KR100255415B1 - 비엠피-9 조성물 - Google Patents
비엠피-9 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100255415B1 KR100255415B1 KR1019930704031A KR930704031A KR100255415B1 KR 100255415 B1 KR100255415 B1 KR 100255415B1 KR 1019930704031 A KR1019930704031 A KR 1019930704031A KR 930704031 A KR930704031 A KR 930704031A KR 100255415 B1 KR100255415 B1 KR 100255415B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- bmp
- sequence
- protein
- seq
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108010090290 Growth Differentiation Factor 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 112
- 102000037280 Growth Differentiation Factor 2 Human genes 0.000 title claims abstract description 111
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 60
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 37
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 230000011164 ossification Effects 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 21
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 claims 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 abstract description 8
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 abstract description 7
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 39
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 37
- 101000893585 Homo sapiens Growth/differentiation factor 2 Proteins 0.000 description 32
- 102000046041 human GDF2 Human genes 0.000 description 32
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 23
- 101000844802 Lacticaseibacillus rhamnosus Teichoic acid D-alanyltransferase Proteins 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 101100408682 Caenorhabditis elegans pmt-2 gene Proteins 0.000 description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 12
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 9
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 7
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 5
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 4
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- 108010049976 Bone Morphogenetic Protein 5 Proteins 0.000 description 3
- 102100022526 Bone morphogenetic protein 5 Human genes 0.000 description 3
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 101001023985 Mus musculus Growth/differentiation factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 3
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 102000046148 human BMP4 Human genes 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010049951 Bone Morphogenetic Protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 108010049974 Bone Morphogenetic Protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 description 2
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100024504 Bone morphogenetic protein 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100022525 Bone morphogenetic protein 6 Human genes 0.000 description 2
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 2
- 108010019691 inhibin beta A subunit Proteins 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000008470 skin growth Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940078499 tricalcium phosphate Drugs 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920002818 (Hydroxyethyl)methacrylate Polymers 0.000 description 1
- 238000008940 Alkaline Phosphatase assay kit Methods 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 102100028728 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100022545 Bone morphogenetic protein 8B Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000003044 Closed Fractures Diseases 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100040897 Embryonic growth/differentiation factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108010090296 Growth Differentiation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000899368 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 8B Proteins 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 208000002565 Open Fractures Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- -1 SEQ ID NO: 2 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000004645 aluminates Chemical class 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000003462 bioceramic Substances 0.000 description 1
- 239000005312 bioglass Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000014461 bone development Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- WZRZTHMJPHPAMU-UHFFFAOYSA-L disodium;(3e)-3-[(4-amino-3-sulfonatophenyl)-(4-amino-3-sulfophenyl)methylidene]-6-imino-5-methylcyclohexa-1,4-diene-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C(=N)C(C)=CC1=C(C=1C=C(C(N)=CC=1)S([O-])(=O)=O)C1=CC=C(N)C(S(O)(=O)=O)=C1 WZRZTHMJPHPAMU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000011327 histological measurement Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000013289 male long evans rat Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000013077 scoring method Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Abstract
정제된 BMP-9단백질 및 이의 제조방법이 공개된다. 이 단백질은 뼈 및 연골 손상의 치료 및 상처치료와 관련 조직 재생에 사용될 수 있다.
Description
[발명의 명칭]
비엠피-9 조성물
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 BMP-9 단백질로 명명된 새로운 계통의 정제단백질 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 이 단백질은 뼈 및/또는 연골형성의 유도 및 상처치료와 조직 재생에 사용될 수 있다.
쥐 BMP-9 DNA 서열(SEQ ID NO:1)및 아미노산 서열(SEC ID NO:2)을 제1도에 나타낸다. 인간 BMP-9 서열을 제3도(SEQ ID NO:8 및 SEG ID NO:9)에 나타낸다. BMP-9 단백질이 연골 및/또는 뼈의 형성을 유도할 수 있다는 것이 관찰되었다. BMP-9단백질은 하기하는 쥐 뼈 형성 분석에서 연골 및/또는 뼈 형성 활성을 나타냄을 특징으로 한다.
쥐 BMP-9은 제1도(SEQ ID NO:2 아미노산 # 1-110)의 아미노산 #319 내지 # 428을 포함하는 것을 특징으로 한다. 쥐 BMP-9는 제1도(SEG ID NO:1)에 나타낸 뉴클레오티드 # 610 내지 뉴클레오티드 # 1893을 포함하는 DNA서열로 형질 전환된 세포를 배양하고 배양배지로부터 동시에 제조되는 기타단백질 물질이 실질적으로 얻는 제1도(SEG ID NO:2)에 나타낸 바와 같은 아미노산 # 319 내지 # 428을 포함하는 아미노산 서열을 특징으로 하는 단백질을 회수 및 정제함으로써 제조될 수 있다.
인간 BMP-9는 쥐 BMP-9과 유사한 것으로 예상되며, 제3도(SEQ ID NO:9)의 아미노산 # 1(Ser, Ala, Gly) 내지 # 110(Arg)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 인간 BMP-9를 코딩하는 DNA를 수득하기 위한 방법을 포함한다. 이 방법은 표준기술을 사용하여 인간유전자 또는 그의 단편에 대한 라이브러리를 스크린하기 위한 프로브를 만드는데 쥐 BMP-9 뉴클레오티드서열 또는 그의 일부분을 이용하는 것을 필요로 한다. 인간BMP-9는 BMP-9 DNA서열로 형질전환된 세포를 배양하고 배양배지로부터 BMP-9를 회수 및 정제함으로써 제조될 수 있다. 발현 단백질을 배양 배지로부터 분리, 회수, 및 정제한다. 정제발현 단백질은 기타 오염물질 뿐만이 아니라 동시에 제조되는 기타 단백질 물질을 실질적으로 함유하지 않는다. 회수 정제단백질은 연골 및/또는 뼈 형성 활성을 나타내는 것으로 관찰된다. 본 발명의 단백질은 하기의 쥐 뼈 형성 분석에서 연골 및/또는 뼈 형성 활성을 나타내는 것을 또 다른 특징으로 할 수 있다.
인간 BMP-9는 SEQ ID NO:8에 나타낸 뉴클레오티드 # 124 내지 # 453을 포함하는 DNA서열로 형질 전환된 세포를 배양하고 배양배지로부터 동시에 생산되는 기타 단백질 물질을 실질적으로 함유하지 않는 아미노산 # 1 내지 아미노산 # 110의 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 특징으로 하는 단백질을 회수 및 정제함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 제약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체 내에 치료학적 유효량의 BMP-9 단백질을 함유하는 제약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 BMP-9 조성물은 연골형성에 사용될 수 있다. 이들 조성물은 또한 뼈 형성에도 사용될 수 있다. BMP-9 조성물은 상처치료 또는 조직 회복에도 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 1종 이상의 치료적으로 유용한 체제, 예컨대 PCT 공고 WO 88/00205, WO 89/10409 및 WO 90/11366에 공개되어 있는 BMP 단백질 BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 및 BMP-7과 1991년 1월 15일자로 출원된 미합중국 출원 제07/641,204호, 1990년 5월 16일자로 출원된 제07/525,357호 및 1991년 11월 20일자로 출원된 제07/800,364호에 공개된 BMP-8을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 BMP-9단백질 외에, 피부 성장 인자(EGF), 섬유 아세포 성장인자(FGF), 형질전환 성장 인자(TGF-α 및 TGF-β)및 인슬린-유사 성장 인자(IGF)를 포함할 수 있다. 이 조성물은 또한 예를 들면 조성물을 담지하고 뼈 및/또는 연골성장용 표면을 제공하기 위한 적절한 매트릭스를 포함할 수 있다. 이 매트릭스는 뼈 유도 단백질의 서방 및/또는 그의 보존에 적절한 환경을 제공할 수 있다.
BMP-9 조성물은 여러 뼈 및/또는 연골 결함, 치근막 질환 및 다양한 유형의 상처를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 이들 방법은 뼈 및/또는 연골 형성, 상처 치료 또는 조직 재생을 필요로 하는 환자에서 유효량의 BMP-9단백질을 투여하는 것을 포함한다. 이들 방법은 또한 본 발명의 단백질을 상기공동 소유출원에 공개된 1종 이상의 신규BMP 단백질과 함께 투여하는 것을 포함한다. 또한, 이들 방법은 EGF, FGF, TGF-α, TGF-β 및 IGF를 포함하는 기타 성장 인자와 함께 BMP-9 단백질을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 BMP-9단백질의 발현을 위한 DNA코딩 서열이다. 이러한 서열은 제1도(SEQ ID NO:1)및 제3도(SEQ ID NO:8)에 나타낸 5′에서 3′방향으로의 뉴클레오티드서열 또는 특정 조건 하에서 제1도 또는 제3도의 DNA서열과 하이브리다이즈되며 연골 및/또는 뼈의 형성을 유도할 수 있는 단백질을 코딩하는 DNA서열을 포함한다. 최종적으로, 제1도 또는 제3도의 서열의 대립 형질적인 또는 그 외의 변형이, 이러한 뉴클레오티드의 변화가 펩티드서열을 변화시키느냐 아니냐에 따라, 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또 다른 양상은 발현 조절 서열과 연관되어 조작되는 상기한 바와 같은 DNA서열을 포함하는 백터를 포함한다. 이들 벡터는 발현조절서열과 연관되어 조작되는 BMP-9단백질을 코딩하는 DNA서열로 형질 전환된 세포주를 적절한 배양배지에서 배양하고 BMP-9단백질을 회수 및 정제하는 본 발명의 신규BMP-9단백질 제조방법을 사용할 수 있다. 이 방법은 폴리펩티드 발현용 숙주세포로서 다수의 공지된 원핵 및 진핵세포를 사용할 수 있다.
본 발명의 기타 양상 및 잇점은 하기 설명 및 바람직한 실시양태로부터 명백할 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 하기한 클론ML14a로 부터의 쥐BMP-9의 DNA서열 및 유도아미노산 서열을 포함한다.
제2도는 lambda U2OS-3 ATCC #40342로부터의 인간 BMP-4의 DNA서열 및 유도 아미노산 서열을 포함한다.
제3도는 入 FIX/H6111 ATCC # 75252로부터의 인간 BMP-9의 DNA 서열 및 유도 아미노산 서열을 포함한다.
[발명의 상세한 설명]
쥐 BMP-9뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:1)및 코딩된 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 제1도에 나타낸다.
본 발명의 정제된 BMP-9 단백질을 뉴클레오티드 # 610 내지 뉴클레오티드# 1893의 제1도(SEQ ID NO:1)의 DNA 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고 배양 배지로부터 제1도(SEQ ID NO:2)의 아미노산# 319내지 # 428로 표시되는 아미노산서열 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 단백질을 배양배지로부터 회수 및 정제함으로써 제조할 수 있다. 배양배지로부터 회수된 BMP-9단백질을 동시에 제조되는 기타 단백질 물질 및 존재하는 기타 오염물질로부터 분리함으로써 정제한다.
인간 BMP-9 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 SEQ ID NO:8 및 9에 묘사한다. 성숙한 인간 BMP-9는 아미노산 #1(Ser, Ala, Gly)내지 # 110(Arg)를 포함하는 것으로 예상된다.
인간BMP-9는 SEQ ID NO : 8에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 # 124 내지 # 453을 포함하는 DNA 서열로 형질전환된 세포를 배양하고 배양배지로부터 SEQ ID ND:9 아미노산 # 1 내지 아미노산 # 110의 아미노산 서열을 특징으로 하며 동시에 생산되는 기타 단백질 물질이 실질적으로 없는 단백질을 회수 및 정제함으로써 제조될 수 있다.
BMP-9 단백질은 연골 형성을 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다. BMP-9단백질은 또한 뼈의 형성을 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다. BMP-9 단백질은 또한 하기의 쥐 뼈 형성 분석에서 연골 및/또는 뼈 형성을 나타냄을 특징으로 할 수 있다.
여기에서 제공된 BMP-9 단백질은 또한 제1도 및 제3도(SEQ ID NO:1 및 8)의 서열과 유사한, 변형이 자연적으로 제공되거나(예를 들면 폴리펩티드의 아미노산 변화를 결과할 수 있는 뉴클레오티드서열의 대립 형질적 변화), 신중히 가공된 서열에 의해 코딩되는 인자를 포함한다. 예를 들면, 합성 폴리펩티드는 제1도 및 제3도(SEQ ID NO:2 및 9)의 연속적인 아미노산 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 복제할 수 있다. 이들 서열들은 1차, 2차, 또는 3차 구조 및 구조적 특성을 제1도 및 제3도의 뼈성장 인자와 공유함으로써 통상적인 뼈성장 인자의 생물한적 특성을 가질 수 있는 것이다. 그러므로, 이들을 치료과정에서 자연발생 BMP-9및 기타BMP-9 폴리펩티드에 대한. 생물학적 활성 대체물로서 사용할 수 있다.
