JP4755584B2 - 骨形態形成タンパク質(BMP)及びトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質(TGF−β)の発現を細胞において誘導する方法 - Google Patents
骨形態形成タンパク質(BMP)及びトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質(TGF−β)の発現を細胞において誘導する方法 Download PDFInfo
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Description
本発明の分野は、遺伝物質で細胞をトランスフェクトする方法に概して関する。より具体的には、本発明の分野は、LIM石灰化(mineralization)タンパク質(LMP)をコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることによって、1以上の骨形態形成タンパク質(BMP)及び/又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質(TGF−β)の発現を誘導する方法に関する。
骨芽細胞は、多能性の間葉幹細胞より分化すると考えられている。骨芽細胞の成熟化は、石灰化して骨を形成することができる細胞外マトリックスの分泌をもたらす。この複雑なプロセスの調節は、十分には理解されていないが、骨形態形成タンパク質(BMP)として知られる一群のシグナル伝達糖タンパク質が関与すると考えられている。これらのタンパク質は、胚の背側−腹側パターン形成、肢芽発生、及び成体動物における骨折修復に関与することが示されている。B. L. Hogan, Genes & Develop., 10, 1580 (1996)。このトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリー分泌タンパク質の群は、多様な細胞種において、様々な分化の段階で、多様な活性を有するが、これらの近縁分子間の生理活性における違いは、明確にされていない(D. M. Kingsley, Trends Genet., 10, 16 (1994)。
本発明の1つの側面によれば、1以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質(TGF−β)の発現を細胞において誘導する方法が提供される。該方法には、プロモーターへ機能可能的に連結したLIM石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクトすることが含まれる。本発明の方法により、BMP−2、BMP−4、BMP−6、BMP−7、TGF−β1、及びこれらの組合せからなる群より選択される1以上のタンパク質の発現を誘導することができる。本発明のこの側面による単離核酸は、配列番号25の全長へ相補的な核酸分子へ標準条件下にハイブリダイズすることができる核酸;及び/又は配列番号26の全長へ相補的な核酸分子へ高ストリンジェント条件下にハイブリダイズすることができる核酸分子であり得る。細胞は、どの体細胞でもよく、限定されないが、バフィーコート細胞、幹細胞、及び椎間板細胞が含まれる。
LMP−1は、初期の骨芽細胞分化に関連した新規のLIMドメインタンパク質である。発生中の胚の長骨の肥大性軟骨細胞に近接する間葉細胞においてLMP−1転写物がはじめて検出可能になるのは、軟骨原基の中央に骨芽細胞が出現する直前である(Boden, et al.,「LIMドメインタンパク質、LMP−1は、骨形成に及ぼすBMP−6の効果に仲介する(LMP-1, A LIM-Domain Protein, Mediates BMP-6 Effects on Bone Formation)」Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998) を参照のこと)。LMP−1タンパク質は、その多くが様々な細胞種において増殖と分化に関与しているLIMドメインタンパク質の異質ファミリーのメンバーである。しかしながら、LIM−ドメインタンパク質の作用の正確な機序は、ほとんど理解されていない。Kong, et al.,「筋LIMタンパク質は、MyoDの活性を亢進することによって筋発生を促進する(Muscle LIM Protein Promotes Myogenesis by Enhancing the Activity of MyoD)」Mol. Cell. Biol., 17, 4750-4760 (1997);Sadler et al.,「ZyxinとcCRP:細胞骨格と結合した2つの相互作用性LIMドメインタンパク質(Zyxin and cCRP: The Interactive LIM Domain Proteins Associated with the Cytoskeleton)」J. Cell Bio., 119, 1573-1587 (1992);Salgia et al.,「ヒトパキシリン、P210(BCCR/ABL)によりリン酸化されるフォーカルアドヒージョンタンパク質の分子クローニング(Molecular Cloning of Human Paxillin, a Focal Adhesion Protein Phosphorylated by P210 (BCCR/ABL))」J. Biol. Chem., 270, 5039-5047 (1995);及び Way, et al.,「C. Elegans における接触受容体ニューロンの分化を特定するホメオボックス含有遺伝子、Mec−3(Mec-3, A Homeobox-Containing Gene that Specifies the Differentiation of the Touch Receptor Neurons in C. Elegans)」Cell, 54, 5-16 (1988) を参照のこと。
