DE69738302T2

DE69738302T2 - Neues semaphorin-gen: semaphorin y

Info

Publication number: DE69738302T2
Application number: DE69738302T
Authority: DE
Inventors: Toru Kusatsu-shi KIMURA; Kaoru Takarazuka-shi KIKUCHI
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1997-09-09
Publication date: 2008-09-04
Anticipated expiration: 2017-09-10
Also published as: AU4136797A; JP4108755B2; ATE378409T1; EP0960937A1; US20030077669A1; DE69738302D1; CA2265500C; CA2265500A1; WO1998011216A1; EP0960937B1; EP0960937A4; US6566094B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Semaphorin Y, ein neues Semaphorin, das zu der Semaphorin-Familie gehört, sowie die Verwendung von Semaphorin Y für pharmazeutische oder diagnostische Mittel oder Laborreagenzien. Insbesondere betrifft sie Semaphorin Y, welches den Neuritenauswuchs inhibiert, und ein Gen dafür sowie andere Semaphorine, welche mit dem Semaphorin Y-Gen hybridisieren, modifizierte Proteine von Semaphorin Y, Antikörper gegen Semaphorin Y, Antisense-Nucleotide gegen das Semaphorin Y-Gen, nicht-menschliche transgene Tiere und die Verwendung davon als pharmazeutische oder diagnostische Mittel oder als Laborreagenzien.
Hintergrund des Fachgebiets
Es ist allgemein bekannt, dass sich die Neuronen des Zentralnervensystems (ZNS) bei höheren Organismen wie dem Menschen nach einer Verletzung nicht regenerieren können. Daher muss eine Person, welche zum Beispiel infolge eines Verkehrsunfalls eine Verletzung des Rückenmarks davongetragen hat, den Rest ihres Lebens in einem hemiplegischen Zustand verbringen. Andererseits ist bekannt, dass die Neuronen des peripheren Nervensystems (PNS) über eine große Regenerationsfähigkeit verfügen, selbst in höheren Organismen, und daher sind Neurone in einer Extremität in der Lage, sich allmählich zu regenerieren, wenn sie abgetrennt werden, wobei sie gleichzeitig ihre Funktion wiedergewinnen.
In den frühen 1980er Jahren stellte eine Gruppe um Aguayo et al. fest, dass wenn PNS-Neuronen experimentell in verletzte ZNS-Neuronen in einem höheren Organismus implantiert werden, das Axonwachstum der CNS-Neuronen induziert wird. Diese Beobachtung zeigt, dass ZNS-Neuronen in höheren Organismen, von denen im Allgemeinen angenommen worden ist, dass sie nicht zur Regeneration befähigt sind, sich regenerieren können, falls ein geeignetes Milieu vorgesehen wird (Nature 284 (1980), 264–265; Science 214 (1981), 931–933). Dieser Bericht legt die Möglichkeit nahe, dass im ZNS von höheren Organismen ein Faktor existiert, bezeichnet als "Regenerationsinhibitor für ZNS-Neuronen", der die Regeneration von ZNS-Neuronen inhibiert, und dass die Aufhebung der Inhibierung eine Regeneration von ZNS-Neuronen ermöglichen kann. Dieser Vorschlag ebnete den Weg für eine Regenerationstherapie für ZNS-Neuronen.
In 1988 zeigte eine Gruppe um Schwab et al., dass sich ein solcher Regenerationsinhibitor für ZNS-Neuronen unter den Proteinen befindet, welche aus dem ZNS-Myelin isoliert wurden. Ihnen gelang auch die Reinigung, wenngleich teilweise, eines Proteins mit einer Regenerationsinibitionsaktivität gegenüber ZNS-Neuronen, und sie nannten diese Proteinfraktion N135/250 (Annu. Rev. Neurosci. 16 (1993), 565–595), obwohl bisher niemand die Isolierung, Identifizierung und Genclonierung davon gelungen ist. Ferner immunisierten sie Tiere mit dem teilweise gereinigten N135/250, wobei es ihnen gelang, einen Antikörper (IN-1) mit einer neutralisierenden Aktivität zu erhalten. Dieser Antikörper ist in der Lage, eine Bande von N135/250 in einem Western-Blot zu erkennen, und kann in einer Immunfärbung die Region anfärben, von der vermutet wird, dass dort N135/250 verbreitet ist. Sie zeigten außerdem, dass die Verabreichung dieses Antikörpers an ein Tier, welches experimentell eine Verletzung des Rückenmarks davongetragen hat, die Regeneration von Axonen im Rückenmark, obwohl nur teilweise, innerhalb von 2–3 Wochen förderte und deren Funktion innerhalb von 2–3 Monaten wiederherstellte (Nature 343 (1990), 269–272; Nature 378 (1995), 498–501). Diese Erkenntnisse sind von großem Wert, da sie experimentell beweisen, dass ein Regenerationsinhibitor für ZNS-Neuronen existiert, wie durch Aguayo et al. (vorstehend) vorgeschlagen worden ist, und dass ZNS-Neuronen durch Inhibierung der Aktivität des Inhibitors regeneriert werden können. Der vorstehende Antikörper ist jedoch nicht gegen das menschliche, sondern das Ratten-N135/250 gerichtet und zeigt eine geringe Stabilität und Spezifität. Zusätzlich, obwohl eine Regeneration der ZNS-Neuronen, wie vorstehend beschrieben, durch die Verabreichung des Antikörpers beobachtet wurde, war der Effekt davon so partiell und unvollständig, dass nicht alle motorischen Funktionen wiederhergestellt werden konnten. Es wird daher angenommen, dass es bei der Lösung dieser Probleme unerlässlich ist, das Gen für N135/250 oder einen entsprechenden Regenerationsinhibitor für ZNS-Neuronen zu identifizieren und basierend auf den Erkenntnissen der Molekularbiologie, der Neurologie und dergleichen einen Antagonisten, welcher die Regenerationsinhibitionsaktivität gegenüber ZNS-Neuronen stärker inhibiert, oder ein Verfahren zur Inhibierung der Expression des Gens für den Regenerationsinhibitor zu entwickeln.
Adams et al. (Mechanisms of Development 57 (1996), 33–45) beschreiben eine Klasse von murinen Semaphorinen mit einer Homologie zu Thrombospondin, welches während der frühen Embryogenese differentiell exprimiert wird. Die Autoren berichten über die Clonierung von zwei Vertretern (semF und -G) einer neuen Klasse von membrangebundenen Semaphorinen, welche sieben carboxyterminale Thrombospondin-Wiederholungen enthalten.
Culotti und Kolodkin (Current Opinion in Neurobiology 6 (1996), 81–88) beschreiben die Funktionen von Netrinen und Semaphorinen bei der Leitung von Axonen. Es wird berichtet, dass die Analyse von Vertretern der Genfamilien der Netrine und Semaphorine bei Wirbellosen in vivo veranschaulichte, wie Netrine eine Vielzahl von Funktionen bei der Leitung von Axonen in C. elegans ausüben, wie spezifische Domänen des Netrin-Moleküls anziehende und abstoßende Signale bei der Leitung übertragen und wie Semaphorine bei der Entwicklung einer neuromuskulären Spezifität wirksam sein können.
WO 97/20928 beschreibt Semaphorin Z, ein Gen dafür, ein Teilpeptid davon, einen Antikörper, eine DNA, eine komplementäre RNA, ein Screeningverfahren für einen Semaphorin Z-Inhibitor, einen Semaphorin Z-Inhibitor und einen Regenerationspromotor, umfassend den Inhibitor, für das Zentralnervensystem.
Abgesehen von den Vorstehenden benötigt das Nervensystem, unabhängig davon, ob es zentral oder peripher ist, die Ausbildung eines komplizierten neuronalen Netzwerkes zwischen Neuronen oder zwischen Neuronen und peripheren Rezipienten oder Effektoren während der Entwicklung, das heißt, im Stadium des Embryos oder Föten, damit es seine wesentlichen Funktionen, d. h. Informationen übertragen und verarbeiten, präzise ausüben kann. Für den Aufbau eines neuronalen Netzwerkes ist ein ausgeklügelter Mechanismus erforderlich, durch den ein wachsender Neurit zu der weit entfernt liegenden Zielstelle präzise hingeleitet wird.
Es ist bisher angenommen worden, dass ein Faktor, welcher den Neuritenauswuchs positiv reguliert, wie ein Neuritenwachstumspromotor oder ein Neuritenwachstumslockstoff, eine wichtige Rolle bei der Ausbildung des neuronalen Netz- Werkes spielen kann. Jedoch haben nun jüngste Studien über den Mechanismus der Netzwerkbildung ergeben, dass ein entgegengerichteter Faktor, das heißt, ein negativer Faktor mit einer das Auswachsen inhibierenden Aktivität, für eine präzise Hinleitung wichtig ist (Cell 78 (1994), 353–356).
Ein charakteristischer Faktor mit einer solchen das Auswachsen inhibierenden Aktivität ist ein Protein mit der Bezeichnung "Semaphorin". Das zuerst entdeckte Semaphorin war das Fasciclin IV der Heuschrecke. Im Anschluss daran wurde Collapsin (neuerdings bezeichnet als Collapsin I) beim Huhn entdeckt (Cell 75 (1993), 217–227; Neuron 9 (1992), 831–845). Bis heute sind mehr als zehn Gene, welche zu der Semaphorin-Familie gehören, für einen großen Bereich von Spezies, einschließlich Insekten wie Drosophila und Käfer, Menschen und Viren, beschrieben worden (Cell 81 (1995), 471–474). Diese Semaphorine enthalten in ihren Aminosäuresequenzen typischerweise ähnliche Strukturen, bezeichnet als Semaphorin-Domänen, welche jeweils aus etwa 500 Aminosäuren bestehen (Neuron 14 (1995), 941–948; Cell 75 (1993), 1389–1399). Allerdings betragen die Homologien der primären Aminosäuresequenzen in den Semaphorin-Domänen zwischen diesen Semaphorin-Genen nur 80–20%, was nicht sehr hoch ist.
Von diesen Semaphorinen ist nur für einige wenige eine Funktion nachgewiesen worden, einschließlich zum Beispiel für das Fasciclin IV der Heuschrecke, die Semaphorine I und II von Drosophila, das Collapsin des Huhns und Semaphorin III, welches dem Collapsin bei Säugern entspricht. Es ist bekannt, dass alle diese Semaphorine den Neuritenauswuchs oder die Synapsenbildung inhibieren. Insbesondere ist berichtet worden, dass Semaphorin III eine Aktivität aufweist, welche innerhalb kurzer Zeit den Kollaps des Wachstumskegels von gezüchteten Neuronen in vitro zur Folge hat (Wachstumskegel-Kollapsaktivität) (Neuron 14 (1995), 941–948; Neuron 14 (1995), 949–959; Cell 81 (1995), 631–639; Cell 75 (1993), 1389–1399; Cell 75 (1993), 217–227; Neuron 9 (1992), 831–845).
Obwohl nun gezeigt worden ist, wie vorstehend beschrieben, dass bekannte Semaphorine eine Wachstumskegel-Kollapsaktivität und eine Neuritenauswuchs-lnhibitionsaktivität während der Entwicklung haben, sowie eine Rolle bei dem Erhalt einer genauen Leitung der Neuronen spielen, ist gegenwärtig nicht bekannt, ob diese Semaphorine nur während der Entwicklung oder auch bei dem Erwachsenen eine Funktion haben oder nicht, und es ist noch weniger erwiesen, ob Semaphorine eine Rolle als ein Regenerationsinhibitor für ZNS-Neuronen spielen oder nicht. Da gezeigt worden ist, dass bekannte Semaphorine negative Lenkungsfaktoren sind, die den Neuritenauswuchs inhibieren, wäre es gewiss nicht unvernünftig anzunehmen, dass die Semaphorine mögliche Verbindungen für einen Regenerationsinhibitor für ZNS-Neuronen sind (Nature 378 (1995), 439–440). Durch in-vitro-Experimente ist jedoch gezeigt worden, dass Semaphorin III (Sems III), das einzige Semaphorin höherer Organismen, dessen Funktion untersucht worden ist, seine Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität gegenüber sensorischen Neuronen und sympathischen Neuronen, welche beide peripher sind, aber nicht gegenüber retinalen Neuronen, welche zentral sind, ausübt (Cell 75 (1993), 217–227). Ferner hat eine Northern-Analyse zur Verteilung der Sema III-Expression beim Erwachsenen, welche durch die genannten Erfinder durchgeführt wurde, ergeben, dass es vorwiegend in peripheren Geweben exprimiert wird (vgl. nachstehend Referenzbeispiel 2). Es ist daher kaum anzunehmen, dass Sema III mit diesen Merkmalen eine Funktion als ein Regenerationsinhibitor für ZNS-Neuronen ausüben kann.
Probleme, welche durch die Erfindung gelöst werden
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Bereitstellung von Semaphorin Y, einem neuen Semaphorin, welches zu der Semaphorin-Familie gehört, und eines Gens dafür sowie die Bereitstellung von pharmazeutischen Mitteln für neuronale Erkrankungen, insbesondere für die Regeneration von ZNS-Neuronen und damit in Beziehung stehenden diagnostischen Mitteln oder Laborreagenzien. Genauer ermöglicht die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Semaphorin Y, welches den Neuritenauswuchs inhibiert, und eines Gens dafür sowie von anderen Semaphorinen, welche mit dem Semaphorin Y-Gen hybridisieren, Antikörper gegen Semaphorin Y, Antisense-Nucleotiden gegen das Semaphorin Y-Gen und die Verwendung solcher Substanzen als pharmazeutische oder diagnostische Mittel oder als Laborreagenzien. Die vorliegende Erfindung ermöglicht außerdem die Bereitstellung eines Screeningverfahrens für Semaphorin Y-Antagonisten unter Verwendung von Semaphorin Y und von nicht-menschlichen transgenen Tieren, welche Semaphorin Y umfassen.
