CN1355714A - Lim矿化蛋白剪接变体 - Google Patents

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Abstract

本发明致力于编码LIM矿化蛋白或LMP的分离核酸分子。本发明还提供了包含编码LMP的核酸序列剪接变体的载体,以及包含这些载体的宿主细胞。此外,本发明还涉及通过用包含编码LIM矿化蛋白剪接变体的核苷酸序列的分离核酸分子转染生骨前体细胞来诱导骨形成的方法。转染可以离体进行,或者通过直接注射病毒或裸露的质粒DNA而在体内发生。在特定的实施方案中,本发明提供了融合脊骨的方法,即用包含编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸分子转染生骨前体细胞,混和经转染生骨前体细胞与基质,并使基质接触脊骨。最后,本发明涉及通过用本发明载体稳定转染宿主细胞来诱导全身性骨形成的方法。

Description

LIM矿化蛋白剪接变体
发明背景
1.发明领域
一般的说，本发明涉及哺乳动物的生骨细胞以及骨和骨组织形成。具体的说，本发明涉及在体外和在体内增强骨矿化效能的蛋白质新家族以及编码这些蛋白质的核酸。本发明提供了用于治疗与骨和骨组织有关的多种病理学状态的方法，诸如脊骨(spine)融合、骨折修复、和骨质疏松。
2.相关技术的描述
成骨细胞被认为是由多能间充质干细胞分化而来的。成骨细胞的成熟导致细胞外基质的分泌，从而矿化并形成骨。这种复杂过程的调控尚不太清楚，但是认为涉及一组已知为骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)的信号蛋白质。这些蛋白质已显示与胚胎背腹图式、肢芽发育、和成年动物的骨折修复有关(B.L.Hogan，基因和发育(Genes&Develop.)10：1580，1996)。这组转化生长因子β超家族分泌的蛋白质在多种细胞类型中在不同分化阶段具有不同活性；这些紧密相关分子的生理学活性差异尚未阐明(D.M.Kingsley，遗传学趋势(Trends Genet.)10：16，1994)。
为了更好的认识不同BMP信号蛋白的独特生理学作用，我们最近比较了BMP-6与BMP-2和BMP-4诱导大鼠颅盖成骨细胞分化的潜能(Boden等人，内分泌学(Endocrinology)137：3401，1996)。我们在需要BMP或糖皮质激素来发动分化的大鼠胎儿颅盖第一代传代(继代)培养物中研究了这种过程。在这种膜成骨形成模型中，糖皮质激素(GC)或BMP将发动趋向能够分泌骨钙蛋白(成骨细胞特异性蛋白质)的矿化骨结的分化。这种传代培养物系统不同于经历自发分化的大鼠成骨细胞原代培养物。在这种传代系统中，糖皮质激素导致10倍诱导BMP-6 mRNA和蛋白质的表达，它负责增强成骨细胞分化(Boden等人，内分泌学(Endocrinology)138：2920，1997)。
除了细胞外信号(诸如BMP)，细胞内信号或调控分子也可能在导致新骨形成的级联事件中发挥作用。一大类细胞内调控分子是LIM蛋白质，如此命名是因为它们具有称为LIM结构域的特征性结构基元。LIM结构域是由通过2-氨基酸间隔物连接在一起的两个特殊锌指组成的富含半胱氨酸结构基元。有些蛋白质只具有LIM结构域，而其它蛋白质具有多种其它功能性结构域。LIM蛋白质形成多样性组，包括转录因子和细胞骨架蛋白。LIM结构域的主要作用似乎是通过与相同或不同LIM结构域形成二聚体或者通过结合独特蛋白质来介导蛋白质-蛋白质相互作用。
在LIM同源结构域蛋白质(即具有两个LIM结构域和一种同源结构域序列的蛋白质)中，LIM结构域作为负调控元件发挥功能。LIM同源结构域蛋白质涉及细胞谱系决定的控制和分化的调控，尽管只含LIM的蛋白质可能具有相似作用。只含LIM的蛋白质还涉及细胞增殖的控制，因为编码这种蛋白质的几种基因与致癌染色体易位有关。
人和其它哺乳动物易患需要骨修复和/或再生过程的疾病或损伤。例如，能够刺激天然骨修复机制由此缩短治愈骨折所需时间的新治疗方案将改进骨折治疗。在另一个实例中，遭受全身性骨紊乱(诸如骨质疏松)的个体将受益于能够导致全身性新骨形成的治疗方案。这些治疗方案将降低由骨质流失引起骨折的发病率，而骨质流失是这种疾病的特征。
至少为了这些原因，已经研究了细胞外因子(诸如BMP)以用于在体内刺激新骨形成。尽管使用BMP和其它细胞外信号分子获得了早期成功，但是它们的应用也引起大量缺点。例如，增强新骨形成需要较大剂量的纯化BMP，由此增加了这种治疗方法的费用。而且，细胞外蛋白质在导入宿主动物后易于降解。另外，因为它们通常具有免疫原性，所以始终存在激发针对所用蛋白质的免疫应答的可能性。
出于这些考虑，需要使用细胞内信号分子诱导新骨形成的有用治疗方案。现在，基因疗法领域的进展有可能将构成骨形成过程一部分的细胞内信号的编码核苷酸片段导入生骨前体细胞(即涉及骨形成的细胞)或外周血白细胞。骨形成的基因疗法具有大量潜在优点：(1)生产成本较低；(2)由于能够长期表达细胞内信号，所以与细胞外治疗方案相比，效能较高；(3)回避细胞外信号疗法可能受到的信号受体数目有限的牵制；(4)能够将经转染的潜在骨原细胞直接投递至需要局部骨形成的位点；和(5)将能够进行全身性骨形成，由此为骨质疏松和其它代谢性骨疾病提供治疗方案。
                        发明概述
本发明提供了使用早期参与导致骨形成的级联事件的细胞内信号分子来诱导骨形成的新型组合物和方法，从而试图克服现有技术的缺点。申请人已经发现了10-4/RLMP(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)，即序列最初分离自受激大鼠颅盖成骨细胞培养物的新LIM基因。该基因已经克隆、测序、并分析了在体外增强骨矿化效能的能力。蛋白质RLMP影响骨基质的矿化，以及趋向成骨细胞谱系的细胞分化。与其它已知细胞因子(例如BMP)不同，RLMP不是分泌性蛋白质，而是细胞内信号分子。这种特性能够有利的提供细胞内信号放大，而且更易于评价转染细胞。它还适用于更加有效且特异的体内应用。合适的临床应用包括增强骨折、骨缺陷、骨移植中的骨修复、和骨质疏松患者中的正常稳态。
申请人还已经克隆、测序、并推导了相应人蛋白质的氨基酸序列，命名为HLMP-1。该人蛋白质在体外和在体内证明了对骨矿化的增强效能。
另外，申请人已经表征了截短(短)型LMP-1，命名为HLMP-1s。这种短型得自点突变，即在cDNA克隆的一种来源中提供终止密码子从而截短蛋白质。该短型蛋白(LMP-1s)在细胞培养物中和在体内表达时完全有功能。
通过对人心脏cDNA文库的PCR分析，申请人已经鉴定了在编码HLMP-1的核苷酸序列的第325-444位碱基对区域不同于HLMP-1的另外两种剪接变体(称为HLMP-2和HLMP-3)。HLMP-2序列在该区域内具有119bp的删除和17bp的插入。与HLMP-1相比，编码HLMP-3的核苷酸序列没有删除，但是也具有与HLMP-2相同的17bp，插入HLMP-1序列的第444位。
下面的描述将阐明本发明的其它特性和优点，根据说明书将变得部分清晰，或者可以由本发明的实践认识。通过本文描述和权利要求具体指出的方法和组合物将实现和达到本发明的目的和其它优点。
在一个宽广方面，本发明涉及包含编码任何LIM矿化蛋白的核酸序列的分离核酸分子，其中该核酸分子在标准条件下与和全长SEQ ID NO：25互补的核酸分子发生杂交，且其中该核酸分子在高度严谨条件下与和全长SEQ ID NO：26互补的核酸分子发生杂交。在一个具体方面，该分离的核酸分子编码HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2、或HLMP-3。另外，本发明致力于包含这些核酸分子的载体，以及包含这些载体的宿主细胞。在另一个具体方面，本发明涉及这些蛋白质自身。
在第二种宽广方面，本发明涉及对LIM矿化蛋白，包括HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2、和HLMP-3特异的抗体。在一个具体方面，抗体是多克隆抗体。在另一个具体方面，抗体是单克隆抗体。
在第三个宽广方面，本发明涉及诱导骨形成的方法，其中用包含编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸分子转染生骨前体细胞(osteogenic precursor cell)。在一个具体方面，分离核酸分子位于载体中，载体可以是质粒或病毒，诸如腺病毒或逆转录病毒。转染可以通过直接注射分离核酸分子而离体或在体内发生。转染的分离核酸分子可以编码HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2或HLMP-3。
在另一个方面，本发明涉及融合脊髓的方法，即用包含编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的分离核酸分子转染生骨前体细胞，混和经转染的生骨前体细胞与基质，并使基质接触骨髓。
在还有一个方面，本发明涉及通过用本发明载体稳定转染宿主细胞来诱导全身性骨形成的方法。
可以理解，上文一般性描述和下文详细描述都是例示性和解释性的，而且意欲提供所要求保护的发明的进一步解释。
                        缩写和定义
BMP           骨形态发生蛋白
HLMP-1        人LMP-1，也称为人LIM蛋白或HLMP
HLMP-1s       人LMP-1短(截短)型蛋白
HLMPU         人LIM蛋白独特区
LMP           LIM矿化蛋白
MEM           极限必需培养基
Trm           曲安西龙(Triamcinolone)
-GlyP         β-磷酸甘油
RACE          cDNA末端的快速扩增
RLMP          大鼠LIM矿化蛋白，也称为RLMP-1
RLMPU         大鼠LIM蛋白独特区
RNAsin        RNA酶抑制剂
ROB           大鼠成骨细胞
10-4          包含RLMP cDNA序列的克隆(SEQ ID NO：2)
UTR           非翻译区
HLMP-2        人LMP剪接变体2
HLMP-3        人LMP剪接变体3
                       发明详述
本发明涉及新的哺乳动物LIM蛋白，此处命名为LIM矿化蛋白或LMP。本发明更具体的涉及人LMP，称为HLMP或HLMP-1，或者人LMP的其它剪接变体，称为HLMP-2或HLMP-3。申请人已经发现这些蛋白质在体外培养的哺乳动物细胞中增强骨的矿化。当哺乳动物中生成LMP时，它还在体内诱导骨的形成。
用编码LMP或HLMP的核酸离体转染骨髓细胞、生骨前体细胞、外周血白细胞、或间充质干细胞，随后将转染细胞复植到供体体内的方法适用于治疗多种骨相关紊乱或损伤。例如，可以使用这种方法来：加强长骨骨折修复；在节段性缺损中生成骨；为骨折提供骨移植替代物；促进肿瘤重建或脊骨融合；和(通过注射)为薄弱或骨质疏松的骨提供局部治疗，诸如髋骨、椎骨、或腕骨的骨质疏松。用LMP或HLMP编码核酸进行的转染还可用于：经皮注射经转染的骨髓细胞以加速骨折长骨的修复；治疗长骨骨折的愈合迟滞或不愈合或者脊骨融合的假关节病；和在髋或膝的无血管性坏死中诱导新骨形成。
除了基因疗法基于离体的方法，还可以在体内实现包含编码LMP或HLMP的核酸序列的重组DNA载体的转染。当将编码LMP或HLMP的DNA片段插入适当病毒载体(例如腺病毒载体)时，可以将病毒构建物直接注射到需要软骨内骨化的体内位点。通过直接经皮注射导入LMP或HLMP序列，即可刺激骨形成，而不需要手术干预来获得骨髓细胞(以进行离体转染)或复植到患者体内需要新骨的位点。Alden等人(神经外科学焦点(Neurosurgical Focus)，1998)已经证明了使用编码BMP-2的cDNA(已克隆到腺病毒载体中)的基因疗法直接注射方法的效用。
还有可能通过将包含编码HLMP的核酸序列的裸露的即未包囊的重组质粒直接注射至适当身体位点来进行体内基因疗法。在本发明的这个实施方案中，当适当的靶细胞摄取或内在化裸露的质粒DNA时，即发生转染，这已有描述。正如在使用病毒构建物的体内基因疗法的情况中，直接注射裸露的质粒DNA具有仅需要少许或者不需要手术干预的优点。在人患者中已经成功的证明了使用编码内皮细胞有丝分裂原VEGF(血管内皮生长因子)的裸露质粒DNA进行的直接基因疗法(Baumgartner等人，循环(Circulation)97(12)：1114-1123，1998)。
通过使用腺病毒载体将LMP投递至生骨细胞，实现了LMP的瞬时表达。发生这种现象的原因是腺病毒不掺入所转染的靶细胞的基因组。LMP的瞬时表达，即在经转染靶细胞的生存期中发生表达，足以实现本发明的目的。然而，当使用掺入靶细胞基因组的载体作为投递载体时，能够发生LMP的稳定表达。例如，基于逆转录病毒的载体适用于该目的。
LMP的稳定表达在多种全身性骨相关紊乱的治疗中特别有用，诸如骨质疏松和成骨不全。对于本发明的这个实施方案，除了使用整合到靶细胞基因组的载体将LMP编码核苷酸序列投递至靶细胞内，还将LMP表达置于可调控启动子的控制之下。例如，通过暴露于外源诱导剂(诸如四环素)来开启的启动子是合适的。使用这种方法，能够通过施用有效量的外源诱导剂在全身基础上刺激新骨形成。一旦形成了足够数量的骨质，就可以停止施用外源诱导剂。根据需要，可以重复这种过程来复原骨质流失(例如因骨质疏松所致)。
对HLMP特异的抗体特别适用于测定患者细胞的骨诱导即骨形成潜力的方法中。以这种方式，能够鉴定患者是否有骨修复愈合缓慢或不良的风险。同样，HLMP特异性抗体适用于标记物测定法，用于鉴定骨变性疾病(诸如骨质疏松)的风险因子。
遵循众所周知的传统方法，通过连接编码LMP的核酸片段与其它核酸序列(诸如克隆和/或表达载体)制备本发明的基因。构建和分析这些重组载体的所需方法，例如限制性内切酶消化、克隆方案、诱变、寡核苷酸的有机合成、和DNA测序，已有描述。对于DNA测序，优选双脱氧终止物法。
已经发表了许多关于重组DNA方法的论文，包括Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，第2版，1988；Davis等人，《分子生物学基本方法》(BasicMethods in Molecular Biology)，Elsevier，1986；和Ausubel等人，《分子生物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley Interscience，1988(特别收入本文作为参考)。
引物指导的DNA或cDNA扩增是本发明基因表达中的常用步骤。它通常是通过聚合酶链式反应(PCR)来进行的。授予Mullis等人的美国专利4,800,159和其它已发表来源描述了PCR。PCR的基本原理是通过引物延伸的连续循环来指数复制DNA序列。当一种引物的延伸产物与另一种引物发生杂交时，即成为合成另一核酸分子的模板。引物-模板复合物作为DNA聚合酶的底物，而DNA聚合酶在发挥复制功能时延伸引物。用于PCR应用的传统酶是分离自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的热稳定DNA聚合酶，或Taq DNA聚合酶。
基本的PCR方法存在大量变异，而且熟练技术人员能够容易的进行构建本发明重组载体所需任何特定步骤中选择的具体流程。例如，为了测量10-4/RLMP的细胞表达，可以在众所周知的标准流程下提取RNA并逆转录，然后通过PCR为适当的mRNA序列分析获得的cDNA。
在重组表达系统的表达载体中表达编码LIM矿化蛋白的基因。当然，构建的序列无需与原始序列或其互补序列相同，而可以是根据DNA密码简并性确定表达具有骨形成活性的LMP的任何序列。还可以采用保守氨基酸替代或其它修饰(诸如氨基末端存在甲硫氨酸残基)。
将在选择的宿主表达系统中有活性的核糖体结合位点连接至嵌合LMP编码序列的5端，形成合成基因。通过连接适当线性化的质粒，可以将合成基因插入多种表达载体中的任一种。可调控启动子(例如大肠杆菌lac启动子)也适用于表达嵌合编码序列。其它合适的可调控启动子包括trp、tac、recA、T7、和λ启动子。
通过几种已发表的标准流程之一，例如磷酸钙沉淀、DEAE-Dextran、电穿孔、或原生质体融合，将编码LMP的DNA转染到受体细胞中，形成稳定的转化体。优选磷酸钙沉淀，如下进行时特别如此。
在转移到细胞内之前，参照Graham和Van Der的方法(病毒学(Virology)52：456，1973)使DNA与磷酸钙共沉淀。取40-50g DNA，以鲑鱼精或小牛胸腺DNA作为载体，应用于铺在100mm培养皿上的0.5×106个细胞。将DNA与0.5ml 2x Hepes溶液(280mM NaCl/50mM Hepes/1.5mMNa2HPO4，pH7.0)混和，并加入等体积的2x CaCl2(250mM CaCl2/10mM Hepes，pH7.0)。30-40分钟后出现白色颗粒沉淀，均匀的滴加在细胞上，并于37℃温育4-16小时。除去培养基，并将细胞在溶于PBS的15％甘油中震动3分钟。除去甘油后，用含10％胎牛血清的Dulbecco氏极限必需培养基(DMEM)培养细胞。
还可以使用下列方法转染DNA：Kimura等人(病毒学(Virology)49：394，1972)和Sompayrac等人(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78：7575，1981)的DEAE-Dextran法；Potter(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：7161，1984)的电穿孔法；和Sandri-Goddin等人(分子和细胞生物学(Molec.Cell.Biol.)1：743，1981)的原生质体融合法。
固相亚磷酰胺化学法是用于有机合成寡脱氧核苷酸和多脱氧核苷酸的优选方法。另外，可采用许多其它化学合成法。本领域技术人员能够容易的用这些方法合成本发明的具体序列。
本发明还包括在标准条件下与编码本发明LIM矿化蛋白的任何核酸序列发生杂交的核酸分子。“标准杂交条件”将随探针大小、核酸试剂的背景和浓度、以及杂交类型(例如原位、Southern印渍、或DNA-RNA杂合体杂交(Northern印渍))而变化。“标准杂交条件”的确定属于本领域技术水平之内。例如，参阅授予Fremeau等人的美国专利5,580,775；E.M.Southern，分子生物学杂志(J.Mo1.Biol.)98：503，1975；Alwine等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)68：220，1979；和Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，第7.19-7.50页，冷泉港出版社，1989(收入本文作为参考)。
一组优选的标准杂交条件包括将印渍在50％甲酰胺/5x SSPE(150nMNaCl/10mM NaH2PO4[pH7.4]/1mM EDTA[pH8.0])/5x Denhardt氏溶液(每100ml水含20mg Ficoll/20mg聚乙烯吡咯烷酮/20mg BSA)/10％硫酸葡聚糖/1％ SDS/100g/ml鲑鱼精DNA中于42℃预杂交2小时；加入32P标记的cDNA探针，并将杂交继续14小时；然后，将印渍用2x SSPE/0.1％ SDS于22℃清洗20分钟2次，随后用0.1x SSPE/0.1％ SDS于65℃清洗1小时；然后将印渍干燥并在存在增感屏的条件下使X射线胶片曝光5天。
在“高度严谨条件”下，若探针与其靶序列充分相同，则这两种序列将发生杂交。正如在标准杂交条件的情况中，本领域技术人员能够根据本领域技术水平和具体实验的种类确定只有充分相同序列发生杂交的条件。
本发明的另一个方面包括由核酸序列编码的蛋白质。在还有一个方面，本发明涉及基于抗LMP抗体的对这种蛋白质的鉴定。在这个实施方案中，通过裂解细胞和SDS-PAGE分离蛋白质来制备用于Western印渍分析的蛋白质样品。如Ausubel等人(《分子生物学现行方案》(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley and Sons，1987)所述，通过电印迹将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。用速溶脱脂奶粉(1gm溶于100ml PBS)封闭滤膜后，将抗LMP抗体加到滤膜上，并于室温温育1小时。用磷酸盐缓冲液(PBS)彻底清洗滤膜，并与辣根过氧化物酶(HRPO)-抗体缀合物于室温温育1小时。再次用PBS彻底清洗滤膜，并通过加入二氨基联苯胺(DAB)来鉴定抗原条带。
单特异性抗体是本发明选择的试剂，具体用于分析患者细胞与LMP表达有关的特定特征。如本文所用，“单特异性抗体”定义为对LMP具有均一结合特征的一种或多种抗体。如本文所用，“均一结合”指抗体结合特定抗原或表位(诸如上述LMP相关抗原或表位)的能力。由包含LMP反应性抗体的哺乳动物抗血清纯化针对LMP的单特异性抗体，或者使用Kohler和Milstein(自然(Nature)256：495-497，1975)的技术制备LMP反应性单克隆抗体。通过用适当浓度的LMP(含或不含免疫佐剂)免疫动物(诸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、或马)来制备LMP特异性抗体。
在这种方法中，在第一次免疫前采集免疫前血清。每只动物接受大约0.1mg-大约1000mg LMP，根据需要，可结合使用可接受免疫佐剂。这种可接受佐剂包括(但不限于)弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、明矾沉淀物、包含小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)的油包水乳剂、和tRNA佐剂。初始免疫包括皮下(PC)、腹膜内(IP)、或二者兼之多处注射优选于弗氏完全佐剂中的LMP。以规则时间间隔(优选每周一次)对每只动物采血以测定抗体效价。动物可以在初始免疫后接受或不接受加强注射。那些接受加强注射的动物通常通过相同途径接受于弗氏不完全佐剂中的等量抗原。以大约3周的时间间隔给予加强注射，直至获得最高效价。每次加强免疫后大约7天或单次免疫后大约每周一次，对动物采血，收集血清，并分装保存于大约-20℃。
