CN1665391A - 在非骨细胞中表达lim矿化蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了在哺乳动物非骨细胞中表达LIM矿化蛋白的方法，如干细胞或椎间盘细胞(如纤维环细胞或髓核细胞)。方法包括用分离的核酸转染细胞，所述核酸包含可操作连接于启动子的编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列。转染可体外或体内完成，通过直接注射病毒或裸露DNA，或通过非病毒载体例如质粒。表达LIM矿化蛋白可刺激能产生蛋白聚糖和/或胶原的细胞中生成蛋白聚糖和/或胶原。也描述了治疗盘疾病的方法，疾病与外伤或盘变性相关。

Description

在非骨细胞中表达LIM矿化蛋白的方法
本专利申请要求2001年11月14日提交的美国临时专利申请序列号60/331,132的权利。临时专利申请全部纳入本文供参考。
本专利申请涉及提交于1988年7月29日的美国专利申请序列号09/124,238，现在是美国专利申请号6,300,127，以及提交于2000年4月28日的美国待审批专利申请序列号09/959,578。这些专利申请都全部纳入本文供参考。
                            发明背景
发明领域
发明的技术领域一般涉及在非骨细胞中表达LIM矿化蛋白的方法，如椎间盘细胞或髓核细胞。发明的技术领域更特定涉及用编码LIM矿化蛋白的核酸转染非骨细胞，如椎间盘细胞。
技术背景
认为造骨细胞从多能间质干细胞分化。造骨细胞的成熟导致可矿化和形成骨的胞外基质分泌。没有充分理解此复杂过程的调节，但认为它包括称为骨形态发生蛋白(BMPs)的信号糖蛋白组。这些蛋白显示参与成年动物中的胚胎背腹图式、肢芽发育和断裂修复。 B.L.Hogan，Genes&Develop.，10，1580(1996)。此转化生长因子-β超家族分泌蛋白组在多种不同分化阶段的细胞类型中有活性谱；这些紧密相关分子间的生理活性差异未被阐明。 D.M.Kingsley，Trends Genet.，10，16(1994)。
为更好确定不同BMP信号蛋白的独特生理作用，我们最近将BMP-6诱导大鼠颅顶造骨细胞分化的潜能与BMP-2和BMP-4比较。 Boden等，Endocrinology，137，3401(1996)。我们研究了在大鼠胎颅顶初次传代(二级)培养物中的此过程，需要BMP或糖皮质激素用于起始分化。在此膜骨形成的模型中，糖皮质激素(GC)或BMP起始分化成能分泌骨钙蛋白的矿化骨节，造骨细胞特异蛋白。此二级培养系统不同于进行同时分化的原代大鼠造骨细胞培养物。在此二级培养系统中，糖皮质激素产生10倍诱导的BMP-6 mRNA和蛋白表达，使造骨细胞分化增加。 Boden等，Endocrinology，138，2920(1997)。
除了胞外信号如BMPs，胞内信号或调节分子也可在导致新骨形成的事件级联中发挥作用。一个广泛种类的胞内调节分子是LIM蛋白，这样命名是因为它们具有称为LIM结构域的特征结构基序。LIM结构域是半胱氨酸-丰富的结构基序，包括两个由2-氨基酸间隔区连接的特殊锌指。一些蛋白质仅有LIM结构域，而另一些包含多种另外的功能结构域。LIM蛋白形成一个多样的组，包括转录因子和细胞骨架蛋白。LIM结构域的主要作用似乎是调节蛋白质-蛋白质相互作用，通过形成具相同或不同LIM结构域的二聚体或通过结合不同的蛋白质。
在LIM同源域蛋白即具有LIM结构域和同源域序列的蛋白中，LIM结构域功能是负调节因子。LIM同源域蛋白参与控制细胞谱系确定和调节分化，尽管LIM-单独蛋白可能具有类似作用。
人和其它哺乳动物种易患需要骨修复和/或再生过程的疾病和损伤。例如，改进骨折治疗可通过能刺激天然骨修复机制的治疗方案，从而减少断裂骨愈合所需时间。在另一个例子中，患全身骨疾病如骨质疏松症的个体可从治疗方案中获益，此治疗方案导致全身形成新骨。这种治疗方案使骨物质损失产生的骨折发生率降低，骨物质损失是此病的特征。
由于至少这些原因，研究胞外因子如BMPs以使用它们刺激体内新骨形成。尽管用BMPs和其它胞外信号分子获得早期成功，它们的使用涉及一些劣势。例如，需要相对大剂量的纯化BMPs以提高新骨形成，从而增加这种治疗方法的花费。此外，胞外蛋白在引入宿主动物中易受降解。另外，因为它们通常是免疫原性，存在刺激免疫反应针对施用蛋白的可能性。
由于这些考虑，需要有可用的治疗方案，使用胞内信号分子诱导新骨形成。基因治疗领域的发展使编码胞内信号的核苷酸片段能被导入成骨前体细胞，即参与骨形成的细胞或外周血液白细胞，胞内信号构成部分骨形成过程。用于骨形成的基因治疗提供一些潜在优势：(1)更低的生产成本；(2)与胞外治疗方案相比更高的效率，这是由于胞内信号获得延长表达的能力；(3)绕过可能受阻的胞外信号治疗，受阻是由于存在有限数量的信号受体；(4)它可将转染的潜在骨原细胞直接传递给需要局部骨形成的位置；(5)它允许全身骨形成，从而提供治疗方案用于骨质疏松症和其它代谢骨疾病。
除了骨疾病，人和其它哺乳动物种也易患椎间盘变性，它与下腰痛、盘疝形成(disc herniation)和椎管狭窄相关。盘变性与逐渐失去蛋白聚糖基质相关。这可能使盘更易受生物机械损伤和变性。因此，需要方法刺激适当细胞的蛋白聚糖和/或胶原合成，例如髓核细胞、纤维环细胞和椎间盘细胞。
                            发明概述
根据发明的第一个方面，提供在哺乳动物非骨细胞中表达LIM矿化蛋白的方法。根据发明的此方面，方法包括用分离的核酸转染细胞，所述核酸包含可操作连接于启动子的编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列。细胞可以是能产生蛋白聚糖和/或胶原的细胞，从而LIM矿化蛋白的表达刺激细胞中蛋白聚糖和/或胶原合成。根据发明此方面的分离核酸可以是一种核酸分子，能在标准条件下和与全长SEQ.IDNO：25互补的核酸分子杂交；和/或能在高度严格条件下和与全长SEQ.ID NO：26互补的核酸分子杂交。细胞可以是干细胞、椎间盘细胞、纤维环细胞或髓核细胞。
根据发明的第二个方面，提供哺乳动物非骨细胞，包括编码LIM矿化蛋白的分离核酸序列。根据发明的此方面，细胞可以是干细胞、髓核细胞、纤维环细胞或椎间盘细胞。
根据发明的第三个方面，提供治疗椎间盘损伤或疾病的方法。根据发明的此方面，方法包括将分离的核酸转染到能产生蛋白聚糖和/或胶原的哺乳动物细胞。分离的核酸包含编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列，可操作连接于启动子。LIM矿化蛋白刺激细胞中蛋白聚糖和/或胶原合成。
根据发明的第四个方面，提供椎间盘移植物。根据发明的此方面，移植物包括载体物质和哺乳动物细胞集合，细胞含编码LIM矿化蛋白的分离核苷酸序列。同样根据发明的此方面，载体物质包括生物适合物质的多孔基质且哺乳动物细胞结合到载体物质中。
                               附图简述
参考附图可更好理解本发明，其中：
图1显示大鼠椎间盘细胞表达HLMP-1后的硫酸化粘多糖(sGAG)生成，细胞用不同MOIs转染；
图2是一个图表，显示用不同MOI的AdHLMP-1感染6天后，大鼠椎间盘细胞的剂量反应；
图3是一个图表，显示用250个病毒粒子/细胞的MOI转染6天后，AdHLMP-1转染的大鼠椎间盘细胞的聚集蛋白聚糖和BMP-2 mRNA表达；
图4A是一个图表，显示用不同MOIs的Ad-hLMP-1感染12小时后HLMP-1 mRNA的表达；
图4B是一个图表，显示来自感染后3到6天的培养基中sGAG的生成；
图5是一个图表，显示sGAG生成的时程变化；
图6A是一个图表，显示在用于聚集蛋白聚糖的大鼠纤维环细胞中对LMP-1过量表达的基因反应；
图6B是一个图表，显示在用于BMP的大鼠纤维环细胞中对LMP-1过量表达的基因反应；
图7显示用25 MOI的AdHLMP-1感染后，大鼠纤维环细胞中HLMP-1 mRNA水平的时程；
图8是一个图表，显示对应于HLMP-1过量表达的BMPs和聚集蛋白聚糖mRNA水平变化；
图9显示对应于HLMP-1表达的sGAG生成增加的时程；
图10是一个图表，显示LMP-1调节的sGAG生成增加被头蛋白阻碍；
图11显示单层培养6天后LMP-1对培养基中sGAG的效果。
                    优选实施方案的详细描述
本发明涉及用编码LIM矿化蛋白的核酸转染非骨细胞。本发明者发现用编码LIM矿化蛋白的核酸转染非骨细胞如椎间盘细胞，可导致蛋白聚糖、胶原和其它椎间盘成分及组织合成增加。本发明也提供治疗椎间盘疾病的方法，疾病与蛋白聚糖、胶原或其它椎间盘成分损失相关。
要理解的是上面的一般描述和下列详细描述作为示范和解释，旨在提供对权利要求的发明的进一步解释。
                        缩写和定义
BMP              骨形态发生蛋白
HLMP-1           人LMP-1，也定义为人LIM蛋白或HLMP
HLMP-1s          人LMP-1短(截短)蛋白
HLMPU            人LIM蛋白独特区域
LMP              LIM矿化蛋白
MEM              基本培养基
Trm              去炎松
β-GlyP          β-甘油磷酸
RACE            迅速扩增cDNA末端
RLMP            大鼠LIM矿化蛋白，也定义为RLMP-1
RLMPU           大鼠LIM蛋白独特区域
RNAsin          RNA酶抑制剂
ROB             大鼠造骨细胞
10-4            含RLMP(SEQ ID NO：2)cDNA序列的克隆
UTR             未翻译区
HLMP-2          人LMP剪接变体-2
HLMP-3          人LMP剪接变体-3
MOI             感染复数
sGAG            硫酸化粘多糖
AdHLMP-1        重组5型腺病毒，包括编码HLMP-1的核苷酸序列
LIM基因(10-4/RLMP)从刺激的大鼠颅顶造骨细胞培养物中分离(SEQ.ID NO：1、SEQ.ID NO：2)。参见美国专利号6,300,127。此基因被克隆、测序和分析其提高体外骨矿化效率的能力。发现蛋白RLMP影响骨基质的矿化以及细胞分化成造骨细胞谱系。不像其它已知细胞因子(如BMPs)，RLMP不是分泌蛋白，而是胞内信号分子。此特征的优势是提供胞内信号扩增以及更易评估转染细胞。它也适于更有效和特异的体内应用。适当临床应用包括提高骨折、骨缺陷、骨移植中的骨修复和在表现骨质疏松症的病人中提高正常动态平衡。
对应的人蛋白名为人LMP-1(”HLMP-1”)，其氨基酸序列被克隆、测序和推断。参见美国专利号6,300,127。发现人蛋白显示提高体外和体内骨矿化效率。
此外，截短(短)形式的HLMP-1名为HLMP-1s，其特征被确定。参见美国专利号6,300,127。此短形式来自一种cDNA克隆来源的点突变，提供截短蛋白质的终止密码子。发现HLMP-1s在细胞培养物和体内表达时完全有功能。
用PCR分析人心脏cDNA文库，鉴定了两种另外的剪接变体(称为HLMP-2和HLMP-3)，与HLMP-1的差异在于编码HLMP-1核苷酸序列中碱基对325-444间的区域。参见提交于2000年4月28日的美国待审批专利申请序列号09/959,578。HLMP-2序列在此区域中具有119个碱基对缺失和17个碱基对插入。与HLMP-1相比，编码HLMP-3的核苷酸序列没有缺失，但它与HLMP-2一样有17个碱基对在HLMP-1序列的位置444插入。
LMP是多能分子，调节或影响一些生物过程。不同的LMP剪接变体预期在哺乳动物中有不同的生物功能。它们可能在多种组织的生长、分化和/或再生中发挥作用。例如，一些形式的LMP不仅在骨中表达，也在肌肉、腱、韧带、脊髓、末稍神经和软骨中表达。
根据一个方面，本发明涉及刺激哺乳动物中蛋白聚糖和/或胶原合成，通过提供分离的核酸，核酸包含编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列，可操作连接于启动子；将所述分离核酸序列转染到能产生蛋白聚糖的哺乳动物细胞中；表达所述编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列，在其中刺激蛋白聚糖合成。哺乳动物细胞可以是非骨细胞，如椎间盘细胞、纤维环细胞或髓核细胞。转染可体外或体内发生，通过直接注射病毒或裸露DNA例如质粒。在一些实施方案中，病毒是重组腺病毒，优选AdHLMP-1。
发明的另一个实施方案包括哺乳动物非骨细胞，含编码LIM矿化蛋白的分离核酸序列。哺乳动物非骨细胞可以是干细胞(如多能干细胞或间质干细胞)或椎间盘细胞，优选髓核细胞或纤维环细胞。
在另一方面，发明涉及在哺乳动物非骨细胞中表达编码LIM矿化蛋白的分离核酸序列的方法，包括提供分离的核酸，核酸包含编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列，可操作连接于启动子；将所述分离核酸序列转染到哺乳动物非骨细胞中；表达所述编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列。哺乳动物非骨细胞可以是干细胞或椎间盘细胞(如髓核细胞或纤维环细胞)。转染可体外或体内发生，通过直接注射病毒或裸露DNA例如质粒。病毒可以是重组腺病毒，优选AdHLMP-1。
在另外一个实施方案中，发明涉及通过反转、延迟或减缓盘变性来治疗椎间盘疾病的方法，包括提供分离的核酸，核酸包含编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列，可操作连接于启动子；将所述分离核酸序列转染到能产生蛋白聚糖的哺乳动物细胞中；通过表达所述编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列来刺激所述细胞中蛋白聚糖合成，其中盘变性被反转、中断或减缓。盘疾病可包括下腰痛、盘疝形成或椎管狭窄。哺乳动物细胞可以是干细胞或椎间盘细胞(如髓核细胞或纤维环细胞)。
转染可体外或体内发生，通过直接注射病毒或裸露DNA例如质粒。在一些实施方案中，病毒是重组腺病毒，优选AdHLMP-1。
本发明涉及一种新的哺乳动物LIM蛋白，本文称为LIM矿化蛋白或LMPs。本发明更特定涉及人LMP，称为HLMP或HLMP-1，或另外的人LMP剪接变体，称为HLMP-2或HLMP-3。专利申请者发现这些蛋白质提高体外生长哺乳动物细胞中的骨矿化。当在哺乳动物中生成时，LMP也诱导体内骨形成。
用编码LIM矿化蛋白(如LMP或HLMP)的核酸体外转染骨髓细胞、成骨前体细胞、外周血细胞和干细胞(如多能干细胞或间质干细胞)，接着在供体中重移植转染的细胞，适于治疗多种骨相关疾病或损伤。例如，可使用此方法以：在骨折修复很久前增强；在部分缺陷中产生骨；提供骨移植取代断裂；促进肿瘤重建或剌融合；提供局部治疗(通过注射)用于弱或骨质疏松的骨，如臀、椎骨或手腕骨质疏松症。用LMP或编码HLMP的核酸转染也用于：经皮肤注射转染的骨髓细胞以加速断裂长骨的修复；治疗长骨断裂的联合延迟或不联合或者刺融合的假关节；用于诱导臀或膝无血管坏死中的新骨形成。
除了基因治疗的体外方法，可体内完成转染重组DNA载体，载体包括编码LMP或HLMP的核酸序列。当编码LMP或HLMP的DNA片段插入适当病毒载体时，例如腺病毒载体，病毒构建可直接注射到需要软骨内骨化的身体位置。通过使用直接、经皮肤注射以导入LMP或HLMP序列，可完成刺激骨形成而不需手术干预以获得骨髓细胞(用于体外转染)或将它们重移植到病人需要新骨的位置。 Alden等，Neuro-surgical Focus(1998)证明基因治疗的直接注射方法效用，使用编码BMP-2的cDNA，cDNA克隆到腺病毒载体。
也能完成体内基因治疗，通过将裸露即未密封的重组质粒直接注射到适当身体位置，质粒含编码HLMP的核酸序列。在发明的此实施方案中，当裸露的质粒DNA被所述适当靶细胞吸收或内在化时，发生转染。如用病毒构建的体内基因治疗情况中，直接注射裸露的质粒DNA提供的优势是需要很少或不需要手术干预。直接基因治疗用编码内皮细胞有丝分裂原VEGF(血管内皮生长因子)的裸露质粒DNA，在人类患者中被证明成功。 Baumgartner等，Circulation，97，12，1114-1123(1998)。
对于椎间盘应用，完成体外转染通过从椎间盘收集细胞，用编码LMP的核酸体外转染细胞，接着将细胞导入椎间盘。细胞可从椎间盘收集或导入其背面，用本领域技术人员已知的任何方法，例如适用于刺的任何手术技术。在一个实施方案中，细胞通过注射导入椎间盘。
同样根据发明，干细胞(如多能干细胞或间质干细胞)可用编码LIM矿化蛋白的核酸体外转染并导入椎间盘(如通过注射)。
体外转染的细胞也能结合载体以形成椎间盘移植物。含转染细胞的载体随后可植入试验者的椎间盘。适当载体物质示于 Helm等，《骨移植取代用于促进脊髓关节固定》(Bone Graft Substitutes for the Promotion of Spinal Arthrodesis)，Neurosurg Focus，第10卷(4)：2001年4月。载体优选包括生物适合的多孔基质如去矿化的骨基质(DBM)、生物适合的合成聚合基质或蛋白质基质。适当蛋白质包括胞外基质蛋白如胶原。移植前，用LMP体外转染的细胞可结合到载体(即进入多孔基质的孔中)。
类似的，对于体内转染细胞的椎间盘应用，DNA可用本领域技术人员已知的任何适当方法导入椎间盘。在一个实施方案中，核酸直接注入椎间空间。
通过使用腺病毒载体以传递LMP到成骨细胞，获得LMP的暂时表达。这会发生是因为腺病毒不结合到转染的靶细胞基因组。暂时表达LMP即表达发生在转染的靶细胞生存期中，它足以达到发明的目标。然而，当结合到靶细胞基因组的载体被用作传递载体时，可发生LMP的稳定表达。例如，以逆转录病毒为基础的载体适于此目的。
稳定表达LMP特定用于治疗多种全身的骨相关疾病，如骨质疏松症和成骨不全。对于发明的此实施方案，除了使用整合到靶细胞基因组的载体以传递编码LMP的核苷酸序列到靶细胞中，LMP表达能置于可调节启动子的控制下。例如通过暴露于外源诱导剂而打开的启动子适合，如四环素。
使用此方法，可在全身基础上刺激新骨形成，通过施用有效量的外源诱导剂。一旦获得足够量的骨物质，可中止施用外源诱导剂。重复此过程以满足置换骨物质损失的需要，例如作为骨质疏松症的结果。特异于HLMP的抗体特定用于测定病人细胞的骨诱导即骨形成潜力。同样，HLMP特异抗体适用于标记测定以鉴定骨变性疾病中的风险因子，例如骨质疏松症。
遵循熟知和常规的方法，制备本发明的基因通过连接编码LMP的核酸部分和其它核酸序列，如克隆和/或表达载体。描述了构建和分析这些重组载体所需的方法，例如限制性内切酶消化、克隆操作、突变、有机合成寡核苷酸和DNA测序。对于DNA测序DNA，优选双脱氧终止子(dieoxyterminator)方法。
发表了许多关于重组DNA方法的条约，包括 Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborPress(1988)， Dabis等，《分子生物的基本方法》(Basic Methods in MolecularBiology)，Elsevier(1986)和 Ausubel等，《分子生物的当前操作》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Wiley Interscience(1988)。这些参考手册特别纳入本文供参考。
以引物为指导扩增DNA或cDNA是表达本发明基因的一个普通步骤。它一般通过聚合酶链式反应(PCR)进行。PCR描述于Mullis等，的美国专利号4,800,159和其它发表来源。PCR的基本原理是通过连续循环的引物延伸来指数复制DNA序列。一个引物的延伸产物与另一个引物杂交时，成为合成另一个核酸分子的模板。引物-模板复合物作为DNA聚合酶底物，聚合酶行使其复制功能延伸引物。用于PCR应用的常规酶是分离自栖热水生菌(Thermus aquaticus)的热稳定DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶。
存在此基本PCR方法的许多变化，选择构建本发明重组载体所需特定步骤的特定过程由技术人员进行。例如，为测量10-4/RLMP的细胞表达，提取RNA并在标准和熟知的过程下反转录。随后通过PCR分析所得cDNA的适当mRNA序列。
编码LIM矿化蛋白的基因在重组表达系统的表达载体中表达。当然，构建的序列不必须与原始或其互补序列相同，而可以是通过DNA密码子简并性确定的任何序列，序列表达具骨形成活性的LMP。可使用保守氨基酸取代或其它修饰，如产生氨基末端的甲硫氨酸残基。
所选宿主表达系统中的活性核糖体结合位点连接嵌合LMP编码序列的5’末端，形成合成基因。合成基因可插入多种表达载体之一，这是通过连入适当线性化的质粒。可调节启动子如大肠杆菌lac启动子，也适用于表达嵌合编码序列。其它适当的可调节启动子包括trp、tac、recAT7和λ启动子。
编码LMP的DNA通过一些标准的发表过程转染到受体细胞，例如磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔或原生质体融合，用于形成稳定转化子。磷酸钙沉淀优选，特别当如下进行时。
DNAs转到细胞前用磷酸钙共沉淀，根据 Graham和Van Der，Virology，52，456(1973)的方法。40-50μg的等分DNA用于0.5×106个细胞在100mm皿平板培养，鲑精或小牛胸腺DNA作为载体。DNA混合0.5ml 2X Hepes溶液(280mM NaCl、50mMHepes和1.5mM Na2HPO4，pH7.0)，加入等体积的2x CaCl2(250mM CaCl2和10mMHepes，pH7.0)。30-40分钟后出现白色粒状沉淀，逐滴均匀分布在细胞上，可在37℃孵育4-16小时。去除培养基且细胞用15％PBS中的甘油振荡3分钟。去除甘油后，细胞用含10％胎牛血清的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)养。
转染DNA也可用：DEAE-葡聚糖的方法， Kimura等，Virology，49：394(1972)和Sompayrac等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，7575(1981)；电穿孔的方法， Potter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，7161(1984)；原生质体融合的方法， Sandri-Goddin 等，Molec.Cell.Biol.，1，743(1981)。
固相上的亚磷酰胺化学是有机合成双脱氧核苷酸和聚双脱氧核苷酸的优选方法。此外，可用许多其它有机合成方法。这些方法容易由本领域技术人员修改适于发明的特定序列。
本发明也包括核酸分子，在标准条件下与编码本发明LIM矿化蛋白的任何核酸序列杂交。“标准杂交条件”随着探针大小、背景和核酸试剂浓度以及杂交类型而不同，例如原位、DNA印迹或DNA-RNA杂合(RNA印迹)。确定“标准杂交条件”在本领域技术水平内。例如参见 Fremeau等，的美国专利5,580,775，由于此目的纳入供参考。也参见 Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975)， Alwine，Meth.Enzymol.，68：220(1979)和 Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》，第2版，Cold SpringHarbor Press，7.19-7.50(1989)。
一套优选的标准杂交条件包括印迹在50％甲酰胺、5X SSPE(150mM NaCl、10mMNa2HPO4[pH7.4]、1mM EDTA[pH8.0])、15X Denhardt溶液(20mg Ficoll、20mg聚乙烯吡咯烷酮和20mg BSA每100ml水)、10％硫酸葡聚糖、1％SDS和100μg/ml鲑精DNA中42℃预杂交2小时。加入32P-标记的cDNA探针，杂交连续14小时。之后，印迹用2X SSPE、0.1％SDS在22℃洗2次20分钟，接着在0.1X SSPE、0.1％SDS中65℃洗1小时。随后干燥印迹并在增光屏存在时对x-光薄膜曝光5天。
在“高度严格条件”下，如果两种序列完全相同，探针与其靶序列杂交。在标准杂交条件的情况中，本领域技术人员可根据本领域技术水平和特定实验性质来确定仅完全相同序列会杂交的条件。