通常の静脈血由来のバフィーコート細胞の ex vivo 遺伝子治療への使用は、比較的新しい。Viggeswarapu, et al.,「LIM石灰化タンパク質−1のアデノウイルス送達は、in vitro 及び in vivo で新骨形成を誘導する(Adenoviral Delivery of LIM Mineralization Protein-1 Induces New-Bone Formation in vitro and in vivo)」J. Bone Joint Surg. Am., 83-A, 364-376 (2001) を参照のこと。LMP−1 cDNAでトランスフェクトされたバフィーコート細胞がどのくらい長い間 in vivo で生存して、BMPの合成、分泌、及び活性を高めるかを決定するために、CD−45抗原が使用された(Kurtin, et al.,「白血球共通抗原−モノクローナル抗体を使用するパラフィン切片における造血性及び非造血性新生物間の診断識別因子:免疫学的試験及び超構造定位法との相関性(Leukocyte Common Antigen--A Diagnostic Discriminant Between Hematopoietic and Nonhematopoietic Neoplasms in Paraffin Sections using Monoclonal Antibodies: Correlation with Immunologic Studies and Ultrastructural Localization)」Hum Pathol., 16, 353-365 (1985);及び Pulido et al.,「4つの異なるCD45抗原特異性の比較生化学及び組織分布試験(Comparative Biochemical and Tissue Distribution Study of Four Distinct CD45 Antigen Specificities)」J. Immunol., 140, 3851-3857 (1988) を参照のこと)。抗CD−45一次抗体と特異的に反応する細胞の数は累進的に減少し、移植後10日までに最小になった。抗CD−45染色の消失、7日目でインプラントの中央で細胞が脱落していること、そして骨形成の求心性パターンは、いずれも、移植した細胞(LMP−1 cDNAを発現するものが含まれる)が長い時間の間生存しないことを示唆し、LMP発現細胞が分泌因子(これが後続的に宿主の前駆細胞を動員して、成熟骨芽細胞へのその分化を変調させる)の誘導を介して骨形成プロセスに間接的に参画する可能性があることを示唆した。証拠の示すところでは、LMP−1は、いくつかの骨誘導タンパク質(BMP)の分泌が含まれるイベントのカスケードを開始させる。故に、LMP−1は、多くの細胞において発現されることなく有意な効果を及ぼして、in vivo で長い時間存続することができるので、理想的な治療候補物質である。
ラット骨芽細胞(「ROB」)としても知られるラット頭蓋冠細胞を、Boden, et al., (Endocrinology, 137, 8, 3401-3407 (1996)) により既に記載されたように、分娩前20日のラットより入手した。一次培養物を集密状態にまで増殖させ(7日)、トリプシン処理し、一次継代培養細胞として6ウェルプレートへ移した(1x105細胞/35mmウェル)。0日目で集密していた継代培養細胞を、さらに7日間増殖させた。0日目に開始して、培地を交換し、処理薬(Trm及び/又はBMP)を3又は4日ごとに層流フード下で適用した。標準の培養プロトコールは以下の通りであった:1〜7日目、MEM,10% FBS,50μg/ml アスコルビン酸、±刺激;8〜14日目、BGJb培地、10% FBS,5mM β−GlyP(石灰化を可能にするための無機リン酸の供給源として)。14日目に、骨結節形成及びオステオカルシン分泌のエンドポイント分析を実施した。この系において、試験したすべてのBMPについての用量応答曲線に対して中間範囲の効果を実証したパイロット実験に基づいて、BMPの用量を50ng/mlと選択した。
