CN1908170A - Lim矿化蛋白剪接变体 - Google Patents

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Abstract

本发明致力于编码LIM矿化蛋白或LMP的分离核酸分子。本发明还提供了包含编码LMP的核酸序列剪接变体的载体，以及包含这些载体的宿主细胞。此外，本发明还涉及通过用包含编码LIM矿化蛋白剪接变体的核苷酸序列的分离核酸分子转染生骨前体细胞来诱导骨形成的方法。转染可以离体进行，或者通过直接注射病毒或裸露的质粒DNA而在体内发生。在特定的实施方案中，本发明提供了融合脊骨的方法，即用包含编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸分子转染生骨前体细胞，混和经转染生骨前体细胞与基质，并使基质接触脊骨。最后，本发明涉及通过用本发明载体稳定转染宿主细胞来诱导全身性骨形成的方法。

Description

LIM矿化蛋白剪接变体
本申请为2000年4月28日申请的中国发明专利申请“LIM矿化蛋白剪接变体”(申请号为00808895.0)的分案申请。
                      发明背景
1.发明领域
一般的说，本发明涉及哺乳动物的生骨细胞以及骨和骨组织形成。具体的说，本发明涉及在体外和在体内增强骨矿化效能的蛋白质新家族以及编码这些蛋白质的核酸。本发明提供了用于治疗与骨和骨组织有关的多种病理学状态的方法，诸如脊骨(spine)融合、骨折修复、和骨质疏松。
2.相关技术的描述
成骨细胞被认为是由多能间充质干细胞分化而来的。成骨细胞的成熟导致细胞外基质的分泌，从而矿化并形成骨。这种复杂过程的调控尚不太清楚，但是认为涉及一组已知为骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)的信号蛋白质。这些蛋白质已显示与胚胎背腹图式、肢芽发育、和成年动物的骨折修复有关(B.L.Hogan， 基因和 发育(Genes&Develop.)10：1580，1996)。这组转化生长因子β超家族分泌的蛋白质在多种细胞类型中在不同分化阶段具有不同活性；这些紧密相关分子的生理学活性差异尚未阐明(D.M.Kingsley， 遗传学趋势 (Trends Genet.)10：16，1994)。
为了更好的认识不同BMP信号蛋白的独特生理学作用，我们最近比较了BMP-6与BMP-2和BMP-4诱导大鼠颅盖成骨细胞分化的潜能(Boden等人，内分泌学(Endocrinology)137：3401，1996)。我们在需要BMP或糖皮质激素来发动分化的大鼠胎儿颅盖第一代传代(继代)培养物中研究了这种过程。在这种膜成骨形成模型中，糖皮质激素(GC)或BMP将发动趋向能够分泌骨钙蛋白(成骨细胞特异性蛋白质)的矿化骨结的分化。这种传代培养物系统不同于经历自发分化的大鼠成骨细胞原代培养物。在这种传代系统中，糖皮质激素导致10倍诱导BMP-6 mRNA和蛋白质的表达，它负责增强成骨细胞分化(Boden等人， 内分泌学(Endocrinology)138：2920，1997)。
除了细胞外信号(诸如BMP)，细胞内信号或调控分子也可能在导致新骨形成的级联事件中发挥作用。一大类细胞内调控分子是LIM蛋白质，如此命名是因为它们具有称为LIM结构域的特征性结构基元。LIM结构域是由通过2-氨基酸间隔物连接在一起的两个特殊锌指组成的富含半胱氨酸结构基元。有些蛋白质只具有LIM结构域，而其它蛋白质具有多种其它功能性结构域。LIM蛋白质形成多样性组，包括转录因子和细胞骨架蛋白。LIM结构域的主要作用似乎是通过与相同或不同LIM结构域形成二聚体或者通过结合独特蛋白质来介导蛋白质-蛋白质相互作用。
在LIM同源结构域蛋白质(即具有两个LIM结构域和一种同源结构域序列的蛋白质)中，LIM结构域作为负调控元件发挥功能。LIM同源结构域蛋白质涉及细胞谱系决定的控制和分化的调控，尽管只含LIM的蛋白质可能具有相似作用。只含LIM的蛋白质还涉及细胞增殖的控制，因为编码这种蛋白质的几种基因与致癌染色体易位有关。
人和其它哺乳动物易患需要骨修复和/或再生过程的疾病或损伤。例如，能够刺激天然骨修复机制由此缩短治愈骨折所需时间的新治疗方案将改进骨折治疗。在另一个实例中，遭受全身性骨紊乱(诸如骨质疏松)的个体将受益于能够导致全身性新骨形成的治疗方案。这些治疗方案将降低由骨质流失引起骨折的发病率，而骨质流失是这种疾病的特征。
至少为了这些原因，已经研究了细胞外因子(诸如BMP)以用于在体内刺激新骨形成。尽管使用BMP和其它细胞外信号分子获得了早期成功，但是它们的应用也引起大量缺点。例如，增强新骨形成需要较大剂量的纯化BMP，由此增加了这种治疗方法的费用。而且，细胞外蛋白质在导入宿主动物后易于降解。另外，因为它们通常具有免疫原性，所以始终存在激发针对所用蛋白质的免疫应答的可能性。
出于这些考虑，需要使用细胞内信号分子诱导新骨形成的有用治疗方案。现在，基因疗法领域的进展有可能将构成骨形成过程一部分的细胞内信号的编码核苷酸片段导入生骨前体细胞(即涉及骨形成的细胞)或外周血白细胞。骨形成的基因疗法具有大量潜在优点：(1)生产成本较低；(2)由于能够长期表达细胞内信号，所以与细胞外治疗方案相比，效能较高；(3)回避细胞外信号疗法可能受到的信号受体数目有限的牵制；(4)能够将经转染的潜在骨原细胞直接投递至需要局部骨形成的位点；和(5)将能够进行全身性骨形成，由此为骨质疏松和其它代谢性骨疾病提供治疗方案。
                      发明概述
本发明提供了使用早期参与导致骨形成的级联事件的细胞内信号分子来诱导骨形成的新型组合物和方法，从而试图克服现有技术的缺点。申请人已经发现了10-4/RLMP(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)，即序列最初分离自受激大鼠颅盖成骨细胞培养物的新LIM基因。该基因已经克隆、测序、并分析了在体外增强骨矿化效能的能力。蛋白质RLMP影响骨基质的矿化，以及趋向成骨细胞谱系的细胞分化。与其它已知细胞因子(例如BMP)不同，RLMP不是分泌性蛋白质，而是细胞内信号分子。这种特性能够有利的提供细胞内信号放大，而且更易于评价转染细胞。它还适用于更加有效且特异的体内应用。合适的临床应用包括增强骨折、骨缺陷、骨移植中的骨修复、和骨质疏松患者中的正常稳态。
申请人还已经克隆、测序、并推导了相应人蛋白质的氨基酸序列，命名为HLMP-1。该人蛋白质在体外和在体内证明了对骨矿化的增强效能。
另外，申请人已经表征了截短(短)型LMP-1，命名为HLMP-1s。这种短型得自点突变，即在cDNA克隆的一种来源中提供终止密码子从而截短蛋白质。该短型蛋白(LMP-1s)在细胞培养物中和在体内表达时完全有功能。
通过对人心脏cDNA文库的PCR分析，申请人已经鉴定了在编码HLMP-1的核苷酸序列的第325-444位碱基对区域不同于HLMP-1的另外两种剪接变体(称为HLMP-2和HLMP-3)。HLMP-2序列在该区域内具有119bp的删除和17bp的插入。与HLMP-1相比，编码HLMP-3的核苷酸序列没有删除，但是也具有与HLMP-2相同的17bp，插入HLMP-1序列的第444位。
下面的描述将阐明本发明的其它特性和优点，根据说明书将变得部分清晰，或者可以由本发明的实践认识。通过本文描述和权利要求具体指出的方法和组合物将实现和达到本发明的目的和其它优点。
在一个宽广方面，本发明涉及包含编码任何LIM矿化蛋白的核酸序列的分离核酸分子，其中该核酸分子在标准条件下与和全长SEQ ID NO：25互补的核酸分子发生杂交，且其中该核酸分子在高度严谨条件下与和全长SEQ ID NO：26互补的核酸分子发生杂交。在一个具体方面，该分离的核酸分子编码HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2、或HLMP-3。另外，本发明致力于包含这些核酸分子的载体，以及包含这些载体的宿主细胞。在另一个具体方面，本发明涉及这些蛋白质自身。
在第二种宽广方面，本发明涉及对LIM矿化蛋白，包括HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2、和HLMP-3特异的抗体。在一个具体方面，抗体是多克隆抗体。在另一个具体方面，抗体是单克隆抗体。
在第三个宽广方面，本发明涉及诱导骨形成的方法，其中用包含编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸分子转染生骨前体细胞(osteogenic precursor cell)。在一个具体方面，分离核酸分子位于载体中，载体可以是质粒或病毒，诸如腺病毒或逆转录病毒。转染可以通过直接注射分离核酸分子而离体或在体内发生。转染的分离核酸分子可以编码HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2或HLMP-3。
在另一个方面，本发明涉及融合脊髓的方法，即用包含编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸分子转染生骨前体细胞，混和经转染的生骨前体细胞与基质，并使基质接触骨髓。
在还有一个方面，本发明涉及通过用本发明载体稳定转染宿主细胞来诱导全身性骨形成的方法。
可以理解，上文一般性描述和下文详细描述都是例示性和解释性的，而且意欲提供所要求保护的发明的进一步解释。
                      缩写和定义
BMP             骨形态发生蛋白
HLMP-1          人LMP-1，也称为人LIM蛋白或HLMP
HLMP-1s         人LMP-1短(截短)型蛋白
HLMPU           人LIM蛋白独特区
LMP             LIM矿化蛋白
MEM             极限必需培养基
Trm             曲安西龙(Triamcinolone)
-GlyP           β-磷酸甘油
RACE            cDNA末端的快速扩增
RLMP            大鼠LIM矿化蛋白，也称为RLMP-1
RLMPU           大鼠LIM蛋白独特区
RNAsin          RNA酶抑制剂
ROB             大鼠成骨细胞
10-4            包含RLMP cDNA序列的克隆(SEQ ID NO：2)
UTR             非翻译区
HLMP-2          人LMP剪接变体2
HLMP-3          人LMP剪接变体3
                       发明详述
本发明涉及新的哺乳动物LIM蛋白，此处命名为LIM矿化蛋白或LMP。本发明更具体的涉及人LMP，称为HLMP或HLMP-1，或者人LMP的其它剪接变体，称为HLMP-2或HLMP-3。申请人已经发现这些蛋白质在体外培养的哺乳动物细胞中增强骨的矿化。当哺乳动物中生成LMP时，它还在体内诱导骨的形成。
用编码LMP或HLMP的核酸离体转染骨髓细胞、生骨前体细胞、外周血白细胞、或间充质干细胞，随后将转染细胞复植到供体体内的方法适用于治疗多种骨相关紊乱或损伤。例如，可以使用这种方法来：加强长骨骨折修复；在节段性缺损中生成骨；为骨折提供骨移植替代物；促进肿瘤重建或脊骨融合；和(通过注射)为薄弱或骨质疏松的骨提供局部治疗，诸如髋骨、椎骨、或腕骨的骨质疏松。用LMP或HLMP编码核酸进行的转染还可用于：经皮注射经转染的骨髓细胞以加速骨折长骨的修复；治疗长骨骨折的愈合迟滞或不愈合或者脊骨融合的假关节病；和在髋或膝的无血管性坏死中诱导新骨形成。
除了基因疗法基于离体的方法，还可以在体内实现包含编码LMP或HLMP的核酸序列的重组DNA载体的转染。当将编码LMP或HLMP的DNA片段插入适当病毒载体(例如腺病毒载体)时，可以将病毒构建物直接注射到需要软骨内骨化的体内位点。通过直接经皮注射导入LMP或HLMP序列，即可刺激骨形成，而不需要手术干预来获得骨髓细胞(以进行离体转染)或复植到患者体内需要新骨的位点。Alden等人( 神经外科学焦点 (Neurosurgical Focus)，1998)已经证明了使用编码BMP-2的cDNA(已克隆到腺病毒载体中)的基因疗法直接注射方法的效用。
还有可能通过将包含编码HLMP的核酸序列的裸露的即未包囊的重组质粒直接注射至适当身体位点来进行体内基因疗法。在本发明的这个实施方案中，当适当的靶细胞摄取或内在化裸露的质粒DNA时，即发生转染，这已有描述。正如在使用病毒构建物的体内基因疗法的情况中，直接注射裸露的质粒DNA具有仅需要少许或者不需要手术干预的优点。在人患者中已经成功的证明了使用编码内皮细胞有丝分裂原VEGF(血管内皮生长因子)的裸露质粒DNA进行的直接基因疗法(Baumgartner等人，循环(Circulation)97(12)：1114-1123，1998)。
通过使用腺病毒载体将LMP投递至生骨细胞，实现了LMP的瞬时表达。发生这种现象的原因是腺病毒不掺入所转染的靶细胞的基因组。LMP的瞬时表达，即在经转染靶细胞的生存期中发生表达，足以实现本发明的目的。然而，当使用掺入靶细胞基因组的载体作为投递载体时，能够发生LMP的稳定表达。例如，基于逆转录病毒的载体适用于该目的。
LMP的稳定表达在多种全身性骨相关紊乱的治疗中特别有用，诸如骨质疏松和成骨不全。对于本发明的这个实施方案，除了使用整合到靶细胞基因组的载体将LMP编码核苷酸序列投递至靶细胞内，还将LMP表达置于可调控启动子的控制之下。例如，通过暴露于外源诱导剂(诸如四环素)来开启的启动子是合适的。使用这种方法，能够通过施用有效量的外源诱导剂在全身基础上刺激新骨形成。一旦形成了足够数量的骨质，就可以停止施用外源诱导剂。根据需要，可以重复这种过程来复原骨质流失(例如因骨质疏松所致)。
对HLMP特异的抗体特别适用于测定患者细胞的骨诱导即骨形成潜力的方法中。以这种方式，能够鉴定患者是否有骨修复愈合缓慢或不良的风险。同样，HLMP特异性抗体适用于标记物测定法，用于鉴定骨变性疾病(诸如骨质疏松)的风险因子。
遵循众所周知的传统方法，通过连接编码LMP的核酸片段与其它核酸序列(诸如克隆和/或表达载体)制备本发明的基因。构建和分析这些重组载体的所需方法，例如限制性内切酶消化、克隆方案、诱变、寡核苷酸的有机合成、和DNA测序，已有描述。对于DNA测序，优选双脱氧终止物法。
已经发表了许多关于重组DNA方法的论文，包括Sambrook等人， 《分 子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，第2版，1988；Davis等人， 《分子生物学基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevier，1986；和Ausubel等人，《分子生物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley Interscience，1988(特别收入本文作为参考)。
引物指导的DNA或cDNA扩增是本发明基因表达中的常用步骤。它通常是通过聚合酶链式反应(PCR)来进行的。授予Mullis等人的美国专利4,800,159和其它已发表来源描述了PCR。PCR的基本原理是通过引物延伸的连续循环来指数复制DNA序列。当一种引物的延伸产物与另一种引物发生杂交时，即成为合成另一核酸分子的模板。引物-模板复合物作为DNA聚合酶的底物，而DNA聚合酶在发挥复制功能时延伸引物。用于PCR应用的传统酶是分离自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的热稳定DNA聚合酶，或Taq DNA聚合酶。
基本的PCR方法存在大量变异，而且熟练技术人员能够容易的进行构建本发明重组载体所需任何特定步骤中选择的具体流程。例如，为了测量10-4/RLMP的细胞表达，可以在众所周知的标准流程下提取RNA并逆转录，然后通过PCR为适当的mRNA序列分析获得的cDNA。
在重组表达系统的表达载体中表达编码LIM矿化蛋白的基因。当然，构建的序列无需与原始序列或其互补序列相同，而可以是根据DNA密码简并性确定表达具有骨形成活性的LMP的任何序列。还可以采用保守氨基酸替代或其它修饰(诸如氨基末端存在甲硫氨酸残基)。
将在选择的宿主表达系统中有活性的核糖体结合位点连接至嵌合LMP编码序列的5’端，形成合成基因。通过连接适当线性化的质粒，可以将合成基因插入多种表达载体中的任一种。可调控启动子(例如大肠杆菌lac启动子)也适用于表达嵌合编码序列。其它合适的可调控启动子包括trp、tac、recA、T7、和λ启动子。
通过几种已发表的标准流程之一，例如磷酸钙沉淀、DEAE-Dextran、电穿孔、或原生质体融合，将编码LMP的DNA转染到受体细胞中，形成稳定的转化体。优选磷酸钙沉淀，如下进行时特别如此。
在转移到细胞内之前，参照Graham和Van Der的方法( 病毒学 (Virology)52：456，1973)使DNA与磷酸钙共沉淀。取40-50g DNA，以鲑鱼精或小牛胸腺DNA作为载体，应用于铺在100mm培养皿上的0.5×106个细胞。将DNA与0.5ml 2×Hepes溶液(280mM NaCl/50mM Hepes/1.5mMNa2HPO4，pH7.0)混和，并加入等体积的2×CaCl2(250mM CaCl2/10mM Hepes，pH7.0)。30-40分钟后出现白色颗粒沉淀，均匀的滴加在细胞上，并于37℃温育4-16小时。除去培养基，并将细胞在溶于PBS的15％甘油中震动3分钟。除去甘油后，用含10％胎牛血清的Dulbecco氏极限必需培养基(DMEM)培养细胞。
还可以使用下列方法转染DNA：Kimura等人( 病毒学(Virology)49：394，1972)和Sompayrac等人( 美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)78：7575，1981)的DEAE-Dextran法；Potter( 美国国家科学 院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：7161，1984)的电穿孔法；和Sandri-Goddin等人( 分子和细胞生物学(Molec.Cell.Biol.)1：743，1981)的原生质体融合法。
固相亚磷酰胺化学法是用于有机合成寡脱氧核苷酸和多脱氧核苷酸的优选方法。另外，可采用许多其它化学合成法。本领域技术人员能够容易的用这些方法合成本发明的具体序列。
本发明还包括在标准条件下与编码本发明LIM矿化蛋白的任何核酸序列发生杂交的核酸分子。“标准杂交条件”将随探针大小、核酸试剂的背景和浓度、以及杂交类型(例如原位、Southern印渍、或DNA-RNA杂合体杂交(Northern印渍))而变化。“标准杂交条件”的确定属于本领域技术水平之内。例如，参阅授予Fremeau等人的美国专利5,580,775；E.M.Southern， 分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)98：503，1975；Alwine等人， 酶学方法(Meth.Enzymol.)68：220，1979；和Sambrook等人， 《分 子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，第7.19-7.50页，冷泉港出版社，1989(收入本文作为参考)。
一组优选的标准杂交条件包括将印渍在50％甲酰胺/5×SSPE(150nMNaCl/10mM NaH2PO4[pH7.4]/1mM EDTA[pH8.0])/5×Denhardt氏溶液(每100ml水含20mg Ficoll/20mg聚乙烯吡咯烷酮/20mg BSA)/10％硫酸葡聚糖/1％SDS/100g/ml鲑鱼精DNA中于42℃预杂交2小时；加入32P标记的cDNA探针，并将杂交继续14小时；然后，将印渍用2×SSPE/0.1％SDS于22℃清洗20分钟2次，随后用0.1×SSPE/0.1％SDS于65℃清洗1小时；然后将印渍干燥并在存在增感屏的条件下使X射线胶片曝光5天。
在“高度严谨条件”下，若探针与其靶序列充分相同，则这两种序列将发生杂交。正如在标准杂交条件的情况中，本领域技术人员能够根据本领域技术水平和具体实验的种类确定只有充分相同序列发生杂交的条件。
本发明的另一个方面包括由核酸序列编码的蛋白质。在还有一个方面，本发明涉及基于抗LMP抗体的对这种蛋白质的鉴定。在这个实施方案中，通过裂解细胞和SDS-PAGE分离蛋白质来制备用于Western印渍分析的蛋白质样品。如Ausubel等人( 《分子生物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley and Sons，1987)所述，通过电印迹将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。用速溶脱脂奶粉(1gm溶于100ml PBS)封闭滤膜后，将抗LMP抗体加到滤膜上，并于室温温育1小时。用磷酸盐缓冲液(PBS)彻底清洗滤膜，并与辣根过氧化物酶(HRPO)-抗体缀合物于室温温育1小时。再次用PBS彻底清洗滤膜，并通过加入二氨基联苯胺(DAB)来鉴定抗原条带。
单特异性抗体是本发明选择的试剂，具体用于分析患者细胞与LMP表达有关的特定特征。如本文所用，“单特异性抗体”定义为对LMP具有均一结合特征的一种或多种抗体。如本文所用，“均一结合”指抗体结合特定抗原或表位(诸如上述LMP相关抗原或表位)的能力。由包含LMP反应性抗体的哺乳动物抗血清纯化针对LMP的单特异性抗体，或者使用Kohler和Milstein( 自然(Nature)256：495-497，1975)的技术制备LMP反应性单克隆抗体。通过用适当浓度的LMP(含或不含免疫佐剂)免疫动物(诸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、或马)来制备LMP特异性抗体。
在这种方法中，在第一次免疫前采集免疫前血清。每只动物接受大约0.1mg-大约1000mg LMP，根据需要，可结合使用可接受免疫佐剂。这种可接受佐剂包括(但不限于)弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、明矾沉淀物、包含小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)的油包水乳剂、和tRNA佐剂。初始免疫包括皮下(PC)、腹膜内(IP)、或二者兼之多处注射优选于弗氏完全佐剂中的LMP。以规则时间间隔(优选每周一次)对每只动物采血以测定抗体效价。动物可以在初始免疫后接受或不接受加强注射。那些接受加强注射的动物通常通过相同途径接受于弗氏不完全佐剂中的等量抗原。以大约3周的时间间隔给予加强注射，直至获得最高效价。每次加强免疫后大约7天或单次免疫后大约每周一次，对动物采血，收集血清，并分装保存于大约-20℃。
通过用LMP免疫近交小鼠(优选Balb/c小鼠)来制备LMP反应性单克隆抗体(mAb)。通过IP或SC途径用大约0.1mg-大约10mg(优选大约1mg)溶于大约0.5ml缓冲液或生理盐水的LMP及等体积混和的上述可接受佐剂免疫小鼠。优选弗氏完全佐剂。小鼠在第0天接受初始免疫，并休息大约3-30周。通过静脉内(IV)途径给予经免疫小鼠以一次或多次加强免疫，每次大约0.1mg-大约10mg溶于缓冲液(诸如磷酸盐缓冲液)的LMP。通过本领域知道的标准流程，由经免疫小鼠切下脾，获得来自抗体阳性小鼠的淋巴细胞，优选脾淋巴细胞。通过在能够形成稳定杂交瘤的条件下混和脾淋巴细胞与适当的融合配偶体(优选骨髓瘤细胞)以产生杂交瘤细胞。融合配偶体可以包括(但不限于)小鼠骨髓瘤P3/NS1/Ag 4-1、MPC-11、S-194、和Sp 2/0，优选Sp 2/0。在分子量大约1000、浓度大约30％-大约50％的聚乙二醇中融合抗体生成细胞和骨髓瘤细胞。通过本领域知道的流程，在添加次黄嘌呤、胸苷、和氨基蝶呤的Dulbecco’sModified Eagles Medium(DMEM)中进行培养，由此选择融合的杂交瘤细胞。在大约第14、18、和21天由生长阳性孔收集上清液，并通过免疫测定法(诸如固相免疫放射性测定法SPIRA)以LMP作为抗原筛选抗体生成。还在Ouchterlony沉淀测定法中测试培养液，以确定mAb的同种型。通过诸如MacPherson的软琼脂技术(“软琼脂技术”，在 《组织培养方 法和应用》(Tissue Culture Methods and Applications)中，Kruse和Paterson编，Academic出版社，1973)克隆来自抗体阳性孔的杂交瘤细胞。还可参阅Harlow等人， 《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，1988。
还可以通过给降植烷致敏的Balb/c小鼠(每只小鼠大约0.5ml)在致敏后大约4天注射大约2×106-大约6×106个杂交瘤细胞，从而在体内产生单克隆抗体。细胞转移后大约8-12天收集腹水，并通过本领域知道的技术纯化单克隆抗体。
通过在含大约2％胎牛血清的DMEM中培养杂交瘤细胞系进行抗LMP单克隆抗体的体内生产，来获得足够量的特异性mAb，并通过本领域知道的技术纯化mAb。
通过多种血清学或免疫学测定法测定腹水或杂交瘤培养液的抗体效价，包括(但不限于)沉淀、被动凝集、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、和放射性免疫测定法(RIA)。可使用相似测定法检测体液或组织和细胞提取物中是否存在LMP。
本领域技术人员显然知道，上述用于生成单特异性抗体的方法可用于生成对LMP多肽片段、全长初生LMP多肽、或者其变体或等位基因特异的抗体。
在另一个实施方案中，本发明致力于HLMP-1的其它剪接变体。人心脏cDNA的PCR分析揭示了在HLMP-1序列的第325-444位碱基对区域不同于HLMP-1的另外两种HLMP剪接变体(称为HLMP-2和HLMP-3)的mRNA。HLMP-2序列在该区域内具有119bp的删除和17bp的插入。这些变化保留了读码框，产生423个氨基酸的蛋白质，其与HLMP-1相比，净损失34个氨基酸(删除40个氨基酸，插入6个氨基酸)。HLMP-2包含在HLMP-1中存在的C末端LIM结构域。
与HLMP-1相比，HLMP-3没有删除，但是在第444位也插入了相同的17bp。该插入移动了读码框，在第459-461位碱基对处产生终止密码子。结果，HLMP-3编码153个氨基酸的蛋白质。该蛋白质缺乏在HLMP-1和HLMP-2中存在的C末端LIM结构域。通过Western印渍分析确认了由HLMP-2和HLMP-3编码的蛋白质的预测大小。
3种剪接变体的组织分布PCR分析揭示了它们是差异表达的，特定异构体在不同组织中占优势。HLMP-1显然是在白细胞、脾、肺、胎盘、和胎肝中表达的主要形式。HLMP-2似乎是骨骼肌、骨髓、和心脏组织中的主要异构体。然而，HLMP-3在检查的任何组织中都不是主要形式。HLMP-3在大鼠成骨细胞传代培养物中的过度表达诱导骨节形成(287±56)，与糖皮质激素(272±7)和HLMP-1(232±200)的效果相似。既然HLMP-3缺乏C末端LIM结构域，那么骨诱导活性就不需要这些区域。但是，HLMP-2的过度表达不诱导骨节形成(11±3)。这些数据说明由删除的119bp编码的氨基酸是骨诱导所必需的。这些数据还说明HLMP剪接变体的分布对于组织特异功能可能是重要的。令人惊讶的是，我们已经显示HLMP-2在大鼠成骨细胞传代培养物中可抑制类固醇诱导的成骨细胞形成。因此，HLMP-2将在不需要骨形成的临床情形中具有治疗性效用。
1997年7月22日，将位于载体中的10-4/RLMP样品，命名为pCMV2/RLMP(包含插入片段10-4克隆/RLMP的载体pRc/CMV2)，保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852。保藏物的培养物编号是209153。1998年3月19日，将包含插入片段HLMP-1s的载体pHis-A样品保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。保藏物的培养物编号是209698。2000年4月14日，按照布达佩斯条约(BudapestTreaty)，将质粒pHAhLMP-2(包含衍生自含HLMP-2人心肌cDNA的cDNA插入片段的载体pHisA)和pHAhLMP-3(包含衍生自含HLMP-3人心肌cDNA的cDNA插入片段的载体pHisA)样品保藏于ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA，20110-2209，USA。这些保藏物的保藏号依次是PTA-1698和PTA-1699。根据布达佩斯条约的要求，这些保藏物将在ATCC维持至少30年，而且在公开它们的专利授权后可以公开获得。应当明白保藏物的可获得性并不构成对以侵犯由政府行为授予的专利权来实施本发明的许可。
在评价本发明的核酸、蛋白质、或抗体时，采用了酶测定法、蛋白质纯化、和其它传统生化方法。分别通过Southern印渍和Northern印渍技术分析DNA和RNA。通常，通过凝胶电泳将分析的样品大小分离。然后将凝胶中的DNA或RNA转移至硝酸纤维素或尼龙滤膜。然后将印渍(即凝胶中样品图式的复制品)与探针进行杂交。通常，探针是放射性标记的，优选32P，尽管可以用本领域知道的其它信号生成分子标记探针。然后可以通过检测系统(诸如放射自显影)使感兴趣的特定条带显影。
为了举例说明本发明的优选实施方案，本文包括下列非限制性实施例。这些结果证明了使用本发明LIM矿化蛋白及编码这些蛋白质的分离核酸分子来诱导或增强骨形成的可行性。
实施例1.颅盖细胞培养
