferenciación espontánea. En este
sistema secundario, el glucocorticoide dio como resultado una
inducción de diez veces de la expresión de proteína y ARNm de
BMP-6 que era responsable de la potenciación de la
diferenciación de osteoblastos. Boden et al., Endocrinology,
138: 2920 (1997).
Además de las señales extracelulares, tales como
las BMP, las moléculas reguladoras o señales intracelulares pueden
desempeñar también un papel en la cascada de acontecimientos que
conduce a la formación de hueso nuevo. Una amplia clase de
moléculas reguladoras intracelulares son las proteínas LIM, que se
denominan así debido a que presentan un motivo estructural
característico conocido como el dominio LIM. El dominio LIM es un
motivo estructural rico en cisteína compuesto por dos dedos de zinc
especiales que están unidos mediante un espaciador de 2
aminoácidos. Algunas proteínas tienen solamente dominios LIM,
mientras que otras contienen una variedad de dominios funcionales
adicionales. Las proteínas LIM forman un grupo diverso, que incluye
factores de transcripción y proteínas citoesqueléticas. El papel
principal de los dominios LIM parece ser en la mediación de
interacciones proteína-proteína, a través de la
formación de dímeros con dominios LIM idénticos o diferentes, o
mediante la unión de proteínas distintas.
En proteínas de homeodominio LIM, es decir,
proteínas que tienen tanto dominios LIM como una secuencia de
homeodominio, los dominios LIM funcionan como elementos reguladores
negativos. Las proteínas de homeodominio LIM están implicadas en el
control de la determinación del linaje celular y la regulación de la
diferenciación, aunque las proteínas de sólo LIM pueden desempeñar
papeles similares. Las proteínas de sólo LIM están implicadas
también en el control de la proliferación celular puesto que varios
genes que codifican para tales proteínas están asociados a
translocaciones cromosómicas oncogénicas.
Los seres humanos y otras especies de mamífero
son propensos a enfermedades o lesiones que requieren los procesos
de reparación y/o regeneración ósea. Por ejemplo, el tratamiento de
fracturas se mejoraría mediante nuevos regímenes de tratamiento que
pudieran estimular los mecanismos naturales de reparación ósea,
reduciendo de ese modo el tiempo requerido para que se consolide el
hueso fracturado. En otro ejemplo, los individuos afectados de
trastornos óseos sistémicos, tales como osteoporosis, se
beneficiarían de regímenes de tratamiento que dieran como resultado
la formación sistémica de hueso nuevo. Tales regímenes de
tratamiento reducirían la incidencia de fracturas que surgen de la
pérdida de masa ósea que es característica de esta enfermedad.
Al menos por estos motivos, se han investigado
factores extracelulares, tales como las BMP, con el fin de usarlas
para estimular la formación de hueso nuevo in vivo. A pesar
de los éxitos tempranos conseguidos con las BMP y otras moléculas
de señalización extracelulares, su uso conlleva varias desventajas.
Por ejemplo, se requieren dosis relativamente grandes de BMP
purificadas para potenciar la producción de hueso nuevo, aumentando
de ese modo el gasto de tales métodos de tratamiento. Además, las
proteínas extracelulares son susceptibles de degradación tras su
introducción en un animal huésped. Además, debido a que normalmente
son inmunogénicas, la posibilidad de estimular una respuesta
inmunitaria frente a las proteínas administradas está siempre
presente.
Debido a tales preocupaciones, sería deseable
tener regímenes de tratamiento disponibles que usen una molécula de
señalización intracelular para inducir la formación de hueso nuevo.
Los avances en el campo de la terapia génica hacen ahora posible
introducir en células precursoras osteogénicas, es decir, células
implicadas en la osificación, fragmentos de nucleótidos que
codifican para señales intracelulares que forman parte del proceso
de osificación. La terapia génica para la osificación ofrece varias
ventajas potenciales: (1) menores costes de producción; (2) mayor
eficacia, en comparación con los regímenes de tratamiento
extracelular, debido a la capacidad para conseguir una expresión
prolongada de la señal intracelular; (3) evitaría la posibilidad de
que el tratamiento con señales extracelulares pudiera verse
dificultado debido a la presencia de números limitantes de
receptores para esas señales; (4) permite la inserción de células
osteoprogenitoras potenciales transfectadas directamente en el
sitio en el que se requiere la osificación localizada; y (5)
permitiría la osificación sistémica, proporcionando de ese modo un
régimen de tratamiento para la osteoporosis y otras enfermedades
óseas metabólicas.
La presente invención intenta superar los
inconvenientes de la técnica anterior proporcionando composiciones
y métodos novedosos para inducir osificación usando una molécula de
señalización intracelular que participa de manera temprana en la
cascada de acontecimientos que conduce a la osificación. Los
solicitantes han descubierto 10-4/RLMP (SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 2), un gen de LIM novedoso con una secuencia aislada
originariamente de cultivos de osteoblastos calváricos de rata
estimulados. El gen se ha clonado, secuenciado y sometido a ensayo
para determinar su capacidad para potenciar la eficacia de la
mineralización ósea in vitro. La proteína RLMP afecta a la
mineralización de la matriz ósea así como a la diferenciación de
células en el linaje de osteoblastos. A diferencia de otras
citocinas conocidas, por ejemplo, las BMP, RLMP no es una proteína
secretada, sino que es en cambio una molécula de señalización
intracelular. Esta característica tiene la ventaja de proporcionar
amplificación de la señalización intracelular así como una
evaluación más sencilla de las células transfectadas. También es
adecuada para aplicaciones in vivo más eficaces y
específicas. Las aplicaciones clínicas adecuadas incluyen
potenciación de la reparación ósea en fracturas, defectos óseos,
injertos óseos y homeostasis normal en pacientes que presentan
osteoporosis.
Los solicitantes también han clonado,
secuenciado y deducido la secuencia de aminoácidos de una proteína
humana correspondiente, denominada LMP-1 humana. La
proteína humana demuestra una eficacia de mineralización ósea
potenciada in vitro e in vivo.
Además, los solicitantes han caracterizado una
versión truncada (corta) de LMP-1, llamada
HLMP-1s. Esta versión corta resultó de una mutación
puntual en una fuente de un clon de ADNc, que proporcionó un codón
de terminación que truncaba la proteína. La versión corta
(LMP-1s) es totalmente funcional cuando se expresa
en cultivo celular e in vivo.
En la siguiente descripción se expondrán
características y ventajas adicionales de la invención, y en parte
resultarán evidentes a partir de la descripción, o pueden aprenderse
mediante la puesta en práctica de la invención. Los objetivos y
otras ventajas de la invención se realizarán y lograrán mediante los
métodos y composiciones particularmente señalados en la descripción
por escrito y reivindicaciones del presente documento.
En un aspecto amplio, la invención se refiere a
una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia
de ácido nucleico que codifica para cualquier proteína de
mineralización LIM, hibridándose la molécula de ácido nucleico en
condiciones convencionales con una molécula de ácido nucleico
complementaria a la longitud completa de la SEQ. ID NO: 25, e
hibridándose la molécula en condiciones sumamente rigurosas con una
molécula de ácido nucleico complementaria a la longitud completa de
la SEQ. ID NO: 26. En un aspecto específico, la molécula de ácido
nucleico aislada codifica para HLMP-1,
HLMP-1s o RLMP. Además, la invención se refiere a
vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, así como
a células huésped que comprenden los vectores. En otro aspecto
específico, la invención se refiere a las propias proteínas.
En un segundo aspecto amplio, la invención se
refiere a un anticuerpo que es específico para la proteína de
mineralización LIM, incluyendo HLMP-1,
HLMP-1s y RLMP. En un aspecto específico, el
anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otro aspecto específico,
el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En un tercer aspecto amplio, la invención se
refiere a un método de inducción de osificación en el que se
transfectan células precursoras osteogénicas con una molécula de
ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica para la proteína de mineralización LIM. En un aspecto
específico, la molécula de ácido nucleico aislada está en un
vector, que puede ser un plásmido o un virus, tal como adenovirus o
retrovirus. La transfección puede producirse ex vivo o in
vivo mediante inyección directa de la molécula de ácido
nucleico aislada. La molécula de ácido nucleico aislada transfectada
puede codificar para HLMP-1,
HLMP-1s o RLMP.
En un aspecto adicional, la invención se refiere
a métodos de artrodesis vertebral transfectando células precursoras
osteogénicas con una molécula de ácido nucleico aislada que tiene
una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de
mineralización LIM, mezclando las células precursoras osteogénicas
transfectadas con una matriz y poniendo en contacto la matriz con
la vértebra.
Todavía en otro aspecto, la invención se refiere
a métodos para inducir osificación sistémica mediante transfección
estable de células huésped con los vectores de la invención.
Ha de entenderse que tanto la descripción
general anterior como la descripción detallada siguiente son a modo
de ejemplo y de explicación y pretenden proporcionar una explicación
adicional de la invención tal como se reivindica.
- BMP
- Proteína morfogenética ósea
- HLMP-1 LMP-1
- humana, también denominada proteína LIM humana o HLMP
- HLMP-1s
- Proteína corta (truncada) LMP-1 humana
- HLMPU
- Región única de proteína LIM humana
- LMP
- Proteína de mineralización LIM
- MEM
- Medio mínimo esencial
- Trm
- Triamcinolona
- \beta-GlyP
- Beta-glicerolfosfato
- RACE
- Amplificación rápida de extremos de ADNc
- RLMP
- Proteína de mineralización LIM de rata, también designada como RLMP-1
- RLMPU
- Región única de proteína LIM de rata
- RNAsin
- Inhibidor de ARNasa
- ROB
- Osteoblasto de rata
- 10-4
- Clon que contiene la secuencia de ADNc para RLMP (SEQ ID NO: 2)
- UTR
- Región no traducida
La presente invención se refiere a proteínas LIM
de mamífero novedosas, designadas en el presente documento como
proteínas de mineralización LIM, o LMP. La invención se refiere más
particularmente a LMP humana, conocida como HLMP o
HLMP-1. Los solicitantes han descubierto que estas
proteínas potencian la mineralización ósea en células de mamífero
cultivadas in vitro. Cuando se produce en mamíferos, la LMP
induce también la osificación in vivo.
La transfección ex vivo de células de
médula ósea, células precursoras osteogénicas o células madre
mesenquimatosas con ácido nucleico que codifica para LMP o HLMP,
seguido del reimplante de células transfectadas en el donante, es
adecuada para tratar una variedad de trastornos o lesiones
relacionados con los huesos. Por ejemplo, se puede usar este método
para: aumentar la reparación de fracturas de huesos largos; generar
hueso en defectos segmentarios; proporcionar un sustituto de
injerto óseo para fracturas; facilitar la reconstrucción de tumores
o artrodesis vertebral; y proporcionar un tratamiento local
(mediante inyección) para hueso débil o con osteoporosis, tal como
en osteoporosis de la cadera, vértebras o muñeca. La transfección
con ácido nucleico que codifica para HLMP o LMP también es útil en:
la inyección percutánea de células de médula transfectadas para
acelerar la reparación de huesos largos fracturados; el tratamiento
del retraso de la consolidación o falta de consolidación de
fracturas de huesos largos o pseudoartrosis de artrodesis
vertebrales; y para inducir formación de hueso nuevo en la necrosis
avascular de la cadera o la rodilla.