通过用LMP免疫近交小鼠(优选Balb/c小鼠)来制备LMP反应性单克隆抗体(mAb)。通过IP或SC途径用大约0.1mg-大约10mg(优选大约1mg)溶于大约0.5ml缓冲液或生理盐水的LMP及等体积混和的上述可接受佐剂免疫小鼠。优选弗氏完全佐剂。小鼠在第0天接受初始免疫，并休息大约3-30周。通过静脉内(IV)途径给予经免疫小鼠以一次或多次加强免疫，每次大约0.1mg-大约10mg溶于缓冲液(诸如磷酸盐缓冲液)的LMP。通过本领域知道的标准流程，由经免疫小鼠切下脾，获得来自抗体阳性小鼠的淋巴细胞，优选脾淋巴细胞。通过在能够形成稳定杂交瘤的条件下混和脾淋巴细胞与适当的融合配偶体(优选骨髓瘤细胞)以产生杂交瘤细胞。融合配偶体可以包括(但不限于)小鼠骨髓瘤P3/NS1/Ag 4-1、MPC-11、S-194、和Sp 2/0，优选Sp 2/0。在分子量大约1000、浓度大约30％-大约50％的聚乙二醇中融合抗体生成细胞和骨髓瘤细胞。通过本领域知道的流程，在添加次黄嘌呤、胸苷、和氨基蝶呤的Dulbecco’sModified Eagles Medium(DMEM)中进行培养，由此选择融合的杂交瘤细胞。在大约第14、18、和21天由生长阳性孔收集上清液，并通过免疫测定法(诸如固相免疫放射性测定法SPIRA)以LMP作为抗原筛选抗体生成。还在Ouchterlony沉淀测定法中测试培养液，以确定mAb的同种型。通过诸如MacPherson的软琼脂技术(“软琼脂技术”，在《组织培养方法和应用》(Tissue Culture Methods and Applications)中，Kruse和Paterson编，Academic出版社，1973)克隆来自抗体阳性孔的杂交瘤细胞。还可参阅Harlow等人，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A LaboratoryManual)，冷泉港实验室，1988。
还可以通过给降植烷致敏的Balb/c小鼠(每只小鼠大约0.5ml)在致敏后大约4天注射大约2×106-大约6×106个杂交瘤细胞，从而在体内产生单克隆抗体。细胞转移后大约8-12天收集腹水，并通过本领域知道的技术纯化单克隆抗体。
通过在含大约2％胎牛血清的DMEM中培养杂交瘤细胞系进行抗LMP单克隆抗体的体内生产，来获得足够量的特异性mAb，并通过本领域知道的技术纯化mAb。
通过多种血清学或免疫学测定法测定腹水或杂交瘤培养液的抗体效价，包括(但不限于)沉淀、被动凝集、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、和放射性免疫测定法(RIA)。可使用相似测定法检测体液或组织和细胞提取物中是否存在LMP。
本领域技术人员显然知道，上述用于生成单特异性抗体的方法可用于生成对LMP多肽片段、全长初生LMP多肽、或者其变体或等位基因特异的抗体。
在另一个实施方案中，本发明致力于HLMP-1的其它剪接变体。人心脏cDNA的PCR分析揭示了在HLMP-1序列的第325-444位碱基对区域不同于HLMP-1的另外两种HLMP剪接变体(称为HLMP-2和HLMP-3)的mRNA。HLMP-2序列在该区域内具有119bp的删除和17bp的插入。这些变化保留了读码框，产生423个氨基酸的蛋白质，其与HLMP-1相比，净损失34个氨基酸(删除40个氨基酸，插入6个氨基酸)。HLMP-2包含在HLMP-1中存在的C末端LIM结构域。
与HLMP-1相比，HLMP-3没有删除，但是在第444位也插入了相同的17bp。该插入移动了读码框，在第459-461位碱基对处产生终止密码子。结果，HLMP-3编码153个氨基酸的蛋白质。该蛋白质缺乏在HLMP-1和HLMP-2中存在的C末端LIM结构域。通过Western印渍分析确认了由HLMP-2和HLMP-3编码的蛋白质的预测大小。
3种剪接变体的组织分布PCR分析揭示了它们是差异表达的，特定异构体在不同组织中占优势。HLMP-1显然是在白细胞、脾、肺、胎盘、和胎肝中表达的主要形式。HLMP-2似乎是骨骼肌、骨髓、和心脏组织中的主要异构体。然而，HLMP-3在检查的任何组织中都不是主要形式。
HLMP-3在大鼠成骨细胞传代培养物中的过度表达诱导骨节形成(287±56)，与糖皮质激素(272±7)和HLMP-1(232±200)的效果相似。既然HLMP-3缺乏C末端LIM结构域，那么骨诱导活性就不需要这些区域。但是，HLMP-2的过度表达不诱导骨节形成(11±3)。这些数据说明由删除的119bp编码的氨基酸是骨诱导所必需的。这些数据还说明HLMP剪接变体的分布对于组织特异功能可能是重要的。令人惊讶的是，我们已经显示HLMP-2在大鼠成骨细胞传代培养物中可抑制类固醇诱导的成骨细胞形成。因此，HLMP-2将在不需要骨形成的临床情形中具有治疗性效用。
1997年7月22日，将位于载体中的10-4/RLMP样品，命名为pCMV2/RLMP(包含插入片段10-4克隆/RLMP的载体pRc/CMV2)，保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852。保藏物的培养物编号是209153。1998年3月19日，将包含插入片段HLMP-1s的载体pHis-A样品保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。保藏物的培养物编号是209698。2000年4月14日，按照布达佩斯条约(BudapestTreaty)，将质粒pHAhLMP-2(包含衍生自含HLMP-2人心肌cDNA的cDNA插入片段的载体pHisA)和pHAhLMP-3(包含衍生自含HLMP-3人心肌cDNA的cDNA插入片段的载体pHisA)样品保藏于ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA，201 10-2209，USA。这些保藏物的保藏号依次是＿＿＿和＿＿＿。根据布达佩斯条约的要求，这些保藏物将在ATCC维持至少30年，而且在公开它们的专利授权后可以公开获得。应当明白保藏物的可获得性并不构成对以侵犯由政府行为授予的专利权来实施本发明的许可。
在评价本发明的核酸、蛋白质、或抗体时，采用了酶测定法、蛋白质纯化、和其它传统生化方法。分别通过Southern印渍和Northern印渍技术分析DNA和RNA。通常，通过凝胶电泳将分析的样品大小分离。然后将凝胶中的DNA或RNA转移至硝酸纤维素或尼龙滤膜。然后将印渍(即凝胶中样品图式的复制品)与探针进行杂交。通常，探针是放射性标记的，优选32P，尽管可以用本领域知道的其它信号生成分子标记探针。然后可以通过检测系统(诸如放射自显影)使感兴趣的特定条带显影。
为了举例说明本发明的优选实施方案，本文包括下列非限制性实施例。这些结果证明了使用本发明LIM矿化蛋白及编码这些蛋白质的分离核酸分子来诱导或增强骨形成的可行性。
实施例1.颅盖细胞培养
如先前所述(Boden等人，内分泌学(Endocrinology)137(8)：3401-3407，1996)，由分娩前20天的大鼠获得大鼠颅盖细胞(也称为大鼠成骨细胞，ROB)。将原代培养物培养至汇合，胰蛋白酶处理，并传代至6孔板(每个35mm孔1×105个细胞)作为第一代传代培养细胞。将在第0天汇合的传代培养细胞继续培养7天。由第0天开始，每3或4天在层流罩超净台中换培养基并进行处理(Trm和/或BMP)。标准培养方案如下：第1-7天，MEM/10％FBS/50μg/ml抗坏血酸/±刺激物；第8-14天，BGJb培养基/10％ FBS/5mM-GlyP(作为无机磷酸盐来源以进行矿化)。在第14天进行骨节形成和骨钙蛋白分泌的终点分析。根据在所有BMP研究的剂量-应答曲线上证明了中间效应的该系统预试验，BMP的剂量选择为50ng/ml。实施例2.反义处理和细胞培养
为了研究LMP-1在膜成骨形成过程中的潜在功能性作用，我们合成了用于阻断LMP-1 mRNA翻译的反义寡核苷酸，并处理正在经历由糖皮质激素起始分化的成骨细胞传代培养物。使用对应于跨越推定翻译起始位点的25bp序列(SEQ ID NO：42)的高度特异性反义寡核苷酸(与已知大鼠序列没有显著同源性)实现了对RLMP表达的抑制。对照培养物抑或不接受寡核苷酸抑或接受有义寡核苷酸。在存在(预先温育)或不存在脂质转染胺试剂(lipofectamine)的情况中进行实验。简单的说，将22g有义或反义RLMP寡核苷酸在MEM中于室温温育45分钟。温育后，加入更多MEM或预先温育的脂质转染胺试剂/MEM(7％ v/v；于室温温育45分钟)，使寡核苷酸浓度达到0.2M。将获得的混和物于室温温育15分钟。然后将寡核苷酸混和物与适当培养基(即MEM/抗坏血酸/±Trm)混和，使寡核苷酸终浓度达到0.1M。
在存在或不存在适当寡核苷酸的情况中在适当培养基(±刺激物)中培养细胞。将最初用脂质转染胺试剂培养的培养物于37℃在5％ CO2中培养4小时后换成既不含脂质转染胺试剂又不含寡核苷酸的培养基。所有培养物(尤其是接受寡核苷酸的培养物)每24小时换培养基，以维持寡核苷酸水平。
LMP-1反义寡核苷酸以依赖剂量的方式抑制矿化骨节的形成和骨钙蛋白的分泌，与BMP-6寡核苷酸的效果相似。加入外源BMP-6不能挽救成骨细胞分化中的LMP-1反义阻断，却能够逆转BMP-6反义寡核苷酸抑制。该实验进一步确认了在成骨细胞分化途径中LMP-1相对于BMP-6处于上游。LMP-1反义寡核苷酸还在大鼠成骨细胞原代培养物中抑制自发的成骨细胞分化。实施例3.矿化骨节形成的定量
将参照实施例1和2制备的ROB培养物在70％乙醇中固定过夜并用vonKossa银染料染色。使用半自动计算机化视频图像分析系统来定量每个孔中的骨节计数和骨节面积(Boden等人，内分泌学(Endocrinology)137(8)：3401-3407，1996)。然后将这些数值相除，计算面积/骨节值。通过人工计数验证了这种自动化方法，相关系数0.92(p＜0.000001)。所有数据表述为由每种条件5或6个孔计算得到的平均值±平均标准误差(S.E.M.)。每次实验使用来自不同颅盖制备物的细胞确认至少两次。实施例4.骨钙蛋白分泌的定量
如Nanes等人所述(内分泌学(Endocrinology)127：588，1990)，使用我们实验室制备的针对大鼠骨钙蛋白C末端九肽的单特异性多克隆抗体(Pab)的竞争放射性免疫测定法，测量培养基中的骨钙蛋白水平。简单的说，通过乳过氧化物酶法，用1mCi 125I-Na碘化1g九肽。向装有2001测定缓冲液(0.02M磷酸钠/1mM EDTA/0.001％硫柳汞/0.025％ BSA)的管中加入来自细胞培养物的培养基或溶于100μl测定缓冲液的骨钙蛋白标准(0-12,000fmol)。然后加入Pab(1：40,000；100μl)，随后加入碘化肽(12,000cpm；1001)。相似的制备测试非特异性结合的样品，但是不含抗体。
通过加入700μl山羊抗兔IgG，随后于4℃温育18小时，由此分离结合的和游离的Pab。将样品以1200rpm离心45分钟后，弃去上清液，并在γ计数器中对沉淀物计数。以fmol/1001报告骨钙蛋白值，然后将这些数值除以100转换成pmol/ml培养基(3天产量)。数值以每种条件5-6个孔3次测定的平均值±S.E.M.表述。每次实验使用来自不同颅盖制备物的细胞确认至少两次。实施例5.Trm和RLMP在体外对矿化的影响
有义或反义寡核苷酸在未刺激细胞培养系统中对总的骨节形成有很少明显影响。但是，当用Trm刺激ROB时，RLMP的反义寡核苷酸抑制骨节矿化＞95％。向寡核苷酸处理的培养物中加入外源BMP-6不能挽救RLMP反义寡核苷酸所处理骨节的矿化。
骨钙蛋白与骨矿化长期同义，而且骨钙蛋白水平与骨节产生和矿化有关。RLMP反义寡核苷酸显著降低骨钙蛋白生成，但是反义处理的培养物的骨节计数没有显著变化。在这种情况中，加入外源BMP-6只将RLMP反义所处理培养物中的骨钙蛋白生成挽救了10-15％。这说明RLMP的作用位于BMP-6下游，而且比BMP-6更具特异性。实施例6.RNA的收获和纯化
使用4M异硫氰酸胍(GIT)溶液，由双份ROB(参照实施例1和2在6孔培养板中制备)孔收获细胞RNA，产生统计学上的三份样品。简单的说，由孔吸出培养物上清液，然后在每份成对孔收获物上覆盖0.6ml GIT溶液。加入GIT溶液后，将平板旋涡摇动5-10秒钟(尽可能一致)。在进行进一步处理前，将样品于-70℃保存多至7天。
通过参照Sambrook等人(《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，第2版，第7.19章，冷泉港出版社，1989)的标准方法，略微改动，纯化RNA。简单的说，向解冻的样品中加入60 l2.0M醋酸钠(pH4.0)、550 l水饱和酚、和150l氯仿∶异戊醇(49∶1)。旋涡震荡后，将样品于4℃以10000xg离心20分钟，将水相转移至新管，加入600 l异丙醇，并将RNA于-20℃沉淀过夜。
过夜保温后，将样品以10000xg离心20分钟，并轻轻吸去上清液。将沉淀重悬于400l经DEPC处理的水，用酚∶氯仿(1∶1)抽提1次，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，并在加入40l 3.0M醋酸钠(pH5.2)和1.0ml无水乙醇后于-20℃沉淀过夜。为了回收细胞RNA，将样品以10000xg离心20分钟，用70％乙醇清洗1次，空气干燥5-10分钟，并重悬于20 l经DEPC处理的水。根据使用分光光度计测定的光密度计算RNA浓度。实施例7.逆转录-聚合酶链式反应
将溶于总体积10.5l DEPC-H2O的5g总RNA于65℃加热5分钟，然后加到装有4l 5x MMLV-RT缓冲液、2l dNTP、21 dT17引物(10pmol/ml)、0.5l RNA抑制剂(40U/ml)、和1μl MMLV-RT(200U/l)的管中。将样品于37℃温育1小时，然后于95℃温育5分钟以灭活MMLV-RT。加入80l水稀释样品。
使用标准方法学(50l总体积)，取5l逆转录样品进行聚合酶链式反应。简单的说，将样品加到装有水和适量PCR缓冲液、25mM MgCl2、dNTP、用于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP，一种持家基因)和/或BMP-6的正向和反向引物、32P-dCTP、和Taq聚合酶的管中。除非另有注明，将引物标准化使之在22轮循环中持续运行(94℃，30”；58℃，30”；72℃，20”)。实施例8.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和磷光图像仪分析对RT-PCR产物的定量
向每管RT-PCR产物中加入5l加样染料，混和，于65℃加热10分钟，然后离心。每个反应取10l，在标准条件下进行PAGE(12％聚丙烯酰胺∶双丙烯酰胺；15V/孔；恒流)。然后将凝胶在凝胶保存缓冲液(10％ v/v甘油/7％ v/v醋酸/40％ v/v甲醇/43％去离子水)中温育30分钟，于80℃真空干燥1-2小时，并用电子增强的磷光成像系统显影6-24小时。分析显影条带。为每条带的计数绘图。
实施例9.差异显示PCR
由用糖皮质激素(Trm，1nM)刺激的细胞提取RNA。如实施例7所述，将溶于总体积10.5l DEPC-H2O的5g总RNA于65℃加热5分钟，DNA酶处理，并进行逆转录，但是使用H-T11M(SEQ ID NO：4)作为MMLV-RT引物。如上所述，通过PCR扩增获得的cDNA，但是使用多种商品化引物对(例如H-T11G(SEQ ID NO：4)和H-AP-10(SEQ ID NO：5)；GenHunter公司，Nashville，TN)。在DNA测序凝胶上通过凝胶电泳分离放射性标记的PCR产物。电泳后，将获得的凝胶真空干燥，并将放射自显影胶片曝光过夜。由凝胶切下代表差异表达cDNA的条带，并使用Conner等人(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad Sci.USA)88：278，1983)的方法通过PCR再次扩增。使用TA克隆试剂盒(InVitrogen，Carlsbad，CA)，将PCR再次扩增产物克隆到载体PCR-II中。实施例10.UMR 106大鼠骨肉瘤细胞cDNA文库的筛选
将UMR106文库(2.5×1010pfu/ml)以5×104pfu/ml涂布在琼脂平板(LB底层琼脂)上，并将平板于37℃温育过夜。将滤膜覆盖平板2分钟。一旦揭下滤膜，变性，漂洗，干燥，并UV交联。然后将滤膜在预杂交缓冲液(2x PIPES[pH6.5]/5％甲酰胺/1％ SDS/100g/ml变性鲑鱼精DNA)中于42℃温育2小时。向完整杂交混和物/滤膜中加入260bp的放射性标记探针(SEQ ID NO：3；通过随机引发进行32P标记)，随后于42℃温育18小时。将滤膜用1x SSC/0.1％ SDS于室温清洗10分钟1次，用0.1x SSC/0.1％ SDS于55℃清洗15分钟3次。
清洗后，如上所述，通过放射自显影分析滤膜。将阳性克隆噬斑纯化。用第二张滤膜重复该步骤4分钟，使假阳性最小化。以λSK(-)噬菌粒的形式挽救经噬斑纯化的克隆。如下所述，对克隆的cDNA测序。实施例11.克隆的测序
通过标准方法(Ausubel等人，《分子生物学现行方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Wiley Interscience，1988)对克隆的cDNA插入片段测序。简单的说，将适当浓度的终止混和物、模板、和反应混和物进行适当的循环方案(95℃，30”；68℃，30”；72C，60”；x25)。加入终止混和物终止测序反应。于92℃加热3分钟后，将样品加样至变性6％聚丙烯酰胺测序凝胶(29∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)。将样品以60伏恒流电泳大约4小时。电泳后，将凝胶真空干燥并放射自显影。
人工分析放射自显影胶片。使用缺省参数设置的BLASTn程序对由国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NIH，Bethesda，MD；http：//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)维持的数据库筛选获得的序列。根据序列资料，制备新的测序引物，并重复该过程，直至将完整基因测序。所有序列在两个方向上确认最少3次。
还使用PCGENE软件包(16.0版)分析了核苷酸和氨基酸序列。通过NALIGN程序使用下列参数计算核苷酸序列的同源性百分值：非匹配核苷酸的权，10；非匹配缺口的权，10；考虑的核苷酸最大数目，50；和考虑的核苷酸最小数目，50。
对于氨基酸序列，使用PALIGN计算同源性百分值。开放缺口罚分和单位缺口罚分都选择10。实施例12.RLMP cDNA的克隆
实施例9所述差异显示PCR扩增产物包含大约260bp的主带。将该序列用于筛选大鼠骨肉瘤(UMR 106)cDNA文库。将阳性克隆进行嵌套引物分析，以获得扩增全长cDNM所需引物序列(SEQ ID NO：11、12、29、30、和31)。将选择用于进一步研究的这些阳性克隆之一命名为克隆10-4。
通过嵌套引物分析测定的克隆10-4全长cDNA的序列分析显示，克隆10-4包含由差异显示PCR鉴定的最初260bp片段。克隆10-4(1696bp；SEQ IDNO：2)包含1371bp的开放读码框，编码457个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：1)。终止密码子TGA位于第1444-1446位核苷酸。位于第1675-1680位核苷酸的多聚腺苷酸化信号及毗连的poly(A)+尾位于3’非编码区。在SEQID NO：1的第113-116和第257-259位氨基酸存在两个潜在的N-糖基化位点，分别为Asn-Lys-Thr和Asn-Arg-Thr。在第191位和第349位氨基酸发现了两个潜在的依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点，分别为Ser和Thr。在第3位、第115位、第166位、第219位、和第442位存在5个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点，Ser或Thr。在第272-279位氨基酸确定了1个潜在的ATP/GTP结合位点基元A(P环)，Gly-Gly-Ser-Asn-Asn-Gly-Lys-Thr。
另外，在第341-391位和第400-451位氨基酸发现了2个高度保守的推定LIM结构域。这种最新鉴定的大鼠cDNA克隆中的推定LIM结构域显示与其它已知LIM蛋白LIM结构域有可观同源性。但是，与其它大鼠LIM蛋白的整体同源性低于25％。RLMP(也称为10-4)与人enigma蛋白(参阅美国专利5,504,192)具有78.5％的氨基酸同源性，但是与其最靠近的大鼠类似物CLP-36和RIT-18只具有分别为24.5％和22.7％的氨基酸同源性。实施例13.RLMP表达的Northern印渍分析
将参照实施例1和2制备的30g来自ROB的总RNA通过甲醛凝胶电泳在1％琼脂糖平板凝胶中大小分离，并通过渗透转印渍至尼龙滤膜。用随机引发32P-dCTP标记的全长10-4 cDNA的600bp EcoR1片段探查印渍。
Northern印渍分析显示，1.7kb mRNA与RLMP探针发生杂交。暴露于BMP-6 24小时后，ROB中的RLMP mRNA上调了大约3.7倍。在用BMP-2或BMP-4刺激的ROB中，于24小时没有看到RMLP表达的上调。
实施例14.统计方法
对于报导的每个骨节/骨钙蛋白结果，使用来自代表性实验的5-6个孔的数据计算平均值±S.E.M.。可以为每个参数显示相对于最大值的标准化数据图，从而能够同时绘制骨节计数、矿化面积、和骨钙蛋白图。
对于报导的每次RT-PCR、RNA酶保护实验、或Western印渍分析，使用来自代表性实验的三份样品的数据计算平均值±S.E.M.。可以显示相对于第0天或阴性对照的标准化图，并以超过对照值的增加倍数表述。
使用方差单向分析及(根据需要)Bonferroni的因果推理多重比较修正来评价统计显著性(D.V.Huntsberger，“方差分析”，在《统计学方差要素》(Elements of Statistical Variance)中，P.Billingsley编，第298-330页，Allyn&Bacon公司，波士顿，MA，1977和Sigmastat，Jandel Scientific，Corte&Madera，CA)。显著性α水平定义为p＜0.05。实施例15.通过Western印渍分析对大鼠LIM矿化蛋白的检测
参照England等人(生物化学和生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)623：171，1980)和Timmer等人(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：24863，1993)的方法制备多克隆抗体。
