JP2001512019A - 新規な骨鉱化蛋白質、dna、ベクター及び発現系 - Google Patents
新規な骨鉱化蛋白質、dna、ベクター及び発現系Info
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Abstract
Description
特に本発明は、生体外及び生体内で骨鉱化の効力を促進する新規な蛋白質群及び
これらの蛋白質をコードする核酸に関する。本発明は更に、骨及び骨組織に関す
る様々な病理状態を処理する方法(例えば脊椎固定術、骨折修復及び骨粗鬆症の
処理)を提供する。 2.背景技術 骨芽細胞は多能性間充織幹細胞から分化すると考えられている。骨芽細胞が成
熟すると、骨を鉱化形成する細胞外基質が分泌される。この複雑な過程がどのよ
うに制御されているのかはよく理解されていないが、骨形態形成蛋白質(BMP
)として知られる信号糖蛋白群が関与していると考えられている。これらの蛋白
質は、胎芽の背側−腹側パターン形成、肢芽発達及び成体動物の骨折修復に関与
することが示されている[B.L.Hogan、Genes&Develop. 10:1580(1996)]。このβ超科型トランスフォーミング増殖因子分
泌性蛋白質群は、分化の異なる段階にある様々な種類の細胞において様々な活性
を有するが、これら密接に関連する分子間における生理活性の違いは明らかにさ
れていない[D.M.Kingsley、Trends Genet.10:1
6(1994)]。
めに、ラット頭蓋冠骨芽細胞分化の誘発について、BMP−6の効能と、BMP
−2及びBMP−4の効能とを比較した[Boden他、Endocrinol ogy 137:3401(1996)参照]。この研究には、分化の開始にBM
P又はグルココルチコイドを必要とするラット胎児頭蓋冠の第一継代の培養(二
次培養)を用いた。この膜性骨形成のモデルにおいて、グルココルチコイド(G
C)又はBMPによって、骨芽細胞特異的蛋白質であるオステオカルシンの分泌
が可能な鉱化骨小結節の分化が開始される。この二次培養系は、自然分化を経た
一次ラット骨芽細胞培養とは性質が異なる。この二次培養系においては、グルコ
コルチコイドによって、10倍量のBMP―6 mRNA及び蛋白質発現が誘発
され、骨芽細胞分化が促進された[Boden他、Endocrinology 138:2920(1997)]。
導く一連の事象において役割を担っているようである。細胞内調節分子の主なも
のにLIM蛋白質があり、LIM領域として知られる特徴的な構造パターンを有
するためにそのような呼び名がある。LIM領域は、2−アミノ酸スペーサーに
よって連結している2個の特異なジンクフィンガーによって構成される、システ
インに富んだ構造パターンである。LIM領域のみを有する蛋白質もあるが、様
々な機能領域を更に有する蛋白質もある。LIM蛋白質は多種存在し、それには
転写因子及び細胞骨格蛋白質が含まれる。LIM領域の主要な役割は、LIM領
域と同一な又は異なるニ量体の形成を通じた、又は特異な蛋白質との結合による
、蛋白質−蛋白質間相互作用の媒介であると思われる。
型領域配列を有する蛋白質において、LIM領域は負の調節因子として作用する
。LIM同型領域蛋白質は、細胞系統決定の制御や分化の調節に関与しているが
、LIMのみの蛋白質も同様の機能を有する。LIMのみの蛋白質は、そのよう
な蛋白質をコードする遺伝子の幾つかが腫瘍染色体転座に関与しているので、細
胞増殖の制御にも影響を与えている。
傷をする可能性のある動物である。例えば、自然の骨修復機能を刺激することの
できる新しい治療法が有れば、骨折の治療は改善され、これによって骨折の治癒
にかかる時間が短縮される。他には例えば、骨粗鬆症などの全身性の骨疾患にか
かった者は、全身にわたって新しい骨を形成する治療法が有れば恩恵を受けるこ
とができる。このような治療法によって、この種の疾患に特徴的な多量の骨成分
損失に由来する骨折事故を避けることができる。
、BMP等の細胞外因子が研究されてきた。BMP及び他の細胞外信号分子につ
いて研究初期には大きな成果が得られたにもかかわらず、それらの使用には数多
くの欠点が存在する。例えば、新しい骨形成には精製BMPの比較的大量な投与
が必要であり、従ってそのような治療法には経費がかかる。更に、細胞外蛋白質
は、宿主動物に導入されると分解されやすい。加えて、そうした蛋白質はたいて
いは免疫原となるので、投与した蛋白質に対する免疫応答を刺激する可能性があ
る。
法の実現が望まれる。遺伝子治療分野における進歩によって、骨形成過程の一部
を構成する細胞内信号をコードする核酸断片を、骨形成前駆細胞(すなわち骨形
成に関与する細胞)内に導入することが可能になった。骨形成に遺伝子治療を用
いることによって、(1)費用が削減できる;(2)細胞内信号を長期間発現す
ることができるので、細胞外因子を用いた治療法と比較して、より大きな効果が
得られる;(3)細胞外信号による治療では信号の受容体数が限られていること
で治療が制限されるがそれを回避できる;(4)局所的な骨形成が必要な部位に
、トランスフェクトした潜在的骨形成細胞を直接投与することが可能になる;そ
して(5)全身性の骨形成が可能になり、骨粗鬆症や他の代謝骨疾患に対する治
療法を提供することが可能になる、などの数多くの利点が提供される可能性があ
る。
た骨形成を誘導する新規な構成と方法を提供することによって、先行技術の欠点
を克服することを目的とする。本出願者らは、刺激を加えたラット頭蓋冠骨芽細
胞培養から単離したものを元にした配列を有する新規なLIM遺伝子である、1
0−4/RLMP(配列番号1、配列番号2)を発見した。遺伝子をクローンし
、配列決定し、生体外で骨鉱化効果を促進する能力についてアッセイを行った。
蛋白質RLMPは骨基質の鉱化に影響を与えただけでなく、細胞の骨芽系統への
分化にも影響を与えた。例えば公知の他のサイトカインとは違って、BMPやR
LMPは分泌性蛋白質ではないが、細胞内信号分子である。この特徴によって、
細胞内信号増幅が提供されるという利点があるだけでなく、トランスフェクトし
た細胞の評価が容易に行えるという利点もある。これら蛋白質の使用は、より効
果的で特異な生体内の用途にも適している。好ましい臨床用途としては、骨折、
骨欠損、骨移植回復の促進及び骨粗鬆症の患者における正常な恒常性の促進が挙
げられる。
遺伝子をクローンし、配列決定し、アミノ酸配列を推定した。ヒト蛋白質によっ
て、生体外及び生体内での骨鉱化効果が促進されることが実証される。
1sと称する)についても特徴付けを行った。この短縮版はcDNAクローン源
のひとつにおける点突然変異(蛋白質を短縮する停止コドンを提供する)から得
られたものである。短縮版(LMP−1s)は細胞培養内及び生体内で発現され
た場合十分に機能する。
になるところもあるし、あるいは本発明の実施によって理解されるであろうとこ
ろもある。本発明の目的及び他の利点は、ここに記載の説明及び請求項で特に指
摘する方法及び構成によって実現及び達成される。
配列を包含する単離核酸分子にして、配列番号25の全長に相補的な核酸分子に
標準条件下でハイブリダイズし、そして配列番号26の全長に相補的な核酸分子
に強度の緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子に関する。特異な特徴にあっ
ては、単離核酸分子はHLMP−1、HLMP−1s又はRLMPをコードする
。加えて、本発明はこれらの核酸分子を包含するベクター、及びベクターを包含
する宿主細胞も企図している。他の特異的な特徴にあっては、本発明は蛋白質自
体に関する。
等のLIM鉱化蛋白質に特異的な抗体に関する。一つの特異な特徴にあっては、
抗体はポリクローナル抗体である。他の特異な特徴にあっては、抗体はモノクロ
ーナル抗体である。
ド配列を包含する単離核酸分子によって骨形成前駆細胞のトランスフェクトが行
われる、骨形成誘発の方法に関する。一つの特異な特徴にあっては、単離核酸分
子はベクター(プラスミド又はアデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルス
)内にある。トランスフェクションはエクスビボ(ex vivo)又は生体内で単離 核酸分子を直接投与することで行われる。トランスフェクトした単離核酸分子は
HLMP−1、HLMP−1s又はRLMPをコードする。
ド配列を有する単離核酸分子で骨形成前駆細胞をトランスフェクトし、トランス
フェクトした骨形成前駆細胞を基質と混合し、そしてその基質を脊椎に接触させ
ることを含む脊椎固定の方法に関する。
トランスフェクトすることによって全身骨形成を誘発する方法に関する。
項に記載の発明を更に説明することを企図していることが理解されよう。
称する)に関する。本発明は特に、HLMP又はHLMP−1として知られるヒ
トLMPに関する。本出願者らは、これらの蛋白質が生体外で育成される哺乳類
細胞内の骨鉱化を促進することを発見した。哺乳類内で産生される場合には、L
MPは生体内での骨形成も誘発する。
る核酸でエクスビボトランスフェクションし、次いでこのトランスフェクトされ
た細胞をドナーに移植することは、様々な骨関連疾患又は損傷の治療に適してい
る。例えばこの方法を、長骨骨折修復の増強;体節欠陥部分における骨の形成;