如先前所述(Boden等人， 内分泌学(Endocrinology)137(8)：3401-3407，1996)，由分娩前20天的大鼠获得大鼠颅盖细胞(也称为大鼠成骨细胞，ROB)。将原代培养物培养至汇合，胰蛋白酶处理，并传代至6孔板(每个35mm孔1×105个细胞)作为第一代传代培养细胞。将在第0天汇合的传代培养细胞继续培养7天。由第0天开始，每3或4天在层流罩超净台中换培养基并进行处理(Trm和/或BMP)。标准培养方案如下：第1-7天，MEM/10％FBS/50μg/ml抗坏血酸/±刺激物；第8-14天，BGJb培养基/10％FBS/5mM-GlyP(作为无机磷酸盐来源以进行矿化)。在第14天进行骨节形成和骨钙蛋白分泌的终点分析。根据在所有BMP研究的剂量-应答曲线上证明了中间效应的该系统预试验，BMP的剂量选择为50ng/ml。
实施例2.反义处理和细胞培养
为了研究LMP-1在膜成骨形成过程中的潜在功能性作用，我们合成了用于阻断LMP-1 mRNA翻译的反义寡核苷酸，并处理正在经历由糖皮质激素起始分化的成骨细胞传代培养物。使用对应于跨越推定翻译起始位点的25bp序列(SEQ ID NO：42)的高度特异性反义寡核苷酸(与已知大鼠序列没有显著同源性)实现了对RLMP表达的抑制。对照培养物抑或不接受寡核苷酸抑或接受有义寡核苷酸。在存在(预先温育)或不存在脂质转染胺试剂(lipofectamine)的情况中进行实验。简单的说，将22g有义或反义RLMP寡核苷酸在MEM中于室温温育45分钟。温育后，加入更多MEM或预先温育的脂质转染胺试剂/MEM(7％v/v；于室温温育45分钟)，使寡核苷酸浓度达到0.2M。将获得的混和物于室温温育15分钟。然后将寡核苷酸混和物与适当培养基(即MEM/抗坏血酸/±Trm)混和，使寡核苷酸终浓度达到0.1M。
在存在或不存在适当寡核苷酸的情况中在适当培养基(±刺激物)中培养细胞。将最初用脂质转染胺试剂培养的培养物于37℃在5％CO2中培养4小时后换成既不含脂质转染胺试剂又不含寡核苷酸的培养基。所有培养物(尤其是接受寡核苷酸的培养物)每24小时换培养基，以维持寡核苷酸水平。
LMP-1反义寡核苷酸以依赖剂量的方式抑制矿化骨节的形成和骨钙蛋白的分泌，与BMP-6寡核苷酸的效果相似。加入外源BMP-6不能挽救成骨细胞分化中的LMP-1反义阻断，却能够逆转BMP-6反义寡核苷酸抑制。该实验进一步确认了在成骨细胞分化途径中LMP-1相对于BMP-6处于上游。LMP-1反义寡核苷酸还在大鼠成骨细胞原代培养物中抑制自发的成骨细胞分化。
实施例3.矿化骨节形成的定量
将参照实施例1和2制备的ROB培养物在70％乙醇中固定过夜并用vonKossa银染料染色。使用半自动计算机化视频图像分析系统来定量每个孔中的骨节计数和骨节面积(Boden等人， 内分泌学 (Endocrinology)137(8)：3401-3407，1996)。然后将这些数值相除，计算面积/骨节值。通过人工计数验证了这种自动化方法，相关系数0.92(p＜0.000001)。所有数据表述为由每种条件5或6个孔计算得到的平均值±平均标准误差(S.E.M.)。每次实验使用来自不同颅盖制备物的细胞确认至少两次。
实施例4.骨钙蛋白分泌的定量
如Nanes等人所述( 内分泌学(Endocrinology)127：588，1990)，使用我们实验室制备的针对大鼠骨钙蛋白C末端九肽的单特异性多克隆抗体(Pab)的竞争放射性免疫测定法，测量培养基中的骨钙蛋白水平。简单的说，通过乳过氧化物酶法，用1mCi 125I-Na碘化1g九肽。向装有200l测定缓冲液(0.02M磷酸钠/1mM EDTA/0.001％硫柳汞/0.025％BSA)的管中加入来自细胞培养物的培养基或溶于100μl测定缓冲液的骨钙蛋白标准(0-12,000fmol)。然后加入Pab(1∶40,000；100μl)，随后加入碘化肽(12,000cpm；100l)。相似的制备测试非特异性结合的样品，但是不含抗体。
通过加入700μl山羊抗兔IgG，随后于4℃温育18小时，由此分离结合的和游离的Pab。将样品以1200rpm离心45分钟后，弃去上清液，并在γ计数器中对沉淀物计数。以fmol/100l报告骨钙蛋白值，然后将这些数值除以100转换成pmol/ml培养基(3天产量)。数值以每种条件5-6个孔3次测定的平均值±S.E.M.表述。每次实验使用来自不同颅盖制备物的细胞确认至少两次。
实施例5.Trm和RLMP在体外对矿化的影响
有义或反义寡核苷酸在未刺激细胞培养系统中对总的骨节形成有很少明显影响。但是，当用Trm刺激ROB时，RLMP的反义寡核苷酸抑制骨节矿化＞95％。向寡核苷酸处理的培养物中加入外源BMP-6不能挽救RLMP反义寡核苷酸所处理骨节的矿化。
骨钙蛋白与骨矿化长期同义，而且骨钙蛋白水平与骨节产生和矿化有关。RLMP反义寡核苷酸显著降低骨钙蛋白生成，但是反义处理的培养物的骨节计数没有显著变化。在这种情况中，加入外源BMP-6只将RLMP反义所处理培养物中的骨钙蛋白生成挽救了10-15％。这说明RLMP的作用位于BMP-6下游，而且比BMP-6更具特异性。
实施例6.RNA的收获和纯化
使用4M异硫氰酸胍(GIT)溶液，由双份ROB(参照实施例1和2在6孔培养板中制备)孔收获细胞RNA，产生统计学上的三份样品。简单的说，由孔吸出培养物上清液，然后在每份成对孔收获物上覆盖0.6ml GIT溶液。加入GIT溶液后，将平板旋涡摇动5-10秒钟(尽可能一致)。在进行进一步处理前，将样品于-70℃保存多至7天。
通过参照Sambrook等人( 《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，第7.19章，冷泉港出版社，1989)的标准方法，略微改动，纯化RNA。简单的说，向解冻的样品中加入60l2.0M醋酸钠(pH4.0)、550l水饱和酚、和150l氯仿∶异戊醇(49∶1)。旋涡震荡后，将样品于4℃以10000xg离心20分钟，将水相转移至新管，加入600l异丙醇，并将RNA于-20℃沉淀过夜。
过夜保温后，将样品以10000xg离心20分钟，并轻轻吸去上清液。将沉淀重悬于400l经DEPC处理的水，用酚∶氯仿(1∶1)抽提1次，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，并在加入40l 3.0M醋酸钠(pH5.2)和1.0ml无水乙醇后于-20℃沉淀过夜。为了回收细胞RNA，将样品以10000xg离心20分钟，用70％乙醇清洗1次，空气干燥5-10分钟，并重悬于20l经DEPC处理的水。根据使用分光光度计测定的光密度计算RNA浓度。
实施例7.逆转录-聚合酶链式反应
将溶于总体积10.5l DEPC-H2O的5g总RNA于65℃加热5分钟，然后加到装有4l 5×MMLV-RT缓冲液、2l dNTP、2l dT17引物(10pmol/ml)、0.5l RNA抑制剂(40U/ml)、和1μl MMLV-RT(200U/l)的管中。将样品于37℃温育1小时，然后于95℃温育5分钟以灭活MMLV-RT。加入80l水稀释样品。
使用标准方法学(50l总体积)，取5l逆转录样品进行聚合酶链式反应。简单的说，将样品加到装有水和适量PCR缓冲液、25mM MgCl2、dNTP、用于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP，一种持家基因)和/或BMP-6的正向和反向引物、32P-dCTP、和Taq聚合酶的管中。除非另有注明，将引物标准化使之在22轮循环中持续运行(94℃，30”；58℃，30”；72℃，20”)。
实施例8.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和磷光图像仪分析对RT-PCR产物的定量
向每管RT-PCR产物中加入5l加样染料，混和，于65℃加热10分钟，然后离心。每个反应取10l，在标准条件下进行PAGE(12％聚丙烯酰胺∶双丙烯酰胺；15V/孔；恒流)。然后将凝胶在凝胶保存缓冲液(10％v/v甘油/7％v/v醋酸/40％v/v甲醇/43％去离子水)中温育30分钟，于80℃真空干燥1-2小时，并用电子增强的磷光成像系统显影6-24小时。分析显影条带。为每条带的计数绘图。
实施例9.差异显示PCR
由用糖皮质激素(Trm，1nM)刺激的细胞提取RNA。如实施例7所述，将溶于总体积10.5l DEPC-H2O的5g总RNA于65℃加热5分钟，DNA酶处理，并进行逆转录，但是使用H-T11M(SEQ ID NO：4)作为MMLV-RT引物。如上所述，通过PCR扩增获得的cDNA，但是使用多种商品化引物对(例如H-T11G(SEQ ID NO：4)和H-AP-10(SEQ ID NO：5)；GenHunter公司，Nashville，TN)。在DNA测序凝胶上通过凝胶电泳分离放射性标记的PCR产物。电泳后，将获得的凝胶真空干燥，并将放射自显影胶片曝光过夜。由凝胶切下代表差异表达cDNA的条带，并使用Conner等人(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：278，1983)的方法通过PCR再次扩增。使用TA克隆试剂盒(InVitrogen，Carlsbad，CA)，将PCR再次扩增产物克隆到载体PCR-II中。
实施例10.UMR 106大鼠骨肉瘤细胞cDNA文库的筛选
将UMR 106文库(2.5×1010pfu/ml)以5×104pfu/ml涂布在琼脂平板(LB底层琼脂)上，并将平板于37℃温育过夜。将滤膜覆盖平板2分钟。一旦揭下滤膜，变性，漂洗，干燥，并UV交联。然后将滤膜在预杂交缓冲液(2×PIPES[pH6.5]/5％甲酰胺/1％SDS/100g/ml变性鲑鱼精DNA)中于42℃温育2小时。向完整杂交混和物/滤膜中加入260bp的放射性标记探针(SEQ ID NO：3；通过随机引发进行32P标记)，随后于42℃温育18小时。将滤膜用1×SSC/0.1％SDS于室温清洗10分钟1次，用0.1×SSC/0.1％SDS于55℃清洗15分钟3次。
清洗后，如上所述，通过放射自显影分析滤膜。将阳性克隆噬斑纯化。用第二张滤膜重复该步骤4分钟，使假阳性最小化。以λSK(-)噬菌粒的形式挽救经噬斑纯化的克隆。如下所述，对克隆的cDNA测序。
实施例11.克隆的测序
通过标准方法(Ausubel等人， 《分子生物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley Interscience，1988)对克隆的cDNA插入片段测序。简单的说，将适当浓度的终止混和物、模板、和反应混和物进行适当的循环方案(95℃，30”；68℃，30”；72℃，60”；×25)。加入终止混和物终止测序反应。于92℃加热3分钟后，将样品加样至变性6％聚丙烯酰胺测序凝胶(29∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)。将样品以60伏恒流电泳大约4小时。电泳后，将凝胶真空干燥并放射自显影。
人工分析放射自显影胶片。使用缺省参数设置的BLASTn程序对由国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NIH，Bethesda，MD； http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)维持的数据库筛选获得的序列。根据序列资料，制备新的测序引物，并重复该过程，直至将完整基因测序。所有序列在两个方向上确认最少3次。
还使用PCGENE软件包(16.0版)分析了核苷酸和氨基酸序列。通过NALIGN程序使用下列参数计算核苷酸序列的同源性百分值：非匹配核苷酸的权，10；非匹配缺口的权，10；考虑的核苷酸最大数目，50；和考虑的核苷酸最小数目，50。
对于氨基酸序列，使用PALIGN计算同源性百分值。开放缺口罚分和单位缺口罚分都选择10。
实施例12.RLMP cDNA的克隆
实施例9所述差异显示PCR扩增产物包含大约260bp的主带。将该序列用于筛选大鼠骨肉瘤(UMR 106)cDNA文库。将阳性克隆进行嵌套引物分析，以获得扩增全长cDNA所需引物序列(SEQ ID NO：11、12、29、30、和31)。将选择用于进一步研究的这些阳性克隆之一命名为克隆10-4。
通过嵌套引物分析测定的克隆10-4全长cDNA的序列分析显示，克隆10-4包含由差异显示PCR鉴定的最初260bp片段。克隆10-4(1696bp；SEQ IDNO：2)包含1371bp的开放读码框，编码457个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：1)。终止密码子TGA位于第1444-1446位核苷酸。位于第1675-1680位核苷酸的多聚腺苷酸化信号及毗连的poly(A)+尾位于3’非编码区。在SEQID NO：1的第113-116和第257-259位氨基酸存在两个潜在的N-糖基化位点，分别为Asn-Lys-Thr和Asn-Arg-Thr。在第191位和第349位氨基酸发现了两个潜在的依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点，分别为Ser和Thr。在第3位、第115位、第166位、第219位、和第442位存在5个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点，Ser或Thr。在第272-279位氨基酸确定了1个潜在的ATP/GTP结合位点基元A(P环)，Gly-Gly-Ser-Asn-Asn-Gly-Lys-Thr。
另外，在第341-391位和第400-451位氨基酸发现了2个高度保守的推定LIM结构域。这种最新鉴定的大鼠cDNA克隆中的推定LIM结构域显示与其它已知LIM蛋白LIM结构域有可观同源性。但是，与其它大鼠LIM蛋白的整体同源性低于25％。RLMP(也称为10-4)与人enigma蛋白(参阅美国专利5,504,192)具有78.5％的氨基酸同源性，但是与其最靠近的大鼠类似物CLP-36和RIT-18只具有分别为24.5％和22.7％的氨基酸同源性。
实施例13.RLMP表达的Northern印渍分析
将参照实施例1和2制备的30g来自ROB的总RNA通过甲醛凝胶电泳在1％琼脂糖平板凝胶中大小分离，并通过渗透转印渍至尼龙滤膜。用随机引发32P-dCTP标记的全长10-4cDNA的600bp EcoR1片段探查印渍。
Northern印渍分析显示，1.7kb mRNA与RLMP探针发生杂交。暴露于BMP-624小时后，ROB中的RLMP mRNA上调了大约3.7倍。在用BMP-2或BMP-4刺激的ROB中，于24小时没有看到RMLP表达的上调。
实施例14.统计方法
对于报导的每个骨节/骨钙蛋白结果，使用来自代表性实验的5-6个孔的数据计算平均值±S.E.M.。可以为每个参数显示相对于最大值的标准化数据图，从而能够同时绘制骨节计数、矿化面积、和骨钙蛋白图。
对于报导的每次RT-PCR、RNA酶保护实验、或Western印渍分析，使用来自代表性实验的三份样品的数据计算平均值±S.E.M.。可以显示相对于第0天或阴性对照的标准化图，并以超过对照值的增加倍数表述。
使用方差单向分析及(根据需要)Bonferroni的因果推理多重比较修正来评价统计显著性(D.V.Huntsberger，“方差分析”，在 《统计学 方差要素》(Elements of Statistical Variance)中，P.Billingsley编，第298-330页，Allyn&Bacon公司，波士顿，MA，1977和Sigmastat，Jandel Scientific，Corte&Madera，CA)。显著性α水平定义为p＜0.05。
实施例15.通过Western印渍分析对大鼠LIM矿化蛋白的检测
参照England等人( 生物化学和生物物理学学报(Biochim.Biophys. Acta)623：171，1980)和Timmer等人( 生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：24863，1993)的方法制备多克隆抗体。
用pCMV2/RLMP转染HeLa细胞。参照Hair等人( 白血病研究(Leukemia Research)20：1，1996)的方法由转染细胞收获蛋白质。如Towbin等人(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76：4350，1979)所述，进行天然RLMP的Western印渍分析。
实施例16.由人PCR产物衍生的大鼠LMP独特区(RLMPU)的合成
根据大鼠LMP-1 cDNA序列，合成了正向和反向PCR引物(SEQ ID NO：15和16)，并通过PCR由大鼠LMP-1 cDNA扩增了223bp的独特序列。用相同PCR引物由人MG63骨肉瘤细胞cDNA分离了相似PCR产物。
由在T-75烧瓶中培养的MG63骨肉瘤细胞收获RNA。吸去培养物上清液，用3.0ml GIT溶液覆盖烧瓶，旋涡摇动5-10秒钟，并将获得的溶液转移至1.5ml Eppendorf管(5管，每管0.6ml)。通过标准方法，参阅例如Sambrook等人， 《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第7章第19页，冷泉港实验室出版社，1989和Boden等人， 内分泌学(Endocrinology)138：2820-2828，1997，略微改动，纯化RNA。简单的说，向0.6ml样品中加入60l 2.0M醋酸钠(pH4.0)、550l水饱和酚、和150l氯仿∶异戊醇(49∶1)。加入这些试剂后，将样品旋涡震荡，于4℃以10000xg离心20分钟，并将水相转移至新管。加入600l异丙醇，并将RNA于-20℃沉淀过夜。将样品以10000xg离心20分钟，并轻轻吸去上清液。将沉淀重悬于400l经DEPC处理的水，用酚∶氯仿(1∶1)抽提1次，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，并在40l 3.0M醋酸钠(pH5.2)和1.0ml无水乙醇中于-20℃沉淀过夜。沉淀后，将样品以10000xg离心20分钟，用70％乙醇清洗1次，空气干燥5-10分钟，并重悬于20μl经DEPC处理的水。由光密度计算RNA浓度。
将溶于总体积10.5μl DEPC-H2O的5g总RNA于65℃加热5分钟，然后加到装有4l 5×MMLV-RT缓冲液、2l dNTP、2l dT17引物(10pmol/ml)、0.5l RNA抑制剂(40U/ml)、和1l MMLV-RT(200U/l)的管中。将反应于37℃温育1小时。然后通过于95℃温育5分钟灭活MMLV-RT。加入80l水稀释样品。
使用标准方法学(总体积50l)，取5l逆转录样品进行聚合酶链式反应(Boden等人， 内分泌学(Endocrinology)138：2820-2828，1997；Ausubel等人，“通过聚合酶链式反应对稀有DNA的定量”，在 《分子生 物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，第15.31-1章，Wiley&Sons，Trenton，NJ，1990)。简单的说，将样品加到装有水和适量PCR缓冲液(25mM MgCl2、dNTP、正向和反向引物(用于RLMPU；SEQID NO：15和16))、32P-dCTP、和DNA聚合酶的管中。设计将引物进行22轮一致循环用于检测放射性条带和33轮循环用于扩增PCR产物作为筛选探针(94℃，30”；58℃，30”；72℃，20”)。
对琼脂糖凝胶纯化的MG63骨肉瘤衍生PCR产物测序获得的序列与RLMPU PCR产物的同源性超过95％。该序列命名为HLMP独特区(HLMPU；SEQID NO：6)。
实施例17.逆转录酶衍生的MG63 cDNA的筛选
如实施例7所述，通过使用特异引物对(SEQ ID NO：16和17)的PCR进行筛选。将717bp MG63 PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化并用指定引物(SEQID NO：12、15、16、17、18、27、和28)进行测序。序列在两个方向上最少确认2次。将MG63序列相互进行比对，然后与全长大鼠LMP cDNA序列进行比对，以获得部分人LMP cDNA序列(SEQ ID NO：7)。
实施例18.人心脏cDNA文库的筛选
根据Northern印渍实验，确定了LMP-1在几种不同组织(包括人心肌)中的表达水平不同。因此检查了人心脏cDNA文库。将文库以5×104pfu/ml涂布在琼脂平板(LB底层琼脂)上，并将平板于37℃温育过夜。将滤膜覆盖平板2分钟。然后，将滤膜变性，漂洗，干燥，UV交联，并在预杂交缓冲液(2×PIPES[pH6.5]/5％甲酰胺/1％SDS/100g/ml变性鲑鱼精DNA)中于42℃温育2小时。加入223bp放射性标记LMP独特区探针(32P，随机引物标记；SEQ ID NO：6)并于42℃杂交18小时。杂交后，将滤膜用1×SSC/0.1％SDS于室温清洗10分钟1次，用0.1×SSC/0.1％SDS于55℃清洗15分钟3次。参照制造商的方案(Stratagene，La Jolla，CA)，以λ噬菌粒的形式挽救经放射自显影鉴定双重阳性且经噬斑纯化的心脏文库克隆。
阳性克隆的限制性消化产生不同大小的cDNA插入片段。选择长度超过600bp的插入片段用于作为初始的测序筛选。通过实施例11所述标准方法对这些插入片段进行测序。
还使用对应于SEQ ID NO：11-14、16、和27的引物对一个克隆(7号)进行自动化测序分析。通过这些方法获得的序列通常具有97-100％的同源性。7号克隆(来自心脏文库的部分人LMP-1 cDNA；SEQ ID NO：8)所含序列与翻译区中大鼠LMP cDNA序列的同源性超过87％。
实施例19.全长人LMP-1 cDNA的确定
将MG63人骨肉瘤细胞cDNA序列和人心脏cDNA 7号克隆序列的重叠区用于比对这两种序列并衍生1644bp完整人cDNA序列。将NALIGN(PCGENE软件包中的一个程序)用于比对这两种序列。两种序列的重叠区构成完全同源的大约360bp，除了一处单一核苷酸替代，MG63 cDNA(SEQ ID NO：7)第672位核苷酸是“G”，而7号克隆(SEQ ID NO：8)在相应的第516位核苷酸是“A”。
使用SEQIN(PCGENE的另一种子程序)，用MG63骨肉瘤cDNA细胞的“G”替代，连接比对的两种序列。SEQ ID NO：9显示了获得的序列。使用NALIGN实现新的人衍生序列与大鼠LMP-1 cDNA的比对。全长人LMP-1 cDNA序列(SEQ ID NO：9)与大鼠LMP-1 cDNA序列的翻译部分具有87.3％的同源性。
实施例20.人LMP-1氨基酸序列的确定
用PCGENE子程序TRANSL确定了人LMP-1的推定氨基酸序列。SEQ IDNO：9中的开放读码框编码457个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：10)。使用PCGENG子程序Palign发现人LMP-1氨基酸序列与大鼠LMP-1氨基酸序列具有94.1％的同源性。
实施例21.人LMP cDNA 5’远端非翻译区的测定
通过MG63总RNA的嵌套RT-PCR，使用5’cDNA末端快速扩增(5’RACE)方案，扩增了MG63 5’cDNA。该方法包括使用3’末端含两处简并核苷酸的oligo(dT)锚定引物合成cDNA第一条链(Chenchik等人， 克隆技术 (CLONTECHniques)X：5，1995；Borson等人， PC方法及应用(PC Methods Applic.)2：144，1993)。参照Gubler等人( 基因(Gene)25：263，1983)的方法，使用大肠杆菌DNA聚合酶I、RNA酶H、和大肠杆菌DNA连接酶的混和物合成第二条链。用T4 DNA聚合酶产生平端后，将双链cDNA连接至片段(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′)
(SEQ ID NO：19)。在进行RACE之前，将连接了衔接头的cDNA稀释至适用于Marathon RACE反应的浓度(1∶50)。然后可以特异克隆连接了衔接头的双链cDNA。
使用衔接头特异寡核苷酸AP1
5′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′(AP1)(SEQ.ID NO：20)
作为有义引物和实施例16中所述来自独特区(HLMPU)的基因特异引物(GSP)，进行第一轮PCR。使用嵌套引物对GSP1-HLMPU(反义/反向引物)(SEQ ID NO：23)和GSP2-HLMPUF(SEQ ID NO：24)(参阅实施例16；有义/正向引物)进行第二轮PCR。使用商品化试剂盒高级cDNA PCR核心试剂盒(Clone Tech Laboratories公司，Palo Alto，CA)，采用抗体介导(其它方面是标准的)的热启动方案进行PCR。用于MG63 cDNA的PCR条件包括起始热启动变性(94℃，60sec)，随后是94℃，30sec；60℃，30sec；68℃，4min；30轮循环。第一轮PCR产物的长度为大约750bp，而嵌套PCR产物为大约230bp。将第一轮PCR产物克隆到线性化载体pCR2.1中(3.9kb)。使用M13正向和反向引物(SEQ ID NO：11和12)从两个方向对插入片段进行测序。
实施例22.含5’远端UTR的全长人LMP-1cDNA的确定
比对重叠的MG63人骨肉瘤细胞cDNA 5’UTR序列(SEQ ID NO：21)、MG63 717bp序列(实施例17；SEQ ID NO：8)、和人心脏cDNA 7号克隆序列(实施例18)以衍生新的1704bp人cDNA序列(SEQ ID NO：22)。使用NALIGN(PCGENE和Omiga 1.0二者；Intelligenetics)实现比对。重叠序列构成具有100％同源性的几乎完整717bp区(实施例17)。使用SEQIN实现比对序列的连接。
实施例23.LIM蛋白表达载体的构建
使用实施例17和18所述序列构建pHIS-5ATG LMP-1s表达载体。用ClaI和EcoRV消化717bp克隆(实施例17；SEQ ID NO：7)。凝胶纯化小片段(～250bp)。用ClaI和XbaI消化7号克隆(实施例18；SEQ ID NO：8)，并凝胶纯化1400bp片段。连接分离的～250bp和1400bp限制性片段以形成～1650bp片段。
7号克隆中的单一核苷酸替代(相对于717bp PCR序列和原始大鼠序列)在翻译的第672位碱基对产生终止密码子，由此编码截短(短)型蛋白质，称为LMP-1s。这就是用于表达载体的构建物(SEQ ID NO：32)。通过比对SEQ ID NO：32与5’RACE序列(SEQ ID NO：21)产生含5’UTR的全长cDNA序列(SEQ ID NO：33)。然后推导LMP-1s氨基酸序列(SEQ IDNO：34)是223个氨基酸的蛋白质，并通过Western印渍(如实施例15)确认了预测分子量～23.7kD。
用EcoRV和XbaI消化pHis-ATG载体(InVitrogen，Carlsbad，CA)。回收载体，然后将1650bp限制性片段连接到线性化pHis-ATG中。克隆并扩增连接产物。通过标准方法纯化pHis-ATG-LMP-1s表达载体，也称为含插入片段HLMP-1s的pHIS-A。
实施例24.在体外用LMP表达载体诱导骨节形成和矿化
参照实施例1，分离大鼠颅盖细胞并培养成传代培养物。如实施例1所述，用糖皮质激素(GC)刺激培养物或不进行刺激。参照实施例25，使用修改后的Superfect试剂(Qiagen，Valencia，CA)转染方案，每个孔用3g各种载体转染大鼠颅盖成骨细胞传代培养物。
如实施例3所述，通过Von Kossa染色使矿化骨节显影。人LMP-1s基因产物过度表达在体外本身即可诱导骨节形成(～203骨节/孔)。骨节水平是由GC阳性对照诱导(～412骨节/孔)的大约50％。其它阳性对照包括pHisA-LMP-Rat表达载体(～152骨节/孔)和pCMV2/LMP-Rat-Fwd表达载体(～206骨节/孔)，而阴性对照包括pCMV2/LMP-Rat-Rev。表达载体(～2骨节/孔)和未处理(UT)板(～4骨节/孔)。这些数据证明人cDNA的骨诱导效果至少与大鼠cDNA相同。这种效果低于GC刺激的观察结果，最有可能是因为表达载体没有达到最适剂量。
实施例25.LMP在体外和在体内诱导细胞分化
通过用NotI和ApaI于37℃消化过夜，由克隆10-4(参阅实施例12)切下大鼠LMP cDNA。用相同的限制性酶消化载体pCMV2 MCS(InVitrogen，Carlsbad，CA)。将来自克隆10-4的线性cDNA片段和pCMV2凝胶纯化，提取，并用T4连接酶连接。将连接的DNA凝胶纯化，提取，并转化大肠杆菌JM109细胞进行扩增。挑取阳性琼脂菌落，用NotI和ApaI消化，并通过凝胶电泳检查限制性消化产物。制备阳性克隆的原种培养物。
以类似方式制备反向载体，除了所用限制性酶是XbaI和HindIII。因为使用这些限制性酶，所以将来自克隆10-4的LMP cDNA片段以反向(即不可翻译地)插入pRc/CMV2。产生的重组载体命名为pCMV2/RLMP。
将适当体积的pCMV10-4(最佳终浓度是60nM[3g]；对于这个实验，优选终浓度范围0-600nM/孔[0-30g/孔])重悬于Minimal Eagle Media(MEM)至终体积450l，并旋涡震荡10秒钟。加入Superfect(7.5l/ml终溶液)，将溶液旋涡震荡10秒钟，然后于室温温育10分钟。温育后，加入添加10％FBS的MEM(1ml/孔；6ml/板)，并用移液器混和。
然后迅速将获得的溶液加到(1ml/孔)清洗后的ROB培养物上。将培养物于37℃在含5％CO2的潮湿空气中温育2小时。然后，用无菌PBS轻轻清洗细胞1次，并加入适当的标准温育培养基。
结果在用pCMV10-4诱导的所有大鼠细胞培养物中都出现了显著的骨节形成。例如，pCMV10-4转染细胞产生429骨节/孔。暴露于Trm的阳性对照培养物产生460骨节/孔。相反，不接受处理的阴性对照产生1骨节/孔。相似的，当用pCMV10-4(反向)转染培养物时，没有观察到骨节。
