KR20020033615A

KR20020033615A - 엘아이엠 무기화 단백질 접합 변이체

Info

Publication number: KR20020033615A
Application number: KR1020017013901A
Authority: KR
Inventors: 보덴스코트디; 헤어그레고리에이
Original assignee: 템블 존 엘; 에모리 유니버시티
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2002-05-07
Also published as: EP1181056A4; CN1908170A; AU765516B2; US20070116689A1; AU4683100A; CN1355714A; EP1181056B1; ATE363918T1; HK1045939A1; HK1045939B; CN1315537C; EP1181056A1; CN100441688C; US7045614B1; EP1808182A1; NZ515584A; WO2000066178A1; US7517866B2; DE60035107T2; JP4615736B2

Abstract

본 발명은 LIM 무기화 단백질 또는 LMP를 암호화하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 LMP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 접합 변이체를 포함하는 벡터 뿐 아니라, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 골형성 전구체 세포를 LIM 무기화 단백질의 접합 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로 형질감염시켜 골 형성을 유도하는 방법에 관한 것이다. 형질감염은 바이러스 또는 노출된 플라스미드 DNA의 직접 주입에 의해 생체외 또는 생체내에서 일어날 수 있다. 특정 태양으로, 본 발명은 골형성 전구체 세포를 LIM 무기화 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산 분자로 형질감염시키고 형질감염된 골형성 전구체 세포를 세포간질과 혼합하고 세포간질을 척추와 접촉시킴으로써 척추를 융합시키는 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 숙주 세포를 본 발명의 벡터로 안정하게 형질감염시켜 전신 골 형성을 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

엘아이엠 무기화 단백질 접합 변이체{LIM MINERALIZATION PROTEIN SPLICE VARIANTS}

조골세포는 분화다능 중간엽 간세포와 구별되는 것으로 생각된다. 조골세포의 성숙은 골을 무기화하고 형성할 수 있는 세포외 세포간질의 분비를 야기한다. 상기 복잡한 과정의 조절은 잘 이해되지 않지만 골 형태형성 단백질(BMP)로 알려진 신호 당단백질의 그룹을 포함하는 것으로 생각된다. 상기 단백질은 성체 동물에서 배아 등-복부 형태화, 팔다리싹 발생 및 골절 회복에 수반되는 것으로 밝혀졌다[B.L. Hogan,Genes & Develop., 10, 1580(1996)]. 성장 인자-베타 상과 분비된 단백질을 형질전환시키는 상기 그룹은 분화의 상이한 단계들에서 다양한 세포 유형에서 활성 스펙트럼을 가지며; 상기 밀접하게 관련된 분자들 간의 생리학적 활성의 차이는 명백해지지 않았다[D.M. Kingsley,Trends Genet., 10, 16(1994)].

상이한 BMP 신호 단백질의 독특한 생리학적 역할을 보다 잘 알아보기 위해, 최근에 래트의 두개관 조골세포의 분화를 유도하는데 대한 BMP-6의 효능과 BMP-2 및 BMP-4의 효능을 비교하였다[Boden et al.,Endocrinology, 137, 3401(1996)]. 분화의 개시를 위해 BMP 또는 글루코코르티코이드를 필요로 하는 태아 래트 두개관의 1차 계대접종 (2차) 배양에서 상기 과정을 연구하였다. 상기 막골 형성 모델에서, 글루코코르티코이드(GC) 또는 BMP는 조골세포-특이 단백질인 오스테오칼신을 분비할 수 있는 무기화된 골 결절로의 분화를 개시할 것이다. 상기 2차 배양 시스템은 자발적으로 분화하는 1차 래트 조골세포 배양과 별개이다. 상기 2차 시스템에서, 글루코코르티코이드는 BMP-6 mRNA의 유도 및 조골세포 분화의 증대를 초래하는 단백질 발현을 야기하였다[Boden et al.,Endocrinology, 138, 2920(1997)].

BMP와 같은 세포외 신호 이외에, 세포내 신호 또는 조절 분자도 또한 새로운 골 형성을 야기하는 일련의 상황에서 한 역할을 담당할 수 있다. 한 광범위한 부류의 세포내 조절 분자가 LIM 단백질인데, 이들은 LIM 영역으로 알려진 특징적인 구조적 모티프를 갖기 때문에 그렇게 불린다. LIM 영역은 2-아미노산 스페이서에 의해 결합된 2개의 특정 아연 핑거로 이루어진 시스테인이 많은 구조적 모티프이다. 일부 단백질들은 LIM 영역만을 갖는 반면, 다른 단백질들은 다양한 추가의 기능성 영역을 함유한다. LIM 단백질은 전사 인자 및 세포골격 단백질을 포함하여, 다양한 그룹을 형성한다. LIM 단백질의 주 역할은 같거나 다른 LIM 영역을 갖는이량체의 형성을 통해 또는 별개의 단백질들을 결합시킴으로써 단백질-단백질 상호작용을 매개하는데 있는 것으로 보인다.

LIM 유사영역 단백질은 세포 계통 결정의 제어 및 분화 조절에 관련되지만, LIM 만의 단백질도 유사한 역할을 할 수 있다. LIM 만의 단백질은 또한 상기 단백질을 암호화하는 여러 유전자들이 종양형성 염색체 전좌와 관련되기 때문에 세포 증식의 제어에 연관된다.

인간 및 다른 포유동물종은 골 회복 및/또는 재생 과정을 필요로 하는 질병 또는 손상을 받기 쉽다. 예를 들면, 골절의 치료는 자연적인 골 회복 메카니즘을 자극함으로써 골절된 뼈가 치료되는데 필요한 시간을 감소시킬 수 있는 새로운 치료법에 의해 개선될 수 있다. 다른 예로, 골다공증과 같은 전신성 골 질환으로 고생하는 개인들은 새로운 뼈의 전신적 형성을 야기하는 치료법으로부터 이득을 볼 것이다. 상기 치료법은 상기 질환의 특징인 골 부피의 손실로부터 일어나는 골절의 발생률을 감소시킬 것이다.

적어도 이러한 이유로, BMP와 같은 세포외 인자들은 생체내에서 새로운 뼈의 형성을 자극하는데 이들을 이용할 목적으로 연구되었다. BMP 및 다른 세포외 신호 분자들에 의해 달성된 초기의 성공에도 불구하고, 이들의 사용은 많은 결점들을 수반한다. 예를 들면, 비교적 큰 용량의 정제된 BMP가 새로운 뼈의 생성에 필요함으로써 상기 치료 방법의 비용을 증가시킨다. 또한, 세포외 단백질은 숙주 동물로 도입된 후 분해되기 쉽다. 게다가, 이들은 전형적으로 면역원성이기 때문에, 투여된 단백질에 대한 면역 반응을 자극할 가능성이 항상 존재한다.

그러한 관계로 인해, 새로운 골 형성을 유도하기 위해 세포내 신호 분자를 이용하는 유용한 치료법을 갖는 것이 바람직할 것이다. 현재 유전자 요법 분야에서의 진보는 골형성 전구체 세포, 즉, 골 형성에 수반되는 세포, 또는 골 형성 과정의 일부를 구성하는 세포내 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 단편인 말초혈 백혈구 중에 도입되는 것을 가능하게 한다. 골 형성을 위한 유전자 요법은 많은 잠재적인 이점들을 제공한다: (1) 보다 낮은 생산 비용; (2) 세포내 신호의 지연된 발현을 달성하는 능력으로 인해, 세포외 치료법에 비해 보다 큰 효율; (3) 상기 신호에 대한 한정된 수의 수용체들의 존재로 인해 세포회 신호를 이용한 치료가 제한될 수도 있다는 가능성을 배제함; (4) 편재된 골 형성이 필요한 부위에 형질감염된 잠재적인 골원(osteoprogenitor) 세포의 직접적인 운반을 허용함; 및 (5) 전신성 골 형성을 허용함으로써 골다공증 및 기타 대사성 골 질환에 대한 치료법을 제공함.

발명의 요약

본 발명은 골 형성을 유발하는 일련의 상황에서 초기에 관련되는 세포내 신호 분자를 이용하여 골 형성을 유도하기 위한 새로운 조성물 및 방법을 제공함으로써 선행 기술에서의 결점들을 극복하기 위해 노력하였다. 본 출원인은 원래 자극된 래트 두개관 조골세포 배양으로부터 단리된 서열을 갖는 새로운 LIM 유전자인 10-4/RLMP(서열 번호:1, 서열 번호: 2)를 발견하였다. 상기 유전자를 클로닝하고 서열화하고 시험관내에서 골 무기화의 효율을 증대시키는 그의 능력에 대해 분석하였다. 단백질 RLMP는 골 세포간질의 무기화 뿐 아니라 세포의 조골세포 계통으로의 분화에 영향을 미친다. 다른 알려진 사이토카인, 예를 들면, BMP와 달리, RLMP는 분비된 단백질이 아닌 대신 세포내 신호 분자이다. 상기 특징은 세포내 신호 증폭 뿐 아니라 형질감염된 세포의 초기 평가를 제공한다는 이점을 갖는다. 상기 특징은 또한 보다 효과적이고 특이적인 생체내 적용에 적합하다. 적합한 임상적 용도로는 골절, 골 결손, 골 융합에서의 골 회복, 및 골다공증이 있는 환자에서의 정상적인 항상성의 향상이 포함된다.

본 출원인은 또한 인간 LMP-1으로 불리는 상응하는 인간 단백질의 아미노산 서열을 클로닝하고 서열화하고 추정하였다. 상기 인간 단백질은 시험관내 및 생체내에서 골 무기화의 증대된 효율을 나타낸다.

또한, 본 출원인은 HLMP-1으로 불리는, LMP-1의 절단된(짧은) 변형체를 특성화하였다. 상기 짧은 변형체는 단백질을 절단한 정지 코돈을 제공하는 cDNA 클론의 한 공급원에서의 점 돌연변이로부터 비롯되었다. 짧은 변형체(LMP-1)는 세포 배양물 및 생체내에서 발현될 때 완전히 작용성이다.

인간 심장 cDNA 라이브러리의 PCR 분석법을 이용하여, 본 출원인은, 인간 심장 cDNA 라이브러리의 PCR 분석법을 이용하여, HLMP-1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서 325번과 444번 염기쌍 사이의 영역에서 HLMP-1과 상이한 2개의 대체 접합 변이체(HLMP-2 및 HLMP-3로 지칭함)를 동정하였다. HLMP-2 서열은 119개 염기쌍 결실 및 상기 영역에서 17개 염기쌍의 삽입을 갖는다. HLMP-1에 비해, HLMP-3을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 결실이 없지만, HLMP-1 서열에서의 444번 위치에 삽입된, HLMP-2와 동일한 17개 염기쌍들을 갖는다.

본 발명의 또 다른 특징 및 이점들은 하기의 설명에 나타낼 것이며, 부분적으로 설명으로부터 명백해지거나 또는 본 발명의 실시에 의해 교지될 수 있다. 본 발명의 목적 및 기타 이점들은 기록된 설명 및 청구의 범위에 특별히 지적한 문제의 방법 및 조성물에 의해 실현되고 달성될 것이다.

하나의 광범위한 측면에서, 본 발명은 임의의 LIM 무기화 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것으로, 이때, 상기 핵산 분자는 표준 조건하에서 서열 번호: 25의 전체 길이에 상보적인 핵산 분자에 하이브리드화되고, 매우 엄격한 조건하에서 서열 번호: 26의 전체 길이에 상보적인 핵산 분자에 하이브리드화된다. 특정 태양에서, 상기 단리된 핵산 분자는 HLMP-1, HLMP-1s, RLMP, HLMP-2 또는 HLMP-3를 암호화한다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 뿐 아니라, 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또 다른 특정 태양으로, 본 발명은 단백질 자체에 관한 것이다.

두 번째 광범위한 측면에서, 본 발명은 HLMP-1, HLMP-1s, RLMP, HLMP-2 및 HLMP-3를 포함한, LIM 무기화 단백질에 특이적인 항체에 관한 것이다. 하나의 특정 태양으로, 상기 항체는 다클론성 항체이다. 또 다른 특정 태양으로, 상기 항체는 단클론성 항체이다.

세 번째 광범위한 측면에서, 본 발명은 골형성 전구체 세포를 LIM 무기화 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로 형질감염시키는, 골 형성을 유도하는 방법에 관한 것이다. 하나의 특정 태양으로, 단리된 핵산 분자는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스와 같이, 플라스미드 또는 바이러스일 수 있는 벡터에 존재한다. 형질감염은 단리된 핵산 분자의 직접 주입에 의해 생체외 또는 생체내에서 일어날 수 있다. 형질감염된 단리된 핵산 분자는 HLMP-1, HLMP-1s, RLMP, HLMP-2 또는 HLMP-3를 암호화할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 골형성 전구체 세포를 LIM 무기화 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산 분자로 형질감염시키고 형질감염된 골형성 전구체 세포를 세포간질과 혼합하고 세포간질을 척추와 접촉시킴으로써 척추를 융합시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포를 본 발명의 벡터로 안정하게 형질감염시켜 전신성 골 형성을 유도하는 방법에 관한 것이다.

상기 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 예시적이고 설명적인 것이며 청구된 바와 같은 본 발명의 또 다른 설명을 제공하는 것임을 주지해야 한다.

약자 및 정의

BMP: 골 형태형성 단백질, HLMP-1: 인간 HIM 단백질 또는 HLMP로도 또한 나타낸 인간 LMP-1, HLMP-1s: 인간 LMP-1 짧은(절단된) 단백질, HLMPU: 인간 LIM 단백질 단일 영역, LMP: LIM 무기화 단백질, MEM: 최소 필수 배지, Trm: 트리암시놀론, -GlyP: 베타-글리세롤포스페이트, RACE: cDNA 말단의 신속한 증폭, RLMP: RLMP-1으로도 또한 나타낸 래트 LIM 무기화 단백질, RLMPU: 래트 LIM 단백질 단일 영역, RNAsin: RNA 분해효소 억제제, ROB: 래트 조골세포, 10-4: RLMP에 대한 cDNA 서열(서열 번호:2)을 함유하는 클론, UTR: 미번역 영역, HLMP-2: 인간 LMP 접합 변이체 2, HLMP-3: 인간 LMP 접합 변이체 3.