膜様の骨形成時におけるLMP−1の潜在的な機能上の役割を探究するために、我々は、LMP−1 mRNAの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し、グルココルチコイドにより始動される分化を受けている二次骨芽細胞培養物を処理した。RLMP発現の阻害は、推定の翻訳開始部位が含まれる25塩基対配列(配列番号42)に対応する高特異性のアンチセンスオリゴヌクレオチド(既知のラット配列に対して有意な相同性がない)を用いて達成した。対照培養物にはオリゴヌクレオチドも与えなかったか、又はそれらにはセンスオリゴヌクレオチドを与えた。リポフェクタミンの存在下(プレインキュベーション)及び非存在下で実験を行なった。簡潔に言えば、22μgのセンス又はアンチセンスRLMPオリゴヌクレオチドを、MEMにおいて室温で45分間インキュベートした。そのインキュベーションに続き、さらにMEM又はプレインキュベートしたリポフェクタミン/MEM(7% v/v;室温で45分間インキュベートした)のいずれかを加え、0.2μMのオリゴヌクレオチド濃度を達成した。生じる混合物を室温で15分間インキュベートした。次いで、MEM/アスコルビン酸塩/±Trmとオリゴヌクレオチド混合物を混合して、0.1μMの最終オリゴヌクレオチド濃度を達成した。
実施例1及び2に従って調製したROBの培養物を、70%エタノール中で一晩固定して、ホン・コッサ銀染色で染色した。半自動コンピュータ化ビデオ画像解析システムを使用して、各ウェル中の結節数及び結節面積を定量した(Boden, et al., Endocrinology, 137, 8, 3401-3407 (1996))。次いで、これらの数値を使用して、結節あたりの面積の数値を計算した。この自動化法をマニュアル計数技術に対して検証すると、0.92の相関係数(p<0.000001)を示した。すべてのデータは、各条件で5又は6のウェルより計算する、平均±平均の標準誤差(S.E.M.)として表す。各実験は、様々な頭蓋冠調製物由来の細胞を使用して、少なくとも2回繰り返した。
Nanes, et al. (Endocrinology, 127: 588 (1990)) に記載のように、ラットオステオカルシンのC末端ノナペプチドに対して発明者が産生した単一特異性ポリクローナル抗体(Pab)での競合ラジオイムノアッセイを使用して、培養基中のオステオカルシンレベルを測定した。簡潔に言えば、1マイクログラムのノナペプチドをラクトペルオキシダーゼ法により1mCiの125I−Naでヨウ素化した。200glのアッセイ緩衝液(0.02Mリン酸ナトリウム、1mM EDTA,0.001%チメロサール、0.025% BSA)を含有する試験管に、細胞培養物より採取した培地、又はオステオカルシニン標準品(0〜12,000フェムトモル)をアッセイ緩衝液中100gl/管で入れた。次いで、Pab(1:40,000;100マイクロリットル)に続き、ヨウ素化ペプチド(12,000cpm;100マイクロリットル)を加えた。非特異結合を試験する試料も同様に調製したが、抗体を含めなかった。
非刺激細胞培養系における骨結節の産生全体に対しては、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれも明瞭な効果がほとんどなかった。しかしながら、ROBをTrmで刺激するとき、RLMPに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、結節の石灰化を>95%阻害した。このオリゴヌクレオチド処理培養物へ外因性BMP−6を加えても、RLMP−アンチセンス−処理結節の石灰化をレスキューしなかった。
4Mイソチオシアン酸グアニジン(GIT)溶液を使用して、ROB(実施例1及び2に従って、6ウェル培養皿において調製した)の同一2検体ウェルより細胞RNAを採取して、統計上の同一3検体を得た。簡潔に言えば、培養上清をウェルより吸引し、次いでこれに同一2検体ウェル採取につき0.6mlのGIT溶液を載せた。GIT溶液を加えた後で、プレートを5〜10秒間揺り動かした。試料は−70℃に保存して、7日以内にさらに処理した。
加熱した全RNA(全量10.5マイクロリットルのDEPC−H2O中5マイクログラム、65℃で5分間)を、4マイクロリットルの5X MMLV−RT緩衝液、2マイクロリットルのdNTP、2マイクロリットルのdT17プライマー(10ピコモル/ml)、0.5マイクロリットルのRNAsin(40U/ml)、及び1マイクロリットルのMMLV−RT(200ユニット/マイクロリットル)を含有する試験管へ加えた。37℃で1時間、次いで95℃で5分間試料をインキュベートして、MMLV−RTを不活性化した。次いで、80マイクロリットルの水の添加により試料を希釈した。
RT−PCR産物に5マイクロリットル/試験管のローディング色素を加え、混合し、65℃で10分間加熱し、遠心分離した。各反応物より10マイクロリットルの試料を標準条件下でPAGE(12%ポリアクリルアミド:ビス;15V/ウェル;一定の電流)へ処した。次いで、ゲルをゲル保存緩衝液(10%(v/v)グリセロール、7%(v/v)酢酸、40%(v/v)メタノール、43%脱イオン水)において30分間インキュベートし、真空(80℃)で1〜2時間乾燥させ、電子増強リン光造影システムで6〜24時間発色させた。可視化バンドを解析した。バンドあたりのカウント数をグラフにプロットした。
