JPH06256210A - 骨関連転写制御因子様タンパク質およびその製造法 - Google Patents

骨関連転写制御因子様タンパク質およびその製造法

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JPH06256210A
JPH06256210A JP5048875A JP4887593A JPH06256210A JP H06256210 A JPH06256210 A JP H06256210A JP 5048875 A JP5048875 A JP 5048875A JP 4887593 A JP4887593 A JP 4887593A JP H06256210 A JPH06256210 A JP H06256210A
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dna
osf
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bone
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Makoto Okazaki
誠 岡崎
Atsushi Takeshita
淳 竹下
Shinji Kawai
伸治 河合
Reiko Kikuno
玲子 菊野
Egon Aman
アマン・エゴン
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 マウス、ヒトを含む哺乳動物の骨組織から得
られるＯＳＦ−６と名付けられた骨関連蛋白質。本蛋白
質は骨形成において、重要な役割を担っている新しい天
然型哺乳類蛋白質であり、転写制御因子に属する蛋白質
である。 【効果】 ＯＳＦ−６は、骨疾患の治療剤として用いる
ことができ、また骨に対する臓器特異性が高く、骨疾患
の診断薬として用いることもできる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な骨関連タンパク
質を提供する。さらに詳しくは、本発明のタンパク質は
ＯＳＦ−６と名付けられたものであり、転写制御因子分
子のグループに属するものである。また、このＯＳＦ−
６はマウスまたはヒトを含むほ乳動物の骨組織より得る
ことができる。さらに本発明は、動物細胞などの培養細
胞を用いた組換え遺伝子技術によるＯＳＦ−６製造方法
を提供する。
【０００２】
【発明の背景】骨代謝性疾患と総称される疾患の中に
は、骨粗鬆症(Osteoporosis)、ページェット病(Paget's
disease)、骨軟化症、過骨形成症、大理石病等が含ま
れ、このうち、特に骨粗鬆症は発生頻度が閉経後の女性
及び老齢人口の約半分を越える程に高く、その診断と有
効な治療法が強く望まれている。
【０００３】骨代謝性疾患とは、何らかの骨組織におけ
る、細胞レベルでの、骨に特異的な代謝の変調を伴うも
のであり、骨の代謝に特異的に関与する因子の発見、分
離そして同定は、この代謝の異常を明らかにするための
非常に有効な道具となりうる。本発明者等は、これらの
骨の代謝に特異的な因子の発見のために鋭意研究し、つ
いに、本研究を完成させるに至ったものである。
【０００４】より詳しくは、本発明者等は、特に、骨形
成において主要な働きをする骨芽細胞の細胞株を用い、
この細胞株により特異的に生成されるタンパク性因子を
同定したものである。さらに、本発明は、こうした研究
によって得られた、従来知られている種々の転写制御因
子とアミノ酸配列上で強いホモロジーを有する実質的に
骨特異的なＯＳＦ−６と名付けられた新規なタンパク質
を提供する。
【０００５】本発明のＯＳＦ−６は、本明細書に記載さ
れたＤＮＡ配列から当業者において公知の通常の遺伝子
工学的手法によっても生産でき、また本明細書に記載の
アミノ酸配列から、化学的なペプチド合成法により、Ｏ
ＳＦ−６又はその断片を生産することができる。さら
に、本発明に記載されたＯＳＦ−６のＤＮＡ配列の特に
他の転写制御因子に対し、ＯＳＦ−６の特異性の高い部
分配列を通常のオリゴヌクレオチド化学合成法により、
１５〜５０塩基長で合成し、骨由来細胞を識別診断する
ＤＮＡプローブとして使用することができる。このよう
な骨由来細胞の識別は、特に、転移再発性癌の由来を識
別するために有用であり、適切な再発性癌の治療をもた
らす。さらにＯＳＦ−６の部分ペプチドのうち、抗体の
認識しうるエピトープ(epitope)部分のペプチドは、Ｏ
ＳＦ−６に特異的なモノクローナル抗体を作成するため
に使用できる。こうして得られたモノクローナル抗体
は、免疫学的細胞組織染色法により骨由来細胞の同定に
有用である。
【０００６】以下に本発明で提供されるＯＳＦ−６が属
する転写制御因子グループのタンパク質について知られ
ている従来の知見をまとめてみた。
【０００７】
【従来の技術】高等生物において、細胞の分化や発生と
いう現象は、時間的かつ空間的に、複雑に制御された遺
伝子発現の結果であるといえる。従って、このような生
命現象を理解するためには、遺伝子発現の調節機構を解
明することが重要である。多くの場合、遺伝子の発現調
節は転写レベルで行われている。これまでの真核細胞生
物における研究から、ＤＮＡ上のある特定の塩基配列に
結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を活性化す
る蛋白性の転写制御因子の存在が明らかとなってきた。
転写制御因子が細胞の増殖や分化、その集積として個体
レベルでの発生や組織形成に重要な役割を果たしている
ことは、形態形成に必須であるホメオボックス遺伝子や
筋細胞の分化因子Ｍｙｏ Ｄ、またｊｕｎやｆｏｓなど
の癌遺伝子がＤＮＡ結合能をもつ転写因子をコードして