根据本发明的一个方面，提供分离的核酸分子，分子包含编码LIM矿化蛋白的核酸序列。根据发明的核酸分子可以是一种核酸分子，在标准条件下和与全长SEQ.ID NO：25互补的核酸分子杂交和/或在高度严格条件下和与全长SEQ.ID NO：26互补的核酸分子杂交。更特定的是，根据发明的分离核酸分子可编码HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2或HLMP-3。
发明的另一个方面包括由核酸序列编码的蛋白质。在另一个实施方案中，发明涉及在抗LMP抗体基础上鉴定这些蛋白质。在此实施方案中，制备用于蛋白质印迹分析的蛋白质样品是通过裂解细胞和用SDS-PAGE分离蛋白质。蛋白质通过电印迹(electrobloffing)转移到硝化纤维膜，如 Ausubel等到，《分子生物的当前操作》，John Wiley and Sons(1987)所述。滤器用速溶脱脂奶粉(100ml PBS中1gm)封闭后，抗LMP抗体加入滤器并室温孵育1小时。滤器用磷酸缓冲盐水(PBS)充分洗并用山葵过氧化物酶(HRPO)-抗体缀合物室温孵育1小时。滤器再次用PBS充分洗且抗原带通过加入二胺对二氨基联苯(DAB)来鉴定。
单一特异性抗体是本发明选择的试剂，更特定用于分析病人细胞与LMP表达相关的特异性质。如本文所用，“单一特异性抗体”定义为单个抗体种类或多抗体种类，抗体具有LMP同源结合性质。如本文所用，“同源结合”指抗体种类结合特异抗原或抗原表位的能力，例如如上所述与LMP相联的。LMP的单一特异性抗体从含抗LMP抗体的哺乳动物抗血清中纯化或制备为与LMP反应的单克隆抗体，用 Kohler 和Milstein、Kohler等，Nature，256，495-497(1975)的技术。LMP特异抗体通过免疫动物培养，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊或马，用适当浓度LMP，有或没有免疫佐剂。
在此过程中，初次免疫前收集预免疫血清。各动物接受约0.1mg和约1000mg间的LMP，如果需要LMP与可接受免疫佐剂相联。这种可接受免疫佐剂包括但不限于弗氏完全、弗氏不完全、明矾-沉淀、含棒状杆菌parvum的油中水乳剂和tRNA佐剂。初次免疫由LMP组成，优选弗氏完全佐剂以皮下(SC)、腹膜内(IP)或这两种方式注射到多个位置。各动物以固定间隔放血以确定抗体效价，优选每周。初次免疫后，动物可接受或不接受加强注射。接受加强注射的动物一般通过相同途径给予等量弗氏不完全佐剂中的抗原。加强注射以约3周间隔给予直到获得最大效价。各加强免疫后约7天或单次免疫后约一周，动物被放血，收集血清等分样品保存于约-20℃。
与LMP反应的单克隆抗体(mAb)通过用LMP免疫纯合小鼠来制备，优选Balb/c小鼠。小鼠通过IP或SC途径用约0.1mg到约10mg LMP免疫，优选约1mg，LMP在约0.5ml缓冲液或盐水中，如上所述结合等体积的可接受佐剂。优选弗氏完全佐剂。小鼠在第0天接受初次免疫并休息约3-30周。给予免疫小鼠一次或多次加强免疫，通过静脉内(IV)途径用约0.1到约10mg LMP免疫，LMP在缓冲溶液中如磷酸缓冲盐水。获得来自抗体阳性小鼠的淋巴细胞，优选脾淋巴细胞，通过本领域已知标准过程从免疫小鼠中取出脾。产生杂交瘤细胞通过脾淋巴细胞在可形成稳定杂交瘤的条件下混合适当融合伴侣，优选骨髓瘤细胞。融合伴侣可包括但不限于小鼠骨髓瘤P3/NS1/Ag4-1；MPC-11；S-194和Sp2/0，优选Sp2/0。抗体生成细胞和骨髓瘤细胞在约1000分子量的聚乙二醇中融合，浓度从约30％到约50％。融合的杂交瘤细胞通过在补给性Dulbecco修改Eagles培养基(DMEM)的次黄嘌呤、胸苷和氨喋呤中生长来选择，使用本领域已知过程。上清液在约第14、18和21天从生长阳性孔中收集，通过免疫测定如固相免疫放射测定(SPIRA)筛选抗体生成，LMP用作抗原。培养液也在Quchterlony沉淀测定中测试以确定同型mAb。来自抗体阳性孔的杂交瘤细胞通过技术克隆，如软琼脂技术， MacPherson，《软琼脂技术：组织培养方法和应用》(Soft Agar Techniques：Tissue Culture Methods andApplications)，Kruse和Paterson(编)，Academic Press(1973)。也参见 Harlow 等，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold SpringLaboratory(1988)。
到单克隆抗体也可体内生成，通过在灌注后4天用约2×106到约6×106个杂交瘤细胞注射姥鲛烷灌注的Balb/c小鼠，约0.5ml每只小鼠。腹水液在细胞转移后约8-12天收集，单克隆抗体通过本领域已知技术纯化。
在抗LMP mAb中进行体外生成通过杂交瘤细胞在含约2％胎牛血清的DMEM中生长以获得足够量的特异mAb。mAb通过本领域已知技术纯化。
腹水或杂交瘤培养液的抗体效价通过多种血清学或免疫测定来确定，包括但不限于沉淀、被动凝集、酶联免疫吸收抗体(ELISA)技术和放射性免疫测定(RIA)技术。类似测定用于检测体液或组织和细胞提取物中LMP的存在。
对于本领域技术人员显然的是上述产生单一特异性抗体的方法可用于生成特异于LMP多肽片段、全长新生LMP多肽、或其变体或等位基因的抗体。
在另一个实施方案中，发明涉及另外的HLMP-1剪接变体。PCR分析人心脏cDNA显示两种称为HLMP-2和HLMP-3的另外HLMP-1剪接变体的mRNA，它们与HLMP-1的差异在于HLMP-1序列中碱基对325-444间的区域。HLMP-2序列在此区域中具有119个碱基对缺失和17个碱基对插入。这些变化保存阅读框，产生423个氨基酸的蛋白质，与HLMP-1相比净失去34个氨基酸(40个氨基酸缺失加6个氨基酸插入)。HLMP-2包含HLMP-1中存在的c-末端LIM结构域。
与HLMP-1相比，HLMP-3没有缺失，但它确实在位置444有相同的17个碱基对插入。此插入使读框移位，导致在碱基对459-461的终止密码子。结果，HLMP-3编码153个氨基酸的蛋白质。此蛋白质缺乏HLMP-1和HLMP-2中存在的c-末端LIM结构域。由HLMP-2和HLMP-3编码蛋白质的预测大小通过蛋白质印迹分析确认。
PCR分析三种剪接变体的组织分布显示它们表达不同，特定同工型在不同组织中占优势。HLMP-1显然是白细胞、脾、肺、胎盘和胎儿肝中表达的主要形式。HLMP-2似乎是骨骼肌、骨髓和心脏组织中的主要同工型。然而，HLMP-3不是所检测组织中的主要同工型。
在大鼠造骨细胞二级培养物中过度表达HLMP-3诱导骨节形成(287±56)，与糖皮质激素(glucicorticoid)(272±7)和HLMP-1(232±200)所见的效果类似。由于HLMP-3缺乏C-末端LIM结构域，有的区域不需用于骨诱导活性。
然而，过度表达HLMP-2不诱导节形成(11±3)。这些数据表明骨诱导需要由缺失的119个碱基对编码的氨基酸。数据也表明HLMP剪接变体的分布可能对于组织特异性功能是重要的。令人惊讶的是，我们显示HLMP-2在大鼠造骨细胞二级培养物中抑制类固醇-诱导的造骨细胞形成。因此，HLMP-2可能在临床情况中有治疗效用，其中不需要骨形成。
在1997年7月22日，10-4/RLMP在名为pCMV2/RLMP的载体(它是载体pRc/CMV2，插入10-4克隆/RLMP)中，样品保存于美国模式培养物保藏所(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852。此保存的培养物登录号是209153。在1998年3月19日，载体pHis-A有HLMP-1s插入，样品保存于美国模式培养物保藏所(“ATCC”)。此保存的培养物登录号是209698。在2000年4月14日，质粒pHAhLMP-2(载体pHis-A有cDNA插入，cDNA获得自有HLMP-2的人心肌cDNA)和pHAhLMP-3(载体pHis-A有cDNA插入，cDNA获得自有HLMP-3的人心肌cDNA)，样品保存于ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA，20110-2209，USA，在布达佩斯条约条件下。这些保存的登录号分别是PTA-1698和PTA-1699。如布达佩斯条约所要求的，这些保存在ATCC中维持至少30年并可在显示它们的病人同意下对公众开放。应理解的是保存的可用性不许可实践试验发明去侵犯政府赋予病人的权利。
在评估发明的核酸、蛋白质或抗体中，使用酶测定、蛋白质纯化和其它常规生化方法。DNA和RNA分别用DNA印迹和RNA印迹技术分析。通常，所分析样品通过凝胶电泳进行大小分离。随后胶中的DNA或RNA转移到硝化纤维或尼龙膜。印迹是胶中样品模式的复制，随后与探针杂交。一般，探针用放射性同位素标记，优选32P，尽管可用其它本领域已知的信号-产生分子标记探针。感兴趣的特定带可随后通过检测系统显现，如放射自显影。
为了阐述本发明较佳实施方案的目的，下列非限制的例子被包括。这些结果证明诱导或提高骨形成的可行性，使用发明的LIM矿化蛋白、编码这些蛋白质的分离核酸分子。
实施例1：颅顶细胞培养
大鼠颅顶细胞也称为大鼠造骨细胞(“ROB”)，如前所述获得自20天预分娩的大鼠。 Boden等，Endocrinology，137，8，3401-3407(1996)。原代培养物生长到汇合(7天)，胰蛋白酶消化，传代到6孔板(1×105个细胞/35mm孔)作为初期传代细胞。传代细胞在第0天汇合，再生长7天。从第0天开始，每3或4天在层流净化罩下改变培养基且应用处理(Trm和/或BMPs)。标准的培养操作如下：第1-7天，MEM、10％FBS、50μg/ml抗坏血酸、±刺激；第8-14天，BGJb培养基、10％FBS、5mMβ-GlyP(作为无机磷酸来源以允许矿化)。骨节形成和骨钙蛋白分泌的终点分析在第14天进行。在此系统预实验基础上选择BMP剂量为50ng/ml，预实验显示中部范围对所有被研究BMPs的剂量反应曲线的效果。
实施例2：反义治疗和细胞培养
为研究LMP-1在膜骨形成中的潜在功能作用，我们合成了反义寡核苷酸以阻断LMP-1 mRNA翻译和处理正进行分化的二级造骨细胞培养物，分化由糖皮质激素起始。抑制RLMP表达用高度特异反义寡核苷酸(与已知大鼠序列没有显著同源性)完成，反义寡核苷酸对应于横跨推定翻译起始位置的25bp序列(SEQ.ID NO：42)。对照培养物没有接受寡核苷酸或接受反义寡核苷酸。
实验在脂转染胺存在(预孵育)和缺乏时进行。简言之，22μg有义或反义RLMP寡核苷酸在MEM中室温孵育45分钟。孵育后，加入更多MEM或预孵育的脂转染胺/MEM(7％v/v；室温孵育45分钟)以获得0.2μM浓度的寡核苷酸。所得混合物室温孵育15分钟。随后寡核苷酸混合物与适当培养基混合，即MEM/抗坏血酸盐/±Trm，以获得0.1μM终浓度的寡核苷酸。
细胞用适当培养基在合适寡核苷酸存在或缺乏时培养。原始用脂转染胺培养的培养物用培养基孵育(37℃；5％CO2)4小时后再养，培养基不含脂转染胺或寡核苷酸。所有培养物特别是接受寡核苷酸的培养物，每24小时再养以维持寡核苷酸水平。
LMP-1反义寡核苷酸以剂量-依赖方式抑制矿化节形成和骨钙蛋白分泌，类似于BMP-6寡核苷酸的效果。造骨细胞分化中的LMP-1反义阻断不能通过加入外源BMP-6恢复，而BMP-6反义寡核苷酸抑制通过加入BMP-6反转。此实验进一步确认LMP-1在造骨细胞分化途径中相对BMP-6的上游位置。LMP-1反义寡核苷酸也抑制原代大鼠造骨细胞培养物中的自发造骨细胞分化。
实施例3：矿化骨节形成的定量
根据实施例1和2制备的ROBs培养物在70％乙醇中过夜固定且用冯克普氏银染染色。半自动计算机化视频图象分析系统用于定量各孔中的节数和节面积。Boden等，Endocrinology，137，8，3401-3407(1996)。随后除以这些值以计算每节的面积值。此自动化过程根据手工计数技术验证且证明相关系数为0.92(p＜0.000001)。所有数据表示为平均数±平均数的标准偏差(S.E.M.)，在各情况下从5或6个孔计算。各实验用来自不同颅顶制品的细胞确认至少2次。
实施例4：骨钙蛋白分泌的定量
培养基中的骨钙蛋白水平用竞争性放射免疫测定测量，用我们实验室培养的单一特异性多克隆抗体(Pab)，抗大鼠骨钙蛋白的C-末端九肽，如 Nanes等，Endocrinology，127：588(1990)所述。简言之，1μg九肽用1mCi125I-Na通过乳过氧化物酶方法碘化。含200gl测定缓冲液(0.02M磷酸钠、1mM EDTA、0.001％硫柳汞、0.025％BSA)的管以测定缓冲液中100gl/管接受培养基，培养基取自细胞培养物或骨钙蛋白标准(0-12,000 fmole)。随后加入Pab(1∶40,000；100μl)，接着是碘化肽(12,000cpm；100μl)。测试非特异结合的样品制备类似，但不含抗体。
分开结合和游离的Pabs通过加入700μl山羊抗兔IgG，接着在4℃孵育18小时。样品以1200rpm离心15分钟后，轻轻倒出上清且沉淀在γ计数器中计数。骨钙蛋白值报导为fmole/100μl，随后通过将这些值除以100转化成fmole/ml培养基(3-天生成)。值表示为平均数±各情况中5-6孔三次确定的标准偏差(S.E.M.)。各实验用来自不同颅顶制品的细胞确认至少2次。
实施例5：Trm和RLMP对体外矿化的效果
有义或反义寡核苷酸对非刺激细胞培养系统中总体骨节生成的明显效果很小。然而当ROBs用Trm刺激时，RLMP的反义寡核苷酸抑制＞95％的节矿化。外源BMP-6加入寡核苷酸-处理的培养物不恢复RLMP-反义-处理节的矿化。
骨钙蛋白长期与骨矿化同义，骨钙蛋白水平与节生成和矿化相关。RLMP-反义寡核苷酸显著减少骨钙蛋白生成，但反义-处理培养物中的节计数没有显著变化。在此情况中，加入外源BMP-6仅恢复RLMP-反义-处理培养物中10-15％的骨钙蛋白生成。这表明RLMP的作用是下游，更特定是BMP-6下游。
实施例6：收集和纯化RNA
来自两倍孔ROBs的细胞RNA(根据实施例1和2在6孔培养皿中制备)用4M异硫氰酸酯(GIT)溶液收集以产生三倍统计。简言之，培养物上清从孔中吸出，然后覆盖用0.6ml GIT溶液每双倍孔收集。加入GIT溶液后，平板涡旋5-10秒(尽可能一致)。进一步加工前，样品保存于-70℃至多7天。
RNA通过稍微修改的标准方法纯化，根据 Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》，7.19，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)。简言之，解冻样品接受60μl2.0M乙酸钠(pH4.0)、550μl酚(水饱和)和150μl氯仿∶异戊醇(49∶1。涡旋后，离心样品(10000xg；20分钟；4℃)，水相转移到新管，加入600μl异丙醇且RNA在-20℃过夜沉淀。
过夜孵育后，离心样品(10000xg；20分钟)，温和吸出上清。沉淀重悬浮于400μl DEPC-处理水，用酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，加入40μl乙酸钠(3.0M；pH5.2)和1.0ml无水乙醇后，-20℃过夜沉淀。为回收细胞RNA，离心样品(10000xg；20分钟)，用70％乙醇洗，空气干燥5-10分钟并重悬浮于20μlDEPC-处理水。RNA浓度从分光光度计确定的光密度计算。
实施例7：反转录酶链式反应25
加热的总RNA(5μg在10.5μl总体积DEPC-H2O中，65℃ 10分钟)加入管，管含4μl 5X MMLV-RT缓冲液、2μl dNTPs、2μl dT17引物(10pmol/ml)、0.5μlRNAsin(40U/ml)和1μl MMLV-RT(200单位/μl)。样品在37℃孵育1小时，随后95℃5分钟以灭活MMLV-RT。加入80μl水来稀释样品。
反转录样品(5μl)用标准方法(50μl总体积)进行聚合酶链式反应。简言之，样品加入管中，管含水和适当量的PCR缓冲液、25mM MgCl2、dNTPs、用于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP，管家基因)的正向和反向引物和/或BMP-6、32P-dCTP和Taq聚合酶。除非另有说明，引物标准化以在22个循环恒定运行(94℃，30”；58℃，30”；72℃，20”)。
实施例8：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和磷成像仪分析来定量RT-PCR产物
RT-PCR产物接受5μl/管的加样染料，混合，65℃加热10分钟并离心。10μl的各反应在标准条件下进行PAGE(12％聚丙烯酰胺：bis；15V/孔；恒定电流)。胶随后在胶保存缓冲液(10％v/v甘油、7％v/v乙酸、40％v/v甲醇、43％去离子水)中孵育30分钟，真空干燥(80℃)1-2小时，用电子增强的磷光成像系统显影6-24小时。分析显现的带。根据每条带的计数绘图。
实施例9：差异显示PCR
RNA从糖皮质激素(Trm，1nM)刺激的细胞中提取。加热、DNA酶-处理的总RNA(5μg在10.5μl总体积DEPC-H2O中，65℃10分钟)，如实施例7所述反转录，但H-T11M(SEQ.ID.NO：4)用作MMLV-RT引物。如上所述，所得cDNAs用PCR扩增，但用不同商业引物组(例如H-T11G(SEQ.ID.NO：4)和H-AP-10(SEQ.ID.NO：5)；GenHunter Corp，Nashville，TN)。放射性标记的PCR产物在DNA测序胶上通过凝胶电泳分离。电泳后，所得胶真空干燥且放射自显影过夜曝光。表现不同表达cDNAs的带从胶中切下并通过PCR再扩增，使用 Conner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，278(1983)的方法。PCR再扩增产物克隆到载体PCR-11(TA克隆试剂盒；InVitrogen，Carlsbad，CA)。
实施例10：筛选UMR 106大鼠骨肉瘤细胞cDNA文库
UMR 106文库(2.5×1010pfu/ml)以5×104pfu/ml在琼指平板(LB底部琼指)上培养，平板在37℃过夜培养。滤膜覆盖在平板上2分钟。一旦取出，滤器被变性、冲洗、干燥和UV-交联。随后滤膜在预杂交缓冲液(2X PIPES[pH6.5]、5％甲酰胺、1％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA)中42℃孵育2小时。260个碱基对放射性标记的探针(SEQ.ID.NO：3；通过随机引物标记32P)加入完整的杂交混合物/滤器，接着在42℃杂交18小时。膜在室温洗1次(10分钟，1xSSC、0.1％SDS)和55℃洗3次(15分钟，0.1xSSC、0.1％SDS)。
洗后，膜通过上述放射自显影分析。阳性克隆用噬斑纯化。此过程用第二种滤器重复4分钟以最小化假阳性。噬斑纯化的克隆作为λSK(-)噬菌粒恢复。克隆的cDNAs如下所述测序。
实施例11：测序克隆
克隆的cDNA插入通过标准方法测序。 Ausubel等，《分子生物的当前操作》，Wiley Interscience(1988)。简言之，适当浓度的终止混合物、模板和反应混合物接受合适循环操作(95℃，30秒；68℃，30秒；72℃，60秒；x25)。加入终止混合物以终止测序反应。92℃加热3分钟后，样品加样到6％变性聚丙烯酰胺测序胶(29∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)。样品以60伏、恒定电流电泳约4小时。电泳后，胶在真空干燥并放射自显影。
放射自显影用手工分析。所得序列根据数据库筛选，数据库由国家生物技术信息中心维持(NIH，Bethesda，MD；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，BLASTN程序用默认参数。在序列数据基础上，制备新的测序引物且重复此过程直到完整的基因被测序。所有序列以两个方向最少确认3次。
也用PCGENE软件包(16.0版本)分析核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列的百分比同源性值由程序NALIGN计算，使用下列参数：非匹配核苷酸重量，10；非匹配缺口重量，10；最大考虑核苷酸数量，50；最小考虑核苷酸数量，50。
对于氨基酸序列，计算百分比同源性值用PALIGN。开放缺口成本和单位缺口成本都选择10的值。
实施例12：克隆RLMP cDNA
实施例9所述差异显示的PCR扩增产物包含约260碱基对的主要带。此序列用于筛选大鼠骨肉瘤(UMR 106)cDNA文库。阳性克隆进行巢式引物分析以获得扩增全长cDNA(SEQ.ID Nos：11、12、29、30和31)所需的引物序列。用于进一步研究的所选阳性克隆之一命名为克隆10-4。
克隆10-4中全长cDNA的序列分析由巢式引物分析确定，显示克隆10-4包含通过差异显示PCR鉴定的原始260碱基对片段。克隆10-4(1696个碱基对；SEQ.IDNO：2)包含1371个碱基对的可读框，编码的蛋白质有457个氨基酸(SEQ.ID NO：1)。终止密码子TGA出现在核苷酸1444-1446。核苷酸1675-1680的多腺苷酸信号和相邻聚(A)+尾存在于3’非编码区。有两个潜在N-糖基化位点天冬酰胺-赖氨酸-苏氨酸和天冬酰胺-精氨酸-苏氨酸，分别在SEQ.ID NO：1的氨基酸位置113-116和257-259。两个潜在的cAMP-和cGMP-依赖的蛋白激酶磷酸化位点丝氨酸和苏氨酸分别发现于氨基酸位置191和349。有五个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点丝氨酸或苏氨酸，在氨基酸位置3、115、166、219和442。一个潜在的ATP/GTP结合位点基序A(P-环)甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-赖氨酸-苏氨酸，确定在氨基酸位置272-279。
此外，两个高度保守的推定LIM结构域在氨基酸位置341-391和400-451发现。此新鉴定大鼠cDNA克隆中的推定LIM结构域显示与其它已知LIM蛋白的LIM结构域显著同源。然而，与其它大鼠LIM蛋白的总体同源性小于25％。RLMP(也称为10-4)与人enigma蛋白(参见美国专利号5,504,192)有78.5％的氨基酸同源性，但与其最近的大鼠同系物CLP-36和RIT-18仅分别有24.5％和22.7％的氨基酸同源性。
实施例13：RNA印迹分析RLMP表达
来自ROBs的30μg总RNA根据实施例1和2制备，在1％琼脂糖平板胶(agaroseflatbed gel)中通过甲醛凝胶电泳分离大小并渗透转印迹到尼龙膜。印迹用全长10-4cDNA的600碱基对 EcoR1片段探测，cDNA通过随机引物标记32P-dCTP。
RNA印迹分析显示1.7kb mRNA种类与RLMP探针杂交。暴露于BMP-6 24时后，RLMP mRNA在ROBs中上调约3.7倍。在BMP-2或BMP-4刺激的ROBs中24小时时没有发现RLMP表达上调。
实施例14：统计方法
对于各报导的节/骨钙蛋白结果，来自代表实验5-6孔的数据用于计算平均数±S.E.M.。图可用相对各参数最大值标准化的数据显示以同时做出骨计数、矿化区域和骨钙蛋白的图。
对于各报导的RT-PCR、RNA酶保护测定或蛋白质印迹分析，来自代表实验三倍样品的数据用于确定平均数±S.E.M.。显示的图可相对第0天或负对照标准化且表示为超过对照值的倍数。
评估统计显著性用单向方差分析，适当时可采用Bonferroni的post-hoc多种比较修正。 D.V.Huntsberger，“方差分析”(The Analysis of Variance)，《统计方差要素》(Elements of Statistical Variance)，P.Billingsley(编)，Allyn &Bacon Inc.，Boston，MA，298-330(1977)和SigmaStat，Jandel Scientific，CorteMadera，CA。显著性的α水平定义为p＜0.05。
实施例15：通过蛋白质印迹分析检测大鼠LIM矿化蛋白
多克隆抗体根据 England等，Biochim.Biophys.Acta，623，171(1980)和 Timmer 等，J.Biol.Chem.，268，24863(1993)的方法制成。
海拉细胞用pCMV2/RLMP转染。蛋白质从转染细胞中收集，根据 Hair等，Leukemia Research，20，1(1996)的方法。进行蛋白质印迹分析新生RLMP，如 Towbin 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：4350(1979)所述。