본 발명의 분야는 일반적으로 포유동물 종에서의 골형성 세포, 및 골 및 골 조직의 형성에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 시험관내 및 생체내에서 골 무기화의 효율을 증대시키는, 새로운 부류의 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은, 예를 들면, 척추 융합, 골절 회복 및 골다공증과 같이 골 및 골 조직과 관련된 다양한 병리학적 증상을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본원에서 LIM 무기화 단백질 또는 LMP로 표시한, 새로운 포유동물 LIM 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 보다 특히는 HLMP 또는 HLMP-1으로 알려진 인간 LMP, 또는 HLMP-2 또는 HLMP-3로 알려진 인간 LMP의 대안적인 접합 변이체에 관한 것이다. 본 출원인은 상기 단백질들이 시험관내에서 성장한 포유동물 세포에서 골 무기화를 증대시킴을 발견하였다. 포유동물에서 생성되는 경우, LMP는 또한 생체내에서 골 형성을 유도한다.

골수 세포, 골형성 전구체 세포, 말초혈 백혈구 또는 중간엽 간세포를 LMP 또는 HLMP를 암호화하는 핵산으로 생체외 형질감염시킨 다음, 형질감염된 세포를 공여체에 재이식하는 것은 다양한 골-관련 질환 또는 손상을 치료하는데 적합하다. 예를 들면, 장골 골절 회복을 촉진하고; 분절 결손시 뼈를 생성시키고; 골절에 대한 골 융합 대체물을 제공하고; 종양 개량 또는 척추 융합을 촉진하고; 둔부, 척추 또는 손목의 골다공증에서와 같이 약하거나 골다공성 뼈에 대한 국소적 치료(주입에 의한)를 제공하기 위해 상기 방법을 이용할 수 있다. LMP 또는 HLMP-암호화 핵산으로 형질감염시키는 것은 또한 골절된 장골의 회복을 촉진하기 위한 형질감염된 골수 세포의 경피 주입; 장골 골절 또는 척추 융합의 가성관절의 지연된 결합 또는 비-결합의 치료; 및 둔부 또는 무릎의 무혈관성 괴사에서 새로운 골 형성을 유도하는데 유용하다.

유전자 요법의 생체외-기초 방법 이외에, LMP 또는 HLMP를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터의 형질감염을 생체내에서 달성할 수 있다. LMP또는 HLMP를 암호화하는 DNA 단편을 적절한 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터에 삽입하는 경우, 바이러스 구조물은 연골성 뼈 형성이 필요한 신체 부위에 직접 주입될 수 있다. 직접적인 경피 주입을 이용하여 LMP 또는 HLMP 서열을 도입함으로써, 골수 세포(생체외로 형질감염시키기 위한)를 수득하거나 또는 이들을 환자의 새로운 뼈가 필요한 부위에 재이식하기 위한 외과적 조정이 필요없이 골 형성의 자극이 달성될 수 있다. 앨든(Alden) 등[Neurosurgical Focus(1998)]은 아데노바이러스 벡터에 클로닝된 BMP-2를 암호화하는 cDNA를 이용하는 유전자 요법의 직접 주입 방법의 유용성을 입증하였다.

HLMP를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 노출된, 즉, 피막이 없는 재조합 플라스미드를 적절한 신체 부위에 직접 주입함으로써 유전자 요법을 생체내에서 수행하는 것도 또한 가능하다. 본 발명의 상기 태양에서, 형질감염은 노출된 플라스미드 DNA가 기술한 적절한 표적 세포에 의해 흡수되거나 세포내이입되는 경우에 일어난다. 바이러스 구조물을 이용하는 생체내 유전자 요법의 경우에서와 같이, 노출된 플라스미드 DNA의 직접 주입은 외과적 조정이 거의 또는 전혀 필요없다는 이점을 제공한다. 내피 세포 미토겐 VEGF(혈관 내피 성장 인자)를 암호화하는 노출된 플라스미드 DNA를 이용하는 직접 유전자 요법은 인간 환자에서 성공적으로 논증되었다[Baumgartner et al.,Circulation, 97(12), 1114-1123(1998)].

LMP를 골형성 세포로 운반하기 위해 아데노바이러스 벡터를 이용함으로써, LMP의 일시적 발현이 달성된다. 이러한 현상은 아데노바이러스가 형질감염되는 표적 세포의 게놈 중에 삽입되지 않기 때문에 일어난다. LMP의 일시적 발현, 즉, 형질감염된 표적 세포의 수명동안 일어나는 발현은 본 발명의 목적을 달성하는데 충분하다. 그러나, LMP의 안정한 발현은 표적 세포의 게놈 중에 삽입되는 벡터를 운반 비히클로 사용하는 경우에 일어날 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스-기본 벡터가 상기 목적에 적합하다.

LMP의 안정한 발현은 골다공증 및 불완전한 골형성과 같은 다양한 전신성 골-관련 질환을 치료하는데 특히 유용하다. 본 발명의 상기 태양에 있어, LMP-암호화 뉴클레오티드 서열을 표적 세포로 운반하기 위해 표적 세포의 게놈 중에 통합되는 벡터를 이용하는 것 이외에, LMP 발현은 조절성 프로모터의 제어를 받게 된다. 예를 들면, 테트라사이클린과 같은 외인성 유도제에 노출됨으로써 자극되는 프로모터가 적합하다. 상기 접근방법을 이용하여, 효과량의 외인성 유도제를 투여함으로써 전신 기준으로 새로운 뼈의 형성을 자극할 수 있다. 일단 충분한 양의 골 부피가 달성되면, 외인성 유도제의 투여를 중단한다. 상기 과정은, 예를 들면, 골다공증의 결과로서 손실된 골 부피를 대체하기 위해 필요한 대로 반복할 수 있다.

HLMP에 특이적인 항체는 환자 세포의 골유도성, 즉, 골-형성 잠재력을 분석하기 위한 방법에 사용하기에 특히 적합하다. 이러한 방식으로, 골 회복의 느리거나 빈약한 치료에 대한 위험에 처한 환자를 확인할 수 있다. 또한, HLMP-특이성 항체는, 예를 들면, 골다공증과 같은 골 퇴행성 질환에서의 위험 인자를 확인하기 위한 마커 분석에 사용하기에 적합하다.

공지되고 통상적인 방법에 따라, LMP를 암호화하는 핵산 단편을 클로닝 및/또는 발현 벡터와 같은 다른 핵산 서열에 접합시킴으로써 본 발명의 유전자를 제조한다. 이들 재조합 벡터를 제작하고 분석하기 위해 필요한 방법, 예를 들면, 제한 엔도뉴클레아제 절단, 클로닝 프로토콜, 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드의 유기 합성 및 DNA 서열화를 기술하였다. DNA 서열화의 경우, DNA, 데옥시터미네이터 방법이 바람직하다.

문헌 [Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2nd edition(1988); Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier(1986); and Ausubel et al.,Current Protoclos in Molecular Biology, Wiley Interscience(1988)]을 포함하여, 재조합 DNA 방법에 대한 많은 논문들이 발표되었다. 상기 참고 문헌들은 본원에 특정하게 참고로 인용된다.

DNA 또는 cDNA의 프라이머-유도된 증폭은 본 발명 유전자들의 발현에 있어 공통적인 단계이다. 상기 증폭은 전형적으로 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행된다. PCR은 미국 특허 제 4,800,159 호(멀리스 등(Mullis et al.)) 및 다른 발표된 출처들에 기술되어 있다. PCR의 기본 원리는 프라이머 연장의 연속 순환에 의한 DNA 서열의 지수적 복제이다. 또 다른 프라이머에 하이브리드화되는 경우 한 프라이머의 연장 생성물은 또 다른 핵산 분자의 합성에 주형이 된다. 프라이머-주형 복합체는, 그 복제 기능을 수행할 때 프라이머를 연장시키는 DNA 중합효소에 대한 기질로서 작용한다. PCR 용도를 위한 통상적인 효소는서머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 단리된 열안정성 DNA 중합효소 또는 TaqDNA 중합효소이다.

기본 PCR 방법의 많은 변형들이 존재하며, 본 발명의 재조합 벡터를 구축하는데 필요한 임의의 주어진 단계에서 선택되는 특정 절차는 숙련된 기술자에 의해 쉽게 수행된다. 예를 들면, 10-4/RLMP의 세포 발현을 측정하기 위해, RNA를 추출하고 공지된 표준 절차에 따라 역 전사시킨다. 이어서, 생성된 cDNA를 PCR에 의한 적절한 mRNA 서열에 대해 분석한다.

LIM 무기화 단백질을 암호화하는 유전자는 재조합 발현 시스템 중의 발현 벡터에서 발현된다. 물론, 구성된 서열은 원래 서열 또는 그의 상보성 서열과 동일할 필요는 없지만, 그 대신에 변성에도 불구하고 골 형성 활성을 갖는 LMP를 발현하는 DNA 코드의 변성에 의해 결정된 임의의 서열일 수 있다. 통상적인 아미노산 치환, 또는 아미노-말단 메티오닌 잔기의 발생과 같은 다른 변형도 또한 이용할 수 있다.

선택된 숙주 발현 시스템에서 활성인 리보좀 결합 부위를 키메라성 LMP 코딩 서열의 5' 말단에 접합시켜 합성 유전자를 생성한다. 합성 유전자는 적절하게 선형화된 플라스미드에 접합시킴으로써 매우 다양한 발현용 벡터 중 어느 하나에 삽입될 수 있다. 조절성 프로모터, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 프로모터도 또한 키메라 코딩 서열의 발현에 적합하다. 다른 적합한 조절성 프로모터로는 trp, tac, recA, T7 및 람다 프로모터가 포함된다.

LMP를 암호화하는 DNA를 발표된 여러 표준 절차 중 하나에 의해, 예를 들면, 인산 칼슘 침전, DEAE-덱스트란, 일렉트로포레이션 또는 원형질 융합에 의해 수용체 세포에 형질감염시켜 안정한 형질전환체를 형성한다. 인산 칼슘 침전이 바람직한데, 특히 다음과 같이 수행될 때 바람직하다.

DNA를 세포에 형질감염시키기 전에, 문헌 [Graham and Van Der,Virology, 52, 456(1973)]의 방법에 따라 인산 칼슘으로 동시침전시킨다. 담체로서 연어 정액 또는 송아지 흉선 DNA와 함께 한 분취량의 40 내지 50 g의 DNA를 100 ㎜ 접시 위에 평판배양된 0.5 x 10⁶세포에 사용한다. DNA를 0.5 ㎖의 2X Hepes 용액(280 mM NaCl, 50 mM Hepes 및 1.5 mM Na₂HPO₄(pH 7.0))과 혼합하고, 여기에 동 부피의 2x CaCl₂(250 mM CaCl₂및 10 mM Hepes(pH 7.0))를 가한다. 30 내지 40 분후에 나타나는 백색의 과립 침전물을 세포들 위에 고르게 적하하여 분포시키고, 37 ℃에서 4 내지 16 시간동안 배양한다. 배지를 제거하고 세포를 PBS 중의 15% 글리세롤로 3 분간 충격을 준다. 글리세롤을 제거한 후에, 세포에 10% 태아 소 혈청을 함유하는 둘벡코 최소 필수 배지(Dulbecco's Minimal Essential Medium, DMEM)를 공급한다.

DNA는 또한 다음 방법을 이용하여 형질감염시킬 수 있다: 문헌 [Kimura et al.,Virology, 49, 394(1972); and Sompayrac et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7575(1981)]의 DEAE-덱스트란 방법; 문헌 [Potter,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7161(1984)]의 일렉트로포레이션 방법; 및 문헌 [Sandri-Goddin et al.,Molec. Cell. Biol., 1, 743(1981)]의 원형질 융합 방법.

고체상에서의 포스포르아미다이트 화학이 올리고데옥시뉴클레오티드 및 폴리데옥시뉴클레오티드의 유기 합성에 바람직한 방법이다. 또한, 많은 다른 유기 합성 방법이 이용가능하다. 상기 방법들은 당해 분야에 숙련된 자들에 의해 본 발명의 특정 서열에 용이하게 순응된다.

본 발명은 또한 표준 조건하에서 본 발명의 LIM 무기화 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 서열에 하이브리드화되는 핵산 분자를 포함한다. "표준 하이브리드화 조건"은 프로브의 크기, 핵산 시약의 배경 및 농도 뿐 아니라, 하이브리드화 유형, 예를 들면, 동일 반응계내, 서던 블롯(Southern blot) 또는 DNA-RNA 하이브리드의 하이브리드화(노던 블롯(Northern blot))에 따라 달라질 것이다. "표준 하이브리드화 조건"의 결정은 당해 분야의 기술 수준에 속한다. 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,580,775 호(프리뮤 등(Fremeau et al.))를 참조하시오. 또한, 문헌 [Southern, E.M.,J. Mol. Biol., 98, 503(1975); Alwine et al.,Meth. Enzymol., 68, 220(1979); and Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, pp. 7.19-7.50, Cold Spring Harbor Press(1989)]을 참조하시오.

하나의 바람직한 표준 하이브리드화 조건의 구성은 42 ℃에서, 50% 포름아미드, 5X SSPE(150 nM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄(pH 7.4), 1 mM EDTA(pH 8.0)), 5X 덴하르트(Denhardt) 용액(100 ㎖의 물 당 20 ㎎ 피코일(Ficoil), 20 ㎎ 폴리비닐피롤리돈 및 20 ㎎ BSA), 10% 덱스트란 설페이트, 1% SDS 및 100 g/㎖ 연어 정액 DNA 중에서 2 시간동안 예비하이브리드화된 블롯을 포함한다.³²P-표지된 cDNA 프로브를 가하고, 하이브리드화를 14 시간동안 계속한다. 그런 후에, 상기 블롯을 22 ℃에서 2X SSPE, 0.1% SDS로 20 분동안 2회 세척한 후, 65 ℃에서 0.1X SSPE, 0.1% SDS로 1 시간동안 세척한다. 이어서, 상기 블롯을 건조하고 증감지의 존재하에 5 일간 x-선 필름에 노출시킨다.