いることからも明らかである。
【０００８】これまでにクローニングされた転写制御因
子の分子構造と機能ドメインの解析から、典型的な転写
制御因子にはＤＮＡ結合領域と転写活性化領域が存在
し、それぞれいくつかのモチーフに分類されることが知
られている(Mitchel and Tjian, (1989) Science, vo
l．245, p.371〜378)。DNA結合領域として分類されるも
のには、Ｚｎフィンガー(zinc-finger)、ホメオドメイ
ン(Homeodomain)、ロイシンジッパー(Leucine zipper)
等がある。このうち、Ｚｎフィンガーは近接したおのお
の２残基のシステイン(cysteine)とヒスチジン(histidi
ne)を介してＺｎ2+を配位した高次構造をとるもので、
これまで多くのＤＮＡ結合タンパク質で見つかってい
る。ホメオドメインは、形態形成に重要な役割を果たす
ホメオボックス遺伝子産物に高度に保存されている領域
で、約６０のアミノ酸がヘリックス-ターン-ヘリックス
を構成している。また、ロイシンジッパーはヘリックス
構造の中で７つおきに存在するＬｅｕ残基が同一面上に
並び２量体の形成に関与するもので、直接ＤＮＡと相互
作用するのは隣接する塩基性アミノ酸領域であると考え
られている。一方、転写活性化領域として分類されるも
のには、酸性アミノ酸領域、グルタミン酸に富む(Gluta
mic acid-rich)領域、プロリンに富む(Prolin-rich)領
域等が知られている。これらの転写活性化領域による転
写促進のメカニズムについてはまだ解明されていない
が、最近、酵母を用いた研究から、転写活性化領域が直
接転写開始複合体と相互作用することが示された。さら
に、この相互作用はアダプター(Adaptor)あるいはメデ
ィエーター(Mediator)と呼ばれる非ＤＮＡ結合性の蛋白
因子を介していることが示唆され、実際にAdaptorとし
て機能していると考えられる分子のｃＤＮＡクローニン
グもなされている(Berger et al., (1992) Cell, vol．
70, p.251〜265) 。
【０００９】一方、骨形成過程において中心的な役割を
担う骨芽細胞は、未分化の間葉系細胞 (mesenchymal ce
ll)から分化すると考えられている。この細胞は、骨芽
細胞の他に筋芽細胞や脂肪細胞へも分化し得ることが知
られているが、成熟した骨芽細胞がどのような分化過程
を経ているのかについては不明な点が多い。骨成長因子
として知られるＢＭＰ(Bone morphogenetic protein)(W
ozney et al., (1988)Science, vol．242, p.1528〜153
4)はある種のストローマ細胞株(stromal cellline)を骨
芽細胞様細胞に分化させる能力をもつという報告がある
(Yamaguchi et al., (1991) J. Cell Bio., vol．113,
p.681〜687, Thies et al., (1992) Endocrinology, vo
l．130, p.1318〜1324) が、どのようなメカニズムで骨
関連遺伝子の発現がもたらされるのかということに関し
てはほとんど明らかにされていない。また、骨芽細胞の
分化過程においてもＩ型コラーゲンやアルカリホスファ
ターゼ、さらにオステオポンチンやオステオカルシン等
の骨基質タンパク質の差次的遺伝子発現が認められ、こ
れらの遺伝子の発現調節が骨芽細胞の分化すなわち骨形
成過程に重要であると考えられる。骨形成に関与する転
写制御因子として知られているものには、オステオポン
チンやオステオカルシン遺伝子の上流領域に結合し、そ
の転写を促進するビタミンＤレセプターや、発生過程に
おいて骨・軟骨組織で多量に発現しているｃ−Ｆｏｓな
どがあるが、骨芽細胞特異的な転写制御因子は未だ報告
されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、骨細胞、なかでもは骨芽細胞に特異的に発現してい
る新しいタイプの転写制御因子を見いだす事である。こ
うした骨由来の転写制御因子は主に骨形成期において、
骨形成に必須である様々な遺伝子の発現を調節すること
で、諸々の骨代謝疾患への治療効果が期待できる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】マウスＯＳＦ−６のｃＤ
ＮＡは、マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１由来
のｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ(Polymerase chai
n reaction)法とサブトラクション(Subtraction)法を組
み合わせた方法によりｃＤＮＡライブラリーを作成し、
ディファレンシャルスクリーニング(Differential scre
ening)法によってクローン化した。得られたクローンを
ＯＳＦ−６と名付け、その塩基配列を決定した。ＯＳＦ
−６のｃＤＮＡの塩基配列は現在利用できる種々のＤＮ
Ａ及びアミノ酸配列データベースによる検索で、新規で
ある事が明らかにされた。
【００１２】ＯＳＦ−６は一般に分泌型タンパク質で知
られているシグナルペプチドは有していない。ＯＳＦ−
６はＮ末端より１２８番目のシステインから１６３番目
のヒスチジンまでの領域にＺｎフィンガー様のモチーフ
を持つ。このシステインに富む領域はショウジョウバエ
(Drosophila)ｒｅｆ(２)Ｐ遺伝子産物(Dezelee et al.,
(1989) The EMBO J., vol．8, p.3437〜3446) 、酵母の