骨折治療用の代用骨移植片の提供;腫瘍再建術又は脊椎固定術の促進;及び臀部
、椎骨又は手関節の骨粗鬆症などにおける、脆弱化骨又は骨粗鬆症骨の(注射に
よる)局所的治療の提供に用いることができる。LMP又はHLMPをコードす
る核酸を用いたトランスフェクションは、長骨の骨折修復を促進することを目的
とする、トランスフェクトした骨髄細胞の経皮注射;長骨骨折における癒合の遅
延又は非癒合の治療、あるいは脊椎固定における偽関節の治療;及び臀部又は膝
関節の無血管壊死における新しい骨形成の誘発、においても有用である。
する核酸配列を包含する組替えDNAベクターによるトランスフェクトを、生体
内で行うことができる。LMP又はHLMPをコードするDNA断片を適当なウ
イルスベクター(例えばアデノウイルスベクター)に挿入し、得られるウイルス
構造体を軟骨内性骨形成が望まれる体の部位に直接に注射することができる。L
MP又はHLMP配列を導入する直接的な経皮注射を用いることによって、(エ
クスビボでトランスフェクトするための)骨髄細胞の入手や新しい骨形成が必要
とされる患者の部位へのそれらの移植を目的とした外科的な処理を行う必要なく
、骨形成を刺激することが可能になる。Alden他、Neurosurgic al Focus (1998)は、アデノウイルスベクター内にクローンしたB
MP−2をコードするcDNAを用いた遺伝子治療における、直接注射法の有用
性を実証している。
いない組替えプラスミドを、適当な体部位に直接注射する生体内遺伝子治療を実
施することが可能である。本発明のこの態様においては、上記したように、裸の
プラスミドDNAが適当な標的細胞によって取りこまれる又は内在化させられる
とトランスフェクションが起こる。ウイルス構造体を用いた生体内遺伝子治療の
場合のように、裸プラスミドDNAを直接注射することによって、外科的処理が
殆ど又は全く必要なくなるという利点が得られる。内皮細胞有糸分裂促進剤VE
GF(血管内皮発育因子)をコードする裸プラスミドDNAを用いた直接遺伝子
治療は、ヒト患者における効果が実証されている[Baumgartner他、 Circulation 97(12):1114−23(1998)]。
によって、LMPの一時的な発現が可能になる。トランスフェクトされる標的細
胞のゲノム内にアデノウイルスが組み込まれないためにこのようなことが起こる
。LMPの一時的発現、すなわちトランスフェクトされた標的細胞の寿命間に起
こる発現は、本発明の目的を達成するのに十分である。しかしLMPの安定した
発現は、標的細胞のゲノムに組み込まれるベクターが導入媒体として用いられた
時に可能となる。例えばレトロウイルスに基づくベクターが、この目的に適して
いる。
疾患の治療に特に有用である。本発明のこの態様にあっては、LMPをコードす
るヌクレオチド配列を標的細胞内に導入するために、標的細胞のゲノム内に組み
込まれるベクターを用いることに加え、LMP発現を調節性プロモーターの制御
下におく。例えばテトラサイクリン等の外因性誘発剤と接触することによって起
動するプロモーターが好ましい。この方法を利用して有効量の外因性誘発剤を投
与することによって、全身性の新しい骨形成を刺激することができる。十分量の
骨塊が形成されたのち、外因性誘発剤の投与を中止する。この工程は、例えば骨
粗鬆症の治療後の経過など、骨塊の損失を補う必要に応じて、繰り返してもよい
。
力をアッセイする方法に用いるのに特に適している。この方法を用いて、骨回復
の進行が遅くなる又は治癒の程度が低くなる可能性のある患者を同定することが
できる。更に、HLMP特異的抗体は、骨粗鬆症などの骨変性疾患における危険
因子を同定するマーカーアッセイに用いるのに適している。
又は発現ベクターなどの他の核酸配列に連結することによって、本発明の遺伝子
を調製する。これらの組替えベクターを作成し分析するのに必要な方法、例えば
制限エンドヌクレアーゼによる消化、クローニングプロトコル、突然変異誘発、
オリゴヌクレオチドの有機合成及びDNA配列決定は、公知のものを用いること
ができる。DNA配列決定には、デオキシターミネーター法を用いるのが好まし
い。
ld Spring Harbor Press、第2版(1988)、Dav
is他、Basic Methods in Molecular Biolo gy 、Elsevier(1986)、及びAusubel他、Current Protocols in Molecular Biology 、Wile
y Interscience(1988)]。これらの参考文献は、ここに参
照して説明に代える。
においてよく用いられる工程である。これは一般的にはポリメラーゼ連鎖反応(
PCR)によって行われる。PCRについては米国特許第4,800,159号
(Mullis他)や他の文献に記載がある。PCRの基本原理は、プライマー
伸長のサイクルを繰り返すことによるDNA配列の指数関数的複製である。1個
のプライマーの伸長産物が、別のプライマーとハイブリダイズすると、他の核酸
分子合成用の鋳型となる。プライマー−鋳型複合体はDNAポリメラーゼの基質
として作用し、複製を行う際に、プライマーを伸長する。PCRに従来用いられ
ている酵素は、サームス・アクアティクス(Thermus aquaticu
s)から単離した耐熱性DNAポリメラーゼ、又はTaqDNAポリメラーゼで
ある。
ーを作成するのに必要な段階は、どのような方法を選択したとしても、当業者に
よって容易に行うことができる。例えば、10−4/RLMPの細胞発現を測定
するために、RNAを抽出して標準的で公知の方法によって逆転写する。得られ
るcDNAを適当なmRNA配列についてPCRで分析する。
内で発現される。もちろん、作成される配列は元の配列又はその相補的配列と同
じである必要はなく、DNAコードが縮退していても骨形成活性を有するLMP
を発現するものであれば、どのような配列であってもよい。保存的アミノ酸置換
や、アミノ末端におけるメチオニン残基の出現などの他の改変を、用いることも
できる。
ド配列の5’末端に連結し、合成遺伝子を作成する。合成遺伝子は、適当に線型
化されたプラスミドに連結することによって、様々な発現ベクターのいずれか一
つに導入することができる。調節性プロモーター、例えば大腸菌(E.coli
)lacプロモーターも、キメラコード配列の発現に適している。他に好ましい
調節性プロモーターの例としては、trp、tac、recA、T7及びλプロ
モーターが挙げられる。
カルシウム沈殿法、DEAE−デキストラン法、電気穿孔法、又は原形質体融合
法によってレシピエント細胞にトランスフェクトされ、安定した形質転換体を形
成する。特に下記の態様で実施されるリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。
沈させる。40〜50μgのDNAの等画分の一つに、担体としてサケ精子又は
子牛胸腺DNAを加えたものを、100mmディッシュに植えた0.5×106 細胞に用いる。DNAを0.5mlの2×ヘペス溶液(280mM NaCl、
50mMヘペス及び1.5mM Na2HPO4、pH7.0)に混合し、等体積
の2×CaCl2(250mM CaCl2及び10mMヘペス、pH7.0)を
添加する。30〜40分後に現れた白い顆粒沈殿を、細胞上に均等に滴下し、3
7℃で4〜16時間保温する。培地を除去し15%グリセロールを含むPBSで
3分間、細胞にショックを与える。グリセロールを除去したのち、10%ウシ胎
児血清を含むダルベッコの最小必要培地(DMEM)に細胞を入れる。
(1972)及びSompayrac他、Proc.Natl.Acad.Sc i.USA 78:7575(1981)参照];電気穿孔法[Potter、P roc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7161(1984)参照
];及び原形質体融合法[Sandri−Goddin他、Molec.Cel l.Biol. 1:743(1981)参照]を用いても、DNAをトランスフ
ェクトすることができる。
ポリデオキシヌクレオチドを有機合成する方法として好ましい。加えて、他の多
くの有機合成法を用いることも可能である。当業者は、本発明の特定の配列につ
いてこれらの方法を容易に適用することが可能である。
酸配列のいずれかにハイブリダイズする核酸分子を含む。「標準的ハイブリダイ
ゼーション条件」はプローブの大きさ、核酸試薬のバックグラウンド及び濃度、
並びにハイブリダイゼーションの種類(例えばインサイチューサザンブロット法
又はDNA−RNAハイブリッドのハイブリダイゼーション(ノーザンブロット
法))に伴って異なる。「標準的ハイブリダイゼーション条件」は当分野の技術
レベルの範疇にある。例えばFremeau他の米国特許第5,580,775
号、Southern、E.M.、J.Mol.Biol.98:503(19
75)、Alwine他、Meth.Enzymol.68:220(1979
)、及びSambrook他、Molecular Cloning:A La boratory Manual 第2版、pp7.19−7.50、Cold
Spring Harbor Press(1989)を参照されたい(ここに
参照して説明に代える)。
ド、5×SSPE(150nM NaCl、10mM NaH2PO4[pH7.