为了证明体内从头骨形成，由4-5周龄正常大鼠(rnu/+；隐性无胸腺状况是杂合的)的后肢吸取骨髓。将吸取的骨髓细胞用αMEM清洗，离心，并通过将沉淀重悬于0.83％NH4Cl/10mM Tris(pH7.4)来裂解RBC。用MEM清洗剩余骨髓细胞3次，每3×106个细胞用9g pCMV-LMP-1s(正向或反向)转染2小时。然后用MEM清洗转染细胞2次，并以浓度3×107细胞/ml重悬。
用无菌移液器将细胞悬浮液(100l)加到无菌2×5mm I型牛胶原盘(Sulzer Orthopaedics，Wheat Ridge，CO)上。通过手术将牛胶原盘移植至4-5周龄无胸腺大鼠(rnu/rnu)的头、胸、腹、或背脊的皮下。于第3-4周处死大鼠，通过手术切下牛胶原盘或外科手术区域，并在70％乙醇中固定。通过放射显影法分析固定标本，并对用Goldner Trichrome染色的5m厚切片进行未脱钙组织学检查。还使用失活(胍提取)脱矿骨基质(Osteotech，Shrewsbury，NJ)取代胶原盘进行实验。
放射显影揭示了高水平的矿化骨形成，与含LMP-1s转染骨髓细胞的原始胶原盘的形式是一致的。在阴性对照(用反向LMP-1s cDNA(不编码翻译蛋白质)转染的细胞)中没有观察到矿化骨形成，而对载体的吸收显得很好。
组织学揭示了在LMP-1s转染植入物中沿成骨细胞的新骨小梁。随着阴性对照中的载体部分再吸收没有看到骨。
进一步实验，即在无胸腺大鼠腰椎和胸椎之间变换位点加入18套(9个阴性对照pCMV-LMP-REV和9个实验性pCMV-LMP-1s)植入物，其放射显影证明9个阴性对照移植中没有一个在椎骨之间显示骨形成(脊骨融合)。所有9个经pCMV-LMP-1s处理的植入物都在椎骨之间显示固相骨融合。
实施例26.由实施例2和3中演示的序列合成pHIS-5’ATG LMP-1s表达载体
用ClaI和EcoRV(New England Biologicals，city，MA)消化717bp克隆(实施例17)。凝胶纯化小片段(～250bp)。用ClaI和XbaI消化7号克隆(实施例18)。凝胶纯化来自该消化反应的1400bp片段。通过标准方法连接分离的～250bp和1400bp cDNA片段以形成～1650bp片段。用EcoRV和XbaI消化pHis-A载体(InVitrogen)。回收线性化载体，并连接嵌合的1650bp cDNA片段。通过标准方法克隆并扩增连接产物，并如先前所述将pHis-A-5’ATG LMP-1s表达载体(也称为含插入片段HLMP-1s的载体pHis-A)保藏于ATCC。
实施例27.在体外用pHis-5’ATG LMP-1s表达载体诱导骨节形成和矿化
参照实施例1，分离大鼠颅盖细胞并培养成传代培养物。参照实施例1，用糖皮质激素(GC)刺激培养物或不进行刺激。参照实施例25，每个孔用3g重组pHis-A载体DNA转染培养物。参照实施例3，通过Von Kossa染色使矿化骨节显影。
人LMP-1s基因产物过度表达在体外可单独(即不用GC刺激)诱导显著的骨节形成(～203骨节/孔)。这是由暴露于GC阳性对照的细胞产生的骨节数量(～412骨节/孔)的大约50％。由转染了pHisA-LMP-Rat表达载体(～152骨节/孔)和pCMV2/LMP-Rat-Fwd(～206骨节/孔)的培养物获得相似结果。相反，阴性对照pCMV2/LMP-Rat-Rev产生～2骨节/孔，而在未处理板中看到～4骨节/孔。这些数据证明，在这种模型系统中，人LMP-1 cDNA的骨诱导效果至少与大鼠LMP-1 cDNA相同。这次实验的效果低于GC刺激的效果，但是是可比的。
实施例28.LMP诱导可溶性骨诱导因子的分泌
如实施例24所述RLMP-1或HLMP-1s在大鼠颅盖成骨细胞培养物中的过度表达导致骨节形成显著多于阴性对照。为了研究LIM矿化蛋白的作用机制，在不同时间点收获条件培养基，浓缩10倍，过滤除菌，用含新鲜血清的培养基稀释至最初浓度，并施加于未转染细胞4天。
在第4天由RLMP-1或HLMP-1s转染细胞收获的条件培养基诱导骨节形成的效果与在转染细胞中直接过度表达RLMP-1大致一样有效。来自反向RLMP-1或HLMP-1s转染细胞的条件培养基对骨节形成没有明显效果。在第4天之前由LMP-1转染培养物收获的条件培养基同样不诱导骨节形成。这些资料说明LMP-1的表达引起可溶性因子的合成和/或分泌，而在转染后4天以内这种可溶性因子在培养基中未达到有效量。
既然rLMP-1的过度表达导致骨诱导因子分泌进入培养基，那么就用Western印渍分析来确定培养基中是否存在LMP-1蛋白。使用对LMP-1(QDPDEE)特异的抗体来评价rLMP-1蛋白的存在，并通过传统方法进行检测。只在培养物的细胞层中发现LMP-1蛋白，而培养基中没有。
通过标准的25％和100％硫酸铵沉淀及随后的DE-52阴离子交换分批层析法(100mM或500mM NaCl)实现骨诱导性可溶性因子的部分纯化。在高硫酸铵、高NaCl部分中观察到所有活性。这种定位与单一因子负责调理培养基的可能性是一致的。
实施例29.由低剂量腺病毒介导的腰椎脊骨融合(lumbar spine Fusion)中的基因疗法
该研究确定了使用腺病毒投递LMP-1 cDNA(SEQ ID NO：2)从而在正常即免疫活性兔中促进脊骨融合的最佳剂量。
使用Adeno-QuestTM试剂盒(Quantum Biotechnologies公司，Montreal)，用由CMV启动子启动的LMP-1 cDNA(SEQ ID NO：2)构建了复制缺陷型人重组腺病毒。使用含β-半乳糖苷酶基因的商品化重组腺病毒(Quantum Biotechnologies公司，Montreal)作为对照。
最初，以感染复数(“MOI”)0.025、0.25、2.5、或25噬斑形成单位(pfu)/细胞进行60分钟病毒转导，进行体外剂量应答实验以确定腺病毒投递的LMP-1(“AdV-LMP-1”)在大鼠颅盖成骨细胞培养物中诱导骨分化的最佳浓度。通过7天暴露于109M糖皮质激素(“GC”)分化阳性对照培养物。剩下阴性对照不处理。在第14天，将培养物von Kossa染色后，对矿化骨节数目计数，并通过放射性免疫测定法测量分泌到培养基中的骨钙蛋白水平(pmol/ml)(平均值±SEM)。
表1显示了实验结果。在未处理的阴性对照培养物中基本上没有形成自发骨节。数据显示等于0.25pfu/细胞的MOI对于骨诱导骨节是最有效的，达到的水平与阳性对照(GC)可比。更低或更高的腺病毒剂量不如它有效。
                                       表1
  结果                               AdV-LMP-1剂量(MOI)
  阴性对照   GC   0.025   0.25   2.5   25
  骨节骨钙蛋白   0.5±0.21.0±0.1   188±3557.8±9   79.8±1328.6±11   145.1±1322.8±1   26.4±1518.3±3   87.6±226.0±2
然后进行体内实验以确定最佳体外剂量能否在骨骼成熟的新西兰白兔中促进横突间脊骨融合。麻醉9只兔子，并使用18号针头经髁间节由股骨末梢吸取3cc骨髓。然后分离血沉棕黄层，用AdV-LMP-1转导10分钟，并将细胞送回手术室用于灌输。进行单一水平后侧腰椎关节固定术，并剥除横突皮质、插入含8-15×106个AdV-LMP-1(MOI＝0.4)或AdV-BGal(MOI＝0.4)转导的自体带核血沉棕黄层细胞的载体(兔失活骨基质或胶原海绵)。5周后对兔施行安乐死，并通过人工触摸、平面X射线、CT扫描、和未脱钙组织学评价脊骨融合。
在所有9只兔子中接受AdV-LMP-1的脊骨融合位点都诱导固相、连续的脊骨融合块。相反，接受AdV-BGal或较低剂量AdV-LMP-1(MOI＝0.04)的位点产生少许骨或没有，并导致脊骨融合速率与仅用载体可比(＜40％)。这些结果与通过人工触摸、CT扫描、和组织学进行的评价是一致的。但是，平面射线显影有时过高评价存在的骨量，尤其是在对照位点。使用两种测试的载体材料的LMP-1 cDNA投递和骨诱导都是成功的。没有证据表明存在针对腺病毒载体的全身或局部免疫应答。
这些资料证明在先前验证很有前途的兔脊骨融合模型有一致骨诱导。而且，与需要过夜转导或在培养物中扩增细胞数周的其它方法相比，使用自体骨髓细胞和手术间离体基因转导(10分钟)的方案在临床上更加可行。另外，重组腺病毒最有效剂量(MOI＝0.25)大大低于在其它基因疗法应用中报导的剂量(MOI＝40-500)。我们认为这要归功于LMP-1是细胞内信号分子且具有有力的信号放大级联的事实。此外，在细胞培养物中诱导骨的相同浓度AdV-LMP-1在体内也有效的观察结果还令人惊讶的显示，而其它生长因子在由细胞培养物转变成动物实验时通常需要增加剂量。一并考虑，这些观察结果指出，使用腺病毒投递LMP-1 cDNA的局部基因疗法是可能的，而需要的低剂量有可能使针对腺病毒载体的免疫应答的消极影响最小化。
实施例30.外周静脉血具核细胞(血沉棕黄层)用于生成骨的LMP-1 cDNA基因疗法的应用
如上所述(实施例29)在4只兔子中进行了脊骨融合手术，除了转导细胞是来自静脉血而非骨髓的血沉棕黄层。用Adeno-LMP或pHIS-LMP质粒转染这些细胞，获得了与使用骨髓细胞同样成功的结果。将普通静脉血细胞用于基因投递的这一发现使基因疗法在临床上更加可行，因为它避免了痛苦的常规麻醉骨髓采集并由相同体积起始材料产生多2倍的细胞。
实施例31.人LMP-1剪接变体的分离
内含子/外显子mRNA转录本剪接变体是信号转导和细胞/组织发育中较常见的调控机制。多种基因的剪接变体显示可改变蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、和蛋白质-底物相互作用。剪接变体还可以控制基因表达的组织特异性，从而在不同的组织中表达不同的形式(因此发挥不同功能)。剪接变体是细胞中的常见调控现象。LMP剪接变体有可能在其它组织中产生效果，诸如神经再生、肌肉再生、或其它组织发育。
为了对人心脏cDNA文库筛选HLMP-1序列的剪接变体，制备了对应于部分SEQ ID NO：22的PCR引物对。使用标准技术合成的正向PCR引物对应于SEQ ID NO：22的第35-54位核苷酸，序列如下：
5’GAGCCGGCATCATGGATTCC 3’(SEQ ID NO：35)
反向PCR引物与SEQ ID NO：22的第820-839位核苷酸反向互补，序列如下：
5’GCTGCCTGCACAATGGAGGT 3’(SEQ ID NO：36)
通过标准技术，将正向和反向PCR引物用于对人心脏cDNA(ClonTech，目录编号7404-1)筛选序列与HLMP-1相似的序列，循环方案如下：94℃，30”；64℃，30”；72℃，60”；30轮循环，随后于72℃温育10分钟。将扩增的cDNA序列凝胶纯化，并提交给Emory DNA Sequence Core Facility进行测序。使用标准技术对克隆测序，并用PCGENE(Intelligenetics；程序SEQUIN和NALIGN)检查序列，以测定与SEQ ID NO：22的同源性。然后用Intelligenetics的程序TRANSL将相对于SEQ ID NO：22具有推定的其它剪接位点的两种同源核苷酸序列翻译成相应的蛋白质产物。
这两种新的人cDNA序列之一(SEQ ID NO：37)包含1456bp：
        10         20         30         40         50         60
CGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG
        70         80         90        100        110        120
GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT
       130        140        150        160        170        180
GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC
       190        200        210        220        230        240
GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA
       250        260        270        280        290        300
GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG
       310        320     *  330        340  *     350        360
CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAG GTGCAG ACCCCTGACA AACAGCCGCT CCGACCGCTG
       370        380        390        400        410        420
GTCCCAGATG CCAGCAAGCA GCGGCTGATG GAGAACACAG AGGACTGGCG GCCGCGGCCG
       430        440        450        460        470        480
GGGACAGGCC AGTCGCGTTC CTTCCGCATC CTTGCCCACC TCACAGGCAC CGAGTTCATG
       490        500        510        520        530        540
CAAGACCCGG ATGAGGAGCA CCTGAAGAAA TCAAGCCAGG TGCCCAGGAC AGAAGCCCCA
       550        560        570        580        590        600
GCCCCAGCCT CATCTACACC CCAGGAGCCC TGGCCTGGCC CTACCGCCCC CAGCCCTACC
       610        620        630        640        650        660
AGCCGCCCGC CCTGGGCTGT GGACCCTGCG TTTGCCGAGC GCTATGCCCC GGACAAAACG
       670        680        690        700        710        720
AGCACAGTGC TGACCCGGCA CAGCCAGCCG GCCACGCCCA CGCCGCTGCA GAGCCGCACC
       730        740        750        760        770        780
TCCATTGTGC AGGCAGCTGC CGGAGGGGTG CCAGGAGGGG GCAGCAACAA CGGCAAGACT
       790        800        810        820        830        840
CCCGTGTGTC ACCAGTGCCA CAAGGTCATC CGGGGCCGCT ACCTGGTGGC GTTGGGCCAC
       850        860        870        880        890        900
GCGTACCACC CGGAGGAGTT TGTGTGTAGC CAGTGTGGGA AGGTCCTGGA AGAGGGTGGC
       910        920        930        940        950        960
TTCTTTGAGG AGAAGGGCGC CATCTTCTGC CCACCATGCT ATGACGTGCG CTATGCACCC
       970        980        990       1000       1010       1020
AGCTGTGCCA AGTGCAAGAA GAAGATTACA GGCGAGATCA TGCACGCCCT GAAGATGACC
      1030       1040       1050       1060       1070       1080
TGGCACGTGC ACTGCTTTAC CTGTGCTGCC TGCAAGACGC CCATCCGGAA CAGGGCCTTC
      1090       1100       1110       1120       1130       1140
TACATGGAGG AGGGCGTGCC CTATTGCGAG CGAGACTATG AGAAGATGTT TGGCACGAAA
      1150       1160       1170       1180       1190       1200
TGCCATGGCT GTGACTTCAA GATCGACGCT GGGGACCGCT TCCTGGAGGC CCTGGGCTTC
      1210       1220       1230       1240       1250       1260
AGCTGGCATG ACACCTGCTT CGTCTGTGCG ATATGTCAGA TCAACCTGGA AGGAAAGACC
      1270       1280       1290       1300       1310       1320
TTCTACTCCA AGAAGGACAG GCCTCTCTGC AAGAGCCATG CCTTCTCTCA TGTGTGAGCC
      1330       1340       1350       1360       1370       1380
CCTTCTGCCC ACAGCTGCCG CGGTGGCCCC TAGCCTGAGG GGCCTGGAGT CGTGGCCCTG
      1390       1400       1410       1420       1430       1440
CATTTCTGGG TAGGGCTGGC AATGGTTGCC TTAACCCTGG CTCCTGGCCC GAGCCTGGGC
      1450
TCCCGGGCCC TGCCCA
由删除119bp片段(*之间)和插入17bp片段(下划线)引起的读码框移动导致截短的基因产物，其氨基酸序列(SEQ ID NO：38)如下：
        10         20         30         40         50         60
MDSFKVVLEG PAPWGFRLQG GKDFNVPLSI SRLTPGGKAA QAGVAVGDWV LSIDGENAGS
        70         80         90        100        110        120
LTHIEAQNKI RACGERLSLG LSRAQPVQNK PQK VQTPDKQ PLRPLVPDAS KQRLMENTED
       130        140        150        160        170        180
WRPRPGTGQS RSFRILAHLT GTEFMQDPDE EHLKKSSQVP RTEAPAPASS TPQEPWPGPT
       190        200        210        220        230        240
APSPTSRPPW AVDPAFAERY APDKTSTVLT RHSQPATPTP LQSRTSIVQA AAGGVPGGGS
       250        260        270        280        290        300
NNGKTPVCHQ CHQVIRARYL VALGHAYHPE EFVCSQCGKV LEEGGFFEEK GAIFCPPCYD
       310        320        330        340        350        360
VRYAPSCAKC KKKITGEIMH ALKMTWHVLC FTCAACKTPI RNRAFYMEEG VPYCERDYEK
       370        380        390        400        410        420
MFGTKCQWCD FKIDAGDRFL EALGFSWHDT CFVCAICQIN LEGKTFYSKK DRPLCKSHAF
SHV
这种423个氨基酸蛋白质显示与SEQ ID NO：10所示蛋白质100％同源，加粗区域序列(第94-99位)除外，它是由于上述核苷酸变化所致。
第二种新的人心脏cDNA序列(SEQ ID NO：39)包含1575bp：
        10         20         30         40         50         60
CGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG
        70         80         90        100        110        120
GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGG3C TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT
       130        140        150        160        170        180
GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC
       190        200        210        220        230        240
GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA
       250        260        270        280        290        300
GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG
       310        320        330        340        350        360
CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAGGCCTCC GCCCCCGCCG CGGACCCTCC GCGGTACACC
       370        380        390        400        410        420
TTTGCACCCA GCGTCTCCCT CAACAAGACG GCCCGGCCCT TTGGGGCGCC CCCGCCCGCT
       430        440        450        460        470        480
GACAGCGCCC CGCAACAGAA TGG GTGCAGA CCCCTGACAAACAGCCGCTC CGACCGCTGG
       490        500        510        520        530        540
TCCCAGATGC CAGCAAGCAG CGGCTGATGG AGAACACAGA GGACTGGCGG CCGCGGCCGG
       550        560        570        580        590        600
GGACAGGCCA GTCGCGTTCC TTCCGCATCC TTGCCCACCT CACAGGCACC GAGTTCATGC
       610        620        630        640        650        660
AAGACCCGGA TGAGGAGCAC CTGAAGAAAT CAAGCCAGGT GCCCAGGACA GAAGCCCCAG
       670        680        690        700        710        720
CCCCAGCCTC ATCTACACCC CAGGAGCCCT GGCCTGGCCC TACCGCCCCC AGCCCTACCA
       730        740        750        760        770        780
GCCGCCCGCC CTGGGCTGTG GACCCTGCGT TTGCCGAGCG CTATGCCCCG GACAAAACGA
       790        800        810        820        830        840
GCACAGTGCT GACCCGGCAC AGCCAGCCGG CCACGCCCAC GCCGCTGCAG AGCCGCACCT
       850        860        870        880        890        900
CCATTGTGCA GGCAGCTGCC GGAGGGGTGC CAGGAGGGGG CAGCAACAAC GGCAAGACTC
       910        920        930        940        950        960
CCGTGTGTCA CCAGTGCCAC AAGGTCATCC GGGGCCGCTA CCTGGTGGCG TTGGGCCACG
       970        980        990       1000       1010       1020
CGTACCACCC GGAGGAGTTT GTGTGTAGCC AGTGTGGGAA GGTCCTGGAA GAGGGTGGCT
      1030       1040       1050       1060       1070       1080
TCTTTGAGGA GAAGGGCGCC ATCTTCTGCC CACCATGCTA TGACGTGCGC TATGCACCCA
      1090       1100       1110       1120       1130       1140
GCTGTGCCAA GTGCAAGAAG AAGATTACAG GCGAGATCAT GCACGCCCTG AAGATGACCT
      1150       1160       1170       1180       1190       1200
GGCACGTGCA CTGCTTTACC TGTGCTGCCT GCAAGACGCC CATCCGGAAC AGGGCCTTCT
      1210       1220       1230       1240       1250       1260
ACATGGAGGA GGGCGTGCCC TATTGCGAGC GAGACTATGA GAAGATGTTT GGCACGAAAT
      1270       1280       1290       1300       1310       1320
GCCATGGCTG TGACTTCAAG ATCGACGCTG GGGACCGCTT CCTGGAGGCC CTGGGCTTCA
      1330       1340       1350       1360       1370       1380
GCTGGCATGA CACCTGCTTC GTCTGTGCGA TATGTCAGAT CAACCTGGAA GGAAAGACCT
      1390       1400       1410       1420       1430       1440
TCTACTCCAA GAAGGACAGG CCTCTCTGCA AGAGCCATGC CTTCTCTCAT GTGTGAGCCC
      1450       1460       1470       1480       1490       1500
CTTCTGCCCA CAGCTGCCGC GGTGGCCCCT AGCCTGAGGG GCCTGGAGTC GTGGCCCTGC
      1510       1520       1530       1540       1550       1560
ATTTCTGGGT AGGGCTGGCA ATGGTTGCCT TAACCCTGGC TCCTGGCCCG AGCCTGGGCT
      1570
CCCGGGCCCT GCCCA
由插入17bp片段(粗体、斜体、和下划线)引起的读码框移动导致在第565-567位(下划线)提前出现翻译终止密码子，所衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)包含153个氨基酸的，如下所示：
        10         20         30         40         50         60
MDSFKVVLEG PAPWGFRLQG GKDFNVPLSI SRLTPGGKAA QAGVAVGDWV LSIDGENAGS