ＡＤＡ２(Berger et al., (1992) Cell, vol．70，p.25
1〜265) などと相同性を示す。これらの分子の機能は明
らかではないが、ＡＤＡ２はエンハンサー結合蛋白のよ
うな転写制御因子と、ＴＡＴＡ ｂｏｘ結合タンパクの
ような基本的転写制御因子を物理的に相互作用させるbr
idging molecule(adaptor)としての機能が推定されてい
る。この領域を挟むようにして、塩基性アミノ酸のクラ
スターが２か所(100〜110、181〜192番目)存在する。既
知のＤＮＡ結合タンパク質の中では、ロイシンジッパー
に隣接する塩基性アミノ酸領域が直接ＤＮＡへ結合する
という報告があり、ＯＳＦ−６のこの領域もＺｎフィン
ガー様モチーフとともにＤＮＡへの結合に関与している
可能性がある。１９６番目から２３２番目にはプロリン
に富むドメイン(Prolin−rich domain)がある。この領
域のプロリン含有率は約３０％に達し、ＣＴＦ／ＮＦ−
１などいくつかの転写制御因子で報告されている転写活
性化ドメインに相当する領域であると考えられる。ＯＳ
Ｆ−６のＣ末端領域(３９２〜４４２番目)はｒｅｆ(２)
Ｐ遺伝子の第３エクソンがコードするドメイン(同じく
Ｒｅｆ(２)Ｐタンパク質のＣ末端に相当する)と約４０
％の相同性を示しており、機能的な相関を示唆してい
る。ＯＳＦ−６は全体的に親水性であり、塩基性または
酸性のアミノ酸を多く含む荷電したタンパク質である。
【００１３】一般に、ＯＳＦ−６はヒト、ウシ、マウス
またはその他の材料から、公知の生化学的技術により、
直接骨組織または軟骨組織から抽出する事ができる。ま
た、ＯＳＦ−６をコードするＤＮＡは、脊椎動物の骨組
織から抽出したｍＲＮＡより作成したｃＤＮＡライブラ
リーまたはゲノム遺伝子ライブラリーから、本明細書中
で開示されたマウスのｃＤＮＡ塩基配列の断片を標識し
てプローブとして用い、得る事ができる。全長ｃＤＮＡ
クローンは上記の及び他の標準的な分子生物学的な技術
を組み合わせて得る事ができる。
【００１４】本発明は、さらに、ＯＳＦ−６のアナログ
を提供する。即ち、ミュータント、融合蛋白及びＯＳＦ
−６ならびにそのアナログを含む断片を提供する。本発
明はまた、組換え遺伝子技術によるＯＳＦ−６の製造方
法を提供する。
【００１５】本発明をより具体的に説明するために、以
下に実施例を示す。
【００１６】
【実施例】
〔実施例１〕 サブトラクション／ＰＣＲ ｃＤＮＡラ
イブラリーの作成 この実施例では、骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に
特異的なｃＤＮＡライブラリーの構築について記述す
る。このｃＤＮＡライブラリーは、サブトラクション法
とＰＣＲ法を組み合わせることにより、マウス肝組織で
発現している遺伝子を差し引いたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のｃ
ＤＮＡライブラリーであり、各ｃＤＮＡクローンは平均
約３００塩基対の遺伝子断片を有し、さらに、本来含有
量の少ない遺伝子をも増幅されるという特徴を有してい
る。
【００１７】全ての一般的な組換えＤＮＡ技術に関する
手順(protocol)は、特に他に断らなければ、サムブルッ
ク(Sambrook)らによる「Molecular Cloning Manual」(1
989、Cold Spring Harbor Laboratory社、米国、Cold S
pring Harbor)に準じて行った。総ＲＮＡはグアニジン
法により、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞及びマウス肝組織のそ
れぞれ８×１０7個、約１ｇから抽出した。ポリＡ+ＲＮ
Ａは、総ＲＮＡから市販の「オリゴｄＴラテックスｍＲ
ＮＡ精製キット（宝酒造（株））により精製した。各１
μｇのポリＡ+ＲＮＡを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット
(Amersham社)を用いてｃＤＮＡを合成した。ただし、オ
リゴｄＴプライマーの代わりにランダムプライマーを用
い、通常使用量の１.５倍量を使用した。これにより、
ｃＤＮＡ鎖伸長反応を平均約３００塩基に制限した。上
記のキットを用いて２本鎖平滑末端にした後、下記の２
種類の合成ＤＮＡリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造（株））により、それぞれＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡ
にはＡＴＯＳ−１／２を、肝臓ｃＤＮＡにはＡＴＯＳ−
４／５を結合した。 ATOS-1/2 ATOS-1 5′- CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3′ ATOS-2 3′-ACACGAGAACGAACTTAAGCCTGAT-5′ ATOS-4/5 ATOS-4 5′- CTCTTGCTTAAGCTTGGACTA-3′ ATOS-5 3′-ACACGAGAACGAATTCGAACCTGAT-5′ 次に、各反応産物について、ＡＴＯＳ−１とＡＴＯＳ−
４をそれぞれプライマーとして用いたＰＣＲ(Polymeras
e Chain Reaction)法により、ＤＮＡの増幅を行った。
増幅したＤＮＡの濃度は「ＤＮＡ濃度測定キット“DNA
Dipstick"」(Invitrogen社)を用いて測定した。サブト
ラクション法はフォトビオチン(Photobiotin, Pirce社)
を用いて行った。ＰＣＲ法により増幅した２０μｇの肝
臓ｃＤＮＡに２０ｎｇのフォトビオチンを加え、サンラ
ンプを１０ｃｍ隔て１０分間照射することにより、ＤＮ