グルココルチコイド(Trm,1nM)で刺激した細胞よりRNAを抽出した。加熱してDNアーゼ処理した全RNA(全量10.5マイクロリットルのDEPC−H2O中5マイクログラム、65℃で5分間)を実施例7に記載のように逆転写したが、MMLV−RTプライマーとしては、H−T11M(配列番号4)を使用した。生じるcDNAを上記のようにPCR増幅したが、様々な市販のプライマーセット(例えば、H−T11G(配列番号4)、及びH−AP−10(配列番号5);GenHunter社、テネシー州ナッシュビル)を用いた。放射標識されたPCR産物を、DNA配列決定ゲル上でのゲル電気泳動により分画した。電気泳動の後で、生じるゲルを真空で乾燥させ、オートラジオグラフを一晩露出した。差示的に発現されたcDNAを表すバンドをゲルから切り出し、Conner, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 278 (1983)) に記載される方法を使用してPCRにより再増幅させた。PCR再増幅の産物をベクターPCR−11(TAクローニングキット;Invitrogen,カリフォルニア州カールスバッド)へクローニングした。
UMR106ライブラリー(2.5x1010pfu/ml)を寒天プレート(LB寒天ボトム)上に5x104pfu/mlでプレートし、このプレートを37℃で一晩インキュベートした。フィルター膜をプレート上に2分間載せた。このフィルターを、取り出してすぐに変性させ、濯ぎ、乾燥させて、UVで架橋連結させた。次いで、このフィルターをプレハイブリダイゼーション緩衝液(2XPIPES[pH6.5],5%ホルムアルデヒド、1% SDS及び100μg/ml 変性サケ精子DNA)において42℃で2時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションミックス/フィルター全体へ260塩基対の放射標識プローブ(配列番号3;ランダムプライミングによる32P標識化)を加え、42℃で18時間のハイブリダイゼーションを続けた。この膜を室温で1回(1xSSC,0.1% SDSで10分)、55℃で3回(0.1xSSC,0.1% SDSで15分)洗浄した。
クローニングしたcDNAインサートを標準法により配列決定した。簡潔に言えば、適正濃度の終止混合物、鋳型、及び反応混合物を適正なサイクル処理プロトコール(95℃,30秒;68℃,30秒;72℃,60秒;x25)へ処した。停止混合物を加えて、配列決定反応を終止させた。92℃で3分間加熱後、試料を変性6%ポリアクリルアミド配列決定ゲル(29:1 アクリルアミド:ビスアクリルアミド)上へロードした。試料を60ボルト、定電流で約4時間電気泳動した。電気泳動後、ゲルを真空で乾燥させて、オートラジオグラフ処理した。
実施例12:RLMP cDNAのクローニング
実施例9に記載する差示ディスプレイPCR増幅産物は、ほぼ260塩基対のメジャーバンドを含んでいた。この配列を使用して、ラット骨肉腫(UMR 106)cDNAライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンを入れ子プライマー解析へ処して、全長cDNAを増幅するのに必要なプライマー配列(配列番号11、12、29、30及び31)を得た。さらなる試験用に選択したこれら陽性クローンの1つをクローン10−4と命名した。
実施例1及び2に従って調製した、ROB由来の30マイクログラムの全RNAを1%アガロース平板ゲルにおけるホルムアルデヒドゲル電気泳動によりサイズ分画し、ナイロン膜へ浸透圧でトランスブロットした。このブロットを、ランダムプライミングにより32P−dCTPで標識した全長10−4 cDNAの600塩基対EcoRI断片でプローブした。
それぞれ報告される結節/オステオカルシンの結果について、代表的な実験からの5〜6ウェルのデータを使用して、平均±S.E.M.を計算した。各変数について最大値に正規化したデータでグラフを示して、結節数、石灰化面積、及びオステオカルシンの同時グラフ化を可能にすることができる。
England, et al. (Biochim. Biophys. Acta, 623, 171 (1980)) 及び Timmer, et al.,(J. Biol. Chem., 268, 24863 (1993)) の方法に従って、ポリクローナル抗体を調製した。
ラットLMP−1 cDNAの配列に基づいて、フォワード及びリバースのPCRプライマー(配列番号15及び16)を合成し、ユニークな223塩基対配列をラットLMP−1 cDNAよりPCR増幅した。同じPCRプライマーで、ヒトMG63骨肉腫細胞のcDNAより類似のPCR産物を単離した。
実施例7に記載のような特定プライマー(配列番号16及び17)を使用して、PCRでスクリーニングを実施した。717塩基対のMG63 PCR産物をアガロースゲル精製して、所与のプライマー(配列番号12、15、16、17、18、27、及び28)で配列決定した。両方向に少なくとも2回で配列を確定した。このMG63配列を互いに対して、次いで全長ラットLMP cDNA配列に対して並置して、部分的なヒトLMP cDNA配列(配列番号7)を得た。