Mittel zur Lösung der Probleme
Um pharmazeutische Mittel für neuronale Erkrankungen, insbesondere für die Regeneration von ZNS-Neuronen, und damit in Beziehung stehende diagnostische Mittel oder Laborreagenzien bereitzustellen, hatten die genannten Erfinder den Plan, ein neues Semaphorin zu identifizieren, welches noch nicht cloniert worden ist. Insbesondere konzentrierten die genannten Erfinder ihre Aufmerksamkeit auf die Ähnlichkeit zwischen den in-vitro-Aktivitäten des vorstehend beschriebenen Proteins N135/250 und Semaphorin, d. h. auf den Umstand, dass N135/250 eine Wachstumskegel-Kollapsaktivität und eine Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität in vitro aufweist (J. Neurosci. 8 (1988), 2381–2393; Science 259 (1993), 80), während bekannte Semaphorine gleichermaßen eine Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität aufweisen, und insbesondere Semaphorin III auch eine Wachstumskegel-Kollapsaktivität besitzt. Dies eröffnete den Erfindern die Möglichkeit, dass unbekannte Semaphorine, welche noch nicht identifiziert worden sind, ein Semaphorin einschließen könnten, welches die Regeneration von ZNS-Neuronen inhibiert. Genauer hatten die genannten Erfinder die Idee, dass ein Semaphorin, welches dadurch gekennzeichnet, dass es 1) im ZNS eines Erwachsenen, wo die Regeneration von Neuronen (oder der Neuritenauswuchs) inhibiert ist, stark exprimiert wird, aber es 2) in anderen Geweben wie peripheren Geweben in dem Erwachsenen kaum exprimiert wird, noch nicht identifiziert worden ist, und, falls ein neues unbekanntes Semaphorin mit diesen Eigenschaften identifiziert werden kann, dieses Semaphorin an der Inhibition der Regeneration von CNS-Neuronen beteiligt sein könnte.
Die Erfinder durchsuchten zunächst eingehend DNA-Datenbanken auf der Grundlage der Aminosäuresequenz, welche in bereits beschriebenen Semaphorin-Genen relativ gut konserviert ist. Genauer durchsuchten sie eine EST (Expressed Sequence Tags exprimierte sequenzmarkierte Stelle)-Datenbank nach einer DNA-Sequenz, welche einem Gen entspricht, welches nicht in peripheren Geweben, aber im postnatalen Gehirn exprimiert wird und welches eine Aminosäuresequenz codiert, welche bei Semaphorinen relativ gut konserviert ist. Als Ergebnis wurde das DNA-Fragment R59527 identifiziert, welches als eine partielle Sequenz eine Sequenz codiert, welche aus sieben Aminosäuren besteht: Gin (oder Arg)-Asp-Pro-Tyr-Cys-Ala (oder Gly)-Trp. Das R59527-Fragment lieferte die Sequenzinformation für nur 238 Basen, wobei nur einige Prozent davon in eine Aminosäuresequenz translatiert werden konnten, die mit den bekannten Semaphorinen übereinstimmt. Außerdem konnte das Leseraster nicht bestimmt werden, da eine Sequenz vorhanden war, welche in R59527 nicht endgültig bestimmt wurde. Es war daher in diesem Stadium völlig unmöglich zu folgern, dass die Basensequenz von R59527 ein Teil eines neuen Semaphorin ist. Den Erfindern gelang jedoch schließlich die Clonierung eines neuen Semaphorin-Gens mittels der folgenden Verfahren: das Synthetisieren von DNA-Primern auf der Grundlage der Sequenzinformation; das Durchführen einer PCR mit den Primern unter Verwendung von cDNAs, hergestellt aus einer menschlichen Hippocampus-cDNA-Bank, als Matrizen, wobei ein neues DNA-Fragment (SEQ ID NO: 7), bestehend aus 170 Basen erhalten wurde; das Markieren des DNA-Fragments mit ³²P, um eine DNA-Sonde zu synthetisieren: und das Durchmustern von cDNA-Banken der Ratte und des Menschen mit dieser Sonde. Die Erfinder nannten dieses neue Semaphorin "Semaphorin Y".
Eine nachfolgende Analyse ergab, dass Semaphorin Y das neue Semaphorin ist, nachdem die Erfinder gesucht haben, da es im ZNS eines Erwachsenen stark exprimiert wird, während bei peripheren Geweben eine Expression nur in bestimmten Geweben beobachtet werden konnte.
Das Semaphorin Y der vorliegenden Erfindung mit diesen Eigenschaften scheint an der Inhibition der Regeneration von ZNS-Neuronen beim Erwachsenen beteiligt zu sein. Das Semaphorin Y kann für das Screening nach Semaphorin Y-Antagonisten verwendet werden, wobei erwartet wird, dass die Antagonisten, welche durch ein solches Screeningsystem identifiziert werden, die Regeneration von ZNS-Neuronen fördern. Ebenso wird erwartet, dass Antisense-DNAs oder -RNAs gegen das Semaphorin Y-Gen in gleicher Weise wie die vorstehenden Antagonisten die Regeneration von ZNS-Neuronen fördern.
Im Hinblick auf die Tatsache, dass das Semaphorin Y der vorliegenden Erfindung den Neuritenauswuchs inhibiert, kann es außerdem als ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel für Schmerzen oder Immunkrankheiten wie atopische Dermatitis verwendet werden, indem es an periphere Gewebe verabreicht wird, was die Inhibition des Neuritenauswuchs von PNS-Neuronen zur Folge hat. Ferner ist Semaphorin Y ein neues Semaphorin, welches zu der Semaphorin-Familie gehört, wobei dessen Expressionsverteilung unkonventionell charakterisiert ist, wie vorstehend beschrieben, und welches auch dadurch charakterisiert ist, dass es keine Ig- Domänen enthält, welche üblicherweise in den bisher beschriebenen Semaphorinen von Wirbeltieren gefunden wurden. Semaphorin Y kann daher als ein wichtiges Forschungsmaterial oder als ein Laborreagens verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage der vorstehenden Erkenntnisse vollendet worden.
Folglich beinhaltet der Hauptinhalt der vorliegenden Erfindung das Folgende:

(1) DNA, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) DNA, codierend zumindest die reife Form eines Proteins, umfassend die in SEQ ID NO: 3 oder 6 dargestellte Aminosäuresequenz; (b) DNA, umfassend die in SEQ ID NO: 1, 2, 4 oder 5 dargestellte Basensequenz; (c) DNA, umfassend die cDNA der Insertion, die in dem Plasmid enthalten ist, welches unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6021 oder FERM BP-6022 hinterlegt ist; (d) DNA, welche unter stringenten Bedingungen hybridisiert und eine Homologie von 80% oder mehr zu der DNA nach (b) oder (c) aufweist und welche ein Protein codiert, das den Neuritenauswuchs inhibiert; und (e) DNA, welche unter stringenten Bedingungen hybridisiert und eine Homologie von 80% oder mehr zu der DNA, umfassend die in SEQ ID NO: 7 dargestellte Basensequenz, aufweist und welche ein Protein mit einer Semaphorin-Domäne codiert.
(2) Expressionsplasmid, welches die DNA nach (1) exprimiert.
(3) Wirtszelle, welche mit dem Expressionsplasmid nach (2) transformiert ist.
(4) Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, wobei das Verfahren das Züchten der Wirtszelle nach (3) und das Gewinnen des exprimierten rekombinanten Proteins umfasst.
(5) Protein, welches durch die DNA nach (1) codiert wird oder durch das Exprimieren der DNA nach (1) erhältlich ist.
(6) Antisense-Nucleotid oder eine chemisch modifizierte Variante davon, welche(s) gegen ein Segment gerichtet ist, das mindestens acht oder mehr Basen in der DNA nach (1) umfasst.
(7) Antisense-Nucleotid oder eine chemisch modifizierte Variante davon nach (6), dadurch gekennzeichnet, dass es (sie) in der Lage ist, die Expression des Proteins nach (5) zu inhibieren.
(8) Antikörper gegen das Protein nach (5).
(9) Pharmazeutisches Mittel, umfassend als aktiven Bestandteil die DNA nach (1), das Protein nach (5), das Antisense-Nucleotid oder die chemisch modifizierte Variante davon nach (6) oder (7) oder den Antikörper nach (8).
(10) Pharmazeutische Zusammensetzung nach (9) zur Verwendung als ein antiallergisches, immunosuppressives oder Anti-Tumor-Mittel.
(11) Diagnostisches Mittel, umfassend die DNA nach (1), das Protein nach (5), das Antisense-Nucleotid oder die chemisch modifizierte Variante davon nach (6) oder (7) oder den Antikörper nach (8).
(12) Screeningverfahren für Semaphorin Y-Antagonisten, dadurch gekennzeichnet, dass es das Protein nach (5) verwendet.
(13) Zusammensetzung, welche die Regeneration von ZNS-Neuronen fördert, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eines der Antisense-Nucleotide oder der chemisch modifizierten Varianten davon nach (6) oder (7) oder den Antikörper nach (8) enthält.
(14) Neuritenauswuchsinhibitor für PNS-Neuronen, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eines der Proteine nach (5) enthält.
(15) Nicht-menschliches transgenes Tier, in welches die DNA nach (1) in das Chromosom davon künstlich eingeführt oder darin ausgeschaltet worden ist.

Verfahren zur Durchführung der Erfindung
Die erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, welches Semaphorin Y codiert, umfassend die in SEQ ID NO: 3 oder 6 dargestellte Aminosäuresequenz, oder ein Gen, codierend ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, worin eine oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des vorstehenden Semaphorin Y deletiert, substituiert und/oder hinzugefügt sind, und wobei das Protein den Neuritenauswuchs inhibiert. Die zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Semaphorin Y-Gen, umfassend die in SEQ ID NO: 1, 2, 4 oder 5 dargestellte Basensequenz, oder ein Gen, welches unter stringenten Bedingungen mit einem solchen Semaphorin Y-Gen hybridisiert und das ein Protein codiert, welches den Neuritenauswuchs inhibiert. Diese Gene werden nachstehend der Reihe nach beschrieben.
1) Gen, codierend Semaphorin Y (Semaphorin Y-Gen)
Von den oben erwähnten Genen verweist "ein Gen, welches ein Semaphorin Y-Protein codiert, umfassend die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Aminosäuresequenz", oder "ein Semaphorin Y-Gen, umfassend die in SEQ ID NO: 1 oder 2 dargestellte Basensequenz", auf ein Gen, welches das Ratten-Semaphorin Y der vorliegenden Erfindung codiert, während "ein Gen, welches ein Semaphorin Y-Protein codiert, umfassend die in SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz", oder "ein Semaphorin Y-Gen, umfassend die in SEQ ID NO: 4 oder 5 dargestellte Basensequenz", ein Gen ist, welches das menschliche Semaphorin Y der vorliegenden Erfindung codiert. Von diesen Genen entsprechen die in SEQ ID NO: 2 und 5 dargestellten Sequenzen den offenen Leserastern für den Rattentyp bzw. menschlichen Typ von Semaphorin Y. Diese Gene können cloniert werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, indem eine cDNA-Bank, abgeleitet aus ZNS-Geweben, unter Verwendung einer Sonde (zum Beispiel einer DNA-Sonde mit der in SEQ ID NO: 7 gezeigten Basensequenz) durchmustert wird, welche auf der Grundlage der Sequenz von "R59527, welche in der EST-Datenbank identifiziert wurde, hergestellt wurde. Besondere Techniken für eine solche Clonierung können den Standardtexten wie zum Beispiel "Molecular Cloning", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989), entnommen werden. Die Basensequenz der clonierten DNA kann auch durch herkömmliche Methoden, zum Beispiel mittels eines im Handel erhältlichen Sequenzierungskits, bestimmt werden.
Alternativ kann nach Veröffentlichung der Basensequenz der cDNAs für das Ratten- und das menschliche Semaphorin Y der vorliegenden Erfindung ein Fachmann auch ohne Anwendung von Clonierungsverfahren, wie vorstehend beschrieben, in einfacher Weise die vollständigen Gene, welche den Rattentyp bzw. menschlichen Typ von Semaphorin Y codieren, unter Verwendung eines Teils dieser cDNA als eine Sonde clonieren.
2) Gen, codierend ein modifiziertes Protein von Semaphorin Y
Von den in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Genen, verweist "ein Gen, codierend ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, worin eine oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des vorstehenden Semaphorin Y deletiert, substituiert und/oder hinzugefügt sind, und wobei das Protein den Neuritenauswuchs inhibiert", auf ein Gen, welches ein sogenanntes "modifiziertes Protein" von Semaphorin Y codiert,, das den Neuritenauswuchs inhibiert. Fachleute können in einfacher Weise zum Beispiel durch eine ortsspezifische Mutagenese (Methods in Enzymology 100 (1983), 448) oder ein PCR-Verfahren (Molecular Cloning, 2. Auflage, Kapitel 15, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989); "PCR, A Practical Approach", IRL Press, 200–210 (1991)) ein Gen erhalten, welches ein solches Protein codiert. In diesem Zusammenhang entspricht die Zahl der Aminosäurereste, welche deletiert, substituiert und/oder hinzugefügt werden, einer solchen Anzahl, welche die Deletion, Substitution und/oder Addition mittels gut bekannter Verfahren wie der vorstehend beschriebenen ortsspezifischen Mutagenese ermöglicht.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Inhibierung des Neuritenauswuchses", dass das Protein eine Kollaps induzierende Wirkung auf den Wachstumskegel von Neuronen ausübt oder dass das Protein eine Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität besitzt. Diese Aktivitäten können mit einer Testsubstanz wie zum Beispiel einem Expressionsprodukt einer DNA, welche Semaphorin Y oder ein modifiziertes Protein davon codiert, beispielsweise in der folgenden Weise gemessen werden:
Da Semaphorin Y ein Membranprotein ist, kommt es in der Zellmembran der Zellen vor, welche mit dem Semaphorin Y-Gen transformiert sind. Die Aktivitäten der vorstehenden Testsubstanz können daher in einfacher Weise unter Verwendung der Membranfraktion der transformierten Zellen als Testmaterial gemessen werden.