实施例16：获得自人PCR产物的大鼠LMP-独特(RLMPU)的合成
在大鼠LMP-1 cDNA序列基础上，合成正向和反向PCR引物(SEQ.ID NO：15和16)，独特的223碱基对序列从大鼠LMP-1 cDNA中PCR扩增。类似的PCR产物用相同的PCR引物从人MG63骨肉瘤细胞cDNA中分离。
RNA从生长于T-75瓶的MG63骨肉瘤细胞中收集。吸出培养物上清，瓶用3.0mlGIT溶液每双倍覆盖，涡旋5-10秒，所得溶液转移到1.5ml离心管(6管，0.6ml/管)。RNA通过稍微修改的标准方法纯化，例如参见 Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》，第7章，19页，Cold Spring Harbor Press(1989)和 Boden等，Endocrinology，138，2820-2828(1997)。简言之，0.6ml样品接受60μl 2.0M乙酸钠(pH4.0)、550μl水饱和的酚和150μl氯仿∶异戊醇(49∶1)。加入这些试剂后，涡旋样品，离心(10000xg；20分钟；4℃)，水相转移到新管。加入异丙醇(600μl)且RNA在-20℃过夜沉淀。离心样品(10000xg；20分钟)，温和吸出上清。沉淀重悬浮于400μl DEPC-处理水，用酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，在40μl乙酸钠(3.0M；pH5.2)和1.0ml无水乙醇中-20℃过夜沉淀。沉淀后，离心样品(10000xg；20分钟)，用70％乙醇洗一次，空气干燥5-10分钟并重悬浮于20μl DEPC-处理水。RNA浓度从光密度获得。
总RNA(5μg在10.5μl总体积DEPC-H2O中)在65℃加热5分钟，随后加入管，管含4μl 5X MMLV-RT缓冲液、2μl dNTPs、2μl dT17引物(10pmol/ml)、0.5μlRNAsin(40U/ml)和1μl MMLV-RT(200单位/μl)。反应在37℃孵育1小时。之后95℃加热5分钟以灭活MMLV-RT。加入80μl水来稀释样品。
反转录样品(5μl)用标准方法(50μl总体积)进行聚合酶链式反应。Boden等，Endocrinology，138，2820-2828(1997)； Ausubel等，“通过聚合酶链式反应定量稀有DNA”(Quantitation of Rare DNAs by the Polymerase Chain Reaction)《分子生物的当前操作》，15.31-1章，Wiley & Sons，Trenton，NJ(1990)。简言之，样品加入管中，管含水和适当量的PCR缓冲液(25mM MgCl2、dNTPs、正向和反向引物(用于RLMPU；SEQ.ID NOS：15和16)、32P-dCTP和DNA聚合酶。设计引物恒定运行22个循环用于放射性带检测以及33循环用于扩增PCR产物用作筛选探针(94℃，30”；58℃，30”；72℃，20”)。
测序琼脂糖胶-纯化、获得自MG63骨肉瘤的PCR产物显示序列与RLMPU PCR产物同源性大于95％。此序列命名为HLMP独特区(HLMPU；SEQ.ID NO：6)。
实施例17：筛选逆转录酶获得的MG63 cDNA
筛选用PCR进行，使用实施例17所述特异引物(SEQ.ID NOS：16和17)。717个碱基对的MG63 PCR产物通过琼脂糖胶纯化并用特定引物(SEQ.ID NOs：12、15、16、17、18、27和28)测序。序列以两个方向最少确认2次。MG63序列相互排列，随后相对全长大鼠LMP cDNA序列排列以获得部分人LMP cDNA序列(SEQ.ID NO：7)。
实施例18：筛选人心脏cDNA文库
在RNA印迹实验基础上，确定不同组织以不同水平表达LMP-1，包括人心肌。因此检测人心脏cDNA文库。文库以5×104pfu/ml在琼指平板(LB底部琼指)上培养，平板在37℃过夜培养。滤膜覆盖在平板上2分钟。一旦取出，滤器被变性、冲洗、干燥和UV-交联并在预杂交缓冲液(2X PIPES[pH6.5]；5％甲酰胺、1％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA)中42℃孵育2小时。加入放射性标记、LMP-独特的223个碱基对探针(32P，随机引物标记；SEQ.ID.NO：6)且42℃杂交18小时。杂交后，膜在室温洗1次(10分钟，1xSSC、0.1％SDS)和55℃洗3次(15分钟，0.1xSSC、0.1％SDS)。双重阳性噬斑纯化的心脏文库克隆通过放射自显影鉴定，根据厂商操作恢复为λ噬菌粒。
限制性消化阳性克隆产生不同大小的cDNA插入。通过测序选择长度大于600个碱基对的插入用于初始筛选。这些插入通过实施例11所述标准方法测序。
7号克隆也进行自动序列分析，所用引物对应于SEQ.ID NOS：11-14、16和27。这些方法所得序列一般是97-100％同源。克隆7(来自心脏文库的部分人LMP-1 cDNA序列；SEQ.ID.NO：8)包含的序列与大鼠LMP cDNA序列在翻译区同源性大于87％。
实施例19：确定全长人LMP-1 cDNA
MG63人骨肉瘤细胞cDNA序列和人心脏cDNA克隆7序列的重叠区用于排列这两个序列并获得1644个碱基对的完整人cDNA序列。PCGENE软件包中的程序NALIGN用于这两个序列。两个序列的重叠区构成约360个碱基对，完全同源，除了MG63cDNA的核苷酸672有单核苷酸取代(SEQ.ID.NO：7)而克隆7在对应核苷酸516是”A”而不是”G”(SEQ.ID.NO：8)。
两个排列序列用另一种PCGENE子程序SEQIN连接，用”G”取代MG63骨肉瘤cDNA克隆。所得序列示于SEQ.ID.NO：9。排列来自于人的新序列和大鼠LMP-1 cDNA用NALIGN完成。全长人LMP-1 cDNA序列(SEQ.ID.NO：9)与大鼠LMP-1 cDNA序列翻译部分87.3％同源。
实施例20：确定人LMP-1的氨基酸序列
人LMP-1的推定氨基酸序列用PCGENE子程序TRANSL确定。SEQ.ID.NO：9中可读框编码的蛋白质含457个氨基酸(SEQ.ID.NO：10)。用PCGENE子程序Palign，发现人LMP-1氨基酸序列与大鼠LMP-1氨基酸序列94.1％同源。
实施例21：确定人LMP-1 cDNA的5引物(Prime)未翻译区
MG63 5’cDNA通过MG63总RNA的巢式RT-PCR扩增，用5’迅速扩增cDNA末端(5’RACE)操作。此方法包括用锁-对接(lock-docking)寡(dT)引物合成第一条cDNA链，引物在3’末端有两个简并核苷酸位置( Chenchik等，CLONTECHniques，X：5(1995)； Borson等，PC Methods Applic.，2，144(1993))。合成第二条链根据 Gubler 等，Gene，2，263(1983)的方法进行，用大肠杆菌DNA聚合酶1、RNase H和大肠杆菌DNA连接酶的混合物。用T4 DNA聚合酶产生钝端后，双链cDNA连接到片段(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’)(SEQ.ID.NO：19)。RACE前，衔接子连接的cDNA稀释到适于Marathon RACE反应的浓度(1∶50)。随后可特异克隆衔接子连接的双链cDNA。
进行第一轮PCR，衔接子特异性寡核苷酸5’-CCATCCTAATACGACTCACTATA GGGC-3’(AP1)(SEQ.ID.NO：20)作为有义引物，基因特异引物(GSP)来自实施例16所述独特区(HLMPU)。进行第二轮PCR，用巢式引物GSP1-HLMPU(反义/反向引物)(SEQ.ID.NO：23)和GSP2-HLMPUF(SEQ.ID.NO：24)(参见实施例16；有义/正向引物)。PCR用商业试剂盒(优势cDNA PCR核心试剂盒；CloneTech Laboratories Inc.，PaloAlto，CA)进行，此试剂盒使用抗体-调节但却标准、热启动的操作。M663 cDNA的PCR条件包括开始的热启动变性(94℃，60秒)，接着：94℃，30秒；60℃，30秒；68℃，4分钟；30个循环。第一轮PCR产物长度约750个碱基对而巢式PCR产物约230个碱基对。第一轮PCR产物克隆到线性pCR2.1载体(3.9Kb)。插入用M13正向和反向引物(SEQ.ID.NO：11；SEQ.ID.NO：12)以两个方向测序。
实施例22：确定具5端UTR的全长人LMP-1 cDNA
排列重叠的M663人骨肉瘤细胞cDNA 5’-UTR序列(SEQ.ID.NO：21)、MG63 717个碱基对序列(实施例17；SEQ.ID.NO：8)和人心脏cDNA克隆7序列(实施例18)以获得1704个碱基对的人cDNA新序列(SEQ.ID.NO：22)。排列用NALIGN(PCGENE和Omiga 1.0；Intelligenetics)完成。重叠序列几乎100％同源构成完整的717个碱基对序列(实施例17)。排列序列的连接用SEQIN完成。
实施例23：构建LIM蛋白表达载体
构建pHIS-5ATG LMP-1s表达载体用实施例17和18所述序列完成。717个碱基对克隆(实施例17；SEQ.ID.NO：7)用 ClaI和 EcoRV消化。胶纯化小片段(约250个碱基对)。克隆7(实施例18；SEQ.ID.NO：8)用 ClaI和 XbaI消化且1400个碱基对片段用胶纯化。连接分离的250个碱基对和1400个碱基对限制性片段以形成约1650个碱基对片段。
由于克隆7中的单核苷酸取代(相对717个碱基对PCR序列和原始大鼠序列)，在翻译的碱基对672产生终止密码子。由于此终止密码子，截短(短)蛋白被编码，因此命名为LMP-1s。这是用于表达载体的构建(SEQ.ID.NO：32)。具5’UTR的全长cDNA序列通过排列SEQ.ID.NO：32和5’RACE序列(SEQ.ID.NO：21)而产生。随后LMP-1s的氨基酸序列推断为223个氨基酸蛋白并通过蛋白质印迹确认(如实施例15)，跑在约23.7kD的预计分子量。
pHis-ATG载体(InVitrogen，Carlsbad，CA)用 EcoRV和 XbaI消化。回收载体，随后650个碱基对的限制性片段连入线性pHis-ATG。克隆并扩增连接产物。pHis-ATG-LMP-1s表达载体也命名为插入HLMP-1s的pHIS-A，通过标准方法纯化。
实施例24：用LIM表达载体体外诱导骨节形成和矿化
根据实施例1分离大鼠颅顶细胞并生长于二级培养物。不刺激培养物或用实施例1所述糖皮质激素(GC)刺激。根据实施例25，修改的Superfect试剂(Qiagen，Valencia，CA)转染操作用于将3μg/孔的各载体转染到大鼠颅顶造骨细胞二级培养物中。
矿化节通过冯克普氏染色呈现，如实施例3所述。人LMP-1s基因产物过度表达单独诱导体外骨节形成(约230个节/孔)。节的水平约为GC正对照(约412个节/孔)的50％。其它正对照包括pHisA-LMP-大鼠表达载体(约152个节/孔)和pCMV2/LMP-大鼠-正向表达载体(约206个节/孔)，而负对照包括pCMV2/LMP-大鼠-反向表达载体(约2个节/孔)和未处理(NT)平板(约4个节/孔)。这些数据证明人cDNA至少和大鼠cDNA一样诱导骨。效果小于GC刺激所观察到的，最有可能是因为表达载体剂量不最理想。
实施例25：LIM-诱导的体外和体内细胞分化
克隆10-4中的大鼠LMP cDNA(参见实施例12)从载体中切下，这是通过 NotI和 ApaI 37℃过夜双重消化克隆。载体pCMV2 MCS(InVitrogen，Carlsbad，CA)用相同的限制性酶消化。来自克隆10-4的线性cDNA片段和pCMV2都用胶纯化，提取和T4连接酶连接。连接的DNA用胶纯化，提取和用于转化大肠杆菌JM109细胞以扩增。挑出阳性琼脂菌落，用 NotI和 ApaI消化，限制性消化通过凝胶电泳检测。保存培养物由阳性克隆制备。
反向载体以类似方式制备，除了所用的限制性酶是 XbaI和 HindIII。由于使用这些限制性酶，来自克隆10-4的LMP cDNA片段以反(即不能翻译)方向插入pRc/CMV2。生成的重组载体名为pCMV2/RLMP。
适当量的pCMV10-4(60nM终浓度最佳[3μg]；对于此实验，优选0-600nM/孔[0-30μg/孔]的终浓度范围)重悬浮于基本Eagle培养基(MEM)至450μl终体积，涡旋10秒。加入Superfect(7.5μl/ml终溶液)，溶液涡旋10秒，随后室温孵育10分钟。孵育后，加入添加10％FBS的MEM(1ml/孔；6ml/平板)并通过抽吸混合。
然后所得溶液迅速吸到(1ml/孔)洗过的ROB培养物上。培养物在含5％CO2的潮湿空气中37℃孵育2小时。之后，细胞用无菌PBS温和洗一次且加入适当的正常孵育培养基。
结果证明用pCMV10-4诱导的所有大鼠细胞培养物中骨节形成显著。例如，pCMV10-4转染的细胞产生429个节/孔。暴露于Trm的正对照培养物产生460个节/孔。相反，没有接受处理的负对照产生1个节/孔。类似的，培养物用pCMV10-4(反向)转染，没有观察到节。
为证明体内重新骨形成，骨髓从4-5周大正常大鼠(rnu/+；隐性无胸腺杂合)后肢中吸出。吸出的骨髓细胞在αMEM中洗，离心，裂解RBCs，这是通过沉淀重悬浮于10mM Tris(pH7.4)中的0.83％NH4Cl。剩余骨髓细胞用MEM洗3次，用9μgpCMV-LMP-1s(正或反向)每3×106个细胞转染2小时。随后，转染细胞用MEM洗2次并以3×107个细胞/ml的浓度重悬浮。
细胞悬浮液(100μl)经无菌移液管应用到无菌2×5mm I型牛胶原盘(SulzerOrthopaedics，Wheat Ridge，CO)。盘通过手术皮下移植到4-5周大无胸腺大鼠(rnu/rnu)的头骨、胸、腹或背鳍鳍棘。动物在第3-4周杀死，此时切下盘或手术区域并固定在70％乙醇中。固定样本通过放射显影分析，在5μm厚切片上进行未脱钙组织检测，切片用三色Goldner染色。实验也用早衰(胍提取)去矿化骨基质(Osteotech，Shrewsbury，NJ)取代胶原盘进行。
放射显影显示高水平的矿化骨形成，与形成原始胶原盘符合，胶原盘含LMP-1s转染的骨髓细胞。在负对照(用反向形式的LMP-1s cDNA转染细胞，此cDNA不编码翻译蛋白)中没有观察到矿化骨形成，载体吸收似乎进行很好。
组织学显示新骨小梁在LMP-1s转染移植中沿造骨细胞排列。在负对照中没有发现骨与部分重吸收载体一起。
放射显影进一步的实验，其中18组(9个负对照pCMV-LMP-反向&9个实验性pCMV-LMP-1s)移植加入无胸腺大鼠腰或胸脊柱位置，证明0/9负对照移植表现出椎骨间的骨形成(脊柱融合)。所有9个pCMV-LMP-1s处理的移植表现出椎骨间的固体骨融合。
实施例26：来自实施例2和3所示序列的pHIS-5’ATG LIM-1s表达载体的合成
717个碱基对的克隆(实施例17)用 ClaI和 EcoRV(New England Biologicals，city，MA)消化。胶纯化小片段(约250个碱基对)。克隆7(实施例18)用 ClaI和XbaI消化。1400个碱基对的片段从此消化中胶纯化。通过标准方法连接分离的250个碱基对和1400个碱基对cDNA片段以形成约1650bp片段。pHisA载体(InVitrogen)用 EcoRV和 XbaI消化。回收线性载体并连入嵌合的1650个碱基对cDNA片段。通过标准方法克隆并扩增连接产物，pHis-ATG-LMP-1s表达载体也命名为插入HLMP-1s的pHIS-A，如前所述保存于ATCC。
实施例27：用pHis-5’ATG LIM-1s表达载体体外诱导骨节形成和矿化
根据实施例1分离大鼠颅顶细胞并生长于二级培养物。不刺激培养物或根据实施例1用糖皮质激素(GC)刺激。如实施例25所述，培养物用3μg重组pHis-A载体DNA/孔转染。根据实施例3，矿化节通过冯克普氏染色呈现。
人LMP-1s基因产物过度表达单独(即没有GC刺激)体外诱导显著骨节形成(约203个节/孔)。这约为暴露于GC正对照的细胞所产生节数量(约412个节/孔)的50％。用pHisA-LMP-大鼠表达载体(约152个节/孔)和pCMV2/LMP-大鼠-正向(约206个节/孔)转染培养物获得类似结果。相反，负对照pCMV2/LMP-大鼠-反向产生(约2个节/孔)，而未处理平板中发现约4个节/孔。这些数据证明在此模型系统中人LMP-1 cDNA至少和大鼠LMP-1 cDNA一样诱导骨。此实验的效果小于GC刺激所观察到的；但某些效果可以相比。
实施例28：LMP诱导可溶骨诱导因子的分泌
如实施例24所述，在大鼠颅顶造骨细胞培养物中过度表达RLMP-1或HLMP-1s导致节形成显著高于负对照中所观察到的。为研究LIM矿化蛋白作用机制，在不同时间点收集条件培养基，浓缩到10X，无菌过滤，在含新鲜血清的培养基中稀释到其原始浓度，应用于未转染细胞4天。
条件培养基在第4天从RLMP-1或HLMP-1s转染的细胞中收集，它诱导节形成的有效性几乎与转染细胞中直接过量表达RLMP-1一样。来自转染反向RLMP-1或HLMP-1的细胞的条件培养基对节形成没有明显效果。第4天之前从LMP-1转染培养物中收集的条件培养基也不诱导节形成。这些数据表明LMP表达引起可溶因子的合成和/或分泌，可溶因子不以有效量出现在培养基中，直到转染后4天。
由于过度表达rLMP-1导致骨诱导因子分泌到培养集中，蛋白质印迹分析用于确定LMP-1蛋白是否存在于培养集中。RLMP-1蛋白的存在用特异于LMP-1(QDPDEE)的抗体评估并通过常规方法检测。LMP-1蛋白仅在培养的细胞层发现且培养基中没有检测到。
完成骨诱导可溶因子的部分纯化通过标准25％和100％硫酸铵切，接着用DE-52阴离子交换分批层析(100mM或500mM NACl)。所有活性在高硫酸铵、高NaCl部分观察到。这种局部化与单个因子限制培养基的可能性一致。
实施例29：基因治疗低剂量腺病毒调节的腰脊柱融合
此研究确定腺病毒传递LMP-1 cDNA(SEQ.ID.NO：2)的最佳剂量，用于促进正常即免疫感受态兔中的脊柱融合。
复制-缺陷的人重组腺病毒用LMP-1 cDNA(SEQ.ID.NO：2)构建，由CMV启动自驱动，使用Adeno-QuestTM试剂盒(Quantum Biotechnologies，Inc.，Montreal)。商业购买(Quantum Biotechnologies，Inc.，Montreal)的重组腺病毒包含β-半乳糖苷酶基因，用作对照。
最初，进行体外剂量反应实验以确定腺病毒-传递LMP-1(”AdV-LMP-1”)的最佳浓度以诱导大鼠颅顶造骨细胞培养物中的骨分化，用0.025、0.25、2.5或25噬斑形成单位(pfu)病毒每细胞的感染复数(”MOI”)转导60分钟。正对照培养物通过7天暴露于109M糖皮质激素(”GC”)分化。负对照培养物不处理。在第14天，冯克普氏染色培养物后计算矿化骨节数量，分泌到培养基的骨钙蛋白水平(pmol/mL)通过放射免疫测定测量(平均数±SEM)。
此实验结果示于表1。在未处理的负对照培养物中几乎没有自发节形成。数据显示相当于0.25pfu/细胞的MOI对于诱导骨节最有效，达到的水平可与正对照(GC)相比。更低和更高剂量的腺病毒效果更小。
                                          表1
结果             Adv-LMP-1剂量(MOI)
负对照 GC 0.025 0.25  2.5 25
骨节 0.5±0.2 188±35 79.8±13 145.1±13  26.4±15 87.6±2
骨钙蛋白 1.0±.1 57.8±9 28.6±11 22.8±1  18.3±3 26.0±2
随后进行体内实验以确定最佳体外剂量是否能促进骨骼成熟的新西兰白兔中横突间加工(intertransverse process)脊柱融合。麻醉9只兔，3cc骨髓用18规格针经髁间凹口从末梢腿节吸出。然后分离淡黄色外层，用Adv-LMP-1转导10分钟，细胞返回到手术室用于移植。单一水平的后外侧腰脊柱关节固定术通过去横皮质过程和插入载体(兔早衰骨基质或胶原海绵)进行，载体含800到1500万自身有核淡黄色包被细胞，细胞用Adv-LMP-1(MOI＝0.4)或AdV-BGal(MOI＝0.4)转导。5周后兔被施以安乐死，脊柱融合通过手工触诊、简单的x光、CT扫描和不脱钙组织学评估。
在所有9只兔中，接受Adv-LMP-1的脊柱融合位置诱导固体、连续的脊柱融合块。相反，接受AdV-Bgal或更低剂量Adv-LMP-1(MOI＝0.4)的位置产生很少或没有骨，导致脊柱融合速度可与单独载体相比(＜40％)。这些结果与手工触诊、CT扫描和组织学评估一致。然而，简单的放射显影有时过高估计骨存在的量，特别在对照位置。两种测试载体物质的LMP-1 cDNA传递和骨诱导都成功。没有证据表明对腺病毒载体的全身或局部免疫反应。
这些数据证明在以前确认的兔脊柱融合模型中的恒定骨诱导，这是很挑战性的。此外，在外科手术体外基因转导时用自身骨髓细胞的操作(10分钟)比其它方法更具临床可行性，其它方法需要过夜转导或细胞扩增几周培养。另外，最有效的重组腺病毒剂量(MOI＝0.25)显著低于其它基因治疗应用(MOI 40-500)报导的剂量。我们认为这是由于LMP-1是胞内信号分子且可能有强大的的信号扩大级联。此外，在细胞培养中诱导骨的相同浓度Adv-LMP-1在体内有效，此发现也令人惊讶，因为从细胞培养转移到动物实验时，通常需要增加其它生长因子剂量。结合到一起，这些观察说明用腺病毒传递LMP-1 cDNA的局部基因治疗是可行的且所需低剂量可能最小化免疫反应对腺病毒载体的负效果。
实施例30：使用外周静脉血有核细胞(淡黄色包被)以通过LMP-1 cDNA基因治 疗产生骨
我们在4只兔中如上进行脊柱融合手术(实施例29)，除了转导细胞是来自静脉血的淡黄色包被，而不是骨髓。这些细胞用腺-LMP或pHIS-LMP质粒转染，具有的成功结果与用骨髓细胞时相同。发现普通静脉血细胞用于基因传递使基因治疗在临床上更可行，因为它避免了全身麻醉下痛苦的骨髓收集且产生2倍细胞每mL起始物质。
实施例31：分离人LMP-1剪接变体
内含子/外显子mRNA转录剪接变体在信号转导和细胞/组织发育中是相对普通的调节机制。不同基因的剪接变体显示改变蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA和蛋白质-底物相互作用。剪接变体也能控制基因表达的组织特异性，使不同形式(以及因而的功能)可在多种组织中表达。剪接变体是细胞中普遍的调节现象。可能LMP剪接变体能在其它组织中产生效果，如神经再生、肌肉再生或其它组织的发育。
为筛选人心脏cDNA文库中HLMP-1序列的剪接变体，制备一对PCR引物对应于SEQ.ID NO：22部分。正向PCR引物用标准技术合成，对应于SEQ.ID NO：22的核苷酸35-54。它具有下列序列：
5’GAGCCGGCATCATGGATTCC 3’(SEQ.ID NO：35)
反向PCR引物是SEQ.ID NO：22中核苷酸820-839的反向互补，具有下列序列：
5’GCTGCCTGCACAATGGAGGT 3’(SEQ.ID NO：36)
正向和反向PCR引物用于通过标准技术筛选人心脏cDNA(ClonTech，货号7404-1)中类似HLMP-1的序列，使用循环操作94℃30秒，64℃30秒和72℃1分钟，重复30次，接着72℃孵育10分钟。cDNA序列扩增用胶纯化并提交Emory DNA序列核心设备以测序。克隆用标准技术测序，序列用PCGENE(intelligenetics；程序SEQUIN和NALIGN)检测以确定与SEQ.ID NO：22的同源性。与SEQ.ID NO：22相比，具另外剪接位置的两种同源核苷酸序列随后用Intelligenetic的程序TRANSL翻译成它们各自的蛋白质产物。
这两种新的人cDNA序列之一(SEQ.ID NO：37)包括1456bp：
CGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG    60
GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT    120
GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC    180
GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA    240
GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG    300
                           X                 X
CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAG GTGCAG ACCCCTGACA AACAGCCGCT CCGACCGCTG 360
GTCCCAGATG CCAGCAAGCA GCGG CTGATG GAGAACACAG A GGACTGGCG GCCGCGGCCG  420
GGGACAGGCC AGTCGCGTTC CTTC CGCATC CTTGCCCACC T CACAGGCAC CGAGTTCATG  480
CAAGACCCGG ATGAGGAGCA CCTG AAGAAA TCAAGCCAGG T GCCCAGGAC AGAAGCCCCA  540
GCCCCAGCCT CATCTACACC CCAG GAGCCC TGGCCTGGCC C TACCGCCCC CAGCCCTACC  600
AGCCGCCCGC CCTGGGCTGT GGAC CCTGCG TTTGCCGAGC G CTATGCCCC GGACAAAACG  660
AGCACAGTGC TGACCCGGCA CAGC CAGCCG GCCACGCCCA C GCCGCTGCA GAGCCGCACC  720
TCCATTGTGC AGGCAGCTGC CGGA GGGGTG CCAGGAGGGG G CAGCAACAA CGGCAAGACT  780
CCCGTGTGTC ACCAGTGCCA CAAG GTCATC CGGGGCCGCT A CCTGGTGGC GTTGGGCCAC  840
GCGTACCACC CGGAGGAGTT TGTG TGTAGC CAGTGTGGGA A GGTCCTGGA AGAGGGTGGC  900
TTCTTTGAGG AGAAGGGCGC CATC TTCTGC CCACCATGCT A TGACGTGCG CTATGCACCC  960
AGCTGTGCCA AGTGCAAGAA GAAG ATTACA GGCGAGATCA T GCACGCCCT GAAGATGACC  1020
TGGCACGTGC ACTGCTTTAC CTGT GCTGCC TGCAAGACGC C CATCCGGAA CAGGGCCTTC  1080
TACATGGAGG AGGGCGTGCC CTAT TGCGAG CGAGACTATG A GAAGATGTT TGGCACGAAA  1140
TGCCATGGCT GTGACTTCAA GATC GACGCT GGGGACCGCT T CCTGGAGGC CCTGGGCTTC  1200
AGCTGGCATG ACACCTGCTT CGTC TGTGCG ATATGTCAGA T CAACCTGGA AGGAAAGACC  1260
TTCTACTCCA AGAAGGACAG GCCT CTCTGC AAGAGCCATG C CTTCTCTCA TGTGTGAGCC  1320
CCTTCTGCCC ACAGCTGCCG CGGT GGCCCC TAGCCTGAGG G GCCTGGAGT CGTGGCCCTG  1380
CATTTCTGGG TAGGGCTGGC AATG GTTGCC TTAACCCTGG C TCCTGGCCC GAGCCTGGGC  1440
TCCCGGGCCC TGCCCA                                                    1456
缺失119bp片段和加入17bp片段(下划线)(在X间)引起可读框移位，产生截短基因产物，产物具有下列导出的氨基酸序列(SEQ.ID NO：38)：
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Asn Lys Pro Gln Lys Val Gln Thr
                 85                  90                  95
Pro Asp LysGln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser Lys Gln
            100                 105                 110
Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly Thr Gly
        115                 120                 125
Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr Glu Phe
    130                 135                 140
Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln Val Pro
145                 150                 155                 160
Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu Pro Trp
                165                 170                 175
Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp Ala Val
            180                 185                 190
Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser Thr Val
        195                 200                 205
Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln Ser Arg
    210                 215                 220
Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly Gly Ser
225                 230                 235                 240
Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Gln Val Ile Arg
                245                 250                 255
Ala Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu Glu Phe
            260                 265                 270
Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe Phe Glu
        275                 280                 285
Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg Tyr Ala
    290                 295                 300
Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile Met His
305                 310                 315                 320
Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Leu Cys Phe Thr Cys Ala Ala Cys
                325                 330                 335
Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly Val Pro
            340                 345                 350
Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys Gln Trp
        355                 360                 365
Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala Leu Gly
    370                 375                 380
Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln Ile Asn
385                 390                 395                 400
Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu Cys Lys
                405                 410                 415
Ser His Ala Phe Ser His Val
            420
此423个氨基酸的蛋白质证明与SEQ.ID NO：10所示蛋白质100％同源，除了突出区域(氨基酸94-99)中的序列，这是由于上述核苷酸变化。
第二个新的人心脏cDNA序列(SEQ.ID NO：39)包括1575bp：
CGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCC GGGCCAA GCAGGAGCCG  GCATCATGGA TTCCTTCAAG  60
GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACC TTGGGGC TTCCGGCTGC  AAGGGGGCAA GGACTTCAAT  120
GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCT CACTCCT GGGGGCAAAG  CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC  180
GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CAT CGATGGC GAGAATGCGG  GTAGCCTCAC ACACATCGAA  240
GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTG CGGGGAG CGCCTCAGCC  TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG  300
CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAA GGCCTCC GCCCCCGCCG  CGGACCCTCC GCGGTACACC  360
TTTGCACCCA GCGTCTCCCT CAA CAAGACG GCCCGGCCCT  TTGGGGCGCC CCCGCCCGCT  420
GACAGCGCCC CGCAACAGAA TGG GTGCAGA CCCCTGACAA ACAGCCGCTC CGACCGCTGG 480
TCCCAGATGC CAGCAAGCAG CGG CTGATGG AGAACACAGA  GGACTGGCGG CCGCGGCCGG  540
GGACAGGCCA GTCGCGTTCC TTC CGCATCC TTGCCCACCT  CACAGGCACC GAGTTCATGC  600
AAGACCCGGA TGAGGAGCAC CTG AAGAAAT CAAGCCAGGT  GCCCAGGACA GAAGCCCCAG  660
CCCCAGCCTC ATCTACACCC CAG GAGCCCT GGCCTGGCCC  TACCGCCCCC AGCCCTACCA  720
GCCGCCCGCC CTGGGCTGTG GAC CCTGCGT TTGCCGAGCG  CTATGCCCCG GACAAAACGA  780
GCACAGTGCT GACCCGGCAC AGC CAGCCGG CCACGCCCAC  GCCGCTGCAG AGCCGCACCT  840
CCATTGTGCA GGCAGCTGCC GGA GGGGTGC CAGGAGGGGG  CAGCAACAAC GGCAAGACTC  900
CCGTGTGTCA CCAGTGCCAC AAG GTCATCC GGGGCCGCTA  CCTGGTGGCG TTGGGCCACG  960
CGTACCACCC GGAGGAGTTT GTG TGTAGCC AGTGTGGGAA  GGTCCTGGAA GAGGGTGGCT  1020
TCTTTGAGGA GAAGGGCGCC ATC TTCTGCC CACCATGCTA  TGACGTGCGC TATGCACCCA  1080
GCTGTGCCAA GTGCAAGAAG AAG ATTACAG GCGAGATCAT  GCACGCCCTG AAGATGACCT  1140
GGCACGTGCA CTGCTTTACC TGT GCTGCCT GCAAGACGCC  CATCCGGAAC AGGGCCTTCT  1200
ACATGGAGGA GGGCGTGCCC TAT TGCGAGC GAGACTATGA  GAAGATGTTT GGCACGAAAT  1260
GCCATGGCTG TGACTTCAAG ATC GACGCTG GGGACCGCTT  CCTGGAGGCC CTGGGCTTCA  1320
GCTGGCATGA CACCTGCTTC GTC TGTGCGA TATGTCAGAT  CAACCTGGAA GGAAAGACCT  1380
TCTACTCCAA GAAGGACAGG CCT CTCTGCA AGAGCCATGC  CTTCTCTCAT GTGTGAGCCC  1440
CTTCTGCCCA CAGCTGCCGC GGT GGCCCCT AGCCTGAGGG  GCCTGGAGTC GTGGCCCTGC  1500
ATTTCTGGGT AGGGCTGGCA ATG GTTGCCT TAACCCTGGC  TCCTGGCCCG AGCCTGGGCT  1560
CCCGGGCCCT GCCCA                                                     1575
加入17bp片段(粗体、斜体和下划线)引起可读框移位，在位置565-567(下划线)产生早期翻译终止密码子。
所得氨基酸序列(SEQ.ID NO：40)由153个氨基酸组成：
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala
                 85                  90                  95
Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu
            100                 105                 110
Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala
        115                 120                 125
Pro Gln Gln Asn Gly Cys Arg Pro Leu Thr Asn Ser Arg Ser Asp Arg
    130                 135                 140
Trp Ser Gln Met Pro Ala Ser Ser Gly
145                 150
此蛋白质证明与SEQ.ID NO：10 100％同源，直到氨基酸94，其中加入核苷酸序列所示的17bp片段导致移框。在氨基酸94-153，蛋白质不与SEQ.ID NO：10同源。由于核苷酸序列所示的早期终止密码子，SEQ.ID NO：10中氨基酸154-457不存在。
实施例32：基因组HLMP-1核苷酸序列
专利申请者鉴定了编码HLMP-1的基因组DNA序列，包括与HLMP-1表达相关的推定调节元件。完整基因组序列示于SEQ.ID NO：41。此序列获得自AC023788(克隆RP11-564G9)，基因组测序中心，Washington University School of Medicine，St.Louis，MO。
HLMP-1的推定启动子区域横跨SEQ.ID NO：41的核苷酸2,660-8,733。此区域包括至少10个潜在糖皮质激素反应元件(”GREs”)(核苷酸6148-6153、6226-6231、6247-6252、6336-6341、6510-6515、6552-6557、6727-6732、6752-6757、7738-7743和8255-8260)、12个与Mothers同源的潜在Sma-2，相对果蝇decapentaplegic(”SMAD”)结合元件位置(核苷酸3569-3575、4552-4558、4582-4588、5226-5232、6228-6234、6649-6655、6725-6731、6930-6939、7379-7384、7738-7742、8073-8079和8378-8384)以及3个TATA盒(核苷酸5910-5913、6932-6935和7380-7383)。3个TATA盒、所有GREs和8个SMAD结合元件(”SBEs”)聚集在SEQ.ID NO：41中跨核苷酸5,841-8,733的区域。这些调节元件可用于例如调节外源核苷酸序列表达，序列编码的蛋白质参与骨形成过程。这允许全身施用涉及骨形成和修复的治疗因子或基因以及与组织分化和发育相关的因子或基因。
除了推定调节元件外，鉴定了13个外显子，对应于编码HLMP-1的核苷酸序列。这些外显子横跨下列SEQ.ID NO：41中的核苷酸：
外显子1     8733-8767
外显子2     9790-9895
外显子3     13635-13787
外显子4     13877-13907
外显子5     14387-14502
外显子6     15161-15297
外显子7     15401-15437
外显子8     16483-16545
外显子9     16689-16923
外显子10    18068-18248
外显子11    22117-22240
外显子12    22323-22440
外显子13    22575-22911
在HLMP-2中有另一个外显子(外显子5A)，它跨核苷酸14887-14904。
实施例33：在椎间盘细胞中表达HLMP-1
LIM矿化蛋白-1(LMP-1)是胞内蛋白，能指导骨和非骨组织中的细胞分化。此例子证明在椎间盘细胞中表达人LMP-1(”HLMP-1”)增加蛋白聚糖合成且促进更多软骨细胞表型。此外，HLMP-1对细胞基因表达的效果通过测量聚集蛋白聚糖和BMP-2基因表达来证明。腰椎间盘细胞通过温和酶消化从Sprague-Darley大鼠中收集并单层培养于添加10％FBS的DMEM/F12中。这些细胞随后以约200,000个细胞每孔分到6孔板中，培养约6天直到细胞达到约300,000个细胞每孔。培养基变成1％FBS DMEM/F12且这被认为是第0天。
上述复制缺陷5型腺病毒包括HLMP-1 cDNA，可操作连接于巨细胞病毒(”CMV”)启动子，例如描述于美国专利号6,300,127。负对照腺病毒相同，除了HLMP-1 cDNA被LacZ cDNA取代。对于正对照，未感染的培养物在连续存在100纳克/毫升浓度的BMP-2时培养。
在第0天，培养物在300微升培养基中37℃感染腺病毒30分钟，培养基含1％FBS。用荧光激活细胞分选仪(”FACS”)分析腺病毒处理的细胞以确定表达转基因的最佳剂量范围，腺病毒含绿色荧光蛋白(”GFP”)基因(”AdGFP”)。用含人LMP-1cDNA(AdHLMP-1)(MOIs为0、100、300、1000或3000)的腺病毒或含LacZ标记基因(AdLacZ MOI为1000)(负对照)的腺病毒处理细胞。培养基在感染后第3天和第6天改变。
蛋白聚糖生成通过测量培养基中硫酸化粘多糖(sGAG)的存在来估计，使用二甲基-亚甲蓝(”DMMB”)量热测定。
为定量聚集蛋白聚糖和BMP-2 mRNA，细胞在第6天收集且通过Trizol技术提取RNA。mRNA用反转录酶转变成cDNA并用于实时PCR，实时PCR可确定聚集蛋白聚糖和BMP-2信使的相对丰度。设计实时引物并在以前实验中测试聚集蛋白聚糖和BMP-2。使用Cybergreen技术。标准化曲线用于定量mRNA丰度。
对于转染细胞，细胞形态用光学显微镜记录。细胞用AdHLMP-1(MOI 1000)处理变成圆形，而不是用AdLacZ处理。AdLacZ感染不显著改变细胞形态。
FACS分析以1000 MOI感染ADGFP的大鼠盘细胞显示最高百分比的感染细胞(45％)
sGAG生成和AdHLMP-1 MOI间的剂量依赖增加。这些数据见于图1，显示在大鼠盘细胞单层培养中以不同MOIs过量表达HLMP-1后的sGAG生成。结果根据第0天未处理细胞来标准化。误差条(error bar)代表平均数的标准误差。如图1所示，第3天观察到的sGAG生成相对较少，说明转染和细胞生成GAG间有延迟时间。用AdLacZ处理不显著改变sGAG生成。也如图1所示，AdHLMP-1最佳剂量是1000MOI，使sGAG生成在第6天相对未处理对照提高260％。更高或更低剂量的AdHLMP-1导致反应减小。
AdHLMP-1剂量(MOI)对sGAG生成的效果进一步阐明于图2。图2是一个图表，显示用AdHLMP-1以不同MOIs处理后第6天的大鼠盘sGAG水平。如图1所示，AdHLMP-1最佳剂量是1000MOI。
聚集蛋白聚糖和BMP-2 mRNA生成可见于图3。此图证明过量表达HLMP-1后聚集蛋白聚糖和BMP-2 mRNA增加。对从大鼠盘细胞第6天提取的mRNA进行实时PCR，比较未处理(”NT”)细胞和用AdHLMP-1以250MOI处理的细胞。图3的数据代表相对未处理样品的百分比增加。如图3所示，注意到AdHLMP-1处理后聚集蛋白聚糖和BMP-2 mRNA显著增加。BMP-2表达提高说明BMP-2是下游基因，调节蛋白聚糖合成的HLMP-1刺激。
这些数据证明用AdHLMP-1转染有效增加椎间盘细胞的蛋白聚糖合成。病毒剂量产生最高的转基因表达(MOI 1000)，也导致最高的sGAG诱导，表明HLMP-1表达和sGAG生成间有关联。这些数据说明HLMP-1基因治疗是增加椎间盘细胞中蛋白聚糖合成的方法，HLMP-1是治疗盘疾病的试剂。
图4A是一个图表，显示用Ad-hLMP-1以不同MOIs感染12小时后HLMP-1 mRNA的表达。在图4A中，外源LMP-1表达用不同剂量(MOI)的Ad-hLMP-1病毒诱导并用实时PCR定量。数据根据来自Ad-LMP-1 MOI 5的HLMP-1 mRNA水平标准化，用于比较目的。在负对照组即未处理(”NT”)或AdLacZ处理(”LacZ”)中没有检测到HLMP-1。HLMP-1 mRNA水平以剂量依赖方式用MOI 25和50达到约8倍的平台(pleateau)。
图4B是一个图表，显示来自感染后3到6天的培养基中sGAG的生成。DMMB测定用于定量感染后3到6天间的总sGAG生成。图4B中的数据根据对照(即未处理)组标准化。如图4B可见，sGAG的剂量依赖增加，用MOI 25和50达到约为对照3倍的峰值。负对照AdLacZ在MOI 25时不导致sGAG增加。在图4B中，各结果表示为平均数和3个样品的SD。
图5是一个图表，显示sGAG生成的时程变化。如图5可见，在第3天，MOI 25和50的sGAG生成显著增加。在第6天，sGAG生成的剂量依赖对应于AdLMP-1上升。MOI 25达到sGAG的平台水平增加。也如图5可见，用AdLacZ处理(”LacZ”)不显著改变sGAG生成。各结果表示为平均数和6到9个样品的SD。在图5中，”**”表示相对未处理对照P值＜0.01的数据点。