用pCMV2/RLMP转染HeLa细胞。参照Hair等人(白血病研究(LeukemiaResearch)20：1，1996)的方法由转染细胞收获蛋白质。如Towbin等人(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76：4350，1979)所述，进行天然RLMP的Western印渍分析。实施例16.由人PCR产物衍生的大鼠LMP独特区(RLMPU)的合成
根据大鼠LMP-1 cDNA序列，合成了正向和反向PCR引物(SEQ ID NO：15和16)，并通过PCR由大鼠LMP-1 cDNA扩增了223bp的独特序列。用相同PCR引物由人MG63骨肉瘤细胞cDNA分离了相似PCR产物。
由在T-75烧瓶中培养的MG63骨肉瘤细胞收获RNA。吸去培养物上清液，用3.0ml GIT溶液覆盖烧瓶，旋涡摇动5-10秒钟，并将获得的溶液转移至1.5ml Eppendorf管(5管，每管0.6ml)。通过标准方法，参阅例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第7章第19页，冷泉港实验室出版社，1989和Boden等人，内分泌学(Endocrinology)138：2820-2828，1997，略微改动，纯化RNA。简单的说，向0.6ml样品中加入60l 2.0M醋酸钠(pH4.0)、550l水饱和酚、和150l氯仿∶异戊醇(49∶1)。加入这些试剂后，将样品旋涡震荡，于4℃以10000xg离心20分钟，并将水相转移至新管。加入600l异丙醇，并将RNA于-20℃沉淀过夜。将样品以10000xg离心20分钟，并轻轻吸去上清液。将沉淀重悬于400l经DEPC处理的水，用酚∶氯仿(1∶1)抽提1次，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，并在40l 3.0M醋酸钠(pH5.2)和1.0ml无水乙醇中于-20℃沉淀过夜。沉淀后，将样品以10000xg离心20分钟，用70％乙醇清洗1次，空气干燥5-10分钟，并重悬于20μl经DEPC处理的水。由光密度计算RNA浓度。
将溶于总体积10.5μl DEPC-H2O的5g总RNA于65℃加热5分钟，然后加到装有4l 5x MMLV-RT缓冲液、2l dNTP、2l dT17引物(10pmol/ml)、0.5l RNA抑制剂(40U/ml)、和1l MMLV-RT(200U/l)的管中。将反应于37℃温育1小时。然后通过于95℃温育5分钟灭活MMLV-RT。加入80l水稀释样品。
使用标准方法学(总体积50l)，取5l逆转录样品进行聚合酶链式反应(Boden等人，内分泌学(Endocrinology)138：2820-2828，1997；Ausubel等人，“通过聚合酶链式反应对稀有DNA的定量”，在《分子生物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，第15.31-1章，Wiley&Sons，Trenton，NJ，1990)。简单的说，将样品加到装有水和适量PCR缓冲液(25mM MgCl2、dNTP、正向和反向引物(用于PLMPU；SEQID NO：15和16))、32P-dCTP、和DNA聚合酶的管中。设计将引物进行22轮一致循环用于检测放射性条带和33轮循环用于扩增PCR产物作为筛选探针(94℃，30”；58℃，30”；72℃，20”)。
对琼脂糖凝胶纯化的MG63骨肉瘤衍生PCR产物测序获得的序列与RLMPU PCR产物的同源性超过95％。该序列命名为HLMP独特区(HLMPU；SEQID NO：6)。实施例17.逆转录酶衍生的MG63 cDNA的筛选
如实施例7所述，通过使用特异引物对(SEQ ID NO：16和17)的PCR进行筛选。将717bp MG63 PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化并用指定引物(SEQID NO：12、15、16、17、18、27、和28)进行测序。序列在两个方向上最少确认2次。将MG63序列相互进行比对，然后与全长大鼠LMP cDNA序列进行比对，以获得部分人LMP cDNA序列(SEQ ID NO：7)。实施例18.人心脏cDNA文库的筛选
根据Northern印渍实验，确定了LMP-1在几种不同组织(包括人心肌)中的表达水平不同。因此检查了人心脏cDNA文库。将文库以5×104pfu/ml涂布在琼脂平板(LB底层琼脂)上，并将平板于37℃温育过夜。将滤膜覆盖平板2分钟。然后，将滤膜变性，漂洗，干燥，UV交联，并在预杂交缓冲液(2x PIPES[pH6.5]/5％甲酰胺/1％ SDS/100g/ml变性鲑鱼精DNA)中于42℃温育2小时。加入223bp放射性标记LMP独特区探针(32P，随机引物标记；SEQ ID NO：6)并于42℃杂交18小时。杂交后，将滤膜用1x SSC/0.1％ SDS于室温清洗10分钟1次，用0.1x SSC/0.1％ SDS于55℃清洗15分钟3次。参照制造商的方案(Stratagene，La Jolla，CA)，以λ噬菌粒的形式挽救经放射自显影鉴定双重阳性且经噬斑纯化的心脏文库克隆。
阳性克隆的限制性消化产生不同大小的cDNA插入片段。选择长度超过600bp的插入片段用于作为初始的测序筛选。通过实施例11所述标准方法对这些插入片段进行测序。
还使用对应于SEQ ID NO：11-14、16、和27的引物对一个克隆(7号)进行自动化测序分析。通过这些方法获得的序列通常具有97-100％的同源性。7号克隆(来自心脏文库的部分人LMP-1 cDNA；SEQ ID NO：8)所含序列与翻译区中大鼠LMP cDNA序列的同源性超过87％。实施例19.全长人LMP-1 cDNA的确定
将MG63人骨肉瘤细胞cDNA序列和人心脏cDNA 7号克隆序列的重叠区用于比对这两种序列并衍生1644bp完整人cDNA序列。将NALIGN(PCGENE软件包中的一个程序)用于比对这两种序列。两种序列的重叠区构成完全同源的大约360bp，除了一处单一核苷酸替代，MG63 cDNA(SEQ ID NO：7)第672位核苷酸是“G”，而7号克隆(SEQ ID NO：8)在相应的第516位核苷酸是“A”。
使用SEQIN(PCGENE的另一种子程序)，用MG63骨肉瘤cDNA细胞的“G”替代，连接比对的两种序列。SEQ ID NO：9显示了获得的序列。使用NALIGN实现新的人衍生序列与大鼠LMP-1 cDNA的比对。全长人LMP-1 cDNA序列(SEQ ID NO：9)与大鼠LMP-1 cDNA序列的翻译部分具有87.3％的同源性。实施例20.人LMP-1氨基酸序列的确定
用PCGENE子程序TRANSL确定了人LMP-1的推定氨基酸序列。SEQ IDNO：9中的开放读码框编码457个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：10)。使用PCGENG子程序Palign发现人LMP-1氨基酸序列与大鼠LMP-1氨基酸序列具有94.1％的同源性。实施例21.人LMP cDNA 5’远端非翻译区的测定
通过MG63总RNA的嵌套RT-PCR，使用5’cDNA末端快速扩增(5’RACE)方案，扩增了MG63 5’cDNA。该方法包括使用3’末端含两处简并核苷酸的oligo(dT)锚定引物合成cDNA第一条链(Chenchik等人，克隆技术(CLONTECHniques)X：5，1995；Borson等人，PC方法及应用(PC MethodsApplic.)2：144，1993)。参照Gubler等人(基因(Gene)25：263，1983)的方法，使用大肠杆菌DNA聚合酶I、RNA酶H、和大肠杆菌DNA连接酶的混和物合成第二条链。用T4 DNA聚合酶产生平端后，将双链cDNA连接至片段(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’)
(SEQ ID NO：19)。在进行RACE之前，将连接了衔接头的cDNA稀释至适用于Marathon RACE反应的浓度(1∶50)。然后可以特异克隆连接了衔接头的双链cDNA。
使用衔接头特异寡核苷酸AP1
5’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(AP1)(SEQ.ID NO：20)
作为有义引物和实施例16中所述来自独特区(HLMPU)的基因特异引物(GSP)，进行第一轮PCR。使用嵌套引物对GSP1-HLMPU(反义/反向引物)(SEQ ID NO：23)和GSP2-HLMPUF(SEQ ID NO：24)(参阅实施例16；有义/正向引物)进行第二轮PCR。使用商品化试剂盒高级cDNA PCR核心试剂盒(Clone Tech Laboratories公司，Palo Alto，CA)，采用抗体介导(其它方面是标准的)的热启动方案进行PCR。用于MG63 cDNA的PCR条件包括起始热启动变性(94℃，60sec)，随后是94℃，30sec；60℃，30sec；68℃，4min；30轮循环。第一轮PCR产物的长度为大约750bp，而嵌套PCR产物为大约230bp。将第一轮PCR产物克隆到线性化载体pCR2.1中(3.9kb)。使用M13正向和反向引物(SEQ ID NO：11和12)从两个方向对插入片段进行测序。实施例22.含5’远端UTR的全长人LMP-1 cDNA的确定
比对重叠的MG63人骨肉瘤细胞cDNA 5’UTR序列(SEQ ID NO：21)、MG63 717bp序列(实施例17；SEQ ID NO：8)、和人心脏cDNA 7号克隆序列(实施例18)以衍生新的1704bp人cDNA序列(SEQ ID NO：22)。使用NALIGN(PCGENE和Omiga 1.0二者；Intelligenetics)实现比对。重叠序列构成具有100％同源性的几乎完整717bp区(实施例17)。使用SEQIN实现比对序列的连接。实施例23.LIM蛋白表达载体的构建
使用实施例17和18所述序列构建pHIS-5ATG LMP-1s表达载体。用ClaI和EcoRV消化717bp克隆(实施例17；SEQ ID NO：7)。凝胶纯化小片段(～250bp)。用ClaI和XbaI消化7号克隆(实施例18；SEQ ID NO：8)，并凝胶纯化1400bp片段。连接分离的～250bp和1400bp限制性片段以形成～1650bp片段。
7号克隆中的单一核苷酸替代(相对于717bp PCR序列和原始大鼠序列)在翻译的第672位碱基对产生终止密码子，由此编码截短(短)型蛋白质，称为LMP-1s。这就是用于表达载体的构建物(SEQ ID NO：32)。通过比对SEQ ID NO：32与5’RACE序列(SEQ ID NO：21)产生含5’UTR的全长cDNA序列(SEQ ID NO：33)。然后推导LMP-1s氨基酸序列(SEQ IDNO：34)是223个氨基酸的蛋白质，并通过Western印渍(如实施例15)确认了预测分子量～23.7kD。
用EcoRV和XbaI消化pHis-ATG载体(InVitrogen，Carlsbad，CA)。回收载体，然后将1650bp限制性片段连接到线性化pHis-ATG中。克隆并扩增连接产物。通过标准方法纯化pHis-ATG-LMP-1s表达载体，也称为含插入片段HLMP-1s的pHIS-A。实施例24.在体外用LMP表达载体诱导骨节形成和矿化
参照实施例1，分离大鼠颅盖细胞并培养成传代培养物。如实施例1所述，用糖皮质激素(GC)刺激培养物或不进行刺激。参照实施例25，使用修改后的Superfect试剂(Qiagen，Valencia，CA)转染方案，每个孔用3g各种载体转染大鼠颅盖成骨细胞传代培养物。
如实施例3所述，通过Von Kossa染色使矿化骨节显影。人LMP-1s基因产物过度表达在体外本身即可诱导骨节形成(～203骨节/孔)。骨节水平是由GC阳性对照诱导(～412骨节/孔)的大约50％。其它阳性对照包括pHisA-LMP-Rat表达载体(～152骨节/孔)和pCMV2/LMP-Rat-Fwd表达载体(～206骨节/孔)，而阴性对照包括pCMV2/LMP-Rat-Rev。表达载体(～2骨节/孔)和未处理(UT)板(～4骨节/孔)。这些数据证明人cDNA的骨诱导效果至少与大鼠cDNA相同。这种效果低于GC刺激的观察结果，最有可能是因为表达载体没有达到最适剂量。实施例25.LMP在体外和在体内诱导细胞分化
通过用NotI和ApaI于37℃消化过夜，由克隆10-4(参阅实施例12)切下大鼠LMP cDNA。用相同的限制性酶消化载体pCMV2 MCS(InVitrogen，Carlsbad，CA)。将来自克隆10-4的线性cDNA片段和pCMV2凝胶纯化，提取，并用T4连接酶连接。将连接的DNA凝胶纯化，提取，并转化大肠杆菌JM109细胞进行扩增。挑取阳性琼脂菌落，用NotI和ApaI消化，并通过凝胶电泳检查限制性消化产物。制备阳性克隆的原种培养物。
以类似方式制备反向载体，除了所用限制性酶是XbaI和HindIII。因为使用这些限制性酶，所以将来自克隆10-4的LMP cDNA片段以反向(即不可翻译地)插入pRc/CMV2。产生的重组载体命名为pCMV2/RLMP。
将适当体积的pCMV10-4(最佳终浓度是60nM[3g]；对于这个实验，优选终浓度范围0-600nM/孔[0-30g/孔])重悬于Minimal Eagle Media(MEM)至终体积450l，并旋涡震荡10秒钟。加入Superfect(7.5l/m1终溶液)，将溶液旋涡震荡10秒钟，然后于室温温育10分钟。温育后，加入添加10％ FBS的MEM(1ml/孔；6ml/板)，并用移液器混和。
然后迅速将获得的溶液加到(1ml/孔)清洗后的ROB培养物上。将培养物于37℃在含5％ CO2的潮湿空气中温育2小时。然后，用无菌PBS轻轻清洗细胞1次，并加入适当的标准温育培养基。
结果在用pCMV10-4诱导的所有大鼠细胞培养物中都出现了显著的骨节形成。例如，pCMV10-4转染细胞产生429骨节/孔。暴露于Trm的阳性对照培养物产生460骨节/孔。相反，不接受处理的阴性对照产生1骨节/孔。相似的，当用pCMV10-4(反向)转染培养物时，没有观察到骨节。
为了证明体内从头骨形成，由4-5周龄正常大鼠(rnu/+；隐性无胸腺状况是杂合的)的后肢吸取骨髓。将吸取的骨髓细胞用αMEM清洗，离心，并通过将沉淀重悬于0.83％NH4Cl/10mM Tris(pH7.4)来裂解RBC。用MEM清洗剩余骨髓细胞3次，每3×106个细胞用9g pCMV-LMP-1s(正向或反向)转染2小时。然后用MEM清洗转染细胞2次，并以浓度3×107细胞/ml重悬。
用无菌移液器将细胞悬浮液(100l)加到无菌2×5mm I型牛胶原盘(Sulzer Orthopaedics，Wheat Ridge，CO)上。通过手术将牛胶原盘移植至4-5周龄无胸腺大鼠(rnu/rnu)的头、胸、腹、或背脊的皮下。于第3-4周处死大鼠，通过手术切下牛胶原盘或外科手术区域，并在70％乙醇中固定。通过放射显影法分析固定标本，并对用Goldner Trichrome染色的5m厚切片进行未脱钙组织学检查。还使用失活(胍提取)脱矿骨基质(Osteotech，Shrewsbury，NJ)取代胶原盘进行实验。
放射显影揭示了高水平的矿化骨形成，与含LMP-1s转染骨髓细胞的原始胶原盘的形式是一致的。在阴性对照(用反向LMP-1s cDNA(不编码翻译蛋白质)转染的细胞)中没有观察到矿化骨形成，而对载体的吸收显得很好。
组织学揭示了在LMP-1s转染植入物中沿成骨细胞的新骨小梁。随着阴性对照中的载体部分再吸收没有看到骨。
进一步实验，即在无胸腺大鼠腰椎和胸椎之间变换位点加入18套(9个阴性对照pCMV-LMP-REV和9个实验性pCMV-LMP-1s)植入物，其放射显影证明9个阴性对照移植中没有一个在椎骨之间显示骨形成(脊骨融合)。所有9个经pCMV-LMP-1s处理的植入物都在椎骨之间显示固相骨融合。实施例26.由实施例2和3中演示的序列合成pHIS-5’ATG LMP-1s表达载体
用ClaI和EcoRV(New England Biologicals，city，MA)消化717bp克隆(实施例17)。凝胶纯化小片段(～250bp)。用ClaI和XbaI消化7号克隆(实施例18)。凝胶纯化来自该消化反应的1400bp片段。通过标准方法连接分离的～250bp和1400bp cDNA片段以形成～1650bp片段。用EcoRV和XbaI消化pHis-A载体(InVitrogen)。回收线性化载体，并连接嵌合的1650bp cDNA片段。通过标准方法克隆并扩增连接产物，并如先前所述将pHis-A-5’ATG LMP-1s表达载体(也称为含插入片段HLMP-1s的载体pHis-A)保藏于ATCC。实施例27.在体外用pHis-5’ATG LMP-1s表达载体诱导骨节形成和矿化
参照实施例1，分离大鼠颅盖细胞并培养成传代培养物。参照实施例1，用糖皮质激素(GC)刺激培养物或不进行刺激。参照实施例25，每个孔用3g重组pHis-A载体DNA转染培养物。参照实施例3，通过Von Kossa染色使矿化骨节显影。
人LMP-1s基因产物过度表达在体外可单独(即不用GC刺激)诱导显著的骨节形成(～203骨节/孔)。这是由暴露于GC阳性对照的细胞产生的骨节数量(～412骨节/孔)的大约50％。由转染了pHisA-LMP-Rat表达载体(～152骨节/孔)和pCMV2/LMP-Rat-Fwd(～206骨节/孔)的培养物获得相似结果。相反，阴性对照pCMV2/LMP-Rat-Rev产生～2骨节/孔，而在未处理板中看到～4骨节/孔。这些数据证明，在这种模型系统中，人LMP-1 cDNA的骨诱导效果至少与大鼠LMP-1 cDNA相同。这次实验的效果低于GC刺激的效果，但是是可比的。实施例28. LMP诱导可溶性骨诱导因子的分泌
如实施例24所述RLMP-1或HLMP-1s在大鼠颅盖成骨细胞培养物中的过度表达导致骨节形成显著多于阴性对照。为了研究LIM矿化蛋白的作用机制，在不同时间点收获条件培养基，浓缩10倍，过滤除菌，用含新鲜血清的培养基稀释至最初浓度，并施加于未转染细胞4天。
在第4天由RLMP-1或HLMP-1s转染细胞收获的条件培养基诱导骨节形成的效果与在转染细胞中直接过度表达RLMP-1大致一样有效。来自反向RLMP-1或HLMP-1s转染细胞的条件培养基对骨节形成没有明显效果。在第4天之前由LMP-1转染培养物收获的条件培养基同样不诱导骨节形成。这些资料说明LMP-1的表达引起可溶性因子的合成和/或分泌，而在转染后4天以内这种可溶性因子在培养基中未达到有效量。
既然rLMP-1的过度表达导致骨诱导因子分泌进入培养基，那么就用Western印渍分析来确定培养基中是否存在LMP-1蛋白。使用对LMP-1(QDPDEE)特异的抗体来评价rLMP-1蛋白的存在，并通过传统方法进行检测。只在培养物的细胞层中发现LMP-1蛋白，而培养基中没有。
通过标准的25％和100％硫酸铵沉淀及随后的DE-52阴离子交换分批层析法(100mM或500mM NaCl)实现骨诱导性可溶性因子的部分纯化。在高硫酸铵、高NaCl部分中观察到所有活性。这种定位与单一因子负责调理培养基的可能性是一致的。实施例29.由低剂量腺病毒介导的腰椎脊骨融合(lumbar spine Fusion)中的基因疗法
该研究确定了使用腺病毒投递LMP-1 cDNA(SEQ ID NO：2)从而在正常即免疫活性兔中促进脊骨融合的最佳剂量。
使用Adeno-QuestTM试剂盒(Quantum Biotechnologies公司，Montreal)，用由CMV启动子启动的LMP-1 cDNA(SEQ ID NO：2)构建了复制缺陷型人重组腺病毒。使用含β-半乳糖苷酶基因的商品化重组腺病毒(Quantum Biotechnologies公司，Montreal)作为对照。
最初，以感染复数(“MOI”)0.025、0.25、2.5、或25噬斑形成单位(pfu)/细胞进行60分钟病毒转导，进行体外剂量应答实验以确定腺病毒投递的LMP-1(“AdV-LMP-1”)在大鼠颅盖成骨细胞培养物中诱导骨分化的最佳浓度。通过7天暴露于109M糖皮质激素(“GC”)分化阳性对照培养物。剩下阴性对照不处理。在第14天，将培养物von Kossa染色后，对矿化骨节数目计数，并通过放射性免疫测定法测量分泌到培养基中的骨钙蛋白水平(pmol/ml)(平均值±SEM)。
表1显示了实验结果。在未处理的阴性对照培养物中基本上没有形成自发骨节。数据显示等于0.25pfu/细胞的MOI对于骨诱导骨节是最有效的，达到的水平与阳性对照(GC)可比。更低或更高的腺病毒剂量不如它有效。
                       表1
    结果     AdV-LMP-1剂量(MOI)阴性对照       GC        0.025        0.25        2.5       25
    骨节骨钙蛋白  0.5±0.2    188±35    79.8±13    145.1±13  26.4±15   87.6±21.0±0.1    57.8±9    28.6±11    22.8±1    18.3±3    26.0±2
然后进行体内实验以确定最佳体外剂量能否在骨骼成熟的新西兰白兔中促进横突间脊骨融合。麻醉9只兔子，并使用18号针头经髁间节由股骨末梢吸取3cc骨髓。然后分离血沉棕黄层，用AdV-LMP-1转导10分钟，并将细胞送回手术室用于灌输。进行单一水平后侧腰椎关节固定术，并剥除横突皮质、插入含8-15×106个AdV-LMP-1(MOI＝0.4)或AdV-BGal(MOI＝0.4)转导的自体带核血沉棕黄层细胞的载体(兔失活骨基质或胶原海绵)。5周后对兔施行安乐死，并通过人工触摸、平面X射线、CT扫描、和未脱钙组织学评价脊骨融合。
在所有9只兔子中接受AdV-LMP-1的脊骨融合位点都诱导固相、连续的脊骨融合块。相反，接受AdV-BGal或较低剂量AdV-LMP-1(MOI＝0.04)的位点产生少许骨或没有，并导致脊骨融合速率与仅用载体可比(＜40％)。这些结果与通过人工触摸、CT扫描、和组织学进行的评价是一致的。但是，平面射线显影有时过高评价存在的骨量，尤其是在对照位点。使用两种测试的载体材料的LMP-1 cDNA投递和骨诱导都是成功的。没有证据表明存在针对腺病毒载体的全身或局部免疫应答。
这些资料证明在先前验证很有前途的兔脊骨融合模型有一致骨诱导。而且，与需要过夜转导或在培养物中扩增细胞数周的其它方法相比，使用自体骨髓细胞和手术间离体基因转导(10分钟)的方案在临床上更加可行。另外，重组腺病毒最有效剂量(MOI＝0.25)大大低于在其它基因疗法应用中报导的剂量(MOI＝40-500)。我们认为这要归功于LMP-1是细胞内信号分子且具有有力的信号放大级联的事实。此外，在细胞培养物中诱导骨的相同浓度AdV-LMP-1在体内也有效的观察结果还令人惊讶的显示，而其它生长因子在由细胞培养物转变成动物实验时通常需要增加剂量。一并考虑，这些观察结果指出，使用腺病毒投递LMP-1 cDNA的局部基因疗法是可能的，而需要的低剂量有可能使针对腺病毒载体的免疫应答的消极影响最小化。实施例30.外周静脉血具核细胞(血沉棕黄层)用于生成骨的LMP-1 cDNA基因疗法的应用