ノーザンブロット実験に基づいて、ヒト心臓筋肉が含まれる、いくつかの異なる組織によって異なるレベルでLMP−1が発現されることが判明した。故に、ヒト心臓cDNAライブラリーを試験した。このライブラリーを寒天プレート(LB寒天ボトム)上に5x104pfu/mlでプレートし、プレートを37℃で一晩増殖させた。フィルター膜をプレート上に2分間載せた。その後で、このフィルターを変性させ、濯ぎ、乾燥させて、UVで架橋連結させ、プレハイブリダイゼーション緩衝液(2XPIPES[pH6.5];5%ホルムアルデヒド、1% SDS、100g/ml 変性サケ精子DNA)において42℃で2時間インキュベートした。放射標識化、LMPユニークの223塩基対プローブ(32P、ランダムプライマー標識化;配列番号6)を加え、42℃で18時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに続き、この膜を室温で1回(10分、1xSSC,0.1% SDS)、55℃で3回(15分、0.1xSSC,0.1% SDS)洗浄した。製造業者のプロトコール(ストラタジーン、カリフォルニア州ラホヤ)に従って、オートラジオグラフィーにより同定した、二重陽性のプラーク精製した心臓ライブラリークローンをラムダファージミドとしてレスキューした。
MG63ヒト骨肉腫細胞cDNA配列とヒト心臓cDNAクローン7配列の重複領域を使用して、これら2つの配列を並置して、1644塩基対の完全なヒトcDNA配列を導いた。NALIGN(PCGENEソフトウェアパッケージのプログラム)を使用して、この2つの配列を並置した。この2つの配列の重複領域は、MG63 cDNA(配列番号7)中のヌクレオチド672での単一ヌクレオチド置換を除いて完全な相同性を有するほぼ360塩基対を構成し、クローン7は、対応するヌクレオチド516で「G」の代わりに「A」を有した(配列番号8)。
ヒトLMP−1の推定アミノ酸配列をPCGENEサブプログラムのTRANSLで決定した。配列番号9中のオープンリーディングフレームは、457のアミノ酸(配列番号10)を含んでなるタンパク質をコードする。PCGENEサブプログラムのPalignを使用して、ヒトLMP−1アミノ酸配列がラットLMP−1アミノ酸配列に対して94.1%相同であることを見出した。
cDNA末端の5’迅速増幅(5’RACE)プロトコールを使用して、MG63の全RNAの入れ子RT−PCRによって、MG63の5’cDNAを増幅した。この方法には、3’末端に2つの縮重ヌクレオチド位置があるロックドッキング(lock-docking)オリゴ(dT)プライマーを使用する第一鎖cDNA合成が含まれた(Chenchik, et al., CLONTECHniques, X:5 (1995);Borson et al., PC Methods Applic., 2, 144 (1993))。第二鎖合成は、Gubler, et al. (Gene, 2, 263 (1983)) の方法に従って、大腸菌DNAポリメラーゼI、RNアーゼH、及び大腸菌DNAリガーゼのカクテルで実施した。T4 DNAポリメラーゼでの平滑末端の創出後、二本鎖cDNAを断片(5’−CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT−3’)(配列番号19)へ連結した。RACEに先立って、アダプター連結cDNAをMarathon RACE反応に適した濃度へ希釈した(1:50)。次いで、アダプター連結二本鎖cDNAを特異的にクローニングされるように用意した。
重複しているMG63ヒト骨肉腫細胞cDNA 5’−UTR配列(配列番号21)、MG63 717塩基対配列(実施例17;配列番号8)、及びヒト心臓cDNAクローン7配列(実施例18)を並置して、1704塩基対の新規ヒトcDNA配列(配列番号22)を導いた。この並置は、NALIGN(PCGENEとOmiga 1.0の両方;Intelligenetics)で達成した。重複配列は、全717塩基対領域(実施例17)のほとんどを100%相同性で構成した。並列配置の結合は、SEQINで達成した。
実施例17及び18に記載される配列で、pHIS−5ATG LMP−1s発現ベクターの構築を行った。717塩基対クローン(実施例17;配列番号7)をClaI及びEcoRVで消化した。小断片(約250塩基対)をゲル精製した。クローン7(実施例18;配列番号8)をClaI及びXbaIで消化して、1400塩基対断片をゲル精製した。単離した250塩基対及び1400塩基対の制限断片を連結させて、約1650塩基対の断片を形成した。
実施例1に従って、ラット頭蓋冠細胞を単離し、二次培養において増殖させた。培養物は、実施例1に記載されるように、非刺激であるか、又はグルココルチコイド(GC)で刺激した。実施例25に従って、Superfect試薬(Qiagen,カリフォルニア州バレンシア)トランスフェクションプロトコールの変法を使用して、各ベクターの3マイクログラム/ウェルを二次ラット頭蓋冠骨芽細胞培養物へトランスフェクトした。
クローン10−4(実施例12を参照のこと)中のラットLMP cDNAをNotI及びApaIでの37℃で一晩の二重消化により、このベクターより切り出した。ベクターのpCMV2 MCS(Invitrogen,カリフォルニア州カールスバッド)を同じ制限酵素で消化した。クローン10−4及びpCMV2由来の線状cDNA断片をともにゲル精製し、抽出し、T4リガーゼで連結した。この連結DNAをゲル精製し、抽出し、増幅用の大腸菌JM109細胞を形質転換するのに使用した。陽性の寒天コロニーを選択し、NotI及びApaIで消化し、この制限消化物をゲル電気泳動法により検証した。陽性クローンよりストック培養物を調製した。