图6A和6B是图表，分别显示在用于聚集蛋白聚糖和BMP-2的大鼠纤维环细胞中对LMP-1过量表达的基因反应。用Ad-LMP-1(”LMP-1”)以MOI 25感染后3天进行定量实时PCR。如图6A和6B可见，用Ad-LMP-1感染后，聚集蛋白聚糖和BMP-2的基因表达相对未处理对照(”NT”)显著增加。此外，与未处理对照相比，用AdLacZ处理(”LacZ”)以MOI 25处理不显著改变聚集蛋白聚糖或BMP-2的基因表达。在图6A和6B中，各结果表示为平均数和6个样品的SD。在图6A和6B中，”**”表示P值＜0.01的数据点。
图7显示用AdHLMP-1以MOI 25感染后，大鼠纤维环细胞中HLMP-1 mRNA水平的时程。数据表示为用18S和过量表达LMP-1引物的复制系数标准化后，相对MOI5 AdHLMP-1的增加倍数。也如图7可见，HLMP-1 mRNA早在感染后12小时显著上调。此外，第1和第3天间表达水平显著增加。图7中的各结果表示为平均数和6个样品的SD。
图8是一个图表，显示对应于HLMP-1过量表达的BMPs和聚集蛋白聚糖mRNA水平变化。BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP7和聚集蛋白聚糖mRNA水平用实时PCR在Ad-hLMP-1 MOI 25感染后的不同时间点确定。如图8可见，BMP-2 mRNA早在AdLMP-1感染后12小时显著上调。各结果表示为平均数和6个样品的SD。在图8中，”**”表示AdLMP-1感染相对未处理对照P值＜0.01的数据点。
图9显示对应于HLMP-1表达的sGAG生成增加的时程。对于图9中的数据，大鼠环细胞用Ad-hLMP-1以MOI 25感染。培养基在感染后每3天改变并用DMMB测定分析sGAG。此数据显示sGAG生成在第6天达到平台且在第9天大致维持。
图10是一个图表，显示头蛋白(BMP拮抗物)对LMP-1调节的sGAG生成增加的效果。如图10可见，用Ad-LMP-1以MOI 25感染大鼠环细胞导致第3和第6天间的sGAG生成增加3倍。此增加通过加入3200ng/ml和800ng/ml浓度的头蛋白(BMP拮抗物)阻碍。然而如图10所示，头蛋白不显著改变未感染细胞中的sGAG生成。也如图10可见，加入BMP-2后，用100ng/ml rhBMP-2刺激导致第3和第6天间的sGAG生成增加3倍。800ng/ml浓度的头蛋白也阻碍此增加。
图11是一个图表，显示单层培养6天后LMP-1对培养基中sGAG的效果。数据点代表相对未处理细胞的增加倍数。如图11所示，当有CMV启动子的LMP-1通过AAV载体传递时，也有效刺激单层大鼠盘细胞的粘多糖合成。
表2：用于SYBR Green的RT-PCR&实时PCR的引物序列
    引物     序列
    聚集蛋白聚糖(正向)聚集蛋白聚糖(反向)BMP-2(正向)BMP-2(反向)GAPDH(正向)GAPDH(反向)     AGGATGGCTTCCACCAGTGCTGCGTAAAAGACCTCACCCTCCCACAAGTCAGTGGGAGAGCGCTTCCGCTGTTTGTGTTTGACCACAGTCCATGCCATCACTCCACCACCCTGTTGCTGTA
表2中的GAPDH表示磷酸甘油醛脱氢酶。
表3：用于TaqMan的实时PCR的引物和探针序列
引物     序列
过量表达LMP-1(正向)过量表达LMP-1(反向)过量表达LMP-1(探针)     AATACGACTCACTATAGGGCTCGAGGAAGCCCCAAGGTGCT-FAM-AGCCGGCATCATGGATTCCTTCAA-TAMRA
TaqMan核糖体RNA对照试剂(Part号4308329，Applied Biosystems，FosterCity，CA，U.S.A.)用于18S核糖体RNA(rRNA)基因的正向引物、反向引物和探针。
所有引用的出版物和专利全部纳入本文供参考。
上述说明书教授了本发明的原理，提供例子用于阐述目的，本领域技术人员通过读此说明书理解可对形式和细节作出多种改变而不离开发明的真实范围。
序列表
<110>W.F.麦克凯(MCKAY，William，F.)
     S.D.罗登(BODEN，Scott，D.)
     S.T.永恩(YOON，Sangwook，T.)
<120>在非骨细胞中表达LIM矿化蛋白的方法
<130>3819-002-53
<140>
<141>
<150>US 60/331,321
<151>2001-11-14
<160>42
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>457
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>1
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Leu Thr
                 85                  90                  95
Pro Pro Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Ala Ser Leu
            100                 105                 110
Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Thr Asp Ser Ala
        115                 120                 125
Leu Ser Gln Asn Gly Gln Leu Leu Arg Gln Leu Val Pro Asp Ala Ser
    130                 135                 140
Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr
                165                 170                 175
Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu Phe Met Lys Lys Ser Ser Gln
            180                 185                 190
Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Thr Ile Pro Gln Glu
        195                 200                 205
Ser Trp Pro Gly Pro Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp
    210                 215                 220
Ala Val Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser
225                 230                 235                 240
Thr Val Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln
                245                 250                 255
Asn Arg Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly
            260                 265                 270
Gly Ser Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Lys Ile
        275                 280                 285
Ile Arg Gly Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu
    290                 295                 300
Glu Phe Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe
305                 310                 315                 320
Phe Glu Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Ser Cys Tyr Asp Val Arg
                325                 330                 335
Tyr Ala Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile
            340                 345                 350
Met His Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Pro Cys Phe Thr Cys Ala
        355                 360                 365
Ala Cys Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly
    370                 375                 380
Ala Pro Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys
385                 390                 395                 400
Arg Gly Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala
                405                 410                 415
Leu Gly Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln
            420                 425                 430
Ile Asn Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Lys Pro Leu
        435                 440                 445
Cys Lys Ser His Ala Phe Ser His Val
    450                 455
<210>2
<211>1696
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>2
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<210>3
<211>260
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>3
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<212>DNA
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<400>4
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<212>DNA
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<210>6
<211>223
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>6
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<210>7
<211>717
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>7
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<210>8
<211>1488
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>8
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<210>9
<211>1644
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>9
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ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 240
ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac 300
cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg 360
gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc 420
ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 480
acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa 540
gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 600
ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 660
cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgcc atgccccgga caaaacgagc 720
acagtgctga cccggcacag ccagccggcc acgcccacgc cgctgcagag ccgcacctcc 780
attgtgcagg cagctgccgg aggggtgcca ggagggggca gcaacaacgg caagactccc 840
gtgtgtcacc agtgccacaa ggtcatccgg ggccgctacc tggtggcgtt gggccacgcg 900
taccacccgg aggagtttgt gtgtagccag tgtgggaagg tcctggaaga gggtggcttc 960
tttgaggaga agggcgccat cttctgccca ccatgctatg acgtgcgcta tgcacccagc 1020
tgtgccaagt gcaagaagaa gattacaggc gagatcatgc acgccctgaa gatgacctgg 1080
cacgtgcact gctttacctg tgctgcctgc aagacgccca tccggaacag ggccttctac 1140
atggaggagg gcgtgcccta ttgcgagcga gactatgaga agatgtttgg cacgaaatgc 1200
catggctgtg acttcaagat cgacgctggg gaccgcttcc tggaggccct gggcttcagc 1260
tggcatgaca cctgcttcgt ctgtgcgata tgtcagatca acctggaagg aaagaccttc 1320
tactccaaga aggacaggcc tctctgcaag agccatgcct tctctcatgt gtgagcccct 1380
tctgcccaca gctgccgcgg tggcccctag cctgaggggc ctggagtcgt ggccctgcat 1440
ttctgggtag ggctggcaat ggttgcctta accctggctc ctggcccgag cctgggctcc 1500
cgggcccctg cccacccacc ttatcctccc accccactcc ctccaccacc acagcacacc 1560
ggtgctggcc acaccagccc cctttcacct ccagtgccac aataaacctg tacccagctg 1620
aattccaaaa aatccaaaaa aaaa                                        1644
<210>10
<211>457
<212>PRT
<213>智人(Homo sapies)
<400>10
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala
                 85                  90                  95
Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu
            100                 105                 110
Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala
        115                 120                 125
Pro Gln Gln Asn Gly Gln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser
    130                 135                 140
Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr
                165                 170                 175
Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln
            180                 185                 190
Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu
        195                 200                 205
Pro Trp Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp
    210                 215                 220
Ala Val Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser
225                 230                 235                 240
Thr Val Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln
                245                 250                 255
 Ser Arg Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly
             260                 265                 270
Gly Ser Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Lys Val
        275                 280                 285
Ile Arg Gly Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu
    290                 295                 300
Glu Phe Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe
305                 310                 315                 320
Phe Glu Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg
                325                 330                 335
Tyr Ala Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile
            340                 345                 350
Met His Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val His Cys Phe Thr Cys Ala
        355                 360                 365
Ala Cys Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly
    370                 375                 380
Val Pro Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys
385                 390                 395                 400
His Gly Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala
                405                 410                 415
Leu Gly Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln
            420                 425                 430
Ile Asn Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu
        435                 440                 445
Cys Lys Ser His Ala Phe Ser His Val
    450                 455
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>11
gccagggttt tcccagtcac ga                                              22
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>12
gccagggttt tcccagtcac ga                                              22
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>13
tcttagcaga gcccagcctg ct                                              22
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>14
gcatgaactc tgtgcccgtg ag                                              22
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>15