如上所述(实施例29)在4只兔子中进行了脊骨融合手术，除了转导细胞是来自静脉血而非骨髓的血沉棕黄层。用Adeno-LMP或pHIS-LMP质粒转染这些细胞，获得了与使用骨髓细胞同样成功的结果。将普通静脉血细胞用于基因投递的这一发现使基因疗法在临床上更加可行，因为它避免了痛苦的常规麻醉骨髓采集并由相同体积起始材料产生多2倍的细胞。实施例31.人LMP-1剪接变体的分离
内含子/外显子mRNA转录本剪接变体是信号转导和细胞/组织发育中较常见的调控机制。多种基因的剪接变体显示可改变蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、和蛋白质-底物相互作用。剪接变体还可以控制基因表达的组织特异性，从而在不同的组织中表达不同的形式(因此发挥不同功能)。剪接变体是细胞中的常见调控现象。LMP剪接变体有可能在其它组织中产生效果，诸如神经再生、肌肉再生、或其它组织发育。
为了对人心脏cDNA文库筛选HLMP-1序列的剪接变体，制备了对应于部分SEQ ID NO：22的PCR引物对。使用标准技术合成的正向PCR引物对应于SEQ ID NO：22的第35-54位核苷酸，序列如下：
5’GAGCCGGCATCATGGATTCC 3’(SEQ ID NO：35)
反向PCR引物与SEQ ID NO：22的第820-839位核苷酸反向互补，序列如下：
5’GCTGCCTGCACAATGGAGGT 3’(SEQ ID NO：36)
通过标准技术，将正向和反向PCR引物用于对人心脏cDNA(ClonTech，目录编号7404-1)筛选序列与HLMP-1相似的序列，循环方案如下：94℃，30”；64℃，30”；72℃，60”；30轮循环，随后于72℃温育10分钟。将扩增的cDNA序列凝胶纯化，并提交给Emory DNA Sequence Core Facility进行测序。使用标准技术对克隆测序，并用PCGENE(Intelligenetics；程序SEQUIN和NALIGN)检查序列，以测定与SEQ ID NO：22的同源性。然后用Intelligenetics的程序TRANSL将相对于SEQ ID NO：22具有推定的其它剪接位点的两种同源核苷酸序列翻译成相应的蛋白质产物。
这两种新的人cDNA序列之一(SEQ ID NO：37)包含1456bp：
    10         20         30         40         50          60CGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG
    70         80         90        100        110        120GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT
   130        140        150        160        170        180GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC
   190        200        210        220        230        240GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA
   250        260        270        280        290        300GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG
   310        320     *  330        340  *     350        360CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAGGTGCAG ACCCCTGACA AACAGCCGCT CCGACCGCTG
   370        380        390        400        410        420GTCCCAGATG CCAGCAAGCA GCGGCTGATG GAGAACACAG AGGACTGGCG GCCGCGGCCG
   430        440        450        460        470        480GGGACAGGCC AGTCGCGTTC CTTCCGCATC CTTGCCCACC TCACAGGCAC CGAGTTCATG
   490        500        510        520        530        540CAAGACCCGG ATGAGGAGCA CCTGAAGAAA TCAAGCCAGG TGCCCAGGAC AGAAGCCCCA
   550        560        570        580        590        600GCCCCAGCCT CATCTACACC CCAGGAGCCC TGGCCTGGCC CTACCGCCCC CAGCCCTACC
   610        620        630        640        650        660AGCCGCCCGC CCTGGGCTGT GGACCCTGCG TTTGCCGAGC GCTATGCCCC GGACAAAACG
   670        680        690        700        710        720AGCACAGTGC TGACCCGGCA CAGCCAGCCG GCCACGCCCA CGCCGCTGCA GAGCCGCACC
   730        740        750        760        770        780TCCATTGTGC AGGCAGCTGC CGGAGGGGTG CCAGGAGGGG GCAGCAACAA CGGCAAGACT
   790        800        810        820        830        840CCCGTGTGTC ACCAGTGCCA CAAGGTCATC CGGGGCCGCT ACCTGGTGGC GTTGGGCCAC
   850        860        870        880        890        900GCGTACCACC CGGAGGAGTT TGTGTGTAGC CAGTGTGGGA AGGTCCTGGA AGAGGGTGGC
   910        920        930        940        950        960TTCTTTGAGG AGAAGGGCGC CATCTTCTGC CCACCATGCT ATGACGTGCG CTATGCACCC
   970        980        990       1000       1010       1020AGCTGTGCCA AGTGCAAGAA GAAGATTACA GGCGAGATCA TGCACGCCCT GAAGATGACC
  1030       1040       1050       1060       1070       1080TGGCACGTGC ACTGCTTTAC CTGTGCTGCC TGCAAGACGC CCATCCGGAA CAGGGCCTTC
  1090       1100       1110       1120       1130       1140TACATGGAGG AGGGCGTGCC CTATTGCGAG CGAGACTATG AGAAGATGTT TGGCACGAAA
  1150       1160       1170       1180       1190       1200TGCCATGGCT GTGACTTCAA GATCGACGCT GGGGACCGCT TCCTGGAGGC CCTGGGCTTC
  1210       1220       1230       1240       1250       1260AGCTGGCATG ACACCTGCTT CGTCTGTGCG ATATGTCAGA TCAACCTGGA AGGAAAGACC
  1270       1280       1290       1300       1310       1320TTCTACTCCA AGAAGGACAG GCCTCTCTGC AAGAGCCATG CCTTCTCTCA TGTGTGAGCC
  1330       1340       1350       1360       1370       1380CCTTCTGCCC ACAGCTGCCG CGGTGGCCCC TAGCCTGAGG GGCCTGGAGT CGTGGCCCTG
  1390       1400       1410       1420       1430       1440CATTTCTGGG TAGGGCTGGC AATGGTTGCC TTAACCCTGG CTCCTGGCCC GAGCCTGGGC
  1450TCCCGGGCCC TGCCCA
由删除119bp片段(*之间)和插入17bp片段(下划线)引起的读码框移动导致截短的基因产物，其氨基酸序列(SEQ ID NO：38)如下：
    10        20          30         40         50         60MDSFKVVLEG PAPWGFRLQG GKDFNVPLSI SRLTPGGKAA QAGVAVGDWV LSIDGENAGS
    70         80         90        100        110        120LTHIEAQNKI RACGERLSLG LSRAQPVQNK PQKVOTPDKQ PLRPLVPDAS KQRLMENTED
   130        140        150        160        170        180WRPRPGTGQS RSFRILAHLT GTEFMQDPDE EHLKKSSQVP RTEAPAPASS TPQEPWPGPT
   190        200        210        220        230        240APSPTSRPPW AVDPAFAERY APDKTSTVLT RHSQPATPTP LQSRTSIVQA AAGGVPGGGS
   250        260        270        280        290        300NNGKTPVCHQ CHQVIRARYL VALGHAYHPE EFVCSQCGKV LEEGGFFEEK GAIFCPPCYD
   310        320        330        340        350        360VRYAPSCAKC KKKITGEIMH ALKMTWHVLC FTCAACKTPI RNRAFYMEEG VPYCERDYEK
   370        380        390        400        410        420MFGTKCQWCD FKIDAGDRFL EALGFSWHDT CFVCAICQIN LEGKTFYSKK DRPLCKSHAFSHV
这种423个氨基酸蛋白质显示与SEQ ID NO：10所示蛋白质100％同源，加粗区域序列(第94-99位)除外，它是由于上述核苷酸变化所致。
第二种新的人心脏cDNA序列(SEQ ID NO：39)包含1575bp：
    10         20         30         40         50         60CGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG
    70         80         90        100        110        120GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT
   130        140        150        160        170        180GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC
   190        200        210        220        230        240GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA
   250        260        270        280        290        300GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG
   310        320        330        340        350        360CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAGGCCTCC GCCCCCGCCG CGGACCCTCC GCGGTACACC
   370        380        390        400        410        420TTTGCACCCA GCGTCTCCCT CAACAAGACG GCCCGGCCCT TTGGGGCGCC CCCGCCCGCT
   430        440        450        460        470        480GACAGCGCCC CGCAACAGAA TGGGTGCAGA CCCCTGACAA ACAGCCGCTC CGACCGCTGG
   490        500        510        520        530        540TCCCAGATGC CAGCAAGCAG CGGCTGATGG AGAACACAGA GGACTGGCGG CCGCGGCCGG
   550        560        570        580        590        600GGACAGGCCA GTCGCGTTCC TTCCGCATCC TTGCCCACCT CACAGGCACC GAGTTCATGC
   610        620        630        640        650        660AAGACCCGGA TGAGGAGCAC CTGAAGAAAT CAAGCCAGGT GCCCAGGACA GAAGCCCCAG
   670        680        690        700        710        720CCCCAGCCTC ATCTACACCC CAGGAGCCCT GGCCTGGCCC TACCGCCCCC AGCCCTACCA
   730        740        750        760        770        780GCCGCCCGCC CTGGGCTGTG GACCCTGCGT TTGCCGAGCG CTATGCCCCG GACAAAACGA
   790        800        810        820        830        840GCACAGTGCT GACCCGGCAC AGCCAGCCGG CCACGCCCAC GCCGCTGCAG AGCCGCACCT
   850        860        870        880        890        900CCATTGTGCA GGCAGCTGCC GGAGGGGTGC CAGGAGGGGG CAGCAACAAC GGCAAGACTC
   910        920        930        940        950        960CCGTGTGTCA CCAGTGCCAC AAGGTCATCC GGGGCCGCTA CCTGGTGGCG TTGGGCCACG
   970        980        990       1000       1010       1020CGTACCACCC GGAGGAGTTT GTGTGTAGCC AGTGTGGGAA GGTCCTGGAA GAGGGTGGCT
  1030       1040       1050       1060       1070       1080TCTTTGAGGA GAAGGGCGCC ATCTTCTGCC CACCATGCTA TGACGTGCGC TATGCACCCA
  1090       1100       1110       1120       1130       1140GCTGTGCCAA GTGCAAGAAG AAGATTACAG GCGAGATCAT GCACGCCCTG AAGATGACCT
  1150       1160       1170       1180       1190       1200GGCACGTGCA CTGCTTTACC TGTGCTGCCT GCAAGACGCC CATCCGGAAC AGGGCCTTCT
  1210       1220       1230       1240       1250       1260ACATGGAGGA GGGCGTGCCC TATTGCGAGC GAGACTATGA GAAGATGTTT GGCACGAAAT
  1270       1280       1290       1300       1310       1320GCCATGGCTG TGACTTCAAG ATCGACGCTG GGGACCGCTT CCTGGAGGCC CTGGGCTTCA
  1330       1340       1350       1360       1370       1380GCTGGCATGA CACCTGCTTC GTCTGTGCGA TATGTCAGAT CAACCTGGAA GGAAAGACCT
  1390       1400       1410       1420       1430       1440TCTACTCCAA GAAGGACAGG CCTCTCTGCA AGAGCCATGC CTTCTCTCAT GTGTGAGCCC
  1450       1460       1470       1480       1490       1500CTTCTGCCCA CAGCTGCCGC GGTGGCCCCT AGCCTGAGGG GCCTGGAGTC GTGGCCCTGC
  1510       1520       1530       1540       1550       1560ATTTCTGGGT AGGGCTGGCA ATGGTTGCCT TAACCCTGGC TCCTGGCCCG AGCCTGGGCT
  1570CCCGGGCCCT GCCCA
由插入17bp片段(粗体、斜体、和下划线)引起的读码框移动导致在第565-567位(下划线)提前出现翻译终止密码子，所衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)包含153个氨基酸的，如下所示：
    10         20         30         40         50         60MDSFKVVLEG PAPWGFRLQG GKDFNVPLSI SRLTPGGKAA QAGVAVGDWV LSIDGENAGS
    70         80         90        100        110        120LTHIEAQNKI RACGERLSLG LSRAQPVQSK PQKASAPAAD PPRYTFAPSV SLNKTARPFG
   130        140        150
这种蛋白质直至第94位氨基酸显示与SEQ ID NO：10有100％同源性，此处插入核苷酸序列中所述17bp片段，导致读码框移动。蛋白质的第94-153位氨基酸与SEQ ID NO：10不同源。由于核苷酸序列中所述提前出现的.终止密码子，因此不存在SEQ ID N0：10的第154-457位氨基酸。实施例32.基因组HLMP-1核苷酸序列
申请人已经鉴定了编码HLMP-1的基因组DNA序列，包括与HLMP-1表达有关的推定调控元件。SEQ ID NO：41显示了完整基因组序列。该序列衍生自AC023788(克隆RP11-564G9)，基因组测序中心，华盛顿大学医学院，圣路易斯，MO。
HLMP-1的推定启动子区跨越SEQ ID NO：41的第2660-8733位核苷酸。该区域包含至少10个潜在糖皮质激素应答元件(“GRE”)(第6148-6153位、第6226-6231位、第6247-6252位、第6336-6341位、第6510-6515位、第6552-6557位、第6727-6732位、第6752-6757位、第7738-7743位、和第8255-8260位核苷酸)、12个针对Drosophilla decapentaplegic的Mother的Sma-2同源物(“SMAD”)潜在结合元件位点(第3569-3575位、第4552-4558位、第4582-4588位、第5226-5232位、第6228-6234位、第6649-6655位、第6725-6731位、第6930-6936位、第7379-7384位、第7738-7742位、第8073-8079位、和第8378-8384位核苷酸)、和3个TATA盒(第5910-5913位、第6932-6935位、和第7380-7383位核苷酸)。3个TATA盒、所有GRE、和8个SMAD结合元件(“SBE”)群聚于跨越SEQ ID NO：41的第5841-8733位核苷酸的区域。这些调控元件可用于例如调控编码涉及骨形成过程的蛋白质的外源核苷酸序列的表达。这将能够全身性施用涉及骨形成和修复的治疗因子或基因，以及与组织分化和发育有关的因子或基因。