4]、1mM EDTA[pH8.0])、5×デンハート溶液(水100g中
20mgのフィコール、20mgのポリビニルピロリドン及び20mgのBSA
を含む)、10%硫酸デキストラン、1%SDS及び100μg/mlサケ精子
DNA中に、42℃で2時間プレハイブリダイズするブロットに関する。32P標
識化cDNAプローブを添加し、ハイブリダイゼーションを14時間続けた。次
いで、ブロットを2×SSPE、0.1%SDSを用いて22℃で20分にわた
る洗浄を2回行い、次いで0.1×SSPE、0.1%SDSを用いて65℃で
1時間洗浄した。ブロットを乾燥し、増感スクリーンの存在下でX線フィルムに
5日間露出した。
、これらはハイブリダイズする。標準的ハイブリダイズ条件の場合のように、当
業者は実質的に同一の配列のみがハイブリダイズする条件を設定することができ
る。
他の態様においては、本発明は抗LMP抗体を用いたそのような蛋白質の同定に
関する。この態様においては、細胞を溶解し蛋白質をSDS−PAGEで分離す
ることによってウエスタンブロット用の蛋白質試料が調製される。蛋白質は電気
ブロットによってニトロセルロースに転写される[Ausubel他、Curr ent Protocols in Molecular Biology 、J
ohn Wiley and Sons(1987)参照]。フィルターを即席
脱脂粉乳(100mlPBS中1gm)でブロックしたのち、抗LMP抗体をフ
ィルターに添加して室温で1時間保温する。フィルターをリン酸緩衝食塩水(P
BS)で完全に洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRPO)−抗体複
合体と共に室温で1時間保温する。フィルターを再度PBSで完全に洗浄したの
ち、ジアミノベンジジン(DAB)を添加して抗体バンドを同定する。
に関連した特異的な特徴について患者の細胞を分析するのに用いられる。ここで
いう「単一特異的抗体」とは、LMPに対する単一結合特性を有する単抗体種又
は複数抗体種のことを言う。ここで言う「単一結合」とは、(例えば上記したよ
うにLMPに関連する)特異な抗原又はエピトープに結合する抗体種の能力のこ
とを言う。LMPに対する単一特異的抗体は、LMPに対して反応性を有する抗
体を含む哺乳類抗血清から精製されるか、又はLMPに対して反応性を有するモ
ノクローナル抗体からKohler及びMilstein[Nature256
:495−97(1975)]の方法を用いて調製される。LMP特異性抗体は
例えばネズミ、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ又はウマなどの動物を、適当
な濃度のLMP(及び免疫アジュバント)で免疫化することによって調製するこ
とができる。
は約0.1〜1000mgのLMP(及び望ましい場合には許容される免疫アジ
ュバント)を投与される。このような許容される免疫アジュバントの例としては
、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、明礬沈殿、コ
リネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum
)を含有する油乳濁液の水、及びtRNAアジュバントが挙げられるが、これら
に限定されるものではない。初期免疫は、好ましくは、フロイント完全アジュバ
ントに含まれるLMPを、複数部位に皮下注射(SC)、腹腔内注射(IP)の
いずれか又はその両方によって導入することを含む。各動物から一定間隔で、好
ましくは1週間ごとに採血し、抗体価を測定する。動物は初期免疫化に続いて追
加注射を受けてもよいし受けなくてもよい。追加注射を受ける動物は一般に、フ
ロイント不完全アジュバントに含まれる抗体を等量、同じ経路で投与される。追
加注射は最大抗体価が得られるまで約3週間の間隔で投与される。各追加免疫化
から約7日後に、又は1回の免疫化から約1週間ごとに、動物から採血して血清
を回収し、画分を約−20℃で貯蔵する。
ス、好ましくはBalb/cマウスをLMPで免疫化することによって調製する
。マウスは、約0.1〜10mg、好ましくは約1mgのLMPを含む約0.5
mlの緩衝液又は食塩水と等量の許容されるアジュバントとを混合したものをI
P又はSC経路で投与することによって免疫化される(上記参照)。アジュバン
トとしてはフロイント完全アジュバントが好ましい。ネズミは第0日に初期免疫
を受け、約3~30週間静養させる。免疫化ネズミは、約0.1〜10mgのL MPを含む緩衝溶液(例えばリン酸緩衝食塩水)を静脈注射(IV)経路で1回
以上投与する追加免疫化をうける。抗体陽性ネズミから得たリンパ球、好ましく
は脾臓リンパ球を、当分野で公知の標準法を用いて免疫化ネズミから脾臓を除去
することによって得る。脾臓リンパ球と適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞
とを、安定的なハイブリドーマが得られる条件下で混合することによってハイブ
リドーマ細胞を作成する。融合相手の例としては、マウス骨髄腫P3/NS1/
Ag4−1;MPC−11;S−194;及びSp2/0が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。このうちSp2/0が好ましい。抗体産生細胞と
骨髄腫細胞とは、約30〜50%の濃度の、約1000分子量のポリエチレング
リコール中で融合される。融合ハイブリドーマ細胞は、公知の方法で補助ダルベ
ッコ改変イーグル培地(DMEM)中でヒポキサンチン、チミジン及びアミノプ
テリンで育成することによって選択する。第14、18及び21日あたりで上澄
液を成長が陽性のウェルから回収し、LMPを抗体として用いる固相イムノラジ
オアッセイ(SPIRA)等のイムノアッセイによって、抗体産生についてのス
クリーニングを行う。培養液をオクタロニー沈降アッセイで試験して、mAbの
アイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞は、軟寒
天法などによってクローンする[MacPherson、“Soft Agar
Techniques”、Tissue Culture Methods and Applications 、Kruse and Paterson(
編)、Academic Press(1973);Harlow他、Anti bodies:A Laboratory Manual 、Cold Spri
ng Laboratory(1988)参照]。
につきプライム化約4日後の約2×106〜6×106ハイブリドーマ細胞を約0
.5ml注射することによって、生体内で産生することもできる。細胞移転の後
約8〜12日で腹水を回収し、モノクローナル抗体を公知の技術で精製する。
ることによって抗LMPmAbの生体外産生を行い、十分量の特異的mAbを得
る。mAbを公知の技術で精製する。
セイによって決定する。それらの例として沈降法、受動的凝集、固相酵素免疫測
定法(ELISA)及びラジオイムノアッセイ(RIA)が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。体液又は組織、及び細胞抽出物中のLMPの存在
を調べるのに、同様のアッセイが用いられる。
の新生LMPポリペプチド、又はその改変体、あるいはその対立形質に特異な抗
体を産生するのに利用できることは、当業者には自明のことであろう。
(すなわち10−4クローン/RLMPを挿入したpRc/CMV2ベクター)
が、1997年7月22日にATCC(American Type Cult
ure Collection、20852メリーランド州ロックビル、パーク
ローンドライブ12301)に寄託されている。培養番号は209153が割り
当てられている。HLPM−1sを挿入したpHis−Aベクター試料が199
8年3月19日にATCCに寄託されている。培養番号は209698が割り当
てられている。ブダペスト条約の取り決め下に扱われるこれらの寄託物は、少な
くとも30年間ATCCに保持され、それらを開示する特許の権利賦与のもとに
誰もが入手することができる。寄託物が入手しやすいとはいっても、政府の決定
による特許権を軽んじて本発明を実施するライセンスが賦与されたとみなすべき
でないことは理解されるべきである。
び従来の他の生物化学的方法が用いられる。DNA及びRNAはそれぞれサザン
ブロット法及びノーザンブロット法によって分析される。通常、分析される試料
はゲル電気泳動によって寸法を分別される。ゲル中のDNA又はRNAは、次い
でニトロセルロース又はナイロン膜に転写される。ゲル中の試料パターンの複製
であるブロットは、プローブとハイブリダイズされる。一般に、プローブは放射
性同位元素、好ましくは32Pで標識付けされるが、当分野で公知の信号発生分子
でプローブを標識付けすることもできる。次いで対象とする特異的なバンドを、
オートラジオグラフィー等の検出系によって可視化することができる。
限定するものではない。これらの結果は本発明のLIM鉱化蛋白質、及びこれら