atccttgctc acctcacggg                                                 20
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>16
gcactgtgct ggttttgtct gg                                              22
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>17
catggattcc ttcaaggtag tgc                                         23
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>18
gttttgtctg gggcagagcg                                             20
<210>19
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Marathon RACE反应的衔接子
<400>19
ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt                  44
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Marathon RACE衔接子特异的PCR引物
<400>20
ccatcctaat acgactcact atagggc                                     27
<210>21
<211>765
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>21
ccgttgtttg taaaacgacg cagagcagcg ccctggccgg gccaagcagg agccggcatc 60
atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 120
ggcaaggact tcaatgtgcc ctcctccatt tcccggctca cctctggggg caaggccgtg 180
caggccggag tggccgtaag tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 240
ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 300
ctcaacaggg cccagccggt tcagaacaaa ccgcaaaagg cctccgcccc cgccgcggac 360
cctccgcggt acacctttgc accaagcgtc tccctcaaca agacggcccg gcccttgggg 420
gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcag cagaatggac agccgctccg accgctggtc 480
ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 540
acaggccagt gccgttcctt tcgcatcctt gctcacctta caggcaccga gttcatgcaa 600
gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 660
ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 720
cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgcc                 765
<210>22
<211>1689
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>22
cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag 60
gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat 120
gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc 180
gtgggtgact gggtgctgag caccgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa 240
gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag 300
ccggttcaga gcaaaccgca gaaggcctcc gcccccgccg cggaccctcc gcggtacacc 360
tttgcaccca gcgtctccct caacaagacg gcccggccct ttggggcgcc cccgcccgct 420
gacagcgccc cgcaacagaa tggacagccg ctccgaccgc tggtcccaga tgccagcaag 480
cagcggctga tggagaacac agaggactgg cggccgcggc cggggacagg ccagtcgcgt 540
tccttccgca tccttgccca cctcacaggc accgagttca tgcaagaccc ggatgaggag 600
cacctgaaga aatcaagcca ggtgcccagg acagaagccc cagccccagc ctcatctaca 660
ccccaggagc cctggcctgg ccctaccgcc cccagcccta ccagccgccc gccctgggct 720
gtggaccctg cgtttgccga gcgctatgcc ccggacaaaa cgagcacagt gctgacccgg 780
cacagccagc cggccacgcc cacgccgctg cagagccgca cctccattgt gcaggcagct 840
gccggagggg tgccaggagg gggcagcaac aacggcaaga ctcccgtgtg tcaccagtgc 900
cacaaggtca tccggggccg ctacctggtg gcgttgggcc acgcgtacca cccggaggag 960
tttgtgtgta gccagtgtgg gaaggtcctg gaagagggtg gcttctttga ggagaagggc 1020
gccatcttct gcccaccatg ctatgacgtg cgctatgcac ccagctgtgc caagtgcaag 1080
aagaagatta caggcgagat catgcacgcc ctgaagatga cctggcacgt gcactgcttt 1140
acctgtgctg cctgcaagac gcccatccgg aacagggcct tctacatgga ggagggcgtg 1200
ccctattgcg agcgagacta tgagaagatg tttggcacga aatgccatgg ctgtgacttc 1260
aagatcgacg ctggggaccg cttcctggag gccctgggct tcagctggca tgacacctgc 1320
ttcgtctgtg cgatatgtca gatcaacctg gaaggaaaga ccttctactc caagaaggac 1380
aggcctctct gcaagagcca tgccttctct catgtgtgag ccccttctgc ccacagctgc 1440
cgcggtggcc cctagcctga ggggcctgga gtcgtggccc tgcatttctg ggtagggctg 1500
gcaatggttg ccttaaccct ggctcctggc ccgagcctgg gctcccgggc ccctgcccac 1560
ccaccttatc ctcccacccc actccctcca ccaccacagc acaccggtgc tggccacacc 1620
agcccccttt cacctccagt gccacaataa acctgtaccc agctgaattc caaaaaatcc 1680
aaaaaaaaa                                                         1689
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>23
gcactgtgct cgttttgtcc gg                                          22
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>24
tccttgctca cctcacgggc a                                           21
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>25
tcctcatccg ggtcttgcat gaactcggtg                                  30
<210>26
<211>28
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>26
gcccccgccc gctgacagcg ccccgcaa                                    28
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>27
tccttgctca cctcacgggc accg                                        24
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>28
gtaatacgac tcactagg gc                                            22
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>29
gcggctgatg gagaatactg aag                                         23
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>30
atcttgtggc actggtggca tac                                         23
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>31
tgtgtcgggt cagcactgtg ct                                          22
<210>32
<211>1620
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>32
atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 60
ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg 120
caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 180
ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 240
ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac 300
cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg 360
gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc 420
ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 480
acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa 540
gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 600
ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 660
cgcccgccct gagctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgccccgga caaaacgagc 720
acagtgctga cccggcacag ccagccggcc acgcccacgc cgctgcagag ccgcacctcc 780
attgtgcagg cagctgccgg aggggtgcca ggagggggca gcaacaacgg caagactccc 840
gtgtgtcacc agtgccacaa ggtcatccgg ggccgctacc tggtggcgtt gggccacgcg 900
taccacccgg aggagtttgt gtgtagccag tgtgggaagg tcctggaaga gggtggcttc 960
tttgaggaga agggcgccat cttctgccca ccatgctatg acgtgcgcta tgcacccagc 1020
tgtgccaagt gcaagaagaa gattacaggc gagatcatgc acgccctgaa gatgacctgg 1080
cacgtgcact gctttacctg tgctgcctgc aagacgccca tccggaacag ggccttctac 1140
atggaggagg gcgtgcccta ttgcgagcga gactatgaga agatgtttgg cacgaaatgc 1200
catggctgtg acttcaagat cgacgctggg gaccgcttcc tggaggccct gggcttcagc 1260
tggcatgaca cctgcttcgt ctgtgcgata tgtcagatca acctggaagg aaagaccttc 1320
tactccaaga aggacaggcc tctctgcaag agccatgcct tctctcatgt gtgagcccct 1380
tctgcccaca gctgccgcgg tggcccctag cctgaggggc ctggagtcgt ggccctgcat 1440
ttctgggtag ggctggcaat ggttgcctta accctggctc ctggcccgag cctgggctcc 1500
cgggcccctg cccacccacc ttatcctccc accccactcc ctccaccacc acagcacacc 1560
ggtgctggcc acaccagccc cctttcacct ccagtgccac aataaacctg tacccagctg 1620
<210>33
<211>1665
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>33
cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag 60
gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat 120
gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc 180
gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa 240
gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag 300
ccggttcaga gcaaaccgca gaaggcctcc gcccccgccg cggaccctcc gcggtacacc 360
tttgcaccca gcgtctccct caacaagacg gcccggccct ttggggcgcc cccgcccgct 420
gacagcgccc cgcaacagaa tggacagccg ctccgaccgc tggtcccaga tgccagcaag 480
cagcggctga tggagaacac agaggactgg cggccgcggc cggggacagg ccagtcgcgt 540
tccttccgca tccttgccca cctcacaggc accgagttca tgcaagaccc ggatgaggag 600
cacctgaaga aatcaagcca ggtgcccagg acagaagccc cagccccagc ctcatctaca 660
ccccaggagc cctggcctgg ccctaccgcc cccagcccta ccagccgccc gccctgagct 720
gtggaccctg cgtttgccga gcgctatgcc ccggacaaaa cgagcacagt gctgacccgg 780
cacagccagc cggccacgcc cacgccgctg cagagccgca cctccattgt gcaggcagct 840
gccggagggg tgccaggagg gggcagcaac aacggcaaga ctcccgtgtg tcaccagtgc 900
cacaaggtca tccggggccg ctacctggtg gcgttgggcc acgcgtacca cccggaggag 960
tttgtgtgta gccagtgtgg gaaggtcctg gaagagggtg gcttctttga ggagaagggc 1020
gccatcttct gcccaccatg ctatgacgtg cgctatgcac ccagctgtgc caagtgcaag 1080
aagaagatta caggcgagat catgcacgcc ctgaagatga cctggcacgt gcactgcttt 1140
acctgtgctg cctgcaagac gcccatccgg aacagggcct tctacatgga ggagggcgtg 1200
ccctattgcg agcgagacta tgagaagatg tttggcacga aatgccatgg ctgtgacttc 1260
aagatcgacg ctggggaccg cttcctggag gccctgggct tcagctggca tgacacctgc 1320
ttcgtctgtg cgatatgtca gatcaacctg gaaggaaaga ccttctactc caagaaggac 1380
aggcctctct gcaagagcca tgccttctct catgtgtgag ccccttctgc ccacagctgc 1440
cgcggtggcc cctagcctga ggggcctgga gtcgtggccc tgcatttctg ggtagggctg 1500
gcaatggttg ccttaaccct ggctcctggc ccgagcctgg gctcccgggc ccctgcccac 1560
ccaccttatc ctcccacccc actccctcca ccaccacagc acaccggtgc tggccacacc 1620
agcccccttt cacctccagt gccacaataa acctgtaccc agctg                 1665
<210>34
<211>223
<212>PRT
<213>智人(Homo sapies)
<400>34
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala
                 85                  90                  95
Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu
            100                 105                 110
Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala
        115                 120                 125
Pro Gln Gln Asn Gly Gln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser
    130                 135                 140
Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr
                165                 170                 175
Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln
            180                 185                 190
Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu
        195                 200                 205
Pro Trp Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro
    210                 215                 220
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>35
gagccggcat catggattcc                                                 20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>36
gctgcctgca caatggaggt                                             20
<210>37
<211>1456
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>37
cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag 60
gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat 120
gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc 180
gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa 240
gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag 300
ccggttcaga gcaaaccgca gaaggtgcag acccctgaca aacagccgct ccgaccgctg 360
gtcccagatg ccagcaagca gcggctgatg gagaacacag aggactggcg gccgcggccg 420
gggacaggcc agtcgcgttc cttccgcatc cttgcccacc tcacaggcac cgagttcatg 480
caagacccgg atgaggagca cctgaagaaa tcaagccagg tgcccaggac agaagcccca 540