Beispiele einer Aktivitätsmessung schließen die Messung der Kollapsaktivität gegenüber dem Wachstumskegel von Neuronen (Igarashi M. et al., Science, Bd. 259 (1993), S. 77–79) oder die Messung der Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität (z. B. Davies J. A. et al., Neuron, Bd. 2 (1990), S. 11–20; und Bastmeyer M., J. Neurosci., Bd. 11 (1991), S. 626–640) ein. Ein Verfahren zur Messung der Wachstumskegel-Kollapsaktivität wird in der Literatur (Igarashi M. et al., Science, Bd. 259 (1993), S. 77–79) ausführlich beschrieben. Kurz zusammengefasst, kann die Messung mit Hilfe eines Verfahrens, bei dem Zellen, welche eine Testsubstanz wie Semaphorin Y exprimieren, homogenisiert werden, und das Homogenat, enthaltend die Zellmembranfraktion, oder die gereinigte Membranfraktion verwendet werden (Cox E. C. et al., Neuron, Bd. 2 (1990), S. 31–37), oder mittels eines Verfahrens, bei dem ein" Protein, welches aus der Membranfraktion extrahiert wurde, in einem Liposom rekonstituiert wird und das Liposom als Testmaterial verwendet wird (Bandtlow C. E., Science, Bd. 259 (1993), S. 80–84), durchgeführt werden. Um die Wachstumskegel-Kollapsaktivität unter Verwendung dieser Materialien in der Praxis zu messen, wird eine Testsubstanz wie Semaphorin Y zum Beispiel in einer der vorstehend beschriebenen Formen zu Neuronen zugegeben, welche unter herkömmlichen Bedingungen (z. B. "Culturing Nerve Cells", herausgegeben durch Banker et al., MIT Press (1991)) in einem Behälter, welcher mit einer Substanz beschichtet ist, die den Neuritenauswuchs und die Wachstumskegelbildung fördert, wie Laminin, Kollagen, Polylysin oder Polyornithin, gezüchtet werden. Nach der Zugabe, wenn ein ausreichender Zeitraum verstrichen ist, um das Eintreten eines Kollaps des Wachstumskegels zu ermöglichen (typischerweise 30 Minuten bis eine Stunde nach der Zugabe), werden die Neuronen mit 1% Glutaraldehyd oder ähnlichem fixiert, und die Anzahl der Wachstumskegel, bei denen Kollaps eingetreten ist, wird unter einem Mikroskop gezählt. Bei dieser Messung ist es wichtig, dass eine andere Probe als Kontrolle verwendet wird, welche aus Zellen, die die Testsubstanz wie Semaphorin Y nicht exprimieren, nach den gleichen Verfahren hergestellt wird, welche bei den Zellen, welche die Testsubstanz exprimieren, angewendet wurden. Typischerweise wird eine Normalisierung der Proben auf der Basis der in den Proben enthaltenen Proteingesamtmengen durchgeführt. Um die Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität zu messen, wird ein Teil der Oberfläche eines Micropore-Filters oder eines aus Glas oder Kunststoff hergestellten Kulturbehälters mit einer Testsubstanz wie Semaphorin Y, welche hergestellt wurde, wie vorstehend beschrieben, beschichtet, und die Aktivität wird zum Beispiel durch die Unfähigkeit der Neuronen, welche unter herkömmlichen Bedingungen gezüchtet werden, sich an die beschichtete Fläche anzuhaften, oder durch eine deutliche Verringerung der Rate des Neuritenauswuchses auf der beschichteten Fläche oder durch die Unfähigkeit wachsender Neuriten zur Invasion von der Außenseite der beschichteten Fläche in die beschichtete Fläche hinein auf grund des Anhaltens der Neuriten an der Grenzfläche zwischen der beschichteten und der unbeschichteten Fläche oder der Umgehung der beschichteten Fläche durch die Neuriten angezeigt. Wenn ein Cluster von Zellen, welche eine Testsubstanz exprimieren, gleichzeitig mit Neuronen in einem Kollagengel gezüchtet werden, kann die Unfähigkeit der auswachsenden Neuriten, in den Cluster von Zellen, welche die Testsubstanz exprimieren, einzudringen, auch als ein Indikator verwendet werden (Sophia A. et al., Cell, Bd. 81 (1995), 621–629).
Als Zellen für die vorstehenden Aktivitätsmessungen können sowohl ZNS- als auch PNS-Neuronen verwendet werden. Wie in dem Abschnitt "Hintergrund des Fachgebiets" beschrieben, enthält das ZNS bei erwachsenen Säugern natürlicherweise eine hohe Menge eines Regenerations (Auswuchs)-Inhibitors. Es ist daher sehr schwierig, eine Hemmwirkung auf den Neuritenauswuchs von ZNS-Neuronen in vivo zu messen, und daher wird eine solche Hemmwirkung üblicherweise durch ein in-vitro-Verfahren, wie vorstehend beschrieben, gemessen. Da diese in-vitro-Verfahren jeweils individuelle Merkmale beinhalten, wird bevorzugt, dass mehr als ein Verfahren angewendet wird, um die Aktivität nachzuweisen. Obwohl die bevorzugten Neuronen, welche für eine Messung der Aktivität verwendet werden, ZNS-Neuronen sind, wie motorische Neuronen im Rückenmark oder in der motorischen Rindenregion, können PNS-Neuronen des oberen Halsganglions und der hinteren Spinalwurzel ebenfalls verwendet werden, da gezeigt worden ist, dass N135/250, ein bekannter Regenerationsinhibitor von ZNS-Neuronen, seine Wirkungen wie die Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität und die Wachstumskegel-Kollapsaktivität auch gegenüber PNS-Neuronen zeigt (J. Cell Biol. 106 (1988), 1281–1288; Science 259 (1993), 80–83).
Spezifische Beispiele der modifizierten Proteine dieser Ausführungsform werden nachstehend beschrieben.
Basierend auf einem strukturellen Vergleich der bekannten Semaphorine sind die meisten der konservierten Aminosäuren in der Semaphorin-Domäne zu finden, was darauf hinweist, dass diese konservierten Aminosäuren für die Ausprägung der Aktivität der Semaphorine unerlässlich sind. Ferner haben die genannten Erfinder festgestellt, dass ein modifiziertes Sema III-Protein, worin der Asparaginsäurerest in Position 198 in der Semaphorin-Domäne durch Glycin ersetzt worden ist, keine Wachstumskegel-Kollapsaktivität hat (vgl. nachstehend Referenzbeispiel 1). Demgemäß wird angenommen, dass der Asparaginsäurerest in Position 198 von Sema III für die Ausprägung der Aktivität unerlässlich ist. Die Aminosäurereste, welche dieser Position entsprechen, sind in den bekannten Semaphorinen stark konserviert und entsprechen alle einem Asparaginsäurerest, von wenigen Ausnahmen abgesehen, wobei Glutaminsäure an dieser Position vorkommt. Es wird daher angenommen, dass der Aminosäurereste an dieser Position auch für die Ausprägung der Aktivität anderer Semaphorine als Sema III unerlässlich ist. Es wird vermutet, dass in dem Semaphorin Y der vorliegenden Erfindung der Aminosäurerest, welcher der Position 198 in Sema III entspricht, der Asparaginsäurerest an Position 197 in der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz oder der Asparaginsäurerest an Position 198 in der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz des menschlichen Semaphorin Y ist.
In Anbetracht der vorstehenden Informationen ist es wünschenswert, die oben beschriebenen Deletionen, Substitutionen und/oder Additionen von Aminosäuren an Positionen durchzuführen, welche sich von den konservierten Positionen in den Semaphorinen unterscheiden, um die Aktivität von Semaphorin Y bei den modifizierten Proteinen beizubehalten. Insbesondere ist es wünschenswert, den Asparaginsäurerest an Position 197 in dem in SEQ ID NO: 3 dargestellten Ratten-Semaphorin Y und den Asparaginsäurerest an Position 198 in dem menschlichen Semaphorin Y nicht zu modifizieren. Um Aminosäuren zu substituieren, welche bei Semaphorinen konserviert sind, während die Aktivität von Semaphorin Y beibehalten wird, ist es wünschenswert, den Aminosäurerest, welcher substituiert werden soll, durch eine Aminosäure mit einer ähnlichen Seitenkette zu ersetzen. Durch das Ersetzen einer konservierten Aminosäure durch eine Aminosäure mit einer ähnlichen Seitenkette wird es möglich, ein modifiziertes Protein herzustellen, welches eine erhöhte Aktivität für Semaphorin Y vorsieht. Ein solches modifiziertes Protein mit einer erhöhten Aktivität ist als ein Neuritenauswuchsinhibitor für PNS-Neuronen sehr gut geeignet, wie nachstehend in dem Abschnitt der 22ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
In der oben erwähnten Ausführungsform verweist "eine konservierte Aminosäure" auf eine Aminosäure, die an einer Position vorkommt, an welcher mehr als 50% der Semaphorin-Gene, welche in 2 von Cell 75 (1993), 1389–1399, oder in 1 von Neuron 14 (1995), 941–948, dargestellt sind, die gleiche Aminosäure gemeinsam haben.
3) DNA, welche unter stringenten Bedingungen mit dem Semaphorin Y-Gen hybridisiert
Von den oben erwähnten DNAs verweist "ein Gen, welches unter stringenten Bedingungen mit dem Semaphorin Y-Gen hybridisiert und welches ein Protein codiert, das den Neuritenauswuchs inhibiert", auf ein Gen wie ein Semaphorin Y-Gen, welches von einem Säuger stammt und unter stringenten Bedingungen mit einem Ratten- oder einem menschlichen Semaphorin Y-Gen, umfassend die in SEQ ID NO: 1, 2, 4 oder 5 dargestellte Basensequenz, hybridisiert.
Wie hierin verwendet, verweist "ein Gen, welches unter stringenten Bedingungen hybridisiert", auf ein Gen, welches mit einem Ratten- oder einem menschlichen Semaphorin Y-Gen hybridisiert, wenn es zum Beispiel einer Hybridisierung bei einer Formamidkonzentration von etwa 45% (Vol./Vol.) und einer Salzkonzentration von etwa 5x SSPE und bei einer Temperatur von etwa 42°C unterzogen wird und bei einer Salzkonzentration von etwa 2x SSPE und bei einer Temperatur von etwa 42°C gewaschen wird. Die Clonierung solcher Gene kann zum Beispiel dadurch erfolgen, dass cDNA- oder genomische Banken, welche aus verschiedenen tierischen Geweben hergestellt wurden, unter Verwendung der gesamten oder eines Teils der in SEQ ID NO: 1 oder 4 dargestellten DNA als ein Sonde durchmustert werden. Eine solche Durchmusterung kann unter Bezugnahme auf Standardtexte wie zum Beispiel "Molecular Cloning", 2. Auflage (Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989)), durchgeführt werden.
Spezifische Beispiele des Gens dieser Ausführungsform können alle Semaphorin Y-Gene von Säugern und Vögeln einschließen. Unter Säugern oder zwischen Säugern und Vögeln weisen homologe Gene recht ähnliche Sequenzen auf, wobei üblicherweise mehr als 80%, in vielen Fällen mehr als 90% der Basensequenz untereinander identisch sind. Daher entsprechen alle Semaphorin Y-Gene von Säugern und Vögeln dieser Ausführungsform. Anders ausgedrückt, sind solche Gene, welche eine Homologie von 80% oder mehr und vorzugsweise 90% oder mehr aufweisen, in dieser Ausführungsform eingeschlossen.
Die dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, welche unter stringenten Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, welche die in SEQ ID NO: 7 dargestellte Basensequenz umfasst und welche ein Protein mit einer Semaphorin-Domäne codiert.
In der vorstehenden Beschreibung verweist "eine DNA, umfassend die in SEQ ID NO: 7 dargestellte Basensequenz", auf ein Fragment, das mittels PCR unter Verwendung der Sequenzinformation der DNA für "R59527" cloniert wurde, welche zum Teil eine Sequenz bestehend aus sieben Aminosäuren codiert, welche unter Semaphorinen stark konserviert ist (Gin (oder Arg)-Asp-Pro-Tyr-Cys-Ala (oder Gly)-Trp), und wobei das DNA-Fragment einer Region von Position 1574 bis Position 1743 in der Basensequenz des in SEQ ID NO: 1 dargestellten Ratten-Semaphorin Y oder einer Region von Position 1574 bis Position 1693 in der Basensequenz des in SEQ ID NO: 4 dargestellten menschlichen Semaphorin Y entspricht.
Die "stringenten Bedingungen" verweisen auf solche Bedingungen, welche vorstehend in dem Abschnitt der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden.
Die Clonierung dieser cDNAs erfolgt zum Beispiel durch die Hybridisierung mit der DNA von SEQ ID NO: 7 und kann spezifisch zum Beispiel gemäß den in TINS 15 (1992), 319–323, und den darin angeführten Referenzen beschriebenen Verfahren und genauer gemäß den folgenden Verfahren durchgeführt werden.
Das heißt, die Clonierung kann mittels Durchmusterung von cDNA- oder genomischen Banken, welche aus verschiedenen tierischen Geweben hergestellt wurden, unter Verwendung einer DNA, bestehend aus der in SEQ ID NO: 7 dargestellten Basensequenz, als eine Sonde durchgeführt werden. Die Durchmusterung kann zum Beispiel gemäß den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugte cDNA-Banken schließen solche ein, welche von einem erwachsenen Gewebe des ZNS abgeleitet sind, wobei cDNA-Banken, welche dem Hippocampus, Corpus striatum und Cerebellum entstammen, mehr bevorzugt werden. Wie vorstehend beschrieben, können die in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen oder die in TINS 15 (1992), 319–323, und den darin angeführten Referenzen beschriebenen Bedingungen für die Hybridisierung verwendet werden.
Die DNA dieser Ausführungsform entspricht auch "einer DNA, welche ein Protein mit einer Semaphorin-Domäne codiert". Wie hierin verwendet, verweist "eine Semaphorin-Domäne" auf eine Domäne, welche aus 300-600 Aminosäureresten besteht, wobei mehr als 20% davon zu den Aminosäuren identisch sind, welche die Semaphorin-Domäne irgendeines der zehn bekannten Semaphorine (G-Sems I, T-Sems I, D-Sems II, H-Sems III, C-Collapsin, Sem A, Sem B, Sem C, Sem D, Sem E) ausmachen, welche zum Beispiel in Cell 75 (1993), 1389–1399; oder Neuron 14 (1995), 941–948, beschrieben sind. Die Proteine mit einer Semaphorin-Domäne, worin mehr als 30% der Aminosäuren mit den Aminosäuren in irgendeinem der bekannten Semaphorine identisch sind, werden besonders bevorzugt. Die Identität der Aminosäuren wird durch einen Vergleich zum Beispiel unter Verwendung von DNASIS Ver. 2.0 (HITACH Software Engineering) unter den Bedingungen von ktup = 1 und cutoff = 1 bestimmt. Mehr bevorzugte Proteine sind solche, worin zehn oder mehr Cysteine, insbesondere zwölf oder mehr Cysteine, der dreizehn Cysteine, die in den Semaphorin-Domänen der zehn bekannten Semaphorine konserviert sind (zum Beispiel die Cysteine, welche in 1 auf Seite 942 von Neuron 14 (1995), 941–948, gekennzeichnet sind), konserviert sind.