"매우 엄격한 조건" 하에서, 프로브와 그 표적 서열이 실질적으로 동일한 경우, 프로브는 그 표적 서열에 하이브리드화될 것이다. 표준 하이브리드화 조건의 경우에서와 같이, 당해 분야의 기술을 가진 자라면 당해 분야의 기술 수준 및 특정 실험의 특성이 제공된 상태에서 실질적으로 동일한 서열 만이 하이브리드화될 조건을 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질을 포함한다. 또 다른 태양으로, 본 발명은 항-LMP 항체를 기본으로 하는 상기 단백질의 동정에 관한 것이다. 상기 태양에서는, 세포를 용해시키고 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리함으로써 웨스턴 블롯(Western bolt) 분석을 위한 단백질 샘플을 제조한다. 상기 단백질은 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons(1987)]에 기술된 바와 같이 전기블롯팅에 의해 니트로셀룰로즈로 옮겨진다. 필터를 인스턴트 탈지 분유(100 ㎖ PBS 중 1 g)로 폐쇄한 후, 항-LMP 항체를 필터에 가하고 실온에서 1 시간동안 배양한다. 필터를 인산염 완충된 식염수(PBS)로 완전히 세척하고 실온에서 호스라디쉬 퍼옥시다제(HRPO)-항체 접합체와 함께 1 시간동안 배양한다. 필터를 다시 PBS로 완전히 세척하고 항원 띠를 디아미노벤지딘(DAB)을 가하여 확인한다.

단일특이성 항체가 본 발명에서 선택되는 시약이며, 특히 LMP의 발현과 관련된 특정한 특성들에 대해 환자 세포를 분석하는데 이용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단일특이성 항체"는 LMP에 대한 동종 결합 특성을 갖는 단일 항체 종 또는 다중 항체 종으로서 정의된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "동종 결합"은 전술한 바와 같이 LMP와 관련된 것들과 같은 특이 항원 또는 에피토프에 결합하는 항체 종의 능력을 말한다. LMP에 대해 반응하는 항체를 함유하는 포유동물의 항혈청으로부터 LMP에 대한 단일특이성 항체를 정제하거나, 또는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256-495-497(1975)]의 기술을 이용하여 LMP와 반응성인 단클론성 항체로서 LMP에 대한 단일특이성 항체로서 제조된다. LMP 특이 항체는, 예를 들면, 마우스, 래트, 기니 피그, 토끼, 양 또는 말과 같은 동물들을, 면역 보조제의 존재 또는 부재하에 적절한 농도의 LMP로 면역시킴으로써 상승된다.

상기 과정에서, 예비면역 혈청을 1차 면역화 전에 수거한다. 각각의 동물에게, 경우에 따라, 허용되는 면역 보조제와 함께 약 0.1 내지 약 1000 ㎎의 LMP를 주입한다. 상기 허용되는 보조제로는 프로인트(Freund) 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제, 명반-침전물,코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)을 함유하는 유중 수적형 유화액 및 tRNA 보조제가 포함되나 이로 한정되지는 않는다. 초기 면역화는 다중 부위에서 피하(SC), 복강내(IP) 또는 둘 다로 주입된, 바람직하게는 프로인트 완전 보조제 중의 LMP로 이루어진다. 각각의 동물은 규칙적인 간격으로, 바람직하게는 매주 채혈하여 항체 역가를 측정한다. 동물들은 초기 면역화 후에 추가면역을 주입받거나 받지 않을 수 있다. 추가면역을 주입받은 동물들에게는 일반적으로 동일한 경로로 프로인트 불완전 보조제 중의 동량의 항원이 제공된다. 추가면역 주입은 최대 역가가 얻어질 때까지 약 3주 간격으로 제공된다. 각각의 추가 면역화 후 약 7 일째에 또는 단일 면역화 후 약 1 주일째에, 동물들을 채혈하고 혈청을 수거하고 분취량들을 약 -20 ℃에 보관한다.

동종번식 마우스, 바람직하게는 Balb/c 마우스를 LMP로 면역시켜 LMP와 반응하는 단클론성 항체(mAb)를 제조한다. 마우스는 IP 또는 SC 경로에 의해, 상기에서 논의한 바와 같은 동 부피의 허용되는 보조제 중에 혼입된 약 0.5 ㎖ 완충액 또는 식염수 중의 약 0.1 내지 약 10 ㎎, 바람직하게는 약 1 ㎎의 LMP로 면역시킨다. 프로인트의 완전 보조제가 바람직하다. 마우스는 제 0 일에 초기 면역을 받고 약 3 내지 30 주동안 휴면시킨다. 면역화된 마우스에게는 정맥내(IV) 경로에 의해 인산염 완충된 식염수와 같은 완충액 중의 약 0.1 내지 약 10 ㎎의 LMP로 한번 이상의 추가면역이 제공된다. 항체-양성 마우스로부터 당해 분야에 공지된 표준 절차에 의해 면역화된 마우스로부터 비장을 제거하여 임파구, 바람직하게는 비장 임파구를 수득한다. 안정한 하이브리도마를 생성할 조건 하에서 비장 임파구를 적절한 융합 대상, 바람직하게는 골수종 세포와 혼합하여 하이브리도마 세포를 생성시킨다. 융합 대상으로는 마우스 골수종 P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 및 Sp 2/0이 포함될 수 있으나 이로 한정되지는 않으며, Sp 2/0이 바람직하다. 항체 생성 세포 및 골수종 세포를 약 30 내지 약 50% 농도에서 약 1000 몰중량의 폴리에틸렌 글리콜 중에서 융합시킨다. 당해 분야에 공지된 절차에 의해 보충된 둘벡코의 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM) 중에서 하이포크산틴, 티미딘 및 아미노프테린 중에서 성장시켜 융합된 하이브리도마 세포를 선별한다. 약 14, 18 및 21 일째에 성장 양성 웰로부터 상등액을 수거하고, 항원으로 LMP를 사용하여 고체상 면역방사분석법(SPIRA)과 같은 면역분석법에 의해 항체 생성에 대해 선별한다. 배양액을 또한 오취터로니(Ouchterlony) 침전 분석법으로 시험하여 mAb의 동종형(isotype)을 결정한다. 문헌 [MacPherson, "Soft Agar Techniques",Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson(eds.), Academic Press(1973)]의 소프트 아가 기술과 같은 기술에 의해 항체 양성 웰로부터 하이브리도마 세포를 클로닝한다. 문헌 [Harlow et al.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory(1988)]도 또한 참조하시오.

프리스탄-초회항원자극된 Balb/c 마우스에게 초회항원자극 후 약 4 일째에 약 2 x 10⁶내지 약 6 x 10⁶개의 하이브리도마 세포를 마우스당 약 0.5 ㎖ 주입함으로써 단클론성 항체를 생체내에서 생성할 수 있다. 세포 전이 후 약 8 내지 12 일째에 복수액을 수거하고 당해 분야에 공지된 기술에 의해 단클론성 항체를 정제한다.

항-LMP mAb에서의 시험관내 생성은 약 2% 태아 송아지 혈청을 함유하는 DMEM 중에서 하이브리도마 세포주를 성장시켜 충분한 양의 특이성 mAb를 수득함으로써 수행한다. mAb는 당해 분야에 공지된 기술에 의해 정제한다.

복수 또는 하이브리도마 배양액의 항체 역가는 침전, 수동 응집, 효소-결합 면역흡착제 항체(ELISA) 기술 및 방사면역분석법(RIA) 기술을 포함한(이로 한정되지는 않는다) 다양한 혈청학적 또는 면역학적 분석법에 의해 결정한다. 유사한 분석법들을 이용하여 체액 또는 조직 및 세포 추출물 중의 LMP의 존재를 검출한다.

당해 분야에 숙련된 자에게라면 단일특이성 항체를 생성하기 위한 전술한 방법들을 이용하여 LMP의 폴리펩타이드 단편, 전체 길이의 미완성 LMP 폴리펩타이드, 또는 그의 변이체 또는 대립인자에 특이적인 항체를 생성할 수 있음이 쉽게 명백할 것이다.

또 다른 태양으로, 본 발명은 HLMP-1의 대안적인 접합 변이체에 관한 것이다. 인간 심장 cDNA의 PCR 분석 결과 hLMP-1 서열의 325번 염기쌍과 444번 염기쌍 사이의 영역에서 HLMP-1과 상이한, HLMP-2 및 HLMP-3으로 불리는 2개의 HLMP 대체 접합 변이체에 대한 mRNA를 나타내었다. HLMP-2 서열은 상기 영역에서 119개 염기쌍 결실 및 17개 염기쌍의 삽입을 갖는다. 이러한 변화는 해독 구조를 유지하여 HLMP-1과 비교하여 총 34개 아미노산이 소실된(결실된 40개 아미노산과 6개의 삽입된 아미노산을 합하여) 423개 아미노산 단백질을 생성한다. HLMP-2는 HLMP-1에 존재하는 c-말단 LIM 영역을 함유한다.

HLMP-1과 비교하여, HLMP-3은 결실이 없으나, 444번 위치에서 동일한 17개 염기쌍 삽입을 갖는다. 상기 삽입은 판독 구조를 이동시켜 459 내지 461번 염기쌍에서 정지 코돈을 야기한다. HLMP-2 및 HLMP-3에 의해 암호화된 단백질의 예상 크기는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다.

3개의 접합 변이체의 조직 분포를 PCR 분석한 결과 이들은 상이한 조직에서 우세한 특정 이형질체(isoform)를 가지면서 구별되게 발현되는 것으로 나타났다.HLMP-1은 명백하게 백혈구, 비장, 폐, 태반 및 태아 간에서 발현되는 주된 형태이다. HLMP-2는 골격 근육, 골수 및 심장 조직에서 우세한 이형질체인 것으로 보인다. 그러나, HLMP-3는 조사한 어떤 조직에서도 우세한 이형질체가 아니었다.

2차 래트 조골세포 배양에서 HLMP-3의 과발현은 글루코코르티코이드(272±7) 및 HLMP-1(232±200)에서 보여진 효과와 유사한 골 결절 형성(287±56)을 유도하였다. HLMP-3는 C-말단 LIM 영역이 결여되어 있기 때문에, 골유도성 활성에 대한 영역이 필요하지 않다. 그러나, HLMP-2의 과발현은 결정 형성(11±3)을 유도하지 않았다. 이러한 데이터는 결실된 119개 염기쌍에 의해 암호화되는 아미노산들이 골유도에 필수적임을 시사한다. 상기 데이터는 또한 HLMP 접합 변이체의 분포가 조직-특이적 기능에 중요할 수 있음을 제시한다. 놀랍게도, HLMP-2는 2차 래트 조골세포 배양에서 스테로이드-유도된 조골세포 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, HLMP-2는 골 형성이 바람직하지 않는 임상적 상황에서 치료적 유용성을 가질 것이다.

1997년 7월 22일자로, pCMV2/RLMP로 표시된 벡터 중의 10-4/RLMP(10-4 클론/RLMP가 삽입된 벡터 pRc/CMV2이다)의 샘플을 미국 메릴랜드 20852 로크빌 파크론 드라이브 12301에 소재한 미국 종균 협회(American Type Culture Collection, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, ATCC)에 기탁하였다. 상기 기탁의 종균 승인 번호는 209153이다. 1998년 3월 19일자로, HLMP-1s가 삽입된 벡터 pHis-A의 샘플을 ATCC에 기탁하였다. 상기 기탁에 대한 종균 승인 번호는 209698이다. 2000년 4월 14일자로, 플라스미드 pHAhLMP-2(HLMP-2에 의해 인간 심장 근육 cDNA로부터 유도된cDNA 삽입물을 갖는 벡터 pHisA) 및 pHAhLMP-3(HLMP-3에 의해 인간 심장 근육 cDNA로부터 유도된 cDNA 삽입물을 갖는 벡터 pHisA)의 샘플을 부다페스트 조약의 조건 하에서 미국 버지니아 20110-2209 매너서스 유니버시티 블러버드 10801에 소재한 ATCC에 기탁하였다. 상기 기탁에 대한 승인 번호는 각각 PTA-1698 및 PTA-1699이다. 부다페스트 조약에 의해 요구되는 바와 같이 상기 기탁은 ATCC에서 최하 30년간 유지될 것이며 이들을 개시하는 특허의 권리부여시 대중에게 이용가능해질 것이다. 기탁물의 이용가능성은 정부의 작용에 의해 승인된 특허권의 훼손에 있어 본 발명을 실시하기 위한 인가를 구성하지 않음을 주지해야 한다.

본 발명의 핵산, 단백질 또는 항체를 평가함에 있어, 효소 분석, 단백질 정제 및 기타 통상적인 생화학적 방법들을 이용한다. DNA와 RNA는 각각 서던 블롯팅 및 노던 블롯팅 기술에 의해 분석한다. 전형적으로, 분석된 샘플들은 겔 전기영동에 의해 크기 분류된다. 그런 다음, 겔 중의 DNA 또는 RNA를 니트로셀룰로즈 또는 나일론 막으로 전이시킨다. 이어서, 겔에서의 샘플 패턴의 복제물인 블롯을 프로브로 하이브리드화시킨다. 전형적으로, 프로브는 바람직하게는³²P로 방사성표지화되지만, 프로브를 당해 분야에 공지된 다른 신호-발생 분자로 표지할 수 있다. 그런 다음, 문제의 특정 띠를 자가방사선사진술과 같은 검출 시스템에 의해 가시화할 수 있다.

본 발명의 바람직한 태양들을 예시하기 위해, 하기의 비-제한 실시예를 나타낸다. 이들 결과는 본 발명의 LIM 무기화 단백질 및 이들 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자를 이용하여 골의 형성을 유도하거나 증대시키는 가능성을 입증한다.

실시예 1: 두개관 세포 배양

래트 조골세포("ROB")로도 또한 알려진 래트 두개관 세포는 전술한 바와 같이 분만 20일전 래트로부터 얻었다[Boden et al.,Endocrinology, 137(8); 3401-3407(1996)]. 1차 배양물을 합류점까지 성장시키고(7일), 트립신화시키고, 첫 번째 계대배양 세포로서 6-웰 플레이트(1x10⁵세포/35 ㎜ 웰)로 옮겼다. 제 0일에 합류된 계대배양 세포를 7일간 더 성장시켰다. 제 0일에 시작하여, 매 3 또는 4일마다 층류 후드하에서 배지를 갈아주고 처리(Trm 및/또는 BMP)를 적용하였다. 표준 배양 프로토콜은 다음과 같았다: 1 내지 7일, MEM, 10% FBS, 50 g/㎖ 아스코르브산, ± 자극; 8 내지 14일, BGJb 배지, 10% FBS, 5 mM -GlyP(무기화를 가능하게 하는 무기 인산염의 공급원으로서). 골 결절 형성 및 오스테오칼신 분비의 종점 분석을 제 14일에 수행하였다. BMP의 용량은 연구된 모든 BMP에 대한 용량-반응 곡선에 대한 중간-범위 효과를 나타낸 상기 시스템에서의 파일럿 실험을 근거로 50 ng/㎖로 선택하였다.