여기에 기술된 BMP-9단백질 서열의 기타특정 돌연변이는 글리코실화부위의 변형을 포함한다. 이들 변형은 O-결합 또는 N -결합 글리코실화부위를 포함할 수 있다. 예를 들면 글리코실화의 부재 또는 단지 부분적인 글리코실화만으로 아스파라긴-결합 글리코실화 인식부위에서의 아미노산 치환 또는 결실을 결과한다. 아스파라긴 결합 글리코실화 인식 부위는 적절한 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열을 포함한다. 이들 트리펩티드 서열은 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린이며, 여기에서 X는 통상적으로 임의의 아미노산이다 글리코실화 인식 부위의 제1 또는 제3아미노산의 한쪽 또는 양쪽 모두에서의 다양한 아미노산 치환 또는 결실(및/또는 제2위치에서의 아미노산결실)은 변형 트리펩티드 서열에서의 비글리코실화를 결과한다.
본 발명은 또한 기타 단백질 물질을 코딩하는 DNA 서열과의 연계가 없으며 BMP-9단백질의 발현을 코딩하는 신규DNA서열을 또한 포함한다. 이들 DNA 서열은 5′에서 3′방향으로의 제1도 또는 제3도(SEQ ID NO:1 및 8)에 나타낸 서열 및 특정 하이브리다이제이션 조건[참조, T. Maniatis 등, Molecular Cloning(A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory(1982), page 387-389]하에서 상기 서열에 하이브리다이즈되며 연골 및/또는 뼈 유도 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다.
유사하게, 제1도 또는 제3도의 서열에 의해 코딩된 BMP-9 단백질을 코딩하나 유전코드의 변성 또는 대립 형질적 변화(아미노산변화를 야기하거나 야기할 수 없는 종집단 내에서의 자연발생 염기 변화)로 인하여 코돈 서열에 차이가 있는 DNA서열 또한 여기에 기재된 신규인자를 코딩한다. 코딩되는 폴리펩티드의 활성, 반감기 또는 제조를 증진시킬 수 있는 점 변이 또는 유도변형(삽입, 결실 및 치환포함)에 의해 변형된 제1도 또는 제3도의(SEQ ID NO:1 및 8)의 DNA 서열 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또 다른 양상은 BMP-9단백질의 신규 제조방법을 제공한다. 본 발명의 이 방법은 본 발명의 BMP-9단백질을 코딩하는 DNA서열로 형질전환된 적절한 세포주를 공지된 조절서열의 조절 하에서 배양하는 것을 포함한다. 형질 전환된 숙주세포를 배양하고 BMP-9단백질을 배양배지로부터 회수 및 정제한다. 정제단백질은 기타 오염물질뿐만이 아니라 동시에 제조되는 기타 단백질을 실질적으로 함유하지 않는다.
적절한 세포 또는 세포계는 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소세포(CHO)일 수 있다. 적절한 포유동물 숙주 세포의 선택과 형질전판, 배양, 중식, 스크리닝, 생성물 제조 및 정제방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, Gething 및 Sambrook, 「Nature, 293:620~625(1981), 또는 대안적으로 Kaufman 등, Mol. Cell. Biol., 5(7):1750∼1759(1985) 또는 Howley 등, 미합중국 특허 제4,419,446호를 참조한다. 첨부 실시예에 기술된 또 다른 적절한 포유동물 세포계는 원숭이 COS-1세포계이다. 포유동물 세포 CV-1 또한 적절할 수 있다.
세균세포 또는 적절한 숙주이다. 예를 들면, 이. 콜리(예를 들면, HB101, MC1061)의 다양한 균주가 유전공학 분야에 숙주세포로서 공지되어 있다. 비. 서브틸리스, 슈도모나스, 기타 바실러스 등의 여러 균주를 이 방법에 또한 사용할 수 있다.
당 분야에 공지된 효모 세포의 여러 균주를 본 발명 폴리펩티드의 발현용 숙주세포로서 이용할 수 있다. 추가적으로 원한다면, 곤충 세포를 본 발명의 방법에서 숙주세포로서 이용할 수 있다. 예를 들면, Miller 등의 Genetic Engineering, 8:277∼298(Plenum Press 1986)및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다.
본 발명의 또 다른 양상은 이들 신규 BMP-9폴리펩티드의 발현 방법에 사용하기 위한 벡터를 제공한다. 바람직하게 벡터는 본 발명의 신규 인자를 코딩하는 완전히 신규한 상기 DNA서열을 함유한다. 추가적으로, 이 벡터는 또한 BMP-9단백질 서열을 발현시키는 적절한 발현 조절 서열을 함유한다. 대안적으로, 상기한 바와 같이 변형된 서열을 포함하는 벡터 또한 본 발명의 구현예이다. 이 벡터는 세포주를 형질전환시키는 방법에 사용될 수 있으며, 선택된 숙주세포내에서 복제 및 발현을 조정할 수 있는 본 발명의 DNA 코딩 서열과 연관되어 조작되는 선택된 조절 서열을 함유할 수 있다. 각 벡터에 대한 조절 서열은 당 분야 숙련인에게 공지되어 있으며 숙주세포에 따라서 선택될 수 있다. 이러한 선택은 통상적인 일이며, 본 발명의 일부를 형성하지 못한다.
뼈가 보통 형성되지 않는 환경 하에서 연골 및/또는 뼈 형성을 유도하는 본 발명의 단백질을 인간과 기타 동물의 골절 및 연골 손상을 치료하는데 사용한다. BMP-9단백질을 사용하는 제제는 폐쇄 및 개방골절 환원과 인공관절의 개선된 고정의 용도를 가질 수 있다. 골형성제에 의해 유도된 새로운 뼈 형성은 선천성의, 외상에 의한 손상 또는 종양 절개에 의한 두개 안면 결함을 회복시키고 또한 성형 수술에 유용하다. BMP-9단백질은 치근막 질병의 치료와 기타 치아 회복시 사용될 수 있다. 이러한 약제는 뼈 형성세포를 유인하고, 뼈 형성 세포의 성장을 촉진하거나 뼈 형성 세포의 원종 증식을 유도하는 환경을 제공할 수 있다. 본 발명의 BMP-9 폴리펩티드는 골다공증의 치료에 유용할 수 있다. 다양한 뼈 및 연골유도 인자가 기술되어있다. 예를 들면 유럽 특허 출원 제148,155호와 제169,016호를 참고한다.
본 발명의 단백질을 상처 치료 및 관련 조직 회복에 사용할 수 있다. 상처의 형태는 화상, 절개 및 궤양을 포함하나 이것만으로 제한되는 것은 아니다(참조, 예를 들면 PCT공고 WO 84/01106, 상처 치료 및 관련 조직 회복).
본 발명의 단백질은 신경 재생을 증가시킬 수 있으므로 이식 및 신경재생의 감소를 나타내는 조건의 치료에 유용하다.
본 발명의 또 다른 양상은 골절 및 연골 및/또는 뼈 손상 또는 치근막 질병과 관련된 기타 증상을 회복시키기 위한 치료 방법 및 조성물이다. 본 발명은 상처 치유 및 조직 재생용 치료 방법 및 조성물을 포함한다. 상기조성물은 제약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 매질과의 혼합물 상태로 1종 이상의 본 발명의 BMP-9단백질의 치료학적으로 유효한 양을 포함한다.
본 발명의 단백질은 기타 관련 단백질 및 성장인자와 함께 또는 아마도 상승적으로 작용할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 치료방법 및 조성물은 상기한 공동소유 출원에 공개된 1종 이상의 기타 BMP단백질의 치료학적 양과 함께 본 발명의 1종 이상의 BMP-9단백질의 치료학적 양을 포함한다. 상기 조합은 BMP 단백질의 별개 분자 또는 여러 BMP 부분을 포함하는 이종분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법 및 조성물은 BMP 단백질 서브 유니트와 상기한 “BMP” 단백질중 하나로부터의 서브 유니트를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태는 BMP-9 부분의 이종 이량체를 포함할 수 있다. 또한, BMP-9단백질은 문제의 뼈 및/또는 연골손상, 상처 또는 조직을 치료하는데 이로운 기타 약제와 합해질 수 있다. 이들 시약은 피부성장 인자(EGF), 혈소판 유도 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장인자(TGF-α 및 TGF-β)와 인슐린 유사 성장 인자(IGF)와 같은 다양한 성장 인자를 포함한다.
pH로 인한 등장성, 안정성 등을 갖는 상기 생리학적으로 허용 가능한 단백질 조성물의 제조 및 배합은 당 분야의 기술 범위내이다. 치료조성물은 또한 BMP단백질내의 종 특이성이 없기 때문에 가축에 사용하기 위해서도 유용하다. 인간과 더불어 가축 및 순종 말이 본 발명의 BMP-9단백질로 상기질병을 치료하기에 특히 바람직한 환자이다.
치료 방법은 조성물을 국소적으로, 계내로 또는 이식물 또는 장치를 사용하여 소역적으로 투여하는 것을 포함한다. 투여될 때, 본 발명에 사용하기 위한 치료적 조성물은 물론 발연물질이 없는 생리적으로 허용 가능한 형태이다. 또한 조성물은 뼈, 연골 또는 조직손상 부위로 분비되기 위하여 캡슐화되거나 점성있는 형태로 주사제로 만들어질 수 있다. 국소 투여는 상처치유 및 조직회복에 적절할 수 있다. 상기한 조성물 내에 또한 임의적으로 포함될 수 있는 BMP-9 단백질 이외의 치료학적으로 유용한 약제는 대안적으로 또는 추가적으로 본 발명 방법에서 BMP조성물과 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다.
뼈 및/또는 연골형성을 위해서, 바람직하게 조성물은 BMP-9또는 기타단백질을 뼈 및/또는 연골 손상 부위에 분비하고, 뼈 및 연골 발달을 위한 구조를 제공하며 임의적으로 뼈 내로 다시 흡수될 수 있는 매트리스를 포함할 수 있다. 상기 매트릭스는 기타 이식 의약 조성물에 현재 사용되고 있는 물질로 형성될 수 있다.
매트릭스 물질의 선택은 생혼화성, 생분해성, 기계적 특성, 표면 외관 및 접촉특성을 기준으로 한다. BMP-9조성물의 특정 사용이 적절한 제제를 한정할 것이다. 조성물용 매트릭스로서는 생분해 가능하고 화학적으로 정의된 칼슘 스테아레이트, 트리칼슘포스페이트, 히드록시아파타이트, 폴리액트산 및 폴리안히드라이드 일 수 있다. 기타 가능한 물질은 생분해 가능하고 생물학적으로 정의된 예컨대 뼈 또는 피부콜라겐이다. 또 다른 매트릭스는 순수 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분을 포함한다. 기타 가능한 물질은 생분해될 수 없으며 화학적으로 정의된, 예컨대 소결 히드록시 파타이트, 생유리, 알루미네이트 또는 기타 세라믹이다. 매트릭스는 임의의 상기 유형 물질의 조합, 예컨대 폴리아세트산 및 히드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 트리칼슘포스페이트를 포함할 수 있다. 바이오세라믹, 예컨대 알루미네이트-포스페이트 및 가공물의 조성이 기공크기, 입자크기, 입자형태, 및 생분해성을 변경시키기 위하여 변경될 수 있다.
투여량은 BMP-9단백질의 작용을 변경시킬 수 있는 여러 인자 예를 들면 뼈의 원하는 형성 중량, 뼈 손상부위, 손상뼈의 상태, 상처의 크기, 손상조직의 형태, 환자의 연형, 성별 및 식이요법, 임의 감염의 정도, 투여시간 및 기타 임상적 요건을 고려한 의사의 의견에 따라서 투여 표준량을 결정할 수 있다. 투여량은 조성물내의 BMP 단백질의 유형 및 재구성에 사용되는 매질의 형태에 따라서 다양하게 변화할 수 있다. 최종 조성물에 IGF I(인슐린 유사성장 인자 I)과 같은 기타 공지 인자들 참가하는 것 또한 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 진전 과정을 뼈 성장 및/또는 회복의 주기적 관찰, 예를 들면 X -레이, 조직학적 측정 및 테트라사이클린 라벨링에 의해 관찰할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 실행을 기술하는 것이며, 쥐 BMP-9단백질의 회수 및 특징화와 인간 및 기타 BMP-9 단백질을 회수하기 위하여 이들 사용하여 인간 단백질 수득하고, 재조합 기술을 통해 단백질을 발현하는 것을 설명한다.