Beispiele eines solchen Gens dieser Ausführungsform können Semaphorin-Gene einschließen, welche unter stringenten Bedingungen mit einer DNA, umfassend die in SEQ ID NO: 7 dargestellte Basensequenz, hybridisieren und welche Semaphorin-Domänen enthalten und eine Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität zeigen, einschließlich aller Semaphorin Y-Gene von Säugern und Vögeln.
Die 4te Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, das durch Exprimieren des Gens nach einem der obigen Punkte (1) bis (3) erhalten wird.
Typische Beispiele der Proteine, welche in dieser Ausführungsform eingeschlossen sind, sind das Ratten-Semaphorin Y, umfassend die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Aminosäuresequenz, und das menschliche Semaphorin Y, umfassend die in SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz. Das Ratten- oder das menschliche Semaphorin Y enthält an seinem N-Terminus eine Signalsequenz, wobei angenommen wird, dass diese Signalsequenz der Region von Position 1 bis Position 23 der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. von Position 1 bis Position 24 der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz entspricht. Da die Signalsequenz während des Transports zur Membran durch Prozessierung entfernt wird, sind solche reife Formen von Semaphorin Y ebenfalls in dieser Ausführungsform eingeschlossen.
Die Herstellung der Proteine dieser Ausführungsform kann zum Beispiel dadurch erfolgen, dass eine clonierte Ratten-Semaphorin Y-cDNA in einen bekannten Expressionsvektor wie pET oder pCDM8 ligiert wird und dieser in geeignete Wirtszellen eingebracht wird, um Semaphorin Y zu exprimieren und herzustellen. Die Wirtszellen können Prokaryonten oder Eukaryonten sein. Zum Beispiel werden Escherichia coli-Stämme oder tierische Zelllinien bereits konventionell für solche Zwecke verwendet und sind im Handel erhältlich oder öffentlich zugänglich. Beispiele tierischer Wirtszellen schließen COS-1-, COS-7- oder CHO-Zellen und dergleichen ein.
Um geeignete tierische Wirtszellen mit einem Expressionsplasmid zu transformieren, kann ein bekanntes Verfahren wie zum Beispiel die DEAE-Dextran-Methode (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. M. et al., Hrsg., John Wiley & Sons (1987)), angewendet werden. Wie in Beispiel 6 bestätigt wird, kommt das Semaphorin Y in der Zellmembranfraktion vor, welche eine ausreichende Menge an Semaphorin Y enthält, so dass diese direkt in verschiedenen Tests verwendet werden kann. Daher können verschiedenen Tests für die Aktivitäten eines Proteins dieser Ausführungsform in einfacher Weise unter Verwendung einer Zellmembranfraktion, welche aus geeigneten Zellen hergestellt wurde, durchgeführt werden.
Ferner kann ein Protein dieser Ausführungsform zum Beispiel durch eine Affinitätsreinigung unter Verwendung von Semaphorin Y erkennenden Antikörpern, welche nachstehend in dem Abschnitt der 16ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, oder einer herkömmlichen Säulenchromatographie gereinigt werden.
Die Anmeldung beschreibt auch ein Gen, codierend ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, worin eine oder mehrere Aminosäuren in dem Ratten- oder dem menschlichen Semaphorin Y, dargestellt in SEQ ID NO: 3 bzw. 6, deletiert, substituiert und/oder hinzugefügt sind, wobei das Protein den Neuritenauswuchs fördert. Ebenso beschrieben wird ein Protein, welches durch Exprimieren des oben erwähnten Gens der vorliegenden Erfindung erhalten wird.
In die oben erwähnten Gene können Deletionen, Substitutionen und/oder Additionen eingeführt werden, wobei Verfahren angewendet werden, die solchen entsprechen, welche für ein Gen, codierend ein modifiziertes Protein der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, angewendet werden. In ähnlicher Weise kann die fördernde Wirkung auf den Neuritenauswuchs zum Beispiel durch das Einbringen von Semaphorin Y in ein Testsystem für die Semaphorin Y-Aktivität, welches vorstehend in dem Abschnitt der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, und ferner das Zugeben einer Testsubstanz (d. h. eines in Frage kommenden modifizierten Semaphorin Y-Proteins) dazu ohne Weiteres gemessen werden. Für Einzelheiten vgl. die Beschreibungen in dem Abschnitt der 18ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Spezifische Beispiele der beschriebenen Proteine können modifizierte Proteine sein, deren Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität eliminiert worden ist. Es wird erwartet, dass diese modifizierten Proteine, welche keine Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität besitzen, eine fördernde Wirkung auf den Neuritenauswuchs haben, wenn sie an Rezeptoren für Semaphorin Y oder an Semaphorin Y selbst binden, indem sie die Bindung von Semaphorin Y an die Rezeptoren verhindern. Wie vorstehend in dem Abschnitt der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben, ist vorgeschlagen worden, dass das aktive Zentrum von Semaphorin in der Semaphorin-Domäne lokalisiert sein kann, und insbesondere, dass es an dem Asparaginsäurerest an Position 197 in dem Ratten-Semaphorin Y oder an dem Asparaginsäurerest an Position 198 in dem menschlichen Semaphorin Y lokalisiert sein kann. Demgemäß, um die Semaphorin Y-Aktivität des modifizierten Proteins zu eliminieren, beschreibt die vorliegenden Anmeldung die Einführung von Deletionen, Substitutionen und/oder Additionen in die konservierten Aminosäuren in der Semaphorin-Domäne, vorzugsweise an dem Asparaginsäurerest an Position 197 in dem Ratten-Semaphorin Y oder an dem Asparaginsäurerest an Position 198 in dem menschlichen Semaphorin Y. Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch solche Substitutionen, wobei die ursprüngliche Aminosäure durch eine Aminosäure mit einer anderen Seitenkette ersetzt wird. In Fällen, in denen das Semaphorin Y nicht vom Menschen oder von der Ratte stammt, wird auch bevorzugt, dass die Modifikationen an dem Asparaginsäurerest in dieser Position durchgeführt werden, das heißt, an dem Aminosäurerest in der Position, welche Position 197 in dem Ratten-Semaphorin Y oder Position 198 in dem menschlichen Semaphorin Y entspricht, wenn die Aminosäuresequenz dieses Semaphorin Y an der Sequenz des Ratten- oder menschlichen Semaphorin Y ausgerichtet wird, um eine maximale Identität zu erhalten.
Da die beschriebenen Proteine der vorliegenden Erfindung den Neuritenauswuchs fördern, wie vorstehend beschrieben, werden einige dieser Proteine als Regenerationspromotoren für CNS-Neurone dienen, wie nachstehend beschrieben wird.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch eine DNA, welche aus einer menschlichen cDNA-Bank oder einer menschlichen genomischen Bank cloniert wird und welche unter stringenten Bedingungen mit einer DNA, umfassend zumindest einen Teil der Ratten- oder menschlichen Semaphorin Y-DNA, welche in SEQ ID NO: 1 bzw. 4 dargestellt ist, hybridisiert.
Clonierungsverfahren werden zum Beispiel in "Molecular Cloning, 2. Auflage", Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989), ausführlich beschrieben und schließen insbesondere zum Beispiel Verfahren ein, welche eine Hybridisierung oder eine PCR beinhalten. Obwohl eine bevorzugte hierin verwendete Bank eine genomische Bank ist, welche vom einem Menschen stammt, kann auch eine cDNA-Bank, welche von ZNS-Neuronen in einem Erwachsenen abgeleitet ist, verwendet werden. Die Verfahren mittels Hybridisierung können zum Beispiel gemäß TINS 15 (1992), 319–323, und den darin angeführten Referenzen durchgeführt werden. Die Verfahren mittels PCR können zum Beispiel gemäß "PCR", herausgegeben durch McPherson et al., IRL Press (1991), durchgeführt werden.
Die auf diese Weise clonierten DNAs schließen nicht nur die DNA in der vollständigen Länge, sondern auch DNA-Fragmente davon, umfassend mehr als 200 Basen, oder Einzelstrangformen (codierende Stränge oder komplementäre Stränge davon) der DNA-Fragmente ein. Spezifische Beispiele einer DNA der siebten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können zusätzlich zu den Regionen, welche Aminosäuren codieren, chromosomale DNAs, enthaltend 5'- und/oder 3'-Transkriptionskontrollregionen, nichtcodierende Sequenzen von Exons, Introns oder dergleichen, einschließen. Solche Sequenzen, welche keine Aminosäuren codieren, sind zum Beispiel auch bei der Entwicklung eines Medikaments durch die nachstehend beschriebenen Antisense-Techniken sehr nützlich.
Die achte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Expressionsplasmid, welches entweder das Gen der ersten, zweiten oder dritten Ausführungs form der vorliegenden Erfindung exprimiert. Die neunte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, welche mit dem Expressionsplasmid der achten Ausführungsform transformiert ist. Ferner ist die zehnte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, wobei das Verfahren das Züchten der Wirtszelle der neunten Ausführungsform und das Gewinnen des exprimierten rekombinanten Proteins umfasst. Wie vorstehend in dem Abschnitt der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben, sind die Verfahren zur Herstellung eines Expressionsplasmids und einer Wirtszelle sowie die Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins per se den Fachleuten alle gut bekannt.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch ein Peptid, welches mindestens 6 Aminosäuren eines Proteins der vierten oder sechsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch ein Peptid, das den Neuritenauswuchs fördert. Ein solches Polypeptid kann durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die fördernde Wirkung auf den Neuritenauswuchs kann auch in einfacher Weise gemessen werden, wie vorstehend beschrieben, indem Semaphorin Y in ein Aktivitätstestsystem, welches vorstehend in dem Abschnitt der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, eingebracht wird und ferner eine Testsubstanz (d. h. ein in Frage kommendes Peptid von Semaphorin Y) dazu zugegeben wird. Für Einzelheiten vgl. die Beschreibungen in dem Abschnitt der 18ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Spezifische Beispiele dieser Peptide können Peptide sein, welche die Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität von Semaphorin Y verloren haben. Es wird erwartet, dass ein Peptid, welches keine Semaphorin Y-Aktivität besitzt, seine den Neuritenauswuchs fördernde Wirkung ausübt, wenn es an Rezeptoren für Semaphorin Y oder an Semaphorin Y selbst bindet, indem die Bindung von Semaphorin Y an die Rezeptoren inhibiert wird. Einige dieser Peptide werden als Regenerationspromotoren für ZNS-Neuronen beschrieben.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch ein Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es den Asparaginsäurerest an Position 198 der in SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz oder einen Aminosäurerest, entsprechend der Posi tion des Asparaginsäurerestes, enthält. Solche Peptide können durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Wie vorstehend in dem Abschnitt der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben, scheint der Asparaginsäurerest an Position 198 des in SEQ ID NO: 6 dargestellten menschlichen Semaphorin Y (im Falle der Ratte, der Asparaginsäurerest an Position 197) für die Ausprägung der Aktivität von Semaphorin Y unerlässlich zu sein. Da dieser Aminosäurerest möglicherweise an der Bindung zwischen Semaphorin Y und seinen Rezeptoren beteiligt sein kann, kann ein Peptid dieser Ausführungsform, enthaltend diesen Aminosäurerest, die Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität von Semaphorin Y dadurch inhibieren, dass es an Rezeptoren für Semaphorin Y oder an Semaphorin Y selbst bindet, wodurch der Neuritenauswuchs gefördert wird. Einige der Peptide mit einer solchen Wirkung werden als Regenerationspromotoren für ZNS-Neuronen beschrieben, wie nachstehend in dem Abschnitt der 21ten Ausführungsform erläutert wird. Die den Neuritenauswuchs fördernde Aktivität kann in einfacher Weise gemessen werden, wie vorstehend beschrieben, indem Semaphorin Y in ein Aktivitätstestsystem, welches vorstehend in dem Abschnitt der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, eingebracht wird, und ferner eine Testsubstanz (d. h. ein in Frage kommendes Peptid von Semaphorin Y) dazu zugegeben wird. Für Einzelheiten vgl. die Beschreibungen in dem Abschnitt der 18ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt ferner, dass "eine Aminosäure, entsprechend der Position der Asparaginsäure", auf einen Aminosäurerest verweist, der sich an der Position befindet, welche der Position 198 in dem menschlichen Semaphorin Y entspricht, wenn die Aminosäuresequenz des Proteins der vierten oder sechsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung an der Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 6 dargestellten menschlichen Semaphorin Y ausgerichtet wird, um eine maximale Identität zu erhalten. Demgemäß verweist "ein Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäure enthält, welche der Position der Asparaginsäure entspricht", auf ein Peptid, das eine solche Aminosäure an der Position, welche der Position 198 in dem menschlichen Semaphorin Y entspricht, sowie umgebende Aminosäuren auf beiden Seiten davon enthält.
Die 14te Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Antisense-Nucleotid oder eine chemisch modifizierte Variante davon, welche(s) gegen ein Segment gerichtet ist, das mindestens acht oder mehr Basen in dem Gen nach einer der ersten bis dritten Ausführungsformen oder in der DNA der siebten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst.
Wie hierin verwendet, verweist ein "Antisense-Nucleotid" auf ein sogenannte(s) Antisense-Oligonucleotid, Antisense-RNA oder Antisense-DNA, und es kann unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes synthetisch hergestellt werden oder zum Beispiel durch Exprimieren eines Gens in der entgegengesetzten Richtung wie im üblichen Falle (d. h. in der Antisense-Richtung) erhalten werden. Für Einzelheiten vgl. die nachstehenden Beschreibungen.
Diese Antisense-Nucleotide werden dazu verwendet, die Expression von Semaphorin Y zu inhibieren, wie nachstehend in dem Abschnitt der 15ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, und sind auch als Laborreagenzien zum Beispiel für die in-situ-Hybridisierung nützlich. In der vorliegenden Erfindung verweist "eine chemisch modifizierte Variante" insbesondere auf eine solche Variante, welche chemisch modifiziert ist, um die Übertragbarkeit des Antisense-Nucleotids in Zellen zu verbessern oder die Stabilität des Antisense-Nucleotids in den Zellen zu erhöhen. Beispiele einer solchen chemisch modifizierten Variante sind Phosphorothioat-, Phosphorodithioat-, Alkylphosphotriester-, Alkylphosphonat-, Alkylphosphoamidat- und ähnliche Derivate ("Antisense RNA and DNA", Wiley-Liss, 1992, S. 1–50; J. Med. Chem. 36 (1993), 1923–1937). Die chemisch modifizierte Variante kann zum Beispiel gemäß den unmittelbar vorstehend angeführten Referenzen hergestellt werden.