717塩基対クローン(実施例17)をClaI及びEcoRV(ニューイングランドバイオロジカルズ、シティ、マサチューセッツ州)で消化した。小断片(約250塩基対)をゲル精製した。クローン番号7(実施例18)をClaI及びXbaIで消化した。その消化物より1400塩基対の断片をゲル精製した。単離した250塩基対及び1400塩基対のcDNA断片を標準法により連結して、約1650塩基対の断片を形成した。pHis−Aベクター(Invitrogen)をEcoRV及びXbaIで消化した。この線状化ベクターを回収し、キメラの1650塩基対cDNA断片へ連結した。この連結産物をクローニングして、標準法により増幅し、このphis−A−5’ATG LMP−1s発現ベクター(インサートHLMP−1s付きベクターpHis−Aとも表記される)を先に記載のようにATCCに寄託した。
実施例1に従って、ラット頭蓋冠細胞を単離し、二次培養において増殖させた。培養物は、実施例1に従って、非刺激であるか、又はグルココルチコイド(GC)で刺激した。この培養物を、実施例25に記載されるように、3マイクログラムの組換えpHis−AベクターDNA/ウェルでトランスフェクトした。実施例3に従って、ホン・コッサ染色により石灰化結節を視覚化した。
実施例24に記載されるようなラット頭蓋冠骨芽細胞培養物におけるRLMP−1又はHLMP−1の過剰発現は、陰性対照において観察されるものより有意に大きい結節形成をもたらした。LIM石灰化タンパク質の作用機序を検討するために、条件付け培地を異なる時点で採取し、10倍へ濃縮し、無菌濾過し、新鮮な血清を含有する培地においてその元の濃度へ希釈し、非トランスフェクト細胞へ4日間適用した。
本試験は、正常、即ち免疫適格性のウサギにおける脊椎融合を促進する、LMP−1 cDNA(配列番号2)のアデノウイルス送達の最適量を決定した。
4匹のウサギにおいて、我々は上記(実施例29)のように脊椎融合手術を実施したが、但し、形質導入される細胞は、骨髄ではなくて、静脈血由来のバフィーコートであった。これらの細胞をAdLMP又はpHIS−LMPプラスミドでトランスフェクトして、骨髄細胞を使用したときと同等の成功した結果を得た。通常の静脈血細胞を遺伝子送達に使用するというこの発見は、遺伝子治療を臨床的により実行可能にする。なぜなら、全身麻酔下での痛ましい骨髄採取を回避して、1ミリリットルにつき2倍多い細胞の出発材料が得られるからである。
イントロン/エクソンmRNA転写物のスプライス変異体は、シグナル伝達及び細胞/組織発生において比較的一般的な調節機序である。様々な遺伝子のスプライス変異体は、タンパク質−タンパク質、タンパク質−DNA、タンパク質−RNA、及びタンパク質−基質の相互作用を改変することが示されてきた。スプライス変異体はまた、遺伝子発現の組織特異性を制御して、様々な形態(それ故に、機能)が様々な組織において発現されることを可能にする。スプライス変異体は、細胞における一般的な調節現象である。LMPスプライス変異体は、神経再生、筋肉再生、又は他の組織の発生のように、他の組織において諸効果をもたらす可能性があるかもしれない、
ヒト心臓cDNAライブラリーについてHLMP−1配列のスプライス変異体をスクリーニングするために、配列番号22の部分に対応する1対のPCRプライマーを調製した。標準技術を使用して合成したフォワードのPCRプライマーは、配列番号22のヌクレオチド35〜54に対応する。これは、以下の配列を有する:
5’GAGCCGGCATCATGGATTCC3’ (配列番号35)
配列番号22のヌクレオチド820〜839の逆相補体である、リバースのPCRプライマーは、以下の配列を有する:
5’GCTGCCTGCACAATGGAGGT3’ (配列番号36)
このフォワード及びリバースのプライマーを使用して、94℃30秒間、64℃30秒間、及び72℃1分、30回繰り返しのサイクル処理プロトコールに続き、72℃で10分インキュベーションを使用する標準技術によって、ヒト心臓cDNA(ClonTech,カタログ番号7404−1)についてHLMP−1に類似の配列をスクリーニングした。増幅cDNA配列をゲル精製して、配列決定のためにEmory DNA Sequence Core Facilityへ提出した。標準技術を使用してこのクローンを配列決定して、配列をPCGENE(Intelligenetics;プログラムSEQUIN及びNALIGN)で検証して、配列番号22に対する相同性を決定した。次いで、配列番号22に比較して推定される可変スプライス部位のある2つの相同ヌクレオチド配列を、IntelligeneticsのTRANSLプログラムで、そのそれぞれのタンパク産物へ翻訳した。
出願人は、HLMP−1発現に関連した推定調節要素が含まれる、HLMP−1をコードするゲノムDNA配列を同定した。全体のゲノム配列を配列番号41に示す。この配列は、AC023788(クローンRP11−564G9)(ゲノム配列決定センター、ワシントン医科大学校、ミズーリ州セントルイス)より導いた。
実施例33:椎間板細胞におけるHLMP−1の発現