Ａをビオチンで標識した。この標識した肝臓ｃＤＮＡ
３.０μｇに標識していないＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ｃＤＮＡ
０.３μｇを加え、ハイブリダイゼーションを行った。
次いで、これにストレプトアビジン(Streptavidin,宝酒
造（株）)を反応させ、フェノール抽出することによ
り、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡから肝臓ｃＤＮＡと共通
するｃＤＮＡを除いた。サブトラクション法を再度繰り
返して行い、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ｃＤＮＡから肝臓ｃＤ
ＮＡと共通するものをできるだけ除いた。さらに、上記
のＡＴＯＳ−１を用いたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅
し、ＤＮＡ濃度を測定した。このｃＤＮＡ １０ｎｇを
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、ＥｃｏＲＩで消化し
末端を脱リン酸化したファージベクターλｇｔ１０（λ
ｇｔ１０／ＥｃｏＲＩクローニングキット，Stratagene
社) １μｇとＴ４リガーゼを用いて連結した。これを市
販のインビトロパッケージングキット(in vitro packag
ing kit)「ギガパックゴールド(Gigapack-gold)」(Stra
tagene社)を用いて、λファージ粒子にパッケージング
した。この組換え体ファージを大腸菌Ｃ６００（日本予
防衛生研究所、日本癌研究資源バンクにＨＴ００３とし
て保存されている）に感染させ、軟寒天培地とともに寒
天培地上にまき、ファージプラークを形成させ感染効率
を測定したところ、１μｇのｃＤＮＡあたり３×１０6
のファージプラークが得られた。
【００１８】さらに、このｃＤＮＡライブラリーからデ
ィファレンシャルスクリーニング(Differential screen
ing)法を用い、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異性の高いクロー
ンを選択した。すなわち、２.２５×１０4個のファージ
を計１０枚のプレートにまき、それぞれ２枚（計２０
枚）のナイロンメンブレンフィルターに移した。これら
のうち、一方は放射能でラベルしたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の
ｃＤＮＡを、また他方は同様にラベルした肝臓ｃＤＮＡ
をプローブとしてプラークハイブリダイゼーション法を
行った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ｃＤＮＡプローブでシグナ
ルが認められ、かつ、肝臓ｃＤＮＡプローブでシグナル
の認められない２７３クローンをミニライブラリーと
し、以後の実験に用いた。
【００１９】〔実施例２〕 マウスＯＳＦ−６クローン
の単離 この実施例では、上記の実施例１で作成したミニライブ
ラリーから、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異的なクローンとし
て、ＯＳＦ−６の部分的ｃＤＮＡ断片を同定し、さら
に、これを用いてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のｃＤＮＡライブラ
リーから、完全長ｃＤＮＡをクローニングする方法につ
いて記述している。
【００２０】実施例１で調製したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１及び
肝臓の各総ＲＮＡを、それぞれ１μｇずつナイロンメン
ブレンフィルターにスポットし、このフィルターを２７
３個作成して、以下のハイブリダイゼーションに用い
た。一方、実施例１で作成した２７３個のファージクロ
ーンの挿入部分のＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅した。
このＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、主なバン
ドを切り出して精製し、放射能でラベルしてプローブと
して用いた。オートラジオグラフィーの結果、ＭＣ３Ｔ
３−Ｅ１でシグナルが認められ、しかも肝臓でシグナル
が認められないクローンについてプラスミドベクターに
リクローニング(recloning)した。つまり、ＰＣＲ法に
より増幅し精製した挿入部分のＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化し、プラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒
造（株））のＥｃｏＲＩサイトにリクローニングした。
これらのクローンについて、市販の「ＤＮＡシーケンシ
ングキット」（宝酒造（株））を用いユニバーサルプラ
イマーにて塩基配列を決定した。得られた塩基配列につ
いてＤＮＡ及びタンパク質のデータベースを検索したと
ころ、既存のＤＮＡ及びタンパク質とは同一でない新規
のクローンが見出され、これをｐＭＣＬＳ ６と命名
し、これを用いて以後の完全長ｃＤＮＡのクローニング
を行った。
【００２１】完全長ｃＤＮＡクローニングのために、実
施例１で精製したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のポリＡ+ＲＮＡ ５
μｇから「ｃＤＮＡ合成キット」(cDNA synthsis syste
m plus, Amersham社)を用いて平滑末端２本鎖ｃＤＮＡ