[실시예 Ⅰ]
[쥐 BMP-9]
백터 lambdaZAP(Stratagene/Catalog # 935302)에서 만들어진 쥐간 cDNA라이브러리의 750,000 재조합체를 플레이팅하고 니트로셀룰로오즈 레플리카를 만든다. 제2도(SEQ ID NO:3)(인간 BMP-4 서열)의 뉴클레오티드 1330-1627에 상응하는 인간 BMP-4 DNA 단편을 Feinderg 등의 랜덤 프라이밍 방법 [Anal. Biochem. 132:6-13(1983)]에 의해32P로 표지한 다음 SHB 내에서 60℃에서 2 내지 3일간 필터의 양 세트에 하이브리다이즈한다. 필터의 양 셋트를 완화된 특정 조건하에서 세척한다(4XSSC, 60℃에서 0.1% SDS). 다양한 강도(대략 92)의 복제 하이브리다이징 재조합체가 관찰된다. 50개의 가장 강한 하이브리다이징 재조합체 박테리오 파지를 플라크 정제하며 그들의 삽입물을 제조자(Stratagene)가 쓴 생체내 절채 실험 방법에 따라서 플라스미드 Bluescript SK(+/-)로 이동시킨다. 수개 재조합체의 DNA 서열을 분석하였더니, 기타 BMP단백질 및 TGF-β계의 기타 단백질과 유사한 단백질을 코딩함을 나타낸다. ML14a로 명명된 한 재조합체의 DNA서열 및 유도아미노산서열을 제1도(SEQ ID NO:1)에 나타낸다.
클론 ML14a의 뉴클레오티드 서열은 428 아미노산의 BMP-9 단백질을 코딩하는 1284bp의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유한다. 코딩된 428 아미노산 BMP-9 단백질은 코딩 서열로서의 1차 번역 생성물이 세 개 모두의 리딩 프레임 내에서 스톱 코돈과 함께 609bp의 5′ 비번역 서열 뒤에 있는 것으로 관찰된다. 428 아미노산 서열도 48,000달톤 분자량의 BMP-5 단백질을 예견한다.
기타 BMP단백질 및 기타 TGF-β계 단백질에 대한 지식을 기초로 하여, 전구체 폴리펩티드는 ARG-X-X-ARG의 제안된 일치단백질 분해성 가공서열과 일치하는 다염기 서열 ARG-ARG-LYS-ARG에서 분해될 것으로 예상된다. 이 위치에서의 BMP-9전구체 폴리펩티드의 분해는 # 319위치의 아미노산 SER로 시작되는 110아미노산 숙성 펩티드를 발생한다. 숙성 형태로의 BMP-9의 가공은 관련 단백질 TGF-β의 가공 [L. E. Gentry, 등, Molec. ＆Cell. Biol. 8:4162(1988); R. Derynck, 등, Nature 316; 701(1985)]과 유사한 방법에 따른 이량체화와 N - 말단 영역의 삭제를 포함할 것이다.
그러므로, 쥐 BMP-9의 숙성 활성종은 2개의 폴리펩티드의 호모다이머를 포함하며, 아미노산 # 319∼# 428을 포함하는 각각의 서브유니트는 대략 12,000달톤의 예상 분자량을 갖는 것으로 관찰된다. 또 다른 활성종은 아미노산 # 326~# 428을 포함하여서 첫 번째 보존 시스테인 잔기를 포함하는 것으로 관찰된다. 단백질의 TGF-β계 및 BMP의 다른 멤버로서, BMP-9단백질의 카르복시 말단 영역은 아미노 말단 부분에 비하여 보다 높은 서열 보존율을 나타낸다. 기타 인간 BMP단백질 및 TGF-β계의 기타단백질의 상응하는 영역에 대한 시스테인-풍부 C말단 영역(아미노산 # 326~# 428)내의 쥐 BMP-9 단백질의 동일 아미노산 비율은 다음과 같다:BMF-2, 53%; BMP-3,43%; BMP-4,53%; MP-5,55%; BMP-6,55%; BMP-7,53%; Vgl,50%; GDF-143%; TGF-β1, 32%; TGF-β2, 34%; TGF-β3, 34%; inhibin β(B), 34% 및 inhibin β(A), 42%.
[실시예 Ⅱ]
[인간 BMP-9]
쥐 및 인간의 뼈유도 인자 유전자는 상당히 유사한 것으로 예견되므로 쥐 코딩 서열 또는 그의 일부는 인간 게놈 라이브러리를 스크린하는 프로브 또는 유사인간 연골 및/또는 뼈 단백질을 합성하는 인간 세포계 또는 조직을 확인하기 위한 프로브로서 사용된다. 인간 게놈 라이브러리(Toole등, 상기 기재되어 있음)를 상기 프로브로 스크리닝 할 수 있으며, 가정 포지티브가 분리되고 DNA서열이 수득된다. 이 재조합체가 인간BMP-9의 일부를 코딩한다는 증거는 쥐/인간단백질 및 유전자 구조의 유사성이다.
인간 연골 및/또는 뼈 유도 인자 분자 부분을 코딩하는 DNA 함유 재조합체 박테리오파지가 일단 수득되면, 인간 코딩 서열이 BMP-9를 합성하는 인간세포계 또는 조직을 확인하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 쥐의 코딩 서열을 인간 세포계 또는 조직을 확인하는데 사용할 수 있다. 간략하게 기술하자면, RNA는 선택된 세포 또는 조직원으로부터 추출되며 포름알데히드 아가로오스겔 상에서 전기 영동되고 니트로셀룰로오즈로 이동되거나, 포름알데히드와 반응되고 니트로셀룰로로즈에 직접 스폿팅된다. 이 니트로셀룰로오즈를 쥐 또는 인간 BMP-9의 코딩서열로부터 유도된 프로브에 하이브리다이즈한다. mRNA가 oligo(dT) 셀룰로오즈 크로마토그래피에 의해 선택되며 확립된 기술(Toole등, 상기 기재되어 있음)에 의해 lambda gt 10 또는 lambda ZAP 내에서 합성되고 클로닝된다.
당 분야에 공지된 방법을 본 발명의 인간 및 기타종의 BMP단백질을 분리하는데 사용할 수 있다.
[A. 인간 BMP-9 DNA의 분리]
백터 入FIX(Stratagene 카탈로그 # 944201)에서 구축된 인간 게놈 라이브러리의 일백만 재조합체를 플레이팅하고 복제 니트로셀룰로오즈 레플리카를 만든다. 제1도(SEQ ID NO:1)에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 # 1665~# 1704 및 # 1837~1876을 기준으로 하여 계획된 2개의 올리고뉴클레오티드를 자동화 DNA 합성기상에서 합성한다. 이들 두개의 올리고 뉴클레오티드의 서열을 하기에 나타낸다:
이들 2개의 올리고 뉴클레오티드 프로브를 γ32P-ATP로 방사능으로 표지하고 각각을 1세트의 복제 니트로셀룰로오즈 레플리카로 SHB내에서 65℃에서 하이브리다이즈 하고 1X SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 세척한다. 양쪽 올리고뉴클레오티드 프로브로 하이브리다이즈하는 세 개의 제조합체가 관찰된다. 양성 하이브리다이징 재조합체 세 개 모두를 플라크정제하고 박테리오파지 플레이트 스토크가 제조되고 박테리오파지 DNA가 각각으로부터 분리된다. HG111로 지정된 이들 재조합체중 하나의 올리고뉴클레오티드 하이브리다이징 영역을 1.2kb Pst I/xba I 단편에 배치한다. 이 단편을 플라스미드 벡터(pGEM-3)내로 서브클로닝하고 DNA 서열 분석을 실행한다. HG111은 ATCC(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA)에 1992년 6월 16일자로 부다페스트 조약에 따라 기탁되었으며, 수탁번호는 ATCC 75252이다. 상기 서브클론을 pGEM-111로 명명한다. 클론 pGEM-111의 DNA서열의 일부분을 제3도(SEQ ID NO:8/인간 BMP-9 서열)에 공개한다. 이 서열은 인간 BMP-9의 전체 숙성 영역과 폴리펩티드의 일부를 코딩한다. 이 서열이 예비 데이터로 구성되어 있다는 것을 주목해야만 한다. 특히, 폴리펩티드 영역에 대해서 분석 및 특성화를 더 실행한다. 예를 들면, 뉴클레오티드 #1 내지 #3(TGA)는 서열의 예비 특성으로 인하여 부정확할 수 있는 번역 정지를 코딩한다. pGEM-111(aGEM에 서브클로닝된 HG111의 1.2kb Pst I/Xba I 단편)및 HG111에 모두에 존재하는 추가서열이 인간BMP-9폴리펩티드 영역의 추가적인 아미노산을 코딩하는 것으로 예상된다. TGF-β계의 기타 단백질 및 기타 BMP의 지식을 기초로 하여 제안된 일치 단백질 분해 가공 서열 ARG-X-X-ARG와 일치하는 다염기 서열 ARG-ARG-LYS-ARG(SEQUENCE ID NO:9의 아미노산 #-4 내지 #-1)에서 분해될 것이라는 것이 예상된다.
이 위치에서의 인간 BMP-9 전구체 폴리펩티드의 분해는 SEGUENCE ID NO:9의 위치 # 1에서 아미노산SER로 시작되는 110개 아미노산 숙성 펩티드(SEQUENCE ID NO:8의 뉴클레오티드 # 124 내지 # 126으로 코딩됨)를 발생시킨다. 인간 BMP-9의 숙성 형태로의 가공은 관련 단백질 TGF-β의 가공 [L. E. Gentry, 등, Molec. ＆ Cell. Biol. 8:4162(1988); R. Derynck 등, Nature 316:701(1985)] 과 유사한 방식으로의 이량화 및 N-말단 영역의 제어를 포함할 것으로 기대된다.
그러므로, 인간BMP-9의 숙성 활성종이 각각 12,000달톤의 예상 분자량의 SEQUENCE ID NO:9 의 아미노산 #1 내지 #110을 포함하는 두개의 폴리펩티드 서브유니트의 호모다이머를 포함하는 것으로 예측된다. 또한 활성 종이 아미노산 #8 내지 #110을 포함하며 제1보존 시스테인 잔기를 포함하는 것으로 예상된다. BMP 및 단백질의 TGP-β계의 다른 것들에 비하여 인간 BMP-9 서열의 카르복시말단 부분은 아미노 말단 부분보다 큰 서열 보존율을 나타낸다. 시스테인 풍부 C-말단 영역내의 인간 BMP-9 단백질의 기타 인간 BMP 단백질 및 TGP-β계 내의 기타 단백질에 대한 아미노산 동일성비율은 하기와 같다:BMP-2, 52%; BMP-3, 40%; BMP-4,52%; BMP-5, 55%; BMP-6, 55%; BMP-7, 53%; 쥐 BMP-9, 97%; Vgl, 50%; GDF-1, 44%; TGF-β1, 32%; TGF-β2,32%; TGF-β3, 32%; inhibin β(B), 35%; 및 inhibinβ(A) 41%.
[실시예 Ⅲ]
[Rosen 변형 Sampath-Reddi 분선]
Sampath 및 Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 80:6591~6595(1983)에 기재된 쥐 뼈 형성 분석의 변형 방법을 사용하여 BMP단백질의 뼈 및/또는 연골 활성을 평가한다. 여기에서 이 변형 분석을 Rosen-변형 Sampath-Reddi분석으로 칭한다. Sampath-Reddi 방법의 에탄을 침전 단계를 검색될 분획의 물에 대한 투석(조성물이 용액이라면)또는 다이아필터링(조성물이 현탁액이라면)으로 대체한다. 용액 또는 현탁액을 0.1% TFA에 재용해시키고 생성 용액을 20mg의 쥐 매트릭스에 첨가한다. 단백질로 처리하지 않은 모방쥐 매트릭스 샘플을 대조용으로 한다. 이 물질을 동결 및 동결건조하고 생성 분말을 #5젤라틴 캡슐에 넣는다. 캡슐을 21~49일 숙성 수컷 Long Evans쥐의 복부 흉부에 피하 이식한다. 이식물을 7~14일 후에 제거한다. 각각 이식물의 2/1을 알칼리 포스파타제분석 [참조, A. H. Reddi 등, Proc. Natl Acad Sci., 69:1601(1972)]에 사용한다.