除了推定调控元件以外，还鉴定了对应于编码HLMP-1的核苷酸序列的13个外显子。这些外显子跨越SEQ ID NO：41的下列核苷酸：
外显子1  第8733-8767位
外显子2  第9790-9895位
外显子3  第13635-13787位
外显子4  第13877-13907位
外显子5  第14387-14502位
外显子6  第15161-15297位
外显子7  第15401-15437位
外显子8  第16483-16545位
外显子9  第16689-16923位
外显子10 第18068-18248位
外显子11 第22117-22240位
外显子12 第22323-22440位
外显子13 第22575-22911位
在HLMP-2中，存在另一个外显子(外显子5A)，跨越第14887-14904位。
本文引用的所有发表物和专利完整收入作为参考。
上文详述以及作为例示提供的实施例传授了本发明的原理，本领域技术人员通过阅读本公开书应当领会，可以在形式和细节上进行多种变化而不偏离本发明的真实范围。
                     序列表<110> Boden M.D.，Scott D
  Hair Ph.D.，Gregory A<120> LIM矿化蛋白剪接变体<130> 剪接变体LMP<140> 6148.0222-00304<141> 2000-04-28<150> 60/132,021<151> 1999-04-30<160> 42<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 457<212> PRT<213> 褐家鼠<400> 1Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1               5                  10                  15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
         20                  25                  30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
     35                  40                  45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
 50                  55                  60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65                  70                  75                  80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Leu Thr
             85                  90                  95Pro Pro Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Ala Ser Leu
        100                 105                 110Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Thr Asp Ser Ala
    115                 120                 125Leu Ser Gln Asn Gly Gln Leu Leu Arg Gln Leu Val Pro Asp Ala Ser
130                 135                 140Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly145                 150                 155                 160Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr
            165                 170                 175Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu Phe Met Lys Lys Ser Ser Gln
        180                 185                 190Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Thr Ile Pro Gln Glu
    195                 200                 205Ser Trp Pro Gly Pro Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp
210                 215                 220Ala Val Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser225                 230                 235                 240Thr Val Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln
            245                 250                 255Asn Arg Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly
        260                 265                 270Gly Ser Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Lys Ile
    275                 280                 285Ile Arg Gly Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu
290                 295                 300Glu Phe Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe305                 310                 315                 320Phe Glu Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Ser Cys Tyr Asp Val Arg
            325                 330                 335Tyr Ala Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile
        340                 345                 350Met His Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Pro Cys Phe Thr Cys Ala
    355                 360                 365Ala Cys Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly
370                 375                 380Ala Pro Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys385                 390                 395                 400Arg Gly Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala
            405                 410                 415Leu Gly Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln
        420                 425                 430Ile Asn Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Lys Pro Leu
    435                 440                 445Cys Lys Ser His Ala Phe Ser His Val
450                 455<210> 2<211> 1696<212> DNA<213> 褐家鼠<400> 2gcacgaggat cccagcgcgg ctcctggagg ccgccaggca gccgcccagc cgggcattca 60ggagcaggta ccatggattc cttcaaggta gtgctggagg gacctgcccc ttggggcttc 120cgtctgcaag ggggcaagga cttcaacgtg cccctctcca tctctcggct cactcctgga 180ggcaaggccg cacaggccgg tgtggccgtg ggagactggg tactgagtat cgacggtgag 240aacgccggaa gcctcacaca cattgaagcc cagaacaaga tccgtgcctg tggggagcgc 300ctcagcctgg gtcttagcag agcccagcct gctcagagca aaccacagaa ggccctgacc 360cctcccgccg accccccgag gtacactttt gcaccaagcg cctccctcaa caagacggcc 420cggcccttcg gggcaccccc acctactgac agcgccctgt cgcagaatgg acagctgctc 480agacagctgg tccctgatgc cagcaagcag cggctgatgg agaatactga agactggcgc 540ccgcggccag ggacaggcca gtcccgttcc ttccgcatcc ttgctcacct cacgggcaca 600gagttcatgc aagacccgga tgaggaattc atgaagaagt caagccaggt gcccaggaca 660gaagccccag ccccagcctc aaccataccc caggaatcct ggcctggccc caccaccccc 720agccccacca gccgcccacc ctgggccgta gatcctgcat ttgctgagcg ctatgcccca 780gacaaaacca gcacagtgct gacccgacac agccagccag ccacacctac gcctctgcag 840aaccgcacct ccatagttca ggctgcagct ggagggggca caggaggagg cagcaacaat 900ggcaagacgc ctgtatgcca ccagtgccac aagatcatcc gcggccgata cctggtagca 960ctgggccacg cgtaccatcc tgaggaattt gtgtgcagcc agtgtgggaa ggtcctggaa 1020gagggtggct tcttcgagga gaagggagct atcttttgcc cctcctgcta tgatgtgcgc 1080tatgcaccca gctgtgccaa atgcaagaag aagatcactg gagagatcat gcatgcgctg 1140aagatgacct ggcatgttcc ctgcttcacc tgtgcagcct gcaaaacccc tatccgcaac 1200agggctttct acatggagga gggggctccc tactgcgagc gagattacga gaagatgttt 1260ggcacaaagt gtcgcggctg tgacttcaag atcgatgccg gggaccgttt cctggaagcc 1320ctgggtttca gctggcatga tacgtgtttt gtttgcgcaa tatgtcaaat caacttggaa 1380ggaaagacct tctactccaa gaaggacaag cccctgtgca agagccatgc cttttcccac 1440gtatgagcac ctcctcacac tactgccacc ctactctgcc agaagggtga taaaatgaga 1500gagctctctc tccctcgacc tttctgggtg gggctggcag ccattgtcct agccttggct 1560cctggccaga tcctggggct ccctcctcac agtccccttt cccacacttc ctccaccacc 1620accaccgtca ctcacaggtg ctagcctcct agccccagtt cactctggtg tcacaataaa 1680cctgtatgta gctgtg                                                 1696<210> 3<211> 260<212> DNA<213> 褐家鼠<400> 3ttctacatgg aggagggggc tccctactgc gagcgagatt acgagaagat gtttggcaca 60aagtgtcgcg gctgtgactt caagatcgat gccggggacc gtttcctgga agccctgggt 120ttcagctggc atgatacgtg ttttgtttgc gcaatatgtc aaatcaactt ggaaggaaag 180accttctact ccaagaagga caagcccctg tgcaagagcc atgccttttc ccacgtatga 240gcacctcctc acactactgc                                             260<210> 4<211> 16<212> DNA<213> MMLV<400> 4aagctttttt tttttg                                                      16<210> 5<211> 13<212> DNA<213> MMLV<400> 5aagcttggct atg                                                             13<210> 6<211> 223<212> DNA<213> 人类<400> 6atccttgctc acctcacggg caccgagttc atgcaagacc cggatgagga gcacctgaag 60aaatcaagcc aggtgcccag gacagaagcc ccagccccag cctcatctac accccaggag 120ccctggcctg gccctaccgc ccccagccct accagccgcc cgccctgggc tgtggaccct 180gcgtttgccg agcgctatgc cccagacaaa accagcacag tgc                   223<210> 7<211> 717<212> DNA<213> 人类<400> 7atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 60ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg 120caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 180ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 240ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac 300cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg 360gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc 420ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 480acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa 540gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 600ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 660cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgccccgga caaaacg    717<210> 8<211> 1488<212> DNA<213> 人类<400> 8atcgatggcg agaatgcggg tagcctcaca cacatcgaag ctcagaacaa gatccgggcc 60tgcggggagc gcctcagcct gggcctcagc agggcccagc cggttcagag caaaccgcag 120aaggcctccg cccccgccgc ggaccctccg cggtacacct ttgcacccag cgtctccctc 180aacaagacgg cccggccctt tggggcgccc ccgcccgctg acagcgcccc gcaacagaat 240ggacagccgc tccgaccgct ggtcccagat gccagcaagc agcggctgat ggagaacaca 300gaggactggc ggccgcggcc ggggacaggc cagtcgcgtt ccttccgcat ccttgcccac 360ctcacaggca ccgagttcat gcaagacccg gatgaggagc acctgaagaa atcaagccag 420gtgcccagga cagaagcccc agccccagcc tcatctacac cccaggagcc ctggcctggc 480cctaccgccc ccagccctac cagccgcccg ccctgagctg tggaccctgc gtttgccgag 540cgctatgccc cggacaaaac gagcacagtg ctgacccggc acagccagcc ggccacgccc 600acgccgctgc agagccgcac ctccattgtg caggcagctg ccggaggggt gccaggaggg 660ggcagcaaca acggcaagac tcccgtgtgt caccagtgcc acaaggtcat ccggggccgc 720tacctggtgg cgttgggcca cgcgtaccac ccggaggagt ttgtgtgtag ccagtgtggg 780aaggtcctgg aagagggtgg cttctttgag gagaagggcg ccatcttctg cccaccatgc 840tatgacgtgc gctatgcacc cagctgtgcc aagtgcaaga agaagattac aggcgagatc 900atgcacgccc tgaagatgac ctggcacgtg cactgcttta cctgtgctgc ctgcaagacg 960cccatccgga acagggcctt ctacatggag gagggcgtgc cctattgcga gcgagactat 1020gagaagatgt ttggcacgaa atgccatggc tgtgacttca agatcgacgc tggggaccgc 1080ttcctggagg ccctgggctt cagctggcat gacacctgct tcgtctgtgc gatatgtcag 1140atcaacctgg aaggaaagac cttctactcc aagaaggaca ggcctctctg caagagccat 1200gccttctctc atgtgtgagc cccttctgcc cacagctgcc gcggtggccc ctagcctgag 1260gggcctggag tcgtggccct gcatttctgg gtagggctgg caatggttgc cttaaccctg 1320gctcctggcc cgagcctggg ctcccgggcc cctgcccacc caccttatcc tcccacccca 1380ctccctccac caccacagca caccggtgct ggccacacca gccccctttc acctccagtg 1440ccacaataaa cctgtaccca gctgaattcc aaaaaatcca aaaaaaaa              1488<210> 9<211> 1644<212> DNA<213> 人类<400> 9atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 60ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg 120caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 180ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 240ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac 300cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg 360gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc 420ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 480acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa 540gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 600ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 660cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgccccgga caaaacgagc 720acagtgctga cccggcacag ccagccggcc acgcccacgc cgctgcagag ccgcacctcc 780attgtgcagg cagctgccgg aggggtgcca ggagggggca gcaacaacgg caagactccc 840gtgtgtcacc agtgccacaa ggtcatccgg ggccgctacc tggtggcgtt gggccacgcg 900taccacccgg aggagtttgt gtgtagccag tgtgggaagg tcctggaaga gggtggcttc 960tttgaggaga agggcgccat cttctgccca ccatgctatg acgtgcgcta tgcacccagc 1020tgtgccaagt gcaagaagaa gattacaggc gagatcatgc acgccctgaa gatgacctgg 1080cacgtgcact gctttacctg tgctgcctgc aagacgccca tccggaacag ggccttctac 1140atggaggagg gcgtgcccta ttgcgagcga gactatgaga agatgtttgg cacgaaatgc 1200catggctgtg acttcaagat cgacgctggg gaccgcttcc tggaggccct gggcttcagc 1260tggcatgaca cctgcttcgt ctgtgcgata tgtcagatca acctggaagg aaagaccttc 1320tactccaaga aggacaggcc tctctgcaag agccatgcct tctctcatgt gtgagcccct 1380tctgcccaca gctgccgcgg tggcccctag cctgaggggc ctggagtcgt ggccctgcat 1440ttctgggtag ggctggcaat ggttgcctta accctggctc ctggcccgag cctgggctcc 1500cgggcccctg cccacccacc ttatcctccc accccactcc ctccaccacc acagcacacc 1560ggtgctggcc acaccagccc cctttcacct ccagtgccac aataaacctg tacccagctg 1620aattccaaaa aatccaaaaa aaaa                                        1644<210> 10<211> 457<212> PRT<213> 人类<400> 10Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1               5                  10                  15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
         20                  25                  30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
     35                  40                  45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
 50                  55                  60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65                  70                  75                  80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala
             85                  90                  95Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu
        100                 105                 110Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala
    115                 120                 125Pro Gln Gln Asn Gly Gln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser
130                 135                 140Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly145                 150                 155                 160Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr
            165                 170                 175Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln
        180                 185                 190Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu
    195                 200                 205Pro Trp Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp
210                 215                 220Ala Val Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser225                 230                 235                 240Thr Val Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln
            245                 250                 255Ser Arg Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly
        260                 265                 270Gly Ser Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Lys Val
    275                 280                 285Ile Arg Gly Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu
290                 295                 300Glu Phe Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Va1 Leu Glu Glu Gly Gly Phe305                 310                 315                 320Phe Glu Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg
            325                 330                 335Tyr Ala Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile
        340                 345                 350Met His Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val His Cys Phe Thr Cys Ala
    355                 360                 365Ala Cys Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly
370                 375                 380Val Pro Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys385                 390                 395                 400His Gly Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala
            405                 410                 415Leu Gly Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln
        420                 425                 430Ile Asn Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu
    435                 440                 445Cys Lys Ser His Ala Phe Ser His Val
450                 455<210> 11<211> 22<212> DNA<213> 褐家鼠<400> 11gccagggttt tcccagtcac ga                                           22<210> 12<211> 22<212> DNA<213><400> 12gccagggttt tcccagtcac ga                                           22<210> 13<211> 22<212> DNA<213> 人类<400> 13tcttagcaga gcccagcctg ct                              22<210> 14<211> 22<212> DNA<213> 人类<400> 14gcatgaactc tgtgcccgtg ag                              22<210> 15<211> 20<212> DNA<213> 褐家鼠<400> 15atccttgctc acctcaccggg                                20<210> 16<211> 22<212> DNA<213> 褐家鼠<400> 16gcactgtgct ggttttgtct gg                              22<210> 17<211> 23<212> DNA<213> 人类<400> 17catggattcc ttcaaggtag tgc                             23<210> 18<211> 20<212> DNA<213> 人类<400> 18gttttgtctg gggcagagcg                                 20<210> 19<211> 44<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述：用于马拉松RACE反应的衔接头<400> 19ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt           44<210> 20<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220> 人工序列的描述：对马拉松RACE衔接头特异的PCR引物<400> 20ccatcctaat acgactcact atagggc                              27<210> 21<211> 765<212> DNA<213> 人类<400> 21ccgttgtttg taaaacgacg cagagcagcg ccctggccgg gccaagcagg agccggcatc 60atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 120ggcaaggact tcaatgtgcc ctcctccatt tcccggctca cctctggggg caaggccgtg 180caggccggag tggccgtaag tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 240ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 300ctcaacaggg cccagccggt tcagaacaaa ccgcaaaagg cctccgcccc cgccgcggac 360cctccgcggt acacctttgc accaagcgtc tccctcaaca agacggcccg gcccttgggg 420gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcag cagaatggac agccgctccg accgctggtc 480ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 540acaggccagt gccgttcctt tcgcatcctt gctcacctta caggcaccga gttcatgcaa 600gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 660ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 720cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgcc                 765<210> 22<211> 1689<212> DNA<213> 人类<400> 22cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag 60gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat 120gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc 180gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa 240gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag 300ccggttcaga gcaaaccgca gaaggcctcc gcccccgccg cggaccctcc gcggtacacc 360tttgcaccca gcgtctccct caacaagacg gcccggccct ttggggcgcc cccgcccgct 420gacagcgccc cgcaacagaa tggacagccg ctccgaccgc tggtcccaga tgccagcaag 480cagcggctga tggagaacac agaggactgg cggccgcggc cggggacagg ccagtcgcgt 540tccttccgca tccttgccca cctcacaggc accgagttca tgcaagaccc ggatgaggag 600cacctgaaga aatcaagcca ggtgcccagg acagaagccc cagccccagc ctcatctaca 660ccccaggagc cctggcctgg ccctaccgcc cccagcccta ccagccgccc gccctgggct 720gtggaccctg cgtttgccga gcgctatgcc ccggacaaaa cgagcacagt gctgacccgg 780cacagccagc cggccacgcc cacgccgctg cagagccgca cctccattgt gcaggcagct 840gccggagggg tgccaggagg gggcagcaac aacggcaaga ctcccgtgtg tcaccagtgc 900cacaaggtca tccggggccg ctacctggtg gcgttgggcc acgcgtacca cccggaggag 960tttgtgtgta gccagtgtgg gaaggtcctg gaagagggtg gcttctttga ggagaagggc 1020gccatcttct gcccaccatg ctatgacgtg cgctatgcac ccagctgtgc caagtgcaag 1080aagaagatta caggcgagat catgcacgcc ctgaagatga cctggcacgt gcactgcttt 1140acctgtgctg cctgcaagac gcccatccgg aacagggcct tctacatgga ggagggcgtg 1200ccctattgcg agcgagacta tgagaagatg tttggcacga aatgccatgg ctgtgacttc 1260aagatcgacg ctggggaccg cttcctggag gccctgggct tcagctggca tgacacctgc 1320ttcgtctgtg cgatatgtca gatcaacctg gaaggaaaga ccttctactc caagaaggac 1380aggcctctct gcaagagcca tgccttctct catgtgtgag ccccttctgc ccacagctgc 1440cgcggtggcc cctagcctga ggggcctgga gtcgtggccc tgcatttctg ggtagggctg 1500gcaatggttg ccttaaccct ggctcctggc ccgagcctgg gctcccgggc ccctgcccac 1560ccaccttatc ctcccacccc actccctcca ccaccacagc acaccggtgc tggccacacc 1620agcccccttt cacctccagt gccacaataa acctgtaccc agctgaattc caaaaaatcc 1680aaaaaaaaa                                                         1689<210> 23<211> 22<212> DNA<213> 人类<400> 23gcactgtgct  cgttttgtcc gg                                  22<210> 24<211> 21<212> DNA<213> 人类<400> 24tccttgctca cctcacgggc a                                    21<210> 25<211> 30<212> DNA<213> 人类<400> 25tcctcatccg ggtcttgcat gaactcggtg                           30<210> 26<211> 28<212> DNA<213> 人类<400> 26gcccccgccc gctgacagcg ccccgcaa                             28<210> 27<211> 24<212> DNA<213> 人类<400> 27tccttgctca cctcacgggc accg                                 24<210> 28<211> 22<212> DNA<213> 人类<400> 28gtaatacgac tcactatagg gc                                   22<210> 29<211> 23<212> DNA<213> 褐家鼠<400> 29gcggctgatg gagaatactg aag                                  23<210> 30<211> 23<212> DNA<213> 褐家鼠<400> 30atcttgtggc actggtggca tac                                  23<210> 31<211> 22<212> DNA<213> 褐家鼠<400> 31tgtgtcgggt cagcactgtg ct                                   