        70         80         90        100        110        120
LTHIEAQNKI RACGERLSLG LSRAQPVQSK PQK ASAPAAD PPRYTFAPSV SLNKTARPFG
       130        140        150
APPPADSAPQ QNGCRPLTNS RSDRWSQMPA SSG
这种蛋白质直至第94位氨基酸显示与SEQ ID NO：10有100％同源性，此处插入核苷酸序列中所述17bp片段，导致读码框移动。蛋白质的第94-153位氨基酸与SEQ ID NO：10不同源。由于核苷酸序列中所述提前出现的.终止密码子，因此不存在SEQ ID NO：10的第154-457位氨基酸。
实施例32.基因组HLMP-1核苷酸序列
申请人已经鉴定了编码HLMP-1的基因组DNA序列，包括与HLMP-1表达有关的推定调控元件。SEQ ID NO：41显示了完整基因组序列。该序列衍生自AC023788(克隆RP11-564G9)，基因组测序中心，华盛顿大学医学院，圣路易斯，MO。
HLMP-1的推定启动子区跨越SEQ ID NO：41的第2660-8733位核苷酸。该区域包含至少10个潜在糖皮质激素应答元件(“GRE”)(第6148-6153位、第6226-6231位、第6247-6252位、第6336-6341位、第6510-6515位、第6552-6557位、第6727-6732位、第6752-6757位、第7738-7743位、和第8255-8260位核苷酸)、12个针对Drosophilla decapentaplegic的Mother的Sma-2同源物(“SMAD”)潜在结合元件位点(第3569-3575位、第4552-4558位、第4582-4588位、第5226-5232位、第6228-6234位、第6649-6655位、第6725-6731位、第6930-6936位、第7379-7384位、第7738-7742位、第8073-8079位、和第8378-8384位核苷酸)、和3个TATA盒(第5910-5913位、第6932-6935位、和第7380-7383位核苷酸)。3个TATA盒、所有GRE、和8个SMAD结合元件(“SBE”)群聚于跨越SEQ ID NO：41的第5841-8733位核苷酸的区域。这些调控元件可用于例如调控编码涉及骨形成过程的蛋白质的外源核苷酸序列的表达。这将能够全身性施用涉及骨形成和修复的治疗因子或基因，以及与组织分化和发育有关的因子或基因。
除了推定调控元件以外，还鉴定了对应于编码HLMP-1的核苷酸序列的13个外显子。这些外显子跨越SEQ ID NO：41的下列核苷酸：
外显子1   第8733-8767位
外显子2    第9790-9895位
外显子3    第13635-13787位
外显子4    第13877-13907位
外显子5    第14387-14502位
外显子6    第15161-15297位
外显子7    第15401-15437位
外显子8    第16483-16545位
外显子9    第16689-16923位
外显子10   第18068-18248位
外显子11   第22117-22240位
外显子12   第22323-22440位
外显子13   第22575-22911位
在HLMP-2中，存在另一个外显子(外显子5A)，跨越第14887-14904位。
本文引用的所有发表物和专利完整收入作为参考。
上文详述以及作为例示提供的实施例传授了本发明的原理，本领域技术人员通过阅读本公开书应当领会，可以在形式和细节上进行多种变化而不偏离本发明的真实范围。
Figure A20061008422800411
                                     有关保藏微生物的信息(PCT Rule 13bis)
                                            有关保藏微生物的信息(PCT Rule 13bis)
Figure A20061008422800422
                              序列表
<110>Boden M.D.，Scott D
     Hair Ph.D.，Gregory A
<120>LIM矿化蛋白剪接变体
<130>剪接变体LMP
<140>6148.0222-00304
<141>2000-04-28
<150>60/132,021
<151>1999-04-30
<160>42
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>457
<212>PRT
<213>褐家鼠
<400>1
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Leu Thr
                 85                  90                  95
Pro Pro Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Ala Ser Leu
            100                 105                 110
Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Thr Asp Ser Ala
        115                 120                 125
Leu Ser Gln Asn Gly Gln Leu Leu Arg Gln Leu Val Pro Asp Ala Ser
    130                 135                 140
Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr
                165                 170                 175
Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu Phe Met Lys Lys Ser Ser Gln
            180                 185                 190
Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Thr Ile Pro Gln Glu
        195                 200                 205
Ser Trp Pro Gly Pro Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp
    210                 215                 220
Ala Val Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser
225                 230                 235                 240
Thr Val Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln
                245                 250                 255
Asn Arg Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly
            260                 265                 270
Gly Ser Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Lys Ile
        275                 280                 285
Ile Arg Gly Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu
    290                 295                 300
Glu Phe Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe
305                 310                 315                 320
Phe Glu Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Ser Cys Tyr Asp Val Arg
                325                 330                 335
Tyr Ala Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile
            340                 345                 350
Met His Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Pro Cys Phe Thr Cys Ala
        355                 360                 365
Ala Cys Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly
    370                 375                 380
Ala Pro Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys
385                 390                 395                 400
Arg Gly Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala
                405                 410                 415
Leu Gly Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln
            420                 425                 430
Ile Asn Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Lys Pro Leu
        435                 440                 445
Cys Lys Ser His Ala Phe Ser His Val
    450                 455
<210>2
<211>1696
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>2
gcacgaggat cccagcgcgg ctcctggagg ccgccaggca gccgcccagc cgggcattca  60
ggagcaggta ccatggattc cttcaaggta gtgctggagg gacctgcccc ttggggcttc  120
cgtctgcaag ggggcaagga cttcaacgtg cccctctcca tctctcggct cactcctgga  180
ggcaaggccg cacaggccgg tgtggccgtg ggagactggg tactgagtat cgacggtgag  240
aacgccggaa gcctcacaca cattgaagcc cagaacaaga tccgtgcctg tggggagcgc  300
ctcagcctgg gtcttagcag agcccagcct gctcagagca aaccacagaa ggccctgacc  360
cctcccgccg accccccgag gtacactttt gcaccaagcg cctccctcaa caagacggcc  420
cggcccttcg gggcaccccc acctactgac agcgccctgt cgcagaatgg acagctgctc  480
agacagctgg tccctgatgc cagcaagcag cggctgatgg agaatactga agactggcgc  540
ccgcggccag ggacaggcca gtcccgttcc ttccgcatcc ttgctcacct cacgggcaca  600
gagttcatgc aagacccgga tgaggaattc atgaagaagt caagccaggt gcccaggaca  660
gaagccccag ccccagcctc aaccataccc caggaatcct ggcctggccc caccaccccc  720
agccccacca gccgcccacc ctgggccgta gatcctgcat ttgctgagcg ctatgcccca  780
gacaaaacca gcacagtgct gacccgacac agccagccag ccacacctac gcctctgcag  840
aaccgcacct ccatagttca ggctgcagct ggagggggca caggaggagg cagcaacaat  900
ggcaagacgc ctgtatgcca ccagtgccac aagatcatcc gcggccgata cctggtagca  960
ctgggccacg cgtaccatcc tgaggaattt gtgtgcagcc agtgtgggaa ggtcctggaa  1020
gagggtggct tcttcgagga gaagggagct atcttttgcc cctcctgcta tgatgtgcgc  1080
tatgcaccca gctgtgccaa atgcaagaag aagatcactg gagagatcat gcatgcgctg  1140
aagatgacct ggcatgttcc ctgcttcacc tgtgcagcct gcaaaacccc tatccgcaac  1200
agggctttct acatggagga gggggctccc tactgcgagc gagattacga gaagatgttt  1260
ggcacaaagt gtcgcggctg tgacttcaag atcgatgccg gggaccgttt cctggaagcc  1320
ctgggtttca gctggcatga tacgtgtttt gtttgcgcaa tatgtcaaat caacttggaa  1380
ggaaagacct tctactccaa gaaggacaag cccctgtgca agagccatgc cttttcccac  1440
gtatgagcac ctcctcacac tactgccacc ctactctgcc agaagggtga taaaatgaga  1500
gagctctctc tccctcgacc tttctgggtg gggctggcag ccattgtcct agccttggct  1560
cctggccaga tcctggggct ccctcctcac agtccccttt cccacacttc ctccaccacc  1620
accaccgtca ctcacaggtg ctagcctcct agccccagtt cactctggtg tcacaataaa  1680
cctgtatgta gctgtg                                                  1696
<210>3
<211>260
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>3
ttctacatgg aggagggggc tccctactgc gagcgagatt acgagaagat gtttggcaca  60
aagtgtcgcg gctgtgactt caagatcgat gccggggacc gtttcctgga agccctgggt  120
ttcagctggc atgatacgtg ttttgtttgc gcaatatgtc aaatcaactt ggaaggaaag  180
accttctact ccaagaagga caagcccctg tgcaagagcc atgccttttc ccacgtatga  240
gcacctcctc acactactgc                                              260
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>MMLV
<400>4
aagctttttt tttttg                                                  16
<210>5
<211>13
<212>DNA
<213>MMLV
<400>5
aagcttggct atg                                                     13
<210>6
<211>223
<212>DNA
<213>人类
<400>6
atccttgctc acctcacggg caccgagttc atgcaagacc cggatgagga gcacctgaag  60
aaatcaagcc aggtgcccag gacagaagcc ccagccccag cctcatctac accccaggag  120
ccctggcctg gccctaccgc ccccagccct accagccgcc cgccctgggc tgtggaccct  180
gcgtttgccg agcgctatgc cccagacaaa accagcacag tgc                    223
<210>7
<211>717
<212>DNA
<213>人类
<400>7
atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg  60
ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg  120
caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc  180
ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc  240
ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac  300
cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg  360
gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc  420
ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg  480
acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa  540
gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc  600
ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc  660
cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgccccgga caaaacg     717
<210>8
<211>1488
<212>DNA
<213>人类
<400>8
atcgatggcg agaatgcggg tagcctcaca cacatcgaag ctcagaacaa gatccgggcc  60
tgcggggagc gcctcagcct gggcctcagc agggcccagc cggttcagag caaaccgcag  120
aaggcctccg cccccgccgc ggaccctccg cggtacacct ttgcacccag cgtctccctc  180
aacaagacgg cccggccctt tggggcgccc ccgcccgctg acagcgcccc gcaacagaat  240
ggacagccgc tccgaccgct ggtcccagat gccagcaagc agcggctgat ggagaacaca  300
gaggactggc ggccgcggcc ggggacaggc cagtcgcgtt ccttccgcat ccttgcccac  360
ctcacaggca ccgagttcat gcaagacccg gatgaggagc acctgaagaa atcaagccag  420
gtgcccagga cagaagcccc agccccagcc tcatctacac cccaggagcc ctggcctggc  480
cctaccgccc ccagccctac cagccgcccg ccctgagctg tggaccctgc gtttgccgag  540
cgctatgccc cggacaaaac gagcacagtg ctgacccggc acagccagcc ggccacgccc  600
acgccgctgc agagccgcac ctccattgtg caggcagctg ccggaggggt gccaggaggg  660
ggcagcaaca acggcaagac tcccgtgtgt caccagtgcc acaaggtcat ccggggccgc  720
tacctggtgg cgttgggcca cgcgtaccac ccggaggagt ttgtgtgtag ccagtgtggg  780
aaggtcctgg aagagggtgg cttctttgag gagaagggcg ccatcttctg cccaccatgc  840
tatgacgtgc gctatgcacc cagctgtgcc aagtgcaaga agaagattac aggcgagatc  900
atgcacgccc tgaagatgac ctggcacgtg cactgcttta cctgtgctgc ctgcaagacg  960
cccatccgga acagggcctt ctacatggag gagggcgtgc cctattgcga gcgagactat  1020
gagaagatgt ttggcacgaa atgccatggc tgtgacttca agatcgacgc tggggaccgc  1080
ttcctggagg ccctgggctt cagctggcat gacacctgct tcgtctgtgc gatatgtcag  1140
atcaacctgg aaggaaagac cttctactcc aagaaggaca ggcctctctg caagagccat  1200
gccttctctc atgtgtgagc cccttctgcc cacagctgcc gcggtggccc ctagcctgag  1260
gggcctggag tcgtggccct gcatttctgg gtagggctgg caatggttgc cttaaccctg  1320
gctcctggcc cgagcctggg ctcccgggcc cctgcccacc caccttatcc tcccacccca  1380
ctccctccac caccacagca caccggtgct ggccacacca gccccctttc acctccagtg  1440
ccacaataaa cctgtaccca gctgaattcc aaaaaatcca aaaaaaaa               1488
<210>9
<211>1644
<212>DNA
<213>人类
<400>9
atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg  60
ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg  120
caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc  180
ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc  240
ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac  300
cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg  360
gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc  420
ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg  480
acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa  540
gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc  600
ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc  660
cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgccccgga caaaacgagc  720
acagtgctga cccggcacag ccagccggcc acgcccacgc cgctgcagag ccgcacctcc  780
attgtgcagg cagctgccgg aggggtgcca ggagggggca gcaacaacgg caagactccc  840
gtgtgtcacc agtgccacaa ggtcatccgg ggccgctacc tggtggcgtt gggccacgcg  900
taccacccgg aggagtttgt gtgtagccag tgtgggaagg tcctggaaga gggtggcttc  960
tttgaggaga agggcgccat cttctgccca ccatgctatg acgtgcgcta tgcacccagc  1020
tgtgccaagt gcaagaagaa gattacaggc gagatcatgc acgccctgaa gatgacctgg  1080
cacgtgcact gctttacctg tgctgcctgc aagacgccca tccggaacag ggccttctac  1140
atggaggagg gcgtgcccta ttgcgagcga gactatgaga agatgtttgg cacgaaatgc  1200
catggctgtg acttcaagat cgacgctggg gaccgcttcc tggaggccct gggcttcagc  1260
tggcatgaca cctgcttcgt ctgtgcgata tgtcagatca acctggaagg aaagaccttc  1320
tactccaaga aggacaggcc tctctgcaag agccatgcct tctctcatgt gtgagcccct  1380
tctgcccaca gctgccgcgg tggcccctag cctgaggggc ctggagtcgt ggccctgcat  1440
ttctgggtag ggctggcaat ggttgcctta accctggctc ctggcccgag cctgggctcc  1500
cgggcccctg cccacccacc ttatcctccc accccactcc ctccaccacc acagcacacc  1560
ggtgctggcc acaccagccc cctttcacct ccagtgccac aataaacctg tacccagctg  1620
aattccaaaa aatccaaaaa aaaa                                         1644
<210>10
<211>457
<212>PRT
<213>人类
<400>10
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala
                 85                  90                  95
Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu
            100                 105                 110
Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala
        115                 120                 125
Pro Gln Gln Asn Gly Gln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser
    130                 135                 140
Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr
                165                 170                 175
Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln
            180                 185                 190
Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu
        195                 200                 205
Pro Trp Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp
    210                 215                 220
Ala Val Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser
225                 230                 235                 240
Thr Val Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly
            260                 265                 270
Gly Ser Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Lys Val
        275                 280                 285
Ile Arg Gly Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu
    290                 295                 300
Glu Phe Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe
305                 310                 315                 320
Phe Glu Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg
                325                 330                 335
Tyr Ala Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile
            340                 345                 350
Met His Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val His Cys Phe Thr Cys Ala
        355                 360                 365
Ala Cys Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly
    370                 375                 380
Val Pro Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys
385                 390                 395                 400
His Gly Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala
                405                 410                 415
Leu Gly Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln
            420                 425                 430
Ile Asn Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu
        435                 440                 445
Cys Lys Ser His Ala Phe Ser His Val
    450                 455
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>11
gccagggttt tcccagtcac ga                                           22
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>12
gccagggttt tcccagtcac ga                                           22
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人类
<400>13
tcttagcaga gcccagcctg ct                                           22
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人类
<400>14
gcatgaactc tgtgcccgtg ag                                           22
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>15
atccttgctc acctcacggg                                              20
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>16
gcactgtgct ggttttgtct gg                                           22
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人类
<400>17
catggattcc ttcaaggtag tgc                                          23
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>18
gttttgtctg gggcagagcg                                              20
<210>19
<211>44
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于马拉松RACE反应的衔接头
<400>19
ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt                   44
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：对马拉松RACE衔接头特异的PCR引物
<400>20
ccatcctaat acgactcact atagggc                                      27
<210>21
<211>765
<212>DNA
<213>人类
<400>21
ccgttgtttg taaaacgacg cagagcagcg ccctggccgg gccaagcagg agccggcatc  60
atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg  120
ggcaaggact tcaatgtgcc ctcctccatt tcccggctca cctctggggg caaggccgtg  180
caggccggag tggccgtaag tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc  240
ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc  300
ctcaacaggg cccagccggt tcagaacaaa ccgcaaaagg cctccgcccc cgccgcggac  360
cctccgcggt acacctttgc accaagcgtc tccctcaaca agacggcccg gcccttgggg  420
gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcag cagaatggac agccgctccg accgctggtc  480
ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg  540
acaggccagt gccgttcctt tcgcatcctt gctcacctta caggcaccga gttcatgcaa  600
gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc  660
ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc  720
cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgcc                  765
<210>22
<211>1689
<212>DNA
<213>人类
<400>22
cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag  60
gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat  120
gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc  180
gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa  240
gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag  300
ccggttcaga gcaaaccgca gaaggcctcc gcccccgccg cggaccctcc gcggtacacc  360
tttgcaccca gcgtctccct caacaagacg gcccggccct ttggggcgcc cccgcccgct  420
gacagcgccc cgcaacagaa tggacagccg ctccgaccgc tggtcccaga tgccagcaag  480
cagcggctga tggagaacac agaggactgg cggccgcggc cggggacagg ccagtcgcgt  540
tccttccgca tccttgccca cctcacaggc accgagttca tgcaagaccc ggatgaggag  600
cacctgaaga aatcaagcca ggtgcccagg acagaagccc cagccccagc ctcatctaca  660
ccccaggagc cctggcctgg ccctaccgcc cccagcccta ccagccgccc gccctgggct  720
gtggaccctg cgtttgccga gcgctatgcc ccggacaaaa cgagcacagt gctgacccgg  780
cacagccagc cggccacgcc cacgccgctg cagagccgca cctccattgt gcaggcagct  840
gccggagggg tgccaggagg gggcagcaac aacggcaaga ctcccgtgtg tcaccagtgc  900
cacaaggtca tccggggccg ctacctggtg gcgttgggcc acgcgtacca cccggaggag  960
tttgtgtgta gccagtgtgg gaaggtcctg gaagagggtg gcttctttga ggagaagggc  1020
gccatcttct gcccaccatg ctatgacgtg cgctatgcac ccagctgtgc caagtgcaag  1080
aagaagatta caggcgagat catgcacgcc ctgaagatga cctggcacgt gcactgcttt  1140
acctgtgctg cctgcaagac gcccatccgg aacagggcct tctacatgga ggagggcgtg  1200
ccctattgcg agcgagacta tgagaagatg tttggcacga aatgccatgg ctgtgacttc  1260
aagatcgacg ctggggaccg cttcctggag gccctgggct tcagctggca tgacacctgc  1320
ttcgtctgtg cgatatgtca gatcaacctg gaaggaaaga ccttctactc caagaaggac  1380
aggcctctct gcaagagcca tgccttctct catgtgtgag ccccttctgc ccacagctgc  1440
cgcggtggcc cctagcctga ggggcctgga gtcgtggccc tgcatttctg ggtagggctg  1500
gcaatggttg ccttaaccct ggctcctggc ccgagcctgg gctcccgggc ccctgcccac  1560
ccaccttatc ctcccacccc actccctcca ccaccacagc acaccggtgc tggccacacc  1620
agcccccttt cacctccagt gccacaataa acctgtaccc agctgaattc caaaaaatcc  1680
aaaaaaaaa                                                          1689
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>人类
<400>23
gcactgtgct cgttttgtcc gg                                           22
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>24
tccttgctca cctcacgggc a                                            21
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>人类
<400>25
tcctcatccg ggtcttgcat gaactcggtg                                   30
<210>26
<211>28
<212>DNA
<213>人类
<400>26
gcccccgccc gctgacagcg ccccgcaa                                     28
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人类
<400>27
tccttgctca cctcacgggc accg                                         24
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人类
<400>28
gtaatacgac tcactatagg gc                                           22
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>29
gcggctgatg gagaatactg aag                                          23
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>30
atcttgtggc actggtggca tac                                          23
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>31
tgtgtcgggt cagcactgtg ct                                           22
<210>32
<211>1620
<212>DNA
<213>人类
<400>32
atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg  60
ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg  120
caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc  180
ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc  240
ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac  300
cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg  360
gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc  420
ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg  480
acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa  540
gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc  600
ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc  660
cgcccgccct gagctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgccccgga caaaacgagc  720
acagtgctga cccggcacag ccagccggcc acgcccacgc cgctgcagag ccgcacctcc  780
attgtgcagg cagctgccgg aggggtgcca ggagggggca gcaacaacgg caagactccc  840
gtgtgtcacc agtgccacaa ggtcatccgg ggccgctacc tggtggcgtt gggccacgcg  900
taccacccgg aggagtttgt gtgtagccag tgtgggaagg tcctggaaga gggtggcttc  960
tttgaggaga agggcgccat cttctgccca ccatgctatg acgtgcgcta tgcacccagc  1020
tgtgccaagt gcaagaagaa gattacaggc gagatcatgc acgccctgaa gatgacctgg  1080
cacgtgcact gctttacctg tgctgcctgc aagacgccca tccggaacag ggccttctac  1140
atggaggagg gcgtgcccta ttgcgagcga gactatgaga agatgtttgg cacgaaatgc  1200
catggctgtg acttcaagat cgacgctggg gaccgcttcc tggaggccct gggcttcagc  1260
tggcatgaca cctgcttcgt ctgtgcgata tgtcagatca acctggaagg aaagaccttc  1320
tactccaaga aggacaggcc tctctgcaag agccatgcct tctctcatgt gtgagcccct  1380
tctgcccaca gctgccgcgg tggcccctag cctgaggggc ctggagtcgt ggccctgcat  1440
ttctgggtag ggctggcaat ggttgcctta accctggctc ctggcccgag cctgggctcc  1500
cgggcccctg cccacccacc ttatcctccc accccactcc ctccaccacc acagcacacc  1560
ggtgctggcc acaccagccc cctttcacct ccagtgccac aataaacctg tacccagctg  1620
<210>33
<211>1665
<212>DNA
<213>人类
<400>33
cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag  60
gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat  120
gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc  180
gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa  240
gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag  300
ccggttcaga gcaaaccgca gaaggcctcc gcccccgccg cggaccctcc gcggtacacc  360
tttgcaccca gcgtctccct caacaagacg gcccggccct ttggggcgcc cccgcccgct  420
gacagcgccc cgcaacagaa tggacagccg ctccgaccgc tggtcccaga tgccagcaag  480
cagcggctga tggagaacac agaggactgg cggccgcggc cggggacagg ccagtcgcgt  540
tccttccgca tccttgccca cctcacaggc accgagttca tgcaagaccc ggatgaggag  600
cacctgaaga aatcaagcca ggtgcccagg acagaagccc cagccccagc ctcatctaca  660
ccccaggagc cctggcctgg ccctaccgcc cccagcccta ccagccgccc gccctgagct  720
gtggaccctg cgtttgccga gcgctatgcc ccggacaaaa cgagcacagt gctgacccgg  780
cacagccagc cggccacgcc cacgccgctg cagagccgca cctccattgt gcaggcagct  840
gccggagggg tgccaggagg gggcagcaac aacggcaaga ctcccgtgtg tcaccagtgc  900
cacaaggtca tccggggccg ctacctggtg gcgttgggcc acgcgtacca cccggaggag  960
tttgtgtgta gccagtgtgg gaaggtcctg gaagagggtg gcttctttga ggagaagggc  1020
gccatcttct gcccaccatg ctatgacgtg cgctatgcac ccagctgtgc caagtgcaag  1080
aagaagatta caggcgagat catgcacgcc ctgaagatga cctggcacgt gcactgcttt  1140
acctgtgctg cctgcaagac gcccatccgg aacagggcct tctacatgga ggagggcgtg  1200
ccctattgcg agcgagacta tgagaagatg tttggcacga aatgccatgg ctgtgacttc  1260
aagatcgacg ctggggaccg cttcctggag gccctgggct tcagctggca tgacacctgc  1320
ttcgtctgtg cgatatgtca gatcaacctg gaaggaaaga ccttctactc caagaaggac  1380
aggcctctct gcaagagcca tgccttctct catgtgtgag ccccttctgc ccacagctgc  1440
cgcggtggcc cctagcctga ggggcctgga gtcgtggccc tgcatttctg ggtagggctg  1500
gcaatggttg ccttaaccct ggctcctggc ccgagcctgg gctcccgggc ccctgcccac  1560
ccaccttatc ctcccacccc actccctcca ccaccacagc acaccggtgc tggccacacc  1620
agcccccttt cacctccagt gccacaataa acctgtaccc agctg                  1665
<210>34
<211>223
<212>PRT
<213>人类
<400>34
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala
                 85                  90                  95
Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu
            100                 105                 110
Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala
        115                 120                 125
Pro Gln Gln Asn Gly Gln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser
    130                 135                 140
Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr
                165                 170                 175
Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln
            180                 185                 190
Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu
        195                 200                 205
Pro Trp Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro
    210                 215                 220
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>35
gagccggcat catggattcc                                              20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>36
gctgcctgca caatggaggt                                              20
<210>37
<211>1456
<212>DNA
<213>人类
<400>37
cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag  60
gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat  120
gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc  180
gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa  240
gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag  300
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gtcccagatg ccagcaagca gcggctgatg gagaacacag aggactggcg gccgcggccg  420
gggacaggcc agtcgcgttc cttccgcatc cttgcccacc tcacaggcac cgagttcatg  480
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gccccagcct catctacacc ccaggagccc tggcctggcc ctaccgcccc cagccctacc  600
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<210>38
<211>423
<212>PRT
<213>人类
<400>38
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Asn Lys Pro Gln Lys Val Gln Thr
                 85                  90                  95
Pro Asp Lys Gln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser Lys Gln
            100                 105                 110
Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly Thr Gly
        115                 120                 125
Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr Glu Phe
    130                 135                 140
Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln Val Pro
145                 150                 155                 160
Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu Pro Trp
                165                 170                 175
Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp Ala Val
            180                 185                 190
Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser Thr Val
        195                 200                 205
Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln Ser Arg
    210                 215                 220
Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly Gly Ser
225                 230                 235                 240
Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Gln Val Ile Arg
                245                 250                 255
Ala Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu Glu Phe
            260                 265                 270
Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe Phe Glu
        275                 280                 285
Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg Tyr Ala
    290                 295                 300
Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile Met His
305                 310                 315                 320
Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Leu Cys Phe Thr Cys Ala Ala Cys
                325                 330                 335
Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly Val Pro
            340                 345                 350
Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys Gln Trp
        355                 360                 365
Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala Leu Gly
    370                 375                 380
Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln Ile Asn
385                 390                 395                 400
Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu Cys Lys
                405                 410                 415
Ser His Ala Phe Ser His Val
            420
<210>39
<211>1575
<212>DNA
<213>人类
<400>39
cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag  60
gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat  120
gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc  180
gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa  240
gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag  300
ccggttcaga gcaaaccgca gaaggcctcc gcccccgccg cggaccctcc gcggtacacc  360
tttgcaccca gcgtctccct caacaagacg gcccggccct ttggggcgcc cccgcccgct  420
gacagcgccc cgcaacagaa tgggtgcaga cccctgacaa acagccgctc cgaccgctgg  480
tcccagatgc cagcaagcag cggctgatgg agaacacaga ggactggcgg ccgcggccgg  540
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aagacccgga tgaggagcac ctgaagaaat caagccaggt gcccaggaca gaagccccag  660
ccccagcctc atctacaccc caggagccct ggcctggccc taccgccccc agccctacca  720
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gcacagtgct gacccggcac agccagccgg ccacgcccac gccgctgcag agccgcacct  840
ccattgtgca ggcagctgcc ggaggggtgc caggaggggg cagcaacaac ggcaagactc  900
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cgtaccaccc ggaggagttt gtgtgtagcc agtgtgggaa ggtcctggaa gagggtggct  1020
tctttgagga gaagggcgcc atcttctgcc caccatgcta tgacgtgcgc tatgcaccca  1080
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ggcacgtgca ctgctttacc tgtgctgcct gcaagacgcc catccggaac agggccttct  1200
acatggagga gggcgtgccc tattgcgagc gagactatga gaagatgttt ggcacgaaat  1260
gccatggctg tgacttcaag atcgacgctg gggaccgctt cctggaggcc ctgggcttca  1320
gctggcatga cacctgcttc gtctgtgcga tatgtcagat caacctggaa ggaaagacct  1380
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cttctgccca cagctgccgc ggtggcccct agcctgaggg gcctggagtc gtggccctgc  1500
atttctgggt agggctggca atggttgcct taaccctggc tcctggcccg agcctgggct  1560
cccgggccct gccca                                                   1575
<210>40
<211>153
<212>PRT
<213>人类
<400>40
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala
                 85                  90                  95
Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu
            100                 105                 110
Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala
        115                 120                 125
Pro Gln Gln Asn Gly Cys Arg Pro Leu Thr Asn Ser Arg Ser Asp Arg
    130                 135                 140
Trp Ser Gln Met Pro Ala Ser Ser Gly
145                 150
<210>41
<211>24740
<212>DNA
<213>人类
<400>41
nnnnnntgta ttttatcata ttttaaaaat caaaaaacaa aaggcagttg aggttaggca  60
tggaggttcg tgcctgtaat cccagcactt tgggaagccg aagcacgtgg atcacctgag  120
gtcaggagtt cgagaccagc ctgcccaata tggtaaaacc ctgtctctac taaaaataca  180
aaaaattagc caggcatggt ggtgggcacc tgtaatccca gctacttggg agactgaggc  240
aggagaatca cttaaacccg ggaggcgggc tgggcgcggt ggctcatgcc tgtaatccca  300
gcactttggg aggccgagac aggcggatca tgaggtcagg agatcgagat catcctggct  360
aacatggtga aaccccatct ctactaaaaa tacaaaaaaa attagccagg cctggtggcg  420
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actccatctt aaagaaaaaa aacaaacccg ggaggcggaa attgcagtca gccgagatct  600
cgccattgca ctcaagtatg ggtgacagag caagactcca tgtcaaaaaa aaaggcagtt  660
gacaggagca aggagcctgg tgaggaagct gtggcatttg acccggctgt gttgctatgg  720
gccagggtgg tgctagtaga ggagctgagt gggaaagagc acaggggaca tgctgaaggc  780
ctgggtgtgg ggatgaggca gagattgggg gcaccttgca gggtcatagc aggtggctgt  840
ggtgagatgg aggaagacac ctggggtact gctctaggct gtcagacata cagaagctgg  900
cccagccaag cccaggggct gcaagggaca tccttttgtg tccccagtga tctgcagctc  960
tcagacaccc tcaagcacag tgcctcttgc ccagcccagc actctcagtg gggagccagg  1020
tgggagaaca ggctcggaag gggacctagg cttatgcagc gagccgggca aagctggaac  1080
tggagcccag gcccctggat gccccctggc ttgtggagtt ctgggatact gaggggaggg  1140
gacagggcat gggagtgcgg tgctctcacc tttgacttga actcattccc caggggacag  1200
gggaggcctc ctcaggatcc acagatgccc agtctcccaa gaggggcctg gtccccatgg  1260
aggaaaactc catctactcc tcctggcagg aaggtaagtt ggaggacgtg caagggcagc  1320
ctcagccccc cacacccagg gctgggtctt tttgggactg acggagctgt cctggccacc  1380
tgccacagtg ggcgagtttc ccgtggtggt gcagaggact gaggccgcca cccgctgcca  1440
gctgaagggg ccggccctgc tggtgctggg cccagacgcc atccagctga gggaggccaa  1500
ggcacccagg ccctctacag ctggccctac cacttcctgc gcaagttcgg ctccgacaag  1560
gtgaggtgca ggggtgggaa agggtgaggg gctgacagcc tggaccctcc tgctaatccc  1620
cacccgtgtg ccctgtgccc agggcgtgtt ctcctttgag gccggccgtc gctgccactc  1680
gggtgagggc ctctttgcct tcagcacccc ctgtgcccct gacctgtgca gggctgtggc  1740
cggggccatc gccgccagcg ggagcggctg ccagagctga ccaggcccca gccctgcccc  1800
ctgccacggg ccacctctct gccctccctg gacacccccg gagagcttcg ggagatgcca  1860
ccaggacctg agccacccac gtccaggaaa atgcacctgg ccgagcccgg accccagagc  1920
ctgccgctac tgctaggccc ggagcccaac gatctggcgt ccgggctcta cgcttcagtg  1980
tgcaagcgtg ccagtgggcc cccaggcaat gagcacctct atgagaacct gtgtgtgctg  2040
gaggccagcc ccacgctgca cggtggggaa cctgagccgc acgagggccc cggcagccgc  2100
agccccacaa ccagtcccat ctaccacaac ggccaggact tgagctggcc cggcccggcc  2160
aacgacagta ccctggaggc ccagtaccgg cggctgctgg agctggatca ggtggagggc  2220
acaggccgcc ctgaccctca ggcaggtttc aaggccaagc tggtgaccct gctgagtcgt  2280
gagcggagga agggcccagc cccttgtgac cggccctgaa cgcccagcag agtggtggcc  2340
agaggggaga ggtgctcccc ctgggacagg agggtgggct ggtgggcaaa cattgggccc  2400
atgcagacac acgcctgtgt ccaccctggc ctgcaggaac aaggcaggcc gcctgtggag  2460
gacctcagcc ctgccctgcc ctcctcatga atagtgtgca gactcacaga taataaagct  2520
cagagcagct cccggcaggg gcactcacgg cacacgcccc tgcccacgtt cattgcggcc  2580
aacacaagca ccctgtgccg gttccagggg cacaggtgac ctgggcctta cctgccaccc  2640
gtgggctcaa acccactgca gcagacagac gggatggaaa tcattaggac tccatgttgc  2700
tctgcacggc cgagtgacac gaagaggcag gcggagggag ctgtgaggct tacttgtcag  2760
actcaggaag gagcaacatg agggcccaac tggagacccg gaggcccgag ctgggaggag  2820
gcagtggggg cggggtgcag gtggaaggga tttcagagac accctcgtcc aaaacacttg  2880
ttccctgctg aaactccaac aatttgcaga tacttctggg aaccccaggc gtcagtctcc  2940
tcatctgtaa aggagagaga accgatgacg tatcaggcat aatccttgat gagagtttgc  3000
tgcgtgccta ctcagtgcca ggcgctgggg gacacagccg tgttcaggac agccttggtc  3060
ctgttctccg ggagccgaca ttccaggggg agagaagttt cctgaagact tccatgctgc  3120
gttccctcct ctgctcctgc tcctggcgcc atcctaggag ccagccatgc acgcaagcgt  3180
catgcctcca gggctctgac tgcccagccc ctcaccgcaa ctccacctca gctgcacaca  3240
cccttggcac atcctgaacc tcattttcat gacggacaca caatttttgc tctctcctgt  3300
ccaagcctca tcctctggcc gccacctcct tccagctcac ttcctttagt gcggccagta  3360
ccgcccctgc ctaggcatgt cgacctgcag ggaccctttt ctggctcttc gaggcctctg  3420
cccaccatcc cctctttgtt ctccatagtc ccttccccct gttctctctc gtttcatctt  3480
actggtctgg caaagtcccc ggccttgggc gagccagacc tcctcagtgc ctgcacacag  3540
ctgcccacag ccagagaaat ccatttaagc agactgcctg catccttctt aacagtgcaa  3600
ggcaggcact ccctgccaca agagaccctg ttccctagta gggcagcttt tctcctcccc  3660
agaacctcct gtctatcccc acccaatgtc tcctcacagg catattgggg aaacaggtca  3720
ggctctccca ccgtatctgc aagtgtactg gcatccatct gtcttcttcc tacccctaca  3780
gtagaaacag tgtctgtccc cagctgtgct ctgatcccgg ctcctttcac ctcagagctt  3840
ggaaaattga gctgtcccca ctctctcctg cgcccattca tcctaccagc agcttttcca  3900
gccacacgca aacatgctct gtaatttcac attttaaacc ttcccttgac ctcacattcc  3960
tcttcggcca cctctgtttc tctgttcctc ttcacagcaa aaactgttca aaagagttgt  4020
tgattacttt catttccact ttctcacccc cattctctcc tcaattaact ctccttcatc  4080
cccatgatgc cattatgtgg cttttattag agtcaccaac cttattctcc aaaacaaaag  4140
caacaaggac tttgacttct cagcagcact cagctctggt tcttgaaaca cccccgttac  4200
ttgctattcc tcctacctca taacaatctc cttcccagcc tctactgctg ccttctctga  4260
gttcttccca gggtcctagg ctcagatgta gtgtagctca accctgctac acaaagaatc  4320
tcctgaaagc ctgtaaaaat gtccatgcat gttctgtgag tgatctacca agaaaataaa  4380
aaattttaaa aatcaaatgc ccatgcctgg gcccacacgc aggggctctg atttcatcag  4440
tctggtaggt gggttctggg catccacgct cactggattt ccggatgatt gtagtatgca  4500
gcctaggctg ggaaccactg gcctcagcaa gccagtcatt ctccaggtgt cacagaccct  4560
ctaggtgcta atgaccccga aggtctgtct tcagtgcaca cctccccctg agctccagat  4620
ttaggaatcc cactgcacac gagacatctg gatgtggaaa agacatctcc agatcccatg  4680
ggtgaaaggg ggttggggga atggagactc gtgttcttcc aggatgtgtg tggacacaga  4740
atgcaaagcc tggagggatg ctagagccat agggaggaag atttcggctc acttattcat  4800
gcaagcactt cctgatgggt aaggtcttag agcaagctga ggccaagagg cgggcagtcg  4860
aggtgctgct gcaggcaccc ccactcccta cagtggcaag cccaagccca gcccttggca  4920
gctcaaatcc caggacacgc tgaaggtcac ccagagagtc aggggcatgg ctagaaccag  4980
aacccaggac tctggggacc cagcatggca tcctttcctt cattacaaat ctgagctgct  5040
ttgtttccta gggatttctg tgatattcca aggggactgt gggaaagaaa gtccttggaa  5100
accaccagga cgctagaggc ctggcctgga gcctcaggag tctcggccac cagagggcgc  5160
tgggtccttg tccaggtcca gttgctacgc aggggctgcc tgtgctggga ggctccccag  5220
gggacacaga ccagagcctt gcaccagccc aaggaatggg agcctggggt cctctctgct  5280
ggaggactgc caggaccccc aggctgccgc ctcttccttt gctcatttgc tgtttcactt  5340
tgtcaatcct tcctttcttc gtgtgttcat tcacatccac tgtgtgctgg ccctggggaa  5400
atgttagata agacacatta gctgtgtgtc ttcattgtcc taacaaagaa cacaccctgg  5460
aaagagcacc gcagagagtc cccattcccc catctccctc cacacatgga atctggagat  5520
gccttttcca catccagatg tctctggtgc tgtgggattc ttaaataaac aaacatttca  5580
tacagaatgt gagatgatgg agatgctatg gggaaaagta aagcagaggg agggcctagt  5640
gtgtgatgcg ggtgaggcat ccagggattg ctgtttcagc tgtgatcagg aaaggccctg  5700
ggaggaggcc acatctgagc agagacctaa ataaagttgg aaacctgttg ctgagatatc  5760
tggagaagtg tttcaagggc cgggcaccgg gcatggtggc tcacgcctgt aatcccagca  5820
ctttgggagg ccaaggcagg tggatcgctg gaggtcagga gtttgagagc agcctgacca  5880
acatggagaa accccatctc tactaaacat ataaaaatta tccgggcatg gtggttcatg  5940
cctgtagtcc cagctactcg ggaggttgag gcaggagaat cacttgaacg tgggaggcag  6000
aggttgcagc aagccgagat cacaccactg cactccagcc tggatgacag agcgagactc  6060
cgtctcaaaa aaaaaaaaga aaagaaaaaa gaaaaaaaaa gaaaagtgtt tcaagcaggg  6120
gaactggcaa gtggagaggc cctgaggcag aaatatgctt ggcctgctgg aggaaatgtg  6180
agtgaggagg tcagggtggc tggagtggag ggagcgagtg gtaggagtca gacccagttt  6240
attcatattc tgtaggtctt aaggacttca gttttatttt gagtgcaata tgagcccact  6300