각 이식물의 나머지 2/1을 조직학적 분석을 위하여 고정 및 가공한다. 1μm 글리콜메타크릴레이트 부분을 Von Kossa 및 산 fuschin으로 염색하여 각 이식물 내에서의 유도된 뼈 및 연골 형성량을 잰다. 용어 +1 내지 +5는 각각의 이식물에서 새로운 뼈 및/또는 연골세포 및 매트릭스가 차지하는 조직학적 부분의 면적을 나타낸다. +5는 이식물의 50% 이상이 이식물 내 단백질의 직접적인 결과로서 제조된 새로운 뼈 및/또는 연골이라는 것을 나타낸다. +4, +3, +2 및 +1은 각각 이식물의 40%, 30%, 20% 및 10%이상의 이식물의 새로운 연골 및/또는 뼈를 함유함을 나타낸다. 변형된 스코링 방법에서는 각 이식물로부터 세 개의 비인접 구획을 평가하고 평균한다. “+/-”는 연골 또는 뼈의 시험적인 확인을 나타내며; “+/-”는 각각의 부분의 >10%가 새로운 연골 또는 뼈임을 나타내고; “+2”는 >25%를; “+3”은 >50%를; “+4”는 >75%를, “+5”는 >80%를 나타낸다. “-”는 이식물이 회복되지 않음을 나타낸다.
매트릭스 샘플의 샘플을 함유하는 BMP-9의 투여량 반응특성은 형성되는 뼈 및/또는 연골의 양이 샘플 내에서 BMP-9의 양이 증가하는 것으로 관찰된다. 대조용 샘플은 임의의 뼈 및/또는 연골 형성을 결과하지 않을 것으로 예상된다.
상기 “BMP”단백질과 같은 기타 뼈 및/또는 연골유도 단백질로는, 형성된 뼈 및/또는 연골이 매트릭스가 차지하는 공간 내에 물리적으로 한정될 것으로 기대된다. 샘플은 또한 SDS 겔 전기영동 및 등전점 포커싱 후에 오토라디오 그래프법으로 분석한다. 활성은 단백질 밴드 및 PI와 상호 연관된다. 특정 분획 내 단백질의 순도를 측정하기 위하여 1 OD/mg-cm의 흡광 계수가 단백질을 측정하기 위해 사용되고 단백질은 SDS PAGE 상에서 실행한 다음 은염색 또는 방사능 요오드화 및 오토라디오그래프법을 실행한다.
[실시예 Ⅳ]
[BMP-9의 발현]
쥐, 인간 또는 기타 포유동물 BMP-9단백질을 제조하기 위하여, 이들을 코딩하는 DNA를 적절한 발현 벡터 내로 이동시킨 다음 포유동물 또는 기타 바람직한 진핵 또는 원핵 숙주에 통상적인 유전공학 기술로 도입한다. 생물학적으로 활성인 재조합체 인간 BMP-9 를 위한 바람직한 발현계는 안정하게 형질전환된 포유동물 세포인 것으로 예상된다.
당 분야 숙련인은 제1도(SEQ ID NO:1)또는 제3도(SEQ ID NO:8)의 서열, 또는 BMP-9단백질을 코딩하는 서열 또는 기타 변형 서열 및 공지 벡터를 예컨대 pCD [Okayama 등, Mol. Cell Biol., - 2:161-170(1982)], pJL3, pJL 4 [Gou 등, EMBO J., 4:645 653(1985)] 및 pMT2 CXM을 사용함으로서 포유동물 발현 벡터를 구축할 수 있다.
포유동물 발현 벡터 pMT2 CXM은 p91023(b)(Wong 등, Science 228:810∼815, 1985)의 유도체이며, 테트라사이클린 내성 유전자 대신에 암피실린내성 유전자를 함유하며 cDNA클론의 삽입을 위한 Xho I부위를 더 함유한다는 점에서 p91023과는 다르다. pMT2 CXM의 기능적 요소가 기술되어 있으며(Kaufman, R. J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689 ∼ 693), 아데노바이러스 VA 유전자, 72bp의 인핸서를 포함하는 SV 40 복제근원, 5′ 스플라이스부위 및 아데노바이러스레이트 mRNA에 존재하는 다수의 아데노바이러스 트리파르타이트 리더 서열을 포함하는 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터, 3′스플라이스 수용체 부위, DHFR삽입물, SV 40초기 폴리아데닐화 부위(SV 40), 및 이. 콜리 제조에 필요한 PBR 322 서열을 포함한다.
플라스미드 pMT 2 CXM은 American Type Culture Collection(ATCC), Rockvill, MD(USA)에 기탁 번호 ATCC 67122로 기탁된 pMT2-VWF의 EcoRI 소화에 의해 수득된다. EcoRl 소화는 pMT2-VWF에 존재하는 cDNA 삽입물을 절형질 전환시키는데 사용될 수 있는 선형의 pMT2를 수득한다. 플라스미드 pMT 2 DNA는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 플라스미드 pMT2 CXM을 루프아우트/돌연변이 [Morinaga 등, Biotechnology 84:636(1984)]를 사용하여 구축한다. 이에 의해 pMT2의 인핸서 서열 및 SV 40 복제 오리진 부근의 Hind III부위에 관련된 염기 1075내지 1145가 제거된다. 또한, 하기 서열:
을 뉴클레오티드 1145에서 삽입한다. 이 서열은 제한효소 Xho I에 대한 인식 부위를 함유한다. pMT2CXM의 유도체 pMT 23은 제한 효소 PstI, EcoRI, SalI 및 XhoI에 대한 인식 부위를 함유한다. 플라스미드 pMT2 CXM 및 pMT23 DNA를 통상적인 방법으로 제조할 수 있다.
pMT21로부터 유도된 pEMC2bl은 또한 본 발명을 실행하는데 적절할 수 있다. pMT21은 pMT2-VWF로부터 유도된 pMT2로부터 유도된다. 상기한 바와 같이 EcoRI 소화로 pMT-VWF에 존재하는 cDNA 삽입물을 절개하여 연결될 수 있고 이. 콜리 HB101인 또는 DH-5를 암피실린 내성으로 형질전환시킬 수 있는 선형의 pMT2를 수득한다. 플라스미드 pMT2 DNA를 통상적인 방법으로 제조할 수 있다.
pMT21이 pMT2로부터 하기 2개의 변형을 통하여 유도된다. 먼저, cDNA용 G/C테일링으로부터 19G잔기의 스트렌치를 포함하는 DHFR cDNA의 76bp의 5′ 비번역 영역을 삭제한다. 이 방법에서 Xho I부위를 삽입하여 DHFR의 상류로부터 하기 서열을 즉시 수득한다:
두 번째로, 유일한 ClaI부위를 EcoRV 및 XbaI으로 소화시켜 도입하고, DNA폴리머라제 I의 Klenow 단편으로 처리하고 ClaI 링커(CATCGATG)에 연결한다. 이로 인해 아테노바이러스 연결 RNA(VAI)영역으로부터 250bp 단편이 삭제되나 VIA RNA 유전자 발현 또는 기능이 방해받지 않는다. pMT 21은 EcoRI 및 XhoI으로 소화되고 벡터 pEMC2Bl을 유도하는데 사용된다.
EMCV리더의 일부는 pMT2-ECATI [S. K. Jung, 등, J. Virol 63:1651~1660(1989)]로부터 EcoRI 및 PstI으로의 소화에 의해 수득되며, 2752bp 단편이 생성된다. 이 단편을 TaqI으로 소화하여 저온 용융 아가로오즈 겔에 의해 정제되는 508bp의 Eco RI-Tag I 단편을 제조한다. 68bp 어댑터 및 그의 상보 나선을 하기 서열을 갖는 3′XhoI 돌출 말단 및 5′Taq I 돌출말단으로 합성한다.
GAAAACAGATTGC - 3′
XhoI (SEQ ID : 7)
이 서열은 뉴클레오티드 763내지 827의 EMC바이러스 리더 서열에 매치된다. 이는 또한 EMC바이러스 리더내의 10위치의 ATG를 ATT로 변화시킨 후에 XhoI로 변화시킨다. pMT 21 Eco RI - XhoI 단편, EMC 바이러스 EcoRI-TaqI 단편, 및 68bp올리고뉴클레오티드 어댑터 TaqI-XhoI어댑터의 세 방식의 연결로 벡터 pEMC2β1이 수득된다.
이 벡터는 SV 40복제근원 및 인핸서, 아데노바이러스 레이트 프로모터, 아테노바이러스 트리파르타이트 리더 서열의 대부분의 cDNA 카피, 작은 하이브리드 매개 서열, SV 40 폴리아데닐화 시그날 및 아데노바이러스 VAI 유전자, DHFR 및 β-락타마제마커 및 EMC서열을 포유 동물 세포내에서의 목적하는 cDNA의 고수준발현을 위한 적절한 관계로 함유한다.
벡터의 구축은 BMP-9 DNA서열의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, BMP-9 cDNA는 코딩 영역의 5′ 및 3′말단 상에서 비코딩 뉴클레오티드를 제거함으로써 변형될 수 있다. 삭제된 비-코딩 뉴클레오티드는 발현에 이로운 것으로 공지된 기타 서열에 의해 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 이들 벡터는 BMP-9단백질의 발현을 위한 적절한 숙주세포내로 형질 전환된다.
당 분야 숙련인은 제1도 또는 제3도(SEQ ID NO:1 및 8)의 서열을 코딩 서열 측면의 포유동물 조절 서열을 제거 또는 세균 서열로 치환함으로써 세균 세포에 의한 세포내 또는 세포외 발현용 세균 벡터를 만들 수 있도록 조작할 수 있다. 예를 들면, 코딩 서열을 더 조작할 수 있다(예를 들면, 공지링커에 연결하거나 공지기술에 의해 비코딩서열을 삭제하거나, 그 안의 뉴클레오티드를 변경시킴에 의한 변형). 변형된 BMP-9코딩 서열을 T. Taniguchi 등, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:5230~5233(1980)에 기재된 바와 같은 기술을 사용하여 공지 세균 벡터로 삽입할 수 있다. 그후 이 세균 세포는 세균숙주 세포내로 형질전환될 수 있으며, 이에 의해 BMP-9단백질이 발현된다. 세균 세포내의BMP-9단백질의 세포외 발현을 위한 방법으로서, 예를 들면 유럽특허출원 EP A 177,343호를 참조한다.
유사한 조작을 곤충 세포 발현을 위한 곤충 벡터의 구축을 위해 실행할 수 있다(참조, 예를 들면 유럽특허출원 제155,476에 공개된 방법). 효모세포에 의해 본 발명의 인자를 세포내 또는 세포외 발현시키기 위하여 효모 벡터를 이스트 조절 서열을 사용하여 구축할 수 있다[참조, 공고 PCT 출원 WO 86/00639 및 유럽 특허출원 EPA 123,289에 기재된 방법].
포유 동물 내에서 본 발명의 BMP-9 단백질을 높은 수준으로 제조하기 위한 방법은 이종BMP-9유전자의 다중카피를 함유하는 세포의 구축을 포함할 수 있다. 이종 유전자는 증폭 마커, 예를 들면 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)유전자에 Kaufman 및 Sharp, J. Mol. Biol., 159:601∼629(1982)의 방법에 따라서 연결되어, 증가된 유전자 카피를 함유하는 세포를 메록트레세이트(MTX)를 증가된 농도로 증식시키기 위해 선택할 수 있다. 이 접근을 다수의 여러 세포형에 사용할 수 있다.
예를 들면, 발현을 조절할 수 있는 다른 플라스미드 서열과 관련되어 조작되는 본 발명의 BMP-9용 DNA서열을 함유하는 플라스미드 및 DHFR 발현플라스미드 pAdA26SV(A)3 [Kaufman 및 Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304(1988)]를 DHFR-결핍 CHO 세포, DUKX-BII내로 칼슘 인산염 공침전 및 감염, 일렉트로포레이션 또는 원형질체 융합을 포함하는 여러 방법에 의해 동시 도입될 수 있다. 형질 전환체를 발현하는 DHFR은 Kaufman 등, Mol. Cell. Biol., 5:1750(1983)에 기재된 바와 같이 투석 태아소혈청으로의 알파 매질내의 성장을 위해 선택되며 MTX가 농도를 증가(예를 들면, 0.02, 0.2, 1.0 및 5μM MTX의 연속 단계)시키면서 성장함에 의한 증폭을 위해 선택된다. 형질 전환체가 클로닝되고, 생물학적으로 활성인 BMP-9발현이 실시예 Ⅲ에 언급한 바와 같은 Resen-변형 Sampath-Reddi쥐 뼈 형성 분석에 의해 관찰된다. BMP-9발현은 MIX내성을 증가시킴에 따라 증가된다. BMP-9폴리펩티드는(358)메티오닌 또는 시스테닌으로의 펄스 표지 및 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동과 같은 당분야공지의 표준 방법을 사용하여 특성화 할 수 있다. 유사한 방법에 따라서 기타 관련된 BMP-9 단백질을 제조할 수 있다.