Además de métodos ex vivo de terapia
génica, la transfección de un vector de ADN recombinante que
comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para LMP o
HLMP puede conseguirse in vivo. Cuando se inserta un
fragmento de ADN que codifica para LMP o HLMP en un vector viral
apropiado, por ejemplo, un vector de adenovirus, el constructo
viral puede inyectarse directamente en un sitio del organismo en el
que se desea la osificación endocondral. Usando una inyección
percutánea directa para introducir la secuencia de LMP o HLMP puede
conseguirse la estimulación de la osificación sin la necesidad de
intervención quirúrgica o bien para obtener células de médula ósea
(para transfectar ex vivo) o bien para reimplantarlas en el
paciente en el sitio en el que se requiere hueso nuevo. Alden et
al., Neurosurgical Focus (1998), han demostrado la utilidad de
un método de inyección directa de terapia génica que usa un ADNc
que codifica para BMP-2, que se clonó en un vector
de adenovirus.
También es posible llevar a cabo la terapia
génica in vivo inyectando directamente en un sitio del
organismo apropiado, un plásmido recombinante desnudo, es decir, no
encapsulado, que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica para HLMP. En esta realización de la invención, la
transfección se produce cuando el ADN de plásmido desnudo se capta,
o internaliza, por las células diana apropiadas, que se han
descrito. Tal como en el caso de la terapia génica in vivo
que usa un constructo viral, la inyección directa de ADN de
plásmido desnudo ofrece la ventaja de que se requiere una pequeña
intervención quirúrgica o ninguna. Se ha mostrado de manera
satisfactoria en pacientes humanos la terapia génica directa, que
usa ADN de plásmido desnudo que codifica para el mitógeno de
células endoteliales VEGF (factor de crecimiento endotelial
vascular). Baumgartner et al., Circulation,
97(12):1114-23 (1998).
Usando un vector de adenovirus para insertar LMP
en células osteogénicas, se consigue la expresión transitoria de
LMP. Esto se produce debido a que el adenovirus no se incorpora en
el genoma de las células diana que se transfectan. La expresión
transitoria de LMP, es decir, la expresión que se produce durante el
tiempo de vida de las células diana transfectadas, es suficiente
para conseguir los objetos de la invención. Sin embargo, la
expresión estable de LMP puede producirse cuando se usa un vector
que se incorpora en el genoma de la célula diana, como vehículo de
inserción. Los vectores basados en retrovirus, por ejemplo, son
adecuados para este fin.
La expresión estable de LMP es particularmente
útil para tratar diversos trastornos sistémicos relacionados con
los huesos, tales como osteoporosis y osteogénesis imperfecta. Para
esta realización de la invención, además de usar un vector que se
integra en el genoma de la célula diana para insertar una secuencia
de nucleótidos que codifica para LMP en las células diana, la
expresión de LMP se sitúa bajo el control de un promotor regulable.
Por ejemplo, es adecuado un promotor que se activa mediante la
exposición a un agente de inducción exógeno, tal como tetraciclina.
Usando este enfoque, puede estimularse la formación de hueso nuevo
de manera sistémica administrando una cantidad eficaz del agente de
inducción exógeno. Una vez que se consigue una cantidad suficiente
de masa ósea, se interrumpe la administración del agente de
inducción exógeno. Este proceso puede repetirse según sea necesario
para remplazar la masa ósea que se ha perdido, por ejemplo, como
consecuencia de la osteoporosis.
Los anticuerpos específicos para HLMP son
particularmente adecuados para su uso en los métodos para someter a
ensayo el potencial osteoinductor, es decir, de osificación, de las
células del paciente. De este modo, pueden identificarse pacientes
que corren el riesgo de una consolidación lenta o escasa de la
reparación ósea. Además, los anticuerpos específicos de HLMP son
adecuados para su uso en ensayos con marcadores para identificar
factores de riesgo en enfermedades degenerativas óseas, tales como,
por ejemplo, osteoporosis.
Siguiendo métodos convencionales y bien
conocidos, los genes de la presente invención se preparan mediante
ligamiento de segmentos de ácido nucleico que codifican para LMP a
otras secuencias de ácido nucleico, tales como vectores de
clonación y/o expresión. Se han descrito métodos necesarios para
construir y analizar estos vectores recombinantes, por ejemplo,
digestos de endonucleasas de restricción, protocolos de clonación,
mutagénesis, síntesis orgánica de oligonucleótidos y secuenciación
de ADN. Para ADN de secuenciación de ADN, el método de
didesoxiterminador es el preferido.
Se han publicado muchos tratados sobre métodos
con ADN recombinante, incluyendo Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2ª Edición
(1988), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology,
Elsevier (1986), y Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, Wiley Interscience (1988). Estos manuales de
referencia se incorporan específicamente al presente documento como
referencia.
La amplificación dirigida por cebadores de ADN o
ADNc es una etapa común en la expresión de los genes de esta
invención. Se realiza normalmente mediante la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR). La PCR se describe en la patente
estadounidense número 4.800.159 concedida a Mullis et al. y
otras fuentes publicadas. El principio básico de la PCR es la
replicación exponencial de una secuencia de ADN mediante ciclos
sucesivos de extensión de cebadores. Los productos de extensión de
un cebador, cuando se hibridan con otro cebador, se convierten en
un molde para la síntesis de otra molécula de ácido nucleico. Los
complejos de cebador-molde actúan como sustrato
para la ADN polimerasa, que al realizar su función de replicación,
extiende los cebadores. La enzima convencional para las
aplicaciones de PCR es la ADN polimerasa termoestable aislada de
Thermus aquaticus, o Taq ADN polimerasa.
Existen numerosas variaciones del método de PCR
básico, y un procedimiento de elección particular en cualquier
etapa dada necesaria para construir los vectores recombinantes de
esta invención se realiza fácilmente por un experto. Por ejemplo,
para medir la expresión celular de 10-4/RLMP, se
extrae ARN y se transcribe de manera inversa con procedimientos
convencionales y bien conocidos. Entonces, se analiza el ADNc
resultante para determinar la secuencia de ARNm apropiada mediante
PCR.
El gen que codifica para la proteína de
mineralización LIM se expresa en un vector de expresión en un
sistema de expresión recombinante. Por supuesto, la secuencia
construida no es necesario que sea igual a la original, ni su
secuencia complementaria, sino que en cambio, puede ser cualquier
secuencia determinada mediante la degeneración del código de ADN
que no obstante exprese una LMP que tiene actividad de osificación.
También pueden emplearse sustituciones de aminoácidos
conservativas, u otras modificaciones, tales como la aparición de
un residuo de metionina amino-terminal.
\newpage
Un sitio de unión a ribosoma activo en el
sistema de expresión del huésped de elección se liga al extremo 5'
de la secuencia que codifica para la LMP quimérica, formando un gen
sintético. El gen sintético puede insertarse en uno cualquiera de
una gran variedad de vectores para la expresión mediante ligamiento
a un plásmido linealizado de manera apropiada. Un promotor
regulable, por ejemplo, el promotor lac de E. coli, es
también adecuado para la expresión de las secuencias codificantes
quiméricas. Otros promotores regulables adecuados incluyen
promotores trp, tac, recA, T7 y lambda.
El ADN que codifica para LMP se transfecta en
las células del receptor mediante uno de varios procedimientos
publicados convencionales, por ejemplo, precipitación con fosfato de
calcio. DEAE-dextrano, electroporación o fusión de
protoplastos, para formar transformantes estables. Se prefiere la
precipitación con fosfato de calcio, particularmente cuando se
realiza tal como sigue.
Se coprecipitan los ADN con fosfato de calcio
según el método de Graham y Van Der, Virology, 52:456 (1973), antes
de transferirse a las células. Se usa una alícuota de
40-50 \mug de ADN, con ADN de timo de ternero o
esperma de salmón como vehículo, para 0,5x10^{6} células sembradas
en placa en una placa de 100 mm. Se mezcla el ADN con 0,5 ml de 2X
disolución Hepes (NaCl 280 mM, Hepes 50 mM y Na_{2}HPO_{4} 1,5
mM, pH 7,0), a lo que se añade un volumen igual de 2x CaCl_{2}
(CaCl_{2} 250 mM y Hepes 10 mM, pH 7,0). Se distribuye de manera
uniforme un precipitado granular blanco, que aparece tras
30-40 minutos, gota a gota sobre las células, que
se dejan incubar durante 4-16 horas a 37ºC. Se
elimina el medio y se almacenan las células sacudidas con glicerol
al 15% en PBS durante 3 minutos. Tras eliminar el glicerol, se
alimentan las células medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que
contiene suero bovino fetal al 10%.
El ADN puede transfectarse también usando: los
métodos de DEAE-dextrano de Kimura et al.,
Virology, 49:394 (1972) y Sompayrac et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 78:7575 (1981); el método de electroporación de
Potter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7161 (1984); y el método de
fusión de protoplastos de Sandri-Goddin et
al., Molec. Cell. Biol., 1:743 (1981).
La química de la fosforamidita en fase sólida es
el método preferido para la síntesis orgánica de
oligodesoxinucleótidos y polidesoxinucleótidos. Además, se
encuentran disponibles muchos otros métodos de síntesis orgánica.
Esos métodos se adaptan fácilmente por los expertos en la técnica a
las secuencias particulares de la invención.
La presente invención incluye también moléculas
de ácido nucleico que se hibridan en condiciones convencionales con
cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que codifican para
las proteínas de mineralización LIM de la invención. Las
"condiciones de hibridación convencionales" variarán con el
tamaño de la sonda, el fondo y la concentración de los reactivos de
ácido nucleico, así como el tipo de hibridación, por ejemplo, in
situ, transferencia de tipo Southern, o hibridación de híbridos
de ADN-ARN (transferencia de tipo Northern). La
determinación de las "condiciones de hibridación
convencionales" está dentro del nivel de conocimiento en la
técnica. Por ejemplo, véase la patente estadounidense 5.580.775
concedida a Fremeau et al., incorporada al presente
documento como referencia para este fin. Véase también, Southern, E.
M., J. Mol. Biol., 98:503 (1975), Alwine et al., Meth.
Enzymol., 68:220 (1979), y Sambrook et al., Molecular
Cloning: A laboratory Manual, 2ª edición, páginas
7.19-7.50, Cold Spring Harbor Press (1989).
Un conjunto preferido de condiciones de
hibridación convencionales implica una transferencia que se hibrida
previamente a 42ºC durante 2 horas en formamida al 50%, 5X SSPE
(NaCl 150 nM, NaH_{2}PO_{4} 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM [pH
8,0]), 5X disolución de Denhardt (20 mg de Ficoll, 20 mg de
polivinilpirrolidona y 20 mg de BSA por 100 ml de agua), sulfato de
dextrano al 10%, SDS al 1% y ADN de esperma de salmón 100 \mug/ml.