の蛋白質をコードする単離核酸に、骨形成の誘発能又は促進能があることを立証
している。
前のラットから得た[Boden他、Endocrinology137(8)
:3401−07(1996)参照]。一次培養を密集するまで(7日間)培養
し、トリプシン処理し、第一継代培養細胞として6ウェルプレート(1×105 細胞/35mmウェル)に植えた。第0日に密集状態の継代培養細胞を、更に7
日間培養した。第0日に始まって3〜4日ごとに層流フードの下で培養基を交換
して処理(Trm及び/又はBMP)を行った。標準的な培養プロトコルは以下
の通りである。第1〜7日、MEM、10%FBS、50μg/mlアスコルビ
ン酸、±刺激;第8〜14日、BGJb培養基、10%FBS、(鉱化を可能に
する無機隣酸塩源としての)5mMβ−GlyP。骨小結節形成及びオステオカ
ルシン分泌の終点分析を第14日に行った。研究した全てのBMPについて得た
投与応答曲線において範囲中央効果を示した系の試行実験に基づいて、BMP投
与量を50ng/mlとした。
センスオリゴヌクレオチドを合成してLMP−1mRNA翻訳をブロックし、グ
ルココルチコイドにより誘発され分化しつつある二次骨芽細胞培養を処理した。
RLMP発現の阻害を、推定翻訳開始領域に渡る25塩基対に相当する高度に特
異的な(公知のラット配列に対して有意な相同性を有さない)アンチセンスオリ
ゴヌクレオチド(配列番号35)を用いて行った。対照培養としてオリゴヌクレ
オチドを加えないものとセンスオリゴヌクレオチドを加えたものを作成した。リ
ポフェクタミン(lipofectamine)の存在下(前保温)又は非存在
下で実験を行った。以下簡単に述べると、22μgのセンス又はアンチセンスR
LMPオリゴヌクレオチドをMEMに室温で45分間保温した。保温に続いて、
更にMEMか前保温したリポフェクタミン/MEM(7%v/v;室温で45分
保温)のいずれかを添加してオリゴヌクレオチド濃度を0.2μMとした。得ら
れた混合物を室温で15分間保温した。次いでオリゴヌクレオチド混合物を適当
な培養基(すなわちMEM/アスコルビン酸塩/±Trm)に混合し、最終オリ
ゴヌクレオチド濃度を0.1μMとした。
)で保温した。まずリポフェクタミンで保温した培養にリポフェクタミン及びオ
リゴヌクレオチドのいずれも含まない培養基で4時間保温(37℃;5%CO2 )したのち、培地補充した。全ての培養、特にオリゴヌクレオチドを加えた培養
について、オリゴヌクレオチドレベルを保持するために24時間ごとに培地補充
した。
ドの効果と同様に、投与量に依存する形で、鉱化小結節形成及びオステオカルシ
ン分泌を阻害した。 骨芽細胞分化におけるLMP−1アンチセンスブロックは、外因性BMP−6の
添加により回復できなかったが、一方BMP−6アンチセンスオリゴヌクレオチ
ド阻害はBMP−6の添加により取り消された。この実験では骨芽細胞分化経路
においてBMP−6よりLMP−1が上流に位置することも確認された。LMP
−1アンチセンスオリゴヌクレオチドは更に一次ラット骨芽細胞培養において自
然な骨芽細胞の分化を阻害した。
フォンコッサ銀染色で染色した。半自動コンピューター化ビデオイメージ分析シ
ステムを用いて、各ウェルの小結節数及び小結節面積の定量化を行った[End ocrinology 137(8):3401−07(1996)参照]。小結
節値あたりの面積を計算するためにこれらの値を割った。この自動化工程の手動
測定法に対する有効性は確認されており、0.92の相関係数(p<0.000
001)が実証されている。全てのデータは、各条件下のウェル5〜6個から計
算した平均値±平均値の標準誤差(S.E.M.)として表現される。各実験は
異なる頭蓋冠調製物からの細胞を用いて少なくとも2度行われた。
単一特異的ポリクローナル抗体(Pab)を作成した。培養基中のオステオカル
シンのレベルを、この抗体を利用した競合ラジオイムノアッセイを用いて測定し
た[Nanes他、Endocrinology127:588(1990)参
照]。以下簡単に述べると、1μgのノナペプチドをラクトペルオキシダーゼ法
によって1mCi125I−Naでヨウ素処理した。200μlのアッセイ緩衝液 (0.02Mリン酸ナトリウム、1mM EDTA、0.001%チメロサール
、0.025%BSA)を含む試験管に、細胞培養から又はオステオカルシン基
準(0〜12000fmole)から取った培養基を、アッセイ緩衝液中100
μl/試験管の割合で加えた。次いでPab(1:40000;100μl)を
加え、ヨウ素処理したペプチド(12000cpm;100μl)を加えた。非
特異的結合について試験した試料は、同様に調製した(ただし抗体を含まないよ
うに調製した)。
時間保温することによって分離した。試料を1200rpmで45分間遠心分離
したのち、上澄を静かに別容器に移して沈殿物をγ線計数器で測定した。オステ
オカルシンの値はfmole/100μlの単位で測定し、次いで100で割る
ことによってpmole/ml培養基(第三日)の単位に変換した。数値は各条
件下のウェル5〜6個から3回計算した値の平均値±S.E.M.として表現さ
れた。各実験は異なる頭蓋冠調製物からの細胞を用いて少なくとも2度行われた
。
小結節の形成全般に与える効果は、はっきりしていない。しかしROBがTmで
刺激された場合には、RLMPに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは小結
節の鉱化を>95%の割合で阻害する。外因性のBMP−6をオリゴヌクレオチ
ド処理した培養に添加したところ、RLMPアンチセンス処理した小結節の鉱化
は起こらなかった。
ルシンのレベルは小結節形成及び鉱化と関連があった。RLMPアンチセンスオ
リゴヌクレオチドはオステオカルシン産生を有意に減少させるが、アンチセンス
処理した培養における小結節の数は有意に変化しない。この場合、外因性のBM
P−6を添加してもRLMPアンチセンス処理した培養におけるオステオカルシ
ンの産生は10〜15%しか回復しなかった。これはRLMPの作用がBMP−
6の下流で起こり、BMP−6よりも特異的であることを示唆している。
ディッシュ中に調製)を、4Mグアニジンイソチオシアネート(GIT)溶液を
用いて採取し、統計的に同じものを3つ作成した。以下簡単に述べると、培養上
澄をウェルから吸引し、2対ウェルからの採取あたり0.6mlのGIT溶液で
覆った。GIT溶液を添加したのち、プレートを5〜10秒旋回させた(できる
だけ均等に覆うようにした)。さらなる工程を行う前に、試料を−70℃で最大
7日間まで保存した。
arbor Press(1989)]の標準的方法を僅かに改変した方法を用
いてRNAを精製した。以下簡単に述べると、解凍した試料に60μlの2.0
M酢酸ナトリウム(pH4.0)、550μlのフェノール(水飽和)及び15
0μlのクロロホルム:イソアミルアルコール(49:1)を添加した。渦巻攪
拌ののち、試料を遠心分離(10000xg;20分;4℃)にかけ、水性相を
別の試験管に移し、600μlのイソプロパノールを添加してRNAを−20℃
で一晩沈殿させた。
澄を静かに吸引した。得られたペレットを400μlのDEPC処理水に再懸濁
し、フェノール:クロロホルム(1:1)で抽出し、クロロホルム:イソアミル
アルコール(24:1)で抽出し、40μlの酢酸ナトリウム(3.0M;pH
5.2)及び1.0mlの無水エタノールを添加したのち−20℃で一晩沈殿さ
せた。細胞RNAを採取するために、試料を遠心分離(10000xg;20分
)にかけ、70%エタノールで洗浄し、5〜10分間空気乾燥し、20μlのD
EPC処理水に再懸濁した。RNA濃度は分光光度計を用いて測定した光学濃度
から計算した。
のdT17プライマー(10pmol/ml)、0.5μlのRNAsin(4
0U/ml)及び1μlのMMLV−RT(200ユニット/μl)を含む試験
管に添加した。試料を37℃で1時間保温し、次いで95℃で5分保温してMM
LV−RTを不活化した。試料に80μlの水を加えて希釈した。
下簡単に述べると、水、適量のPCR緩衝液(25mM MgCl2、dNTP 、グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAP、ハウスキーピング遺伝
子)の正方向及び逆方向プライマー及び/又はBMP−6)、32P−dCTP及
びTaqポリメラーゼを含む試験管に試料を添加した。プライマーを22サイク
ル(94℃で30秒;58℃で30秒、72℃で20秒)にかけたが、特に注釈
しない限りはサイクルを一定して行った。
dye)を添加し、混合し、65℃で10分加熱し、遠心分離にかけた。10
μlの各反応物を標準条件下でPAGE(12%ポリアクリルアミド;15V/
ウェル;定電流)にかけた。ゲルをゲル保存緩衝液(10%v/vグリセロル、
7%v/v酢酸、40%v/vメタノール、43%脱イオン水)内に30分保温
し、真空内で80℃で1〜2時間乾燥し、電子的に画質を向上させた隣光イメー
ジシステムで6〜24時間発色させた。可視化されたバンドを分析した。バンド
あたりの数をグラフにプロットした。