[A. BMP-9 벡터 구축]
본 발명의 인간 BMP-9단백질을 제조하기 위하여 인간의 BMP-9단백질의 숙성 영역을 코딩하는 DNA서열을 쥐 BMP-9단백질의 폴리펩티드영역을 코딩하는 DNA서열과 연결할 수 있다. 이 쥐/인간 하이브리드DNA서열을 통상적인 유전공학 기술에 의해 적절한 발현 벡터 내로 삽입하고 포유동물 세포 또는 기타 바람직한 진핵 또는 원핵 숙주 내로 도입한다. 이 쥐/인간 BMP-9 함유 발현 플라스미드의 구축을 하기한다.
뉴클레오티드 #105 내지 #470의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간BMP-9 서열(SEQ ID NO:8)의 유도체가 특이적으로 증폭된다. 하기 뉴클레오티드가 프라이머로서 사용되어 상기 클론PGEM-111로부터 인간BMP-9서열(SEQ ID NO:8)의 뉴클레오티드 #105 내지 #470 이 증폭된다.
이 방법에 의해 뉴클레오티드 #105 바로 앞에 뉴클레오티드 서열 ATCGGGCCCCT이 삽입되며 뉴클레오티드 #470 바로 뒤에 뉴클레오티드 서열 GAATTCGCT가 삽입된다. 이들 서열의 첨가로 특이적으로 증폭된 DNA단편의 각 말단에서의 ApaI 및 EcoRI제한 효소 부위의 생성이 결과된다. 생성 374bp ApaI/EcoRI단편을 플라스미드 벡터 PGEM-72f(t)(Promega catalog #p2251)내로 서브클로닝하고 이를 ApaI 및 EcoRI으로 소화한다. 생성 클론을 phBMP9mex-1로 지정한다.
하기 올리고뉴클레오티드를 쥐 BMP-9 서열(SEQ ID NO:1)을 기준으로 하여 지정하고 상기 언급한 쥐/인간 발현 구축을 용이하게 할 수 있도록 변형시킨다.
이들 올리고뉴클레오티드는 첨가시 서로간에 두개의 개별적인 서열의 어닐링(염기 페이링)을 용이하게 하여 하기와 같이 이중 나선 합성 DNA 링커(LINK-1으로 지정)의 형성을 결과 할 수 있는 상보적인 서열들을 함유한다:
이 DNA링커(LINK-1)은 포유동물 세포발현계내의 이종 서열의 최대발현에 필요한 서열뿐만이 아니라 쥐/인간 발현 플라스미드를 구축하기 위해 필요한 다음 조작을 용이하게 하는데 필요한 제한 효소의 인식 서열을 함유한다. 보다 구체적으로(올리고뉴클레오티드 #5/LINK-1의 서열 번호를 참조):뉴클레오티드 #1~#11은 제한효소 BamHI 및 SalI 용 인식 서열을 포함하며, 뉴클레오티드 #11∼#15는 포유동물 세포 발견계내의 이종서열의 최대 발현을 가능하게 하며, 뉴클레오티드 #16∼#31은 쥐 BMP-9 서열(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 # 610∼625에 상응하며, 뉴클레오티드 #32∼33은 두개의 인접한 제한 효소 부위(Eco0109I 및 XbaI)의 효율적인 제한 소화를 용이하게 하기 위하여 삽입되며, 뉴클레오티드 #34~#60은 합성 올리고뉴클레오티드 #5의 뉴클레오티드 #58이 SEQ ID NO:1의 위치 # 1539에 나타나는 A가 아니고 G인 것(이 뉴클레오티드 전환으로 코딩하고자 하는 아미노산 서열의 변화없이 제한효소 인식 서열을 결과한다.)으로 인하여 쥐/인간 하이브리드 발현 플라스미드의 조작을 더 용이하게 한 것을 제외하고는 쥐 BMP-9 서열(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 #1515~1541에 상응한다. LINK-1(올리고 뉴클레오티드 #5 및 #6의 어닐링의 이중나선 생성물)을 제한효소 ApaI 및 BamHI으로 소화된 플라스미드 벡터 pGEM-72f(t)내로 서브클로닝한다. 이로 인하여 pGEM-72f(t) 플라스미드 폴리링커의 ApaI 및 BamHI부위 사이에 통상적으로 존재하는 서열이 상기 LINK-1의 서열로 치환된다. 생성 플라스미드 클론은 pBMP-9 link로 지정된다.
pBMP-9 link를 제한 효소 BamHI 및 XbaI으로 소화시켜서 LINK-1의 뉴클레오티드 #1∼#34(올리고#5의 번호 참조)의 제거를 결과한다. SEQ ID NO:1에 나타낸 서열을 포함하는 삽입물을 함유하는 클론 ML14a를 제한 효소 BamHI 및 XbaI으로 소화시켜서 SEQUENCE ID NO:1(쥐 BMP-9)의 뉴클레오티드#1~#1515를 포함하는 서열의 제거를 결과한다. 생쥐 BMP-9의 이 BamHI/XbaI 단편을 ML14a플라스미드 클론의 잔류부분으로부터 분리하여 상기 합성링커 서열의 제거에 의해 생성된 BamHI/XbaI 부위 내로 서브클로닝된다. 이 생성클론을 p302로 지정한다.
이 클론을 제한 효소 Eco0109 I으로 소화시켜서 쥐 BMP-9 서열(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 #621~#1515 및 LINK-1의 뉴클레오티드 #35~#59(올리고 뉴클레오티드 #5의 번호 참조)에 상응하는 뉴클레오티드가 절단된다. 상기 A가 G로 전환됨에 의해 LINK-1 내에 생성된 ApaI 제한 부위는 Eco0109 I의 인식서열의 서브셋트이므로, p302의 Eco 0109 I으로의 소화로 자연 발생 쥐 Eco0109 I(SEQ ID NO:1의 위치 #619∼#625)뿐만 아니라 ApaI 부위를 분해함으로써 상기 서열을 포함하는 920bp Eco0109 I/Eco0109 I(Apa I)단편이 절단된다. 이 920Eco0109 I/ Eco0109 I(ApaI)단편을 p302플라스미드 클론의 잔류부분으로부터 분리하고 Eco0109 I과 유사하게 소화된 클론pBMP-9 link로 서브클로닝 한다. 원래는 LINK-1의 두개의 인접한 제한부위 Eco0109I 및 XbaI의 보다 완전한 분해를 용이하게 하기 위하여 고안된, 이제는 pBMP9링크(상기한 바와 같다)의 일부인 뉴클레오티드 GG(올리고뉴클레오티드 #5의 #32∼#33)가 Dcm메틸화 인식 서열의 형성을 결과한다. 제한 효소 Eco0109 I는 Dcm 메틸화에 민감하므로 제한 효소 Eco 0109 I에 의한 이 서열(올리고뉴클레오티드 #5/LINK-1의 뉴클레오티드 #25∼#31)의 분해가 이 부위에서 방지된다. 그러므로, 이 플라스미드 클론 pBMP-9 link는 상기한 바와 같은 제한 효소 Eco0109 I으로의 소화시 ApaI 부위에서는 분해되나 Eco0109 I 부위에서는 분해되지 않아서 LINK-1의 Eco0109 I 및 XbaI부위사이의 서열(올리고뉴클레오티드 #5의 번호로 지정된 #32∼#55)의 의도하는 제거를 방지한다. 이로 인해 pBMP-9 link의 Eco0109 I(ApaI)부위에 920bp Eco0109 I/ApaI 단편이 삽입된다. 생성 클론을 p318로 지정한다.
클론 p318을 제한 효소 SalI 및 ApaI으로 소화시켜서, LINK-1의 뉴클레오티드 #6~#56(위치를 정하기 위해 올리고 #5로 칭함), 쥐 BMP-9의 뉴클레오티드 #621∼#1515(SEQ ID NO:1), 및 LINK-1의 뉴클레오티드 #35~#60(위치를 정하기 위해 올리고#5칭함)을 포함하는 서열이 절단된다. 상기한 생성 972bp SalI/ApaI 단편을 p318 플라스미드 클론의 나머지 부분으로부터 분리하고 다음 조작에 이용한다.
인간 BMP-9단백질의 폴리펩티드의 전체 숙성 영역 및 일부 영역을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 클론 phBMP9mex-1을 제한 효소 ApaI 및 EcoRI으로 소화시킨다. 이로 인해 인간 BMP-9서열(SEQ ID NO:8)의 뉴클레오티드 #105~#470과 제한 효소 ApaI 및 EcoRI에 대한 인식 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 #3 및 #4의 추가의 뉴클레오티드를 함유하는 374bp단편이 절단된다. 이 374bp ApaI/EcoRI 단편을 p138로부터의 972bp SalI/ApaI 단편(상기한 바와 같이 분리)과 합하고 SalI 및 EcoRI으로 소화된 포유동물 세포발현 플라스미드 pED 6(pEMC2β1의 유도체)에 연결시킨다. 이 생성 클론을 p324로 지정한다.
이 클론 ML14a(쥐 BMP-9)를 Eco0109 I 및 XbaI으로 소화시켜서 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 #621~#1515를 포함하는 단편을 발생시킨다.
하기 올리고뉴클레오티드를 자동화 DNA 합성기상에서 합성하고 그들의 상보서열이 서로 염기 쌍을 이뤄(어닐링되어) LINK-2로 지정된 이중 나선 합성 DNA 링커가 생성되도록 합한다:
#7 TCGACCACCATGTCCCCTGG
#8 GCCCCAGGGGACATGGTGG
이 이중 나선 합성 DNA 링커(LINK-2)는 하기와 같은 Sal I(한쪽 말단) 또는 Eco 0109 I(다른쪽말단)으로 소화된 DNA단편에 대응되는 단일 나선말단을 형성시킬 수 있도록 어닐링된다:
#7 TCGACCACCATGTCCCCTGG
GGTGGTACAGGGGACCCCG #8
이 LINK-2 합성 DNA 링커는 상기한 바와 같은 쥐 BMP-9(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 #621∼#1515를 포함하는 895bp Eco 0109I/XbaI 단편에 연결된다. 이로 인해 915bp SalI/XbaI 단편이 생성된다.
이 클론 p324를 SalI/XbaI으로 소화시켜 LINK-1의 뉴클레오티드 #6~#56(위치를 정하기 위하여 올리고 #5로 칭함)및 쥐의 BMP-9(SEQ ID NO:1)뉴클레오티드 #621∼#1515를 포함하는 서열을 제거한다. LINK-1의 뉴클레오티드 #35∼#60을 포함하는 서열(위치를 정하기 위하여 올리고 #5로 칭함)및 phBMP9mex-1으로부터 유도된 374bpApaI/EcoRI 단편(인간 BMP-9 서열)을 포함하는 서열은 pED6주쇄 부착되어 있다. LINK-2서열 및 쥐의 BMP-9(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 #621∼#1515를 포함하는 915bp SalI/XbaI 단편을 상기한 SalI 내지 XbaI 서열이 제거된 p324 클론 내로 연결시킨다.
생성 플라스미드를 BMP-9 융합물로 지정하는데, 이는 LINK-2, 쥐 BMP-9(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 #621~#1551, LINK-1의 뉴클레오티드 #35~#59(올리고뉴클레오티드 #5의 번호참조)및 포유동물 세포발현 벡터 pED 6의 SalI 및 EcoRI 사이에 삽입된 클론 pBMP9mex-1(상기)로부터 유도된 374bp ApaI/EcoRI 단편(인간 BMP-9)을 포함한다.
BMP 융합물은 CHO 세포내로 당 분야 숙련인에게 공지된 통상적인 표준기술을 사용하여 트랜스펙션되어 인간의 BMP-9 단백질을 발현할 수 있는 안정한 세포주를 만든다. 이 세포주를 안정한 배양조건하에서 배양하고 BMP-9단백질을 배양 배지로부터 분리 및 정제한다.