を合成した。これにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプター
（宝酒造（株））をＴ４リガーゼを用いて連結した後、
アガロースゲル電気泳動を行って約７００塩基対以上の
フラクションを精製した。この断片をλｇｔ１０ファー
ジベクター(Stratagene社)のＥｃｏＲＩサイトに連結
し、実施例１と同様にパッケージングした後、大腸菌に
感染させ感染効率を測定したところ、１μｇのベクター
ＤＮＡあたり１.５×１０7であった。前述のｐＭＣＬＳ
６を放射能ラベルしてプローブとして用い、このｃＤ
ＮＡライブラリー１.０×１０6個のファージクローンを
プラークハイブリダイゼイション法によりスクリーニン
グした。その結果、最終的に１１個のポジティブクロー
ンが得られた。これらのファージクローンのＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行ったと
ころ、挿入断片中に２か所のＥｃｏＲＩサイトが存在す
ることが明らかになった。そこで、これらのクローンの
うち、最も長い挿入断片をもつファージクローンの３つ
のＥｃｏＲＩ断片（約１.７ｋｂ，０.１５ｋｂ，０.２
ｋｂ）を、別々にプラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝
酒造（株））のＥｃｏＲＩサイトにリクローニングし、
それぞれｐＫＯＴ９７、ｐＫＯＴ１０５、ｐＫＯＴ１０
９と命名した。また、各ＥｃｏＲＩフラグメントの連結
部位の塩基配列を決定するために、ＯＳＦ−６ ｃＤＮ
Ａを含むファージのＢｇｌII−ＨｉｎｄIIIフラグメン
トをｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトに
クローニングし、さらに、このプラスミドからＯＳＦ−
６ ｃＤＮＡの２つのＥｃｏＲＩサイトを含むＰｓｔＩ
−ＳａｃＩフラグメント（約１.３ｋｂ、ファージ由来
のＤＮＡを約０.９ｋｂ含む）をｐＵＣ１１８にサブク
ローニングして、ｐＫＯＴ１０３と命名した。
【００２２】〔実施例３〕 マウスＯＳＦ−６のＤＮＡ
配列 ｐＫＯＴ９７及びこのｃＤＮＡ断片を有するサブクロー
ン(subclone)から、「キロシークエンス用デレーション
キット」（宝酒造（株））を用いて、それぞれ約３００
塩基対おきに両方向からのデレーションミュータントを
作成した。それぞれのデレーションミュータントの塩基
配列の決定は、米国Applied Biosystems社製の自動ＤＮ
Ａシークエンサー・モデル３７３Ａ(automatic DNA seq
uencer)を用いて行った。ｐＫＯＴ１０３、ｐＫＯＴ１
０５、ｐＫＯＴ１０９及びそれらのｃＤＮＡ断片を有す
るサブクローンの塩基配列の決定も同様に行った。これ
らを連結して得られた完全長ｃＤＮＡの塩基配列と、塩
基配列より翻訳したアミノ酸配列を配列表の配列番号１
に示した。このｃＤＮＡにコードされるタンパク質をマ
ウスＯＳＦ−６と名付けた。アミノ酸残基の番号１は予
想されるマウスＯＳＦ−６タンパク質のＮ末端に相当す
る。また、推定されるタンパク質の構造模式図を図１
に、このＤＮＡの制限酵素地図を図４に示した。得られ
たｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を改めて現在使
用できるＤＮＡ及びタンパク質データベースで検索した
ところ、ＯＳＦ−６はショウジョウバエＲｅｆ(２)Ｐ、
酵母ＡＤＡ２と部分的な相同性を示す新規のタンパク質
であることが明かにされた。
【００２３】〔実施例４〕 マウスＯＳＦ−６の組織特
異的発現 マウスＯＳＦ−６の発現の組織特異性を検討するために
ＲＮＡドットブロッティング(RNA dot blotting)を行っ
た。マウス(日本クレアから購入)の胸腺、脾臓、脳、腎
臓、肝臓、肺、睾丸及び心臓の総ＲＮＡをグアニジン法
により調製した。頭蓋冠由来の骨芽細胞を多く含む細胞
は、新生児マウスの頭蓋冠から調製し、これを培養して
得た。さらに、この細胞から総ＲＮＡを前述と同様な方
法で抽出した。上記の組織、頭蓋冠培養細胞、ＭＣ３Ｔ
３−Ｅ１及びマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３(ATCC CR
L 1658)の各総ＲＮＡ １μｇをナイロンメンブレンフィ
ルター(Biodyne, PALL社)にドットし、加熱固定した後
に、ハイブリダイゼーションに用いた。一方、ｐＫＯＴ
９７をＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に
より１.７ｋｂのフラグメントを分離精製し、放射能で
ラベルしてプローブとして用いた。オートラジオグラフ
ィーの結果、頭蓋冠初代培養細胞とＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に
強いシグナルが認められ、また、脳、腎臓、睾丸の各組
織で弱いシグナルが認められた。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１にお
ける発現レベルは培養期間の増加に伴って上昇していた
（培養６０日目の細胞で最も強い発現が認められた）。
【００２４】〔実施例５〕 大腸菌でのＯＳＦ−６の発
現及び抗マウスＯＳＦ−６抗血清の調製 マウスＯＳＦ−６のｃＤＮＡのコーディング領域は、ｐ
ＧＥＸなどの市販の大腸菌発現用ベクターにクローニン
グすることにより、ＧＳＴ(glutathion-S-transferase)
やｌａｃＺとの融合蛋白として、大腸菌内で大量に発現
させることができた。菌体内の融合蛋白は、一般的な生
化学的技術により精製することができた。得られた組換