gccccagcct catctacacc ccaggagccc tggcctggcc ctaccgcccc cagccctacc 600
agccgcccgc cctgggctgt ggaccctgcg tttgccgagc gctatgcccc ggacaaaacg 660
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ttctttgagg agaagggcgc catcttctgc ccaccatgct atgacgtgcg ctatgcaccc 960
agctgtgcca agtgcaagaa gaagattaca ggcgagatca tgcacgccct gaagatgacc 1020
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<210>38
<211>423
<212>PRT
<213>智人(Homo sapies)
<400>38
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
    50                   55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Asn Lys Pro Gln Lys Val Gln Thr
                 85                  90                  95
Pro Asp Lys Gln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser Lys Gln
            100                 105                 110
Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly Thr Gly
        115                 120                 125
Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr Glu Phe
    130                 135                 140
Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln Val Pro
145                 150                 155                 160
Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu Pro Trp
                165                 170                 175
Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp Ala Val
            180                 185                 190
Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser Thr Val
        195                 200                 205
Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln Ser Arg
    210                 215                 220
Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly Gly Ser
225                 230                 235                 240
Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Gln Val Ile Arg
                245                 250                 255
Ala Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu Glu Phe
            260                 265                 270
Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe Phe Glu
        275                 280                 285
Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg Tyr Ala
    290                 295                 300
Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile Met His
305                 310                 315                 320
Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Leu Cys Phe Thr Cys Ala Ala Cys
                325                 330                 335
Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly Val Pro
            340                 345                 350
Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys Gln Trp
        355                 360                 365
Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala Leu Gly
    370                 375                 380
Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln Ile Asn
385                 390                 395                 400
Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu Cys Lys
                405                 410                 415
Ser His Ala Phe Ser His Val
            420
<210>39
<211>1575
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<400>39
cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag 60
gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat 120
gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc 180
gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa 240
gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag 300
ccggttcaga gcaaaccgca gaaggcctcc gcccccgccg cggaccctcc gcggtacacc 360
tttgcaccca gcgtctccct caacaagacg gcccggccct ttggggcgcc cccgcccgct 420
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<210>40
<211>153
<212>PRT
<213>智人(Homo sapies)
<400>40
Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe
  1               5                  10                  15
Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
             20                  25                  30
Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
         35                  40                  45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
     50                  55                  60
Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala
                 85                  90                  95
Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu
            100                 105                 110
Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala
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Pro Gln Gln Asn Gly Cys Arg Pro Leu Thr Asn Ser Arg Ser Asp Arg
    130                 135                 140
Trp Ser Gln Met Pro Ala Ser Ser Gly
145                 150
<210>41
<211>24740
<212>DNA
<213>智人(Homo sapies)
<220>
<221>未知
<222>1..6
<223>a或c或g或t
<220>
<221>未知
<222>8101
<223>a或c或g或t
<400>41
nnnnnntgta ttttatcata ttttaaaaat caaaaaacaa aaggcagttg aggttaggca 60
tggaggttcg tgcctgtaat cccagcactt tgggaagccg aagcacgtgg atcacctgag 120
gtcaggagtt cgagaccagc ctgcccaata tggtaaaacc ctgtctctac taaaaataca 180
aaaaattagc caggcatggt ggtgggcacc tgtaatccca gctacttggg agactgaggc 240
aggagaatca cttaaacccg ggaggcgggc tgggcgcggt ggctcatgcc tgtaatccca 300
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tcatctgtaa aggagagaga accgatgacg tatcaggcat aatccttgat gagagtttgc 3000
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gttccctcct ctgctcctgc tcctggcgcc atcctaggag ccagccatgc acgcaagcgt 3180
catgcctcca gggctctgac tgcccagccc ctcaccgcaa ctccacctca gctgcacaca 3240
cccttggcac atcctgaacc tcattttcat gacggacaca caatttttgc tctctcctgt 3300
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ttgctattcc tcctacctca taacaatctc cttcccagcc tctactgctg ccttctctga 4260
gttcttccca gggtcctagg ctcagatgta gtgtagctca accctgctac acaaagaatc 4320
tcctgaaagc ctgtaaaaat gtccatgcat gttctgtgag tgatctacca agaaaataaa 4380
aaattttaaa aatcaaatgc ccatgcctgg gcccacacgc aggggctctg atttcatcag 4440
tctggtaggt gggttctggg catccacgct cactggattt ccggatgatt gtagtatgca 4500
gcctaggctg ggaaccactg gcctcagcaa gccagtcatt ctccaggtgt cacagaccct 4560
ctaggtgcta atgaccccga aggtctgtct tcagtgcaca cctccccctg agctccagat 4620
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ggtgaaaggg ggttggggga atggagactc gtgttcttcc aggatgtgtg tggacacaga 4740
atgcaaagcc tggagggatg ctagagccat agggaggaag atttcggctc acttattcat 4800
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aacccaggac tctggggacc cagcatggca tcctttcctt cattacaaat ctgagctgct 5040
ttgtttccta gggatttctg tgatattcca aggggactgt gggaaagaaa gtccttggaa 5100
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tgtcaatcct tcctttcttc gtgtgttcat tcacatccac tgtgtgctgg ccctggggaa 5400
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tacagaatgt gagatgatgg agatgctatg gggaaaagta aagcagaggg agggcctagt 5640
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ctttgggagg ccaaggcagg tggatcgctg gaggtcagga gtttgagagc agcctgacca 5880
acatggagaa accccatctc tactaaacat ataaaaatta tccgggcatg gtggttcatg 5940
cctgtagtcc cagctactcg ggaggttgag gcaggagaat cacttgaacg tgggaggcag 6000
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cgtctcaaaa aaaaaaaaga aaagaaaaaa gaaaaaaaaa gaaaagtgtt tcaagcaggg 6120
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ggaatgctaa aagctgagag tgacatggtg ctgtgattct ggctttaaaa atatcacttt 6360
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taacttcatc gtttctgctg aaccagttgg ataaatgttg gtggcacttc ttgaagtgag 6600
gaaggagtta ggaaggtggg aaaggcacaa gtttgaattg ggccatgatg gtctgagata 6660
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tttccacaga ctgggggtgg ggtggggatg gtttcagggt ggttcgagtg cagtacattt 6780
atcattagac tctttttttt tttttttttt tgagatagag tctcgctctg tcacccacac 6840
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agccccagcc ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggtgaga gggagtgggc 16560
tcgggcctgg gcaagggtgg gcagcctcca ggggcatggg ggtggtgggc ttctctcagc 16620
tgcctggggc tccacccccg tcctttgggg tccctgggca cccctttaga gtcactttcc 16680
ccggcaggcc ctaccgcccc cagccctacc agccgcccgc cctgggctgt ggaccctgcg 16740
tttgccgagc gctatgcccc ggacaaaacg agcacagtgc tgacccggca cagccagccg 16800
gccacgccca cgccgctgca gagccgcacc tccattgtgc aggcagctgc cggaggggtg 16860
ccaggagggg gcagcaacaa cggcaagact cccgtgtgtc accagtgcca caaggtcatc 16920
cggtgggtgg cctgttcctg tccgaccctg gctttcccat cctgcagccc agccccacct 16980
gtctgcccac ctgtcttgcc tcagctgcga ctggggggaa taaggattca gttctcagct 17040
ggagtaggag tagggacctg ggctgggtcc tcccattctt aatcccacgc tacctacccc 17100
agcccaccca caacaactgc tagcagcatc tgccgtggcg aaatagccga agggccaacc 17160
ataggctgaa gctgcacccc tacctttgct gctctctggg caaagagggg cctgccccct 17220
cccagcgcgt ctgcccctcc ctcctgctct ctgtctccct ctgctctcag agcatacagg 17280
cctggagcca ctccctctgt gcactgcccc gtggggccaa gcagcatcaa acacccccca 17340
gcatcagcgt gccggattct agagccttcc taattcgcag gcctggcctg ctctcatctc 17400
tgtcagctct tttttttttt tttttgaaac agagtctcac tgtgttgccc acgttggcgt 17460
gcagtggcgc gatctcggct cactgcaacc tctgcctcct gggttcaaga gattctcctg 17520
cctcagcctc ctgagtagct gggattacag gcacccgcca ccatgcctgg ctaattttgt 17580
atttttagta gagacggggt tttaccatgt tggccaggct ggtctcaaac tcctcacctc 17640
aggtgatctc aggcctgcct tggcctccca aagtgctggg actacaggtg tgagccactg 17700
tgcccagccg actctatcag ctcttgccag gtagaacagg caggccagca ggacagggca 17760
gctccagggt ttgcccaggg gcggctcagc ttttatgagg ctccagtcgt cagcccttcc 17820
tcccggggtc ctccctgctc taaagctgcc tctcctgtca ccagcagttc agtgtggcgg 17880
actggctctg taagcttcat ggctgccacg gtcacttccc aagcctgtct tctatcctat 17940
gtggaaaatg gggagaatga actgtccctc ccaaggcctc ctggtgggtg gtcagtcaac 18000
ctgaaggggg ccaagacccc cacctctctg cgtgtgctcc ctctgaccgc tctcgcctcc 18060
ctgcaggggc cgctacctgg tggcgctggg ccacgcgtac cacccggagg agtttgtgtg 18120
tagccagtgt gggaaggtcc tggaagaggg tggcttcttt gaggagaagg gcgccatctt 18180
ctgcccacca tgctatgacg tgcgctatgc acccagctgt gccaagtgca agaagaagat 18240
tacaggcgtg agtagggctg gctggcgggg aggtggtccc aagcctgtca gtgggaacga 18300
gggctgctgg gaaacccaca gtccaggtct ctccccgagt gagcctccgg gtccttacca 18360
gcgtaataaa tgggctgctg tactggcctc accctgcatt agtcaggatg ctcttaacaa 18420
atgaccatgt tcctgctcag aaaccgccca aggctgcaaa gagcaggagg accaagccag 18480
gagaagccct gggccctcct gactcccact ttgggctctc cctgccctgg tgaaatgaca 18540
gaacggccaa cttgacacgc tgaagctgct ctgtctcatg cgtcctcctc atttctggat 18600
ccagagccag ggctgccagg agtagccaga gagctctgtg tggtgatgtt catattagtg 18660
aggtttacct tgaccacgag cagtgggaaa ctcaaaataa tggtggctta tttctcatct 18720
aaaaacatcc cggggtgggt ggtctgggac tgatctggtg gacccaggct ccgccttgtt 18780
gcttgactgt tggcagcacc tgcttactta ccactcatgg tgcaagatga cacttcagcc 18840
tccgccaaaa tgctcacctt ccagccagca ggaagtcgga aggagaagaa aggggacaga 18900
gccccatggc gtccatcctt agaggatgct gccacctgaa cctctgcttt catcctgttg 18960
gtcagaaccc agtcacatga ccacacccag tggcaacgga ggctgggaaa tatagtcttt 19020