실시예 2: 안티센스 처리 및 세포 배양

막골 형성 동안 LMP-1의 잠재적인 기능 역할을 조사하기 위해, LMP-1 mRNA번역을 차단하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하고 글루코코르티코이드에 의해 개시된 분화가 일어난 2차 조골세포 배양물을 처리하였다. RLMP 발현의 억제는 추정상의 번역 개시 부위에 걸쳐 있는 25 bp 서열(서열 번호: 42)에 상응하는 매우 특이성 안티센스 올리고뉴클레오티드(알려진 래트 서열에 대해 큰 상동성을 갖지 않음)에 의해 달성되었다. 대조용 배양물은 올리고뉴클레오티드를 주입하지 않거나 센스 올리고뉴클레오티드를 주입하였다. 실험은 리포펙타민의 존재(예비 배양) 및 부재 하에 수행하였다. 간략히, 22 g의 센스 또는 안티센스 RLMP 올리고뉴클레오티드를 실온에서 MEM 중에서 45 분간 배양하였다. 상기 배양 후에, 추가의 MEM 또는 예비 배양된 리포펙타민/MEM(7%(v/v); 실온에서 45 분간 배양)을 가하여 0.2 M의 올리고뉴클레오티드 농도를 달성하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15 분간 배양하였다. 이어서, 올리고뉴클레오티드 혼합물을 적절한 배지, 즉, MEM/아스코르베이트/±Trm과 혼합하여 0.1 M의 최종 올리고뉴클레오티드 농도를 달성하였다.

세포를 적절한 올리고뉴클레오티드의 존재 또는 부재 하에 적절한 배지(±자극)를 사용하여 배양하였다. 원래 리포펙타민과 함께 배양된 배양물에 배양(37 ℃; 5% CO₂)한 지 4 시간 후에 리포펙타민이나 올리고뉴클레오티드를 함유하지 않는 배지를 재공급하였다. 모든 배양물, 특히 올리고뉴클레오티드를 투여한 배양물을 24 시간마다 재공급하여 올리고뉴클레오티드 수준을 유지하였다.

LMP-1 안티센스 올리고뉴클레오티드는, BMP-6 올리고뉴클레오티드의 효과와유사하게, 무기화된 결절 형성 및 오스테오칼신 분비를 용량-의존성 방식으로 억제하였다. 조골세포 분화에 있어 LMP-1 안티센스 차단은 외인성 BMP-6의 첨가에 의해 해제되지 않았지만, BMP-6 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제는 BMP-6의 첨가에 의해 역전되었다. 상기 실험은 또한 조골세포 분화 경로에서 BMP-6에 대한 LMP-1의 상위 위치를 확인하였다. LMP-1 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 1차 래트 조골세포 배양물에서 자발적인 조골세포 분화를 억제하였다.

실시예 3: 무기화된 골 결절 형성의 정량화

실시예 1 및 2에 따라 제조된 ROB의 배양물을 밤새 70% 에탄올 중에서 고정시키고 폰 코사(von Kossa) 은 염색액으로 염색하였다. 반-자동화 컴퓨터 비디오 영상 분석 시스템을 이용하여 각 웰에서의 결절 수 및 결절 면적을 정량화하였다[Boden et al.,Endocrinology, 137(8), 3401-3407(1996)]. 이어서, 상기 값을 나누어 결절 당 면적 값을 계산하였다. 상기 자동화 과정은 수동 계수 기법으로 확인되었으며 0.92의 상관 계수를 나타내었다(p<0.000001). 모든 데이터는 각각의 조건에서 5 또는 6개 웰로부터 계산된 평균의 평균 ± 표준 오차(S.E.M)로서 나타내었다. 각각의 실험은 상이한 두개관 제제로부터 얻은 세포를 사용하여 2회 이상 확인하였다.

실시예 4: 오스테오칼신 분비의 정량화

배지 중 오스테오칼신 수준은 문헌 [Nanes et al.,Endocrinology, 127, 588(1990)]에 기술된 바와 같이 래트 오스테오칼신의 C-말단 노나펩타이드에 대해 본 실험실에서 산출한 단일특이성 다클론성 항체(Pab)를 사용하여 경쟁적 방사면역분석법을 이용하여 측정하였다. 간략히, 1 g의 노나펩타이드를 락토퍼옥시다제 방법에 의해 1 mCi¹²⁵I-Na로 요오드화하였다. 200 ℓ의 분석용 완충액(0.02 M 인산 나트륨, 1 mM EDTA, 0.001% 티메로살, 0.025% BSA)을 함유하는 튜브에, 분석 완충액 중 100 ℓ/튜브에서 세포 배양물 또는 오스테오칼신 표준물(0 내지 12,000 fmole)로부터 취한 배지를 공급하였다. 이어서, Pab(1:40,000, 100 ℓ)를 가한 다음 요오드화된 펩타이드(12,000 cpm; 100 ℓ)를 가하였다. 비-특이적 결합에 대해 시험된 샘플을 유사하지만 항체를 포함시키지 않고 제조하였다.

결합된 PAB 및 유리 PAB를 700 ℓ의 양 항-토키 IgG를 첨가하여 분리한 후 4 ℃에서 18 시간동안 배양하였다. 샘플을 1200 rpm으로 45 분간 원심분리한 후, 상등액을 경사분리하고 침전물을 감마 계수기에서 계수하였다. 오스테오칼신 값을 fmole/100 ℓ로 기록하고, 이어서 상기 값을 100으로 나누어 pmole/㎖ 배지(3일 생성)로 전환시켰다. 값은 각각의 조건에 대해 5 내지 6개 웰에 대해 3벌씩 측정한 것의 평균 ± S.E.M.으로 나타내었다. 각각의 실험은 상이한 두개관 제제로부터 얻은 세포를 사용하여 2회 이상 확인하였다.

실시예 5: 시험관내에서 무기화에 대한 Trm 및 RLMP의 영향

비-자극 세포 배양 시스템에서의 골 결절의 전체 생산에 대한 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뚜렷한 영향은 거의 없었다. 그러나, ROB를 Trm으로 자극한 경우, RLMP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 95%보다 높게 결절의 무기화를 억제하였다. 올리고뉴클레오티드-처리된 배양물에 대한 외인성 BMP-6의 첨가는 RLMP-안티센스-처리된 결절의 무기화를 돕지 못했다.

오스테오칼신은 오랫동안 골 무기화와 같은 의미였으며, 오스테오칼신 수준은 결절 생성 및 무기화와 상관되었었다. RLMP-안티센스 올리고뉴클레오티드는 오스테오칼신 생성을 현저히 감소시키지만, 안티센스-처리된 배양물에서의 결절 수는 별로 변하지 않는다. 이 경우, 외인성 BMP-6의 첨가만이 RLMP-안티센스-처리된 배양물에서의 오스테오칼신의 생성을 10 내지 15% 상승시켰다. 이것은 RLPM의 작용이 BMP-6의 하위에 있으며 BMP-6보다 더 특이적임을 시사한다.

실시예 6: RNA의 회수 및 정제

ROB(6-웰 배양 접시에서 실시예 1 및 2에 따라 제조함)의 이중 웰로부터 세포 RNA를 4 M 구아니딘 이소티오시아네이트(GIT) 용액을 사용하여 회수하여 통계적인 3벌을 얻었다. 간략히, 배양 상등액을 웰로부터 흡출한 다음, 이것을 이중 웰 회수물 당 0.6 ㎖의 GIT 용액으로 덮었다. GIT 용액을 첨가한 후에, 플레이트를 5 내지 10 초간(가능한 일정하게) 와류시켰다. 샘플을 더 처리하기 전에 7일까지 -70 ℃에서 보관하였다.

RNA는 문헌 [Sambrook et al.,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., chapter 7.19, Cold Spring Harbor Press(1989)]에 따른 표준 방법을 약간 변형시켜 정제하였다. 간략히, 해동된 샘플에 60 ℓ의 2.0 M 아세트산 나트륨(pH 4.0), 550 ℓ의 페놀(수 포화) 및 150 ℓ의 클로로포름:이소아밀 알콜(49:1)을 공급하였다. 진탕시킨 후에, 샘플을 원심분리(10000 x g; 20 분; 4 ℃)하고, 수성상을 새로운 튜브로 옮기고, 600 ℓ의 이소프로판올을 가하고, RNA를-20 ℃에서 밤새 침전시켰다.

밤새 배양한 후에, 샘플을 원심분리(10000 x g; 20 분)하고 상등액을 완만하게 흡출하였다. 펠릿을 400 ℓ의 DEPC-처리된 물에 재현탁하고, 페놀:클로로포름(1:1)으로 1회 추출하고, 클로로포름:이소아밀 알콜(24:1)로 추출하고, 40 ℓ의 아세트산 나트륨(3.0 M, pH 5.2) 및 1.0 ㎖의 무수 에탄올을 가한 후에 -20 ℃에서 밤새 침전시켰다. 세포 RNA를 회수하기 위해, 샘플을 원심분리(10000 x g; 20 분)하고, 70% 에탄올로 1회 세척하고, 5 내지 10 분간 공기 건조시키고, 20 ℓ의 DEPC-처리된 물에 재현탁하였다. RNA 농도는 분광계로 측정된 흡광도로부터 계산하였다.

실시예 7: 역 전사-중합효소 연쇄 반응

가열시킨 전체 RNA(65 ℃에서 5 분간 총 부피 10.5 ℓ의 DEPC-H₂O 중 5 g)를 4 ℓ의 5X MMLV-RT 완충액, 2 ℓ의 dNTP, 2 ℓ의 dT17 프라이머(10 pmol/㎖), 0.5 ℓ의 RNAsin(40 U/㎖) 및 1 ℓ의 MMLV-RT(200 유니트/ℓ)를 함유하는 튜브에 가하였다. 샘플을 37 ℃에서 1 시간동안 배양한 후 95 ℃에서 5 분간 배양하여 MMLV-RT를 불활성화시켰다. 샘플을 80 ℓ의 물을 첨가하여 희석하였다.

역전사 샘플(5 ℓ)을 표준 방법을 이용하여 중합효소 연쇄 반응시켰다(50 ℓ 총부피). 간략히, 샘플을 물 및 적절한 양의 PCR 완충액(25 mM MgCl₂, dNTP, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAP, 하우스키핑 유전자)에 대한 순방향 및 역방향 프라이머 및/또는 BMP-6,³²P-dCTP 및 Taq 중합효소)를 함유하는튜브에 가하였다. 달리 언급하지 않는 한, 프라이머는 22 주기(94 ℃, 30 초; 58 ℃, 30 초; 72 ℃, 20 초)에서 일관되게 실시되도록 표준화시켰다.

실시예 8: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 인 영상 분석법에 의한 RT-PCR 생성물의 정량화

RT-PCR에 5 ℓ/튜브의 로딩 염료를 공급하고, 혼합하고, 65 ℃에서 10 분간 가열하고 원심분리하였다. 각각의 반응물 10 ℓ를 표준 조건하에서 PAGE(12% 폴리아크릴아미드:비스; 15 V/웰; 일정 전류)에 적용하였다. 이어서, 겔을 겔 보존 완충액(10%(v/v) 글리세롤, 7%(v/v) 아세트산, 40%(v/v) 메탄올, 43% 탈이온수) 중에서 30 분간 배양하고, 진공하에 1 내지 2 시간동안 건조(80 ℃)하고 전자적으로 증강된 형광 영상 시스템으로 6 내지 24 시간동안 전개시켰다. 가시화된 띠를 분석하였다. 띠 당 총수를 그래프로 플롯팅하였다.

실시예 9: 시차 표시 PCR

RNA를 글루코코르티코이드(Trm, 1 nM)로 자극시킨 세포에서 추출하였다. 가열시킨, DNA 분해효소 처리된 전체 RNA(65 ℃에서 5 분간 DEPC-H₂O 중 총 부피 10.5 ℓ 중 5 g)를, H-T₁₁M(서열 번호: 4)을 MMLV-RT 프라이머로 사용한 것을 제외하고 실시예 7에서 기술한 바와 같이 역 전사시켰다. 생성된 cDNA를 다양한 시판 프라이머 세트(예를 들면, H-T₁₁G(서열 번호: 4) 및 H-AP-10(서열 번호: 5); 미국 테네시주 내쉬빌 소재의 젠헌터 코포레이션(GenHunter Corp.))를 사용하는 것을 제외하고 전술한 바와 같이 PCR-증폭시켰다. 방사성표지된 PCR 생성물을 DNA 서열화 겔상에서 겔 전기영동에 의해 분류하였다. 전기영동후에, 생성된 겔을 진공하에 건조하고, 자가방사선사진을 밤새 노출시켰다. 구별되게 발현된 cDNA를 나타내는 띠를 겔로부터 절제하여 문헌 [Conner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 273(1983)]의 방법을 이용하여 PCR에 의해 재증폭시켰다. PCR 재증폭 생성물을 벡터 PCR-II(TA 클로닝 키트; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(InVitrogen))에 클로닝하였다.

실시예 10: UMR 106 래트 골육종 세포 cDNA 라이브러리의 검색

UMR 106 라이브러리(2.5 x 10¹⁰pfu/㎖)를 아가 플레이트 상에 5 x 10⁴pfu/㎖로 평판배양하고 플레이트를 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 필터 막을 2 분간 플레이트 위에 놓았다. 일단 제거되면, 필터를 변성시키고 헹구고 건조하고 UV 교차-결합시켰다. 이어서, 필터를 42 ℃에서 예비-하이브리드화 완충액(2X PIPES(pH 6.5), 5% 포름아미드, 1% SDS 및 100 g/㎖의 변성된 연어 정액 DNA) 중에서 2 시간동안 배양하였다. 260개 염기쌍의 방사성표지된 프로브(서열 번호: 3; 무작위적 초회항원자극에 의해³²P 표지됨)를 전체 하이브리드화 혼합물/필터에 가한 후 42 ℃에서 18 시간동안 하이브리드화시켰다. 막을 실온에서 1회(10 분, 1 x SSC, 0.1% SDS) 세척하고, 55 ℃에서 3회(15 분, 0.1 x SSC, 0.1% SDS) 세척하였다.