えＯＳＦ−６タンパク質は、抗ＯＳＦ−６抗体を作成す
る際の抗原として使用することができた。
【００２５】〔実施例６〕 動物細胞でのＯＳＦ−６の
発現 マウスＯＳＦ−６の全長ｃＤＮＡ領域を含むＮｏｔＩ断
片（２.０ｋｂ）は、適当な動物細胞発現用ベクターに
クローニングし、カルシウム・リン酸共沈法など従来の
トランスフェクションの方法を用いて、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ：Chinese Hamster Ovary）
に導入・発現させることができた。遺伝子を導入した細
胞はｎｅｏrなどの薬剤耐性遺伝子によって、クローン
化することができた。得られた細胞は、動物細胞でのＯ
ＳＦ−６の生産等に用いることができた。
【００２６】
【発明の効果】本発明により提供されるＯＳＦ−６は、
骨代謝性疾患の治療剤として用いることができ、また、
骨に対する臓器特異性が高いので骨代謝性疾患の診断剤
として用いることもできる。
【００２７】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：2005 配列の型：核酸 鎖の数：二重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：マウス(Mus musculus) 株名：骨芽細胞株 MC3T3E1 配列の特徴： 配列 GTCCGTACCT AGACCGCGGT T ATG GCG TCG TTC ACG GTG AAG GCC TAT CTT 51 Met Ala Ser Phe Thr Val Lys Ala Tyr Leu 1 5 10 CTG GGC AAG GAG GAG GCG ACC CGC GAG ATC CGC CGC TTC AGC TTC TGC 99 Leu Gly Lys Glu Glu Ala Thr Arg Glu Ile Arg Arg Phe Ser Phe Cys 15 20 25 TTC AGC CCG GAG CCG GAG GCG GAA GCC CAA GCC GCG GCC GGC TCG GGG 147 Phe Ser Pro Glu Pro Glu Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala Gly Ser Gly 30 35 40 CCC TGC GAG AGG CTG CTG AGC CGA GTG GCT GTG CTG TTC CCC ACG CTG 195 Pro Cys Glu Arg Leu Leu Ser Arg Val Ala Val Leu Phe Pro Thr Leu 45 50 55 AGG CCT GGC GGC TTC CAG GCG CAC TAC CGC GAT GAG GAT GGG GAC TTG 243 Arg Pro Gly Gly Phe Gln Ala His Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Asp Leu 60 65 70 GTT GCC TTT TCC AGT GAT GAG GAG CTG ACA ATG GCT ATG TCC TAT GTG 291 Val Ala Phe Ser Ser Asp Glu Glu Leu Thr Met Ala Met Ser Tyr Val 75 80 85 90 AAA GAT GAC ATC TTC CGC ATC TAC ATT AAA GAG AAG AAG GAG TGC CGG 339 Lys Asp Asp Ile Phe Arg Ile Tyr Ile Lys Glu Lys Lys Glu Cys Arg 95 100 105 CGG GAA CAT CGC CCA CCA TGT GCT CAG GAG GCA CCC CGA AAC ATG GTG 387 Arg Glu His Arg Pro Pro Cys Ala Gln Glu Ala Pro Arg Asn Met Val 110 115 120 CAC CCC AAT GTG ATC TGT GAT GGT TGC AAC GGG CCT GTG GTG GGA ACT 435 His Pro Asn Val Ile Cys Asp Gly Cys Asn Gly Pro Val Val Gly Thr 125 130 135 CGC TAT AAG TGC AGT GTG TGC CCA GAC TAC GAC CTG TGC AGC GTG TGC 483 Arg Tyr Lys Cys Ser Val Cys Pro Asp Tyr Asp Leu Cys Ser Val Cys 140 145 150 GAG GGG AAG GGC CTG CAC AGG GAA CAC AGC AAG CTC ATC TTT CCC AAC 531 Glu Gly Lys Gly Leu His Arg Glu His Ser Lys Leu Ile Phe Pro Asn 155 160 165 170 CCC TTT GGC CAC CTC TCT GAT AGC TTC TCT CAT AGC CGC TGG CTT CGG 579 Pro Phe Gly His Leu Ser Asp Ser Phe Ser His Ser Arg Trp Leu Arg 175 180 185 AAG CTG AAA CAT GGA CAC TTT GGC TGG CCT GGC TGG GAG ATG GGC CCA 627 Lys Leu Lys His Gly His Phe Gly Trp Pro Gly Trp Glu Met Gly Pro 190 195 200 CCG GGG AAC