。加熱してDNアーゼで処理した総RNA(5μgを総量10.5μlのDEP
C−H2O中に65℃で5分間)を実施例7で述べたように逆転写した[ただし H−T11M(配列番号4)をMMLV―RTプライマーとして用いた]。得られ
たcDNAを上記したようにPCRで増幅した[ただしH―T11G(配列番号4
)、H−AP−10(配列番号5)(GenHunter社、テネシー州ナッシ
ュビル)などの市販の様々なプライマーセットを用いた]。放射性同位元素標識
化PCR産物をDNA配列決定ゲル上でゲル電気泳動にかけて分別した。電気泳
動の後、得られたゲルを真空下で乾燥し、オートラジオグラフィーに一晩さらし
た。区別をつけて発現されたcDNAのバンドをゲルから切り出し、Conne
r他[Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:278(1983
)]の方法を用いてPCRで再増幅した。PCR再増幅の産物をベクターPCR
−II(TAクローニングキット;InVitrogen社、カリフォルニア州
カールズバッド)内にクローンした。
板上に2分間載せた。濾過膜を取り除いて変性させ、洗浄し、乾燥してUV架橋
した。次いで濾過膜を前ハイブリダイゼーション緩衝液[2×PIPES(pH
6.5)、5%ホルムアミド、1%SDS及び100μg/ml変性サケ精子D
NA]内に42℃で2時間保温した。260塩基対の放射性同位元素標識化プロ
ーブ(配列番号3;ランダムプライミングによる32P標識化)をハイブリダイゼ
ーション混合物/濾過膜全体に添加し、42℃で18時間ハイブリダイズした。
膜を室温で1回(10分、1×SSC、0.1%SDS)、55℃で3回(15
分、0.1×SSC、0.1%SDS)洗浄した。
クローンをプラークで精製した。この工程を第二の濾過膜についても4分間行い
、見せかけの正のクローンを最小化した。プラーク精製したクローンをλSK(
−)ファージミド(phagemid)として回収した。クローンcDNAは下
記のように配列決定した。
他、Current Protocols in Molecular Bio logy 、Wiley Interscience(1988)参照]。以下簡
単に述べると、適当な濃度の終止混合物、鋳型及び反応混合物を適当なサイクル
プロトコル(95℃、30秒;68℃、30秒;72℃、60秒;25回)にか
ける。配列決定反応を終わらせるために停止混合物を添加する。92℃で3分間
加熱したのち、試料を変性6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル(29:1 ア
クリルアミド:ビスアクリルアミド)に載せる。試料を60ボルト定電流で約4
時間電気泳動にかける。電気泳動の後、ゲルを真空下で乾燥してオートラジオグ
ラフィーを行う。
ー情報センター(NIH、メリーランド州ベセズダ、http://www.n
cbi.nlm.nih.gov/)で保持されているデータベースについて、
デフォルト値でBLASTnプログラムを用いてスクリーンした。配列データに
基づいて、新しい配列決定プライマーを調製し、遺伝子全体を配列決定するまで
工程を繰り返した。全ての配列を両方向について最低3回確認した。
.0)を用いて分析した。ヌクレオチド配列について相同性のパーセントをNA
LIGNプログラムによって計算した。計算にはパラメーターとして、非調和(
non−matching)ヌクレオチドのウェイト=10;非調和ギャップの
ウェイト=10;考察の対象となるヌクレオチドの最大数=50;及び考察の対
象となるヌクレオチドの最小数=50、を用いた。
。オープンギャップコスト(open gap cost)及びユニットギャッ
プコスト(unit gap cost)の両方について、値を10とした。
0塩基対の主要バンドを含んでいた。この配列をラット骨肉腫(UMR106)
cDNAライブラリーのスクリーニングに用いた。正のクローンをネスト状プラ
イマー分析にかけ、全長cDNAを増幅するのに必要なプライマー配列を得た(
配列番号11、12、29、30及び31)。後の研究のために選んだ正のクロ
ーンの一つをクローン10−4と称した。
定した。その結果、クローン10−4はディファレンシャルディスプレーPCR
で同定された元の260塩基対断片を含んでいた。クローン10−4(1696
塩基対、配列番号2)は457アミノ酸(配列番号1)を有する蛋白質をコード
する1371塩基対の開いた読み枠を含んでいる。終止コドンTGAはヌクレオ
チド1444〜1446に見られる。ヌクレオチド1675〜1680のポリア
デニレーション信号及びそれに隣接するポリ(A)+末端は3’非コード領域に 存在する。配列番号1のアミノ酸位置113〜116及び257〜259にそれ
ぞれAsn−Lys−Thr及びAsn−Arg−Thrという2個の潜在的N
−グリコシレーション部位が存在する。2個の潜在的cAMP依存及びcGMP
依存蛋白質キナーゼリン酸化部位Ser及びThrがそれぞれアミノ酸位置19
1及び349に見られた。5個の蛋白質キナーゼCリン酸化部位Ser又はTh
rがアミノ酸位置3、115、166、219、442に見られた。1個の潜在
的ATP/GTP結合部位モチーフA(P−ループ)Gly−Gly−Ser−
Asn−Asn−Gly−Lys−Thrがアミノ酸位置272〜279に見ら
れた。
1及び400〜451に見られた。この新たに同定されたラットcDNA中の推
定LIM領域は、他に公知のLIM蛋白質のLIM領域とかなりの相同性を示し
た。しかし、他のラットLIM蛋白質との全体的相同性は25%未満であった。
RLMP(10−4とも称する)はヒトエニグマ(enigma)蛋白質(米国
特許第5,504,192号参照)と78.5%のアミノ酸相同性を有している
が、最も近いラット同族体CLP−36及びRIT−18に対してそれぞれ僅か
24.5%及び22.7%のアミノ酸相同性しか有していない。
平面ゲル上のホルムアルデヒドゲル電気泳動にかけて寸法を分別し、ナイロン膜
に浸透によりブロット転写した。ブロットに対して、ランダムプライミングで32 P−dCTP標識化した全長10−4cDNAの600塩基対EcoR1断片を
プローブとして用いた。
kbのmRNA種が得られた。RLMPmRNAはBMP−6に24時間さらし
たROB中で約3.7倍に増加した。24時間BMP−2又はBMP−4で刺激
したROB中ではRMLP発現の増加はみられなかった。
ら得られたデータを用いて平均値±S.E.M.を計算した。各パラメーターの
最大値に正規化されたデータでグラフを作成し、小結節の個数、鉱化された領域
及びオステオカルシンについて同時にグラフにすることが可能になる。
果について、代表的な実験の3組用意した試料から得たデータを用いて、平均値
±S.E.M.を決定した。グラフを作成することによって、第0日又は負の対
照に正規化されたデータが示され、上記対照値を数倍に増加したものとして表現
される。
用いた分散の一方向分析を用いて評価した[D.V.Huntsberger“
The Analysis of Variance”Elements of Statistical Variance 、P.Bilingsley編、
pp.298〜330、Allyn&Bacon社、マサチューセッツ州ボスト
ン(1977)及びSigmastat、Jandel Scientific
社、カリフォルニア州コルテマデラ]。有意性のαレベルはp<0.05として
定義した。
1(1980)及びTimmer他、J.Biol.Chem.268:248
63(1993)の方法に従って、ポリクローナル抗体を調製した。 ヒーラ細胞をpCMV2/RLMPでトランスフェクトした。Hair他、L eukemia Research 20:1(1996)の方法に従って蛋白質
をトランスフェクトした細胞から採取した。天然RLMPのウエスタンブロット
分析をTowbin他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:
4350(1979)に記載のされているように行った。
マー(配列番号15及び16)を合成し、ユニーク223塩基対の配列をラット
LMP―1cDNAからPCR増幅した。同様なPCR産物をヒトMG63骨肉
腫細胞cDNAから同じPCRプライマーを用いて単離した。
上澄を吸引によって除去し、フラスコに対あたり3.0mlのGITを添加して
覆い、5〜10秒旋回させ、得られた溶液を1.5mlエッペンドルフ試験管に
移した(5本の試験管、0.6ml/試験管)。Sambrook他[Mole cular Cloning:a Laboratory Manual 、第7
章19ページ、Cold Spring Harbor Press(1989
)及びBoden他、Endocrinology138:2820−28(1
997)参照]の標準的方法を僅かに改変した方法を用いてRNAを精製した。
以下簡単に述べると、0.6mlの試料に60μlの2.0M酢酸ナトリウム(
pH4.0)、550μlの水飽和フェノール及び150μlのクロロホルム:
イソアミルアルコール(49:1)を添加した。これら試薬を添加したのち、試