LIM石灰化タンパク質−1(LMP−1)は、骨性及び非骨性の組織において細胞分化を指令することができる細胞内タンパク質である。本実施例は、椎間板細胞においてヒトLMP−1(HLMP−1)を発現することがプロテオグリカン合成を高めて、より軟骨細胞の表現型を促進することを実証する。さらに、細胞の遺伝子発現に及ぼすHLMP−1発現の効果を、アグリカン及びBMP−2遺伝子発現を測定することによって実証した。スプリーグ−ドーリーラットより、穏やかな酵素消化によって腰椎間板細胞を採取し、10% FBSを補充したDMEM/F12において単層で培養した。次いで,これらの細胞を約200,000細胞/ウェルで6つのウェルプレートへ分けて、約300,000細胞/ウェルに細胞が達するまで、約6日間培養した。培養基を1% DMEM/F12へ変更して、これを0日目とみなした。
sGAG産生とAdhLMP−1 MOIの間には、用量依存性の増加があった。これらのデータを図1に見るが、これは、単層培養のラット椎間板細胞における、異なるMOIでのHLMP−1過剰発現後のsGAGの産生を示す。この結果は、0日目の非処理細胞へ正規化した。誤差のバーは、平均の標準誤差を表す。図1に示すように、3日目に観察されるsGAG産生は相対的に少なく、トランスフェクションと細胞のGAG産生の間にラグタイムがあることを示す。AdLacZでの処理は、sGAG産生を有意に変化させなかった。図1にまた見られるように、AdhLMP−1の最適用量は、1000のMOIでのものであり、6日目に非処理対照に対して260%のsGAG産生の亢進をもたらした。これより高いか又は低いAdhLMP−1の用量は、減少した応答をもたらす。
表3:TaqMan(登録商標)のリアルタイムPCR用のプライマー及びプローブ配列
動物及び in vitro 試験により、比較的低い用量のアデノウイルス又はプラスミドベクターを使用するLIM石灰化タンパク質−1(LMP−1)cDNAの ex vivo 遺伝子移入での衝撃的で一貫した骨形成効果が実証されている(Boden, et al.,「Volvo基礎科学賞:新規骨誘導タンパク質(LMP−1)をコードするcDNAを用いた局所遺伝子治療による腰椎融合(Volvo Award in Basic Sciences: Lumbar Spine Fusion by Local Gene Thrapy with a cDNA Encoding a Novel Osteoinductive Protein (LMP-1))」Spine, 23, 2486-2492 (1998))。しかしながら、LMP−1の作用機序、形質導入された細胞がどのくらい長く生存するのかということ、あるいは、どの骨誘導増殖因子及び細胞が新しい骨及び骨芽細胞の分化の誘導に参画するのかということについて、ほとんどわかっていない(Boden, et al.,「LIMドメインタンパク質、LMP−1は、骨形成に及ぼすBMP−6の効果に仲介する(LMP-1, A LIM-Domain Protein, Mediates BMP-6 Effects on Bone Formation)」Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998) 及び Boden, et al., Spine, 23, 2486-2492 (1998) を参照のこと)。さらに、骨形成の in vivo 機序(即ち、軟骨内か膜性か)も決定されていない。LMP−1作用の機序を理解することは、臨床現場におけるLMP−1誘導性の骨形成の最適制御と、さらに、骨芽細胞分化に関与する細胞内シグナル伝達経路の理解に有用であろう。
フェーズ1:LMP−1で誘導される骨誘導因子の in vitro 検出
上記のように、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター付きのヒトLMP−1 cDNAを移入ベクターへクローニングして、引き続き、組換え複製欠損(E1、E3欠失)アデノウイルスへ移入した。
実験プロトコールは、施設内動物ケア及び使用委員会とヒト研究委員会により、検討されて承認された。ウサギ又はヒトの末梢血(3mL)を静脈穿刺により入手して、1200xgで10分間の簡略な遠心分離によりバフィーコート細胞を単離した。この細胞を計数し、1x106の細胞を4.0pfu/細胞のMOIで、37℃で10分間、アデノウイルス(AdLMP−1又はAdLacZ)に感染させた。感染後、この細胞を80μLの最終容量に再懸濁させて、7mmX7mmX3mmのコラーゲンディスク(ウシI型コラーゲン)へ適用した。
抗LMP−1抗体:抗LMP−1抗体は、ヒトLMP−1の内部領域内にマッピングされる、アフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体であり、ウサギ及びヒト起源のLMP−1と反応する。この抗体をLMP−1タンパク質の同定に1:500又は1:1000の希釈で使用した。