TGG AGC CCA CGT CCT CCT CGT GCA GGG GAT GGC CGC CCT 675 Pro Gly Asn Trp Ser Pro Arg Pro Pro Arg Ala Gly Asp Gly Arg Pro 205 210 215 TGC CCT ACA GCT GAG TCA GCT TCT GCT CCA CCA GAA GAT CCC AAT GTC 723 Cys Pro Thr Ala Glu Ser Ala Ser Ala Pro Pro Glu Asp Pro Asn Val 220 225 230 AAT TTC CTG AAG AAT GTG GGG GAG AGT GTG GCA GCT GCC CTC AGC CCT 771 Asn Phe Leu Lys Asn Val Gly Glu Ser Val Ala Ala Ala Leu Ser Pro 235 240 245 250 CTA GGC ATT GAG GTT GAC ATT GAT GTG GAA CAT GGA GGG AAG AGA AGC 819 Leu Gly Ile Glu Val Asp Ile Asp Val Glu His Gly Gly Lys Arg Ser 255 260 265 CGC CTG ACA CCC ACT ACC CCA GAA AGT TCC AGC ACA GGC ACA GAA GAC 867 Arg Leu Thr Pro Thr Thr Pro Glu Ser Ser Ser Thr Gly Thr Glu Asp 270 275 280 AAG AGT AAC ACT CAG CCA AGC AGC TGC TCT TCG GAA GTC AGC AAA CCT 915 Lys Ser Asn Thr Gln Pro Ser Ser Cys Ser Ser Glu Val Ser Lys Pro 285 290 295 GAC GGG GCT GGG GAG GGC CCT GCT CAG TCT CTG ACA GAG CAA ATG AAA 963 Asp Gly Ala Gly Glu Gly Pro Ala Gln Ser Leu Thr Glu Gln Met Lys 300 305 310 AAG ATA GCC TTG GAG TCG GTG GGA CAG CCA GAG GAA CAG ATG GAG TCG 1011 Lys Ile Ala Leu Glu Ser Val Gly Gln Pro Glu Glu Gln Met Glu Ser 315 320 325 330 GGA AAC TGC TCA GGA GGA GAC GAT GAC TGG ACA CAT TTG TCT TCA AAA 1059 Gly Asn Cys Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys 335 340 345 GAA GTG GAC CCA TCT ACA GGT GAA CTC CAG TCT CTA CAG ATG CCA GAA 1107 Glu Val Asp Pro Ser Thr Gly Glu Leu Gln Ser Leu Gln Met Pro Glu 350 355 360 TCG GAA GGG CCA AGC TCT CTA GAC CCC TCA CAG GAA GGA CCC ACA GGG 1155 Ser Glu Gly Pro Ser Ser Leu Asp Pro Ser Gln Glu Gly Pro Thr Gly 365 370 375 CTG AAG GAA GCT GCC CTA TAC CCA CAT CTC CCA CCA GAG GCT GAT CCC 1203 Leu Lys Glu Ala Ala Leu Tyr Pro His Leu Pro Pro Glu Ala Asp Pro 380 385 390 CGG CTG ATT GAG TCC CTC TCC CAG ATG CTG TCC ATG GGT TTC TCG GAT 1251 Arg Leu Ile Glu Ser Leu Ser Gln Met Leu Ser Met Gly Phe Ser Asp 395 400 405 410 GAA GGC GGC TGG CTC ACC AGG CTC CTA CAG ACC AAG AAT TAC GAC ATC 1299 Glu Gly Gly Trp Leu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Lys Asn Tyr Asp Ile 415 420 425 GGG GCT GCT CTG GAC ACG ATC CAG TAT TCG AAG CAC CCT CCA CCA TTG 1347 Gly Ala Ala Leu Asp Thr Ile Gln Tyr Ser Lys His Pro Pro Pro Leu 430 435 440 TGA TAGTGCTGTG GCCAAGCCCC ACCCCCTTTG TCTTGTAGTT GCATCACGTA 1400 *** GAGCAGCAGG GCTTCTATAG ATAGGCCCAG TGTCTTGGCA TTCTTGTAGA ATCTTCAGGT 1460 GGGAATGTGT GATGCCTTTT CAGGCAATAG GAAAGTGCAT GAGGAGAGTT TTGAATGTGC 1520 ATATGCTGAC GCCTGAGAAC AGACCCAGGT ACCCGTGGCT GAGCTGAGCT TCCTCTGCTT 1580 TCCCTAGGCC TGGCCTCTGC AGGGAACTGC AGCACACACT GCACTCCCAC