attttgggca cccatgtgtc cagcaaaact gggggttcca tcagtcggca agaacgggag 19080
agtggccgat gcagtggctg atgcttgtat cccagcactt tgggaggtcg aggtgggcag 19140
atcacctgag gtcaggagtt caagaccagc ctggccaata tggtgaaacc ctgtctctac 19200
taaaaataaa aaaattagct gggtgtgctg gcgcacctgt agtcccagct acttgggagg 19260
ctgaggcagg agaatcgctt gatcttgaga ggtggaggtt gcagtgagcc aagattgtgc 19320
cactgccttc cagcctggga gacagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagggcc 19380
aggcacggtg gctcacacct gtaatcccag cactttggga ggccgagatg ggcggatcac 19440
gaggtcagga gattgagacc atcctggcta acacggtgaa accccatctc tactaaaaat 19500
acaaaaaaat tggccgggca tggtggagta gtcccagcta ctcgggaggc tgaggcagga 19560
gaatggcgtg aacctgggag gcagagcttg cagtgagccg agatcgcgcc actgcactcc 19620
agcctgggca acagagcgag actcttgtct caaaaagaaa aaaagaaaga gaaatctgcc 19680
tcccagcctt gggctcctgc cctaccagcc cacacccctg gtagagcctc ctctcccacc 19740
agctcaaagc ccaagttcct tcactgtgac cttgtctgct cctctaaaac aggcaacacc 19800
agacagtgag aagagccagc cagacatggg cagaaaacct atttctgtga tctactggct 19860
gtgtgagcag gggctagttg ctctctctgg gcctcactga agagaagggt ggcactatgc 19920
tagggccggc acggttgcaa ggtagatgta agatggggta caggtgttgt ggagggcaga 19980
aatgcaccat ccgaaggcta catgtccccc acacttatgt cttgcttggc ccacactgtt 20040
tcattttaaa atcagtagca aacaatttaa aaaatcagaa gatttgcctg catgatgcag 20100
tggctcatgc ctgtaatccc agcactttgg gaggccaagg tgggaggatt gcttgagccc 20160
aggagttcaa gaccagcatg ggcaccatag caagacccct gtttctacaa aaaaaaaaaa 20220
attagaaaat tagccaagtg tggtggcatg cacctgtggt cccagctact tgggaggcag 20280
agggaaagtg agatctcctg ctttttattt ctttatgtat aatgataggg tcttgctctg 20340
ttgcccaggc tggagtgcag tggcatgatc actgctcact gcagccttga tctcctgggc 20400
tcagaggatc ctcccacctc agcctcccaa atagctagga ctagaggtgc ccaccagcat 20460
gctcagcaga tttttaaatc tttttgtaga gatgaggttt tgctatgttg cccaggctgg 20520
tctcgaactc ctggcctcga gcgatcctcc caccttggcc tcccaaagca ctgggattac 20580
agacgtgagc cactgcgccc agcagatttc tctttaacac ctagatttca gcctgagcca 20640
ggcaggcatt cctgaatgaa ccagtagtac tgctcccaga agaagaggtc ctcctccgtg 20700
tgacacagtc cccacttggc ccttgcaggg attggatctg ggatccctgg atttaaactc 20760
agggccatcc tcataacagc ctcacaaggc tgggattagc ttcccagttc acaagggaag 20820
aaaccaagac ttgagaaggt caaggtctgg ccagacccac acatcttgga ccctcatacc 20880
gcctcgaggc cccatgctgc cctctgcctg ctccagatgt gaatactgct ggccctggct 20940
ggccccggct ggccccgagg gtcctaggga tgaacagccc agcccaggga gagctcagcc 21000
ccttgtgcct ctgccccttc ccacctcctg cggaggccag tcgactcacc cacaaagggc 21060
caggcactgt ggggatagat cagctaacaa aacagttgat gcttcctgcc cttctgggcc 21120
ttacattttg gctggaagaa gaggggagag gcagactgta agcaataagc gcaataagta 21180
ggttgcctgg aagtaatgtt agatcacgtt acggaaaaca ggaaagagca gagcgacaag 21240
tgctggggtg cgtggtgcag ggaaggcagc tggctgctgc tggtgtggtc agagtgggcc 21300
ctcatggaga agactgcatt cgagcagaaa cttgaagggg gtgaggggtg agcctagaga 21360
tatctggggc agagcagtcc aggcagaggg gacagccggt gtcaagccca ggacaggagt 21420
gtgcctggtg tgccagtttc aggcaagagg ccagtgtgca gaggcaaggt gagaacgcaa 21480
gggagagcag tggcggagac gggtgggaac gaggtcagac ctgctggcct ccagcctctg 21540
catggggctt ggctcttgct gggagcaatg ggaagcagta cacagtttca tgcaggggga 21600
gaaggcctgt cttgggttgc aggggcacgc tgtggcagct gggatcagag agaggagctt 21660
gtaggccagt tgttatgtgg tcccacgggc cagatggcca tggcttacct cacttcaggg 21720
aggctgtgag aagcactcag aatctggatg tgccttgggg gtgggcccca ctggatttcc 21780
tggtggacct ggtgtggggt gtgagaggag ggtgtgtttg gctgcagcag acaggagaat 21840
ggagttgcca tccgcgtgat ggggatggct gtgggaggag aggtttgggg tgagggaatc 21900
aggaactgag tgctggacat ggcaagtctg aaggcgcagt ggtcgtccac tcagagacct 21960
tggagttgga gatggaggtg tgggagtcct gaacagttag atgtagtgtt taccgcgaga 22020
aggaacaggg cttgcggcca gccctcctgt gttcccgtga cccagggcag ggcaggaggg 22080
gcctgagcct gccgagtgac tgggacctcc ttccaggaga tcatgcacgc cctgaagatg 22140
acctggcacg tgcactgctt tacctgtgct gcctgcaaga cgcccatccg gaacagggcc 22200
ttctacatgg aggagggcgt gccctattgc gagcgaggta cccactggcc agtgagggtg 22260
aggagggatg gtgcatgggg caggcatgaa tccaggtcct ctttctctct gcccccattc 22320
tcagactatg agaagatgtt tggcacgaaa tgccatggct gtgacttcaa gatcgacgct 22380
ggggaccgct tcctggaggc cctgggcttc agctggcatg acacctgctt cgtctgtgcg 22440
gtgagagccc cgcccctcga actgagcccc aagcccaccg gccctctgtt cattccccag 22500
gagatgcagg agaagttggg aaggggcctc tcctgctgcc cccaacccca tgtgactggg 22560
cctttgctgt ccttagatat gtcagatcaa cctggaagga aagaccttct actccaagaa 22620
ggacaggcct ctctgcaaga gccatgcctt ctctcatgtg tgagcccctt ctgcccacag 22680
ctgccgcggt ggcccctagc ctgaggggcc tggagtcgtg gccctgcatt tctgggtagg 22740
gctggcaatg gttgccttaa ccctggctcc tggcccgagc ctggggctcc ctgggccctg 22800
ccccacccac cttatcctcc caccccactc cctccaccac cacagcacac cgatgctggc 22860
cacaccagcc ccctttcacc tccagtgcca caataaacct gtacccagct gtgtcttgtg 22920
tgcccttccc ctgtgcatcc ggaggggcag aatttgaggc acgtggcagg gtggagagta 22980
agatggtttt cttgggctgg ccatctgggt ggtcctcgtg atgcagacat ggcgggctca 23040
tggttagtgg aggaggtaca ggcgagaccc catgtgccag gcccggtgcc cacagacatg 23100
aggggagcca ctggtctggc ctggcttgga ggttagagaa gggtagttag gaagggtagt 23160
tagcatggtg gctcatgcct gtgatcccag cactttggaa ggccaaggtg ggcagatcgc 23220
ttgaggtcag gagttcgaga cctcatggcc aacacggtga aacagcgtct ctagtaaaaa 23280
tacaaaaatt agccgagtgt ggtggggcat gcctgtaatc ccagccactc aggaggctga 23340
ggcgggaaaa tcacttgaac ctgggaagtg gaggttgcag tgagctgaga tcacaccact 23400
gcgcgcgagc ctgggtggca gatggcagag cgagaccctg cttcaaaaaa aaaaaaaaaa 23460
aaaaaaaaaa gaagggtagt tgtagttggg ggtggatctg cagagatatg gtgtggaaaa 23520
cagcaatggc cacagcaaag tcctggaggg gccagctgcc gtccaaacag aagaaggcag 23580
ggctggagag ggtagccctt aggtcctggg aagccacgag tgccaggcag tagagctggg 23640
gctgtctctt gaggttaggg cagggcaagg cacagcagag tttgaaatag gtttgtgttg 23700
tattgcagaa aagaggcccc agaacactga gggagtgcag gagggaggct gggaggagga 23760
gttgcagcag ggcctagggg cgggggccag gcaagggagg ggcagagagt aatatggcag 23820
agatgggacc cagtggcagg tccgggggat gagggatgga gagaaggaca ggagcgttgc 23880
caggcatctg gcctatacca gacatgctca cgctgtctcc cgcgaacctc ctagcaacct 23940
tgcgccgttg tctgcaatca cttatttcat tttttctttt ttaactttaa ttttttttgt 24000
ttttaagaga caggatctcc ctaggttgcc cgggctggtt tcaaactcct gggctcaagc 24060
aattcttcct ccttagcccc aaagtgctgg cattacaggt gtgagccacc atgcctggcc 24120
cacttatttt ctagatgagg cacagaaaga ttgggagact tgaccaaggt cacgctgtca 24180
ttgagccatg agccagacta gaatccaggc ctgaagctgg gtgcgctgtc ccaggactgg 24240
ctggcactga gtaccatttg ccagcgagca tctctctggg aagctgactt ctgcccggta 24300
cctggaggac tgtagacctt ggtggtggcg ccgtcactct ggggcttcct gcctcccact 24360
gatgcccgca ccaccctaga gggactgtca tctctcctgt cccaagcctg gactggaaag 24420
actgaagaga agccttaagt aggccaggac agctcagtgt gccatggctg cccgtccttc 24480
agtggtccct ggcatgagga cctgcaacac atctgttagt cttctcaaca ggcccttggc 24540
ccggtcccct ttaagagacg agaagggctg ggcacggtga ctcacacctc taatcccagc 24600
actttggaag gctgaggctg gagaagggct ccagcttagg agttcaggac cagcctgggc 24660
aacatggtga gaccctgttt tgttttgttt tttgtttttt tgagatggag tcttgctctg 24720
tcgcccaggc tggagtgcag                                             24740
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>42
gcactactt gaaggaatcc atggt                                        25

Claims (50)

1.一种在哺乳动物非骨细胞中表达LIM矿化蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
用分离的核酸转染细胞，所述核酸包含可操作连接于启动子的编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞能产生蛋白聚糖和/或胶原，且其中LIM矿化蛋白的表达刺激细胞中蛋白聚糖和/或胶原的合成。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离的核酸：
在标准条件下和与全长SEQ.ID NO：25互补的核酸分子杂交；和/或
在高度严格条件下和与全长SEQ.ID NO：26互补的核酸分子杂交。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞是干细胞、椎间盘细胞、髓核细胞或纤维环细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞体外转染。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞体内转染。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞通过直接注射核酸到哺乳动物椎间盘进行体内转染。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸在载体中。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述载体是表达载体。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述表达载体是质粒。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述病毒是腺病毒。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述病毒是逆转录病毒。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述腺病毒是AdHLMP-1。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子是巨细胞病毒启动子。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白聚糖是硫酸化粘多糖。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LIM矿化蛋白是RLMP、HLMP-1、HLMP-1s、HLMP-2或HLMP-3。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LIM矿化蛋白是HLMP-1。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LIM矿化蛋白的表达增加细胞中一个或多个骨形态发生蛋白的表达。
20.一种哺乳动物非骨细胞，其特征在于，所述细胞包括编码LIM矿化蛋白的分离的核酸序列。
21.如权利要求20所述的哺乳动物非骨细胞，其特征在于，所述细胞是干细胞、纤维环细胞、髓核细胞或椎间盘细胞。
22.如权利要求20所述的哺乳动物非骨细胞，其特征在于，所述细胞是多能干细胞或间质干细胞。
23.一种治疗哺乳动物椎间盘损伤或疾病的方法，其特征在于，所述方法包括：
将分离的核酸转染到能产生蛋白聚糖和/或胶原的哺乳动物细胞；
其中所述分离的核酸包含可操作连接于启动子的编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列，其中所述LIM矿化蛋白的表达刺激细胞中蛋白聚糖和/或胶原合成。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述方法反转、防止或延迟盘变性。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述盘疾病是变性性盘疾病、下腰痛、盘疝形成或椎管狭窄。
26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述细胞是椎间盘细胞，其中所述细胞通过直接注射分离核酸到哺乳动物椎间盘进行体内转染。
27.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞体外转染，随后移植到哺乳动物中。
28.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是哺乳动物非骨细胞。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是干细胞、椎间盘细胞、纤维环细胞或髓核细胞。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是多能干细胞或间质干细胞。
31.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述分离的核酸在载体中。
32.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述分离的核酸在表达载体中。
33.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述分离的核酸在质粒中。
34.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述分离的核酸在病毒中。
35.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述分离的核酸在腺病毒中。
36.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述分离的核酸在逆转录病毒中。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述腺病毒是AdHLMP-1。
38.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述启动子是巨细胞病毒启动子。
39.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述LIM矿化蛋白是RLMP、HLMP-1、HLMP-1s、HLMP-2或HLMP-3。
40.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述LIM矿化蛋白是HLMP-1。
41.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述分离的核酸：
在标准条件下和与全长SEQ.ID NO：25互补的核酸分子杂交；和/或
在高度严格条件下和与全长SEQ.ID NO：26互补的核酸分子杂交。
42.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞移植到椎间盘。
43.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
使转染细胞在移植到哺乳动物前与载体结合。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述载体包括多孔基质。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述载体包括合成聚合体或胶原基质。
46.一种椎间盘移植物，其特征在于，所述移植物包括：
载体物质；
哺乳动物细胞集合，其中包含编码LIM矿化蛋白的分离的核酸序列；
其中所述载体物质包括生物适合物质的多孔基质，且其中所述哺乳动物细胞结合到载体中。
47.如权利要求46所述的移植物，其特征在于，所述哺乳动物细胞选自干细胞、纤维环细胞、髓核细胞、椎间盘细胞和它们的组合。
48.如权利要求46所述的移植物，其特征在于，所述哺乳动物细胞是多能干细胞、间质干细胞或它们的组合。
49.如权利要求46所述的移植物，其特征在于，所述生物适合物质包括合成聚合体或蛋白质。
50.如权利要求46所述的移植物，其特征在于，所述生物适合物质包括胶原。
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