標識化ストレプタビジン−ビオチン法(LSAB法)を使用して、染色手順を実施した。LMP−1、BMP−2、BMP−4、BMP−6、BMP−7、TGF−β1、CD45、MyoD、I型コラーゲン、及びII型コラーゲンに対する抗体での免疫染色に、キット(ユニバーサルLSABキット、ペルオキシダーゼ;DAKO社、カリフォルニア州カーピンテリア)を使用した。一次抗体を産生した動物によって、適正なビオチニル化二次抗体を使用した。0.3%過酸化水素を含有するメタノールで内因性ペルオキシダーゼを阻止した。5%正常ウサギ血清又は5%正常ヤギ血清のいずれかと1%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)とともに標本を室温で15分間インキュベートして非特異結合を回避してから、適正濃度の一次抗体とともに加湿チャンバに4℃で一晩置いた。PBSで3回、5分間の洗浄後、加湿チャンバにおいて室温で10分間、ビオチニル化二次抗体及びストレプタビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とのインキュベーションに続き、3,3’−ジアミノベンチジンテトラクロリド(DAB;DAKO社、カリフォルニア州カーピンテリア)を使用して発色させた。最後に、この切片をヘマトキシリンにより対比染色した。陰性対照として、それぞれの一次抗体を、標本とのインキュベーションに先立って、対応する阻止ペプチド(サンタクルス・バイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルス)とともに室温で3時間インキュベートした。ある実験では、一次抗体単独、又は二次抗体単独を追加の陰性対照として使用した。
フェーズ1:LMP−1で誘導される骨誘導因子の in vitro 検出
図12A〜12Dに示すように、AdLMP−1で感染したA549細胞は、LMP−1タンパク質の強い細胞内染色を示した。図12A〜12Dは、AdLMP−1(図12A)、Adβgal(図12C)での感染後48時間のA549細胞、又は非処理細胞(図12D)中のLMP−1タンパク質についての免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。図12A、12C及び12Dより見られるように、AdLMP−1で感染した細胞には、どの対照にも見られない(図12C及び12D)、特異的な細胞内反応が見られた(図12A)。一次抗体の阻止ペプチドへのプレ曝露が陽性の細胞内染色を消失させた(図12B)ので、非特異反応の可能性は棄却された。図12A〜12Dの顕微鏡写真は、X132の原寸大で撮影した。
白血球の免疫定位。図15A〜15Dに示すように、移植後1及び3日目に、AdLMP−1(活性)及びAdβgal(対照)で処理したインプラントの両方の内部のバフィーコート調製物に抗CD45抗体により染色される細胞が多量に存在した。
ウサギ又はヒトのいずれかのバフィーコート細胞を使用しても、結果は同じであった。重複を避けるために、以下の記載と対応する例示は、ヒトのドナー細胞についてのものである。図19A〜19Dに示すように、移植後1及び3日目に、Ad−NMPインプラントは、インプラントの周縁で細胞数を増やしていた。
プロモーターへ機能可能的に連結したLIM石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクトすることが含まれる。本発明によれば、BMP−2、BMP−4、BMP−6、BMP−7、TGF−β1、及びこれらの組合せからなる群より選択される1以上のタンパク質の発現を含めることができる。単離核酸は、配列番号25の全長へ相補的な核酸分子へ標準条件下でハイブリダイズすることができる核酸;及び/又は配列番号26の全長に相補的な核酸分子へ高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる核酸分子であり得る。細胞は、バフィーコート細胞、幹細胞(例えば、間葉幹細胞又は多能性幹細胞)、又は椎間板細胞(例えば、髄核の細胞、又は繊維輪の細胞)であり得る。細胞は、ex vivo 又は、in vivo でトランスフェクトすることができる。例えば、細胞は、哺乳動物の椎間板への核酸の直接注射により in vivo でトランスフェクトしてよい。
Claims (5)
- 椎間板細胞においてBMP−2タンパク質の発現を誘導する方法であって:
プロモーターへ連結したLIM石灰化(mineralization)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で前記細胞をex vivoでトランスフェクトすることを含んでなり、ここで、前記LIM石灰化タンパク質は、RLMP、HLMP−1、HLMP−1s、HLMP−3、又はこれらの組合せからなる群より選択される、前記方法。 - LIM石灰化タンパク質がHLMP−1である、請求項1記載の方法。
- 椎間板細胞が、髄核の細胞又は繊維輪の細胞である、請求項1又は2記載の方法。
- 単離核酸で細胞をex vivoでトランスフェクトすることが、RLMP、HLMP−1、HLMP−1s、HLMP−3、又はこれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質をコードする単離核酸を含んでなる組換えアデノウイルスベクターでの細胞の感染を含む、請求項1記載の方法。
- トランスフェクトされる細胞が椎間インプラントを含む、請求項1記載の方法。
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