ggaatgctaa aagctgagag tgacatggtg ctgtgattct ggctttaaaa atatcacttt  6360
ggctgcttcg tgaagactct ggaaggggca agggtgaaag cagggatgcc cgttaggaga  6420
ccgttacagg ggcgcaggca caaaatggca gtggctggga caatggtggc agcagcggtt  6480
agatgtgaac atgttgaagg tggaatttgc agaatctggg ggaggacaga agagaaagga  6540
taacttcatc gtttctgctg aaccagttgg ataaatgttg gtggcacttc ttgaagtgag  6600
gaaggagtta ggaaggtggg aaaggcacaa gtttgaattg ggccatgatg gtctgagata  6660
cctagtacag tggttcccca acctttttgg cagaagggac cgctttcatg gaagacaatt  6720
tttccacaga ctgggggtgg ggtggggatg gtttcagggt ggttcgagtg cagtacattt  6780
atcattagac tctttttttt tttttttttt tgagatagag tctcgctctg tcacccacac  6840
tggagtgcag tggagccatc ttggctcact acaacctctg ctgcccaggt tcaagtcatt  6900
ctcctgcctc agcctctcaa gtagctggga ttataggcat atgcgccacc acgcccagct  6960
aatttttgta tttttagtag agacggggtt tcaccatatt ggccaggatg gtctcgaact  7020
cctgacctca agtgatcctc ccccgcctca acctcccaaa gtgctggggt tacaggcgtg  7080
aaccactgca cccggcccat ttatcattag attctcataa ggaatgagca acctagatcc  7140
ctcgcatgca cagttcacaa tagggttcac gctcctatgg gagtctaatg ctgccgctgc  7200
actcagcttc tctggcttgc cgctgctcac cttctgctgt gcagcccagt tcctaacagg  7260
ccacaaacgg ggagttgggg acccctgatc tagtaaacat ctaggcaggg ttttggataa  7320
tggagttaga gttcctgggg agaggtcagg ctggccatga aacatgggat gcctttgcat  7380
ataggtggtg ttgaaagcca caggacagta cggggtctca gggggtgagc ataaagagag  7440
gcgacatcag atggccaagg ccagaggcag aggaggatgg gaaggagggg ccagtggggc  7500
agggggaagc tgtgaagcca gggaaaaagg gtgtttcgcg gaaaaggatc aacctggacc  7560
agtgctgccc ctaggcaggg caggatgaaa cttaaccacc acggattcca tggccccatg  7620
gcctccaggc cacaggggac cttgagaaga gagatctcag gggacgggtg cggacaagag  7680
cccgcctggc atggcttcaa gagataactg aaggaaagca agtggagacg cgataaacag  7740
acaactccct ggaggaattt tactctcgag aggagaatta aagggtagta gctggagagg  7800
gatgtggggt caagagaagg tctttaacga cgagaactct cacggcggtt tgtgcagaac  7860
agggtgggtg tgatgactgt ggatggagag gggagaactg cagcgactct gtcctaggag  7920
gaggtgatgg gccgggacca ccaagcgagt ggagggtgga cgccccttcc ctcaccccga  7980
cacccgcatg tgctcagtgt ccgtgccgcc ggccctagtg cctgggctga acgcggggcc  8040
gggactctga ggacgcctcc caggcgcgca gtccgtctgg ccaaggtgga gcgggacggc  8100
ngcttccgac ggtgcgcggg tcggctcggg gttgcaggga catccggcgt ccgctcctgc  8160
cctgttttcc tgccttcgca gagcgttgcg caactctagc tttaaacgcc cctgtccccc  8220
tcaacttgtc tcccccagcc cctctgattt acagattctg cagtccccga gggttgcgcc  8280
tacgataccg acactcgcgg cagcctgcga ggcgagtatg atcgtcccat ttttcggagt  8340
agcaaactaa ggttcagaga ctactatgtc ccaggtcggt ctggtttgaa ggtccgcttt  8400
cctctccctc cgccagcggg cggtgcgagg gactgggcga ggcagcgctt ccctaaggag  8460
gcgacccgca gccccggccc cctcccgact ccgccccgtt gcagggcccg ggtcggcgag  8520
gcctctcagc tctaagcccg acgggacttg gtgattgggc aggacggaag agctgggtgg  8580
ggctttccac cagcggagaa agtctagtgg gcgtggtcgc gacgagggcg tggcctggtg  8640
ccccgccccc gtccgcgcgc tcaaagtgga gggtggctgt gggggcgggg tcagaacact  8700
ggcggccgat cccaacgagg ctccctggag cccgacgcag agcagcgccc tggccgggcc  8760
aagcaggtat cgacgaccgc gcggggcgtc ttgggctgga ccaggcgggc gcccggggcc  8820
tgctgaggac cacaaagggc actgggggtc gtggtccagg ctgtgcttcc tcccgctggc  8880
cctggcccct gcctccgccc ccgcccccgc cttcctgccg ctaagccggc tgcggcgggg  8940
ccgattggcg cctgccggct tcctgcgccg gggccagtct aatgcatggg gcccgggcgg  9000
gggactaagg ggaaactgag tcacgtcggt gtgggagcag ttctgtgtgg gaggcaccac  9060
cccccactgg gctcggggaa ggatccccct ccaagctatg cttgagggtc ccagccccca  9120
tctgtctcca caggggccgc accccactcc cgccttcccc ttcttcagca cccaggggtc  9180
ccgccctggc tcccagcagc ctcgactggt cccggaatgg ctaggaggat ccgctgcagc  9240
cgcctccctc ccctcccctc ccctcccctc ccctcccctc ccctcccctc ccctcccctc  9300
cccctcgcgt cccaagcccc cgtgtgctcc ctccgctggc tctccgcaca gtgtcagctt  9360
acacgcctta tatagtccga gcaggctcca gccgcggcct gctgccggga cctgggggcg  9420
ggggagagga gagccggccc ctgactcacc cggaccgccc gaggctccag gctggcttgg  9480
ggggaggccg cgccagttta gtccctcggc ccacccctgg ttgcaaagaa cctcaagcct  9540
ggattcaggc acccctcacc gttccagtcc caaggggagg ggggctgctc ctgtctttcc  9600
aaagtgaggt ccgccagcca gcagcccagg ccagcctgac aaaatacctg cctcctatgg  9660
cttgggcgtg ctcaggggct gcccgtgcct gcctggcccc tgtccaaggc tggtatcctg  9720
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cctctcagga gccggcatca tggattcctt caaagtagtg ctggaggggc cagcaccttg  9840
gggcttccgg ctgcaagggg gcaaggactt caatgtgccc ctctccattt cccgggtgag  9900
cctaggtttg gggagggggc tcccccagcg gtctttcggt gcttaggtct ccagagggtg  9960
atggggggag tcctaacagg agctggtcag gggccagcag gccaggagat gtctaggtcc  10020
ggagatgtag tggtacctgc ctgccacaag gactcccaat gaggtggata ctgggaggga  10080
gcacccaggc ttctccagcc ctgcactgta cccgatgctg ttctcccaag ctcctgtggc  10140
cacctctgag ggctggaggg aggctcattg tgcaggatgg gagcctaaca tttcaggagg  10200
tatctaaact tgaggtggca atgcttggag ccaggcccca ggcaggacac tgtgactata  10260
ggatttcact tcagcctcac tgccgcccag ggaatagcaa tcctcatccc gtttttccag  10320
atgagagaag aactcatgga gaggtggcgg ggctcgctca tcgagtccat ggtgaagcag  10380
ggattggaat tgaggcacag catggcgtac attttttgtg ggtagaaggg gtctctcccc  10440
agcctatgta aggacccaca tccactgttc ccattcagga tgtggtggcc tttgacccca  10500
agcagaagtg taggacaggg ctccattcta ggggcttaac ttcagcttcc aagagcctgc  10560
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cccaagaatg cagccccacg ctgggatggc caacagtggc tgcggtctgc agagctgaaa  10680
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gctgttgtca ggaagcccaa ggcaagccca gcctggaggg gcccagaggg tcgtggcctg  10980
aggaggggct caagctggag tctgtctgta ggagctgggc gtgggggtta gggtgggcag  11040
gccagcagtg ctcttctcag gggtcctttg atggcattct cctggaacct gccccgccag  11100
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ccctgaaacc tacctgacgt cctgctccct gggaaagtgc tggcccagtg tgtctgggga  11220
gcctgaacct cagtttcttc cctgatggag atgactttca gatatggcct gttgggggca  11280
ctccgggctc cagctccctg gtcagcatcc ctggcatgtg ggcggggcca ctagctgatc  11340
ccagccctgg agttggacct gggcccacat gggtgggtga ggtgggcttt tctgagttag  11400
gccagccccc tccccctccc ctgaccccag aatggaggga ggtgggaggg gcaagggctg  11460
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ggctgactca cccccacctc atgcagggtc cagccccctg gctttttccc tccttggttc  11580
ctctggcctt accctgcccc tggcttgagc ccctccctgc ctctctccag ccacccgccc  11640
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gcttcctgcc ctcctcactc tgggaaggga agccgtcccc gccccccacc ccctctccag  11760
gagccagcta gctgcacccc aagaccccca cctcgggctc agcccacagc tcccaggagc  11820
cagccctgtg ggcagggagt ggctgggcca ggtttccctt ctactgactc accatgacct  11880
tgagtaagtc acttcccctc tggggtgtca cttccccata cacagtataa ggggttgatt  11940
tagttggatt gaactaaagg tgagggagtg gctcagggtg tctccaggtg ggctgacccc  12000
tcagttgggc ccccatgctc agcagaggtg gcccacagtg gtggagcctt agggtcagag  12060
acacttcctg gctctgcctc ttactagctg ggtgacttga ggcaagttgt ttaacctctc  12120
tgtgtacatt tgcaagtgca aaatgggtaa aatcccagat tactccacaa ggttgttgga  12180
agattcagtg tcaatatgta gcatagttgg tgctcaataa actgaagcaa gtcttcttat  12240
ttagcgagtg aggaaggggc cgccgagctc tcttagcctt ctgacctcct acgcaagcaa  12300
gaggtcatgt tgagcccagc tcgcctttct tttcccagtg ctgtcaagct ctgtgcctgg  12360
ctgccctgcc ctctgacatc tctctgaaac ctcttgcctc ccctctccct gcctcagctc  12420
agtctgtgca ctgacccacc tgaggagcct cctggggcca ctggcagcct ggaccccccc  12480
agatcccccc cacccagtga aattgtcttc cagcactgcc tcacaaaagc ctacttgatg  12540
cagtgccagg cctcttgcca gatggctggg tggtccctta ggcttggacc cagtcaagct  12600
gccctgcctg tgttgctggg gctgggctag aggcctggaa ggggtttatc agggtcaccc  12660
tctcagggcc tgggagatac ccaatcccag acattaaaac tgccagtagc ccctctacct  12720
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ccgctaggca gcacacgcca ttctccttta ccgaggccca ccgcttcctc aaagtcattc  12840
ctgatggtct cagctcatgc tggtggcagc catttctccc agcctactgt ctctactcat  12900
tgccacagga accagggact cccagctcaa gagcctgaag gattggggtc aggggaaatt  12960
ggcagtcgag ggcttgggag tgacagccat gtatggccta cgaagtccca gctgtcaact  13020
taggtcccat tcaggcagtg ttcacaggga accgggagat aacagggcct gttcctggct  13080
ctcaaagggt cccagcagac ccctatagat ggcccccgac agggtgctgg ggggtgagag  13140
gtccataaga gcccccggtg gtttcgggga ggaagctgcc ccctgcatgg gccagagggc  13200
atatctggta ggtggagtgg cctgggcagg aggccagcag gagcctcaaa aggcaatggt  13260
cctcctgaaa cacttgggct ttagcctgag cgtggctgtt tgtggacatc atagcaattt  13320
ctggactgtg ggggagggtg gtggcggtga atagataagc atcgtgactg gggaagctca  13380
ggtgagcacc acctgaggga gagggtctgg cagtgaataa ataagcagtg tgactgggaa  13440
attgtgaagc tcaggtgagc gccaccacct cctgggttgc tttagtgtcc agcagctgcc  13500
tagaactatg ttgaatgaag agctctctgg gttctggaag tgggacagct ttgggtgggg  13560
cagtgttacc accgtcagcc tggcttgggt ctgcagggtc cagggcctcg gtcactttgc  13620
ttctctctcc acagctcact cctgggggca aagcggcgca ggccggagtg gccgtgggtg  13680
actgggtgct gagcatcgat ggcgagaatg cgggtagcct cacacacatc gaagctcaga  13740
acaagatccg ggcctgcggg gagcgcctca gcctgggcct cagcaggtat gcgggtggac  13800
atggatgggt gcgcccgcgc tggcagtggg gatccctgcg gcccggcccg ctgtcacgct  13860
ttccttctcc tccagggccc agccggttca gagcaaaccg cagaaggtac gaggctggcc  13920
gggacatccg ggcggtgggc ggtgtgggct tggacggcca ggcctgctcg ccctcctggc  13980
acattctcgg taccccaatc cctggccggg agtggagggc agaaaccgga gctaaggcgg  14040
gtctagggcc ctggagttga gccaggggct gctgcacggt cctggcacca cgcatgtccg  14100
cctgtctgtc cgcctgtctg tccgcctgct gcctcccgcc gccggcgctg cgtgctcgcc  14160
cgcactcggt cagccctcgg tcctgcgtgg actgagatcg ccactcccaa atgggcccct  14220
tgaaacctga gtcgtcctct ccccgtagcc tccaaataga tgtagggggt ggggtggggg  14280
tggggggctg gagctgccgc tgtcctctgc tgcaggcgcc ccacttccac ccaggccccc  14340
accttaccct gcccgcccgc cctgcccggc tgtgtctctg cccaggcctc cgcccccgcc  14400
gcggaccctc cgcggtacac ctttgcaccc agcgtctccc tcaacaagac ggcccggcct  14460
ttgggcgccc ccgcccgctg acagcgcccc gcagcagaat gggtacgtcg gcccctgccc  14520
gcccgcgccc acgccatcag gcccactgtg gccccacgcc cgctgcccgc tgctgctcag  14580
tctgtgctgc gccccagccc ggcggaaccg tgcggcacgc cccctggcgg ccggggtggg  14640
gctgcaggca cagggcccct cccgaggctg tggcgccttg cagggcaccg cctggggagg  14700
ggtctctgaa tgacgccgcg ccccctgctg gcggctgggg gttgggttgt ggtgtcgggc  14760
cagctgagcc ccagacactc agtgccgcct tgtccccggc tgttctgacc cctccccgtc  14820
tttcttcctc tcctgtgtct gtccctttgt ccctttatct gtctgtctgt cttatttcct  14880
tcacaggtgc agacccctga caagtcagtg agcccccctc tgcctgtgcc tttcttcttc  14940
cttttggcac tctgggtggc ggcccctccc caccctggct gccctcctct ccacttcgcc  15000
ctcctgtcct ctcacctacc cgcccagcag ggctcctggc ctcaccctta cccactccct  15060
cccatcactg taacccaaac ccacatgcac caaatcctgg gaggggctgc ccccaccgcc  15120
cacccccagt gtggggttct gagccacacc ctccccacag acagccgctc cgaccgctgg  15180
tcccagatgc cagcaagcag cggctgatgg agaacacaga ggactggcgg ccgcggccgg  15240
ggacaggcca gtcgcgttcc ttccgcatcc ttgcccacct cacaggcacc gagttcagta  15300
agtgccagcc cagggcaggg ggtactttcc tcgcccccag cccaggcgtg atccctgacc  15360
ctgtgtcttt tttggtcaat gcctgcctct gctctctcag tgcaagaccc ggatgaggag  15420
cacctgaaga aatcaaggta cagggacggg caccagcccc tctcccacct cctgcctctt  15480
ccattccagc tactgccctg tgtctactcc tgaggctccc agctggggct ctcaattctc  15540
ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt  15600
cccttcctcc ttccttcctt ctttcatttc ttccctccct ccttccttcc ctcctccctc  15660
cctgcctccc ttccatctct ccttccttcc acttcttcct ccctctctct ctgcccctca  15720
gggaaaagta tgtcctggag ctgcagagcc cacgctacac ccgcctccgg gactggcacc  15780
accagcgctc tgcccacgtg ctcaacgtgc agtcgtagcc cggccctctc cagccggctg  15840
ccctctctgc ctccctcttt ctgttcctcc tgcccagggc acccccttag tgcctccagc  15900
ttctgcctac ctcacccccc ctttcgtgcc cctggcctga gcctcctgct ggcctggccc  15960
tggccgccca cctgggttca tctgacactg ccttccctct ttgccctgtg gtactgctgt  16020
ctgccaggtc tgtgctgcct tgggcatgga ataaacattc tcagccctgc ttgctctgcc  16080
tgtcttctat ctttgtggac ctggtttgca tttggggtgt gggggtgttt cgtggttcgg  16140
actgtttggg ccctgccgtc cttgttttca gtgggagggg gtacctggca aaggggccct  16200
gccctgccat cacagatggc ttcctggcat gaggggagcc ccaggagctg cctcagaagc  16260
gggagccctg cctcgtctcc cagctagaga ccgcacacca gctaactgga cattgctagg  16320
agaagctgcc cttcccatcc ctaccccagt gggacctgga atccaactcg gcagtttcca  16380
cgcccccagt catctcccgt ggggccagca ggacccaggt tggggggtgg ggccatgtca  16440
ggaagctcag ccatgcaggg ccttgaatgg cagatcttgc agccaggtgc ccaggacaga  16500
agccccagcc ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggtgaga gggagtgggc  16560
tcgggcctgg gcaagggtgg gcagcctcca ggggcatggg ggtggtgggc ttctctcagc  16620
tgcctggggc tccacccccg tcctttgggg tccctgggca cccctttaga gtcactttcc  16680
ccggcaggcc ctaccgcccc cagccctacc agccgcccgc cctgggctgt ggaccctgcg  16740
tttgccgagc gctatgcccc ggacaaaacg agcacagtgc tgacccggca cagccagccg  16800
gccacgccca cgccgctgca gagccgcacc tccattgtgc aggcagctgc cggaggggtg  16860
ccaggagggg gcagcaacaa cggcaagact cccgtgtgtc accagtgcca caaggtcatc  16920
cggtgggtgg cctgttcctg tccgaccctg gctttcccat cctgcagccc agccccacct  16980
gtctgcccac ctgtcttgcc tcagctgcga ctggggggaa taaggattca gttctcagct  17040
ggagtaggag tagggacctg ggctgggtcc tcccattctt aatcccacgc tacctacccc  17100
agcccaccca caacaactgc tagcagcatc tgccgtggcg aaatagccga agggccaacc  17160
ataggctgaa gctgcacccc tacctttgct gctctctggg caaagagggg cctgccccct  17220
cccagcgcgt ctgcccctcc ctcctgctct ctgtctccct ctgctctcag agcatacagg  17280