Die 15te Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Antisense-Nucleotid oder eine chemisch modifizierte Variante davon gemäß der vorstehend beschriebenen 14ten Ausführungsform, dadurch gekennzeichnet, dass es (sie) die Expression des Proteins der 14ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung inhibiert.
mRNAs, welche durch eine übliche Gentranskription hergestellt werden, sind Sinnstränge, und die Antisense-Nucleotide oder chemisch modifizierten Varianten davon können an solche Sinnstrang-mRNAs in Zellen binden, um die Expression dieser speziellen Gene zu inhibieren. Daher können die vorstehend beschriebenen Antisense-Nucleotide oder chemisch modifizierten Varianten davon die Expression von Semaphorin Y inhibieren und auf diese Weise die Aktivität von Semaphorin Y inhibieren. Einige der Antisense-Nucleotide oder chemisch modifizierten Varianten davon mit einer solchen Wirkung werden als Regenerationspromotoren für ZNS-Neurone dienen, wie nachstehend beschrieben wird.
Es kann in einfacher Weise festgestellt werden, ob ein hergestelltes einzelnes Antisense-Nucleotid oder eine chemisch modifizierte Variante davon die gewünschte Hemmwirkung aufweist oder nicht, indem das Antisense-Oligonucleotid selbst direkt oder ein Gen, welches die Antisense-RNA hergestellt, wenn es transkribiert, in Zellen eingebracht wird, welche Semaphorin Y exprimieren, und im Anschluss daran bestimmt wird, ob sich die Menge des exprimierten Semaphorin Y erhöht oder nicht.
Beispiele für Antisense-Nucleotide mit einer solchen Hemmwirkung sind Oligonucleotide mit Sequenzen, welche zu entweder der codierenden Region oder der nichtcodierenden 5'-Region des Semaphorin-Gens der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen komplementär sind. Besonders bevorzugt werden Antisense-Nucleotide mit Sequenzen, welche zu der Transkriptionsinitiationsstelle, der Translationsinitiationsstelle, der nichtcodierenden 5'-Region, der Exon-Intron-Verbindungsregion oder der 5'-CAP-Region komplementär sind.
Die 16te Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der gegen das Protein der vierten Ausführungsform gerichtet ist. Ein solcher Antikörper kann in einfacher Weise mit Hilfe einer Maus oder eines Kaninchens gemäß den Verfahren hergestellt werden, welche zum Beispiel in "Current Protocols in Immunology", S. 2.4.1–2.6.6 (1992, J. E. Coligan, Hrsg.) beschrieben sind. Monoclonale Antikörper können ebenso in einfacher Weise mit Hilfe der Verfahren, welche in der oben erwähnten Referenz beschrieben sind, hergestellt werden. Solche Antikörper können bei einer Affinitätschromatographie oder zum Durchmustern von cDNA-Banken und als pharmazeutische oder diagnostische Mittel oder als Laborreagenzien verwendet werden. Einige dieser Antikörper weisen eine Neutralisierungsaktivität gegenüber Semaphorin Y auf. Diese Neutralisierungsaktivität kann in einfacher Weise bestimmt werden, wie vorstehend beschrieben, indem Semaphorin Y in ein Aktivitätstestsystem, welches in dem Abschnitt der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, eingebracht wird, und ferner eine Testsubstanz (d. h. ein möglicher Antikörper gegen Semaphorin Y) dazu zugegeben wird. Einige dieser neutralisierenden Antikörper werden als Regenerationspromotoren für ZNS-Neuronen dienen, wie nachstehend in dem Abschnitt der 21ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
Die 17te Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein pharmazeutisches Mittel, welches als aktiven Bestandteil eines der Gene (DNAs), Proteine, Antisense-Nucleotide oder chemisch modifizierten Varianten davon und der Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst.
Von diesen pharmazeutischen Mitteln werden Regeneratoren für ZNS-Neuronen und Neuritenauswuchsinhibitoren für PNS-Neurone in den Abschnitten der 21ten bzw. 22ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben. Vgl. daher die Abschnitte der 21ten bzw. 22ten Ausführungsform für solche Anwendungen.
In den letzten Jahren ist gezeigt worden, dass bestimmte Semaphorine nicht nur innerhalb des Nervensystems, sondern auch außerhalb des Nervensystems eine wichtige Rolle spielen. Zum Beispiel ist vorgeschlagen worden, dass Semaphorin möglicherweise bei der Inhibierung des Wachstums von Herzmuskeln wirksam ist (Nature 383 (1996), 525–528). Es ist auch vorgeschlagen worden, dass ein bestimmtes Semaphorin im Immunsystem an der Aggregation und dem Überleben von B-Lymphocyten beteiligt ist (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 11780–11785). Vor kurzem ist auch darauf hingewiesen worden, dass ein bestimmtes Semaphorin eine Rolle bei den Immunreaktionen bei Rheumatismus spielen kann (B. B. R. C. 234 (1997), 153–156). Ferner ist auch die Beteiligung von Semaphorinen an Lungenkrebs vorgeschlagen worden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 4120–4125).
Demgemäß wird erwartet, dass das Semaphorin Y der vorliegenden Erfindung oder modifizierte Proteine, Antisense-Nucleotide und dergleichen davon als antiallergische Mittel, immunosuppressive Mittel oder Anti-Tumor-Mittel nützlich sind. Für spezielle Anweisungen bezüglich der Verwendung, Dosierung und dergleichen vgl. die Abschnitte der 21ten und 22ten Ausführungsform.
Die 18te Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Screeningverfahren für Semaphorin Y-Antagonisten, dadurch gekennzeichnet, dass es das Protein der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet. Wie hierin verwendet, verweist "Semaphorin Y-Antagonist" auf eine Substanz, welche zum Beispiel die Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität von Semaphorin Y inhibiert.
Das Screening erfolgt durch das Einbringen von Semaphorin Y in ein Testsystem auf eine Semaphorin Y-Aktivität, welches in dem Abschnitt der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde, und ferner das Zugeben einer Testsubstanz dazu. Insbesondere kann die Inhibierung der Semaphorin Y-Aktivität, welche aus der Zugabe der Testsubstanz zu dem Kulturmedium über den gesamten Inkubationszeitraum oder nur vorübergehend innerhalb des Inkubationszeitraums resultiert, als ein Indikator in dem Semaphorin Y-Aktivitätstest, welcher unter Zugabe von Semaphorin Y durchgeführt wird, verwendet werden. Es ist auch wichtig zu bestätigen, dass die Testsubstanz allein in der gleichen Konzentration das Überleben und den Neuritenauswuchs der Neuronen nicht beeinflusst. Wenn diese beiden Anforderungen erfüllt werden, kann die Testsubstanz als ein Semaphorin Y-Antagonist angesehen werden. Obwohl bevorzugt wird, dass die Testsubstanz im Voraus in Form einer wässrigen Lösung hergestellt wird, kann auch ein organisches Lösungsmittel wie DMSO als Lösungsmittel verwendet werden. In jedem Fall ist es wichtig, das Volumen des Lösungsmittels auf ein Minimum zu begrenzen, um irgendwelche Effekte des Lösungsmittels auf die Neuronen auszuschließen. Genauer sollte das zugesetzte Volumen weniger als ein gleiches Volumen, vorzugsweise weniger als ein 1/10 Volumen und mehr bevorzugt weniger als ein 1/100 Volumen im Verhältnis zu dem Kulturmedium sein. Einige der auf diese Weise erhaltenen Semaphorin Y-Antagonisten werden als Regenerationspromotoren für ZNS-Neuronen dienen, wie nachstehend in dem Abschnitt der 21ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
Die 21te Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Regenerationspromotor für ZNS-Neuronen, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine(s) der Antisense-Nucleotide oder der chemisch modifizierten Varianten davon der 14ten oder 15ten Ausführungsform enthält. Da diese Ausführungsform die Verwendung von Substanzen bei der "Regenerationstherapie für ZNS-Neurones" betrifft, werden nachstehend spezielle Anweisungen für die Verwendung, Dosierung und dergleichen der Substanzen beschrieben.
1) Antisense-Nucleotid oder chemisch modifizierte Variante davon
Die Anwendung von Antisense-Nucleotiden ist bei verschiedenen Erkrankungen versucht worden, und in den letzten Jahren ist auch in Betracht gezogen worden, dass sie bei neurologischen Störungen anwendbar sind (TINS 20, Nr. 8 (1997), 321–322).
Wie vorstehend in dem Abschnitt der 14ten oder 15ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben, kann das Antisense-Nucleotid oder die chemisch modifizierte Variante davon der 14ten oder 15ten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Expression des Semaphorin Y-Gens zu inhibieren. Demgemäß kann ein solches Antisense-Nucleotid die Menge des Semaphorin-Proteins verringern und die Regeneration von ZNS-Neuronen fördern. Therapeutische Verfahren unter Verwendung des Nucleotids oder der Variante schließen solche ein, bei denen das Antisense-Oligonucleotid oder die chemisch modifizierte Variante davon selbst verabreicht wird, sowie solche, bei denen eine Antisense-RNA in den Zellen hergestellt wird.
Bei dem Verfahren unter Verabreichung des Antisense-Oligonucleotids oder der chemisch modifizierten Variante davon als solche(s) weist ein bevorzugtes Antisense-Oligonucleotid zum Beispiel eine Länge von etwa 5–200 Basen, mehr bevorzugt 8–25 Basen und besonders bevorzugt 12–25 Basen auf. Das Antisense-Oligonucleotid oder die chemisch modifizierte Variante davon kann durch das Vermischen mit einem Stabilisierungsmittel, Puffer, Lösungsmittel und dergleichen vor dem Verabreichen zubereitet werden. Eine solche Zubereitung kann zum Beispiel zusammen mit einem Antibiotikum, einem entzündungshemmenden Mittel oder einem Anästhetikum verabreicht werden. Obwohl die auf diese Weise hergestellte Zubereitung über verschiedene Wege verabreicht werden kann, wird die topische Verabreichung an eine Stelle, an der Neuronen in besonderem Maße gestört sind, bevorzugt. Üblicherweise erfordert die Regeneration von Neuronen mehrere Tage bis mehrere Monate, und die Zubereitung wird jeden Tag oder alle paar Tage bis Wochen während dieses Zeitraums verabreicht. Um solche häufigen Verabreichungen zu vermeiden, kann eine Minipellet-Formulierung mit anhaltender Freisetzung zubereitet und nahe der betroffenen Stelle implantiert werden. Alternativ kann eine Zubereitung zum Beispiel mit Hilfe einer osmotischen Pumpe allmählich und kontinuierlich an die betroffene Stelle verabreicht werden. Die Dosis wird typischerweise derart eingestellt, dass die Konzentration an dem Wirkort 0,1 nM bis 10 μM beträgt.
Bei dem Verfahren, bei dem eine Antisense-RNA in den Zellen hergestellt wird, weist eine bevorzugte Antisense-RNA zum Beispiel eine Länge von mehr als 100 Basen, vorzugsweise mehr als 300 Basen und mehr bevorzugt 500 Basen oder mehr auf.
Die Verfahren, mit deren Hilfe ein Gen, welches eine Antisense-RNA exprimiert, in einen Patienten eingebracht wird, schließen ein in-vivo-Verfahren, wobei das Gen direkt in die Zellen eines lebenden Körpers eingebracht wird, sowie ein ex-vivo-Verfahren, wobei das Gen ex vivo in bestimmte Zellen eingebracht wird und die Zellen wieder in den Körper eingebracht werden, ein (Nikkei Science, April 1994, S. 20–45; Gekkan-Yakuji, 36 (1) (1994), 23–48; Jikken-Igaku-Zokan, 12 (15), 1994; und darin angeführte Referenzen). Ein in-vivo-Verfahren wird mehr bevorzugt.
Solche in-vivo-Verfahren schließen ein Verfahren unter Verwendung von rekombinanten Viren und andere Verfahren ein (Nikkei Science, April 1994, S. 20–45; Gekkan-Yakuji, 36 (1) (1994), 23–48; Jikken-Igaku-Zokan, 12 (15), 1994, in seiner Gesamtheit; und darin angeführte Referenzen).
Die Verfahren unter Verwendung von rekombinanten Viren können auch Verfahren einschließen, bei denen ein Semaphorin-Gen in das Genom eines Virus, zum Beispiel eines Retrovirus, Adenovirus, adenoassoziierten Virus, Herpesvirus, Vacciniavirus, Poliovirus oder Sindbisvirus, eingebaut wird, und das rekombinante Virus in einen lebenden Körper eingebracht wird. Von diesen Verfahren werden solche unter Verwendung eines Retrovirus, eines Adenovirus oder eines adenoassoziierten Virus besonders bevorzugt.
Andere Verfahren können eine Liposomen-Methode oder eine Lipofection-Methode einschließen. Die Liposomen-Methode wird besonders bevorzugt.
Als ex-vivo-Verfahren können neben den oben beschriebenen Techniken auch die Mikroinjektionsmethode, die Calciumphosphat-Methode, die Elektroporation und dergleichen angewendet werden.
Die Verabreichung des Gens an einen Patienten erfolgt über geeignete Wege, welche von der speziellen Erkrankung oder dem speziellen Symptom, welche(s) behandelt werden soll, und dergleichen abhängen. Zum Beispiel kann es intravenös, intraarteriell, subkutan oder intramuskulär oder direkt an eine betroffene Stelle wie ein Neuron verabreicht werden. Wenn zum Beispiel das Rückenmark mit den rekombinanten Viren infiziert wird, wird die Expression des Semaphorin-Gens ausschließlich im Rückenmark inhibiert. Die Expression eines Antisense-Oligonucleotids der vorliegenden Erfindung hält typischerweise mehrere Tage bis mehrere Monate an, wobei eine solche einmalige Injektion ausreichend ist, um eine Regeneration der Neuronen zu ermöglichen. Das Gen kann auch erneut infiziert werden, falls es schwach exprimiert wird. Wenn es durch ein in-vivo-Verfahren verabreicht wird, kann das Gen zum Beispiel in Form einer Lösung zubereitet werden, wobei es typischerweise in Form einer Injektion, enthaltend das Semaphorin-Gen als aktiven Bestandteil, zubereitet wird, zu welcher gegebenenfalls ein herkömmlicher Träger oder dergleichen zugegeben werden kann. Im Falle von Liposomen oder membranverschmolzenen Liposomen (wie Sendaivirus (HVJ)-Liposomen), welche das Semaphorin-Gen enthalten, können die Liposomenzubereitungen in Form einer Suspension, eines Gefrierpräparates, eines durch Zentrifugation konzentrierten Gefrierpräparates oder dergleichen vorliegen.