Se añade una sonda de ADNc marcada con ^{32}P y se continúa la
hibridación durante 14 horas. Después, se lava la transferencia dos
veces con 2X SSPE, SDS al 0,1% durante 20 minutos a 22ºC, seguido de
un lavado de 1 hora a 65ºC en 0,1X SSPE, SDS al 0,1%. Entonces se
seca la transferencia y se expone a película de rayos X durante 5
días en presencia de una pantalla de intensificación.
En "condiciones sumamente rigurosas", una
sonda se hibridará con su secuencia diana si esas dos secuencias
son sustancialmente idénticas. Tal como en el caso de condiciones de
hibridación convencionales, un experto en la técnica puede, dado el
nivel de conocimiento en la técnica y la naturaleza del experimento
particular, determinar las condiciones en las que solamente
hibridarán secuencias sustancialmente idénticas.
Otro aspecto de la invención incluye las
proteínas codificadas por las secuencias de ácido nucleico. Todavía
en otra realización, la invención se refiere a la identificación de
tales proteínas basándose en anticuerpos anti-LMP.
En esta realización, se preparan muestras de proteína para análisis
de inmunotransferencia de tipo Western lisando las células y
separando las proteínas mediante SDS-PAGE. Se
transfieren las proteínas a nitrocelulosa mediante
electrotransferencia tal como se describe por Ausubel et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1987).
Tras bloquear el filtro con leche en polvo desnatada instantánea (1
g en 100 ml de PBS), se añade anticuerpo anti-LMP
al filtro y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se
lava el filtro meticulosamente con solución salina tamponada con
fosfato (PBS) y se incuba con conjugado de peroxidasa del rábano
(HRPO)-anticuerpo durante 1 hora a temperatura
ambiente. Se lava de nuevo el filtro meticulosamente con PBS y se
identifican las bandas de antígeno añadiendo diaminobencidina
(DAB).
\newpage
Los anticuerpos monoespecíficos son el reactivo
de elección en la presente invención y se usan específicamente para
analizar las células del paciente para determinar características
específicas asociadas con la expresión de LMP. "Anticuerpo
monoespecífico" tal como se usa en el presente documento se
define como una única especie de anticuerpo o múltiples de especies
de anticuerpo con características de unión homogéneas para LMP.
"Unión homogénea" tal como se usa en el presente documento se
refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo para unirse a un
epítopo o antígeno específico, tal como los asociados a LMP, tal
como se describió anteriormente. Se purifican anticuerpos
monoespecíficos frente a LMP a partir antisueros de mamífero que
contienen anticuerpos reactivos frente a LMP o se preparan como
anticuerpos monoclonales reactivos con LMP usando la técnica de
Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975). Los
anticuerpos específicos para LMP se generan inmunizando animales
tales como, por ejemplo, ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras o
caballos, con una concentración apropiada de LMP o bien con o bien
sin un adyuvante inmunitario.
En este proceso, se recoge suero preinmunitario
antes de la primera inmunización. Cada animal recibe entre
aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 1000 mg de LMP asociada a
un adyuvante inmunitario aceptable, si se desea. Tales adyuvantes
aceptables incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes completo de
Freund, incompleto de Freund, precipitado de alumbre, emulsión de
agua en aceite que contiene Corynebacterium parvum y ARNt.
La inmunización inicial consiste en LMP en, preferiblemente,
adyuvante completo de Freund que se inyecta en múltiples sitios o
bien por vía subcutánea (s.c.), por vía intraperitoneal (i.p.) o
ambas. Se extrae sangre de cada animal a intervalos regulares,
preferiblemente de manera semanal, para determinar el título de
anticuerpos. Los animales pueden o no recibir inyecciones de
recuerdo tras la inmunización inicial. A los animales que reciben
inyecciones de recuerdo se les administra generalmente una cantidad
igual del antígeno en adyuvante incompleto de Freund mediante la
misma vía. Las inyecciones de recuerdo se administran a intervalos
de aproximadamente tres semanas hasta que se obtienen títulos
máximos. Aproximadamente a los 7 días tras cada inmunización de
recuerdo o aproximadamente de manera semanal tras una única
inmunización, se extrae sangre de los animales, se recoge el suero
y se almacenan alícuotas a aproximadamente -20º C.
Se preparan anticuerpos monoclonales (AcM)
reactivos con LMP inmunizando ratones consanguíneos, preferiblemente
ratones Balb/c, con LMP. Se inmunizan los ratones por vía i.p. o
s.c. con de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg,
preferiblemente con aproximadamente 1 mg, de LMP en aproximadamente
0,5 ml de tampón o solución salina incorporado en un volumen igual
de un adyuvante aceptable, tal como se trató anteriormente. Se
prefiere el adyuvante completo de Freund. Los ratones reciben una
inmunización inicial en el día 0 y descansan durante
aproximadamente 3-30 semanas. A los ratones
inmunizados se les administra una o más inmunizaciones de recuerdo
de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg de LMP en una
disolución tampón tal como solución salina tamponada con fosfato
por vía intravenosa (i.v.). Se obtienen linfocitos de ratones
positivos para los anticuerpos, preferiblemente linfocitos
esplénicos, extirpando los bazos de ratones inmunizados mediante
procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Se producen
células de hibridoma mezclando los linfocitos esplénicos con un
componente de fusión apropiado, preferiblemente células de mieloma,
en condiciones que permitirán la formación de hibridomas estables.
Los componentes de fusión pueden incluir, pero no se limitan a:
mielomas de ratón P3/NS1/Ag 4-1;
MPC-11; S-194 y Sp 2/0,
prefiriéndose Sp 2/0. Las células productoras de anticuerpos y
células de mieloma se fusionan en polietilenglicol, peso molecular
de aproximadamente 1000, a concentraciones de desde aproximadamente
el 30% hasta aproximadamente el 50%. Se seleccionan células de
hibridoma fusionadas mediante crecimiento en hipoxantina, timidina
y aminopterina en medio de Eagle modificado por Dulbecco
complementado (DMEM) mediante procedimientos conocidos en la
técnica. Se recogen los líquidos sobrenadantes de los pocillos con
crecimiento positivo aproximadamente en los días 14, 18, y 21, y se
examinan para detectar la producción de anticuerpos mediante un
inmunoensayo tal como radioinmunoanálisis en fase sólida (SPIRA)
usando LMP como antígeno. También se someten a prueba los líquidos
de cultivo en el ensayo de precipitación de Ouchterlony para
determinar el isotipo del AcM. Se clonan células de hibridoma de
pocillos positivos para anticuerpos mediante una técnica tal como
la técnica en agar blando de MacPherson, "Soft Agar
Techniques", en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse y
Paterson (eds.), Academic
Press (1973). Véase, también, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory (1988).
Press (1973). Véase, también, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory (1988).
Pueden producirse también anticuerpos
monoclonales in vivo mediante la inyección a ratones de
Balb/c sensibilizados con Pristane, aproximadamente 0,5 ml por
ratón, de aproximadamente de 2x10^{6} a aproximadamente 6x10^{6}
células de hibridoma aproximadamente 4 días tras la
sensibilización. Se recoge el líquido ascítico aproximadamente a
los 8-12 días tras transferir las células y se
purifican los anticuerpos monoclonales mediante técnicas conocidas
en la técnica.
La producción in vitro en AcM
anti-LMP se lleva a cabo haciendo crecer la línea de
células de hibridoma en DMEM que contiene suero de ternero fetal a
aproximadamente el 2% para obtener cantidades suficientes del AcM
específico. Se purifican los AcM mediante técnicas conocidas en la
técnica.
Se determinan los títulos de anticuerpo de
líquidos de cultivo de hibridoma o ascitis mediante diversos ensayos
serológicos o inmunológicos, que incluyen, pero no se limitan a,
técnicas de precipitación, aglutinación pasiva, técnica de
anticuerpo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA) y
radioinmunoanálisis (RIA). Se usan ensayos similares para detectar
la presencia de la LMP tejido o fluidos corporales o extractos
celulares.
Resulta fácilmente evidente para los expertos en
la técnica que los métodos descritos anteriormente para producir
anticuerpos monoespecíficos pueden utilizarse para producir
anticuerpos específicos para fragmentos de polipéptido de LMP,
polipéptido de LMP naciente de longitud completa, o variantes o
alelos de los mismos.
El 22 de julio de 1997, se depositó una muestra
de 10-4/RLMP en un vector designado pCMV2/RLMP (que
es el vector pRc/CMV2 con el inserto clon
10-4/RLMP) en la Colección Americana de Cultivos
Tipo (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. El número
de registro de cultivo para ese depósito es 209153. El 19 de marzo
de 1998, se depositó una muestra del vector pHis-A
con el inserto HLPM-1s en la Colección Americana de
Cultivos Tipo. El número de registro de cultivo para ese depósito
es 209698. Estos depósitos, realizados bajo los requisitos del
Tratado de Budapest, se mantendrán en la ATCC durante al menos 30
años y estarán disponibles al público tras la concesión de una
patente que los describa. Debe entenderse que la disponibilidad de
un depósito no constituye un permiso para poner en práctica la
invención objeto en menoscabo de los derechos de patente concedidos
por la acción gubernamental.
En la evaluación de los ácidos nucleicos,
proteínas o anticuerpos de la invención, se emplean ensayos
enzimáticos, purificación de proteínas y otros métodos bioquímicos
convencionales. Se analizan ADN y ARN mediante técnicas de
transferencia de tipo Southern y de transferencia de tipo Northern,
respectivamente. Normalmente, las muestras analizadas se fraccionan
por tamaños mediante electroforesis en gel. Entonces se transfieren
ADN o ARN en los geles a membranas de nailon o nitrocelulosa.
Entonces se hibridaron con sondas las transferencias, que son
réplicas de los patrones de muestra en los geles. Normalmente, las
sondas están radiomarcadas, preferiblemente con ^{32}P, aunque
podrían marcarse las sondas con otras moléculas de generación de
señales conocidas por los expertos en la técnica. Entonces pueden
visualizarse bandas de interés específicas mediante sistemas de
detección, tales como autorradiografía.
Para los fines de ilustrar las realizaciones
preferidas de la presente invención, se incluyen los siguientes
ejemplos no limitativos. Estos resultados demuestran la viabilidad
de inducir o potenciar la formación de hueso usando las proteínas
de mineralización LIM de la invención, y las moléculas de ácido
nucleico aisladas que codifican para esas proteínas.