이들을 세척한 후에, 막을 전술한 바와 같이 자가방사선사진술로 분석하였다. 양성 클론을 플라크 정제하였다. 상기 절차를 두 번째 필터를 가지고 4 분간반복하여 가짜 양성물을 최소화하였다. 플라크-정제된 클론을 람다 SK(-) 파지미드로서 탈회하였다. 클로닝된 cDNA를 하기에서 기술하는 바와 같이 서열화하였다.

실시예 11: 클론의 서열화

클로닝된 cDNA 삽입물을 표준 방법에 의해 서열화하였다[Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience(1988)]. 간략히, 적절한 농도의 종료 혼합물, 주형 및 반응 혼합물을 적절한 순환 프로토콜(95 ℃, 30 초; 68 ℃, 30 초; 72 ℃, 60 초; x 25)에 적용하였다. 정지 혼합물을 가하여 서열화 반응을 종료하였다. 92 ℃에서 3 분간 가열한 후에, 샘플을 변성 6% 폴리아크릴아미드 서열화 겔(29:1 아크릴아미드:비스-아크릴아미드) 위에 로딩하였다. 샘플을 60 V, 일정한 전류에서 약 4 시간동안 전기영동하였다. 전기영동 후에, 겔을 진공하에 건조하고 자가방사선촬영하였다.

자가방사선사진을 수동으로 분석하였다. 생성된 서열을 생략성 파라미터를 갖는 BLASTn 프로그램 세트를 이용하여 국립 생물공학 정보 센터(the National Center for Biotechnology Information; NIH, 메릴랜드주 베쎄다 소재; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 의해 유지되는 데이터베이스에 대해 검색하였다. 서열 데이터를 근거로 하여, 새로운 서열화 프라이머를 제작하고 전체 유전자가 서열화될 때까지 상기 과정을 반복하였다. 모든 서열은 양쪽 방향으로 최소한 3회 확인하였다.

뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 또한 PCGENE 소프트웨어 패키지(버전 16.0)를 이용하여 분석하였다. 뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 % 값을 하기의파라미터들을 이용하여 프로그램 NALIGN으로 계산하였다: 비-합치 뉴클레오티드의 중량, 10; 비-합치 간극의 중량, 10; 고려된 뉴클레오티드의 최대 수, 50; 및 고려된 뉴클레오티드의 최소 수, 50.

아미노산 서열의 경우, 상동성 % 값은 PALIGN을 이용하여 계산하였다. 10의 값을 개방 간극 평가 및 단위 간극 평가 둘 다에 대해 선택하였다.

실시예 12: RLMP cDNA의 클로닝

실시예 9에서 기술한 시차 표시 PCR 증폭 생성물은 대략 260개 염기쌍의 주요 띠를 함유하였다. 상기 서열을 이용하여 래트 골육종(UMR 106) cDNA 라이브러리를 검색하였다. 양성 클론을 내포 프라이머 분석에 적용하여 전체 길이 cDNA를 증폭시키는데 필요한 프라이머 서열을 수득하였다(서열 번호: 11, 12, 29, 30 및 31). 추가의 연구를 위해 선택된 상기 양성 클론들 중 하나를 클론 10-4로 표시하였다.

내포 프라이머 분석에 의해 결정된 클론 10-4에서 전체 길이 cDNA의 서열 분석 결과, 클론 10-4는 시차 표시 PCR에 의해 확인된 원래의 260 염기쌍 단편을 함유하는 것으로 나타났다. 클론 10-4(1696 염기쌍; 서열 번호: 2)는 457개 아미노산을 갖는 단백질을 암호화하는 1371개 염기쌍(서열 번호: 1)의 개방된 해독 구조를 함유한다. 종료 코돈, TGA는 1444 내지 1446번 뉴클레오티드에 존재한다. 1675 내지 1680번 뉴클레오티드 및 인접 폴리(A)⁺꼬리에서의 폴리아데닐화 신호는 3'-비코딩 영역에 존재하였다. 서열 번호: 1에서 113 내지 116번 및 257 내지 259번 아미노산 위치에 각각 2개의 잠재적인 N-글리코실화 부위, Asn-Lys-Thr 및 Asn-Arg-Thr이 존재하였다. 2개의 잠재적인 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 포스포릴화 부위, Ser 또는 Thr은 각각 191번 및 349번 아미노산 위치에서 발견되었다. 3, 115, 166, 219 및 442번 아미노산 부위에서 5개의 잠재적인 단백질 키나제 C 포스포릴화 부위, Ser 또는 Thr이 존재하였다. 하나의 잠재적인 ATP/GTP 결합 부위 모티프 A(P-루프), Gly-Gly-Ser-Asn-Asn-Gly-Lys-Thr은 272 내지 279번 아미노산 위치에서 결정되었다.

또한, 2개의 고도로 보존된 추정상의 LIM 영역은 341내지 391 및 400 내지 451번 아미노산 위치에서 나타났다. 상기 새로 확인된 래트 cDNA 클론에서의 추정상의 LIM 영역은 다른 알려진 LIM 단백질의 LIM 영역과의 상당한 상동성을 나타내었다. 그러나, 다른 래트 LIM 단백질과의 전체적인 상동성은 25% 미만이었다. RLMP(10-4로도 또한 표시함)는 인간의 불가사의 단백질(미국 특허 제 5,504,192 호 참조)에 대해 78.5% 아미노산 상동성을 가지나, 그의 가장 근사한 래트 동족체인 CLP-36 및 RIT-18에 대해서는 각각 단지 24.5% 및 22.7%의 아미노산 상동성을 갖는다.

실시예 13: RLMP 발현의 노던 블롯 분석

실시예 1 및 2에 따라 제조된 ROB로부터 취한 전체 RNA 30 g을 1% 아가로스 평판 겔에서의 포름알데하이드 겔 전기영동에 의해 크기 분류하고 삼투압적으로 나일론 막에 트랜스블롯팅하였다. 상기 블롯을 무작위적 초회항원자극에 의해³²P-dCTP로 표지된 전체 길이의 10-4 cDNA의 600개 염기쌍EcoR1 단편으로 프로브하였다.

노던 블롯 분석 결과 RLMP 프로브와 하이브리드화된 1.7 kb mRNA 종이 나타났다. RLMP mRNA는 BMP-6에 24 시간 노출시킨 후에 ROB에 있어 대략 3.7배 상향 조절되었다. 24 시간째에 BMP-2 또는 BMP-4-자극된 ROB에서는 어떤 RLMP 발현의 상향 조절도 나타나지 않았다.

실시예 14: 통계학적 방법

각각의 기록된 결절/오스테오칼신 결과에 대해, 대표적인 실험으로부터 5 내지 6웰로부터 취한 데이터를 이용하여 평균치 ± S.E.M.을 계산하였다. 결절 총계, 무기화된 면적 및 오스테오칼신의 동시 그래프화가 가능하도록 각각의 파라미터에 대한 최대 값으로 표준화된 데이터를 가지고 그래프를 도시할 수 있다.

각각의 기록된 RT-PCR, RNA 분해효소 보호 분석 또는 웨스턴 블롯 분석에 대해, 대표적인 실험들의 3벌식의 샘플로부터 얻은 데이터를 이용하여 평균치 ± S.E.M.을 결정하였다. 그래프는 제 0일 또는 음성 대조군으로 표준화되고 대조값보다 높은 배수 증가로서 나타내어 도시될 수 있다.

통계학적 유의성은 적절한 대로 본페로니(Bonferroni)의 hoc-후 다중 비교 보정에 의한 분산의 일원 분석법을 이용하여 평가하였다[D.V. Huntsberger, "The Analysis of Variance",Elements of Statistical Variance, P. Billingsley(ed.), pp. 298-330, Allyn & Bacon Inc., Boston, MA(1977) and Sigmastat, Jandel Scientific, Corte Madera, CA]. 유의성에 대한 알파 수준은 p<0.05로서 정의하였다.

실시예 15: 웨스턴 블롯 분석에 의한 래트 LIM 무기화 단백질의 검출

문헌 [England et al.,Biochim. Biophys. Acta, 623, 171(1980) and Timmer et al.,J. Biol. Chem., 268, 24863(1993)]의 방법에 따라 다클론성 항체를 제조하였다.

HeLa 세포를 pCMV2/RLMP로 형질감염시켰다. 문헌 [Hair et al.,Leukemia Research, 20, 1(1996)]의 방법에 따라 형질감염된 세포로부터 단백질을 회수하였다. 천연 RLMP의 웨스턴 블롯 분석은 문헌 [Towbin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350(1979)]에 기술된 바와 같이 수행하였다.

실시예 16: 래트 LMP-유니크(RLMPU) 유도된 인간 PCR 생성물의 합성

래트의 LMP-1 cDNA의 서열을 근거로, 순방향 및 역방향 PCR 프라이머(서열 번호: 15 및 16)를 합성하고 유일한 223개 염기쌍 서열을 래트 LMP-1 cDNA로부터 PCR 증폭시켰다. 유사한 PCR 생성물을 동일한 PCR 프라이머를 사용하여 인간 MG63 골육종 세포 cDNA로부터 단리하였다.

T-75 플라스크에서 성장시킨 MG63 골육종 세포로부터 RNA를 회수하였다. 배양 상등액을 흡출에 의해 제거하고 플라스크를 두벌 당 3.0 ㎖의 GIT 용액으로 덮고 5 내지 10 초간 와류시키고, 생성된 용액을 1.5 ㎖의 에펜도르프 튜브(0.6 ㎖/튜브를 갖는 5개의 튜브)로 옮겼다. RNA를 표준 방법을 약간 변형시켜 정제하였다(예를 들면, 문헌 [Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, chapter 7, page 19, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) andBoden et al.,Endocrinology, 138, 2820-2828(1997)]을 참조하시오). 간략히, 0.6 ㎖의 샘플에 60 ℓ의 2.0 M 아세트산 나트륨(pH 4.0), 550 ℓ의 수-포화 페놀 및 150 ℓ의 클로로포름:이소아밀 알콜(49:1)을 공급하였다. 상기 시약을 첨가한 후에, 샘플을 진탕시키고, 원심분리(10000 x g; 20 분; 4 ℃)하고 수성상을 새로운 튜브로 옮겼다. 이소프로판올(600 ℓ)을 가하고 RNA를 -20 ℃에서 밤새 침전시켰다. 샘플을 원심분리(10000 x g; 20 분)하고 상등액을 완만하게 흡출하였다. 펠릿을 400 ℓ의 DEPC-처리된 물에 재현탁하고, 페놀:클로로포름(1:1)으로 1회 추출하고, 클로로포름:이소아밀 알콜(24:1)로 추출하고, -20 ℃에서 40 ℓ의 아세트산 나트륨(3.0 M, pH 5.2) 및 1.0 ㎖의 무수 에탄올 중에서 밤새 침전시켰다. 침전 후에, 샘플을 원심분리(10000 x g; 20 분)하고, 70% 에탄올로 1회 세척하고, 5 내지 10 분간 공기 건조시키고, 20 ℓ의 DEPC-처리된 물에 재현탁하였다. RNA 농도는 흡광도로부터 계산하였다.

전체 RNA(DEPC-H₂O 중의 총 부피 10.5 ℓ 중 5 g)를 65 ℃에서 5 분간 가열한 다음, 4 ℓ의 5X MMLV-RT 완충액, 2 ℓ의 dNTP, 2 ℓ의 dT17 프라이머(10 pmol/㎖), 0.5 ℓ의 RNAsin(40 U/㎖) 및 1 ℓ의 MMLV-RT(200 유니트/ℓ)를 함유하는 튜브에 가하였다. 반응물을 37 ℃에서 1 시간동안 배양하였다. 그런 후에, 95 ℃에서 5 분간 배양하여 MMLV-RT를 불활성화시켰다. 샘플을 80 ℓ의 물을 첨가하여 희석하였다.

전사 샘플(5 ℓ)을 표준 방법을 이용하여 중합효소 연쇄 반응시켰다(50 ℓ총부피)[Boden et al.,Endocrinology, 138, 2820-2828(1997); Ausubel et al., "Quantitation of rare DNAs by the polymerase chain reaction",Current Protocols in Molecular Biology, chapter 15.31-1, Wiley & Sons, Trenton, NJ(1990)]. 간략히, 샘플을 물 및 적절한 양의 PCR 완충액(25 mM MgCl₂, dNTP, 순방향 및 역방향 프라이머(RLMPU에 대한 것임; 서열 번호: 15 및 16),³²P-dCTP 및 DNA 중합효소)를 함유하는 튜브에 가하였다. 프라이머는 방사능 띠 검출에 대해서는 22 주기 및 검색 프로브로 사용하기 위한 PCR 생성물의 증폭을 위해서는 33 주기에서 일관되게 실시되도록 고안하였다(94 ℃, 30 초; 58 ℃, 30 초; 72 ℃, 20 초).

아가로스 겔-정제된 MG63 골육종 유도된 PCR 생성물을 서열화하여 RLMPU PCR 생성물에 대해 95% 이상 상동성인 서열을 수득하였다. 상기 서열은 HLMP 유일 영역(HLMPU; 서열 번호: 6)으로 표시하였다.

실시예 17: 역전사효소 유도된 MG63 cDNA의 검색

검색은 실시예 7에서 기술한 바와 같은 특이성 프라이머(서열 번호: 16 및 17)를 사용하여 PCR에 의해 수행하였다. 717개 염기쌍 MG63 PCR 생성물을 아가로스 겔 정제하고 해당 프라이머를 사용하여 서열화하였다(서열 번호: 12, 15, 16, 17, 18, 27 및 28). 서열들은 양쪽 방향으로 최소 2회 확인하였다. MG63 서열을 서로에 대해 정렬시킨 다음 전체 길이의 래트 LMP cDNA에 대해 정렬시켜 부분적인 인간 LMP cDNA 서열을 수득하였다(서열 번호: 7).