[실시예 Ⅴ]
[발현된 BMP-9의 생물학적 활성]
상기 실시예 Ⅳ에서 수득된 발현 BMP-9단백질의 생물학적 활성을 측정하기 위하여, 이 단백질을 세포 배양액으로부터 회수하고 BMP-9단백질을 기타 오염물질 뿐만 아니라 동시에 제조되는 기타 단백질 물질로부터 BMP-9 단백질을 분리함으로써 정제한다. 정제단백질을 실시예 Ⅲ에 기술된 쥐 뼈 형성분석에 따라서 분석할 수 있다.
정제는 당 분야 숙련인에게 공지된 숙련 기술을 사용하여 실행된다. 기타 BMP 단백질과 마찬가지로, 이 정제는 헤파린 세파로오즈의 사용을 포함할 수 있다.
단백질 분석은 은[R. R. Oakley 등, Anal. Biochem. 105:361(1980)]에 의해 염색된 SDS-PAGE 아크릴아미드 [U. K. Laemmli, Nature 227:680(1970)] 및 이뮤 노블롯 [H. Towbin, 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350(1979)]과 같은 표준 기술을 사용하여 실행된다.
상기 기술은 본 발명의 바람직한 실시양태를 기술한 것이다. 본 발명의 실행시 다양한 변형 및 변화가 당 분야 숙련인에게 이들 기술을 바탕으로 실행될 수 있을 것으로 기대된다. 이들 변형 및 변화는 첨부된 특허청구의 범위에 포함되는 것으로 믿어진다.
[서열목록]
(1)일반적 사항
(ⅰ)출원인:존. 엠(M). 우즈니
앤토니 셀레스트
(ⅱ)발명의 명칭:BMP-9 조성물
(ⅲ)서열 갯수:9
(ⅳ)통신 주소
(A) 수신인:제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드
(B)거리:법적 업무지-87 캐임브리지파크 드라이브
(C)시:캐임브리지
(D)주:메사츄세트
(E)국가:미합중국
(F)우편번호:02140
(ⅴ)컴퓨터 판독형
(A)매체형:플로피 디스크
(B)컴퓨터:호환 IBM PC
(C)작동 시스템:PC-DOS/MS-DOS
(D)소프트웨어:Patentln Release #1.0, 버전 #1.25
(ⅵ)현출원 데이터:
(A)출원 번호:US
(B)출원일:
(C)분류:
(ⅷ)대리인 사항
(A)이름:엘렌 제이(J). 카피노스
(B)등록번호:32,245
(C)참고/서류 번호:GI 5186A
(ⅸ)연락처:
(A)전화:(617)876-1176
(B)FAX:(617)876-5851
(2)SEQ ID NO:1에 대한 사항:
(ⅰ)서열특성:
(A)길이:2447 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)나선 형태:이중
(D)토폴로지:선형
(ⅱ)분자형태:cDNA 내지 mRNA
(ⅲ)가설:없음
(ⅳ)안티-센스:없음
(ⅵ)최초 원료:
(A)유기체:Mus musculus
(B)군주:C57B46xCBA
(F)조직형:간
(ⅶ)즉시 원료
(A)라이브러리:생쥐 간 cDNA
(B)클론:ML14A
(ⅷ)게놈 내 위치
(C)단위:bp
(ⅸ)특징부:
(A)NAME/KEY:mat 펩티드
(B)위치:1564..1893
(ⅸ)특징부:
(A)NAME/KEY:CDS
(B)위치:610..1896
(ⅸ)특징부:
(A)NAME/KEY:mRNA
(B)위치:1.. 2447
(ⅹⅰ)서열기술:SEQ ID NQ:1:
(2)SEQ ID NO:9에 대한 사항:
(ⅰ)서열특성:
(A)길이:151 아미노산
(B)형태:아미노산
(D)토폴로지:선형
(ⅱ)분자형태:단백질
(ⅹⅰ)서열기술:SEQ ID No:9
(ⅸ)특징부:
(A)NAME/KEY:엑손
(B)위치:1..470
(ⅸ)특징부:
(A)NAME/KEY:CDS
(B)위치:1..456
(ⅸ)특징부:
(A)NAME/KEY:mat 펩티드,
(B)위치:124..453
(ⅸ)특징부:
(A)NAME/KEY:mRNA
(B)위치:1..470
(ⅹⅰ)서열기술:SEQ ID NO:8:
(2)SEQ ID NO:6에 대한 사항:
(ⅰ)서열특성:
(A)길이:34 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)나산 형태:이중
(D)토폴로지:선형
(ⅱ)분자형태:cDNA 내지 mRNA
(ⅹⅰ)서열기술:SEQ ID NQ:6:
(2)SEQ ID NO:7에 대한 사항:
(ⅰ)서열특성:
(A)길이:68 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)나산 형태:이중
(D)토폴로지:선형
(ⅱ)분자형태:cDNA 내지 mRNA
(ⅹⅰ)서열기술:SEQ ID NO:7:
(2)SEQ ID NO:8에 대한 사항:
(ⅰ)서열특성:
(A)길이:470 아미노산
(B)형태:핵산
(C)나선 형태:이중
(D)토폴로지:선형
(ⅱ)분자형태:DNA(게놈)
(ⅲ)가정:없음
(ⅴ)단편 형태:C-말단
(ⅵ)최초 원료:
(A)유기체:호모 사피엔스
(H)세포계:W138(게놈 DNA)
(ⅶ)즉시 원료:
(A)라이브러리:인간 게놈 라이브러리
(B)클론:lambda 111-1
(ⅷ)게놈 내 위치
(C)단위:bp
(2)SEQ ID NO:5에 대한 사항:
(ⅰ)서열특성:
(A)길이:15 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)나산 형태:이중
(D)토폴로지:선형
(ⅱ)분자형태:cDNA 내지 mRNA
(ⅹⅰ)서열기술:SEQ ID NQ:5:
(2)SEQ ID NO:4에 대한 사항:
(ⅰ)서열특성:
(A)길이:408 염기쌍
(B)형태:아미노산
(D)토폴로지:선형
(ⅱ)분자형태:단백질
(ⅹⅰ)서열기술:SEQ ID NQ:4:
(B)위치:9..1934
(ⅹⅰ)서열기술:SEQ ID NQ:3:
(2)SEQ ID NO:3에 대한 사항:
(ⅰ)서열특성:
(A)길이:1954 염기쌍
(B)형태:핵산
(C)나선 형태:이중
(D)토폴로지:선형
(ⅱ)분자형태:cDNA 내지 mRNA
(ⅲ)가설:없음
(ⅳ)안티-센스:없음
(ⅵ)최초 원료:
(A)유기체:호모사피엔스
(G)세포형태:Osteosarcoma 세포계
(H)세포계:U-20S
(ⅶ)즉시 원료
(A)라이브러리:Lambda gt10 내 U20S cDNA
(B)클론:Lambda U20S-3
(ⅷ)게놈 내 위치
(C)단위:bp
(ⅸ)특징부:
(A)NAME/KEY:CDS
(B)위치:403..1629
(ⅸ)특징부:
(A)NAME/KEY:mat
(B)위치:1279..1626
(ⅸ)특징부:
(A)NAME/KEY:mRNA
(ⅹⅰ)서열기술:SEQ ID NO:2:
(2)SEQ ID NO:2에 대한 사항:
(ⅰ)서열특성:
(A)길이:428 아미노산
(B)형태:아미노산
(D)토폴로지:선형
(ⅱ)분자형태:단백질
Claims (11)
- 제3도(SEQ ID NO:9)에 나타낸 바와 같은 아미노산 #8-110의 아미노산 서열을 포함하는 BMP-9 폴리펩티드.
- 제3도(SEQ ID NO:9)에 나타낸 바와 같은 아미노산 # 1-110의 아미노산 서열을 포함하는 BMP-9 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 각각의 서브유니트가 최소한 제3도(SEQ ID NO:5)의 아미노산 # 8-110의 아미노산 서열을 포함하는 이량체인 BMP-9 폴리펩티드.
- 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 각각의 서브유니트가 최소한 제3도(SEQ ID NO:9)의 아미노산 #1-110의 아미노산 서열을 포함하는 이량체인 BMP-9 폴리펩티드.
- (a)제3도(SEQ ID NO:8)에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 #124 내지 # 453의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA로 형질전환된 세포를 배양하고; (b)상기 배양 배지로부터 제3도(SEQ ID NO:9)에 나타낸 바와 같은 아미노산 #1 내지 아미노산 #110의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 회수 및 정제하는 단계에 의해 제조되는 정제된 BMP-9 단백질.
- (a)제3도(SEQ ID NO:8)에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 #124 내지 # 453의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA로 형질전환된 세포를 배양하고; (b)상기 배양 배지로부터 제3도(SEQ ID NO:9)에 나타낸 바와 같은 아미노산 #8 내지 아미노산 #110의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 회수하는 단계에 의해 제조되는 정제된 BMP-9 단백질.
- (a)뉴클레오티드 124 내지 453(SEQ ID NO:8); 및 (b)서열(a)의 퇴행성(degenerative)서열로서, 연골 및/또는 뼈 형성 활성을 나타내는 서열을 포함하는 DNA 서열.
- (a)뉴클레오티드 145 내지 453(SEQ ID NO:8); 및 (b)서열(a)의 퇴행성(degenerative)서열로서, 연골 및/또는 뼈 형성 활성을 나타내는 서열을 포함하는 DNA 서열.
- BMP-9을 코딩하는, 청구항 7 또는 8항의 DNA 서열로 형질전환된 포유동물 숙주세포.