Se obtuvieron células calváricas de rata,
también conocidas como osteoblastos de rata ("ROB"), de ratas
20 días antes del parto tal como se describió anteriormente. Boden
et al., Endocrinology, 137(8):3401-07
(1996). Se hicieron crecer cultivos primarios hasta confluencia (7
días), se sometieron a tripsinización y se pasaron a placas de 6
pocillos (1 x 10^{5} células/pocillo de 35 mm) como primeras
células de subcultivo. Se hicieron crecer las células de
subcultivo, que estaban en confluencia en el día 0, durante 7 días
adicionales. Comenzando en el día 0, se cambiaron los medios y se
aplicaron tratamientos (Trm y/o BMP) en una campana de flujo
laminar, cada 3 ó 4 días. El protocolo de cultivo convencional era
tal como sigue: días 1-7, MEM, FBS al 10%, ácido
ascórbico 50 \mug/ml, \pm estímulo; días 8-14,
medio BGJb, FBS al 10%, \beta-GlyP 5 mM (como
fuente de fosfato inorgánico para permitir la mineralización). Se
realizó en el día 14 el análisis del punto final de la formación de
nódulos óseos y la secreción de osteocalcina. Se eligió la dosis de
BMP como 50 ng/ml basándose en los experimentos piloto en este
sistema que demostró un efecto de intervalo medio sobre la curva
dosis-respuesta para todas las BMP estudiadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para explorar el posible papel funcional de
LMP-1 durante la osificación membranosa, se
sintetizó un oligonucleótido antisentido para bloquear la
traducción de ARNm de LMP-1 y se trataron cultivos
secundarios de osteoblastos que estaban sometiéndose a
diferenciación iniciada por glucocorticoides. Se realizó la
inhibición de la expresión de RLMP con un oligonucleótido
antisentido sumamente específico (que no tenía homologías
significativas con las secuencias de rata conocidas)
correspondiente a una secuencia de 25 pb que abarca el supuesto
sitio de inicio de la traducción (SEQ ID NO: 35). Los cultivos
control o bien no recibieron oligonucleótido o bien recibieron
oligonucleótido sentido. Se realizaron los experimentos en presencia
(preincubación) y ausencia de lipofectamina. En resumen, se
incubaron 22 \mug de RLMP sentido o antisentido en MEM durante 45
minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, se añadió o
bien más MEM o bien lipofectamina/MEM preincubada (7% v/v; incubada
durante 45 minutos a temperatura ambiente) para lograr una
concentración de oligonucleótido de 0,2 \muM. Se incubó la mezcla
resultante durante 15 minutos a temperatura ambiente. Entonces se
mezclaron las mezclas de oligonucleótidos con el medio apropiado,
es decir, MEM/Ascorbato/\pmTrm, para lograr una concentración
final de oligonucleótido de 0,1 \muM.
Se incubaron las células con el medio apropiado
(\pm estímulo) en presencia o ausencia de los oligonucleótidos
apropiados. Se realimentaron los cultivos incubados originalmente
con lipofectamina tras 4 horas de incubación (37ºC; CO_{2} al 5%)
con medios que no contenían ni lipofectamina ni oligonucleótido. Se
realimentaron todos los cultivos, especialmente los cultivos que
recibieron oligonucleótido, cada 24 horas para mantener los niveles
de oligonucleótidos.
El oligonucleótido antisentido de
LMP-1 inhibió la formación de nódulos mineralizados
y la secreción de osteocalcina de una manera dependiente de la
dosis, similar al efecto de oligonucleótido BMP-6.
El bloqueo antisentido de LMP-1 en la
diferenciación de osteoblastos no pudo rescatarse mediante la
adición de BMP-6 exógena, mientras que se invirtió
la inhibición de oligonucleótido antisentido de
BMP-6 con la adición de BMP-6. Este
experimento confirmó además la posición anterior de
LMP-1 con respecto a BMP-6 en la
ruta de diferenciación de osteoblastos. El oligonucleótido
antisentido de LMP-1 también inhibió la
diferenciación espontánea de osteoblastos en cultivos de
osteoblastos de rata primarios.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fijaron durante la noche en etanol al 70%
cultivos de ROB preparados según los ejemplos 1 y 2 y se tiñeron
con tinción de plata de von Kossa. Se usó un sistema de análisis de
obtención de imágenes de vídeo computerizado semiautomatizado para
cuantificar el recuento de nódulos y el área de los nódulos en cada
pocillo. Boden et al., Endocrinology,
137(8):3401-07 (1996). Entonces se dividieron
estos valores para calcular los valores del área por nódulo. Se
validó este procedimiento automatizado frente a una técnica de
recuento manual y se demostró un coeficiente de correlación de 0,92
(p < 0,000001). Todos los datos se expresan como la media \pm
el error estándar de la media (E.E.M.) calculada a partir de 5 ó 6
pocillos en cada condición. Se confirmó cada experimento al menos
dos veces usando células a partir de diferentes preparaciones
calváricas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron niveles de osteocalcina en los
medios de cultivo usando un radioinmunoanálisis competitivo con un
anticuerpo policlonal (AcP) monoespecífico producido en nuestro
laboratorio frente al nonapéptido C-terminal de
osteocalcina de rata tal como se describió en Nanes et al.,
Endocrinology, 127:588 (1990). En resumen, se trató con yodo 1
\mug de nonapéptido con 1 mCi de ^{125}I-Na
mediante el método de lactoperoxidasa. Tubos que contenían 200
\mul de tampón de ensayo (fosfato de sodio 0,02 M, EDTA 1 mM,
timerosal al 0,001%, BSA al 0,025%) recibieron medios tomados de
cultivos celulares o patrones de osteocalcina
(0-12.000 fmoles) a 100 \mul/tubo en tampón de
ensayo. Entonces se añadió el AcP (1:40.000; 100 \mul) seguido del
péptido yodado (12.000 cpm; 100 \mul). Se prepararon muestras
sometidas a prueba para determinar la unión no específica de manera
similar pero sin contener anticuerpo.
Se separaron AcP unido y libre mediante la
adición de 700 \mul de IgG de cabra anti-conejo,
seguido de la incubación durante 18 horas a 4ºC. Tras centrifugar
las muestras a 1200 rpm durante 45 minutos, se decantaron los
sobrenadantes y se sometieron a recuento los precipitados en un
contador gamma. Se notificaron los valores de osteocalcina en
fmoles/100 \mul, que se convirtieron entonces en pmoles/ml de
medio (producción de 3 días) dividiendo estos valores entre 100. Se
expresaron los valores como la media \pm el E.E.M. de
determinaciones por triplicado para 5-6 pocillos
para cada condición. Se confirmó cada experimento al menos dos veces
usando células a partir de diferentes preparaciones calváricas.
\vskip1.000000\baselineskip
Hubo un pequeño efecto evidente de los
nucleótidos o bien sentido o bien antisentido sobre la producción
global de nódulos óseos en el sistema de cultivo celular no
estimulado. Sin embargo, cuando se estimularon ROB con Trm, el
oligonucleótido antisentido para RLMP inhibió la mineralización de
nódulos en > 95%. La adición de BMP-6 exógena a
los cultivos tratados con oligonucleótido no rescató la
mineralización de nódulos tratados con antisentido de RLMP.
Osteocalcina ha sido desde hace tiempo sinónimo
de la mineralización ósea, y los niveles de osteocalcina se han
correlacionado con la producción de nódulos y la mineralización. El
oligonucleótido antisentido de RLMP disminuye significativamente la
producción de osteocalcina, pero el recuento de nódulos en cultivos
tratados con antisentido no cambia significativamente. En este
caso, la adición de BMP-6 exógena sólo rescata la
producción de osteocalcina en cultivos tratados con antisentido de
RLMP en el 10-15%. Esto sugiere que la acción de
RLMP es posterior a, y más específica que,
BMP-6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogió ARN celular de pocillos por duplicado
de ROB (preparados según los ejemplos 1 y 2 en placas de cultivo de
6 pocillos) usando una disolución 4 M de isotiocianato de guanidina
(GIT) proporcionando triplicados estadísticos. En resumen, se
aspiró el sobrenadante de cultivo de los pocillos, que entonces se
recubrieron con 0,6 ml de disolución de GIT por recogida de
pocillos por duplicado. Tras añadir la disolución de GIT, las
placas se agitaron durante 5-10 segundos (siendo lo
más constante posible). Se guardaron las muestras a -70ºC durante
hasta 7 días antes del procesamiento adicional.
Se purificó ARN mediante una ligera modificación
de los métodos convencionales según Sambrook et al.,
Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª edición, capítulo 7, 19,
Cold Spring Harbor Press (1989). En resumen, las muestras
descongeladas recibieron 60 \mul de acetato de sodio 2,0 M (pH
4,0), 550 \mul de fenol (saturado en agua) y 150 \mul de
cloroformo:alcohol isoamílico (49:1). Tras agitar con vórtex, se
centrifugaron las muestras (10000 x g; 20 minutos; 4ºC), se
transfirió la fase acuosa a un tubo nuevo, se añadieron 600 \mul
de isopropanol y precipitó el ARN durante la noche a -20ºC.
Tras la incubación durante la noche, se
centrifugaron las muestras (10000 x g; 20 minutos) y se aspiró
suavemente el sobrenadante. Se resuspendieron los sedimentos en 400
\mul de agua tratada con DEPC, se extrajeron una vez con
fenol:cloroformo (1:1), se extrajeron con cloroformo:alcohol
isoamílico (24:1) y precipitaron durante la noche a -20ºC tras la
adición de 40 \mul de acetato de sodio (3,0 M; pH 5,2) y 1,0 ml de
etanol absoluto. Para recuperar el ARN celular, se centrifugaron
las muestras (10000 x g; 20 min.), se lavaron una vez con etanol al
70%, se secaron al aire durante 5-10 minutos y se
resuspendieron en 20 \mul de agua tratada con DEPC. Se calcularon
las concentraciones de ARN a partir de las densidades ópticas que se
determinaron con un espectrofotómetro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió ARN total calentado (5 \mug en un
volumen total de 10,5 \mul de DEPC-H_{2}O a 65ºC
durante 5 minutos) a tubos que contenían 4 \mul de 5X tampón
MMLV-RT, 2 \mul de dNTP, 2 \mul de cebador dT17
(10 pmol/ml), 0,5 \mul de ARNsin (40 U/ml) y 1 \mul de
MMLV-RT (200 unidades/\mul). Se incubaron las
muestras a 37ºC durante 1 hora, entonces a 95ºC durante 5 minutos
para inactivar la MMLV-RT. Se diluyeron las
muestras mediante la adición de 80 \mul de
agua.
agua.
Se sometieron las muestras transcritas de manera
inversa (5 \mul) a reacción en cadena de la polimerasa usando
metodologías convencionales (volumen total de 50 \mul). En
resumen, se añadieron las muestras a tubos que contenían agua y
cantidades apropiadas de tampón de PCR, MgCl_{2} 25 mM, dNTP,
cebadores directo e inverso para gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa (GAP, un gen de
mantenimiento) y/o BMP-6),
^{32}P-dCTP y Taq polimerasa. A menos que se
indique lo contrario, se normalizaron los cebadores para ejecutar de
manera constante 22 ciclos (94ºC, 30''; 58ºC, 30''; 72ºC,
20'').