料を渦巻攪拌し、遠心分離(10000xg;20分;4℃)にかけ、水性相を
別の試験管に移した。、600μlのイソプロパノールを添加してRNAを−2
0℃で一晩沈殿させた。試料を遠心分離(10000xg;20分)にかけ、上
澄を静かに吸引した。得られたペレットを400μlのDEPC処理水に再懸濁
し、フェノール:クロロホルム(1:1)で抽出し、クロロホルム:イソアミル
アルコール(24:1)で抽出し、40μlの酢酸ナトリウム(3.0M;pH
5.2)及び1.0mlの無水エタノール中、−20℃で一晩沈殿させた。試料
を遠心分離(10000xg;20分)にかけ、70%エタノールで洗浄し、5
〜10分間空気乾燥し、20μlのDEPC処理水に再懸濁した。RNA濃度は
光学濃度から計算した。
17プライマー(10pmol/ml)、0.5μlのRNAsin(40U/
ml)及び1μlのMMLV−RT(200ユニット/μl)を含む試験管に添
加した。反応物を37℃で1時間保温し、次いで95℃で5分保温してMMLV
−RTを不活化した。試料に80μlの水を加えて希釈した。
den他、Endocrinology138:2820−28(1997);
Ausubel他、“Quantitation of rare DNAs
by the polymerase chain reaction”Cur rent Protocols in Molecular Biology 、
第15.31−1章、Wiley and Sons、ニュージャージー州トレ
ントン(1990)参照]。以下簡単に述べると、水、適量のPCR緩衝液[2
5mM MgCl2、dNTP、正方向及び逆方向プライマー(RLMPU用; 配列番号15及び16)]、32P−dCTP及びDNAポリメラーゼを含む試験
管に試料を添加した。プライマーは放射性バンド検出のため一定のサイクルに2
2回かけ、スクリーニングプローブとして用いるPCR産物を増幅するためにサ
イクルに33回かけた(94℃、30秒;58℃、30秒;72℃、20秒)。
RLMPUのPCR産物と95%以上の相同性があることが判明した。この配列
をHLMPユニーク領域(HLMPU;配列番号6)と称した。
と同様にスクリーニングを行った。717塩基対のMG63PCR産物をアガロ
ースゲルで精製して所与のプライマー(配列番号12、15、16、17、18
、27及び28)で配列決定した。配列は両方向について最低二回確認した。M
G63配列を整列させ全長ラットLMPcDNA配列に対向させ、ヒトLMPc
DNA部分配列(配列番号7)を得た。
例えばヒト心筋)において異なるレベルで発現することが判明した。従ってヒト
心臓cDNAライブラリーを研究した。ライブラリーを5×104pfu/ml で寒天平板(LB底寒天)に植え、37℃で一晩保温した。濾過膜を平板上に2
分間載せた。濾過膜を取り除いて変性させ、洗浄し、乾燥してUV架橋した。次
いで濾過膜を前ハイブリダイゼーション緩衝液[2×PIPES(pH6.5)
、5%ホルムアミド、1%SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA]内
に42℃で2時間保温した。223塩基対のLMPに特異な放射性同位元素標識
化プローブ(配列番号6;ランダムプライミングによる32P標識化)を添加し、
42℃で18時間ハイブリダイズした。膜を室温で1回(10分、1×SSC、
0.1%SDS)、55℃で3回(15分、0.1×SSC、0.1%SDS)
洗浄した。正のプラーク精製を2回行った心臓ライブラリークローンをオートラ
ジオグラフィーで同定し、市販製品のプロトコルに従ってλファージミドとして
回収した(Stratagene社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ)。
0塩基対より長い挿入配列を配列決定により一次スクリーニングについて選択し
た。これらの挿入配列は、実施例11に述べた標準的方法によって配列決定した
。
プライマーを用いる自動配列決定分析にかけた。これらの方法によって得た配列
は通常97〜100%の相同性を示した。クローン7(心臓ライブラリーから得
たヒトLMP−1部分cDNA;配列番号8)は、転写領域においてラットLM
PcDNA配列と87%以上の相同性を示した。
ーバーラップ領域を用いて、これら2つの配列を整列させ、1644塩基対の完
全ヒトcDNA配列を得た。NALIGN(PCGENEソフトウェアー中のプ
ログラム)を用いてこれら2つの配列を整列させた。2つの配列のオーバーラッ
プ領域は、MG63cDNA(配列番号7)のヌクレオチド672における1個
のヌクレオチド置換を除いてはクローン番号7(配列番号8;対応するヌクレオ
チド516においてGの代わりにAを有する。)と完全な相同性を示す約360
塩基対から成り立っていた。
NEの別のサブプログラム)によって、整列させた2つの配列を連結した。結果
として得られる配列を配列番号9に示す。新規なヒト由来配列とラットLMP−
1cDNAとの整列は、NALIGNによって行った。全長ヒトLMP−1cD
NA配列(配列番号9)はラットLMP−1cDNA配列の翻訳領域と87.3
%の相同性を示した。
を用いて決定した。配列番号9の開いた読み枠は457アミノ酸(配列番号10
)を包含する蛋白質をコードする。PCGENEサブプログラムPalignを
用いたところ、ヒトLMP−1アミノ酸配列はラットLMP−1アミノ酸配列と
94.1%の相同性を示すことが判明した。
トコルに従って、MG63総RNAのネスト状RT−PCRにより増幅した。こ
の方法ではまず3’末端の2個所に変性ヌクレオチドを有するロック−ドッキン
グオリゴ(dT)プライマーを用いた第一のcDNA鎖合成を行う[Chenc
hik他、CLONTECHniquesX:5(1995);Borson他
、PC Methods Applic.2:144(1993)]。第二の鎖
合成は、Gubler他、Gene25:263(1983)の方法に従って、
大腸菌(Escherichia coli)DNAポリメラーゼI、RNアー
ゼH、及び大腸菌DNAリガーゼの混合物を用いて行う。ブラントエンドをT4
DNAポリメラーゼで作成したのち、2重鎖cDNAを断片(5’−CTAAT
ACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCA
GGT−3’)(配列番号19)に連結させた。RACEに先だって、アダプタ
ー連結cDNAをマラソンRACE反応に好適な濃度(1:50)に希釈した。
アダプター連結2重鎖cDNAについてこれで特異的クローニングを行う準備が
できた。
オチド5’−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC−3’
(AP1)(配列番号20)及び実施例16で述べたユニーク領域(HLMPU
)からの遺伝子特異的プライマー(GSP)を用いて行った。第2回目のPCR
はネスト状プライマーGSP1−HLMPU(アンチセンス/逆方向プライマー
)(配列番号23)及びGSP2−HLMPUF(配列番号24)(センス/正
方向プライマー、実施例16参照)を用いて行った。PCRは抗体媒介の、しか
しそれ以外は標準のホットスタートプロトコルを利用する市販のキット(アドバ
ンテージcDNA PCRコアキット;CloneTech Laborato
ries社、カリフォルニア州パロアルト)を用いて行った。MG63cDNA
用のPCRは、初期加熱開始変性(94℃、60秒)を行い、次いで94℃で3
0秒;60℃で30秒;68℃で4分;このサイクルを30回繰り返した。第1
回のPCR産物は約750塩基対であり、ネスト状PCR産物は約230塩基対
であった。第1回PCR産物を線型化したpCR2.1ベクター(3.9Kb)
内にクローンした。挿入配列をM13正方向及び逆方向プライマー(配列番号1
1及び12)の両方を用いて配列決定した。
3 717塩基対配列(実施例17;配列番号8)、及びヒト心臓cDNAクロ
ーン7配列(実施例18)のオーバーラップ領域を整列させ、1704塩基対の
新規なヒトcDNA配列(配列番号22)を得た。整列はNALIGN(PCG
ENE及びOmiga1.0;Intelligenetics社)を用いて行
った。オーバーラップ配列は全717塩基対領域(実施例17)とほぼ100%
の相同性を示した。整列配列の結合はSEQINを用いて行った。
した配列を用いて作成した。717塩基対クローン(実施例17;配列番号7)
をClaI及びEcoRVで消化した。小さな断片(〜250塩基対)をゲル精
製した。クローン7(実施例18;配列番号8)をClaI及びXbaIで消化
し、1400塩基対の断片をゲル精製した。単離した250塩基対及び1400
塩基対の制限断片を連結して〜1650塩基対の断片を作成した。
のラット配列と比較)によって、翻訳塩基対672における停止コドンができた
。この停止コドンのため、切断(短縮)蛋白質がコードされることになった(従
ってLMP−1sの呼び名がある)。この構造体を発現ベクター(配列番号32
)に用いた。5’末端にUTRを有する全長cDNA(配列番号33)を、配列