- (a)BMP-9 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 청구항 7 또는 8항의 cDNA로 형질전환된 세포를 배양하고, (b) 배양 배지로부터 상기 BMP-9 단백질을 회수 및 정제하는 단계로 구성되는 정제된 BMP-9 단백질의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 포유 동물 세포가 CHO 세포(중국 햄스터 난소 세포)인 세포.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72059091A | 1991-06-25 | 1991-06-25 | |
| US7/720590 | 1991-06-25 | ||
| PCT/US1992/005374 WO1993000432A1 (en) | 1991-06-25 | 1992-06-25 | Bmp-9 compositions |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR100255415B1 true KR100255415B1 (ko) | 2000-05-01 |
Family
ID=24894572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019930704031A KR100255415B1 (ko) | 1991-06-25 | 1992-06-25 | 비엠피-9 조성물 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5661007A (ko) |
| EP (1) | EP0592562B1 (ko) |
| JP (2) | JP3485917B2 (ko) |
| KR (1) | KR100255415B1 (ko) |
| AT (1) | ATE175441T1 (ko) |
| AU (1) | AU652472B2 (ko) |
| CA (1) | CA2108770C (ko) |
| DE (1) | DE69228118T2 (ko) |
| DK (1) | DK0592562T3 (ko) |
| ES (1) | ES2127757T3 (ko) |
| WO (1) | WO1993000432A1 (ko) |
Families Citing this family (132)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE20004692U1 (de) | 2000-03-14 | 2001-07-26 | Sofamor Danek Gmbh | Wirbelimplantat zum Einschrauben in einen Wirbelzwischenraum |
| US6150328A (en) * | 1986-07-01 | 2000-11-21 | Genetics Institute, Inc. | BMP products |
| US5284756A (en) * | 1988-10-11 | 1994-02-08 | Lynn Grinna | Heterodimeric osteogenic factor |
| US5656593A (en) * | 1991-03-11 | 1997-08-12 | Creative Biomolecules, Inc. | Morphogen induced periodontal tissue regeneration |
| CA2104678C (en) | 1991-03-11 | 2002-05-14 | Charles M. Cohen | Protein-induced morphogenesis |
| US6495513B1 (en) | 1991-03-11 | 2002-12-17 | Curis, Inc. | Morphogen-enhanced survival and repair of neural cells |
| US6287816B1 (en) * | 1991-06-25 | 2001-09-11 | Genetics Institute, Inc. | BMP-9 compositions |
| DE69233022T2 (de) | 1991-11-04 | 2004-02-12 | Genetics Institute, LLC, Cambridge | Rekombinante knochenmorphogenetische protein heterodimere, zusammensetzungen und verfahren zur verwendung |
| DE69433530T2 (de) * | 1993-05-12 | 2005-01-05 | Genetics Institute, LLC, Cambridge | Bmp-11 zusammensetzungen |
| JPH09501305A (ja) * | 1993-05-12 | 1997-02-10 | ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド | Ｂｍｐ−１０組成物 |
| US6333168B1 (en) | 1993-05-20 | 2001-12-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Cloning, expression and uses of dorsalin-1 |
| JPH09501932A (ja) * | 1993-08-26 | 1997-02-25 | ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド | ヒト・骨形態形成蛋白を用いる神経再生 |
| US6027919A (en) * | 1993-12-07 | 2000-02-22 | Genetics Institute, Inc. | BMP-12 and BMP-13 proteins and DNA encoding them |
| US5399677A (en) * | 1993-12-07 | 1995-03-21 | Genetics Institute, Inc. | Mutants of bone morphogenetic proteins |
| ATE319823T1 (de) * | 1993-12-07 | 2006-03-15 | Inst Genetics Llc | Bmp-12, bmp-13 und diese enthaltende sehne- induzierende zusammensetzungen |
| US5942496A (en) | 1994-02-18 | 1999-08-24 | The Regent Of The University Of Michigan | Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells |
| US6551618B2 (en) | 1994-03-15 | 2003-04-22 | University Of Birmingham | Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival |
| US5906827A (en) * | 1994-06-03 | 1999-05-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Matrix for the manufacture of autogenous replacement body parts |
| US5846770A (en) * | 1994-11-22 | 1998-12-08 | Genetics Institute, Inc. | DNA molecules encoding human chordin |
| US5645084A (en) * | 1995-06-07 | 1997-07-08 | Danek Medical, Inc. | Method for spinal fusion without decortication |
| US5635372A (en) * | 1995-05-18 | 1997-06-03 | Genetics Institute, Inc. | BMP-15 compositions |
| DK1364656T3 (da) | 1995-06-05 | 2013-12-16 | Genetics Inst Llc | Brug af knoglemorfogenetiske proteiner til heling og reparation af bindevævsvedhæftning |
| US5902785A (en) * | 1995-06-06 | 1999-05-11 | Genetics Institute, Inc. | Cartilage induction by bone morphogenetic proteins |
| KR20000064752A (ko) | 1996-03-22 | 2000-11-06 | 더 제네랄 호스피탈 코포레이션 | 중추신경계허혈또는외상의발현후폴리펩티드성장인자를투여하는방법 |
| US5700774A (en) * | 1996-03-26 | 1997-12-23 | Genetics Institute, Inc. | Compositions comprising bone morphogenic proteins and truncated parathyroid hormone related peptide, and methods of inducing cartilage by administration of same |
| US6492508B1 (en) | 1996-06-03 | 2002-12-10 | United States Surgical Corp. A Division Of Tyco Healthcare Group | Nucleic acids encoding extracellular matrix proteins |
| US5965403A (en) | 1996-09-18 | 1999-10-12 | Genetics Institute, Inc. | Nucleic acids encoding bone morphogenic protein-16 (BMP-16) |
| US6037519A (en) | 1997-10-20 | 2000-03-14 | Sdgi Holdings, Inc. | Ceramic fusion implants and compositions |
| AU6267798A (en) | 1997-02-07 | 1998-08-26 | Stryker Corporation | Matrix-free osteogenic devices, implants and methods of use thereof |
| US6034062A (en) * | 1997-03-13 | 2000-03-07 | Genetics Institute, Inc. | Bone morphogenetic protein (BMP)-9 compositions and their uses |
| US20010016646A1 (en) | 1998-03-20 | 2001-08-23 | David C. Rueger | Osteogenic devices and methods of use thereof for repair of endochondral bone, osteochondral and chondral defects |
| US7041641B2 (en) | 1997-03-20 | 2006-05-09 | Stryker Corporation | Osteogenic devices and methods of use thereof for repair of endochondral bone and osteochondral defects |
| EP2309261A1 (en) | 1997-05-30 | 2011-04-13 | Stryker Corporation | Methods for evaluating tissue morphogenesis and morphogenic activity |
| US5972368A (en) | 1997-06-11 | 1999-10-26 | Sdgi Holdings, Inc. | Bone graft composites and spacers |
| JP4302877B2 (ja) | 1997-07-30 | 2009-07-29 | エモリー・ユニバーシテイ | 新規な骨鉱化蛋白質、ｄｎａ、ベクター及び発現系 |
| US7923250B2 (en) | 1997-07-30 | 2011-04-12 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells |
| US20020052026A1 (en) | 1997-10-08 | 2002-05-02 | Steven M. Vicik | Methods of refolding proteins |
| US6391311B1 (en) | 1998-03-17 | 2002-05-21 | Genentech, Inc. | Polypeptides having homology to vascular endothelial cell growth factor and bone morphogenetic protein 1 |
| US6511509B1 (en) | 1997-10-20 | 2003-01-28 | Lifenet | Textured bone allograft, method of making and using same |
| US6027917A (en) | 1997-12-10 | 2000-02-22 | Genetics Institute, Inc. | Bone morphogenetic protein (BMP)-17 and BMP-18 compositions |
| NZ525914A (en) | 1998-03-10 | 2004-03-26 | Genentech Inc | Novel polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| ES2313778T3 (es) | 1998-03-17 | 2009-03-01 | Genentech, Inc. | Polipeptidos homologos de vegf y de bmp1. |
| US6211157B1 (en) | 1998-05-01 | 2001-04-03 | Sulzer Biologics, Inc. | Protein mixtures to induce therapeutic angiogenesis |
| US7147839B2 (en) | 1998-05-29 | 2006-12-12 | Curis, Inc. | Methods for evaluating tissue morphogenesis and activity |
| EP1102568A1 (en) | 1998-08-06 | 2001-05-30 | SDGI Holdings, Inc. | Composited intervertebral bone spacers |
| US6849255B2 (en) | 1998-08-18 | 2005-02-01 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Methods and compositions for enhancing cartilage repair |
| US6992066B2 (en) | 1998-10-16 | 2006-01-31 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Povidone-containing carriers for polypeptide growth factors |
| US7087577B2 (en) | 1998-10-16 | 2006-08-08 | Zimmer Orthobiologies, Inc. | Method of promoting natural bypass |
| US6727224B1 (en) | 1999-02-01 | 2004-04-27 | Genetics Institute, Llc. | Methods and compositions for healing and repair of articular cartilage |
| EP2286847A1 (en) | 1999-10-15 | 2011-02-23 | Genetics Institute, LLC | Formulations of hyaluronic acid for delivery of osteogenic proteins |
| JP4672947B2 (ja) | 1999-12-06 | 2011-04-20 | ウォーソー・オーソペディック・インコーポレーテッド | 椎間板の治療装置及び方法 |
| US20060078847A1 (en) * | 2000-09-29 | 2006-04-13 | Kwan Norman H | Dental implant system and additional methods of attachment |
| EP1341484B1 (en) | 2000-12-08 | 2009-05-06 | Osteotech, Inc. | Implant for orthopedic applications |
| US6752831B2 (en) | 2000-12-08 | 2004-06-22 | Osteotech, Inc. | Biocompatible osteogenic band for repair of spinal disorders |
| US20020114795A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-08-22 | Thorne Kevin J. | Composition and process for bone growth and repair |
| TWI329129B (en) | 2001-02-08 | 2010-08-21 | Wyeth Corp | Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof |
| TWI267378B (en) | 2001-06-08 | 2006-12-01 | Wyeth Corp | Calcium phosphate delivery vehicles for osteoinductive proteins |
| US7232802B2 (en) * | 2001-12-21 | 2007-06-19 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Compositions and methods for promoting myocardial and peripheral angiogenesis |
| CH695985A5 (de) * | 2002-01-21 | 2006-11-15 | Straumann Holding Ag | Oberflächenmodifizierte Implantate. |
| CA2495222A1 (en) * | 2002-08-13 | 2004-02-19 | Wyeth | Peptides as solubilizing excipients for transforming growth factor ss proteins |
| DE60331367D1 (de) | 2002-12-30 | 2010-04-01 | Angiotech Int Ag | Wirkstofffreisetzung von schnell gelierender polymerzusammensetzung |
| BRPI0413720A (pt) | 2003-09-12 | 2006-10-17 | Wyeth Corp | bastões e pastas sólidas de fosfato de cálcio injetável para liberação de proteìnas osteogênicas |
| CN1938194B (zh) | 2004-03-10 | 2013-06-05 | 希尔技术股份有限公司 | 涂层植入物、及其制造和应用 |
| CA2563374A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-08 | Research Development Foundation | Antagonism of tgf-.beta.superfamily receptor signaling |
| ES2369629T3 (es) | 2004-05-25 | 2011-12-02 | Stryker Corporation | Uso de op-1 para tratar defectos del cartílago. |
| US7749268B2 (en) | 2004-05-26 | 2010-07-06 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Methods for treating the spine |
| ES2551852T3 (es) | 2004-07-23 | 2015-11-24 | Acceleron Pharma Inc. | Polipéptidos del receptor ActRII |
| US7799754B2 (en) | 2004-10-14 | 2010-09-21 | Biomimetic Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating bone |
| US7473678B2 (en) | 2004-10-14 | 2009-01-06 | Biomimetic Therapeutics, Inc. | Platelet-derived growth factor compositions and methods of use thereof |
| US20060166251A1 (en) * | 2005-01-26 | 2006-07-27 | Archambault Joanne M | Use of sFRPs as markers of BMP activity |
| MX2007011591A (es) * | 2005-03-30 | 2007-12-10 | Wyeth Corp | Metodo para estimular el crecimiento de cabello administrando bmps. |
| US8506646B2 (en) | 2005-04-29 | 2013-08-13 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Multi-purpose medical implant devices |
| US8128933B2 (en) | 2005-11-23 | 2012-03-06 | Acceleron Pharma, Inc. | Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody |
| CA3045808C (en) | 2005-11-23 | 2022-08-16 | Acceleron Pharma, Inc. | Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth |
| US8147860B2 (en) | 2005-12-06 | 2012-04-03 | Etex Corporation | Porous calcium phosphate bone material |
| CA2652549A1 (en) | 2006-05-17 | 2007-12-13 | Stryker Corporation | Use of a soluble morphogenic protein complex for treating cartilage defects |
| ES2664229T3 (es) | 2006-06-30 | 2018-04-18 | Biomimetic Therapeutics, Llc | Composiciones y métodos de biomatriz-PDGF para el tratamiento de lesiones del manguito rotador |
| US9161967B2 (en) | 2006-06-30 | 2015-10-20 | Biomimetic Therapeutics, Llc | Compositions and methods for treating the vertebral column |
| US8524265B2 (en) | 2006-08-17 | 2013-09-03 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Medical implant sheets useful for tissue regeneration |
| US8895016B2 (en) | 2006-12-18 | 2014-11-25 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels |
| US7718616B2 (en) | 2006-12-21 | 2010-05-18 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Bone growth particles and osteoinductive composition thereof |
| TWI584815B (zh) | 2007-02-01 | 2017-06-01 | 艾瑟勒朗法瑪公司 | 活化素-ＡｃｔＲＩＩａ拮抗劑及其治療或預防乳癌之用途 |
| TW202104248A (zh) | 2007-02-02 | 2021-02-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 衍生自ActRIIB的變體與其用途 |
| CA3039330C (en) | 2007-02-09 | 2021-11-09 | Acceleron Pharma Inc. | Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth in cancer patients |
| US7960343B2 (en) | 2007-09-18 | 2011-06-14 | Acceleron Pharma Inc. | Activin-ActRIIa antagonists and uses for decreasing or inhibiting FSH secretion |
| US8216997B2 (en) | 2008-08-14 | 2012-07-10 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators |
| TWI784538B (zh) | 2008-08-14 | 2022-11-21 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 使用ｇｄｆ阱以增加紅血球水平 |
| BR122020000059B8 (pt) | 2008-09-09 | 2021-06-22 | Biomimetic Therapeutics Inc | composição que compreende uma matriz biocompatível e um fator de crescimento derivado de plaqueta e kit |