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de RT-PCR
recibieron 5 \mul/tubo de colorante de carga, se mezclaron, se
calentaron a 65ºC durante 10 min. y se centrifugaron. Se sometieron
diez \mul de cada reacción a PAGE (poliacrilamida al 12%:bis; 15
V/pocillo; corriente constante) en condiciones convencionales.
Entonces se incubaron los geles en tampón de conservación (10% v/v
de glicerol, 7% v/v de ácido acético, 40% v/v de metanol, 43% de
agua desionizada) durante 30 minutos, se secaron (80ºC) a vacío
durante 1-2 horas y se revelaron con un sistema de
obtención de imágenes fosforescentes potenciado electrónicamente
durante 6-24 horas. Se analizaron las bandas
visualizadas. Se representaron gráficamente los recuentos por
banda.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo ARN de células estimuladas con
glucocorticoide (Trm, 1 nM). Se transcribió de manera inversa ARN
total calentado, tratado con ADNasa (5 \mug en un volumen total de
10,5 en DEPC-H_{2}O a 65ºC durante 5 minutos) tal
como se describió en el ejemplo 7, pero se usó
H-T_{11}M (SEQ ID. NO: 4) como cebador de
MMLV-RT. Se amplificaron por PCR los ADNc
resultantes tal como se describió anteriormente, pero con diversos
conjuntos de cebadores comerciales (por ejemplo,
H-T_{11}G (SEQ ID NO: 4) y
H-AP-10 (SEQ ID. NO: 5); GenHunter
Corp, Nashville, TN). Se fraccionaron los productos de PCR
radiomarcados mediante electroforesis en gel sobre un gel de
secuenciación de ADN. Tras la electroforesis, se secaron los geles
resultantes a vacío y se expusieron a autorradiografías durante la
noche. Se cortaron del gel bandas que representaban ADNc que se
expresaban de manera diferencial y volvieron a amplificarse
mediante PCR usando el método de Conner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88:278 (1983). Se clonaron los productos de la
reamplificación por PCR en el vector PCR-II (TA
cloning kit; InVitrogen, Carlsbad, CA).
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se sembró en placa una biblioteca de UMR 106
(2,5 x 1010 ufp/ml) a 5 x 10^{4} ufp/ml sobre placas de agar
(agar de fondo LB) y se incubaron las placas durante la noche a
37ºC. Se recubrieron las placas con membranas filtrantes durante
dos minutos. Una vez retirados, los filtros se desnaturalizaron, se
enjuagaron, se secaron y se reticularon mediante UV. Entonces se
incubaron los filtros en tampón de prehibridación (2X PIPES [pH
6,5], formamida al 5%, SDS al 1% y ADN de esperma de salmón
desnaturalizado 100 \mug/ml) durante 2 h a 42ºC. Se añadió una
sonda radiomarcada de 260 pares de bases (SEQ ID NO: 3; marcada con
^{32}P mediante cebado aleatorio) a los filtros/mezcla de
hibridación completa, seguido de hibridación durante 18 horas a
42ºC. Se lavaron las membranas una vez a temperatura ambiente (10
min., 1 x SSC, SDS al 0,1%) y tres veces a 55ºC (15 min., 0,1 x
SSC, SDS al 0,1%).
Tras lavarse, se analizaron las membranas
mediante autorradiografía tal como se describió anteriormente. Se
purificaron por placa los clones positivos. Se repitió el
procedimiento con un segundo filtro durante cuatro minutos para
minimizar los falsos positivos. Se rescataron clones purificados por
placa como fagémidos lambda SK(-). Se secuenciaron ADNc clonados
tal como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se secuenciaron insertos de ADNc mediante
métodos convencionales. Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, Wiley Interscience (1988). En resumen, se
sometieron concentraciones apropiadas de mezcla de terminación,
molde y mezcla de reacción a un protocolo de ciclación apropiado
(95ºC, 30 s; 68ºC, 30 s; 72ºC, 60 s; x 25). Se añadió mezcla de
detección para terminar las reacciones de secuenciación. Tras
calentar a 92ºC durante 3 minutos, se cargaron las muestran sobre
un gel de secuenciación de poliacrilamida al 6% desnaturalizante
(acrilamida:bis-acrilamida 29:1). Se sometieron a
electroforesis las muestran durante aproximadamente 4 horas a 60
voltios, corriente constante. Tras la electroforesis, se secaron los
geles a vacío y se tomaron autorradiografías.
Se analizaron manualmente las autorradiografías.
Se examinaron las secuencias resultantes en las bases de datos
mantenidas por el Centro Nacional de Información Biotecnológica
("National Center durante Biotechnology Information"
(NIH, Bethesda, MD; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando el programa
BLASTn ajustado con parámetros por defecto. Basándose en los datos
de secuencia, se prepararon nuevos cebadores de secuenciación y se
repitió el procedimiento hasta que todo el gen se había
secuenciado. Se confirmaron todas las secuencias un mínimo de tres
veces en ambas orientaciones.
Se analizaron también las secuencias de
aminoácidos y nucleótidos usando el paquete de software PCGENE
(versión 16.0). Se calcularon valores de homología en tanto por
ciento para las secuencias de nucleótidos mediante el programa
NALIGN, usando los siguientes parámetros: peso de nucleótidos no
apareados, 10; peso de huecos no apareados, 10; número máximo de
nucleótidos considerado, 50; y número mínimo de nucleótidos
considerado, 50.
Para las secuencias de aminoácidos, se
calcularon valores de homología en tanto por ciento usando PALIGN.
Se seleccionó un valor de 10 tanto para el coste de hueco abierto
como para el coste de hueco unitario.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de amplificación por PCR de
presentación diferencial descritos en el ejemplo 9 contenían una
banda principal de aproximadamente 260 pares de bases. Se usó esta
secuencia para examinar una biblioteca de ADNc de osteosarcoma de
rata (UMR 106). Se sometieron clones positivos a análisis con
cebadores anidados para obtener las secuencias de cebadores
necesarias para amplificar el ADNc de longitud completa. (SEQ. ID
NO: 11, 12, 29, 30 y 31). Uno de los clones positivos seleccionados
para su estudio adicional se designó clon 10-4.
El análisis de secuencia del ADNc de longitud
completa en el clon 10-4, determinado mediante
análisis con cebadores anidados, mostró que el clon
10-4 contenía el fragmento de 260 pares de bases
identificado mediante PCR de presentación diferencial. El clon
10-4 (1696 pares de bases; SEQ ID NO: 2) contiene un
marco de lectura abierto de 1371 pares de bases que codifica para
una proteína que tiene 457 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). El codón de
terminación, TGA, se produce en los nucleótidos
1444-1446. La señal de poliadenilación en los
nucleótidos 1675-1680, y la cola de
poli(A)^{+} adyacente, estaba presente en la región
no codificante en 3'. Había dos posibles sitios de
N-glicosilación,
Asn-Lys-Thr y
Asn-Arg-Thr, en las posiciones de
aminoácido 113-116 y 257-259 en SEQ
ID NO: 1, respectivamente. Se hallaron dos posibles sitios de
fosforilación mediante proteínas cinasas dependientes de AMPc y
GMPc, Ser y Thr, en las posiciones de aminoácido 191 y 349,
respectivamente. Había cinco posibles sitios de fosforilación
mediante proteína cinasa C, Ser o Thr, en las posiciones de
aminoácido 3, 115, 166, 219, 442. Se determinó un posible motivo A
de sitio de unión a ATP/GTP (bucle P),
Gly-Gly-Ser-Asn-Asn-Gly-Lys-Thr,
en las posiciones de aminoácido 272-279.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Además, se hallaron dos supuestos motivos LIM
sumamente conservados en las posiciones de aminoácido
341-391 y 400-451. Los supuestos
dominios LIM en este clon de ADNc de rata recién identificado
mostraron una homología considerable con los dominios LIM de otras
proteínas LIM conocidas. Sin embargo, la homología global con otras
proteínas LIM de rata era inferior al 25%. RLMP (designado también
10-4) tiene una homología de aminoácidos del 78,5%
con respecto a la proteína enigma humana (véase la patente
estadounidense 5.504.192), pero sólo una homología de aminoácidos
del 24,5% y el 22,7% con respecto a sus homólogos de rata más
cercanos, CLP-36 y RIT-18,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fraccionaron por tamaño treinta \mug de ARN
total de ROB, preparados según los ejemplos 1 y 2, mediante
electroforesis en gel de formaldehído en geles de fondo plano de
agarosa al 1% y se transfirieron osmóticamente a membranas de
nylon. Se examinó con sonda la transferencia con un fragmento de
EcoR1 de 600 pares de bases de ADNc de 10-4 de
longitud completa marcado con ^{32}P-dCTP mediante
cebado aleatorio.
El análisis de transferencia de tipo Northern
mostró una especie de ARNm de 1,7 kb que se hibridaba con la sonda
de RLMP. El ARNm de RLMP se regulaba por incremento aproximadamente
3,7 veces en ROB tras 24 horas de exposición a
BMP-6. No se observó regulación por incremento de la
expresión de RMLP en ROB estimuladas con BMP-2 o
BMP-4 a las 24 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada resultado de nódulo/osteocalcina
notificado, se usaron datos de 5-6 pocillos de un
experimento representativo para calcular la media \pm EEM. Pueden
mostrarse gráficos con datos normalizados con respecto al valor
máximo para cada parámetro para permitir la representación gráfica
simultánea de recuentos de nódulos, zonas mineralizadas y
osteocalcina.
Para cada análisis de inmunotransferencia de
tipo Western, ensayo de protección de ARNasa o
RT-PCR notificado, se usaron datos de muestras por
triplicado de experimentos representativos para determinar la media
\pm EEM. Pueden mostrarse gráficos normalizados con respecto a o
bien el día 0 o bien controles negativos y expresarse como aumento
en veces por encima de valores control.
Se evaluó la significación estadística usando
análisis de la varianza de una vía con correcciones de Bonferroni
para comparaciones múltiples post-hoc según
fue apropiado. D. V. Huntsberger, "The Analysis of Variance",
en Elements of Statistical Variance, P. Billingsley (ed.), págs.
298-330, Allyn & Bacon Inc., Boston, MA (1977)
y Sigmastat, Jandel Scientific, Corte Madera, CA. Se definieron
niveles alfa para la significación como p < 0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon anticuerpos policlonales según los
métodos de England et al., Biochim. Biophys. Acta, 623: 171
(1980) y Timmer et al., J. Biol. Chem., 268:24863 (1993).
Se transfectaron células HeLa con pCMV2/RLMP. Se
recogió proteína de las células transfectadas según el método de
Hair et al., Leukemia Research, 20:1 (1996). Se realizó
análisis de inmunotransferencia de tipo Western de RLMP nativo tal
como se describe por Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 76:4350 (1979).
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en la secuencia del ADNc de
LMP-1 de rata, se sintetizaron cebadores de PCR
directo e inverso (SEQ ID NO: 15 y 16) y se amplificó por PCR una
secuencia de 223 pares de bases única a partir del ADNc de
LMP-1 de rata. Se aisló un producto de PCR similar
a partir de ADNc de células de osteosarcoma MG63 humanas con los
mismos cebadores de PCR.