실시예 18: 인간 심장 cDNA 라이브러리의 검색

노던 블롯 실험을 근거로 하여, LMP-1이 인간 심장 근육을 포함하여 여러 상이한 조직에서 상이한 수준으로 발현됨을 측정하였다. 그러므로, 인간 심장 cDNA 라이브러리를 조사하였다. 라이브러리를 아가 플레이트(LB 바닥 아가) 위에 5 x 10⁴pfu/㎖로 평판배양하고 플레이트를 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. 필터 막을 2 분간 플레이트 위에 놓았다. 그런 다음, 필터를 변성시키고 헹구고 건조하고 UV 교차-결합시키고, 42 ℃에서 예비-하이브리드화 완충액(2X PIPES(pH 6.5), 5% 포름아미드, 1% SDS 및 100 g/㎖의 변성된 연어 정액 DNA) 중에서 2 시간동안 배양하였다. 방사성표지된, LMP-유일한 223 염기쌍 프로브(³²P, 무작위적 초회항원자극 표지화; 서열 번호: 6)를 가하고 42 ℃에서 18 시간동안 하이브리드화시켰다. 하이드리드화 후에, 막을 실온에서 1회(10 분, 1 x SSC, 0.1% SDS) 세척하고, 55 ℃에서 3회(15 분, 0.1 x SSC, 0.1% SDS) 세척하였다. 자가방사선사진술에 의해 확인된, 이중-양성 플라크-정제된 심장 라이브러리 클론을 제조업자의 프로토콜(캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진(Stratagene))에 따라 람다 파지미드로서 탈회하였다.

양성 클론의 제한효소 절단에 의해 다양한 크기의 cDNA 삽입물을 얻었다. 길이가 600개 염기쌍보다 큰 삽입물을 서열화에 의한 초기 검색을 위해 선택하였다. 상기 삽입물을 실시예 11에서 기술한 바와 같은 표준 방법에 의해 서열화하였다.

하나의 클론, 7번 클론을 또한 서열 번호: 11 내지 14, 16 및 27에 상응하는 프라이머를 사용하여 자동화된 서열 분석에 적용하였다. 상기 방법에 의해 수득된 서열은 통상적으로 97 내지 100% 상동성이었다. 클론 7(심장 라이브러리로부터의 부분 인간 LMP-1 cDNA; 서열 번호: 8)은 번역 영역에서 래트 LMP cDNA에 대해 87% 이상 상동성인 서열을 함유하였다.

실시예 19: 전체 길이 인간 LMP-1 cDNA의 결정

MG63 인간 골육종 세포 cDNA 서열과 인간 심장 cDNA 클론 7 서열의 중복 영역을 이용하여 상기 두 서열을 정렬시키고 1644개 염기쌍의 완전한 인간 cDNA 서열을 유도하였다. PCGENE 소프트웨어 패키지 중의 프로그램인 NALIGN을 이용하여 두 서열을 정렬시켰다. 두 서열의 중복 영역은 MG63 cDNA 중의 672번 뉴클레오티드(서열 번호: 7)에서, 상응하는 516번 뉴클레오티드(서열 번호: 8)에서의 "G" 대신에 "A"를 갖는 클론 7로 단일 뉴클레오티드 치환된 것을 제외하고 완전한 상동성을 갖는, 대략 360개 염기쌍으로 이루어졌다.

2개의 정렬된 서열을 MG63 골육종 cDNA 클론의 "G" 치환을 이용하여, PCGENE의 또 다른 서브프로그램인 SEQIN을 이용하여 결합시켰다. 생성된 서열은 서열 번호: 9로 나타내었다. 래트 LMP-1 cDNA를 갖는 새로운 인간-유도된 서열의 정렬은 NALIGN을 사용하여 달성하였다. 전체 길이의 인간 LMP-1 cDNA 서열(서열 번호: 9)은 래트 LMP-1 cNDA 서열의 번역된 부분에 대해 87.3% 상동성이다.

실시예 20: 인간 LMP-1의 아미노산 서열의 결정

인간 LMP-1의 추정 아미노산 서열을 PCGENE 서브프로그램 TRANSL을 사용하여결정하였다. 서열 번호: 9에서의 개방 해독 구조는 457개 아미노산(서열 번호: 10)을 포함하는 단백질을 암호화한다. PCGENE 서브프로그램 Palign을 이용하여, 인간 LMP-1 아미노산 서열은 래트 LMP-1 아미노산 서열에 대해 94.1% 상동성인 것으로 밝혀졌다.

실시예 21: 인간 LMP cDNA의 5 프라임 미번역 영역의 결정

cDNA 말단(5' RACE) 프로토콜의 5' 신속 증폭을 이용하여 MG63 전체 RNA의 내포된 RT-PCR에 의해 MG63 5' cDNA를 증폭시켰다. 상기 방법은 3' 말단에 2개의 변성 뉴클레오티드 위치를 갖는 로크-도킹(lock-docking) 올리고(dT) 프라이머를 이용한 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 포함하였다[Chenchik et al.,CLONTECHniques, X, 5(1995); Borson et al.,PC Methods Applic., 2, 144(1993)]. 두 번째 가닥 합성은에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) DNA 중합효소 I, RNA 분해효소 H, 및이. 콜라이DNA 리가제의 칵테일을 사용하여 문헌 [Gubler et al.,Gene, 25, 263(1983)]의 방법에 따라 수행한다. T4 DNA 중합효소를 사용하여 평활 말단을 생성한 후에, 이중 가닥 cDNA를 단편 (5'-CTAATACGACTCACTATA GGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3')(서열 번호: 19)에 접합시켰다. RACE 전에, 어댑터-접합된 cDNA를 마라톤(Marathon) RACE 반응에 적합한 농도로 희석하였다(1:50). 이어서, 어댑터-접합된 이중-가닥 cDNA를 특이적으로 클로닝할 준비를 하였다.

센스 프라이머로서 어댑터-특이성 올리고뉴클레오티드, 5'-CCATCCTAA TACGACTCACTATAGGGC-3' 및 실시예 16에서 기술한 유일한 영역으로부터 유전자 특이성 프라이머(Gene Specific Primer, GSP)를 사용하여 PCR의 첫 회전을 수행하였다.PCR의 2 회전은 내포된 프라이머 GSP1-HLMPU(안티센스/역방향 프라이머)(서열 번호: 23) 및 GSP2-HLMPUF(서열 번호: 24)(실시예 16 참조; 센스/순방향 프라이머)를 이용하여 수행하였다. PCR은 항체-매개되거나, 그렇지 않으면 표준의 열-개시 프로토콜을 이용하는 시판 키트(어드밴티지(Advantage) cDNA PCR 코어 키트; 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론 테크 래보러토리즈 인코포레이티드(Clone Tech Laboratories Inc.))를 사용하여 수행하였다. MG63 cDNA에 대한 PCR 조건은 초기 열-개시 변성(94 ℃, 60 초)에 이어 94 ℃, 30 초; 60 ℃, 30 초; 68 ℃, 4 분; 30 주기를 포함하였다. 첫 회 PCR 생성물은 길이가 대략 750개 염기쌍인 반면 내포된 PCR 생성물은 대략 230개 염기쌍이었다. 첫 회의 PCR 생성물은 선형화된 pCR 2.1 벡터(3.9 kb)에 클로닝하였다. 삽입물을 M13 순방향 및 역방향 프라이머(서열 번호: 11; 서열 번호: 12)를 이용하여 양 방향으로 서열화하였다.

실시예 22: 5 프라임 UTR을 사용한 전체 길이 인간 LMP-1 cDNAdml 결정

중복 MG63 인간 골육종 세포 cDNA 5'-UTR 서열(서열 번호: 21), MG63 717 염기쌍 서열(실시예 17; 서열 번호: 8) 및 인간 심장 cDNA 클론 7 서열(실시예 18)을 정렬시켜 1704개 염기쌍의 새로운 인간 cDNA 서열(서열 번호: 22)을 유도하였다. 상기 정렬은 NALIGN(PCGENE 및 Omiga 1.0 둘 다; 인텔리제네틱스(Intelligenetics))을 사용하여 수행하였다. 중복 서열은 100% 상동성을 갖는 전체 717 염기쌍 영역(실시예 17)로 거의 이루어졌다. 정렬된 서열의 연결은 SEQIN을 사용하여 달성하였다.

실시예 23: LIM 단백질 발현 벡터의 구축

실시예 17 및 18에 기술된 서열을 가지고 pHIS-5ATG LMP-1s 발현 벡터를 구축하였다. 717개 염기쌍 클론(실시예 17; 서열 번호: 7)을ClaI 및EcoRV로 절단하였다. 작은 단편(약 250개 염기쌍)을 겔 정제하였다. 클론 7(실시예 18; 서열 번호: 8)을ClaI 및XbaI으로 절단하고, 1400개 염기쌍 단편을 겔 정제하였다. 단리된 250개 염기쌍 및 1400개 염기쌍 제한 단편들을 접합시켜 약 1650개 염기쌍의 단편을 생성하였다.

클론 7에서의 단일 뉴클레오티드 치환(717개 염기쌍 PCR 서열 및 원래의 래트 서열에 대해)으로 인해, 번역된 염기쌍 672에서 정지 코돈이 야기되었다. 상기 정지 코돈으로 인해, 절단된(짧은) 단백질, 즉 LMP-1s가 암호화되었다. 이것은 발현 벡터(서열 번호: 32)에 사용된 구조물이었다. 서열 번호: 32를 5' RACE 서열(서열 번호: 21)과 함께 정렬시킴으로써 5' UTR을 갖는 전체 길이 cDNA 서열(서열 번호: 33)을 생성하였다. 이어서, LMP-1s의 아미노산 서열(서열 번호: 34)을 223개 아미노산 단백질로서 추정하고 웨스턴 블롯(실시예 15에서와 같이)으로 확인하여 약 23.7 kD의 예상된 분자량에서 실시하였다.

pHis-ATG 벡터(캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)을EcoRV 및XbaI으로 절단하였다. 벡터를 회수한 다음, 1650개 염기쌍 제한 단편을 선형화된 pHis-ATG에 접합시켰다. 접합 생성물을 클로닝하고 증폭시켰다. HLMP-1s 삽입물을 갖는 pHIS-A로도 또한 표시하는 pHis-ATG-LMP-1s 발현 벡터를 표준 방법에 의해 정제하였다.

실시예 24: LMP 발현 벡터를 이용한 시험관내 골 결절 형성 및 무기화의 유도

래트 두개관 세포를 단리하고 실시예 1에 따라 2차 배양으로 성장시켰다. 배양물을 자극하지 않거나 또는 실시예 1에서 기술한 바와 같이 글루코코르티코이드(GC)로 자극시켰다. 슈퍼펙트 시약(Superfect Reagent; 캘리포니아 발렌시아 소재의 키아겐(Qiagen)) 형질감염 프로토콜의 변형을 이용하여 3 g/웰의 각 벡터를 실시예 25에 따른 2차 래트 두개관 조골세포 배양물 중에 형질감염시켰다. 무기화된 결절을 실시예 3에서 기술한 바와 같은 폰 코사 염색에 의해 가시화하였다. 인간 LMP-1s 유전자 과발현 생성물 만이 시험관내에서 골 결절 형성(약 203 결절/웰)을 유도하였다. 결절 수준은 GC 양성 대조군에 의해 형성된 것(약 412 결절/웰)의 약 50%였다. 다른 양성 대조군들은 pHisA-LMP-래트 발현 벡터(약 152 결절/웰) 및 pCMV2/LMP-래트-Fwd 발현 벡터(약 206 결절/웰)를 포함한 반면에, 음성 대조군들은 pCMV2/LMP-래트-Rev 발현 벡터(약 2 결절/웰) 및 미처리(NT) 플레이트(약 4 결절/웰)를 포함하였다. 이러한 데이터는 인간 cDNA가 적어도 래트 cDNA만큼 골유도성이라는 것을 입증한다. 그 효과는 거의 대부분 발현 벡터의 준 최적 용량으로 인해 GC 자극에 의해 관찰된 것보다 작았다.

실시예 25: 생체내 및 시험관내에서 LMP-유도된 세포 분화

클론을 37 ℃에서NotI 및ApaI으로 밤새 이중-절단하여 벡터로부터 클론 10-4에서의 래트 LMP cDNA(실시예 12 참조)를 절취하였다. 벡터 pCMV2 MCS(캘리포니아 칼스배드 소재의 인비트로겐)를 동일한 제한 효소들로 절단하였다. 클론 10-4로부터의 선형 cDNA 단편 및 pCMV2를 둘 다 겔 정제하고, 추출하고 T4 리가제로 접합시켰다. 접합된 DNA를 겔 정제하고 추출하고, 증폭을 위한이. 콜라이JM109세포를 형질전환시키는데 사용하였다. 양성 아가 콜로니를 골라 내어NotI 및ApaI으로 절단하고, 제한효소 절단물을 겔 전기영동으로 조사하였다. 양성 클론의 저장 배양액을 제조하였다.

사용된 제한 효소가XbaI 및HindIII인 것을 제외하고 유사한 방식으로 역방향 벡터를 제조하였다. 상기 제한 효소들을 사용하였기 때문에, 클론 10-4로부터의 LMP cDNA 단편을 역(즉, 비-번역) 방향으로 pRc/CMV2에 삽입하였다. 생성된 재조합 벡터는 pCMV2/RLMP로 표시한다.

적절한 부피의 pCMV10-4[60 nM의 최종 농도가 최적이다(3g); 본 실험의 경우 0 내지 600 nM/웰(0 내지 30 g/웰) 범위의 최종 농도가 바람직하다]를 450 ℓ의 최종 부피로 최소 이글 배지(MEM)에 재현탁하고 10 초간 진탕시켰다. 슈퍼펙트를 가하고(7.5 ℓ/최종 용액 ㎖), 용액을 10 초간 진탕한 후 실온에서 10 분간 배양하였다. 상기 배양 후에, 10% FBS(1 ㎖/웰; 6 ㎖/플레이트)로 보충된 MEM을 가하고 피펫으로 따라서 혼합하였다.

이어서, 생성된 용액을 세척된 ROB 배양물 위로 즉시 피펫으로 옮겼다(1 ㎖/웰). 배양물을 5% CO₂를 함유하는 가습 대기하에 37 ℃에서 2 시간동안 배양하였다. 그 후에, 세포를 멸균 PBS로 완만하게 1회 세척하고 적절한 표준 배양 배지를 가하였다.