Obwohl die Menge des Semaphorin-Gens in der Zubereitung in Abhängigkeit von der zu behandelnden Erkrankung, dem Alter und Gewicht des Patienten und dergleichen variieren kann, beträgt sie typischerweise 0,0001–100 mg und vorzugsweise 0,001–10 mg, wobei eine solche Zubereitung vorzugsweise einmal über mehrere Tage bis mehrere Monate verabreicht wird.
2) Modifiziertes Protein von Semaphorin Y
Wie vorstehend beschrieben, kann ein modifiziertes Semaphorin Y hergestellt werden, bei dem die Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität gegenüber ZNS-Neuronen eliminiert worden ist. Es wird erwartet, dass ein solches modifiziertes Protein bei der Verabreichung an einen lebenden Körper anstelle von Semaphorin Y an Rezeptoren für Semaphorin Y bindet, was die Inhibition der Semaphorin Y-Aktivität und die Förderung der Regeneration von ZNS-Neuronen zur Folge hat.
Ein solches modifiziertes Protein von Semaphorin Y wird zusammen mit einem Stabilisator, einem Puffer und einem Verdünnungsmittel zubereitet und zur Therapie an einen Patienten verabreicht. Eine solche Zubereitung kann über verschiedene Wege verabreicht werden, wobei die topische Verabreichung an eine zentrale Stelle bevorzugt wird. Da die Regeneration von Neuronen typischerweise mehrere Tage bis mehrere Monate erfordert, wird die Zubereitung einmal oder mehrmals verabreicht, um die Semaphorin Y-Aktivität während dieses Zeitraums kontinuierlich zu inhibieren. Wenn die Zubereitung mehr als einmal verabreicht wird, wird bevorzugt, dass sie jeden Tag oder wiederholt in geeigneten Abständen verabreicht wird. Wenn die Zubereitung durch Injektion an das ZNS verabreicht wird, zum Beispiel in das Rückenmark, werden mehrere Hundert μg bis 2 g, vorzugsweise weniger als mehrere Zehn mg, pro Verabreichung verwendet. Um die Verabreichungshäufigkeit zu verringern, kann die Zubereitung unter Verwendung einer Formulierung mit anhaltender Freisetzung oder allmählich über einen langen Zeitraum zum Beispiel mit Hilfe einer osmotischen Pumpe verabreicht werden. Alternativ kann sie verabreicht werden, indem Zellen, welche ein solches modifiziertes Semaphorin Y-Protein exprimieren, in einen lebenden Körper implantiert werden.
3) Peptid von Semaphorin Y
Einige der Peptide, welche in der vorliegenden Anmeldung beschrieben werden, unterdrücken die Neuritenauswuchs-Inhibitionsaktivität von Semaphorin Y gegenüber ZNS-Neuronen durch die Inhibierung der Bindung von Semaphorin Y an seine Rezeptoren, was die Förderung der Regeneration von ZNS-Neuronen zur Folge hat. Beispiele für ein Peptid mit einer solchen Wirkung schließen ein Peptid ein, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen Asparaginsäurerest in Position 198 des in SEQ ID NO: 6 dargestellten menschlichen Semaphorin Y oder einen Aminosäurerest an der Position, welche der Position des Asparaginsäurerestes entspricht, enthält, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Suppression kann eine kompetitive, nichtkompetitive, unkompetitive oder allosterische Inhibition beinhalten.
Was die Verfahren für die Zubereitung oder Verabreichung solcher Polypeptide und ihre Dosierungen anbetrifft, vgl. den vorhergehenden Abschnitt ''2) Modifiziertes Protein von Semaphorin Y''.
4) Antikörper gegen Semaphorin Y
Es wird erwartet, dass ein neutralisierender Antikörper, welcher die Aktivität von Semaphorin Y neutralisiert, die Regenerationstherapie für ZNS-Neuronen bei der Verabreichung an einen lebenden Körper durch die Inhibierung der Semaphorin Y-Aktivität unterstützt.
Die Verfahren für die Zubereitung oder Verabreichung solcher neutralisierenden Antikörper und ihre Dosierungen können den im vorhergehenden Abschnitt ''2) Modifiziertes Protein von Semaphorin Y'' beschriebenen entsprechen. Alternativ kann auch ein Verfahren angewendet werden, bei dem Zellen, welche einen monoclonalen Antikörper produzieren, direkt in das ZNS implantiert werden, wie in Nature 343 (1990), 269–272, beschrieben ist.
Die 22te Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Neuritenauswuchsinhibitor für PNS-Neuronen, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eines der Proteine der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält. Obwohl die Proteine der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung den Neuritenauswuchs von ZNS-Neuronen inhibieren können, wird auch erwartet, dass sie den Neuritenauswuchs von PNS-Neuronen inhibieren, da PNS-Neurone wahrscheinlich auch Rezeptoren für Semaphorin Y exprimieren und Rezeptoren für andere Semaphorine vermutlich auch mit Semaphorin Y reagieren. Demgemäß können sie aufgrund ihrer Inhibitionsaktivität auf den Neuritenauswuchs von PNS-Neuronen als therapeutische Mittel für atopische Dermatitis, Schmerzen oder andere Erkrankungen wirksam sein.
Was die Verfahren für die Zubereitung oder Verabreichung solcher Proteine und ihre Dosierungen anbetrifft, vgl. den vorhergehenden Abschnitt ''2) Modifiziertes Protein von Semaphorin Y''.
Die 23te Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein nicht-menschliches transgenes Tier, in welches das Gen nach einer der Ausführungsformen eins bis drei der vorliegenden Erfindung in sein Chromosom künstlich eingeführt oder darin ausgeschaltet worden ist.
Wie aus den folgenden Referenzen ersichtlich ist, kann ein Fachmann in ziemlich einfacher Weise ein nicht-menschliches transgenes Tier, welches das Gen der ersten, vierten oder neunten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung exprimiert; anhand der Geninformation für das Semaphorin Y der vorliegenden Erfindung erzeugen: "Manipulation of Mouse Embryo", herausgegeben durch Hogan B. et al., 1986, Cold Spring Harbor Laborstory; Shinichi Aizawa, "Gene Targeting", 1995, Yodosha; etc. Entsprechend ist das auf diese Weise erzeugte nicht-menschliche transgene Tier natürlicherweise im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Das so erzeugte nicht-menschliche transgene Tier ist als ein Tiermodell für die Entwicklung von Arzneisubstanzen oder als ein Tier für das Screening von Arzneisubstanzen sehr nützlich. Ferner ist ein sogenanntes nicht-menschliches Knockout-Tier, worin das Gen der ersten, vierten oder neunten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung deletiert worden ist, dadurch gekennzeichnet, dass es kein solches Gen enthält. Wie in der Literatur beschrieben oder auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist, können solche nicht-menschlichen Knockout-Tiere nicht ohne die Geninformation für das Semaphorin Y der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. Es ist daher selbstverständlich, dass solche nicht-menschlichen Knockout-Tiere im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
Obwohl Semaphorin Y eine wichtige in-vivo-Funktion in Bezug auf die Regeneration von Neuronen hat, wie vorstehend beschrieben, ist auch vorgeschlagen worden, wie oben erwähnt, dass Semaphorin Y andere unbekannte Funktionen wie eine Immunosuppression haben kann (Cell 75 (1993), 1389–1399). Demgemäß ist es sehr wichtig, die Expression des Semaphorin Y-Gens oder die Verteilung und die Funktion des Semaphorin Y-Proteins zu untersuchen, um dieses technische Gebiet zu studieren oder um eine Diagnose für Patienten mit neurologischen Störungen oder anderen Erkrankungen zu stellen. Die vorliegende Erfindung kann auch Gensonden, Antikörper, rekombinante Proteine, nicht-menschliche transgene Tiere und dergleichen bereitstellen, welche für solche Zwecke verwendet werden können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Aufnahme einer Elektrophorese, welche die Verteilung der Semaphorin Y-Expression, bestimmt durch eine Northern-Analyse, in verschiedenen Geweben zeigt.
Die Gesamt-RNA wurde aus verschiedenen Geweben von sechs Wochen alten Ratten extrahiert, auf einem 1%igen Agarose-Formamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, auf einen Filter geblottet und mit einer ³²P-markierten Ratten-Semaphorin Y-DNA-Sonde hybridisiert, um die Verteilung der Semaphorin Y-mRNA-Expression zu bestimmen. Auf jede Bahn wurden 15 μg RNA aufgetragen. Die obere Tafel zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie. Die Positionen, welche den ribosomalen 18S- und 28S-RNAs entsprechen, sind am linken Rand der Tafel angegeben. Die untere Tafel zeigt eine Ethidiumbromidfärbung des Gels. Die oberen und unteren Banden entsprechen den ribosomalen 28S- bzw. 18S-RNAs.
2 zeigt die Aufnahme einer Elektrophorese, welche die Verteilung der Semaphorin Y-Expression, bestimmt durch eine Northern-Analyse, in ZNS-Geweben zeigt.
Die Gesamt-RNA wurde aus ZNS-Geweben von sechs Wochen alten Ratten extrahiert, auf einem 1%igen Agarose-Formamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, auf einen Filter geblottet und mit einer ³²P-markierten Ratten-Semaphorin Y-DNA-Sonde hybridisiert, um die Verteilung der Semaphorin Y-mRNA-Expression zu bestimmen. Auf jede Bahn wurden 15 μg RNA aufgetragen. Die obere Tafel zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie. Die Positionen, welche den ribosomalen 18S- und 28S-RNAs entsprechen, sind am linken Rand der Tafel angegeben. Die untere Tafel zeigt eine Ethidiumbromidfärbung des Gels. Die oberen und unteren Banden entsprechen den ribosomalen 28S- bzw. 18S-RNAs.
3 zeigt die Aufnahme einer Elektrophorese, welche die Verteilung der Semaphorin Y-Expression, bestimmt durch eine Northern-Analyse, in menschlichen ZNS-Geweben zeigt.
Ein Membranfilter, auf den die mRNAs, welche aus verschiedenen Regionen der menschlichen ZNS-Gewebe präpariert wurden, nach einer Elektrophorese transferiert worden sind (2 μg/Bahn) (Clontech), wurde mit einer ³²P-markierten Semaphorin Y-DNA-Sonde hybridisiert, um die Verteilung der Semaphorin Y-mRNA-Expression zu bestimmen. Die Figur zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie. In dieser Figur geben die Pfeile die Positionen der Semaphorin Y-mRNA-Banden an. Die Positionen der Größenmarker in kb sind am linken Rand der Figur angegeben.
4 zeigt die Aufnahme einer Elektrophorese, welche die Expression des Semaphorin Y-Proteins in COS-7-Zellen zeigt.
Es wurde ein Expressionsplasmid für Semaphorin Y konstruiert, das zusätzlich 10 Aminosäuren des menschlichen c-Myc, angehängt an den C-Terminus davon, enthält, welches zur transienten Expression in COS-7-Zellen eingebracht wurde (angegeben als rSYmyc). Ein Plasmid, welches kein Semaphorin Y-Gen enthält, wurde als Kontrolle verwendet (angegeben als Kontrolle). Am Tag 3 nach dem Einbringen der Plasmide wurden die Zellen geerntet, und die Membranfraktion wurde präpariert. Die Membranfraktion wurde durch eine SDS-PAGE fraktioniert und dann einem Western-Blot-Verfahren unter Verwendung eines anti-Myc-Antikörpers unterzogen. In dieser Figur gibt der Pfeil die Position der Bande des Semaphorin Y-Proteins mit dem angehängten Myc-Peptid an. Die Positionen und Molekulargewichte der Größenmarker in kD sind am linken Rand der Figur angegeben.
5 zeigt die Aufnahme einer Elektrophorese, welche die in-vivo-Verteilung der Semaphorin III-Expression, bestimmt durch eine Northern-Analyse, in verschiedenen Geweben zeigt.
Die Gesamt-RNA wurde aus verschiedenen Geweben von erwachsenen Ratten extrahiert, auf einem 1 %igen Agarose-Formamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, auf einen Filter geblottet und mit einer ³²P-markierten Maus-Semaphorin III-DNA-Sonde hybridisiert, um die Verteilung der Semaphorin III-mRNA-Expression zu bestimmen. Auf jede Bahn wurden 15 μg RNA aufgetragen. Die obere Tafel zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie. Die Positionen der ribosomalen 18S- und 28S-RNAs sind am linken Rand der Tafel angegeben. Die untere Tafel zeigt eine Ethidiumbromidfärbung des Gels. Die oberen und unteren Banden entsprechen den ribosomalen 28S- bzw. 18S-RNAs.
Beispiele
Die grundlegenden Verfahren für die Experimente werden in vielen Veröffentlichungen wie zum Beispiel "Molecular Cloning, 2. Auflage", herausgegeben durch Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989); "Current Protocols in Molecular Biology", herausgegeben durch Ausubel et al. (John Wiley & Sons, 1987); und "Saibo-Kogaku-Jikken Protocols", herausgegeben durch das Department of Oncology, The Institute of Medical Science, The University of Tokyo (Shujunsha, 1991), ausführlich beschrieben. Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele nicht begrenzt werden, und die Beispiele können natürlich wie üblich modifiziert werden.