Se recogió ARN de células de osteosarcoma MG63
hechas crecer en matraces T-75. Se eliminó mediante
aspiración el sobrenadante de cultivo y se recubrieron los matraces
con 3,0 ml de disolución de GIT por duplicado, se agitaron durante
5-10 segundos y se transfirió la disolución
resultante a tubos Eppendorf de 1,5 ml (5 tubos con 0,6 ml/tubo).
Se purificó el ARN mediante una ligera modificación de los métodos
convencionales, por ejemplo, véase Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, capítulo 7, página 19, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989) y Boden et al.,
Endocrinology, 138:2820-28 (1997). En resumen, las
muestras de 0,6 ml recibieron 60 \mul de acetato de sodio 2,0 M
(pH 4,0), 550 \mul de fenol saturado con agua y 150 \mul de
cloroformo:alcohol isoamílico (49:1). Tras la adición de esos
reactivo, se agitaron con vórtex las muestras, se centrifugaron
(10000 x. g; 20 min.; 4ºC) y se transfirió la fase acuosa a un tubo
nuevo. Se añadió isopropanol (600 \mul) y se precipitó el ARN
durante la noche a -20ºC. Se centrifugaron las muestras (10000 x g;
20 minutos) y se aspiró el sobrenadante suavemente. Se
resuspendieron los sedimentos en 400 \mul de agua tratada con
DEPC, se extrajeron una vez con fenol:cloroformo (1:1), se
extrajeron con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se
precipitaron durante la noche a -20ºC en 40 \mul de acetato de
sodio (3,0 M; pH 5,2) y 1,0 ml de etanol absoluto. Tras la
precipitación, se centrifugaron las muestras (10000 x g; 20 min.),
se lavaron una vez con etanol al 70%, se secaron al aire durante
5-10 minutos y se resuspendieron en 20 \mul de
agua tratada con DEPC. Se derivaron las concentraciones de ARN a
partir de las densidades ópticas.
Se calentó ARN total (5 \mug en un volumen
total de 10,5 \mul en DEPC-H_{2}O) a 65ºC
durante 5 minutos, y entonces se añadió a tubos que contenían 4
\mul de tampón 5X MMLV-RT, 2 \mul de dNTP, 2
\mul de cebador dT17 (10 pmol/ml), 0,5 \mul de ARNsin (40 U/ml)
y 1 \mul de MMLV-RT (200 unidades/\mul). Se
incubaron las reacciones a 37ºC durante 1 hora. Después de eso, se
inactivó el MMLV-RT mediante calentamiento a 95ºC
durante 5 minutos. Se diluyeron las muestras mediante adición de 80
\mul de agua.
Se sometieron las muestras transcritas (5
\mul) a reacción en cadena de la polimerasa usando metodologías
convencionales (volumen total de 50 \mul). Boden et al.,
Endocrinology, 138:2820-28 (1997); Ausubel et
al., "Quantitation of rare DNAs by the polymerase chain
reaction", en Current Protocols in Molecular Biology, capítulo
15,31-1, Wiley & Sons, Trenton, NJ (1990). En
resumen, se añadieron muestras a tubos que contenían agua y
cantidades apropiadas de tampón de PCR (MgCl_{2} 25 mM, dNTP,
cebadores directo e inverso (para RLMPU; SEQ ID NO: 15 y 16),
^{32}P-dCTP y ADN polimerasa. Se diseñaron los
cebadores para que funcionasen de manera constante en 22 ciclos
para la detección de bandas radiactivas y 33 ciclos para la
amplificación de producto de PCR para su uso como sonda de
exploración (94ºC, 30 s, 58ºC, 30 s; 72ºC, 20 s).
La secuenciación del producto de PCR derivado
del osteosarcoma MG63 purificado en gel de agarosa dio una secuencia
más del 95% homóloga con respecto al producto de PCR de RLMPU. Esta
secuencia se designa región única de HLMP (HLMPU; SEQ ID NO:
6).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la exploración con PCR usando
cebadores específicos (SEQ ID NO: 16 y 17) tal como se describió en
el ejemplo 7. Se purificó en gel de agarosa un producto de PCR de
MG63 de 717 pares de bases y se secuenció con los cebadores dados
(SEQ ID NO: 12, 15, 16, 17, 18, 27 y 28). Se confirmaron las
secuencias un mínimo de dos veces en ambas direcciones. Se
alinearon las secuencias de MG63 entre sí y luego frente a la
secuencia de ADNc de LMP de rata de longitud completa para obtener
una secuencia de ADNc de LMP humana parcial (SEQ ID NO: 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en experimentos de transferencia de
tipo Northern, se determinó que LMP-1 se expresa a
niveles diferentes por varios tejidos diferentes, incluyendo
músculo cardiaco humano. Se examinó por tanto una biblioteca de
ADNc de corazón humano. Se sembró en placa la biblioteca a 5 x
10^{4} ufp/ml sobre placas de agar (agar de fondo LB) y se
hicieron crecer las placas durante la noche a 37ºC. Se recubrieron
las placas con membranas filtrantes durante dos minutos. Después de
eso, se desnaturalizaron los filtros, se enjuagaron, se secaron, se
reticularon mediante UV y se incubaron en tampón de prehibridación
(2X PIPES [pH 6,5]; formamida al 5%, SDS al 1%, ADN de esperma de
salmón desnaturalizado 100 g/ml) durante 2 h a 42ºC. Se añadió una
sonda radiomarcada, de LMP única, de 223 pares de bases (^{32}P,
marcaje por cebado aleatorio; SEQ ID NO: 6) y se hibridó durante 18
h a 42ºC. Tras la hibridación, se lavaron las membranas una vez a
temperatura ambiente (10 min., 1 x SSC, SDS al 0,1%) y tres veces a
55ºC (15 min., 0,1 x SSC, SDS al 0,1%). Se rescataron clones de la
biblioteca de corazón purificados por placa dobles positivos,
identificados mediante autorradiografía, como fagémidos lambda
según los protocolos de los fabricantes (Stratagene, La Jolla,
CA).
Los digestos de restricción de clones positivos
produjeron insertos de ADNc de tamaños variables. Se seleccionaron
insertos mayores de 600 pares de bases de longitud para la
exploración inicial mediante secuenciación. Se secuenciaron esos
insertos mediante métodos convencionales tal como se describió en el
ejemplo 11.
Un clon, el número 7, se sometió también a
análisis de secuencia automatizado usando cebadores correspondientes
a SEQ ID NO: 11-14, 16 y 27. Las secuencias
obtenidas mediante estos métodos eran rutinariamente homólogas en
el 97-100%. El clon 7 (ADNc de LMP-1
humana parcial de una biblioteca de corazón; SEQ. ID NO: 8) contenía
una secuencia que era homóloga en más del 87% con respecto a la
secuencia de ADNc de LMP de rata en la región traducida.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron regiones solapantes de la secuencia de
ADNc de células de osteosarcoma humanas MG63 y la secuencia del
clon 7 de ADNc de corazón humano para alinear esas dos secuencias y
derivar una secuencia de ADNc humano completa de 1644 pares de
bases. Se usó NALIGN, un programa del paquete de software PCGENE,
para alinear las dos secuencias. Las regiones solapantes de las dos
secuencias constituían aproximadamente 360 pares de bases que
tenían homología completa excepto por una sustitución de un único
nucleótido en el nucleótido 672 en el ADNc de MG63 (SEQ ID NO: 7)
teniendo el clon 7 una "A" en lugar de una "G" en el
correspondiente nucleótido 516 (SEQ ID NO: 8).
Se unieron las dos secuencias alineadas usando
SEQIN, otro subprograma de PCGENE, usando la sustitución "G"
del clon de ADNc de osteosarcoma MG63. Se muestra la secuencia
resultante en SEQ ID NO: 9. Se consiguió la alineación de la
secuencia novedosa derivada de ser humano con el ADNc de
LMP-1 de rata con NALIGN. La secuencia de ADNc de
LMP-1 humana de longitud completa (SEQ. ID NO: 9) es
homóloga en el 87,3% con respecto a la parte traducida de la
secuencia de ADNc de LMP-1 de rata.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la secuencia de aminoácidos
supuesta de LMP-1 humana con el subprograma TRANSL
de PCGENE. El marco de lectura abierto en SEQ ID NO: 9 codifica
para una proteína que comprende 457 aminoácidos (SEQ. ID NO: 10).
Usando el subprograma Palign de PCGENE, se halló que la secuencia de
aminoácidos de LMP-1 humana era homóloga en el
94,1% con respecto a la secuencia de aminoácidos de
LMP-1 de rata.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó el ADNc en 5' de MG63 mediante
RT-PCR anidada de ARN total de MG63 usando un
protocolo de amplificación rápida en 5' de extremos de ADNc (5'
RACE). Este método incluyó la síntesis de ADNc de la primera cadena
usando un cebador de oligo (dT)
"lock-docking" con dos posiciones de
nucleótidos degenerados en el extremo 3' (Chenchik et al.,
CLONTECHniques, X:5 (1995); Borson et al., PC Methods
Applic., 2:144 (1993)). Se realiza la síntesis de la segunda cadena
según el método de Gubler et al., Gene, 25:263 (1983), con un
cóctel de ADN polimerasa I de Escherichia coli, ARNasa H y
ADN ligasa de E. coli. Tras la creación de extremos romos
con ADN polimerasa de T4, se ligó el ADNc bicatenario al fragmento
(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGG
CAGGT-3') (SEQ. ID NO: 19). Antes de RACE, se diluyó el ADNc ligado al adaptador hasta una concentración adecuada para las reacciones de Marathon RACE (1:50). Entonces, el ADNc bicatenario ligado al adaptador estaba listo para clonarse específicamente.
CAGGT-3') (SEQ. ID NO: 19). Antes de RACE, se diluyó el ADNc ligado al adaptador hasta una concentración adecuada para las reacciones de Marathon RACE (1:50). Entonces, el ADNc bicatenario ligado al adaptador estaba listo para clonarse específicamente.