결과는 pCMV10-4로 유도된 모든 래트 세포 배양물에서의 상당한 골 결절 형성을 입증하였다. 예를 들면, pCMV10-4 형질감염된 세포는 429 결절/웰을 생성하였다. T그에 노출된 양성 대조용 배양물은 460 결절/웰을 생성하였다. 대조적으로, 아무 처리되지 않은 음성 대조군은 1 결절/웰을 생성하였다. 유사하게, 배양물을 pCMV10-4(역방향)로 형질감염시키는 경우, 결절이 관찰되지 않았다.

생체내에서 신생 골 형성을 입증하기 위해, 4 내지 5 주된 정상 래트(mu/+; 열성 조건에 대해 이형접합성)의 뒷다리로부터 골수를 흡출하였다. 흡출된 골수 세포를 알파 MEM에서 세척하고, 원심분리하고, 펠릿을 10 mM 트리스(pH 7.4) 중의 0.83% NH₄Cl에 재현탁시켜 RBC를 용해시켰다. 남은 골수 세포를 MEM으로 3회 세척하고 3 x 10⁶세포 당 9 g의 pCMV-LMP-1s(순방향 또는 역방향)로 2 시간동안 형질감염시켰다. 이어서, 형질감염된 세포를 MEM으로 2회 세척하고 3 x 10⁷세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다.

세포 현탁액(100 ℓ)을 멸균 피펫을 통해 멸균 2 x 5 ㎜ I형 소 콜라겐 디스크(코넥티컷 휘트 릿지 소재의 슐처 오르토패딕스(Sulzer Orthopaedics))에 적용하였다. 상기 디스크를 4 내지 5 주된 무흉선 래트(mu/mu)의 두개골, 흉부, 복부 또는 흉추 상에 피하로 외과적으로 이식하였다. 동물을 3 내지 4 주에 죽이고, 이때 디스크 또는 수술 부위를 절제하고 70% 에탄올에 고정시켰다. 고정된 시편을 방사선사진술로 분석하고 탈석회되지 않은 조직학 검사를 골드너 트리크롬(Goldner Tirchrome)으로 염색된 5 ㎜ 두께 부분 위에서 수행하였다. 콜라겐 디스크 대신 탈활된(구아니진 추출된) 탈무기화된 골 세포간질(뉴저지 쉬류스버리 소재의 오스테오테크(Osteotech))을 사용하여 또한 실험을 수행하였다.

방사선사진술 결과 높은 수준의 무기화된 골 형성된 것으로 나타나 LMP-1s 형질감염된 골수 세포를 함유하는 원래의 콜라겐 디스크의 형태를 확인하였다. 음성 대조군(번역 단백질을 암호화하지 않는 LMP-1s cDNA의 역방향 변형체로 형질감염된 세포)에서는 무기화 골 형성이 관찰되지 않았으며, 담체의 흡수는 잘 진행되는 것으로 나타났다.

조직학은 LMP-1s 형질감염된 이식물에서 조골세포로 정렬된 새로운 골주를 나타내었다. 음성 대조군에서는 담체의 부분 재흡수와 함께 어떠한 뼈도 보이지 않았다.

18 세트(9개 음성 대조용 pCMV-LMP-REV 및 9개의 실험용 pCMV-LMP-1s)의 이식물을 무흉선 래트에서 요추와 흉추 사이에서 교번하는 부위에 부가하는 추가의 실험의 방사선사진술은 척추 사이에 골 형성(척추 융합)을 나타내는 0/9 음성 대조용 이식물을 나타내었다. 9개의 pCMV-LMP-1s 처리된 이식물은 모두 고형의 골 융합을 나타내었다.

실시예 26: 실시예 2 및 3에서 입증된 서열로부터 pHIS-5' ATG LMP-1s 발현 벡터의 합성

717개 염기쌍 클론(실시예 17)을ClaI 및EcoRV(메사추세츠 시티 소재의 뉴 잉글랜드 바이올로지칼스(New England Biologicals))로 절단하였다. 작은 단편(약 250개 염기쌍)을 겔 정제하였다. 클론 7(실시예 18)을ClaI 및XbaI으로 절단하였다. 상기 절단물로부터 1400개 염기쌍 단편을 겔 정제하였다. 단리된 250개 염기쌍 및 1400개 염기쌍 cDNA 단편들을 표준 방법으로 접합시켜 약 1650 bp의 단편을생성하였다. pHis-A 벡터(인비트로겐)를EcoRV 및XbaI으로 절단하였다. 선형화된 벡터를 회수하고 키메라성 1650 염기쌍 cDNA 단편에 접합시켰다. 접합 생성물을 클로닝하고 표준 방법으로 증폭시키고, HLMP-1s 삽입물을 갖는 벡터 pHis-A로도 부르는 pHis-A-5' ATG LMP-1s 발현 벡터를 전술한 바와 같이 ATCC에 기탁하였다.

실시예 27: pHis-5' ATG LMP-1s 발현 벡터를 이용한 시험관내 골 결절 형성 및 무기화의 유도

래트 두개관 세포를 단리하고 실시예 1에 따라 2차 배양으로 성장시켰다. 배양물을 자극하지 않거나 또는 실시예 1에 따라서 글루코코르티코이드(GC)로 자극시켰다. 배양물을 실시예 25에서 기술한 바와 같이 3 g의 재조합 pHis-A 벡터 DNA/웰로 형질감염시켰다. 무기화된 결절을 실시예 3에 따라 폰 코사 염색에 의해 가시화하였다.

인간 LMP-1s 유전자 과발현 생성물 만이(즉, GC 자극을 받지 않은) 시험관내에서 상당한 골 결절 형성(약 203 결절/웰)을 유도하였다. 이것은 GC 양성 대조군에 노출된 세포에 의해 생성된 결절의 양(약 412 결절/웰)의 약 50%이다. pHis-A-LMP-래트 발현 벡터(약 152 결절/웰) 및 pCMV2/LMP-래트-Fwd 발현 벡터(약 206 결절/웰)로 형질감염시킨 배양물에서도 유사한 결과가 수득되었다. 대조적으로, 음성 대조군 pCMV2/LMP-래트-Rev(약 2 결절/웰)가 수득되는 한편, 미처리 플레이트에서는 약 4 결절/웰이 나타났다. 이러한 데이터는 인간 LMP-1 cDNA가 상기 모델 시스템에서 적어도 래트 LMP-1 cDNA만큼 골유도성이라는 것을 입증한다. 상기 실험에서의 효과는 GC 자극에 의해 관찰된 것보다 덜하였지만, 일부에서는 상기 효과가필적할만 하였다.

실시예 28: LMP는 가용성 골유도성 인자의 분비를 유도한다

실시예 24에서 기술한 바와 같이 래트 두개관 조골세포 배양물에서 RLMP-1 또는 HLMP-1s의 과발현은 음성 대조군에서 관찰된 것보다 현저하게 많은 결절 형성을 야기하였다. LIM 무기화 단백질 작용의 메카니즘을 연구하기 위해, 조절된 배지를 상이한 시점에서 회수하고, 10배로 농축하고, 멸균 여과하고, 새로운 혈청을 함유하는 배지에서 그의 원래 농도로 희석하고, 4 일간 형질감염되지 않은 세포에 적용하였다.

4일째에 RLMP-1 또는 HLMP-1s로 형질감염된 세포로부터 회수된 조절된 배지는 대략 형질감염된 세포에서 RLMP-1의 직접적인 과발현만큼 결절 형성을 유도하는데 효과적이었다. 역방향으로 RLMP-1 또는 HLMP-1으로 형질감염된 세포로부터 얻은 조절된 배지는 결절 형성에 뚜렷한 효과를 나타내지 않았다. 4일전에 LMP-1 형질감염된 배양물로부터 회수된 조절된 배지는 결절 형성을 유도하지 못했다. 이러한 데이터는 LMP-1의 발현이 가용성 인자의 합성 및/또는 분비를 야기함을 시사하는데, 상기 현상은 형질감염 후 4일까지 배양 배지 중에 효과적인 양으로 나타나지 않았다.

rLMP-1의 과발현은 배지 중에 골유도성 인자의 분비를 야기하기 때문에, 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 LMP-1 단백질이 배지 중에 존재하는지를 결정하였다. rLMP-1 단백질의 존재는 LMP-1에 특이적인 항체(QDPDEE)를 이용하여 평가하고 통상적인 수단에 의해 검출하였다. LMP-1 단백질은 배양물의 세포 층에서만 발견되었으며 배지 중에서는 검출되지 않았다.

골유도성 가용성 인자의 부분 정제는 표준 25% 및 100% 황산 암모늄 절단에 이어 DE-52 음이온 교환 배치 크로마토그래피(100 mM 또는 500 mM NaCl)에 의해 달성하였다. 모든 활성은 높은 황산 암모늄, 높은 NaCl 분획에서 관찰되었다. 상기 편재화는 배지의 조절을 담당하는 단일 인자의 가능성과 일치된다.

실시예 29: 저용량 아데노바이러스에 의해 매개된 요추 융합에서의 유전자 요법

본 연구는 정상적인, 즉, 면역 반응성 토끼에서의 척추 융합을 촉진하기 위한 LMP-1 cDNA(서열 번호: 2)의 아데노바이러스 운반의 최적 용량을 측정하였다.

아데노-퀘스트(Adeno-Quest^TM) 키트(몬트레알 소재의 퀀텀 바이오 테크놀로지, 인코포레이티드(Quantum Biotechnologies, Inc.))를 이용하여 CMV 프로모터에 의해 유도된 LMP-1 cDNA(서열 번호: 2)를 사용하여 복제-결핍성 인간 재조합 아데노바이러스를 제작하였다. 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는, 상업적으로 시판하는(몬트레알 소재의 퀀텀 바이오 테크놀로지, 인코포레이티드) 재조합 아데노바이러스를 대조용으로 사용하였다.

초기에, 세포 당 0.025, 0.25, 2.5 또는 25개 플라크-형성 유니트(pfu)의 바이러스의 감염 다중도("MOI") 하에 60-분 형질도입을 이용하여 래트 두개관 조골세포 배양물에서의 골 분화를 유도하는 아데노바이러스-운반된 LMP-1("AdV-LMP-1")의 최적 농도를 결정하기 위해 시험관내 용량 반응 실험을 수행하였다. 양성 대조군 배양물을 10⁹M 글루코코르티코이드("GC")에 7일간 노출시켜 분화시켰다. 음성 대조군 배양물은 처리하지 않고 방치하였다. 14일째에, 배양물을 폰 코사 염색한 후 무기화된 골 결절의 수를 계수하고, 배지 중에 분비된 오스테오칼신의 수준(pmol/㎖)을 방사면역분석법으로 측정하였다(평균치 ± SEM).

상기 실험의 결과를 표 1에 나타내었다. 미처리된 음성 대조군 배양물에서는 필수적으로 자연적인 결절이 형성되지 않았다. 데이터는 0.25 pfu/세포와 동일한 MOI가 골 결절을 골유도하는데 가장 효과적이어서 양성 대조군(GC)에 필적할만한 수준을 달성함을 보여준다. 더 낮고 더 높은 아데노바이러스 용량은 덜 효과적이었다.

결과			AdV-LMP-1 용량(MOI)
	음성 대조군	GC	0.025	0.25	2.5	25
골 결절	0.5±0.2	188±35	79.8±13	145.1±13	26.4±15	87.6±2
오스테오칼신	1.0±0.1	57.8±9	28.6±11	22.8±1	18.3±3	26.0±2

이어서, 시험관내 최적 용량이 골격적으로 성숙한 뉴질랜드 백색 토끼에서 횡간 과정인 척추 융합을 촉진할 수 있는 지를 결정하기 위해 생체내 실험을 수행하였다. 9 마리의 토끼를 마취시키고, 18 게이지 침을 이용하여 과간 절흔(intercondylar notch)을 통해 원위부 대퇴골로부터 3 cc의 골수를 흡출하였다. 이어서, 연막을 단리하고, AdV-LMP-1으로 10-분 형질도입을 수행하고, 세포를 이식을 위한 작업실로 옮겼다. 횡방향 돌기들의 박피술 및 AdV-LMP-1(MOI = 0.4) 또는 AdV-BGal(MOI = 0.4)로 형질도입된 8 x 10⁶내지 15 x 10⁶의 자가 유핵 연막세포를 함유하는 담체(토끼의 탈활된 골 세포간질 또는 콜라겐 해면체)의 삽입에 의해 단일 수준의 후부측면 요추 관절고정술을 수행하였다. 5 주후에 토끼를 안락사시키고, 촉진, 평면 x-선, CT 주사 및 탈석회되지 않은 조직학에 의해 척추 융합을 평가하였다.

AdV-LMP-1이 공급된 척추 융합 부위는 9 마리 토끼 모두에서 고형의 연속적인 척추 융합괴를 유도하였다. 대조적으로, AdV-BGal 또는 낮은 용량의 AdV-LMP-1(MOI = 0.04)가 공급된 부위는 뼈를 거의 또는 전혀 생성하지 않았으며 담체 단독에 필적하는 비율의(<40%) 척추 융합을 야기하였다. 이러한 결과는 촉진, CT 주사 및 조직학에 의해 평가된 바와 일치되었다. 그러나, 평면 방사선사진은 때때로 특히 대조 부위에 존재하는 뼈의 양을 과대평가하였다. LMP-1 cDNA 운반 및 골 유도는 시험된 두 담체 물질 모두에 있어 성공적이었다. 아데노바이러스 벡터에 대한 전신성 또는 국소 면역 반응의 증거는 없었다.