22<210> 32<211> 1620<212> DNA<213> 人类<400> 32atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 60ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg 120caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 180ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 240ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac 300cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg 360gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc 420ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 480acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa 540gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 600ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 660cgcccgccct gagctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgccccgga caaaacgagc 720acagtgctga cccggcacag ccagccggcc acgcccacgc cgctgcagag ccgcacctcc 780attgtgcagg cagctgccgg aggggtgcca ggagggggca gcaacaacgg caagactccc 840gtgtgtcacc agtgccacaa ggtcatccgg ggccgctacc tggtggcgtt gggccacgcg 900taccacccgg aggagtttgt gtgtagccag tgtgggaagg tcctggaaga gggtggcttc 960tttgaggaga agggcgccat cttctgccca ccatgctatg acgtgcgcta tgcacccagc 1020tgtgccaagt gcaagaagaa gattacaggc gagatcatgc acgccctgaa gatgacctgg 1080cacgtgcact gctttacctg tgctgcctgc aagacgccca tccggaacag ggccttctac 1140atggaggagg gcgtgcccta ttgcgagcga gactatgaga agatgtttgg cacgaaatgc 1200catggctgtg acttcaagat cgacgctggg gaccgcttcc tggaggccct gggcttcagc 1260tggcatgaca cctgcttcgt ctgtgcgata tgtcagatca acctggaagg aaagaccttc 1320tactccaaga aggacaggcc tctctgcaag agccatgcct tctctcatgt gtgagcccct 1380tctgcccaca gctgccgcgg tggcccctag cctgaggggc ctggagtcgt ggccctgcat 1440ttctgggtag ggctggcaat ggttgcctta accctggctc ctggcccgag cctgggctcc 1500cgggcccctg cccacccacc ttatcctccc accccactcc ctccaccacc acagcacacc 1560ggtgctggcc acaccagccc cctttcacct ccagtgccac aataaacctg tacccagctg 1620<210> 33<211> 1665<212> DNA<213> 人类<400> 33cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag 60gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat 120gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagcggcc 180gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa 240gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag 300ccggttcaga gcaaaccgca gaaggcctcc gcccccgccg cggaccctcc gcggtacacc 360tttgcaccca gcgtctccct caacaagacg gcccggccct ttggggcgcc cccgcccgct 420gacagcgccc cgcaacagaa tggacagccg ctccgaccgc tggtcccaga tgccagcaag 480cagcggctga tggagaacac agaggactgg cggccgcggc cggggacagg ccagtcgcgt 540tccttccgca tccttgccca cctcacaggc accgagttca tgcaagaccc ggatgaggag 600cacctgaaga aatcaagcca ggtgcccagg acagaagccc cagccccagc ctcatctaca 660ccccaggagc cctggcctgg ccctaccgcc cccagcccta ccagccgccc gccctgagct 720gtggaccctg cgtttgccga gcgctatgcc ccggacaaaa cgagcacagt gctgacccgg 780cacagccagc cggccacgcc cacgccgctg cagagccgca cctccattgt gcaggcagct 840gccggagggg tgccaggagg gggcagcaac aacggcaaga ctcccgtgtg tcaccagtgc 900cacaaggtca tccggggccg ctacctggtg gcgttgggcc acgcgtacca cccggaggag 960tttgtgtgta gccagtgtgg gaaggtcctg gaagagggtg gcttctttga ggagaagggc 1020gccatcttct gcccaccatg ctatgacgtg cgctatgcac ccagctgtgc caagtgcaag 1080aagaagatta caggcgagat catgcacgcc ctgaagatga cctggcacgt gcactgcttt 1140acctgtgctg cctgcaagac gcccatccgg aacagggcct tctacatgga ggagggcgtg 1200ccctattgcg agcgagacta tgagaagatg tttggcacga aatgccatgg ctgtgacttc 1260aagatcgacg ctggggaccg cttcctggag gccctgggct tcagctggca tgacacctgc 1320ttcgtctgtg cgatatgtca gatcaacctg gaaggaaaga ccttctactc caagaaggac 1380aggcctctct gcaagagcca tgccttctct catgtgtgag ccccttctgc ccacagctgc 1440cgcggtggcc cctagcctga ggggcctgga gtcgtggccc tgcatttctg ggtagggctg 1500gcaatggttg ccttaaccct ggctcctggc ccgagcctgg gctcccgggc ccctgcccac 1560ccaccttatc ctcccacccc actccctcca ccaccacagc acaccggtgc tggccacacc 1620agcccccttt cacctccagt gccacaataa acctgtaccc agctg                 1665<210> 34<211> 223<212> PRT<213> 人类<400> 34Met Asp Ser Phe Lys Val Va1 Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1               5                  10                  15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
         20                  25                  30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
     35                  40                  45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
 50                  55                  60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65                  70                  75                  80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala
             85                  90                  95Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu
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130                 135                 140Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly145                 150                 155                 160Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr
            165                 170                 175Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln
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    195                 200                 205Pro Trp Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro
210                     215                 220<210> 35<211> 20<212> DNA<213> 人类<400> 35gagccggcat catggattcc                                      20<210> 36<211> 20<212> DNA<213> 人类<400> 36gctgcctgca caatggaggt                                      20<210> 37<211> 1456<212> DNA<213> 人类<400> 37cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag 60gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat 120gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc 180gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa 240gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag 300ccggttcaga gcaaaccgca gaaggtgcag acccctgaca aacagccgct ccgaccgctg 360gtcccagatg ccagcaagca gcggctgatg gagaacacag aggactggcg gccgcggccg 420gggacaggcc agtcgcgttc cttccgcatc cttgcccacc tcacaggcac cgagttcatg 480caagacccgg atgaggagca cctgaagaaa tcaagccagg tgcccaggac agaagcccca 540gccccagcct catctacacc ccaggagccc tggcctggcc ctaccgcccc cagccctacc 600agccgcccgc cctgggctgt ggaccctgcg tttgccgagc gctatgcccc ggacaaaacg 660agcacagtgc tgacccggca cagccagccg gccacgccca cgccgctgca gagccgcacc 720tccattgtgc aggcagctgc cggaggggtg ccaggagggg gcagcaacaa cggcaagact 780cccgtgtgtc accagtgcca caaggtcatc cggggccgct acctggtggc gttgggccac 840gcgtaccacc cggaggagtt tgtgtgtagc cagtgtggga aggtcctgga agagggtggc 900ttctttgagg agaagggcgc catcttctgc ccaccatgct atgacgtgcg ctatgcaccc 960agctgtgcca agtgcaagaa gaagattaca ggcgagatca tgcacgccct gaagatgacc 1020tggcacgtgc actgctttac ctgtgctgcc tgcaagacgc ccatccggaa cagggccttc 1080tacatggagg agggcgtgcc ctattgcgag cgagactatg agaagatgtt tggcacgaaa 1140tgccatggct gtgacttcaa gatcgacgct ggggaccgct tcctggaggc cctgggcttc 1200agctggcatg acacctgctt cgtctgtgcg atatgtcaga tcaacctgga aggaaagacc 1260ttctactcca agaaggacag gcctctctgc aagagccatg ccttctctca tgtgtgagcc 1320ccttctgccc acagctgccg cggtggcccc tagcctgagg ggcctggagt cgtggccctg 1380catttctggg tagggctggc aatggttgcc ttaaccctgg ctcctggccc gagcctgggc 1440tcccgggccc tgccca                                                 1456<210> 38<211> 423<212> PRT<213> 人类<400> 38Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1               5                  10                  15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
         20                  25                  30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
     35                  40                  45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
 50                  55                  60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65                  70                  75                  80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Asn Lys Pro Gln Lys Val Gln Thr
             85                  90                  95Pro Asp Lys Gln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser Lys Gln
        100                 105                 110Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly Thr Gly
    115                 120                 125Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr Glu Phe
130                 135                 140Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln Val Pro145                 150                 155                 160Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu Pro Trp
            165                 170                 175Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp Ala Val
        180                 185                 190Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser Thr Val
    195                 200                 205Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln Ser Arg
210                 215                 220Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly Gly Ser225                 230                 235                 240Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Gln Val Ile Arg
            245                 250                 255Ala Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu Glu Phe
        260                 265                 270Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe Phe Glu
    275                 280                 285Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg Tyr Ala
290                 295                 300Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile Met His305                 310                 315                 320Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Leu Cys Phe Thr Cys Ala Ala Cys
            325                 330                 335Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Net Glu Glu Gly Val Pro
        340                 345                 350Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys Gln Trp
    355                 360                 365Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala Leu Gly