Se realizó la PCR de primera ronda con el
oligonucleótido específico de adaptador,
5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
(AP1) (SEQ. ID NO: 20) como cebador sentido y un cebador específico
de gen (GSP) a partir de la región única descrita en el ejemplo 16
(HLMPU). Se realizó la segunda ronda de PCR usando unos cebadores
anidados GSP1-HLMPU (cebador inverso/antisentido)
(SEQ. ID NO: 23) y GSP2-HLMPUF (SEQ. ID NO: 24)
(véase el ejemplo 16; cebador directo/sentido). Se realizó la PCR
usando un kit comercial (kit Advantage cDNA PCR core; Clone Tech
Laboratories Inc., Palo Alto, CA) que utiliza un protocolo de
inicio en caliente mediado por anticuerpos, pero convencional por
lo demás. Las condiciones de PCR para el ADNc de MG63 incluían una
desnaturalización de inicio en caliente inicial (94ºC, 60 s)
seguida de: 94ºC, 30 s; 60ºC, 30 s; 68ºC, 4 min.; 30 ciclos. El
producto de PCR de primera ronda tenía aproximadamente 750 pares de
bases de longitud mientras que el producto de PCR anidada tenía
aproximadamente 230 pares de bases. Se clonó el producto de PCR de
primera ronda en el vector pCR 2.1 linealizado (3,9 Kb). Se
secuenciaron los insertos en ambas direcciones usando cebadores
inverso y directo M13 (SEQ. ID NO: 12; SEQ. ID NO: 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Se alinearon la secuencia de UTR en 5' del ADNc
de células de osteosarcoma humanas MG63 solapante (SEQ ID NO: 21),
la secuencia de 717 pares de bases de MG63 (ejemplo 17; SEQ ID NO:
8) y la secuencia del clon 7 de ADNc de corazón humano (ejemplo 18)
para derivar una secuencia de ADNc humano novedosa de 1704 pares de
bases (SEQ. ID NO: 22). Se consiguió la alineación con NALIGN,
(tanto PCGENE como Omiga 1,0; Intelligenetics). Las secuencias
solapantes constituían casi toda la región de 717 pares de bases
(ejemplo 17) con una homología del 100%. Se consiguió la unión de
las secuencias alineadas con SEQIN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la construcción del vector de
expresión pHIS-5ATG LMP-1s con las
secuencias descritas en los ejemplos 17 y 18. Se digirió el clon de
717 pares de bases (ejemplo 17; SEQ ID NO: 7) con ClaI y EcoRV. Se
purificó en gel un pequeño fragmento (\sim250 pares de bases). Se
digirió el clon 7 (ejemplo 18; SEQ ID NO: 8) con ClaI y XbaI y se
purificó en gel un fragmento de 1400 pares de bases. Se ligaron los
fragmentos de restricción de 1400 pares de bases y 250 pares de
bases aislados para formar un fragmento de \sim1650 pares de
bases.
Debido a la sustitución de un único nucleótido
en el clon 7 (en relación con la secuencia de PCR de 717 pares de
bases y la secuencia de rata original), resultó un codón de parada a
las 672 pares de bases traducidas. Debido a este codón de parada,
se codificó una proteína truncada (corta), de ahí el nombre
LMP-1s. Este fue el constructo usado en el vector
de expresión (SEQ ID NO: 32). Se creó la secuencia de ADNc de
longitud completa con UTR en 5' (SEQ ID NO: 33) mediante la
alineación de SEQ ID NO: 32 con la secuencia RACE en 5' (SEQ ID NO:
21). Entonces se dedujo la secuencia de aminoácidos de
LMP-1s (SEQ ID NO: 34) como una proteína de 223
aminoácidos y se confirmó mediante inmunotransferencia de tipo
Western (como en el ejemplo 15) que migraba al peso molecular
pronosticado de \sim23,7 kD.
Se digirió el vector pHis-ATG
(InVitrogen, Carlsbad, CA) con EcoRV y XbaI. Se recuperó el vector y
entonces se ligó el fragmento de restricción de 1650 pares de bases
en el pHis-ATG linealizado. Se clonó y se amplificó
el producto ligado. El vector de expresión
pHis-ATG-LMP-1s,
también designado pHIS-A con inserto de
HLMP-1s, se purificó mediante métodos
convencionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron células calváricas de rata y se
hicieron crecer en cultivo secundario según el ejemplo 1. Los
cultivos o bien no se estimularon o bien se estimularon con
glucocorticoide (GC) tal como se describió en el ejemplo 1. Se usó
una modificación del protocolo de transfección Superfect Reagent
(Qiagen, Valencia, CA) para transfectar 3 \mug/pocillo de cada
vector en cultivos secundarios de osteoblastos calváricos de rata
según el ejemplo 25.
Se visualizaron los nódulos mineralizados
mediante tinción de Von Kossa, tal como se describió en el ejemplo
3. La sobreexpresión del producto del gen de LMP-1s
humana sola indujo la formación de nódulos óseos (\sim203
nódulos/pocillo) in vitro. Los niveles de nódulos eran
aproximadamente el 50% de los inducidos por el control positivo con
GC (\sim412 nódulos/pocillo). Otros controles positivos incluían
el vector de expresión
pHisA-LMP-Rat (\sim152
nódulos/pocillo) y el vector de expresión
pCMV2/LMP-Rat-Fwd (\sim206
nódulos/pocillo), mientras que los controles negativos incluían el
vector de expresión
pCMV2/LMP-Rat-Rev (\sim2
nódulos/pocillo) y placas no tratadas (NT) (\sim4
nódulos/pocillo). Estos datos demuestran que el ADNc humano era al
menos tan osteoinductor como el ADNc de rata. El efecto era
inferior al observado con la estimulación con GC, lo más
probablemente debido a dosis subóptimas de vector de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cortó el ADNc de LMP de rata en el clon
10-4 (véase el ejemplo 12) del vector mediante
digestión doble del clon con NotI y ApaI durante la noche a 37ºC.
Se digirió el vector pCMV2 MCS (InVitrogen, Carlsbad, CA) con las
mismas enzimas de restricción. Se purificaron en gel tanto el
fragmento de ADNc lineal del clon 10-4 como pCMV2,
se extrajeron y se ligaron con ligasa de T4. Se purificó en gel el
ADN ligado, se extrajo y se usó para transformar células E.
coli JM109 para la amplificación. Se recogieron colonias
positivas en agar, se digirieron con NotI y ApaI y se examinaron
los digestos de restricción mediante electroforesis en gel. Se
prepararon cultivos de reserva de clones positivos.
Se preparó un vector inverso de manera análoga
excepto porque las enzimas de restricción usadas fueron XbaI y
HindIII. Debido a que se usaron estas enzimas de restricción, se
insertó el fragmento de ADNc de LMP del clon 10-4
en pRc/CMV2 en la orientación inversa (es decir, no traducible). El
vector recombinante producido se designa pCMV2/RLMP.
Se resuspendió un volumen apropiado de
pCMV10-4 (es óptima una concentración final de 60 nM
[3\mug]; para este experimento se prefiere un intervalo de
concentración final de 0-600 nM/pocillo
[0-30 \mug/pocillo]) en medio Eagle mínimo (MEM)
hasta un volumen final de 450 \mul y se agitó con vórtex durante
10 segundos. Se añadió Superfect (disolución final de 7,5
\mul/ml), se agitó con vórtex la disolución durante 10 segundos y
entonces se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras
esta incubación, se añadió MEM complementado con FBS al 10% (1
ml/pocillo; 6 ml/placa) y se mezcló mediante pipeteo.
Entonces se pipeteó inmediatamente la disolución
resultante (1 ml/pocillo) sobre cultivos de ROB lavados. Se
incubaron los cultivos durante 2 horas a 37ºC en una atmósfera
humidificada que contenía CO_{2} al 5%. Después de eso, se
lavaron suavemente las células una vez con PBS estéril y se añadió
el medio de incubación normal apropiado.
Los resultados demostraron una formación de
nódulos óseos significativa en todos los cultivos de células de
rata que se indujeron con pCMV10-4. Por ejemplo,
células transfectadas con pCMV10-4 produjeron 429
nódulos/pocillo. Cultivos control positivo, que se expusieron a
Trm, produjeron 460 nódulos/pocillo. En cambio, los controles
negativos, que no recibieron tratamiento, produjeron 1
nódulo/pocillo. De manera similar, cuando se transfectaron cultivos
con pCMV10-4 (inverso), no se observaron
nódulos.
Para demostrar la osificación de novo in
vivo, se aspiró la médula de extremidades traseras de ratas
normales de 4-5 semanas de edad (rnu/+;
heterocigotas para el estado atímico recesivo). Se lavaron las
células de la médula ósea aspiradas en MEM alfa, se centrifugaron y
se lisaron los RBC resuspendiendo el sedimento en NH_{4}Cl al
0,83% en Tris 10 mM (pH 7,4). Se lavaron las células de la médula
restantes 3x con MEM y se transfectaron durante 2 horas con 9
\mug de pCMV-LMP-1s (orientación
inversa o directa) por 3 x 10^{6} células. Entonces se lavaron
las células transfectadas 2X con MEM y se resuspendieron a una
concentración de 3 x 10^{7} células/ml.
Se aplicó la suspensión celular (100 \mul)
mediante una pipeta estéril a un disco de colágeno bovino de tipo 1
de 2 x 5 mm estéril (Sulzer Orthopaedics, Wheat Ridge, CO). Se
implantaron quirúrgicamente los discos por vía subcutánea en el
cráneo, pecho, abdomen o columna vertebral de ratas atímicas de
4-5 semanas de edad (rnu/rnu). Se sacrificaron los
animales a las 3-4 semanas, momento en el que se
extrajeron los discos o las zonas quirúrgicas y se fijaron en
etanol al 70%. Se analizaron las muestras fijadas mediante
radiografía y se realizó el examen histológico no descalcificado
sobre secciones de 5 \mum de grosor teñidas con Goldner
Trichrome. También se realizaron experimentos usando matriz ósea
desmineralizada desvitalizada (extraída con guanidina) (Osteotech,
Shrewsbury, NJ) en lugar de discos de
colágeno.
colágeno.
La radiografía reveló un alto nivel de
osificación mineralizada que se conformaba a la forma del disco de
colágeno original que contenía células de la médula transfectadas
con LMP-1s. No se observó osificación mineralizada
en el control negativo (células transfectadas con una versión
orientada de manera inversa del ADNc de LMP-1s que
no codificaba para una proteína traducida), y la absorción del
portador parecía estar en marcha.
La histología reveló nuevas trabéculas óseas
recubiertas con osteoblastos en los implantes transfectados con
LMP-1. No se observó hueso junto con la resorción
parcial del portador en los controles negativos.
La radiografía de un experimento adicional en el
que se añadieron 18 conjuntos (9 controles negativos de
pCMV-LMP-REV y 9
pCMV-LMP-1s experimentales) de
implantes a sitios que alternaban entre la columna torácica y la
lumbar en ratas atímicas mostró que 0/9 implantes control negativo
presentaban osificación (artrodesis vertebral) entre vértebras. Los
nueve implantes tratados con
pCMV-LMP-1s presentaban artrodesis
óseas sólidas entre vértebras.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió el clon de 717 pares de bases
(ejemplo 17) con ClaI y EcoRV (New England Biologicals, city, MA).
Se purificó en gel un fragmento pequeño (\sim250 pares de bases).
Se digirió el clon nº 7 (ejemplo 18) con ClaI y XbaI. Se purificó
en gel un fragmento de 1400 pares de bases a partir de ese digesto.
Se ligaron los fragmentos de ADNc de 1400 pares de bases y de 250
pares de bases aislados mediante métodos convencionales para formar
un fragmento de \sim1650 pb. Se digirió el vector
pHis-A (InVitrogen) con EcoRV y XbaI. Se recuperó
el vector linealizado y se ligó al fragmento de ADNc de 1650 pares
de bases quimérico. Se clonó el producto ligado y se amplificó
mediante métodos convencionales, y el vector de expresión
pHis-A-5' ATG
LMP-1s, también denominado el vector
pHis-A con inserto de HLMP-1s, se
depositó en la ATCC tal como se describió anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron células calváricas de rata y se
hicieron crecer en cultivo secundario según el ejemplo 1. Los
cultivos o bien se estimularon o bien no se estimularon con
glucocorticoide (GC) según el ejemplo 1. Se transfectaron los
cultivos con 3 \mug de ADN de vector pHis-A
recombinante/pocillo tal como se describió en el ejemplo 25. Se
visualizaron los nódulos mineralizados mediante tinción de Von Kossa
según el ejemplo 3.
La sobreexpresión del producto del gen de
LMP-1s humano sola (es decir, sin estimulación con
GC) indujo la formación de nódulos óseos significativa (\sim203
nódulos/pocillo) in vitro. Esto es aproximadamente el 50% de
la cantidad de nódulos producidos por las células expuestas al
control positivo con GC (\sim412 nódulos/pocillo). Se obtuvieron
resultados similares con cultivos transfectados con el vector de
expresión pHisA-LMP-Rat (\sim152
nódulos/pocillo) y pCMV2/LMP-Rat-Fwd
(\sim206 nódulos/pocillo). Por el contrario, el control negativo
pCMV2/LMP-Rat-Rev produjo (\sim2
nódulos/pocillo), mientras que se observaron aproximadamente 4
nódulos/pocillo en las placas no tratadas. Estos datos demuestran
que el ADNc de LMP-1 humano era al menos tan
osteoinductor como el ADNc de LMP-1 de rata en este
sistema de modelo. El efecto en este experimento era inferior al
observado con la estimulación con GC; pero en cierto modo el efecto
era comparable.
\vskip1.000000\baselineskip
La sobreexpresión de RLMP-1 o
HLMP-1s en cultivos de osteoblastos calváricos de
rata tal como se describió en el ejemplo 24 dio como resultado una
formación de nódulos significativamente mayor que la observada en
el control negativo. Para estudiar el mecanismo de acción de la
proteína de mineralización LIM se recogió el medio condicionado en
diferentes puntos de tiempo, se concentró hasta 10 X, se filtró de
manera estéril, se diluyó hasta su concentración original en medio
que contenía suero fresco y se aplicó durante cuatro días a células
no transfectadas.
Los medios condicionados recogidos de células
transfectadas con RLMP-1 o HLMP-1s
en el día 4 eran aproximadamente tan eficaces para inducir la
formación de nódulos como la sobreexpresión directa de
RLMP-1 en células transfectadas. Los medios
condicionados de células transfectadas con RLMP-1 o
HLMP-1 en la orientación inversa no tenían efecto
aparente sobre la formación de nódulos. Los medios condicionados
recogidos a partir de cultivos transfectados con
LMP-1 antes del día 4 tampoco indujeron la formación
de nódulos. Estos datos sugieren que la expresión de
LMP-1 provocaba la síntesis y/o secreción de un
factor soluble, que no aparecía en el medio de cultivo en
cantidades eficaces hasta 4 días tras la transfección.
Puesto que la sobreexpresión de
rLMP-1 dio como resultado la secreción de un factor
osteoinductor en el medio, se usó análisis de inmunotransferencia
de tipo Western para determinar si la proteína LMP-1
estaba presente en el medio. Se evaluó la presencia de la proteína
rLMP-1 usando anticuerpo específico para
LMP-1 (QDPDEE) y se detectó mediante medios
convencionales. Se halló la proteína LMP-1 sólo en
la capa de células del cultivo y no se detectó en el medio.
Se consiguió la purificación parcial del factor
soluble osteoinductor mediante cortes convencionales con sulfato de
amonio al 25% y al 100% seguido de cromatografía discontinua de
intercambio aniónico DE-52 (NaCl 100 mM o 500 mM).
Se observó toda la actividad en las fracciones de alto contenido en
sulfato de amonio, de alto contenido en NaCl. Tal localización
concuerda con la posibilidad de que un único factor sea el
responsable para condicionar el medio.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Hair, Gregory A.
\hskip1cmBoden, Scott D.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sistemas de expresión, vectores,
ADN, proteínas de mineralización ósea novedosos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 06148.0115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/054.219
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-07-1997
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/080.407
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
02-04-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 457
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1696
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR de presentación
diferencial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagctttttt tttttg
\hfill16
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR de presentación
diferencial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcttggct atg
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 717
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1644
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 457
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccagggttt tcccagtcac ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccagggttt tcccagtcac ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttagcaga gcccagcctg ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatgaactc tgtgcccgtg ag
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccttgctc acctcacggg
\hfill20
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<210> 16
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcactgtgct ggttttgtct gg
\hfill22
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatggattcc ttcaaggtag tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttttgtctg gggcagagcg
\hfill20
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación
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<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt
\hfill44
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipccatcctaat acgactcact atagggc
\hfill27
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 765
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1689
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcactgtgct cgttttgtcc gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccttgctca cctcacgggc a
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctcatccg ggtcttgcat gaactcggtg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación
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<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcccccgccc gctgacagcg ccccgcaa
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccttgctca cctcacgggc accg
\hfill24
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaatacgac tcactatagg gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggctgatg gagaatactg aag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcttgtggc actggtggca tac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgtcgggt cagcactgtg ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
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<211> 1620
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1665
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcactacctt gaaggaatcc atggt
\hfill25
Claims (34)
1. Molécula de ácido nucleico aislada que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
de mineralización LIM humana que contiene un dominio LIM y potencia
la osificación, hibridándose la molécula de ácido nucleico en
condiciones de hibridación convencionales con una molécula de ácido
nucleico complementaria a la longitud completa de la SEQ. ID NO:
26.
2. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 1, comprendiendo la molécula de ácido nucleico
aislada la SEQ ID NO: 33.
3. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 1, comprendiendo la molécula de ácido nucleico
aislada la SEQ ID NO: 22.
4. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 1, que comprende la SEQ ID NO: 9.
5. Proteína de mineralización LIM humana
codificada por una molécula de ácido nucleico aislada según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Proteína de mineralización LIM humana según
la reivindicación 5, que comprende una secuencia de aminoácidos de
la SEQ ID NO: 10.
7. Molécula de ácido nucleico aislada que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
de mineralización LIM de rata que contiene un dominio LIM y
potencia la osificación, hibridándose la molécula de ácido nucleico
aislada en condiciones convencionales con una molécula de ácido
nucleico complementaria a la longitud completa de la SEQ. ID NO:
2.
8. Proteína de mineralización LIM de rata
codificada por una molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 7.
9. Proteína de mineralización LIM de rata según
la reivindicación 8, que comprende la secuencia de aminoácidos de
la SEQ ID NO: 1.
10. Vector que comprende la molécula de ácido
nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó
7.
11. Célula huésped que comprende el vector según
la reivindicación 10, seleccionándose la célula huésped del grupo
que consiste en células procariotas, células de levadura y células
de mamífero.
12. Molécula de ácido nucleico aislada según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 7, que comprende además
un marcador para la detección.
13. Anticuerpo monoclonal o policlonal
específico para una proteína de mineralización LIM según una
cualquiera de las reivindicaciones 5, 8 ó 9.
14. Anticuerpo monoclonal o policlonal según la
reivindicación 13, siendo la proteína de mineralización LIM la SEQ
ID NO: 10.
15. Uso de una molécula de ácido nucleico según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 7, que codifica para
la proteína de mineralización LIM para la preparación de una
composición para transfectar células precursoras osteogénicas para
su uso en la inducción de osificación.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que la
molécula de ácido nucleico aislada está en un vector.
17. Uso según la reivindicación 16, en el que el
vector se selecciona de un vector de expresión, un plásmido, un
virus, un adenovirus o un retrovirus.
18. Uso según la reivindicación 15, en el que
las células precursoras osteogénicas se transfectan ex
vivo.
19. Uso según la reivindicación 15, en el que
las células precursoras osteogénicas se transfectan in vivo
mediante inyección directa de la molécula de ácido nucleico
aislada.
20. Uso según la reivindicación 15, en el que la
molécula de ácido nucleico aislada está en un vector seleccionado
del grupo que consiste en un plásmido y un virus.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que el
vector es un plásmido, inyectándose dicho plásmido directamente en
el tejido muscular.
22. Uso según la reivindicación 15, en el que la
proteína de mineralización LIM es la SEQ ID NO: 10.
23. Uso según la reivindicación 15, en el que la
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de
mineralización LIM es la SEQ ID NO: 22 o la SEQ ID NO: 33.
24. Uso de una molécula de ácido nucleico
aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 7, que
codifica para una proteína de mineralización LIM para la preparación
de una composición para transfectar células precursoras
osteogénicas para su uso en artrodesis vertebral.
25. Uso según la reivindicación 24, en el que
las células precursoras osteogénicas se transfectan ex
vivo.
26. Uso según la reivindicación 24, en el que la
proteína de mineralización LIM se selecciona del grupo que consiste
en la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 34 y la SEQ ID NO: 1.
27. Uso de un vector que se mantiene de manera
estable en células precursoras osteogénicas, comprendiendo el vector
una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, ó 7, que codifica para una proteína de
mineralización LIM y un promotor regulable, controlando el promotor
regulable, que responde a un compuesto de control exógeno, la
expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para la
proteína de mineralización LIM, para la preparación de una
composición para transfectar células precursoras osteogénicas para
su uso en la inducción de osificación sistémica en un huésped
mamífero.
28. Uso según la reivindicación 27, en el que la
proteína de mineralización LIM se selecciona del grupo que consiste
en la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 34 y la SEQ ID NO: 1.
29. Método in vitro de estimulación de la
producción de un factor soluble osteogénico por una célula
osteogénica, que comprende:
- (a)
- transfectar la célula osteogénica con una molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, ó 7 y
- (b)
- sobreexpresar la molécula de ácido nucleico aislada.
30. Método in vitro de inhibición de la
expresión de la proteína de mineralización LIM según una cualquiera
de las reivindicaciones 5, 8 ó 9, que comprende transfectar una
célula en el que la proteína de mineralización LIM se expresa con
un oligonucleótido antisentido.
31. Método según la reivindicación 30, en el que
el oligonucleótido antisentido tiene la secuencia de nucleótidos
expuesta en la SEQ ID NO: 35.
32. Uso de una molécula de ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 7, para preparar una
composición para transfectar una célula osteogénica para su uso en
la estimulación de la producción de un factor soluble osteogénico
por la célula osteogénica.
33. Uso de un oligonucleótido antisentido para
preparar una composición para inhibir la expresión de la proteína
de mineralización LIM según cualquiera de las reivindicaciones 5, 8
ó 9 en una célula.
34. Uso según la reivindicación 33, en el que el
nucleótido antisentido tiene la secuencia de nucleótidos expuesta
en la SEQ ID NO:35.
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