Beispiel 1
Isolierung des Ratten-Semaphorin Y-Gens
(1) Durchmusterung einer Datenbank nach einem neuen Semaphorin-Gen
Unter Verwendung der dbEST-Datenbank des National Center for Biotechnology Research (Bethesda, MD, USA) wurde eine Suche nach einer Sequenz durchgeführt, welche eine Aminosäuresequenz codiert, die bei bekannten Semaphorin-Genen relativ gut konserviert ist, und welche nur in cDNAs des postnatalen Gehirns, aber nicht in cDNAs aus peripheren Geweben vorkommt. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass die Basensequenz von Datei Nr. R59527 eine aus sieben Aminosäuren bestehende Sequenz codiert, welche alle bekannten Semaphorin-Gene gemeinsam haben (Gin (oder Arg)-Asp-Pro-Tyr-Cys-Ala (oder Gly)-Trp). Jedoch ist die aus 238 Basen bestehende Sequenzinformation von R59527 zu kurz, verglichen mit den cDNAs für bekannte Semaphorin-Gene, wobei nur wenige Prozent der gesamten Basen in eine Sequenz translatiert werden konnten, welche bekannte Semaphorine gemeinsam haben. Des Weiteren konnte das Leseraster nicht ermittelt werden, da die Sequenz von R59527 nicht der endgültig bestimmten Sequenz entspricht. Es war daher nicht möglich, daraus zu folgern, dass die Basensequenz von R59527 Teil eines neuen Semaphorin-Gens ist. Im Anschluss daran bestätigten die Erfinder zunächst, dass ein Gen, welches die vorstehende Sequenz enthält, im erwachsenen Gehirn exprimiert wird, und versuchten dann, die cDNA, welche die vorstehende Sequenz enthält, in der vollständiger Länge zu clonieren und die Genstruktur davon zu bestimmen.
(2) Bestätigung der Expression des Gens, enthaltend die Sequenz von R59527, im Gehirn
Um zu bestätigen, dass das Gen im ausgewachsenen menschlichen ZNS exprimiert wird, wurden zwei DNA-Primer, welche ein Segment von etwa 170 bp begrenzen, und zwar:
unter Zugrundelegung der Basensequenz von R59527 synthetisiert und in einer PCR unter herkömmlichen Bedingungen zusammen mit cDNAs, welche aus einer cDNA-Bank des menschlichen Gehirns (Clontech) präpariert wurden, als Matrizen verwen det. Als Ergebnis wurde erwartungsgemäß ein etwa 170 bp großes Fragment amplifiziert. Die DNA wurde dann entsprechend dem Protokoll des Herstellers in pCRII (Invitrogen) cloniert, und die Basensequenz wurde bestimmt, um zu bestätigen, dass das Fragment die gleiche Basensequenz wie die Sequenz von R59527 hat. Mehr als 98% der Sequenz, welche auf diese Weise erhalten wurde (SEQ ID NO: 7), stimmte mit der Sequenz von R59527 überein, wodurch bestätigt wurde, dass ein Gen, welches die Sequenz von R59527 enthält, im erwachsenen menschlichen Gehirn exprimiert wird.
(3) Isolierung des Ratten-Semaphorin Y-Gens
Unter Verwendung des in (2) clonierten 170 bp-Fragments, welches einem Teil von R59527 entspricht, als eine Sonde, clonierten die Erfinder eine cDNA vollständiger Länge, welche die Sequenz der Sonde enthielt, und ermittelten die Struktur. Da die Herstellung einer Ratten-cDNA-Bank einfacher als die einer menschlichen cDNA-Bank ist, wurde zuerst das Rattengen cloniert. Eine cDNA-Bank wurde mittels herkömmlicher Methoden, die in den oben genannten Laborhandbüchern beschrieben sind, unter Verwendung von mRNAs, welche aus dem Gehirn und den Muskeln einer Ratte präpariert wurden, mittels üblicher Verfahren mit Hilfe des Lambda Zap II (λZapII)-cDNA Library Preparation Kit (Stratagene) hergestellt. Unter Verwendung der cDNA-Bank wurden dann etwa 150.000 Plaques auf Agarplatten erzeugt, und die Plaques wurden auf Nylonmembranen (Nippon Pall) übertragen. Nach einer Denaturierung und Neutralisierung wurden die DNAs mit Ultraviolettstrahlen von 0,6 J/cm² fixiert und für eine Hybridisierung verwendet. Die Hybridisierung wurde ausgeführt, indem die Nylonmembran und das mit ³²P markierte 170 bp-DNA-Fragment (hergestellt unter Verwendung des Megaprime DNA Labeling System (Amersham)) als eine Sonde in einen Hybridisierungspuffer (45% (Vol./Vol.) Formamid, 5x SSPE (1x SSPE besteht aus 0,15 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumdihydrogenphosphat und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz, eingestellt auf pH 7,0), 2x Denhardt-Lösung (Wako Pure Chemical industries), 0,5% (Gew.-/Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 20 μg/ml Lachssperma-DNA (Wako Pure Chemical industries)), eingebracht und bei 42°C für 48 Stunden stehen gelassen wurden. Nach der Umsetzung wurde die Nylonmembran 2–3-mal in 2x SSPE, 0,5% (Gew./Vol.) SDS bei Raumtemperatur für 10 min und dann 2–3-mal in 2x SSPE, 0,5% (Gew./Vol.) SDS bei 42°C für 10 min gewaschen. Die auf diese Weise präparierten Filter wurden mittels eines BAS 2000 Bio Imaging Analyzer (Fuji Film) analysiert, wobei sechs positive Signale erhalten wurden. Die Plaques, welche den positiven Signalen entsprachen, wurden aus den Agarplatten ausgeschnitten, in 500 μl SM-Puffer (100 mM Natriumchlorid, 15 mM Magnesiumsulfat, 50 mM Tris (pH 7,5), 0,01% Gelatine), ergänzt mit 20 μl Chloroform, eingebracht und über Nacht bei 4°C stehen gelassen, um die Phagen zu eluieren. Die auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Lambda-Phagen wurden einer zweiten Durchmusterung gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren unterzogen, wobei einzelne Plaques isoliert wurden. Die so erhaltenen Phagen wurden in folgender Weise für die in-vivo-Exzision eines Phagemids, welches die cDNA-Insertion enthält, gemäß den durch Stratagene bereitgestellten Protokollen behandelt. Agargele, welche die bei der zweiten Durchmusterung erhaltenen, vier einzelnen Plaques enthielten, wurden jeweils in 500 μl SM-Puffer, ergänzt mit 20 μl Chloroform, eingebracht und dann über Nacht bei 4°C stehen gelassen. 250 μl der erhaltenen Phagenlösung, 200 μl E. coli XL-1 Blue MRF', suspendiert in 10 mM Magnesiumchlorid bei OD₆₀₀ = 1,0, und 1 μl ExAssist-Helferphagen (> 1 × 10⁶ PbE/ml) wurden gemischt und bei 37°C für 15 min inkubiert. Anschließend wurden 3 ml LB-Medium zugegeben (hergestellt durch Vermischen von 0,5% (Gew.-/Vol.) Natriumchlorid, 1% (Gew.-/Vol.) Bactotrypton (Difco) und 0,5% (Gew.-/Vol.) Hefeextrakt (Difco), wobei das Gemisch unter Verwendung von 5 M Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt wurde), und das Gemisch wurde bei 37°C für 2–3 Stunden geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 2000 × g für 15 min entfernt, und der Überstand wurde bei 70°C für 15 min wärmebehandelt. Der Überstand wurde dann noch einmal bei 2000 × g für 15 min zentrifugiert und als eine Stammlösung eines Phagemids, welches die cDNA-Insertion enthält, gewonnen. Ein Aliquot (10–100 μl) der Phagemid-Stammlösung wurde mit 200 μl E. coli SOLR (OD₆₀₀ = 1,0) vermischt und bei 37°C für 15 min inkubiert. Im Anschluss daran wurden 10–50 μl des Gemisches auf eine Ampicillinpiatte ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert, um einen E. coli-Stamm zu erhalten, welcher das Phagemid enthält, das dem vorstehenden positiven Plaque entspricht.
(4) DNA-Sequenzierung
Die Basensequenz des cDNA-Clons, der auf diese Weise erhalten wurde, wurde mit einem Perkin-Elmer Model 377 DNA-Sequencer, analysiert, um die vollständige Basensequenz zu ermitteln. Die Reaktion wurde unter Verwendung des PRISM Dye-Terminationskits (Perkin-Elmer) ausgeführt. Die auf diese Weise ermittelte DNA-Basensequenz (3195 Basen), das mutmaßliche offene Leseraster (2787 Basen) und die Aminosäuresequenz (929 Aminosäuren sind in SEQ ID NO: 1, 2 bzw. 3 dargestellt.
Das Protein wies in der Aminosäuresequenz an Position 46 bis 570 eine sogenannte Semaphorin-Domäne auf, wodurch endgültig bestätigt wurde, dass das Protein zu der Semaphorin-Familie gehört. Das Protein, welches durch das Gen codiert wird, wurde daher als Semaphorin Y bezeichnet. Außerdem, da die Basensequenz an Position 1574 bis 1811 in dem Semaphorin Y-Gen, dargestellt in SEQ ID NO: 1, eine Identität von 89% zu der gesamten Sequenz von R59527, bestehend aus 238 bp, aufwies, wurde bestätigt, dass R59527 eine Teilsequenz des menschlichen Semaphorin Y-Gens ist.
Beispiel 2
Verteilung der Ratten-Semaphorin Y-Expression, bestimmt durch eine Northern-Analyse
Um die Verteilung der Semaphorin Y-Genexpression in Rattengeweben zu bestimmen, wurden RNAs aus verschiedenen Geweben präpariert und in einer Northern-Analyse verwendet. Die RNAs wurden unter Verwendung verschiedener Rattengewebe gemäß der AGPC-Methode (Takashi Tuji und Toshikazu Nakamura, Jikken-Igaku, Bd. 9 (1991), S. 1937–1940; Ausubel M. F. et al., Hrsg., "Current Protocols in Molecular Biology", 1989, S. 4.2.4–4.2.8, Greene Pub. Associates & Wiley-Interscience) wie folgt präpariert. Kurz zusammengefasst wurden 10 ml einer Denaturierungslösung (4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,5% Sarkosyl, 0,1 M 2-Mercaptoethanol) zu jeweils 1 g der entfernten Gewebe zugegeben und unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators schnell homogenisiert. Zu dem Homogenat wurden 0,1 Volumenteile an 2 M Natriumacetat (pH 4,0), 1 Volumenteil an wassergesättigtem Phenol und 0,2 Volumenteile an Chloroform-Isoamylalkohol (49:1) zugegeben, und das Gemisch wurde stark gerührt. Nach dem Zentrifugieren wurde die wässrige Schicht isoliert und ein gleiches Volumen an Isopropylalkohol dazugegeben, und das Gemisch wurde bei –20°C für 1 Stunde stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gewonnen und in 2–3 ml Denaturierungslösung pro 1 g Gewebe wieder gelöst. Ein gleiches Volumen an Isopropylalkohol wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei –20°C für 1 Stunde stehen gelassen, und anschließend wurde die RNA zentrifugiert. Der Niederschlag wurde mit 75%igem Ethylalkohol gewaschen, kurz getrocknet und dann in einer geeigneten Menge an Wasser gelöst.
Anschließend wurde eine Elektrophorese und ein Northern-Blot-Verfahren unter Verwendung der RNAs mittels der nachstehend beschriebenen herkömmlichen Verfahren durchgeführt. Die aus verschiedenen Geweben präparierten RNAs wurden zunächst auf einem 1%igen Agarosegel, enthaltend Formaldehyd, elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde in 50 mM NaOH für 20 min und dann in 10x SSPE für 40 min geschüttelt. Die RNAs wurden dann mittels Kapillartransfer auf eine Nylonmembran (Biodyne B, Nippon Pall) geblottet und unter Verwendung eines UV-Crosslinkers (Stratagene) (0,6 J/cm²) zur Verwendung bei einer Hybridisierung fixiert. Eine Sonde wurde wie folgt hergestellt. Zunächst wurde eine PCR unter Verwendung von zwei Primern, und zwar 5'-TGTGTAAACGTGACATGG-3' (SEQ ID NO: 10) und 5'-TGCTAGTCAGAGTGAGGA-3' (SEQ ID NO: 11), und der in Beispiel 1 erhaltenen Ratten-Semaphorin Y-cDNA als eine Matrize durchgeführt, um ein Fragment von 477 bp zu amplifizieren. Dieses Fragment wurde in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, in pCRII cloniert, und die Basensequenz wurde bestimmt, um zu bestätigen, dass das Fragment ein Fragment des Ratten-Semaphorin Y-Gens ist. Unter Verwendung dieser Plasmid-DNA als eine Matrize und den vorstehenden Primern wurde eine PCR in herkömmlicher Weise durchgeführt, um das gewünschte Fragment von 545 bp zu amplifizieren. Die amplifizierte DNA, welche unter Verwendung eines Agarosegels aufgetrennt und gereinigt wurde, wurde unter Verwendung des Megaprime DNA Labeling System (Amersham) mit ³²P markiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und als eine Sonde verwendet. Die Hybridisierung wurde ausgeführt, indem die Nylonmembran und die Sonden-DNA in denselben Hybridisierungspuffer, wie unter (2) beschrieben, eingebracht und bei 42°C für 48 Stunden stehen gelassen wurden. Nach der Umsetzung wurde die Nylonmembran 2–3-mal in 2x SSPE, 0,5% (Gew./Vol.) SDS für 10 min bei 42°C und dann 2–3-mal in 2x SSPE, 0,5% (Gew.-/Vol.) SDS bei 55°C für 10 min gewaschen. Die Radioaktivität auf der Membran wurde dann unter Verwendung eines BAS 200 Bio-Imaging Analyzer analysiert. Wie in 1 und 2 dargestellt, zeigte das Ergebnis, dass die mRNA für Semaphorin Y im ausgewachsenen ZNS breit exprimiert wurde, während in peripheren Geweben, mit Ausnahme der Muskeln allein, keine Expression nachgewiesen wurde, was den charakteristischen Merkmalen eines Regenerationsinhibitors für ZNS-Neuronen entspricht, welche für das Semaphorin-Gen erwartet wurden.