cctggagcca ctccctctgt gcactgcccc gtggggccaa gcagcatcaa acacccccca  17340
gcatcagcgt gccggattct agagccttcc taattcgcag gcctggcctg ctctcatctc  17400
tgtcagctct tttttttttt tttttgaaac agagtctcac tgtgttgccc acgttggcgt  17460
gcagtggcgc gatctcggct cactgcaacc tctgcctcct gggttcaaga gattctcctg  17520
cctcagcctc ctgagtagct gggattacag gcacccgcca ccatgcctgg ctaattttgt  17580
atttttagta gagacggggt tttaccatgt tggccaggct ggtctcaaac tcctcacctc  17640
aggtgatctc aggcctgcct tggcctccca aagtgctggg actacaggtg tgagccactg  17700
tgcccagccg actctatcag ctcttgccag gtagaacagg caggccagca ggacagggca  17760
gctccagggt ttgcccaggg gcggctcagc ttttatgagg ctccagtcgt cagcccttcc  17820
tcccggggtc ctccctgctc taaagctgcc tctcctgtca ccagcagttc agtgtggcgg  17880
actggctctg taagcttcat ggctgccacg gtcacttccc aagcctgtct tctatcctat  17940
gtggaaaatg gggagaatga actgtccctc ccaaggcctc ctggtgggtg gtcagtcaac  18000
ctgaaggggg ccaagacccc cacctctctg cgtgtgctcc ctctgaccgc tctcgcctcc  18060
ctgcaggggc cgctacctgg tggcgctggg ccacgcgtac cacccggagg agtttgtgtg  18120
tagccagtgt gggaaggtcc tggaagaggg tggcttcttt gaggagaagg gcgccatctt  18180
ctgcccacca tgctatgacg tgcgctatgc acccagctgt gccaagtgca agaagaagat  18240
tacaggcgtg agtagggctg gctggcgggg aggtggtccc aagcctgtca gtgggaacga  18300
gggctgctgg gaaacccaca gtccaggtct ctccccgagt gagcctccgg gtccttacca  18360
gcgtaataaa tgggctgctg tactggcctc accctgcatt agtcaggatg ctcttaacaa  18420
atgaccatgt tcctgctcag aaaccgccca aggctgcaaa gagcaggagg accaagccag  18480
gagaagccct gggccctcct gactcccact ttgggctctc cctgccctgg tgaaatgaca  18540
gaacggccaa cttgacacgc tgaagctgct ctgtctcatg cgtcctcctc atttctggat  18600
ccagagccag ggctgccagg agtagccaga gagctctgtg tggtgatgtt catattagtg  18660
aggtttacct tgaccacgag cagtgggaaa ctcaaaataa tggtggctta tttctcatct  18720
aaaaacatcc cggggtgggt ggtctgggac tgatctggtg gacccaggct ccgccttgtt  18780
gcttgactgt tggcagcacc tgcttactta ccactcatgg tgcaagatga cacttcagcc  18840
tccgccaaaa tgctcacctt ccagccagca ggaagtcgga aggagaagaa aggggacaga  18900
gccccatggc gtccatcctt agaggatgct gccacctgaa cctctgcttt catcctgttg  18960
gtcagaaccc agtcacatga ccacacccag tggcaacgga ggctgggaaa tatagtcttt  19020
attttgggca cccatgtgtc cagcaaaact gggggttcca tcagtcggca agaacgggag  19080
agtggccgat gcagtggctg atgcttgtat cccagcactt tgggaggtcg aggtgggcag  19140
atcacctgag gtcaggagtt caagaccagc ctggccaata tggtgaaacc ctgtctctac  19200
taaaaataaa aaaattagct gggtgtgctg gcgcacctgt agtcccagct acttgggagg  19260
ctgaggcagg agaatcgctt gatcttgaga ggtggaggtt gcagtgagcc aagattgtgc  19320
cactgccttc cagcctggga gacagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagggcc  19380
aggcacggtg gctcacacct gtaatcccag cactttggga ggccgagatg ggcggatcac  19440
gaggtcagga gattgagacc atcctggcta acacggtgaa accccatctc tactaaaaat  19500
acaaaaaaat tggccgggca tggtggagta gtcccagcta ctcgggaggc tgaggcagga  19560
gaatggcgtg aacctgggag gcagagcttg cagtgagccg agatcgcgcc actgcactcc  19620
agcctgggca acagagcgag actcttgtct caaaaagaaa aaaagaaaga gaaatctgcc  19680
tcccagcctt gggctcctgc cctaccagcc cacacccctg gtagagcctc ctctcccacc  19740
agctcaaagc ccaagttcct tcactgtgac cttgtctgct cctctaaaac aggcaacacc  19800
agacagtgag aagagccagc cagacatggg cagaaaacct atttctgtga tctactggct  19860
gtgtgagcag gggctagttg ctctctctgg gcctcactga agagaagggt ggcactatgc  19920
tagggccggc acggttgcaa ggtagatgta agatggggta caggtgttgt ggagggcaga  19980
aatgcaccat ccgaaggcta catgtccccc acacttatgt cttgcttggc ccacactgtt  20040
tcattttaaa atcagtagca aacaatttaa aaaatcagaa gatttgcctg catgatgcag  20100
tggctcatgc ctgtaatccc agcactttgg gaggccaagg tgggaggatt gcttgagccc  20160
aggagttcaa gaccagcatg ggcaccatag caagacccct gtttctacaa aaaaaaaaaa  20220
attagaaaat tagccaagtg tggtggcatg cacctgtggt cccagctact tgggaggcag  20280
agggaaagtg agatctcctg ctttttattt ctttatgtat aatgataggg tcttgctctg  20340
ttgcccaggc tggagtgcag tggcatgatc actgctcact gcagccttga tctcctgggc  20400
tcagaggatc ctcccacctc agcctcccaa atagctagga ctagaggtgc ccaccagcat  20460
gctcagcaga tttttaaatc tttttgtaga gatgaggttt tgctatgttg cccaggctgg  20520
tctcgaactc ctggcctcga gcgatcctcc caccttggcc tcccaaagca ctgggattac  20580
agacgtgagc cactgcgccc agcagatttc tctttaacac ctagatttca gcctgagcca  20640
ggcaggcatt cctgaatgaa ccagtagtac tgctcccaga agaagaggtc ctcctccgtg  20700
tgacacagtc cccacttggc ccttgcaggg attggatctg ggatccctgg atttaaactc  20760
agggccatcc tcataacagc ctcacaaggc tgggattagc ttcccagttc acaagggaag  20820
aaaccaagac ttgagaaggt caaggtctgg ccagacccac acatcttgga ccctcatacc  20880
gcctcgaggc cccatgctgc cctctgcctg ctccagatgt gaatactgct ggccctggct  20940
ggccccggct ggccccgagg gtcctaggga tgaacagccc agcccaggga gagctcagcc  21000
ccttgtgcct ctgccccttc ccacctcctg cggaggccag tcgactcacc cacaaagggc  21060
caggcactgt ggggatagat cagctaacaa aacagttgat gcttcctgcc cttctgggcc  21120
ttacattttg gctggaagaa gaggggagag gcagactgta agcaataagc gcaataagta  21180
ggttgcctgg aagtaatgtt agatcacgtt acggaaaaca ggaaagagca gagcgacaag  21240
tgctggggtg cgtggtgcag ggaaggcagc tggctgctgc tggtgtggtc agagtgggcc  21300
ctcatggaga agactgcatt cgagcagaaa cttgaagggg gtgaggggtg agcctagaga  21360
tatctggggc agagcagtcc aggcagaggg gacagccggt gtcaagccca ggacaggagt  21420
gtgcctggtg tgccagtttc aggcaagagg ccagtgtgca gaggcaaggt gagaacgcaa  21480
gggagagcag tggcggagac gggtgggaac gaggtcagac ctgctggcct ccagcctctg  21540
catggggctt ggctcttgct gggagcaatg ggaagcagta cacagtttca tgcaggggga  21600
gaaggcctgt cttgggttgc aggggcacgc tgtggcagct gggatcagag agaggagctt  21660
gtaggccagt tgttatgtgg tcccacgggc cagatggcca tggcttacct cacttcaggg  21720
aggctgtgag aagcactcag aatctggatg tgccttgggg gtgggcccca ctggatttcc  21780
tggtggacct ggtgtggggt gtgagaggag ggtgtgtttg gctgcagcag acaggagaat  21840
ggagttgcca tccgcgtgat ggggatggct gtgggaggag aggtttgggg tgagggaatc  21900
aggaactgag tgctggacat ggcaagtctg aaggcgcagt ggtcgtccac tcagagacct  21960
tggagttgga gatggaggtg tgggagtcct gaacagttag atgtagtgtt taccgcgaga  22020
aggaacaggg cttgcggcca gccctcctgt gttcccgtga cccagggcag ggcaggaggg  22080
gcctgagcct gccgagtgac tgggacctcc ttccaggaga tcatgcacgc cctgaagatg  22140
acctggcacg tgcactgctt tacctgtgct gcctgcaaga cgcccatccg gaacagggcc  22200
ttctacatgg aggagggcgt gccctattgc gagcgaggta cccactggcc agtgagggtg  22260
aggagggatg gtgcatgggg caggcatgaa tccaggtcct ctttctctct gcccccattc  22320
tcagactatg agaagatgtt tggcacgaaa tgccatggct gtgacttcaa gatcgacgct  22380
ggggaccgct tcctggaggc cctgggcttc agctggcatg acacctgctt cgtctgtgcg  22440
gtgagagccc cgcccctcga actgagcccc aagcccaccg gccctctgtt cattccccag  22500
gagatgcagg agaagttggg aaggggcctc tcctgctgcc cccaacccca tgtgactggg  22560
cctttgctgt ccttagatat gtcagatcaa cctggaagga aagaccttct actccaagaa  22620
ggacaggcct ctctgcaaga gccatgcctt ctctcatgtg tgagcccctt ctgcccacag  22680
ctgccgcggt ggcccctagc ctgaggggcc tggagtcgtg gccctgcatt tctgggtagg  22740
gctggcaatg gttgccttaa ccctggctcc tggcccgagc ctggggctcc ctgggccctg  22800
ccccacccac cttatcctcc caccccactc cctccaccac cacagcacac cgatgctggc  22860
cacaccagcc ccctttcacc tccagtgcca caataaacct gtacccagct gtgtcttgtg  22920
tgcccttccc ctgtgcatcc ggaggggcag aatttgaggc acgtggcagg gtggagagta  22980
agatggtttt cttgggctgg ccatctgggt ggtcctcgtg atgcagacat ggcgggctca  23040
tggttagtgg aggaggtaca ggcgagaccc catgtgccag gcccggtgcc cacagacatg  23100
aggggagcca ctggtctggc ctggcttgga ggttagagaa gggtagttag gaagggtagt  23160
tagcatggtg gctcatgcct gtgatcccag cactttggaa ggccaaggtg ggcagatcgc  23220
ttgaggtcag gagttcgaga cctcatggcc aacacggtga aacagcgtct ctagtaaaaa  23280
tacaaaaatt agccgagtgt ggtggggcat gcctgtaatc ccagccactc aggaggctga  23340
ggcgggaaaa tcacttgaac ctgggaagtg gaggttgcag tgagctgaga tcacaccact  23400
gcgcgcgagc ctgggtggca gatggcagag cgagaccctg cttcaaaaaa aaaaaaaaaa  23460
aaaaaaaaaa gaagggtagt tgtagttggg ggtggatctg cagagatatg gtgtggaaaa  23520
cagcaatggc cacagcaaag tcctggaggg gccagctgcc gtccaaacag aagaaggcag  23580
ggctggagag ggtagccctt aggtcctggg aagccacgag tgccaggcag tagagctggg  23640
gctgtctctt gaggttaggg cagggcaagg cacagcagag tttgaaatag gtttgtgttg  23700
tattgcagaa aagaggcccc agaacactga gggagtgcag gagggaggct gggaggagga  23760
gttgcagcag ggcctagggg cgggggccag gcaagggagg ggcagagagt aatatggcag  23820
agatgggacc cagtggcagg tccgggggat gagggatgga gagaaggaca ggagcgttgc  23880
caggcatctg gcctatacca gacatgctca cgctgtctcc cgcgaacctc ctagcaacct  23940
tgcgccgttg tctgcaatca cttatttcat tttttctttt ttaactttaa ttttttttgt  24000
ttttaagaga caggatctcc ctaggttgcc cgggctggtt tcaaactcct gggctcaagc  24060
aattcttcct ccttagcccc aaagtgctgg cattacaggt gtgagccacc atgcctggcc  24120
cacttatttt ctagatgagg cacagaaaga ttgggagact tgaccaaggt cacgctgtca  24180
ttgagccatg agccagacta gaatccaggc ctgaagctgg gtgcgctgtc ccaggactgg  24240
ctggcactga gtaccatttg ccagcgagca tctctctggg aagctgactt ctgcccggta  24300
cctggaggac tgtagacctt ggtggtggcg ccgtcactct ggggcttcct gcctcccact  24360
gatgcccgca ccaccctaga gggactgtca tctctcctgt cccaagcctg gactggaaag  24420
actgaagaga agccttaagt aggccaggac agctcagtgt gccatggctg cccgtccttc  24480
agtggtccct ggcatgagga cctgcaacac atctgttagt cttctcaaca ggcccttggc  24540
ccggtcccct ttaagagacg agaagggctg ggcacggtga ctcacacctc taatcccagc  24600
actttggaag gctgaggctg gagaagggct ccagcttagg agttcaggac cagcctgggc  24660
aacatggtga gaccctgttt tgttttgttt tttgtttttt tgagatggag tcttgctctg  24720
tcgcccaggc tggagtgcag                                              24740
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>褐家鼠
<400>42
gcactacctt gaaggaatcc atggt                                        25

Claims (18)

1.包含SEQ ID NO：37的分离核酸分子。
2.由SEQ ID NO：37编码的分离人LMP蛋白。
3.包含权利要求1的分离核酸分子的载体。
4.包含权利要求3的载体的宿主细胞。
5.权利要求4的宿主细胞，其中宿主细胞选自原核细胞、酵母细胞、和哺乳动物细胞。
6.权利要求1的分离核酸分子，其还包含标记物。
7.包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的人LIM矿化蛋白。
8.对HLMP-2SEQ ID NO：38特异的单克隆抗体。
9.包含SEQ ID NO：37的分离核酸分子在制备用于抑制类固醇诱导的成骨细胞形成的药物中的用途。
10.权利要求9的用途，其中分离核酸分子位于载体中。
11.权利要求10的用途，其中载体是表达载体。
12.权利要求11的用途，其中载体是质粒。
13.权利要求11的用途，其中载体是病毒。
14.权利要求13的用途，其中病毒是腺病毒。
15.权利要求13的用途，其中病毒是逆转录病毒。
16.权利要求9的用途，其中所述的分离核酸被离体转染进生骨前体细胞或外周血白细胞。
17.权利要求9的用途，其中通过直接注射所述分离核酸分子将所述的分离核酸体内转染进生骨前体细胞或外周血白细胞。
18.权利要求9的用途，其中所述分离核酸编码LIM矿化蛋白HLMP-2，其包含SEQ ID NO：38。
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7741117B2 (en) * 1997-04-30 2010-06-22 Emory University Bone mineralization protein expression systems, and methods of studying intracellular signaling pathways induced thereby
US7923250B2 (en) * 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
US20030225021A1 (en) * 2001-11-14 2003-12-04 Mckay William F. Methods of inducing the expression of bone morphogenetic proteins (BMPs) and transforming growth factor-beta proteins (TGF-betas) in cells
AU745122B2 (en) * 1997-07-30 2002-03-14 Emory University Novel bone mineralization proteins, DNA, vectors, expression systems
US8916691B2 (en) * 1998-07-29 2014-12-23 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein
WO2001048148A1 (en) * 1999-12-28 2001-07-05 The Regents Of The University Of Michigan Process for ex vivo formation of mammalian bone and uses thereof
US6811776B2 (en) 2000-12-27 2004-11-02 The Regents Of The University Of Michigan Process for ex vivo formation of mammalian bone and uses thereof
JP2004536794A (ja) * 2001-04-09 2004-12-09 メドトロニック、インコーポレイテッド マイクロ遠心機を用いる血液成分の分離方法及びその使用法
US7781574B2 (en) * 2001-11-14 2010-08-24 Emory University Chimeric osteogenic factor containing proteins capable of increased nuclear localization and methods of use thereof
AU2004317501B2 (en) * 2004-04-13 2011-09-01 Emory University Intracellular delivery of osteoinductive proteins and peptides
EP1896046A2 (en) * 2005-03-22 2008-03-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Mechanisms of osteoinduction by lim mineralization protein-1 (lmp-1)
WO2008156500A2 (en) * 2006-11-21 2008-12-24 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of inducing or increasing the expression of proteoglycans such as aggrecan in cells
US20090110637A1 (en) * 2007-10-26 2009-04-30 Warsaw Orthopedic, Inc. LMP and Regulation of Tissue Growth
US8936804B2 (en) 2010-01-15 2015-01-20 Rutgers, The State University Of New Jersey Use of vanadium compounds to accelerate bone healing
WO2013006798A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Vandium compounds as therapeutic adjuncts for cartilage regeneration and repair
US20140322292A1 (en) 2010-12-10 2014-10-30 Rutgers, The State University Of New Jersey Insulin-mimetics as therapeutic adjuncts for bone regeneration
WO2012116135A2 (en) 2011-02-24 2012-08-30 Emory University Noggin blocking compositions for ossification and methods related thereto
US20140248372A1 (en) 2011-09-19 2014-09-04 Emory University Bone morphogenetic protein pathway activation, compositions for ossification, and methods related thereto
JP6214548B2 (ja) * 2011-11-29 2017-10-18 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー 骨再生のための治療補助薬としてのインスリン−疑似剤
WO2014011540A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Emory University Bone morphogenetic protein pathway activation, compositions for ossification, and methods related thereto

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU745122B2 (en) * 1997-07-30 2002-03-14 Emory University Novel bone mineralization proteins, DNA, vectors, expression systems

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