상기 데이터는 상당히 공격적인 이미 확인된 토끼 척추 융합 모델에서 일관된 골 유도를 입증한다. 또한, 공정중 생체외 유전자 형질도입(10 분)과 함께 자가 골수 세포를 이용하는 프로토콜은 하룻밤의 형질도입 또는 배양시 몇주동안의 세포 팽창을 요하는 다른 방법보다 더 임상적으로 유용한 절차이다. 게다가, 재조합 아데노바이러스의 가장 효과적인 용량(MOI = 0.25)은 실질적으로 다른 유전자 요법 용도(MOI = 40 내지 500)에서 보고된 용량보다 낮다. 이것은 LMP-1이 세포내 신호 분자이며 강력한 신호 증폭 단계를 가질 수 있다는 사실에 기인한다. 또한, 세포 배양물에서 뼈를 유도하는 동일한 농도의 AdV-LMP-1이 생체내에서 효과적이라는 관찰은 또한 세포 배양물로부터 동물 실험으로 옮겨가는 경우 다른 성장 인자의 용량에 있어 통상적으로 필요한 증가를 제공하므로 놀라웠다. 이러한 관찰들은 모두 함께 LMP-1 cDNA를 운반하기 위해 아데노바이러스를 사용하는 국소 유전자 요법이 가능하며 필요한 저용량은 아데노바이러스 벡터에 대한 면역 반응의 불리한 영향을 아마도 최소화할 것임을 나타낸다.

실시예 30: 뼈를 생성하기 위한 LMP-1 cDNA를 이용한 유전자 요법에 있어서 말초 정맥혈 유핵 세포(연막)의 사용

4 마리 토끼에서, 형질도입된 세포가 골수가 아니라 정맥혈로부터 얻은 연막인 것을 제외하고 상기(실시예 29)와 같은 척추 융합 수술을 행하였다. 상기 세포들을 아데노-LMP 또는 pHIS-LMP 플라스미드로 형질감염시키고, 골수 세포를 사용하였을 때와 동등한 성공적인 결과를 얻었다. 유전자 운반에 있어 통상적인 정맥혈 세포를 사용한다는 상기 발견은, 유전자 요법이 일반적인 마취 하에서 고통스러운 골수 채취를 피하고 출발 물질 ㎖ 당 2배 더 많은 세포를 수득하기 때문에 유전자 요법을 임상적으로 보다 더 유용하게 만든다.

실시예 31: 인간 LMP-1 접합 변이체의 단리

인트론/엑손(Intron/Exon) mRNA 전사 접합 변이체는 단일 형질도입 및 세포/조직 발달에 있어 비교적 일반적인 조절 메카니즘이다. 다양한 유전자들의 접합 변이체들은 단백질-단백질, 단백질-DNA, 단백질-RNA 및 단백질-기질 상호작용을 변화시키는 것으로 나타났다. 접합 변이체는 또한 유전자 발현에 대한 조직 특이성을 조절하여 다양한 조직에서 상이한 형태들(및 따라서 기능)이 발현되도록 할 수있다. 접합 변이체는 세포에 있어서 통상적인 조절 현상이다. LMP 접합 변이체는 신경 재생, 근육 재생 또는 다른 조직의 발달과 같은 기타 조직에서의 효과를 야기할 수 있는 것도 가능하다.

HLMP-1 서열의 접합 변이체에 대한 인간 심장 cDNA 라이브러리를 검색하기 위해, 서열 번호: 22의 부분들에 상응하는 한 쌍의 PCR 프라이머를 제작하였다. 표준 기술을 이용하여 합성된 순방향 PCR 프라이머는 서열 번호: 22의 35 내지 54번 뉴클레오티드에 상응한다. 상기 프라이머는 하기 서열을 갖는다:

5'-GAGCCGGCATCATGGATTCC-3' (서열 번호: 35)

서열 번호: 22의 820 내지 839번 뉴클레오티드의 역방향 상보체인 역방향 PCR 프라이머는 하기의 서열을 갖는다:

5'-GCTGCCTGCACAATGGAGGT-3' (서열 번호: 36)

순방향 및 역방향 PCR 프라이머를 사용하여, 94 ℃에서 30 초, 64 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 1 분의 순환 프로토콜을 30회 반복한 후 72 ℃에서 10 분간 배양하는 표준 기술에 의해 HLMP-1에 유사한 서열에 대한 인간 심장 cDNA(클론테크(ClonTech), 항목 번호 7404-1 호)를 검색하였다. cDNA 서열의 증폭물을 겔-정제하고 서열화를 위해 에모리(Emory) DNA 서열 코어 설비에 제공하였다. 표준 기술을 이용하여 클론을 서열화하고, 서열을 PCGENE(인텔리제네틱스; 프로그램 SEQUIN and NALIGN)으로 조사하여 서열 번호: 22에 대한 상동성을 결정하였다. 그런 다음, 서열 번호: 22에 비해 추정상의 대안적 접합 부위를 갖는 2개의 상동성 뉴클레오티드 서열을 인텔리제네틱스의 프로그램 TRANSL을 사용하여 그 각각의 단백질 생성물로 번역하였다.

상기 두 개의 새로운 인간 cDNA 서열 중 하나(서열 번호: 37)는 1456개 염기쌍을 포함한다:

119개 bp 단편의 결실(* 사이) 및 17개 bp 단편의 부가(밑줄)에 의해 야기된 해독 구조 이동은 하기의 유도된 아미노산 서열(서열 번호: 38)을 갖는 절단된 유전자 생성물을 야기한다:

상기 423개 아미노산 단백질은, 상기에 설명한 뉴클레오티드 변화에 기인하는 강조된 부분(아미노산 94 내지 99)의 서열을 제외하고 서열 번호: 10에 나타낸 단백질에 대해 100% 상동성을 나타낸다.

두 번째 새로운 인간 심장 cDNA 서열(서열 번호: 39)은 1575개 염기쌍을 포함한다:

17 bp 단편의 부가(굵은 활자, 이탤릭체 및 밑줄)에 의해 야기된 해독 구조 이동은 565 내지 567 번 위치(밑줄)에 초기 번역 정지 코돈을 야기하였다.

유도된 아미노산 서열(서열 번호: 40)은 153개의 아미노산으로 이루어진다:

상기 단백질은 94 번 아미노산까지 서열 번호: 10에 대해 100% 상동성을 나타내는데, 이때 뉴클레오티드 서열에 나타낸 17 bp 단편의 부가는 해독 구조 이동을 야기한다. 94 내지 153 번 아미노산에 걸쳐, 단백질은 서열 번호: 10에 대해 상동성이 아니다. 서열 번호: 10에서의 154 내지 157번 아미노산은 뉴클레오티드 서열에 나타낸 초기 정지 코돈으로 인해 존재하지 않는다.

실시예 32: 게놈 HLMP-1 뉴클레오티드 서열

본 출원인은 HLMP-1 발현과 관련된 추정상의 조절 요소들을 포함하여 HLMP-1을 암호화하는 게놈 DNA 서열을 동정하였다. 전체 게놈 서열은 서열 번호: 41에 나타내었다. 상기 서열은 미저리주 세인트 루이스에 소재한 워싱턴 유니버시티 스쿨 오브 메디신(Washington University School of Medicine)의 게놈 서열화 센터의 AC023788(클론 RP11-564G9)로부터 유도되었다.

HLMP-1에 대한 추정상의 프로모터 영역은 서열 번호: 41에서 2,660 내지 8,773번 뉴클레오티드에 걸쳐 있다. 상기 영역은 다른 것들 중에서, 적어도 10개의 잠재적인 글루코코르티코이드 반응 요소("GER")(뉴클레오티드 6148-6153, 6226-6231, 6247-6252, 6336-6341, 6510-6515, 6552-6557, 6727-6732, 6752-6757, 7738-7743 및 8255-8260), 초파리 데카펜타플레직(Drosophilla decapentaplegic)에 대한모체("SMAD") 결합 요소에 대해 12개의 잠재적인 Sma-2 동족체(뉴클레오티드 3569-3575, 4552-4558, 4582-4588, 5226-5232, 6228-6234, 6649-6655, 6725-6731, 6930-6936, 7379-7384, 7738-7742, 8073-8079 및 8378-8384), 및 3개의 TATA 상자(뉴클레오티드 5910-5913, 6932-6935 및 7380-7383)를 포함한다. 3개의 TATA 상자, GRE 전부 및 SMAD 결합 요소("SBE") 중 8개를 서열 번호: 41에서 뉴클레오티드 5,841 내지 8,733에 걸친 영역에서 그룹을 이룬다. 이들 조절 요소들은, 예를 들면, 골 형성 과정에 포함된 단백질을 암호화하는 외인성 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 골 형성 및 회복과 관련되는 치료 인자 또는 유전자 뿐 아니라, 조직 분화 및 발달과 관련된 인자 또는 유전자의 전신 투여를 허용한다.

추정상의 조절 요소들 이외에, HLMP-1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상응하는 13개 엑손을 동정하였다. 이들 엑손은 서열 번호: 41에서 하기의 뉴클레오티드에 걸쳐 있다:

엑손 1: 8733-8767, 엑손 2: 9790-9895, 엑손 3: 13635-13787, 엑손 4: 13877-13907, 엑손 5: 14387-14502, 엑손 6: 15161-15297, 엑손 7: 15401-15437, 엑손 8: 16483-16545, 엑손 9: 16689-16923, 엑손 10: 18068-18248, 엑손 11: 22117-22240, 엑손 12: 22328-22440, 엑손 13: 22575-22911.

HLMP-2에는 뉴클레오티드 14887내지 14904에 미치는 또 다른 엑손(엑손 5A)이 있다.

모든 인용된 문헌 및 특허들은 본원에 그대로 참고로 인용된다.

전술한 명세서는 본 발명의 원리를 교지하고 있지만, 실시예는 예시의 목적으로 나타내었으며, 당해 분야에 숙련된 자라면 상기 개시내용을 판독함으로써 본 발명의 진정한 범위에서 벗어나지 않고 형태 및 상세한 내용에 있어 다양한 변화를 행할 수 있음을 인지할 것이다.

Claims

서열 번호: 37 또는 서열 번호: 39를 포함하는 단리된 핵산 분자.
서열 번호: 37 또는 서열 번호: 39에 의해 암호화되는 단리된 인간 LMP 단백질.
제 1 항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제 3 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 4 항에 있어서,

원핵 세포, 효모 세포 및 포유동물 세포로 이루어진 그룹에서 선택된 숙주 세포.
제 1 항에 있어서,

표지를 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자.
서열 번호: 38 및 서열 번호: 40으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 LIM 무기화 단백질.
HLMP-2(서열 번호: 38) 또는 HLMP-3(서열 번호: 40)에 특이적인 단클론성 항체.
골형성 전구체 세포 또는 말초혈 백혈구를 서열 번호: 39를 포함하는 단리된 핵산 분자로 형질감염시킴을 포함하는, 골 형성을 유도하는 방법.
제 9 항에 있어서,

단리된 핵산 분자가 벡터 중에 존재하는 방법.
제 10 항에 있어서,

벡터가 발현 벡터인 방법.
제 11 항에 있어서,

벡터가 플라스미드인 방법.
제 11 항에 있어서,

벡터가 바이러스인 방법.
제 13 항에 있어서,

바이러스가 아데노바이러스인 방법.
제 13 항에 있어서,

바이러스가 레트로바이러스인 방법.
제 9 항에 있어서,

골형성 전구체 세포 또는 말초혈 백혈구가 생체외로 형질감염되는 방법.
제 9 항에 있어서,

골형성 전구체 세포가 단리된 핵산 분자의 직접 주입에 의해 생체내에서 형질감염되는 방법.
제 9 항에 있어서,

LIM 무기화 단백질이 HLMP-3(서열 번호: 40)인 방법.
(a) 골형성 전구체 세포 또는 말초혈 백혈구를 서열 번호: 39를 포함하는 단리된 핵산 분자로 형질감염시키고;

(b) 형질감염된 골형성 전구체 세포 또는 말초혈 백혈구를 세포간질과 혼합하고;

(c) 세포간질을 척추와 접촉시킴을 포함하는,

척추를 융합시키는 방법으로서, 뉴클레오티드 서열의 발현이 세포간질에서 무기화된 골 형성을 야기하는 방법.
제 19 항에 있어서,

골형성 전구체 세포 또는 말초혈 세포가 생체외로 형질감염되는 방법.
(a) 외인성 조절 화합물에 반응하는 조절성 프로모터에 실시가능하게 연결된 서열 번호: 39를 포함하는, 골형성 전구체 세포 또는 말초혈 백혈구에서 안정하게 유지되는 벡터로 골형성 전구체 세포 또는 말초혈 백혈구를 형질감염시키고;

(b) 서열 번호: 39의 발현을 유발하기에 효과적인 양의 외인성 조절 물질을, 필요에 따라, 숙주에게 투여함을 포함하는,

전신적 골 형성을 필요로 하는 포유동물 숙주에서 상기 전신적 골 형성을 유도하는 방법.
(a) 골형성 세포 또는 말초혈 백혈구를 서열 번호: 39를 포함하는 단리된 핵산 분자로 형질감염시키고;

(b) 단리된 핵산 분자를 과발현시킴을 포함하는,

골형성 세포에 의해 가용성 골형성 인자의 생성을 자극하는 방법.
제 22 항의 방법에 의해 생성된 가용성 골형성 인자.
제 23 항에 있어서,

골형성 인자가 단백질인 가용성 골형성 인자.
HLMP-2 또는 HLMP-3가 발현되는 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염시킴을 포함하는, HLMP-2 또는 HLMP-3의 발현을 억제하는 방법.
제 17 항에 있어서,

단리된 핵산 분자가 플라스미드 및 바이러스로 이루어진 그룹에서 선택된 벡터 중에 존재하는 방법.
제 26 항에 있어서,

벡터가 플라스미드이고, 상기 플라스미드가 근육 조직에 직접 주입되는 방법.
골형성 전구체 세포 또는 말초혈 백혈구를 서열 번호: 37을 포함하는 단리된 핵산 분자로 형질감염시킴을 포함하는, 골 형성을 억제하는 방법.
제 28 항에 있어서,

단리된 핵산 분자가 벡터 중에 존재하는 방법.
제 29 항에 있어서,

벡터가 발현 벡터인 방법.
제 30 항에 있어서,

벡터가 플라스미드인 방법.
제 30 항에 있어서,

벡터가 바이러스인 방법.
제 32 항에 있어서,

바이러스가 아데노바이러스인 방법.
제 32 항에 있어서,

바이러스가 레트로바이러스인 방법.
제 28항에 있어서,

골형성 전구체 세포 또는 말초혈 백혈구가 생체외로 형질감염되는 방법.
제 28항에 있어서,

골형성 전구체 세포가 단리된 핵산 분자의 직접 주입에 의해 생체내에서 형질감염되는 방법.
제 28 항에 있어서,

LIM 무기화 단백질이 HLMP-2(서열 번호: 38)인 방법.