370                 375                 380Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln Ile Asn385                 390                 395                 400Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu Cys Lys
            405                 410                 415Ser His Ala Phe Ser His Val
        420<210> 39<211> 1575<212> DNA<213> 人类<400> 39cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag 60gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat 120gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc 180gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa 240gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag 300ccggttcaga gcaaaccgca gaaggcctcc gcccccgccg cggaccctcc gcggtacacc 360tttgcaccca gcgtctccct caacaagacg gcccggccct ttggggcgcc cccgcccgct 420gacagcgccc cgcaacagaa tgggtgcaga cccctgacaa acagccgctc cgaccgctgg 480tcccagatgc cagcaagcag cggctgatgg agaacacaga ggactggcgg ccgcggccgg 540ggacaggcca gtcgcgttcc ttccgcatcc ttgcccacct cacaggcacc gagttcatgc 600aagacccgga tgaggagcac ctgaagaaat caagccaggt gcccaggaca gaagccccag 660ccccagcctc atctacaccc caggagccct ggcctggccc taccgccccc agccctacca 720gccgcccgcc ctgggctgtg gaccctgcgt ttgccgagcg ctatgccccg gacaaaacga 780gcacagtgct gacccggcac agccagccgg ccacgcccac gccgctgcag agccgcacct 840ccattgtgca ggcagctgcc ggaggggtgc caggaggggg cagcaacaac ggcaagactc 900ccgtgtgtca ccagtgccac aaggtcatcc ggggccgcta cctggtggcg ttgggccacg 960cgtaccaccc ggaggagttt gtgtgtagcc agtgtgggaa ggtcctggaa gagggtggct 1020tctttgagga gaagggcgcc atcttctgcc caccatgcta tgacgtgcgc tatgcaccca 1080gctgtgccaa gtgcaagaag aagattacag gcgagatcat gcacgccctg aagatgacct 1140ggcacgtgca ctgctttacc tgtgctgcct gcaagacgcc catccggaac agggccttct 1200acatggagga gggcgtgccc tattgcgagc gagactatga gaagatgttt ggcacgaaat 1260gccatggctg tgacttcaag atcgacgctg gggaccgctt cctggaggcc ctgggcttca 1320gctggcatga cacctgcttc gtctgtgcga tatgtcagat caacctggaa ggaaagacct 1380tctactccaa gaaggacagg cctctctgca agagccatgc cttctctcat gtgtgagccc 1440cttctgccca cagctgccgc ggtggcccct agcctgaggg gcctggagtc gtggccctgc 1500atttctgggt agggctggca atggttgcct taaccctggc tcctggcccg agcctgggct 1560cccgggccct gccca                                                  1575<210> 40<211> 153<212> PRT<213> 人类<400> 40Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1               5                  10                  15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg
         20                  25                  30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp
     35                  40                  45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile
 50                  55                  60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65                   70                  75                 80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Ser Ala
             85                  90                  95Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu
        100                 105                 110Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala
    115                 120                 125Pro Gln Gln Asn Gly Cys Arg Pro Leu Thr Asn Ser Arg Ser Asp Arg
130                 135                 140Trp Ser Gln Met Pro Ala Ser Ser Gly145                 150<210> 41<211> 24740<212> DNA<213> 人类<400> 41nnnnnntgta ttttatcata ttttaaaaat caaaaaacaa aaggcagttg aggttaggca 60tggaggttcg tgcctgtaat cccagcactt tgggaagccg aagcacgtgg atcacctgag 120gtcaggagtt cgagaccagc ctgcccaata tggtaaaacc ctgtctctac taaaaataca 180aaaaattagc caggcatggt ggtgggcacc tgtaatccca gctacttggg agacggaggc 240aggagaatca cttaaacccg ggaggcgggc tgggcgcggt ggctcatgcc tgtaatccca 300gcactttggg aggccgagac aggcggatca tgaggtcagg agatcgagat catcctggct 360aacatggtga aaccccatct ctactaaaaa tacaaaaaaa attagccagg cctggtggcg 420ggcacctgta gtcccagcta cttgggaggc tgaggcagga gaatggcgtg aacctgggag 480gcggcgttgc agtgagccaa gatcgcgcca ctgcactcca gcctgggcga caagagtgag 540actccatctt aaagaaaaaa aacaaacccg ggaggcggaa attgcagtca gccgagatct 600cgccattgca ctcaagtatg ggtgacagag caagactcca tgtcaaaaaa aaaggcagtt 660gacaggagca aggagcctgg tgaggaagct gtggcatttg acccggctgt gttgctatgg 720gccagggtgg tgctagtaga ggagctgagt gggaaagagc acaggggaca tgctgaaggc 780ctgggtgtgg ggatgaggca gagattgggg gcaccttgca gggtcatagc aggtggctgt 840ggtgagatgg aggaagacac ctggggtact gctctaggct gtcagacata cagaagctgg 900cccagccaag cccaggggct gcaagggaca tccttttgtg tccccagtga tctgcagctc 960tcagacaccc tcaagcacag tgcctcttgc ccagcccagc actctcagtg gggagccagg 1020tgggagaaca ggctcggaag gggacctagg cttatgcagc gagccgggca aagctggaac 1080tggagcccag gcccctggat gccccctggc ttgtggagtt ctgggatact gaggggaggg 1140gacagggcat gggagtgcgg tgctctcacc tttgacttga actcattccc caggggacag 1200gggaggcctc ctcaggatcc acagatgccc agtctcccaa gaggggcctg gtccccatgg 1260aggaaaactc catctactcc tcctggcagg aaggtaagtt ggaggacgtg caagggcagc 1320ctcagccccc cacacccagg gctgggtctt tttgggactg acggagctgt cctggccacc 1380tgccacagtg ggcgagtttc ccgtggtggt gcagaggact gaggccgcca cccgctgcca 1440gctgaagggg ccggccctgc tggtgctggg cccagacgcc atccagctga gggaggccaa 1500ggcacccagg ccctctacag ctggccctac cacttcctgc gcaagttcgg ctccgacaag 1560gtgaggtgca ggggtgggaa agggtgaggg gctgacagcc tggaccctcc tgctaatccc 1620cacccgtgtg ccctgtgccc agggcgtgtt ctcctttgag gccggccgtc gctgccactc 1680gggtgagggc ctctttgcct tcagcacccc ctgtgcccct gacctgtgca gggctgtggc 1740cggggccatc gccgccagcg ggagcggctg ccagagctga ccaggcccca gccctgcccc 1800ctgccacggg ccacctctct gccctccctg gacacccccg gagagcttcg ggagatgcca 1860ccaggacctg agccacccac gtccaggaaa atgcacctgg ccgagcccgg accccagagc 1920ctgccgctac tgctaggccc ggagcccaac gatctggcgt ccgggctcta cgcttcagtg 1980tgcaagcgtg ccagtgggcc cccaggcaat gagcacctct atgagaacct gtgtgtgctg 2040gaggccagcc ccacgctgca cggtggggaa cctgagccgc acgagggccc cggcagccgc 2100agccccacaa ccagtcccat ctaccacaac ggccaggact tgagctggcc cggcccggcc 2160aacgacagta ccctggaggc ccagtaccgg cggctgctgg agctggatca ggtggagggc 2220acaggccgcc ctgaccctca ggcaggtttc aaggccaagc tggtgaccct gctgagtcgt 2280gagcggagga agggcccagc cccttgtgac cggccctgaa cgcccagcag agtggtggcc 2340agaggggaga ggtgctcccc ctgggacagg agggtgggct ggtgggcaaa cattgggccc 2400atgcagacac acgcctgtgt ccaccctggc ctgcaggaac aaggcaggcc gcctgtggag 2460gacctcagcc ctgccctgcc ctcctcatga atagtgtgca gactcacaga taataaagct 2520cagagcagct cccggcaggg gcactcacgg cacacgcccc tgcccacgtt cattgcggcc 2580aacacaagca ccctgtgccg gttccagggg cacaggtgac ctgggcctta cctgccaccc 2640gtgggctcaa acccactgca gcagacagac gggatggaaa tcattaggac tccatgttgc 2700tctgcacggc cgagtgacac gaagaggcag gcggagggag ctgtgaggct tacttgtcag 2760actcaggaag gagcaacatg agggcccaac tggagacccg gaggcccgag ctgggaggag 2820gcagtggggg cggggtgcag gtggaaggga tttcagagac accctcgtcc aaaacacttg 2880ttccctgctg aaactccaac aatttgcaga tacttctggg aaccccaggc gtcagtctcc 2940tcatctgtaa aggagagaga accgatgacg tatcaggcat aatccttgat gagagtttgc 3000tgcgtgccta ctcagtgcca ggcgctgggg gacacagccg tgttcaggac agccttggtc 3060ctgttctccg ggagccgaca ttccaggggg agagaagttt cctgaagact tccatgctgc 3120gttccctcct ctgctcctgc tcctggcgcc atcctaggag ccagccatgc acgcaagcgt 3180catgcctcca gggctctgac tgcccagccc ctcaccgcaa ctccacctca gctgcacaca 3240cccttggcac atcctgaacc tcattttcat gacggacaca caatttttgc tctctcctgt 3300ccaagcctca tcctctggcc gccacctcct tccagctcac ttcctttagt gcggccagta 3360ccgcccctgc ctaggcatgt cgacctgcag ggaccctttt ctggctcttc gaggcctctg 3420cccaccatcc cctctttgtt ctccatagtc ccttccccct gttctctctc gtttcatctt 3480actggtctgg caaagtcccc ggccttgggc gagccagacc tcctcagtgc ctgcacacag 3540ctgcccacag ccagagaaat ccatttaagc agactgcctg catccttctt aacagtgcaa 3600ggcaggcact ccctgccaca agagaccctg ttccctagta gggcagcttt tctcctcccc 3660agaacctcct gtctatcccc acccaatgtc tcctcacagg catattgggg aaacaggtca 3720ggctctccca ccgtatctgc aagtgtactg gcatccatct gtcttcttcc tacccctaca 3780gtagaaacag tgtctgtccc cagctgtgct ctgatcccgg ctcctttcac ctcagagctt 3840ggaaaattga gctgtcccca ctctctcctg cgcccattca tcctaccagc agcttttcca 3900gccacacgca aacatgctct gtaatttcac attttaaacc ttcccttgac ctcacattcc 3960tcttcggcca cctctgtttc tctgttcctc ttcacagcaa aaactgttca aaagagttgt 4020tgattacttt catttccact ttctcacccc cattctctcc tcaattaact ctccttcatc 4080cccatgatgc cattatgtgg cttttattag agtcaccaac cttattctcc aaaacaaaag 4140caacaaggac tttgacttct cagcagcact cagctctgg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Claims (37)

1.包含SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：39的分离核酸分子。
2.由SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：39编码的分离人LMP蛋白。
3.包含权利要求1的分离核酸分子的载体。
4.包含权利要求3的载体的宿主细胞。
5.权利要求4的宿主细胞，其中宿主细胞选自原核细胞、酵母细胞、和哺乳动物细胞。
6.权利要求1的分离核酸分子，其还包含标记物。
7.包含选自SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：40的氨基酸序列的人LIM矿化蛋白。
8.对HLMP-2(SEQ ID NO：38)或HLMP-3(SEQ ID NO：40)特异的单克隆抗体。
9.诱导骨形成的方法，包括用包含SEQ ID NO：39的分离核酸分子转染生骨前体细胞或外周血白细胞。
10.权利要求9的方法，其中分离核酸分子位于载体中。
11.权利要求10的方法，其中载体是表达载体。
12.权利要求11的方法，其中载体是质粒。
13.权利要求11的方法，其中载体是病毒。
14.权利要求13的方法，其中病毒是腺病毒。
15.权利要求13的方法，其中病毒是逆转录病毒。
16.权利要求9的方法，其中生骨前体细胞或外周血白细胞进行离体转染。
17.权利要求9的方法，其中生骨前体细胞通过直接注射分离核酸分子进行体内转染。
18.权利要求9的方法，其中LIM矿化蛋白是HLMP-3(SEQ ID NO：40)。
19.融合脊骨的方法，包括：
a) 用包含SEQ ID NO：39的分离核酸分子转染生骨前体细胞或外周
   血白细胞；
b) 混和经转染生骨前体细胞或外周血白细胞与基质；并
c) 使基质接触脊骨；
其中所述核苷酸序列的表达在基质中引起矿化骨形成。
20.权利要求19的方法，其中生骨前体细胞或外周血细胞进行离体转染。
21.在有此需要的哺乳动物宿主中诱导全身性骨形成的方法，包括：
a)用能够稳定维持于生骨前体细胞或外周血白细胞中的载体转染生骨
  前体细胞或外周血白细胞，该载体包含SEQ ID NO：39以及与之可
  操作连接的可调控启动子，其中可调控启动子可应答外源控制化合
  物；并
b)根据需要，对宿主施用外源控制物质，其施用量能有效引起SEQ ID
  NO：39的表达。
22.刺激生骨细胞产生生骨可溶性因子的方法，包括：
a)用包含SEQ ID NO：39的分离核酸分子转染生骨细胞或外周血白细
  胞；并
b)过度表达该分离核酸分子。
23.由权利要求22的方法产生的生骨可溶性因子。
24.权利要求23的生骨可溶性因子，其中所述生骨因子是蛋白质。
25.抑制HLMP-2或HLMP-3表达的方法，包括用反义寡核苷酸转染表达HLMP-2或HLMP-3的细胞。
26.权利要求17的方法，其中所述分离核酸分子位于载体中，该载体选自质粒和病毒。
27.权利要求26的方法，其中载体是质粒，该质粒直接注射到肌肉组织中。
28.抑制骨形成的方法，包括用包含SEQ ID NO：37的分离核酸分子转染生骨前体细胞或外周血白细胞。
29.权利要求28的方法，其中分离核酸分子位于载体中。
30.权利要求29的方法，其中载体是表达载体。
31.权利要求30的方法，其中载体是质粒。
32.权利要求30的方法，其中载体是病毒。
33.权利要求32的方法，其中病毒是腺病毒。
34.权利要求32的方法，其中病毒是逆转录病毒。
35.权利要求28的方法，其中生骨前体细胞或外周血白细胞进行离体转染。
36.权利要求28的方法，其中生骨前体细胞通过直接注射分离核酸分子进行体内转染。
37.权利要求28的方法，其中LIM矿化蛋白是HLMP-2(SEQ ID NO：38)。
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