Beispiel 3
Sequenzbestimmung des menschlichen Semaphorin Y
Da gezeigt worden ist, dass R59527 Teil des menschlichen Semaphorin Y-Gens ist, wie vorstehend beschrieben, wurde ein EST-Clon, enthaltend die Sequenz von R59527 (#41581), von Genome Systems Inc. (USA) erworben, und die vollständige Basensequenz wurde mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens ermittelt. Die ermittelte Basensequenz wies eine hohe Homologie zu der gesamten Basensequenz des in SEQ ID NO: 1 dargestellten Ratten-Semaphorin Y auf, wobei 74% der Basen identisch waren. Zusätzlich enthält die 5'-Region der Basensequenz einen Bereich, vermutlich einen Teil des offenen Leserasters, welcher fortlaufend in 427 Aminosäuren translatiert werden konnte. Diese Aminosäuresequenz wies eine Identität von 82% zu derjenigen der Region von Position 504 bis Position 929 des in SEQ ID NO: 3 dargestellten Ratten-Semaphorin Y-Gens auf, was zeigt, dass die Sequenz sehr wahrscheinlich ein Teil des menschlichen Semaphorin Y ist. Jedoch konnte die Sequenz, welche dem N-Terminus des menschlichen Semaphorin Y entspricht, anhand des Clons #41581 nicht bestimmt werden. Um die vollständige Basensequenz des menschlichen Semaphorin Y zu ermitteln, wurden menschliche Hippocampus- und Vorderhirn-cDNA-Banken, welche von Stratagene bezogen wurden, unter Verwendung von verschiedenen Ratten-Semaphorin Y-cDNA-Fragmenten als Sonden durchmustert, wie vorstehend beschrieben, wobei der Clon #10 erhalten wurde. Die Basensequenz des Clons #10, welche mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt wurde, deckte sich über eine Länge von etwa 200 Basen mit dem vorstehenden Clon #41581 und enthielt ferner in seiner 5'-Region eine cDNA-Sequenz, welche aus mehr als 1700 Basen bestand. Die vollständige Basensequenz (3432 Basen), welche aus #41581 und #10 konstruiert wurde, das offene Leseraster (2790 Basen) und die Aminosäuresequenz (930 Aminosäuren) des menschlichen Semaphorin Y sind in SEQ ID NO: 4, 5 bzw. 6 dargestellt. Das menschliche Semaphorin Y wies auf der Aminosäureebene eine Identität von 87% zu dem Ratten-Semaphorin Y auf.
Der E. coli-Stamm SOLR (hSY10), eine Transformante, welche durch Einführung des Plasmids hSY10, enthaltend die Insertion des vorstehenden Clans #10 (die Region, welche der cDNA für das menschliche Semaphorin Y entspricht) in einem pBluescript-Vektor, in den E. coli-Stamm SOLR erhalten wurde, ist bei The National Institute of Bioscience and Human Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6021 am 11. Juli 1997 hinterlegt worden.
Der E. coli-Stamm DH10B (N041581), eine Transformante, welche durch Einführung des Plasmids N041581, enthaltend die Insertion des vorstehenden Clans #41581 (die Region, welche der cDNA für das menschliche Semaphorin Y entspricht) in dem Vektor Lafmid BA, in den E. coli-Stamm DH10B erhalten wurde, ist bei The National Institute of Bioscience and Human Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6022 am 11. Juli 1997 hinterlegt worden.
Beispiel 4
Verteilung der menschlichen Semaphorin Y-Expression, bestimmt durch eine Northern-Analyse
Die Northern-Analyse wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, mittels einer menschlichen mRNA-Blottingmembran (Clontech) unter Verwendung eines Ratten-Semaphorin Y-cDNA-Fragments, bestehend aus 479 bp von Position 832 bis Position 1310 in SEQ ID NO: 1, welches durch eine PCR erhalten wurde, als eine Sonde durchgeführt, um die Verteilung der Semaphorin Y-mRNA-Expression in verschiedenen Regionen von menschlichen erwachsenen ZNS-Geweben zu bestimmen. Wie in 3 gezeigt, wurde die menschliche Semaphorin Y-mRNA in verschiedenen Regionen der erwachsenen ZNS-Gewebe breit exprimiert, wobei eine besonders hohe Expression im Cerebellum beobachtet wurde.
Wie oben erwähnt, wird Semaphorin Y in menschlichen ZNS-Geweben breit exprimiert, was auch für das Rattenhomolog davon zutrifft; dies zeigt, dass Semaphorin Y für Funktionen verantwortlich sein kann, welche bei Nagetieren und Primaten verbreitet sind.
Beispiel 5
Expression von Semaphorin Y in tierischen Zellen
Ein Fragment, welches einen Myc-Marker mit der Sequenz Asp-Ile-Gly-Gly-Glu-Gin-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu codiert, wurde unmittelbar vor dem Stoppcodon des Ratten-Semaphorin Y-Gens eingeführt, und das rekombinante Gen wurde in das Expressionsplasmid pUCSRα eingebracht. Das Expressionsplasmid wurde gemäß der DEAE-Dextran-Methode ("Current Protocols in Molecular Biology", herausgegeben durch F. M. Ausubel, John Wiley & Sons, 1987) in COS-7-Zellen eingeschleust, und die Zellen wurden mit Hilfe einer Abschabvorrichtung für Zellen nach 48 Stunden geerntet. Die geernteten Zellen wurden in Gegenwart von Lösung A, enthaltend Proteaseinhibitoren (physiologische Kochsalzlösung nach Hank, enthaltend 10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, 50 μM Leupeptin, 2 μM Pepstatin, 0,5 mM PMSF und 7,8 mTIU/ml Aprotinin), homogenisiert, und das Homogenat wurde mittels Ultrazentrifugation bei 12.000 × g für 10 min in einen Niederschlag und einen Überstand aufgetrennt. Der mittels Ultrazentrifugation erhaltene Niederschlag, welcher die Membranfraktion enthielt, wurde zweimal mit Lösung A gewaschen, in 2 Volumenteilen an 2,25 M Saccharose/PBS suspendiert und auf 2,25 M Saccharose/PBS überschichtet. Nachdem weiteres 0,8 M Saccharose/PBS darauf überschichtet worden waren, wurde das Gemisch bei 12.000 × g für 20 min zentrifugiert. Die Membranfraktion wurde an der unteren Grenzfläche gewonnen, weiterhin zweimal gewaschen und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
Die erhaltene Membranfraktion wurde einer SDS-PAGE (10%–20% Gradientengel) und dann einem Western-Blot-Verfahren in herkömmlicher Weise unterzogen, um die Produktion des erfindungsgemäßen Semaphorin Y zu bestätigen. Bei diesem Verfahren wurden der anti-Myc-Antikörper 9E10 (Calbiochem) und ein mit alkalischer Phosphatase markierter anti-Maus-IgG-Antikörper (Biosource) als der Primär- bzw. Sekundärantikörper verwendet. Das Ergebnis des Western-Blots zeigte eine spezifische Bande an der Position, welche etwa 130 kDa entspricht, wie in 4 gezeigt ist, wodurch bestätigt wird, dass das Myc-markierte Ratten-Semaphorin Y-Protein in COS-Zellen exprimiert wurde und in der Membran vorhanden war.
Beispiel 6
Aktivitätsmessung von Semaphorin Y
Die in Beispiel 5 erhaltene Membranfraktion und eine andere Membranfraktion, welche in gleicher Weise aus nicht mit Semaphorin Y transfizierten COS-7-Zellen hergestellt wurde, werden jeweils zu einem Kulturmedium für Neuronen wie ZNS-Neuronen oder Ganglienzellen der Vorderwurzel zugegeben, und die Wachstumskegel-Kollapsaktivitäten werden mit Hilfe der bei Igarashi M. et al., Science 259 (1993), 77–79, beschriebenen Methode verglichen. Das Ergebnis zeigt, dass die Membranfraktion von COS-7-Zellen, welche mit dem Expressionsplasmid für Semaphorin Y transfiziert sind, eine signifikant hohe Wachstumskegel-Kollapsaktivität aufweist.
Referenzbeispiel 1
Identifizierung der Stelle, welche für die Semaphorin-Aktivität unerlässlich ist, unter Verwendung von Semaphorin III
Basierend auf der Sequenzinformation für Semaphorin III, welche in Neuron 14 (1995), 941–948, beschrieben ist, wurde eine PCR durchgeführt, und das Strukturgen von Semaphorin III wurde in das Expressionsplasmid pUCSRα eingeführt. Das Expressionsplasmid wurde dann gemäß der DEAE-Dextran-Methode in COS-7-Zellen eingeschleust. Nach zwei Tagen wurde die in dem Kulturüberstand enthaltene Semaphorin III-Aktivität durch eine ähnliche Methode, wie in Cell 75 (1993), 217–227, beschrieben, mittels der Wachstumskegel-Kollapsaktivität gegenüber von Ganglienzellen der Vorderwurzel des Huhns als ein Indikator bestimmt. Als Ergebnis wurde ein Clon identifiziert, welcher keine Aktivität zeigte. Die Basensequenzierung des Clans ergab, dass der Asparaginsäurerest in Position 198 durch Glycin substituiert war. Im Vergleich zu anderen bekannten tierischen Semaphorinen waren die Regionen vor und nach der Position 198 nicht ausgesprochen konserviert, während die Position, welche dem Asparaginsäurerest entspricht, mit wenigen Ausnahmen, bei denen Glutaminsäure an dieser Position vorhanden war, bei Semaphorinen stark konserviert war. Dies legt nahe, dass der Asparaginsäurerest für die Ausprägung der Aktivität unerlässlich ist. Das Gen wurde dann einer ortsspezifischen Mutagenese mittels einer herkömmlichen Methode unterzogen, um den Glycinrest durch einen Asparaginsäurerest zu ersetzen. Da durch diese Mutagenese die starke Kollapsaktivität wiederhergestellt wurde, wurde bestätigt, dass alle Regionen in dem Expressionsplasmid mit Ausnahme dieser Position normal funktionieren. Folglich ist der Asparaginsäurerest in Position 198 von Semaphorin III für die Ausprägung der Funktion von Semaphorin anscheinend unerlässlich. Die Aminosäurereste, welche dem Asparaginsäurerest entsprechen, sind der Asparaginsäurerest an Position 197 in der Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 3 dargestellten Ratten-Semaphorin Y und der Asparaginsäurerest an Position 198 in der Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 6 dargestellten menschlichen Semaphorin Y.
Referenzbeispiel 2
Gewebespezifische Genexpression von Semaphorin III, bestimmt durch eine Northern-Analyse
Um die Verteilung der Semaphorin III-Genexpression in Geweben der Maus zu bestimmen, wurden RNAs aus verschiedenen ausgewachsenen Geweben der Maus präpariert und einer Northern-Analyse unterzogen. Die Verfahren für die Präparation, das Blotten und die Hybridisierung der RNA entsprachen den in Beispiel 2 beschriebenen. Als Sonde wurde das 560 bp große MspI-Fragment der in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Maus-Semaphorin III-DNA verwendet. Als Ergebnis wurde gezeigt, wie in 5 dargestellt, dass die Expression von Semaphorin III bei dem erwachsenen Tier in der Lunge außerordentlich hoch ist, während sie im ZNS eher niedrig ist.
Auswirkungen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Semaphorin Y, das den Neuritenauswuchs inhibiert, und ein Gen dafür sowie andere Semaphorine, welche mit dem Semaphorin Y-Gen hybridisieren, Antikörper gegen Semaphorin Y, Antisense-Nucleotide gegen das Semaphorin Y-Gen und die Verwendung solcher Substanzen als pharmazeutische oder diagnostische Mittel oder als Laborreagenzien bereit. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Screeningverfahren für Semaphorin Y-Antagonisten unter Verwendung von Semaphorin Y, pharmazeutische Mittel und nicht-menschliche transgene Tiere, welche Semaphorin Y einschließen, bereit. SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA codierend zumindest die reife Form eines Proteins umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 3 oder 6; (b) DNA umfassend die Rasensequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1, 2, 4 oder 5; (c) DNA umfassend die cDNA der Insertion enthalten in dem Plasmid hinterlegt unter Hinterlegungsnummer FERM BP-6021 oder FERM BP-6022; (d) DNA, welche unter stringenten Bedingungen hybridisiert und eine Homologie von 80% oder mehr zu DNA nach (b) oder (c) hat und welche ein Protein codiert, dass Neuritenauswuchs inhibiert; und (e) DNA, welche unter stringenten Bedingungen hybridisiert und eine Homologie von 80% oder mehr zu DNA umfassend die Rasensequenz dargestellt in SEQ ID NO: 7 hat und ein Protein mit einer Semaphorindomäne codiert.
Expressionsplasmid, welches die DNA nach Anspruch 1 exprimiert.
Wirstszelle transformiert mit dem Expressionsplasmid nach Anspruch 2.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, wobei das Verfahren das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 3 und das Gewinnen des exprimierten rekombinanten Proteins umfasst.
Protein codiert von der DNA nach Anspruch 1 oder erhältlich durch das Exprimieren der DNA nach Anspruch 1.
Antisense-Nucleotid oder chemisch modifizierte Variante davon, welche(s) gegen ein Segment gerichtet ist, umfassend zumindest acht oder mehr Basen in der DNA nach Anspruch 1.
Antisense-Nucleotid oder chemisch modifizierte Variante davon nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es (sie) in der Lage ist, die Expression des Proteins nach Anspruch 5 zu inhibieren.
Antikörper gegen das Protein nach Anspruch 5.
Pharmazeutisches Agens umfassend, als aktiven Bestandteil, die DNA nach Anspruch 1, das Protein nach Anspruch 5, das Antisense-Nucleotid oder die chemisch modifizierte Variante davon nach Anspruch 6 oder 7, oder den Antikörper nach Anspruch 8.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Verwendung als ein antiallergisches, immunosuppressives oder anti-Tumor-Agens.
Diagnostisches Agens umfassend die DNA nach Anspruch 1, das Protein nach Anspruch 5, das Antisense-Nucleotid oder die chemisch modifizierte Variante davon nach Anspruch 6 oder 7, oder den Antikörper nach Anspruch 8.
Screeningverfahren für Semaphorin Y-Antagonisten, dadurch gekennzeichnet, dass es das Protein nach Anspruch 5 verwendet.
Zusammensetzung, welche die Regeneration von CNS-Neuronen fördert, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest eines der Antisense-Nucleotide oder der chemisch modifizierten Varianten davon nach Anspruch 6 oder 7 oder den Antikörper nach Anspruch 8 enthält.
Neuritenauswuchsinhibitor für PNS-Neurone, dadurch gekennzeichnet, dass er zumindest eines der Proteine nach Anspruch 5 enthält.
Nicht-menschliches transgenes Tier, wobei die DNA nach Anspruch 1 artifiziell in sein Chromosom inseriert oder ausgeschaltet wurde.