番号32と5’RACE配列(配列番号21)とを整列させて作成した。LMP
−1sのアミノ酸配列(配列番号34)を223アミノ酸蛋白質として推定し、
予想される分子量〜23.7kDにてウエスタンブロットを(実施例15と同様
に)行って確認した。
ルズバッド)をEcoRV及びXbaIで消化した。線型化pHis−ATGベ
クターを取りだし、1650塩基対の制限断片を連結させた。連結産物をクロー
ニングして増幅した。pHis−ATG−LMP−1s発現ベクター(HLMP
−1sを挿入したpHIS−Aとも称する)を標準法によって精製した。
実施例1で述べたように刺激を加えないか又はグルココルチコイド(GC)で刺
激を加えた。Superfect試薬(Qiagen社、カリフォルニア州バレ
ンシア)のトランスフェクションプロトコルを改変したものを用いて、3μg/
ウェルの各ベクターを実施例25の2次ラット頭蓋冠骨芽細胞培養にトランスフ
ェクトした。
トLMP−1s遺伝子産物の過剰発現のみが生体外の骨小結節形成(〜203小
結節/ウェル)を誘発した。小結節のレベルはGCの正の対照によって誘発され
るレベル(〜412小結節/ウェル)の約50%であった。他の正の対照はpH
isA−LMP−Rat発現ベクター(〜152小結節/ウェル)及びpCMV
2/LMP−Rat−Fwd発現ベクター(〜206小結節/ウェル)という結
果であった一方、負の対照はpCMV2/LMP−Rat−Rev発現ベクター
(〜2小結節/ウェル)及び非処理(NT)プレート(〜4小結節/ウェル)と
いう結果であった。これらのデータはヒトcDNAが少なくともラットcDNA
程度には骨形成刺激を与えることを実証している。効果はGC刺激を行った場合
よりも少なかったが、これは発現ベクターの量が最適以下であったためと考えら
れる。
及びApalを用いて37℃で一晩2重消化してベクターから切り出した。ベク
ターpCMV2MCS(InVitrogen社、カリフォルニア州カールズバ
ッド)を同じ制限酵素で消化した。クローン10−4からの線型cDNA断片及
びpCMV2の両方をゲル精製し、抽出し、そしてT4リガーゼで連結した。連
結したDNAをゲル精製し、抽出し、大腸菌JM109細胞を形質転換して増幅
した。正の寒天コロニーを選択し、NotI及びApaIで消化し、制限消化物
をゲル電気泳動で分析した。ストック培養は正のクローンで調製した。
法で逆方向ベクターを調製した。これらの制限酵素を用いたことによって、クロ
ーン10−4からのLMPcDNA断片がpRc/CMV2内に逆方向(すなわ
ち非翻訳の方向)に挿入された。得られた組替えベクターをpCMV2/RLM
Pと称した。
は0〜600nM/ウェル(0〜30μg/ウェル)の最終濃度が好ましい]を
最小イーグル培地(MEM)中に再懸濁して450μlの最終体積として10秒
間渦巻攪拌した。Superfectを添加(7.5μl/ml最終溶液)して
、溶液を10秒間渦巻攪拌し、室温で10分保温した。保温の後、10%FBS
(1ml/ウェル;6ml/プレート)を追加したMEMを添加してピペットで
混合した。
ェル)。培養を5%CO2を含む加湿雰囲気中、37℃で2時間保温した。それ から後、細胞を殺菌PBSで静かに一回洗浄し、適当な正常保温培養基を添加し
た。
胞培養全てで起こったことを実証している。例えば、pCMV10−4トランス
フェクト細胞は429小結節/ウェルを産生した。Trmにさらした正の対照培
養は460小結節/ウェルを産生した。これに対し、未処理の負の対照は、1小
結節/ウェルを産生した。同様に、培養をpCMV10−4(逆方向)でトラン
スフェクトした場合、小結節は産生されなかった。
u/+;劣性無胸腺症状態に関して異型接合)の後肢から骨髄を吸引した。吸引
した骨髄細胞をαMEM中で洗浄し、遠心分離にかけ、0.83%NH4Clを 含む10mMトリス(pH7.4)中にペレットを再懸濁してRBCを溶解した
。残った骨髄細胞をMEMで3回洗浄し、3×106細胞あたり9μgのpCMV −LMP−1s(正方向又は逆方向)で2時間トランスフェクトした。トランス
フェクトした細胞をMEMで2回洗浄し、3×107細胞/mlの濃度で再懸濁 した。
ラーゲンディスク(Sulzer Orthopaedics社、コロラド州ホ
イートリッジ)上に載せた。ディスクは外科手術で生後4〜5週の無胸腺症ラッ
ト(mu/mu)の頭蓋、胸、胴体又は脊柱に皮下移植した。3〜4週目に動物
からディスク又は外科処理部位を切りだし、70%エタノールで固定した。固定
された試験片はラジオグラフィーによって分析し、ゴルドナートリクロームで染
色された5μm厚の部分について非脱石灰処理による組織学的研究を行った。コ
ラーゲンディスクの代わりに失活(グアニジン抽出)鉱物質除去骨基質(Ost
eotech社、ニュージャージー州シュローズベリー)を用いた実験も行った
。
を含む元のコラーゲンディスクと同じ形態の、高レベルの鉱化骨形成が得られた
ことが判明した。負の対照(翻訳された蛋白質をコードしない、LMP−1s
cDNAが逆方向をむいたものでトランスフェクトした細胞)では鉱化骨形成は
観察されず、担体の吸着は進行中のようであった。
い骨柱が骨芽細胞と整列していることが判明した。負の対照中で、担体の部分的
再吸収にともなった骨は見られなかった。
MV−LMP−1s)の移植片について、無胸腺症のラット複数における腰部脊
椎と胸部脊椎との相互移植を更に行った。この実験で得たラジオグラフィーは、
脊椎動物間で0/9個の負の対照移植片が骨形成(脊椎固定)を示すことを実証
している。pCMV−LMP−1sで処理した移植片は9個ともに、脊椎動物間
での固形骨固定を示した。
ngland Biologicals社、マサチューセッツ州シティー)で消
化した。小断片(〜250塩基対)をゲル精製した。クローン7(実施例18)
をClaI及びXbalで消化した。1400塩基対断片をその消化物からゲル
精製した。単離した250塩基対及び1400塩基対のcDNA断片を、標準法
によって連結し、〜1650塩基対の断片を作成した。pHis−Aベクター(
InVitrogen社)をEcoRV及びXbaIで消化した。線型化したベ
クターを回収して1650塩基対のキメラcDNA断片に連結した。連結した産
物を標準法によってクローンし増幅した。pHisA−5’ATG LMP−1
s発現ベクター(HLMP−1sを挿入したベクターpHis−Aとも称する)
を上記したようにATCCに寄託した。
実施例1で述べたように刺激を加えないか又はグルココルチコイド(GC)で刺
激を加えた。組替えpHis−AベクターDNAを3μg/ウェルの量で用いて
、実施例25と同様に培養をトランスフェクトした。鉱化した小結節を実施例3
に記したようにフォンコッサ染色で可視化した。
外の骨小結節形成(〜203小結節/ウェル)を誘発した。小結節のレベルはG
Cの正の対照によって誘発されるレベル(〜412小結節/ウェル)の約50%
であった。pHisA−LMP−Rat発現ベクターでトランスフェクトした培
養(〜152小結節/ウェル)及びpCMV2/LMP−Rat−Fwd発現ベ
クターでトランスフェクトした培養(〜206小結節/ウェル)について、同様
な結果が得られた。一方、負の対照はpCMV2/LMP−Rat−Rev発現
ベクター(〜2小結節/ウェル)及び非処理(NT)プレート(〜4小結節/ウ
ェル)という結果であった。これらのデータはヒトLMP−1cDNAが少なく
ともこのモデル系におけるラットLMP−1cDNA程度には骨形成刺激を与え
ることを実証している。効果はGC刺激を行った場合よりも少なかったが、しか
しある場合においては効果が比較可能であった。
はHLMP−1sの過剰発現は、負の対照において観察された小結節形成より有
意に大きな形成を引き起こした。LIM鉱化蛋白質の作用メカニズムを研究する
ために、調節された培養基を異なる時点で回収し、10倍に濃縮し、無菌濾過し
、新鮮な血清を含む培養基中で元の濃度に希釈し、トランスフェクトされていな
い細胞に4日間適用した。
ら回収した調節培養基は、トランスフェクトされた細胞中でRLMP−1が直接
過剰発現されるのとほぼ同じくらい、小結節形成の誘発に効果的であった。逆方
向のRLMP−1又はHLMP−1でトランスフェクトされた細胞から回収した
調節培養基は、小結節形成についてはっきりとした効果を示さなかった。又、第
4日以前にLMP−1でトランスフェクトされた培養から得た調節培養基も、小
結節形成を誘発しなかった。これらのデータは、LMP−1の発現が可溶因子の
合成及び/又は分泌を引き起こしており、トランスフェクションから4日目まで
は培養基中に有効量が産生されていなかったことを示唆している。
、ウエスタンブロット分析を用いてLMP−1蛋白質が培養基中に存在するかど
うかを調べた。rLMP−1蛋白質の存在を、LMP−1に特異な抗体(QDP
DEE)を用いて評価し、従来法によって検出した。LMP−1蛋白質は培養の
細胞層中のみに見られ、培養基中からは検出されなかった。
よる標準的希釈と、DE−52陰イオン交換バッチクロマトグラフィー(100
mM又は500mM NaCl)によって行った。全ての活性が高濃度の硫酸ア
ンモニウムと高濃度のNaClを用いた画分に観察された。このように偏った結
果は、1個の要因が培養基の調節を担っているという可能性に一致する。
るが、本開示を読んだ当業者にとっては、本発明の範囲から離れることなく形態
及び詳細において様々な改変が可能であることを理解されるはずである。
Claims (48)
- 【請求項1】 ヒトLMPをコードするヌクレオチド配列を包含する単離さ
れた核酸分子にして、配列番号25の全長に相補的な核酸分子に標準条件下でハ
イブリダイズし、そして配列番号26の全長に相補的な核酸分子に強度の緊縮条
件下でハイブリダイズする核酸分子。 - 【請求項2】 配列番号33を包含するHLMP−1sであることを特徴と
する、請求項1に記載の核酸分子。 - 【請求項3】 配列番号22を包含するHLMP−1であることを特徴とす
る、請求項1に記載の核酸分子。 - 【請求項4】 配列番号25の全長に相補的な核酸分子に標準条件下でハイ
ブリダイズし、そして配列番号26の全長に相補的な核酸分子に強度の緊縮条件
下でハイブリダイズする単離された核酸分子にコードされるヒトLMP蛋白質。 - 【請求項5】 配列番号34のアミノ酸配列を包含することを特徴とする、
請求項4に記載の蛋白質。 - 【請求項6】 ラットLMP蛋白質をコードするヌクレオチド配列を包含す
る単離された核酸分子にして、配列番号2の全長に相補的な核酸分子に標準条件
下でハイブリダイズする核酸分子。 - 【請求項7】 配列番号2の全長に相補的な核酸分子に標準条件下でハイブ
リダイズする単離された核酸分子にコードされるラットLMP蛋白質。 - 【請求項8】 請求項1、2、3及び6のいずれかに記載の単離された核酸
分子を包含するベクター。 - 【請求項9】 請求項8に記載のベクターを包含する宿主細胞にして、原核
細胞、酵母菌及び哺乳類細胞からなる群より選ばれてなる宿主細胞。 - 【請求項10】 更に検出用の標識を包含する、請求項1、2、3及び6の
いずれかに記載の核酸分子。 - 【請求項11】 配列番号10及び配列番号34のアミノ酸配列からなる群
より選ばれてなる1種を包含するヒトLIM核酸分子。 - 【請求項12】 配列番号1のアミノ酸配列を包含するラットLIM鉱化蛋
白質。 - 【請求項13】 ヒトLIM鉱化蛋白質の発現により誘発される骨形成誘発
可溶因子。 - 【請求項14】 蛋白質であることを特徴とする、請求項13に記載の可溶
因子。 - 【請求項15】 ヒトLIM鉱化蛋白質に特異なモノクローナル抗体。
- 【請求項16】 ヒトLIM鉱化蛋白質がHLMP−1(配列番号10)で
あることを特徴とする、請求項15に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項17】 ヒトLIM鉱化蛋白質がHLMP−1s(配列番号34)
であることを特徴とする、請求項15に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項18】 ヒトLIM鉱化蛋白質に特異なポリクローナル抗体。
- 【請求項19】 ヒトLIM鉱化蛋白質がHLMP−1(配列番号10)で
あることを特徴とする、請求項18に記載のポリクローナル抗体。 - 【請求項20】 ヒトLIM鉱化蛋白質がHLMP−1s(配列番号34)
であることを特徴とする、請求項18に記載のポリクローナル抗体。 - 【請求項21】 ラットLIM鉱化蛋白質(配列番号1)に特異なモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項22】 ラットLIM鉱化蛋白質(配列番号1)に特異なポリクロ
ーナル抗体。 - 【請求項23】 LIM鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列を包含す
る単離した核酸分子で骨形成前駆細胞をトランスフェクトすることを包含する骨
形成誘発の方法。 - 【請求項24】 単離した核酸分子がベクター内にあることを特徴とする、
請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 ベクターが発現ベクターであることを特徴とする、請求項
24に記載の方法。 - 【請求項26】 ベクターがプラスミドであることを特徴とする、請求項2
5に記載の方法。 - 【請求項27】 ベクターがウイルスであることを特徴とする、請求項25
に記載の方法。 - 【請求項28】 ウイルスがアデノウイルスであることを特徴とする、請求
項27に記載の方法。 - 【請求項29】 ウイルスがレトロウイルスであることを特徴とする、請求
項27に記載の方法。 - 【請求項30】 骨形成前駆細胞がエクスビボでトランスフェクトされるこ
とを特徴とする、請求項23に記載の方法。 - 【請求項31】 単離された核酸分子の直接投与によって骨形成前駆細胞が
生体内でトランスフェクトされることを特徴とする、請求項23に記載の方法。 - 【請求項32】 LIM鉱化蛋白質がHLMP−1(配列番号10)である
ことを特徴とする、請求項23に記載の方法。 - 【請求項33】 LIM鉱化蛋白質がHLMP−1s(配列番号34)であ
ることを特徴とする、請求項23に記載の方法。 - 【請求項34】 LIM鉱化蛋白質がRLMP(配列番号1)であることを
特徴とする、請求項23に記載の方法。 - 【請求項35】 (a)LIM鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列を
包含する単離された核酸分子で骨形成前駆細胞をトランスフェクトし; (b)トランスフェクトされた骨形成前駆細胞を基質に混合し;そして (c)基質を脊椎に接触させる ことを包含する脊椎固定の方法にして、 LIM鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列の発現によって基質中の鉱化骨
形成が誘発されることを特徴とする方法。 - 【請求項36】 骨形成前駆細胞がエクスビボでトランスフェクトされるこ
とを特徴とする、請求項35に記載の方法。 - 【請求項37】 LIM鉱化蛋白質が、HLMP−1(配列番号10)、H
LMP−1s(配列番号34)及びRLMP(配列番号1)からなる群より選択
されてなることを特徴とする、請求項35に記載の方法。 - 【請求項38】 (a)LIM鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列と
、調節可能なプロモーター(該プロモーターは外因性の制御化合物に応答し、L
IM鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する)とを包含する
、骨形成前駆細胞中で安定的に維持されるベクターで骨形成前駆細胞をトランス
フェクトし;そして (b)LIM鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列の発現を誘発するのに
十分な量の外因性の制御物質を必要に応じて宿主に投与する ことを包含する、全身性骨形成が必要な哺乳類宿主中で全身性骨形成を誘発する
方法。 - 【請求項39】 LIM鉱化蛋白質が、HLMP−1(配列番号10)、H
LMP−1s(配列番号34)及びRLMP(配列番号1)からなる群より選択
されてなることを特徴とする、請求項38に記載の方法。 - 【請求項40】 (a)LIM鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列を
包含する単離された核酸分子で骨形成原細胞をトランスフェクトし;そして (b)単離された核酸分子を過剰発現させる ことを包含する、骨形成原細胞による骨形成可溶因子の産生を刺激する方法。 - 【請求項41】 請求項40に記載の方法により産生された骨形成可溶因子
。 - 【請求項42】 蛋白質であることを特徴とする、請求項41に記載の因子
。 - 【請求項43】 LIM鉱化蛋白質がアンチセンスオリゴヌクレオチドで発
現されることを特徴とする、細胞をトランスフェクトすることを包含するLIM
鉱化蛋白質発現を阻害する方法。 - 【請求項44】 アンチセンスヌクレオチドが配列番号35のヌクレオチド
配列を有することを特徴とする、請求項43に記載の方法。 - 【請求項45】 ヒトLMPをコードするヌクレオチド配列を包含する単離
された核酸分子にして、配列番号25の全長に相補的な核酸分子に標準条件下で
ハイブリダイズする核酸分子。 - 【請求項46】 ヒトLMPをコードするヌクレオチド配列を包含する単離
された核酸分子にして、配列番号26の全長に相補的な核酸分子に強度の緊縮条
件下でハイブリダイズする核酸分子。 - 【請求項47】 単離された核酸分子が、プラスミド及びウイルスからなる
群より選ばれてなるベクター内にあることを特徴とする、請求項31に記載の方
法。 - 【請求項48】 ベクターが、筋肉組織に直接投与されるプラスミドである
ことを特徴とする、請求項47に記載の方法。
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