CTGCTCTTGC 1640 CGCCAGCATT GCACCAGCAG TCCAGAATTC CTGCCTGACA ACCCGTGTTT CCTTTATTAA 1700 AAGTGATTAG TACAACTGCT AGTTATTTTC AACAAATAAA GCCATTATGT TAAGAGGGGA 1760 CTGTCCATAG TGAGTGAAAG GTGGCAGGCA GGGGCCTACA GCTCCTAGGG AATGGAGAAT 1820 TCATGTGAAG CCGAATGAAG GATCTTATCT TATACTGTCC CCCTTTCTAA TGGCCACTCT 1880 TTAGTGTTTG TGTCTAATGT TAATGCTTAA AGCACAGGAC CCCCATGTAG CTTCCTCTGA 1940 CTTGGTTTGT AAGTAACCTG TAATAAAATG GCATATGCAC TTTAAAAAAA AAAAAAAAAA 2000 AAAAA 2005
【００２８】配列番号：２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リンカーDNA。配列番号３と相補的配列。
名称「ATOS-1」 配列 CTCTTGCTTG AATTCGGACT A 21
【００２９】配列番号：３ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リンカーDNA。配列番号２と相補的配列。
名称「ATOS-2」 配列 TAGTCCGAAT TCAAGCAAGA GCACA 25
【００３０】配列番号：４ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リンカーDNA。配列番号５と相補的配列。
名称「ATOS-4」 配列 CTCTTGCTTA AGCTTGGACT A 21
【００３１】配列番号：５ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リンカーDNA。配列番号４と相補的配列。
名称「ATOS-5」 配列 TAGTCCAAGC TTAAGCAAGA GCACA 25
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＯＳＦ−６タンパク質の構造の模式図で
ある。
【図２】マウスＯＳＦ−６とショウジョウバエＲｅｆ
(２)Ｐ及び酵母ＡＤＡ２のＺｎフィンガー様領域におけ
るアミノ酸配列の比較表である。それぞれの分子に共通
なアミノ酸残基をコンセンサスとして示す。
【図３】マウスＯＳＦ−６のＣ末端領域とショウジョウ
バエＲｅｆ(２)Ｐの第３エクソンがコードする領域のア
ミノ酸配列の比較表である。両者に共通なアミノ酸残基
をコンセンサスとして示す。
【図４】マウスＯＳＦ−６をコードするｃＤＮＡの制限
酵素地図である。太字はＯＳＦ−６のアミノ酸をコード
する領域を示す。
【図５】マウスＯＳＦ−６の組織特異的発現を示す。Ｒ
ＮＡを種々の組織や培養細胞から精製し、ＲＮＡドット
ブロット法により解析したものであり、図はオートラジ
オグラフィーの結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ 9164−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 13/00 ＺＮＡ 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｘ 7055−2Ｊ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列表の配列番号１において、１番から
    ４４２番目までのアミノ酸配列を有するＯＳＦ−６、ま
    たはこれのアナログ、またはこれの断片よりなるタンパ
    ク質。
  2. 【請求項２】 請求項１のタンパク質をコードするＤＮ
    ＡまたはＲＮＡ。
  3. 【請求項３】 ほ乳動物のＯＳＦ−６、またはそのアナ
    ログ、または断片である組換えタンパク質を産生させる
    方法であって、以下の手順を含む方法： (ａ) 以下のＤＮＡ配列より構成される異種のＤＮＡを
    含む細胞集団を得ること。 (ｉ) 当該細胞で機能しうる転写と翻訳をコントロール
    する配列。 (ｉｉ) 上記のコントロール配列の下に結合した当該組
    換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列。 (ｂ) 当該細胞集団を当該組換えタンパク質が産生され
    る条件下で培養すること。
  4. 【請求項４】 請求項３のコントロール配列がさらに、
    当該組換えタンパク質を細胞外に分泌させるためのシグ
    ナルペプチドをコードするＤＮＡを、当該組換えタンパ
    ク質をコードするＤＮＡ配列のすぐ上流に位置するよう
    に、含むことを特徴とする産生方法。
  5. 【請求項５】 細胞集団が大腸菌または酵母またはほ乳
    動物細胞である請求項３または４の産生方法。
  6. 【請求項６】 請求項２のＤＮＡまたはＲＮＡの全体ま
    たはその断片を含む診断方法。
  7. 【請求項７】 請求項１のタンパク質を含む診断方法。
  8. 【請求項８】 請求項１のタンパク質に対するポリクロ
    ーナル抗体及びモノクローナル抗体。
  9. 【請求項９】 請求項８の抗体を含む診断方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１のタンパク質を含む医薬品。
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