| EP2387412A4 (en) | 2009-01-13 | 2013-04-03 | Acceleron Pharma Inc | METHODS FOR INCREASING ADIPONECTIN |
| US8609127B2 (en) | 2009-04-03 | 2013-12-17 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Medical implant with bioactive material and method of making the medical implant |
| CA2764890A1 (en) | 2009-06-08 | 2010-12-16 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for increasing thermogenic adipocytes |
| US20110002897A1 (en) | 2009-06-11 | 2011-01-06 | Burnham Institute For Medical Research | Directed differentiation of stem cells |
| MX351286B (es) | 2009-06-12 | 2017-10-09 | Acceleron Pharma Inc | Proteinas de fusion actriib-fc truncadas. |
| US9399086B2 (en) | 2009-07-24 | 2016-07-26 | Warsaw Orthopedic, Inc | Implantable medical devices |
| ES2658292T3 (es) | 2009-11-17 | 2018-03-09 | Acceleron Pharma, Inc. | Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular |
| WO2011103598A1 (en) | 2010-02-22 | 2011-08-25 | Biomimetic Therapeutics, Inc. | Platelet-derived growth factor compositions and methods for the treatment of tendinopathies |
| WO2011139594A2 (en) | 2010-04-27 | 2011-11-10 | Medtronic, Inc. | Artificial bursa for intra-articular drug delivery |
| TW201138808A (en) | 2010-05-03 | 2011-11-16 | Bristol Myers Squibb Co | Serum albumin binding molecules |
| WO2011156589A2 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Semprus Biosciences Corp. | Non-fouling, anti-microbial, anti-thrombogenic graft-from compositions |
| CA2799639C (en) | 2010-06-09 | 2016-10-04 | Semprus Biosciences Corp. | Articles having non-fouling surfaces and processes for preparing the same without altering bulk physical properties |
| US20110305898A1 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Zheng Zhang | Non-fouling, anti-microbial, anti-thrombogenic graft compositions |
| EP2605804B1 (en) | 2010-08-18 | 2017-03-15 | Emory University | Compounds and compositions for ossification and methods related thereto |
| KR20130132824A (ko) | 2010-11-08 | 2013-12-05 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | Actriia 결합제 및 이의 용도 |
| WO2012068135A1 (en) | 2010-11-15 | 2012-05-24 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Bone void fillers |
| CA2827392A1 (en) | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Emory University | Noggin blocking compositions for ossification and methods related thereto |
| EP2678052B1 (en) | 2011-02-24 | 2018-09-26 | Emory University | Jab1 blocking compositions for ossification and methods related thereto |
| WO2012177759A1 (en) | 2011-06-20 | 2012-12-27 | Rdc Holdings, Llc | System and method for repairing joints |
| US8998925B2 (en) | 2011-06-20 | 2015-04-07 | Rdc Holdings, Llc | Fixation system for orthopedic devices |
| JP2015500913A (ja) | 2011-12-14 | 2015-01-08 | センプラス・バイオサイエンシーズ・コーポレイションＳｅｍｐｒｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ． | 表面改質コンタクトレンズを作り出すための多段階式ｕｖ方法 |
| CA2859696C (en) | 2011-12-14 | 2017-03-21 | Semprus Biosciences Corp. | Silicone hydrogel contact lens modified using lanthanide or transition metal oxidants |
| WO2013090780A1 (en) | 2011-12-14 | 2013-06-20 | Semprus Biosciences Corp. | Surface modified contact lenses |
| US9006359B2 (en) | 2011-12-14 | 2015-04-14 | Semprus Biosciences Corporation | Imbibing process for contact lens surface modification |
| CA2859047C (en) | 2011-12-14 | 2017-03-21 | Semprus Biosciences Corp. | Redox processes for contact lens modification |
| US9809636B2 (en) | 2012-04-06 | 2017-11-07 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9 |
| US10034945B2 (en) | 2012-07-13 | 2018-07-31 | Trustees Of Tufts College | Silk powder compaction for production of constructs with high mechanical strength and stiffness |
| US9833481B2 (en) * | 2012-09-01 | 2017-12-05 | Ken Muneoka | Method for articular cartilage and joint formation |
| CN104936605A (zh) | 2012-11-02 | 2015-09-23 | 细胞基因公司 | 激活素-actrii拮抗剂和用于治疗骨和其它病症的用途 |
| WO2014172692A1 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Theracell, Inc. | Demineralized bone fibers having controlled geometry and shapes and methods thereof |
| BR122023023170A2 (pt) | 2014-06-13 | 2024-02-20 | Acceleron Pharma Inc. | Uso de um antagonista de actrii no tratamento ou prevenção de úlcera cutânea associada com beta-talassemia |
| GB201412290D0 (en) | 2014-07-10 | 2014-08-27 | Cambridge Entpr Ltd | Novel use |
| MA41052A (fr) | 2014-10-09 | 2017-08-15 | Celgene Corp | Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii |
| JP2016091701A (ja) | 2014-10-31 | 2016-05-23 | 北川工業株式会社 | コンタクト部材 |
| FI3227675T3 (fi) | 2014-12-03 | 2023-05-25 | Celgene Corp | Aktiviini-actrii-antagonisteja ja niiden käyttöjä myelodysplastisen oireyhtymän hoitamiseksi |
| WO2016123583A1 (en) | 2015-01-29 | 2016-08-04 | Theracell, Inc. | Demineralized bone fiber composition for use in minimally invasive surgery |
| SG11201707815RA (en) | 2015-06-05 | 2017-12-28 | Novartis Ag | Antibodies targeting bone morphogenetic protein 9 (bmp9) and methods therefor |
| CA2986753A1 (en) | 2015-06-17 | 2016-12-22 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Implants including an oxysterol and methods of use |
| CN115073625B (zh) | 2015-10-26 | 2024-01-16 | 哈佛学院院长等 | 还原和氧化的多糖及其使用方法 |
| US10688222B2 (en) | 2016-11-21 | 2020-06-23 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Lyophilized moldable implants containing an oxysterol |
| US10639157B2 (en) | 2017-03-14 | 2020-05-05 | Theracell, Inc. | Demineralized bone fiber composition for use in minimally invasive surgery |
| US11464888B2 (en) | 2017-06-12 | 2022-10-11 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Moldable formulations containing an oxysterol in an acellular tissue matrix |
| US11103618B2 (en) | 2018-02-22 | 2021-08-31 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Demineralized bone matrix having improved handling characteristics |
| US11498880B2 (en) | 2019-07-26 | 2022-11-15 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Calcium phosphate granules and methods of making them |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4789732A (en) * | 1980-08-04 | 1988-12-06 | Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic protein composition |
| US4455256A (en) * | 1981-05-05 | 1984-06-19 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic protein |
| US4761471A (en) * | 1980-08-04 | 1988-08-02 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic protein composition |
| US4294753A (en) * | 1980-08-04 | 1981-10-13 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic protein process |
| US4619989A (en) * | 1981-05-05 | 1986-10-28 | The Regents Of The University Of Cal. | Bone morphogenetic protein composition |
| US4434094A (en) * | 1983-04-12 | 1984-02-28 | Collagen Corporation | Partially purified osteogenic factor and process for preparing same from demineralized bone |
| US4795804A (en) * | 1983-08-16 | 1989-01-03 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic agents |
| US4804744A (en) * | 1984-01-04 | 1989-02-14 | International Genetic Engineering, Inc. | Osteogenic factors |
| US4608199A (en) * | 1984-03-20 | 1986-08-26 | Arnold Caplan | Bone protein purification process |
| US4627982A (en) * | 1984-07-16 | 1986-12-09 | Collagen Corporation | Partially purified bone-inducing factor |
| EP0169016B2 (en) * | 1984-07-16 | 2004-04-28 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptide cartilage-inducing factors found in bone |
| US4843063A (en) * | 1984-07-16 | 1989-06-27 | Collagen Corporation | Polypeptide cartilage-inducing factors found in bone |
| US4563350A (en) * | 1984-10-24 | 1986-01-07 | Collagen Corporation | Inductive collagen based bone repair preparations |
| US4886747A (en) * | 1985-03-22 | 1989-12-12 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding TGF-β and its uses |
| US4681763A (en) * | 1985-06-11 | 1987-07-21 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Composition for stimulating bone growth |
| US4798885A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-17 | Genentech, Inc. | Compositions of hormonally active human and porcine inhibin containing an α chain and 62 chain |
| US4737578A (en) * | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
| KR900700116A (ko) * | 1988-04-06 | 1990-08-11 | 원본미기재 | 뼈-유도 단백질 |
| US5108753A (en) * | 1988-04-08 | 1992-04-28 | Creative Biomolecules | Osteogenic devices |
| US4968590A (en) * | 1988-04-08 | 1990-11-06 | Stryker Corporation | Osteogenic proteins and polypeptides |
| US5011691A (en) * | 1988-08-15 | 1991-04-30 | Stryker Corporation | Osteogenic devices |
| US5106626A (en) * | 1988-10-11 | 1992-04-21 | International Genetic Engineering, Inc. | Osteogenic factors |
| EP0429570B1 (en) * | 1989-03-28 | 1998-01-14 | Genetics Institute, Inc. | Osteoinductive compositions |
| CA2017466A1 (en) * | 1989-06-02 | 1990-12-02 | Michael C. Kiefer | Bone calcification factor |
| CA2020729A1 (en) * | 1989-07-19 | 1991-01-20 | Michael C. Kiefer | Bone morphogenetic protein |
| EP0489062A4 (en) * | 1989-08-21 | 1992-08-12 | Celtrix Laboratories, Inc. | Bone-specific protein |
| JP3045398B2 (ja) * | 1989-09-06 | 2000-05-29 | 武田薬品工業株式会社 | 蛋白質、ｄｎａおよびその用途 |
| CA2042577A1 (en) * | 1989-10-17 | 1991-04-18 | Hermann Oppermann | Osteogenic devices |
| EP0536186B1 (en) * | 1990-05-16 | 2001-11-21 | Genetics Institute, Inc. | Bone and cartilage inductive proteins |
| US5168050A (en) * | 1990-05-24 | 1992-12-01 | Genentech, Inc. | Mammalian expression of the bone morphogenetic protein-2b using bmp2a/bmp2b fusion |
| WO1992007004A1 (en) * | 1990-10-18 | 1992-04-30 | Creative Biomolecules, Inc. | Osteogenic protein |
| CA2094027C (en) * | 1990-10-18 | 2001-12-25 | Hermann Oppermann | Osteogenic peptides |
| CA2116562C (en) * | 1991-08-30 | 1999-04-13 | Thangavel Kuberasampath | Morphogen-induced modulation of inflammatory response |
| CA2116559C (en) * | 1991-08-30 | 2005-05-10 | Thangavel Kuberasampath | Treatment to prevent loss of and/or increase bone mass in metabolic bone diseases |
-
1992
- 1992-06-25 AT AT92914973T patent/ATE175441T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-06-25 DK DK92914973T patent/DK0592562T3/da active
- 1992-06-25 WO PCT/US1992/005374 patent/WO1993000432A1/en active IP Right Grant
- 1992-06-25 ES ES92914973T patent/ES2127757T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-25 JP JP50166293A patent/JP3485917B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-06-25 CA CA002108770A patent/CA2108770C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-06-25 AU AU22699/92A patent/AU652472B2/en not_active Ceased
- 1992-06-25 EP EP92914973A patent/EP0592562B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-25 US US08/050,132 patent/US5661007A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-25 DE DE69228118T patent/DE69228118T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-06-25 KR KR1019930704031A patent/KR100255415B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-08-01 JP JP2003284907A patent/JP2004002464A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1993000432A1 (en) | 1993-01-07 |
| JP3485917B2 (ja) | 2004-01-13 |
| AU2269992A (en) | 1993-01-25 |
| AU652472B2 (en) | 1994-08-25 |
| CA2108770C (en) | 2007-04-03 |
| JPH06508990A (ja) | 1994-10-13 |
| US5661007A (en) | 1997-08-26 |
| EP0592562A1 (en) | 1994-04-20 |
| CA2108770A1 (en) | 1992-12-26 |
| EP0592562B1 (en) | 1999-01-07 |
| DK0592562T3 (da) | 1999-08-30 |
| ATE175441T1 (de) | 1999-01-15 |
| JP2004002464A (ja) | 2004-01-08 |
| DE69228118T2 (de) | 1999-08-19 |
| DE69228118D1 (de) | 1999-02-18 |
| ES2127757T3 (es) | 1999-05-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100255415B1 (ko) | 비엠피-9 조성물 | |
| KR100227406B1 (ko) | Bmp-11 조성물 | |
| AU677849B2 (en) | BMP-10 compositions | |
| KR100259827B1 (ko) | 재조합 골형태 형성 단백질 헤테로다이머, 그 조성물 및 사용방법 | |
| JP3939729B2 (ja) | Ｂｍｐ−１２、ｂｍｐ−１３およびそれらの腱誘導組成物 | |
| EP0429570B1 (en) | Osteoinductive compositions | |
| US5637480A (en) | DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10 | |
| US5849880A (en) | Bone morphogenetic protein (BMP)--6 | |
| AU645244B2 (en) | Bone and cartilage inductive compositions | |
| KR19990014917A (ko) | Bmp-15 조성물 | |
| ES2213927T3 (es) | Usos neuronales de bmp-11. | |
| EP0550625B1 (en) | Bmp-5 derivatives | |
| EP1000143A1 (en) | Frazzled nucleotide sequences, expression products, compositions and uses | |
| KR100247216B1 (ko) | 골 유도 조성물 | |
| AU624940B2 (en) | Osteoinductive compositions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20090114 Year of fee payment: 10 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |