WO1998011216A1 - Nouveau gene de semaphorine: semaphorine y - Google Patents

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WO1998011216A1
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semaphorin
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protein
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dna
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PCT/JP1997/003167
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Toru Kimura
Kaoru Kikuchi
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to semaphorin Y, which is a novel semaphorin belonging to the semaphorin family, and use of the semaphorin Y as a medicine or a diagnostic reagent. More specifically, semaphorin Y and its gene that act suppressively on nerve elongation, or other semaphorins that hybridize to the semaphorin Y gene, modified proteins of semaphorin Y, partial peptides, and antibodies Conventional techniques relating to the antisense nucleotide of the semaphorin Y gene, antagonists of the semaphorin Y, transgenic animals, or the use of these substances as pharmaceuticals, diagnostics or research reagents
  • the central nervous system has no ability to regenerate once damaged. For this reason, a person whose spinal cord has been damaged in a traffic accident or the like must spend half his life as a paraplegic.
  • the peripheral nerves maintain vigorous regenerative ability even in these higher organisms, and the nerves of the limbs gradually regenerate even once cut, and the function is restored accordingly.
  • the nervous system in order for the nervous system to transmit and process information, which is the main function of the nervous system irrespective of the central and peripheral parts, it is necessary in the developmental stage, that is, in the process of the embryo or fetus, between the nerve cells or between the nerve cells and the periphery A complex neural network must be formed between these receptors and effectors.
  • the formation of neural networks requires a sophisticated mechanism that accurately guides the growing neurites to distant target sites.
  • a representative factor having such an elongation inhibitory activity is a protein called “semaphorin”.
  • the first semaphorin discovered was fasciculin IV, which was discovered in the evening. Collapsin (later named collapsin I) was later discovered in chickens (Cell, 75, 217-227 (1993); Neuron , 9, 831-845 (1992)), and more than 10 genes belonging to the semaphorin family have been reported, ranging from insects such as Drosophila and butterflies to humans or viruses (Cell, 81, 471-474 (1995)).
  • semaphorins are characterized by having a similar structure on their amino acid sequence consisting of about 500 amino acids called the semaphorin domain (Neuron, 14, 941-948 (1995), Cell, 75, 1389-1399 (1993)).
  • the semaphorin gene phase The similarity of the semaphorin domain between the amino acids in the primary sequence is 80% -20%, not necessarily high.
  • semaphorins those whose functions have been confirmed include Fasciclin IV in Buck, Semaphorin I and II in Drosophila, Collapsin in chickens, and Semaphorin III as collapsin in mammals. All of these are known to act suppressively on neurite outgrowth and synapse formation. In particular, semaphorin III has also been reported to have an activity to regenerate cultured nerve growth cones in a short time (growth cone retraction activity) (Neuron, 14, 941-948 (1995), Ne uron.
  • semaphorin III which is the only functionally analyzed in higher organisms, has an activity to inhibit the outgrowth of sensory or sympathetic nerves, while the retina is a central nerve. No effect on nerves has been shown by in vitro experimental results (Cell, 75, 217-227 (1993)).
  • Semalll As a result of examining the expression distribution in adults by Northern analysis, it has been found that the expression is mainly expressed in peripheral tissues (see Reference Example 2 described later). Therefore, it is unlikely that such Sema III has a function as a central nervous system regeneration inhibitory factor.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a new semaphorin belonging to the semaphorin family, semaphorin Y, and a drug related to neurological diseases, in particular, a drug related to regeneration of central nervous system by providing the gene thereof. Or diagnostic reagents or research reagents.
  • semaphorin Y and its gene that act suppressively on neural elongation or other semaphorins that hybridize to the semaphorin Y gene, modified proteins of semaphorin Y, partial peptides, Antibodies, antisense nucleotides of the semaphorin Y gene, or the use of these substances as pharmaceuticals or diagnostic agents or research reagents, and further, a method of screening for a semaphorin Y antagonist using the semaphorin Y,
  • An object of the present invention is to provide a semaphorin Y antagonist obtained by the screening method, a medicine containing these semaphorin Y, a transgenic animal for the semaphorin Y, and the like.
  • the present inventors have considered to identify a novel semaphorin that has not been cloned yet for the purpose of providing a drug related to a neurological disease, particularly a drug related to regeneration of the central nervous system, or a diagnostic agent or a research reagent. .
  • a novel semaphorin that has not been cloned yet for the purpose of providing a drug related to a neurological disease, particularly a drug related to regeneration of the central nervous system, or a diagnostic agent or a research reagent.
  • NI35 / 250 has growth cone retraction activity and neurite outgrowth inhibitory activity in vitro ( J.
  • semaphorin III also has a growth cone regression activity, among other unknown semaphorins that have not yet been identified, 993)
  • semaphorins are characterized by the following characteristics: 1) they are widely expressed in the adult central nervous system in which nerve regeneration (extension) is suppressed, but 2) they are rarely expressed in the peripheral tissues of adults. Although it is not yet known, if an unknown semaphorin having such characteristics can be identified, it was considered that the semaphorin might be involved in inhibiting regeneration of the central nervous system.
  • the sequence information of the R59527 is only 238 bases, and among them, only a few percent of the amino acids that can be translated into a common sequence with a known semaphorin are limited. Since the open reading frame for amino acid could not be determined due to the presence of an undetermined portion, it was almost impossible to conclude that the nucleotide sequence of R59527 was part of a novel semaphorin.
  • we synthesized a DNA primer based on this sequence information performed PCR on the cDNA prepared from a human hippocampus cDNA library using the primers, performed PCR, and obtained a novel 170-base DNA. DNA fragment (SEQ ID NO: 7) was obtained.
  • the semaphorin ⁇ gene was different from the known semaphorin gene and was widely expressed in the adult central nervous system, but was expressed only in a limited number of peripheral tissues. It has been clarified that this is a novel semaphorin intended by the inventors.
  • the semaphorin ⁇ of the present invention having such characteristics is considered to be involved in the inhibition of central nervous system regeneration in adults.
  • the semaphorin ⁇ can be used to screen for semaphorin ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ antagonists, and the antagonists found by such a screening system could promote central nervous system regeneration.
  • antisense DN N or RN ⁇ of the semaphorin ⁇ ⁇ gene may promote the regeneration of the central nervous system in the same manner as the antagonist.
  • the semaphorin Y of the present invention acts on nerve elongation in an inhibitory manner, when applied to peripheral tissues, it inhibits peripheral nerve elongation, thereby making it possible to control skin elongation. It can also be used as a therapeutic or diagnostic agent for immune diseases such as inflammation and pain.
  • the semaphorin Y is a novel semaphorin belonging to the semaphorin family, and its expression distribution is unprecedented as described above. It also has the feature that it does not have the Ig domain commonly found in semaphorins. Therefore, the semaphorin Y becomes an important research material and research reagent in the relevant field.
  • the present invention has been completed based on these research results. That is, the gist of the present invention is:
  • Semaphorin Y protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6
  • Semaphorin YDNA consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5
  • one or more amino acids are composed of a deleted, substituted and Z- or added amino acid sequence, and A gene consisting of DNA that encodes a facilitating protein,
  • a protein obtained by expressing the gene according to (5) (7) DNA cloned from a human cDNA library or a human genomic library, wherein at least a part of the DNA comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 DNA that hybridizes under stringent conditions with other DNA,
  • (21) It comprises at least one of the antisense nucleotide or the chemically modified product thereof according to the above (14) or (15), and the semaphorin Y antagonist according to the above (19) or (20).
  • a central nervous system regeneration promoter
  • a peripheral nerve elongation inhibitor which comprises at least one of the proteins according to (4), and
  • a first aspect of the present invention relates to a gene encoding semaphorin Y consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6,
  • a semaphorin ⁇ gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 4, or 5, or hybridizing with these semaphorin ⁇ genes under stringent conditions. It is a gene that encodes a protein that acts suppressively on nerve elongation. In the following, these messages are explained in order.
  • a gene encoding a semaphorin ⁇ protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6” or “a semaphorin ⁇ gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5” It is a gene encoding the human semaphorin II of the present invention.
  • the genes described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 correspond to the open reading frames of rat semaphorin II and human semaphorin II, respectively.
  • a probe for example, a DNA probe having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7
  • SEQ ID NO: 7 prepared based on the sequence of “R59527” found in the EST database was used for these genes.
  • By screening a cDNA library derived from a tissue of the central nervous system. Each of these cloning techniques can be performed by referring to a basic book such as Molecular Cloning 2nd Edt. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Wear.
  • the nucleotide sequence of the cloned DNA can also be determined by an ordinary method using a commercially available sequence kit or the like.
  • genes ⁇ encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of semaphorin Y, and which acts to inhibit nerve elongation
  • gene that performs refers to a gene that encodes, among so-called “modified proteins” of semaphorin Y, a protein that acts to suppress nerve growth.
  • the gene encoding the protein can be obtained by, for example, site-directed mutagenesis (Methods in Enzymology, 100, 448- (1983)) or PCR (Molecular Cloning 2nd Edt.
  • the number of amino acid residues to be deleted, substituted and Z or added refers to the number of amino acids that can be deleted, substituted and / or added by a known method such as site-directed mutagenesis.
  • “acting in an inhibitory manner on nerve elongation” means, for example, having a regression activity on a nerve growth cone or having a nerve elongation inhibitory activity.
  • the activity can be measured using, for example, a test substance such as an expression product of DNA which encodes semaphorin Y or its modified protein, for example, as follows.
  • semaphorin Y is a membrane protein, it is formed by the semaphorin Y gene. Semaphorin Y is present in the cell membrane of transformed cells. Therefore, the activity of the test substance can be easily measured by using the membrane fraction of the transformed cells as a material.
  • the regression activity on the nerve growth cone is used.
  • a container coated with substances that promote neurite outgrowth and growth cone formation such as laminin collagen, polylysine, and polyornithine.
  • a test substance such as semaphorin Y in the above-mentioned form to neurons (Culturing Nerve Cells compiled by Banker et al., MIT Press (1991), etc.) cultured under normal conditions.
  • the nerve cells were fixed with 1% glutaraldehyde etc. after sufficient time for the growth cone to regress (usually 30 minutes to 1 hour after the addition), and regressed under a microscope. The number of growth cones is counted.
  • a sample prepared in the same manner as when using the test substance-expressing cells using cells that do not express the test substance such as semaphorin Y as a starting material. Normally, sample averaging is included within the sample. This is done according to the total protein content.
  • a test substance such as semaphorin Y prepared in the same manner as above is coated on a micropore filter or a part of the surface of a glass or plastic culture vessel, Nerve cells cultured under these conditions cannot adhere to the coated surface, the elongation speed of the projections is extremely low, or the neurites that extend from outside the coating surface toward the coating surface are coated.
  • any cells of the central nervous system and the peripheral nervous system can be used.
  • the adult central nervous system since the adult central nervous system originally contains a large amount of a regenerative (elongation) inhibitory factor, it has an inhibitory effect on central nervous system elongation in vivo. It is very difficult to measure the concentration, and usually the measurement is performed using the in vitro method as described above. Since these are in vitro methods, each has its own characteristics. Therefore, it is preferable to confirm the activity using a plurality of methods.
  • the neurons used for measuring the action are preferably the central nervous system such as the spinal cord and motor nerves of the cerebral motor cortex, and NI35 / 250, which is known as a central nerve regeneration inhibitory factor, is a peripheral nerve. It has also been shown that cervical ganglia and dorsal root ganglia also have activities such as inhibition of process extension and growth cone retraction (J. Cell Biol., 106, 1281-1288 (1988)). Science. 259, 80-83 (1993)), and the peripheral nerve can also be used.
  • the central nervous system such as the spinal cord and motor nerves of the cerebral motor cortex
  • NI35 / 250 which is known as a central nerve regeneration inhibitory factor
  • cervical ganglia and dorsal root ganglia also have activities such as inhibition of process extension and growth cone retraction (J. Cell Biol., 106, 1281-1288 (1988)). Science. 259, 80-83 (1993)), and the peripheral nerve can also be used.
  • the amino acid corresponding to this position in known semaphorins is very well conserved, and in some semaphorins all but glutamic acid are aspartic acids. Therefore, in semaphorins other than Sema III, the amino acid at this position is considered to be important for the expression of the activity.
  • the amino acid corresponding to position 198 of Seraa III is predicted to be aspartic acid 197 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence of human semaphorin Y described in 6 is predicted to be aspartic acid at position 198.
  • the conserved amino acid refers to 50%! In FIG. 2 of Cell, 75, 1389-1 399 (1993) or FIG. 1 of Neuron, 14, 941-948 (1995).
  • the semaphorin gene it refers to an amino acid located at a position where amino acids are identical.
  • a gene encoding a protein that hybridizes with the semaphorin Y gene under stringent conditions and acts to suppress nerve growth means that it is derived from a mammal. It refers to a gene, such as the semaphorin Y gene, that hybridizes under stringent conditions with a rat or human semaphorin Y gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 4, or 5.
  • the term “genes that hybridize under stringent conditions” refers to, for example, hybridizing under the conditions of formamide concentration: 453 ⁇ 4 ⁇ ( ⁇ / ⁇ ), salt concentration: 5 x SSPE, and temperature: about 42 ° C.
  • This refers to a gene that hybridizes with a rat or human semaphorin Y gene when washed under conditions of salt concentration: 2 ⁇ SSPE and temperature: about 42 ° C.
  • Specific cloning of these genes can be performed, for example, by screening one cDNA library or one genomic library prepared from tissues of various animals using a part or all of the DNA described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 as a probe. This can be done by doing a dent.
  • Specific screening can be performed by referring to a basic book such as Molecular Cloning 2nd Edt. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • Specific examples of such a gene of this embodiment include all semaphorin Y genes of mammals and birds. Sequences between mammals or between mammals and birds are very similar if they are homologous genes, and usually have a common base sequence of 80% or more, often 90% or more. Therefore, all the semaphorin Y genes of the mammal and the bird correspond to the gene of the present embodiment. In other words, those having a homology of not less than 80% are the genes of the present embodiment, and preferably those having a homology of not less than 90%.
  • a third embodiment of the present invention relates to a gene consisting of a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 under stringent conditions and encodes a protein having a semaphorin domain. is there.
  • DNAJ consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 refers to a sequence consisting of 7 amino acids (Gin (or Arg) -Asp-Pro-Tyr-Cys-Ala (or A fragment cloned by PCR based on the sequence information of DNA “R59527” encoding Gly) -Trp) as a partial sequence, and the base sequence of rat semaphorin Y described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the “gentle condition” refers to the condition described in the section of the second aspect of the present invention.
  • the gene of the present embodiment is cloned by hybridization with the DNA of SEQ ID NO: 7, etc.
  • TINS, 15, 319-323 (1992) and this reference It can be performed by the method described, and more specifically, for example, can be performed by the following method.
  • the screening can be performed by screening a cDNA library or a genomic library prepared from tissues of various animals.
  • the screening method for example, the method shown in the first embodiment can be used.
  • the cDNA library a cDNA library derived from an adult central nervous system tissue is preferably used, and more preferably, a cDNA library derived from hippocampus, striatum, or cerebellum is used.
  • the conditions for hybridization include, for example, the conditions described in Example 1 as described above, and the conditions described in TINS, 15, 319-323 (1992) and this cited reference.
  • the gene of the present embodiment is also a DNAJ encoding a protein having a semaphorin domain.
  • the “semaphorin domain” is, for example, Cell, 75, 1389-1399 (1993) or Neuron, 14, 941- 948 (1995) 10 known semaphorins (G-Sema I, T-Seiaa I, D-Sema II, H-Sema III, C-Collapsin, Sera A, Sem B, Sem C, Sem D, Sera E) is a domain consisting of a sequence consisting of 300-600 amino acid residues that is at least 20% identical to the amino acid constituting one of the semaphore mains.
  • 13 cysteines conserved in the semaphore main of 10 known semaphorins (this cysteine is described, for example, in FIG. 1 on page 942 of Neuron, 14, 941-948 (1995)). Marked ones) include those in which 10 or more are preserved, and those in which 12 or more are preserved are particularly preferred.
  • the salt of SEQ ID NO: 7 A semaphorin gene that hybridizes with a DNA consisting of a base sequence under stringent conditions, has a semaphorin domain, and has a nerve elongation inhibitory activity, or a mammal or bird as in the second embodiment. All semaphorin Y genes.
  • a fourth aspect of the present invention is a protein obtained by expressing the gene according to any one of the first to third aspects of the present invention.
  • proteins included in this embodiment include rat semaphorin consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and human semaphorin Y consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the rat and human semaphorin Y have a signal sequence at the N-terminus, and the signal sequence is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 from position 1 to position 23; It is expected to correspond to positions 1 to 24 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. Since the signal sequence is processed and removed when translocating to the membrane, such a mature semaphorin Y from which the signal sequence has been removed is also included in the present embodiment.
  • the method for preparing the protein of the present embodiment is, for example, that the cloned rat semaphorin YcDNA is ligated to a known expression vector such as pET or pCDM8, and then is expressed and produced by introducing it into an appropriate host.
  • a known expression vector such as pET or pCDM8
  • Either prokaryotic or eukaryotic cells can be used as the host.
  • Escherichia coli strains and animal cell strains are already widely available and available.
  • animal cell hosts include COS-1, COS-7, CHO cells and the like.
  • the protein of this embodiment can be purified by affinity purification using the semaphorin Y-recognizing antibody of the 16th embodiment of the present invention described later, or by a conventional method such as column chromatography.
  • a fifth embodiment of the present invention relates to a rat or human semaphorin Y of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6, wherein one or more amino acids have been deleted, replaced and / or added. It is a gene that consists of a sequence and encodes a protein that acts to promote nerve elongation.
  • a sixth aspect of the present invention is a protein obtained by expressing the gene of the fifth aspect of the present invention.
  • Deletion, substitution, and addition or addition in the gene of the fifth embodiment can be performed by the same method as that for the gene encoding the modified protein of the first embodiment of the present invention.
  • the promoting action on the elongation of the nerve can be attained, for example, by adding semaphorin Y to the semaphorin Y activity measurement system described in the first aspect of the present invention and further adding a test substance (ie, a candidate semaphorin as a candidate). (Y-modified protein) can be easily measured.
  • a test substance ie, a candidate semaphorin as a candidate.
  • a modified protein in which the nerve elongation inhibitory activity of semaphorin Y is lost can be considered.
  • the modified protein that has lost the activity of semaphorin Y is replaced with the receptor for semaphorin Y or semaphorin Y itself instead of semaphorin Y.
  • the active site of semaphorin is located in the semaphorin domain, and probably in rat semaphorin Y, aspartic acid at position 197, and in humans. This suggests that semaphorin Y is probably present in asppartic acid at position 198. Therefore, in order to eliminate semaphorin Y activity in the modified protein, the deletion, substitution, and addition or addition of the amino acid should preferably be performed with respect to the conserved amino acid in the semaphorin domain. It is preferable to carry out the reaction for aspartic acid at position 197 of tosemaforin Y and for the aspartic acid at position 198 of human semaphorin Y.
  • semaphorin Y other than human and rat, aspartic acid at the position corresponding to this position, that is, the amino acid sequence of the semaphorin Y was arranged so as to most closely match rat or human semaphorin Y. In this case, it is desirable to modify the amino acid at the position corresponding to position 197 of rat semaphorin Y and position 198 of human semaphorin Y.
  • the protein of the sixth aspect of the present invention acts on nerve elongation in a stimulating manner, it has a central nervous system regeneration promoting agent as described in the below-mentioned 21st aspect. Is included.
  • a seventh aspect of the present invention is a DNA cloned from a human cDNA library or a human genome library, wherein the rat or human semaphorin YDNA according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 is provided.
  • the cloning method is described in detail, for example, in Molecular Cloning 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), and specifically includes a method using hybridization, a method using PCR, and the like.
  • the method can be performed according to, for example, TINS, 15, 319-323 (1992) and the cited reference.
  • the PCR method can be performed according to the PCR (1991) IRL Press edited by McPherson et al.
  • the DNA to be cloned is not limited to its full length, but also includes a DNA fragment consisting of 200 bases or more, or a single-stranded (positive or complementary) DNA fragment.
  • Specific examples of the DNA according to the seventh aspect of the present invention include chromosomal DNAs including 5 'and 3' transcriptional regulatory regions, exon noncoding sequences, introns and the like, not to mention regions encoding amino acids.
  • Can be A sequence that does not encode these amino acids is also very useful when a drug is developed using the antisense technology described below.
  • An eighth aspect of the present invention is an expression plasmid which expresses any of the genes of the first, second, third or fifth aspects of the present invention, or the DNA of the seventh aspect.
  • a ninth aspect of the present invention is a transformant transformed by the expression plasmid of the eighth aspect.
  • a tenth aspect of the present invention is a method for producing a recombinant protein, comprising culturing the transformant according to the ninth aspect, and recovering the expressed recombinant protein. The method for producing these expression plasmids and transformants, or the method for producing a recombinant protein, are all well known to those skilled in the art, as described in the fourth aspect of the present invention.
  • the eleventh aspect of the present invention relates to the protein of the fourth or sixth aspect of the present invention.
  • a peptide consisting of at least 6 amino acids is based on the fact that the minimum size that can take a stable structure is 6 amino acids, but a peptide consisting of 8 amino acids or more is more preferably 10 amino acids. Peptides consisting of about 20 amino acids are preferred.
  • the peptide can be synthesized by a peptide synthesizer if it is as short as about 10 to 20 pieces, and if it is long, DNA prepared by ordinary genetic engineering techniques can be used as the above-mentioned animal. It can be obtained by expressing in a cell or the like.
  • the peptides thus produced can be modified by an ordinary method. These peptides can be applied to the pharmaceuticals described in the later-described twelfth and thirteenth embodiments, and can also be used for producing antibodies.
  • a twelfth aspect of the present invention is a peptide of the eleventh aspect of the present invention, which has a stimulatory action on nerve elongation.
  • the peptide can be prepared by the method described in the section of the first embodiment.
  • semaphorin Y is added to the activity measurement system described in the first aspect of the present invention, and the stimulatory effect on nerve elongation is further tested as described in the fifth aspect of the present invention. It can be easily measured by adding a substance (ie, a candidate semaphorin Y peptide).
  • a substance ie, a candidate semaphorin Y peptide.
  • a peptide in which semaphorin Y is used to suppress nerve growth suppression can be considered.
  • a peptide that does not have semaphorin Y activity binds to the semaphorin Y receptor or semaphorin Y itself, thereby inhibiting the binding of semaphorin Y to the receptor and promoting nerve elongation. It is thought to demonstrate.
  • Such a peptide promotes regeneration of the central nervous system, as described in the section of the twenty-first embodiment below. There are agents.
  • a thirteenth aspect of the present invention is the peptide of the first aspect of the present invention, wherein aspartic acid at position 198 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, or corresponding to the position of the aspartic acid, A peptide characterized by containing the following amino acid.
  • the peptide can be produced by the method described in the eleventh embodiment.
  • aspartic acid at position 198 is an amino acid thought to be important for the expression of semaphorin Y activity.
  • this amino acid may be involved in the binding of semaphorin Y to its receptor, and therefore the peptide of this embodiment containing the amino acid may be a receptor for semaphorin Y, or semaphorin Y.
  • semaphorin Y By binding to semaphorin Y, it can inhibit the binding of semaphorin Y to its receptor and inhibit the semaphorin Y's inhibitory action on nerve elongation (ie, promote nerve elongation). As described in the section of the twenty-first embodiment, some of the peptides having such an action serve as an agent for promoting regeneration of the central nervous system.
  • semaphorin Y is added to the activity measurement system described in the first aspect of the present invention, and the test substance ( That is, it can be easily measured by adding the candidate semaphorin Y (peptide). For details, refer to the section of the eighteenth embodiment of the present invention.
  • the “amino acid corresponding to the position of the aspartic acid” most closely matches the amino acid sequence of the protein of the fourth or sixth embodiment of the present invention to the amino acid sequence of human semaphorin Y described in SEQ ID NO: 6.
  • a peptide characterized by containing an amino acid corresponding to the position of the aspartic acid is defined as having an amino acid at a position corresponding to the 198th position of the human semaphorin Y, And the peptide consisting of the amino acids before and after it.
  • the gene according to any one of the first to third aspects of the present invention, or an antisense nucleotide corresponding to at least a portion of at least 8 bases or more of the DNA of the seventh aspect, or It is a chemically modified form thereof.
  • the term “antisense nucleotide” refers to an antisense oligonucleotide, or an antisense RNA or an antisense DNA, which is artificially synthesized using a synthesizer, By expressing the gene in a different orientation (ie, antisense orientation). For details, refer to the section of the twenty-first embodiment of the present invention.
  • the “chemically modified form” specifically refers to a chemically modified form capable of enhancing the translocation of an antisense nucleotide into a cell or the stability in a cell.
  • Derivatives such as rotioate, phosphorodithioate, alkyl phosphotriester, alkyl phosphonate, alkyl phosphoamidate ("Antisense RNA and DNA” published by WILEY-LISS, 1992 P. 1-50, J. Med Chem. 36, 1923-1937 (1993)).
  • This chemically modified product can be prepared according to the same literature and the like.
  • a fifteenth aspect of the present invention provides the antisense nucleotide according to the fifteenth aspect, wherein the expression of the protein of the fourth aspect of the present invention is suppressed. Or its chemically modified form.
  • MRNA produced by normal gene transcription is the sense strand, but antisense nucleotides or chemically modified forms thereof bind to the sense strand mRNA in cells and suppress the expression of the gene. Can be. Therefore, the antisense nucleotide or a chemically modified product thereof can suppress the expression of semaphorin Y, and can suppress the activity of semaphorin Y by suppressing the expression.
  • the antisense nucleotides or the chemically modified products thereof having such an effect there are those which serve as an agent for promoting regeneration of the central nervous system, as described later in the section of the 21st embodiment of the present invention.
  • Whether the prepared antisense nucleotide or its chemically modified product has the desired inhibitory effect can be determined by directly introducing the antisense oligonucleotide itself from the outside into cells expressing semaphorin Y, or by transcription. It can be easily found by introducing a gene that produces antisense RNA and using as an index whether or not the expression level of the semaphorin Y decreases.
  • the antisense nucleotide having this inhibitory effect may be any one of the coding portion and the 5 ′ non-coding portion of the semaphorin gene of each of the above embodiments, but is preferably a transcription initiation site, a translation initiation site, An antisense nucleotide for the 5 'untranslated region, the boundary region between exon and intron, or the 5' CAP region is desirable.
  • a sixteenth aspect of the present invention is an antibody against the protein of the fourth or sixth aspect of the present invention or the peptide of the first to thirteenth aspects of the present invention.
  • the antibody is described in mouse and egret, for example, in Current Protocols Immunology 2.4.1-2.6.6 (published in 1992, edited by J.G. It can be easily manufactured by the above method.
  • a monoclonal antibody can be easily prepared by using the technique described in the above reference book. Examples of the use of the antibody include affinity chromatography, screening of a cDNA library, and medicines, diagnostic agents and research reagents.
  • Some of the antibodies have a neutralizing activity for semaphorin Y.
  • These neutralizing activities can be determined by adding semaphorin Y to the activity measurement system described in the first aspect of the present invention, as described in the fifth aspect of the present invention, and further adding a test substance (that is, a candidate). Semaphorin Y antibody) can be easily measured. As described in the section of the twenty-first aspect of the present invention, some of the neutralizing antibodies serve as agents for promoting regeneration of the central nervous system.
  • a seventeenth aspect of the present invention relates to a medicament comprising, as an active ingredient, any of the genes (DNA), proteins, peptides, antisense nucleotides or chemically modified forms thereof, or antibodies of the present invention. It is.
  • central nervous system regeneration promoters and peripheral nerve elongation inhibitors are described in the section of the 21st and 22nd aspects of the present invention. Therefore, for these uses, refer to the section of the 21st and 22nd embodiments.
  • the semaphorin Y of the present invention or its modified protein, peptide, antisense nucleotide and the like can be used as an antiallergic agent, an immunosuppressant, or an anticancer agent.
  • an antiallergic agent an immunosuppressant, or an anticancer agent.
  • An eighteenth aspect of the present invention is a method for screening a semaphorin Y angulinist, which comprises using the protein of the fourth aspect of the present invention.
  • semaphorin Y antagonist refers to, for example, a substance that inhibits the action of semaphorin Y on inhibiting nerve growth.
  • the screening is performed by adding semaphorin Y to the semaphorin Y activity measurement system described in the first aspect of the present invention, and further adding a test substance thereto. That is, in the semaphorin Y activity measurement experiment performed by adding semaphorin Y, the activity of semaphorin Y is inhibited by adding the test substance to the culture solution throughout the culture period or only during that period. Is used as an index. It is also important to confirm that the test substance alone at the same concentration does not affect the survival of nerve cells, elongation of processes, etc. If both are met, the test substance can be identified as a semaphorin Y antagonist.
  • the test substance is preferably an aqueous solution in advance, but an organic solvent such as DMSO can be used as the solvent.
  • an organic solvent such as DMSO
  • the volume should be equal to or less than that of the culture solution, preferably 1/10 or less, more preferably Should be less than 1/100.
  • the semaphorin Y antagonists thus obtained there are those which act as a central nervous system regeneration promoter, as described later in the section of the 21st embodiment of the present invention.
  • a nineteenth aspect of the present invention is a semaphorin Y antagonist obtained by using the screening method of the eighteenth aspect of the present invention.
  • the structure and shape of the antagonist are not particularly limited as long as the substance inhibits the activity of semaphorin Y.
  • a semaphore according to a ninth aspect of the present invention comprising the protein according to the sixth aspect of the present invention, the peptide according to any one of the first to thirteenth aspects, or the antibody according to the sixteenth aspect.
  • Lin Y Antagonist That is, the protein of the sixth aspect of the present invention, the polypeptide of any one of the first to thirteenth aspects, or the antibody of the sixteenth aspect has an effect of inhibiting the activity of semaphorin Y. Things.
  • These antagonists can be selected by providing any of the above substances to the screening system of the eighteenth aspect of the present invention. The selected antagonists include the present invention described below.
  • the 21st aspect of the present invention includes the antisense nucleotide of the 14th or 15th aspect of the present invention or a chemical compound thereof as described in the 21st aspect of the present invention.
  • An agent for promoting regeneration of a central nervous system characterized by containing at least one of the modified form or the semaphorin Y antagonist according to the nineteenth or twenty-ninth aspect. Since this embodiment relates to the use of “regeneration of the central nervous system”, specific usage and dosage will be described below.
  • antisense nucleotides to various diseases has been attempted, but in recent years, it has been recognized that the antisense nucleotides can also be applied to nervous system diseases (TINS 20, No. 8, 321-322 (1997)).
  • the fifteenth aspect of the present invention Alternatively, since the expression of the semaphorin Y gene can be controlled using the antisense nucleotide of the fifteenth aspect or a chemically modified product thereof, it is possible to reduce the amount of the semaphorin protein and promote regeneration of the central nervous system. It seems possible.
  • Therapeutic methods include a method in which an antisense oligonucleotide or a chemically modified product thereof is administered as it is, and a method in which antisense RNA is produced intracellularly.
  • the preferable length of the antisense oligonucleotide is, for example, 5 to 200 bases, and more preferably 8 to 2 bases. 5 bases are preferred, and 12 to 25 bases are particularly preferred.
  • the antisense oligonucleotide or its chemically modified product is formulated by mixing with a stabilizing agent, a buffer, a solvent and the like, it can be used simultaneously with an antibiotic, an anti-inflammatory agent, an anesthetic and the like at the time of administration.
  • the preparations thus prepared can be administered in various ways, but are preferably administered locally at the site of significant neurological damage.
  • Nerve regeneration usually takes several days to several months, during which time administration is given daily or every few days to several weeks. In order to avoid such frequent administration, it is also possible to prepare a sustained-release minipellet preparation and implant it near the affected part. Alternatively, it is also possible to gradually and continuously administer to the affected part using an osmotic pump or the like. The usual dosage should be adjusted so that the concentration at the site of action is 0, ⁇ - ⁇ ⁇ ⁇ .
  • a preferable length of the antisense RNA is, for example, 100 bases or more, preferably 300 bases or more, more preferably 500 bases or more.
  • Methods for introducing a gene that produces antisense RNA into a patient include: There are an in vivo method in which a gene is introduced into cells in an implant and an ex vivo method in which a gene is introduced into certain cells outside the body and the cells are returned to the body (Nikkei Science, April 1994, 20- P. 45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medical Science, 12 (15), (1994), and references cited therein), and the in vivo method is more preferable.
  • in vivo methods include methods using recombinant viruses and other methods (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), experiments Any of the methods in the special edition of medical science, 12 (15), all pages (1994), and references cited therein can be applied.
  • a semaphorin gene is incorporated into a virus genome of a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a polio virus, a simbis virus, or the like.
  • a method for introduction into the body There is a method for introduction into the body.
  • a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus or the like is particularly preferable.
  • ribosome method and the ribofectin method, and the ribosome method is particularly preferred.
  • a microinjection method, a calcium phosphate method, an electrification method, or the like can be used in addition to the above methods.
  • the method of administration to a patient is via an appropriate route of administration depending on the disease, symptom, etc., to be treated.
  • it can be administered intravenously, arterial, subcutaneously, intramuscularly, or directly to a target site of a disease such as a nerve.
  • a target site of a disease such as a nerve.
  • the expression of the semaphorin gene is specifically suppressed in the spinal cord.
  • the expression of the antisense oligonucleotides of the present application lasts several days to several months, and this single infection is sufficient for nerve regeneration.
  • ribosomes or fusosomal ribosomes containing the semaphorin gene can be in the form of ribosome preparations such as suspensions, freezers, and centrifugal concentrated freezers.
  • the content of the semaphorin gene in the preparation can be appropriately adjusted according to the disease to be treated, the patient's age, body weight, etc., and is usually 0.0001-lOOmg, preferably 0.001-lOrag, as the semaphorin gene. It is preferably administered once every few days or several months.
  • the modified protein in which the central nervous system elongation inhibitory activity of semaphorin Y has been eliminated, and the modified protein is produced.
  • the modified semaphorin Y protein binds to the semaphorin Y receptor instead of semaphorin Y, and as a result, the activity of semaphorin Y is suppressed, and the regeneration of the central nervous system is promoted. It is possible.
  • the modified protein of semaphorin Y is formulated together with a stabilizer, a buffer, and a diluent and administered to a patient.
  • Administration can be in a variety of ways. Force Preferably administered locally at the site of the bed. Nerve regeneration usually takes several months to complete, during which time one or more doses are given to suppress semaphorin Y activity. When administering two or more times, it is preferable to repeat the administration or at appropriate intervals. When administered by injection to the central nervous system, for example, into the spinal cord, several hundred to 2 g per dose is preferred. Or less than several tens Dig.
  • sustained-release preparation it is also possible to use a sustained-release preparation to reduce the number of administrations, or to administer small doses over a long period using an osmotic pump.
  • transplanting cells expressing the modified semaphorin Y protein into a living body it is also possible by transplanting cells expressing the modified semaphorin Y protein into a living body.
  • Some of the peptides of the eleventh to thirteenth aspects of the present invention inhibit the binding of semaphorin Y to a receptor, thereby suppressing the activity of semaphorin Y to suppress the elongation of the central nervous system. As a result, there are those that promote central nervous system regeneration.
  • Specific examples of the peptide having such effects include, for example, aspartic acid at position 198 of human semaphorin Y of SEQ ID NO: 6, as described in the section of the thirteenth embodiment of the present invention.
  • a peptide characterized by containing an amino acid corresponding to the position of the aspartic acid is mentioned.
  • the mode of inhibition may be any of inhibition of competition, inhibition of non-competition, inhibition of non-competition, and inhibition of allosteric inhibition.
  • Formulation, administration method and dosage of the neutralizing antibody are as described in the above section of ⁇ 2) Modified protein of semaphorin Y ''.
  • Nature, 343, 269-272 As described in 1990, a method of directly transplanting cells producing a monoclonal antibody into the central nervous system is also possible.
  • a twenty-second aspect of the present invention is directed to at least the protein of the fourth aspect of the present invention. It is a peripheral nerve elongation inhibitor characterized by containing one.
  • the protein of the fourth aspect of the present invention can act suppressively on elongation of the central nervous system, it is also possible that the receptor for semaphorin Y may be expressed on peripheral nerves at the same time. Since other semaphorin receptors may also react with semaphorin Y, it may be possible to suppress the elongation of peripheral nerves. Therefore, by suppressing the elongation of peripheral nerves, it may be a therapeutic agent for arthrophobic dermatitis and pain.
  • Semaphorin Y-derived proteins see the section “2) Semaphorin Y-derived proteins” above.
  • any one of the genes of the first to third or fifth aspects of the present invention or the DNA of the seventh aspect is artificially inserted into a chromosome, or any of the DNAs is knocked down.
  • Transgenic animal Given the genetic information of the semaphorin Y of the present invention, the following literature (Manipulation of Bomaenembrio, compiled by Bi Hogan et al., 1986 Cold Spring Harbor Laboratory, Shin Aizawa, Gene Evening, 1995) At the current technical level, transgenic animals expressing the genes of the first, fourth, seventh or ninth aspect of the present invention are produced by researchers in the relevant field. It is very easy to do so, and the transgenic animals obtained in this way are naturally included in the present invention.
  • the transgenic animal thus obtained is very useful as a model animal for drug development or as an animal for drug screening. Furthermore, as described in the power literature, the so-called knockout animals, in which the genes of the first, fourth, seventh, and ninth aspects of the present invention have been deleted, are characterized by having no such genes. Is the common knowledge of researchers in the relevant field, It can be created for the first time by using, and it goes without saying that it is included in the present invention.
  • semaphorin Y plays an important function in vivo for nerve regeneration, but as described above, semaphorin Y has other unknown functions such as immunosuppressive effects. It has been pointed out that it may have a function (Cell, 75, 1389-1399 (1993)), and examining the semaphorin Y gene expression, protein distribution, function, and the like is, for research in this area, Alternatively, it is very important for diagnosis of a patient such as a neurological disease, and the present invention can also provide a gene probe, an antibody, a recombinant protein, a transgenic animal, and the like which can be used for such a purpose.
  • Figure 1 Photographs of electrophoresis showing the expression distribution of semaphorin Y in various tissues by Northern analysis.
  • Figure 2 Photographs of electrophoresis showing the distribution of Semaphorin Y expression in the central nervous system by Northern analysis.
  • Figure 3 Photograph of electrophoresis showing distribution of semaphorin YmRNA expression in human central nervous tissue by Northern analysis.
  • FIG. 4 Electrophoresis picture showing semaphorin Y protein expression in COS 7 cells.
  • An expression plasmid was prepared by adding 10-amino acid derived from human c-Myc to the C-terminus of semaphorin Y, and this was introduced into COS 7 cells and transiently expressed (rSYmyc; ).
  • rSYmyc a plasmid containing no semaphorin Y gene was used (Control in the figure).
  • the cells were collected and a membrane fraction was prepared. After fractionating the membrane fraction by SDS-PAGE, Western blotting was performed using an anti-Myc antibody.
  • the arrow in the figure indicates the position of the band of the Myc peptide-added semaphorin Y protein. The position and molecular weight (kD) of each band of the molecular weight marker are shown on the left side of the figure.
  • Figure 5 Photographs of electrophoresis showing the distribution of semaphorin II expression in living tissues by Northern analysis.
  • RNA in each lane was run. Above, autoradiogram results. 18S. The position of 28S ribosomal RNA is shown at the left end of the figure. Shown below, is a bromide stained image of the gel. The upper and lower two bands are 28S and 18S ribosomal RNAs, respectively.
  • R595 The sequence information of 27 is only 238 bases, which is very short compared to the cDNA of the known semaphorin gene, and only a few percent of the total amino acids that can be translated into a common sequence with the known semaphorin
  • the base sequence of this R59527 is one of the novel semaphorin genes because, for example, the reading frame for amino acid could not be determined due to the presence of an undetermined sequence in 9527. I could not conclude that it was a department. Therefore, after confirming that a gene having this sequence was expressed in adult brain, we decided to clone the full-length cDNA containing this sequence and determine the gene structure.
  • a 170 bp fragment corresponding to a part of R59527 cloned in the above (2) was used as a probe to clone the full length cDNA containing this sequence to determine the structure. Since a cDNA library was easier to prepare than humans, we decided to clone the rat gene first. Rat Using the mRNA prepared from the brain and muscle by a conventional method and the Lambda Zapll cDNA library production kit (Stratagene), the normal method introduced in the above experiment A cDNA library was prepared at.
  • plaques were prepared on an agar plate using this cDNA library, and the plaques were transferred to a nylon membrane (manufactured by Nippon Pall) to denature and neutralize the DNA.
  • the cells were fixed with UV light of / CID 2 and used for hybridization.
  • the hybridization was carried out using this Nippon Membrane membrane and a 170 bp DNA fragment labeled with 32 P as a probe (prepared using Amersham's MegaBlyme DNA labeling system according to Amersham's protocol).
  • hybridization solution 45% (v / v) formamide, 5X SSP solution (SSPE, where 1XSSPE is 0.15M sodium chloride, ⁇ sodium dihydrogen phosphate, lmM ethylenediamine)
  • SSPE 5X SSP solution
  • 1XSSPE 0.15M sodium chloride, ⁇ sodium dihydrogen phosphate, lmM ethylenediamine
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • 20 / zg / ml salmon sperm DNA manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the cells were removed by centrifugation at 2000 ⁇ g for 15 minutes, and the supernatant was heated at 70 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged again at 2000 ⁇ g for 15 minutes, and the supernatant was recovered as a stock solution of phagemid having a cDNA insert.
  • the nucleotide sequence of the obtained cDNA clone was analyzed using a Perkin Elmer 377 DNA sequencer to determine the entire nucleotide sequence.
  • the reaction was performed using a Prism Dita Mination Kit (manufactured by PerkinElmer).
  • the determined DNA base sequence (3195 bases) is shown in SEQ ID NO: 1
  • the putative open reading frame (2787 bases) is shown in SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence (929 amino acid) is shown in SEQ ID NO: 3. .
  • This gene has a so-called sequence from position 46 to position 570 in its amino acid sequence.
  • the gene was named semaphorin Y because it had been confirmed to be a semaphorin family because it had mafolindomin.
  • SEQ ID NO: 1 since the nucleotide sequence at positions 1574 to 1811 of the semaphorin Y gene shown in SEQ ID NO: 1 showed an 89% match with the entire length of the sequence of R59527 consisting of 238 bp, R59527 was replaced with human semaphorin Y. It turned out to be a partial sequence of the gene.
  • RNA was prepared from various tissues and Northern analysis was performed.
  • the RNA was prepared using the various tissues of the rat as follows, using the age-specific method (Takashi Tsuji, Satoshi Nakamura-; Experimental Medicine 1991 9 1937-1940, ed. Power Rent Protocol, Molecular Biology, 1989 4.2.4-4.2.8 (Green Associates Science & Technology, Inc.). Briefly, 10 ml of denaturing solution (4 M guanidine thiocyanate, 25 ⁇ -sodium citrate ( ⁇ 07.0), 0.5 ⁇ sarcosyl, 0.1 M2-mercaptoethanol) was added per lg of excised tissue. Homogenized quickly using a homogenizer.
  • RNA electrophoresis and Northern blotting are performed using the usual methods described below. I went to the meeting. First, RNA prepared from various tissues was electrophoresed in a 1% agarose gel containing formaldehyde. The gel was shaken with 50 mM NaOH for 20 minutes and then in 10XSSPE for 40 minutes. Then, the RNA is blotted on a nylon membrane (Biodyne B, manufactured by Nippon Pall) using capillary action, and fixed using a Star Cross Gene UV crosslinker (0.6 J / cm 2 ). A nylon membrane to be used for the dimensioning was obtained.
  • the probe was prepared as follows. First, the rat semaphorin YDNA obtained in Example 1 above was transformed into a type II using two primers (5 ′ TGTGTAAACGTGAC ATGG3 ′ (SEQ ID NO: 10) and 5 ′ TGCTAGTCAGAGTGAGGA3 (SEQ ID NO: 11)) to perform PCR. And a 477 bp fragment was amplified. After cloning this fragment into pCRII in the same manner as described above, the nucleotide sequence was determined, and it was confirmed that the fragment was a rat semaphorin Y gene fragment.
  • PCR was carried out by the usual method using the above primer to amplify the target 545 bp fragment.
  • the amplified DNA was separated and purified using an agarose gel, and labeled with 32 P using an Amersham megaprime DNA labeling system in the same manner as in Example 1 above to obtain a probe.
  • the hybridization reaction was carried out by leaving the nylon membrane blotted with RNA and the probe DNA in the same hybridization solution as in (2) above at 42 ° C for 48 hours. After the reaction, the nylon membrane is washed in 2XSSPE, 0.5!
  • the library was screened to obtain clone # 10.
  • this sequence overlapped the clone # 41581 above by about 200 bases and contained a cDNA sequence of 1700 bases or more on the 5 'side.
  • the entire nucleotide sequence (3432 nucleotides) of human semaphorin Y constructed by # 41581 and # 10 is shown in SEQ ID NO: 4, the open reading frame (2790 nucleotides) is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence ( 930 amino acids) are shown in SEQ ID NO: 6, respectively.
  • Human semaphorin Y was 87% identical to rat semaphorin Y at the amino acid level.
  • the insert part of the above clone # 10 (c of human semaphorin Y) E. coli S0LR (hSY10), a transformant obtained by introducing a plasmid (hSYlO) having the DNA portion) into a vector pBluescript into an E. coli SOLR strain, is located at 1-chome 1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki Prefecture No.3, deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Indication of microorganisms: E. coli SOLR (hSYlO); Contract date: July 11, 1997; Contract number: FERM BP-6021) .
  • E. coli DH10B (NO41581) has been deposited with the National Institute of Bioscience and Human-Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as above. (Microorganism: E. coli DH10BCN041581); Deposit: July 11, 1997; Accession number: FERM BP-6022).
  • a 47.9 bp rat semaphorin YcDNA from position 832 to position 1310 of SEQ ID NO: 1 obtained by PCR was used as a probe.
  • Northern analysis was performed in the same manner as in Example 2, and the expression distribution of semaphorin YmRNA in various regions in the central nervous tissue of human adults was examined. As shown in FIG. 3, human semaphorin Y mRNA was widely expressed in various regions of adult central nervous tissue, and particularly strong expression was observed in the cerebellum.
  • semaphorin Y in humans is also widely expressed in the central nervous system, as in rats, and semaphorin Y has a common function from rodents to primates. Seem.
  • the mixture was homogenized in the presence of TlU / ml aprotinin-containing Hank's saline) and separated into a precipitate and a supernatant by high-speed centrifugation at 12,000 g for 10 minutes.
  • the precipitate from the high-speed centrifugation containing the membrane fraction is washed twice with solution A, suspended in twice the amount of 2.25M sucrose ZPBS, layered on 2.25M sucrose ZPBS solution, and further layered on top. After overlaying the 8M sucrose / PBS solution, the mixture was centrifuged at 12000 g for 20 minutes. The membrane fraction was collected from the lower interface, washed twice more, and stored at -80 ° C until use.
  • Semaphorin Y was obtained in the same manner as in the cell membrane fraction obtained in Example 5 above.
  • a cell membrane fraction prepared from untransfected COS 7 cells was added to a culture of the central nervous system, dorsal root ganglion nerve, etc., cultivated in vitro, and M. Igarashi et al., Science, 259, 77 -79 (1993), the membrane fraction of COS 7 cells transfected with the semaphorin Y protein expression plasmid has a significantly higher growth cone regression activity. It becomes clear.
  • a PCR reaction was performed based on the semaphorin II sequence information described in Neuron, 14, 941-948 (1995), and the semaphorin III structural gene was incorporated into the expression plasmid pUCSR.
  • This expression plasmid was introduced into C0S7 cells by the DEAE dextran method, and two days later, the activity of semaphorin III contained in the culture supernatant was measured in the same manner as described in Cel 1, 75, 217-227 (1993). When the method was used to examine the growth cone regression activity of the chicken dorsal root ganglion nerve as an index, one clone showing no activity was found.
  • the 198th aspartic acid of semaphorin III is essential for the expression of semaphorin function.
  • the sequence number corresponds to this aspartic acid.
  • rat semaphorin Y of No. 3 it is 197th aspartic acid
  • human semaphorin Y of SEQ ID NO: 6 it is 198th aspartic acid.
  • RNA was prepared from various tissues of adult mice, and Northern analysis was performed. Preparation, plotting, and hybridization of RNA were performed in the same manner as in Example 2. A 560 bp Mspl fragment of mouse semaphorin III DNA described in Reference Example 1 was used as a probe. As a result, as shown in FIG. 5, the expression distribution of semaphorin III in adults was found to be very strong in the lung, but rather weak in the central nervous system.
  • semaphorin Y and its gene that act suppressively on nerve elongation other semaphorins that hybridize to the semaphorin Y gene, modified proteins of the semaphorin Y, partial peptides, antibodies, Antisense nucleotides of the semaphorin Y gene, use of these substances as pharmaceuticals, diagnostics or research reagents, furthermore, a method for screening semaphorin Y antagonist using the semaphorin Y, and a method for screening
  • a semaphorin Y antagonist obtained by the above method a medicine containing these antagonists, a transgenic animal for the semaphorin Y, and the like.
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Rat (Rattus norvegicus) Tissue type: Brain tissue
  • Sequence type nucleic acid
  • Tissue type brain tissue
  • ATGCCCCGTG CCCCCCACTC CATGCCCTTG CTGCTGCTGT TGCTGCTGTC ACTCCCCCAA 60 GCCCAGACTG CCTTTCCCCA GGACCCCATC CCTCTGTTGA CCTCTGACCT ACAAGGTACC 120 TCTCCGTCAT CCTGGTTCCG GGGCCTGGAG GACGATGCTG TGGCTGTGGGAC ACTTGGGCTG GATTCGCTGGGACTG TTCTCCTTCG ATCTTCAAGC CCAAGAAGAA GGGGAGGGGC TGGTGCCCAA CAAGTTTCTG 300
  • GTGTGTAAAC GTGACATGGG TGGCTCACCA CGGGCCTTGG ATCGCCACTG GACATCCTTC 840
  • Gly Lys Arg Ser Pro Arg Ala Ala Arg Arg lie lie Gly Leu Glu Leu
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism Human (Homo sapiens) Tissue type: Pediatric brain tissue Sequence characteristics
  • CAAGTATCTA ACATGGAGAA GCCAAGATGT GGAGAACTGT GCTGTACGGG GAAAGCTGAC 540
  • TCCTGTGTCT GAGGACAGAG TTCCCTCACC CAGGCCAGGA TCCTGTGCAG GAGTAGGGGG 1320 AGCTGCCTTG TTCTCCTCTT CCCGAGACCT CCCTGATGAT GTCCTGACCT TCATCAAGGC 1380 TCACCCGCTG CTGGACCCCG CTGTACCACC TGTCACCCAT CAGCCTCTAC TCACTCTCAC 1440 TAGCAGGGCC CTACTGACCC AAGTAGCTGT GGATGGCATG GCTGGTCCCC ACAGTAACAT 1500 CACAGTCATG TTCCTTGGCT CCAATGATGG GACAGTGCTG AAGGTGCTGA CCCCAGGTGG 1560 GCGATCCGGG GGACCTGAGC CCATCCTCCT GGAAGAGATT GATGCCTACA GCCCTGCCCG 1620 GTGCAGTGGG AAGCGGACAG CCCAAACAGC ACGACGGATC ATAGGGCTGG AGCTGGACAC 1680 TGAGGGTCAC AGGCTTTTTG TGG
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Human (Homo sapiens)
  • Tissue type pediatric brain tissue
  • Organism name Human (Homo sapiens)
  • Tissue type pediatric brain tissue
  • Leu Leu lie Ser Asp Leu Gin Gly Thr Ser Pro Leu Ser Trp Phe Arg
  • Organism name Human (Homo sapiens)
  • Tissue type brain tissue
  • Sequence type nucleic acid
  • CDS Array features Characteristic symbol
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
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Description

明 細 書 新規セマフォ リ ン遺伝子：セマフォ リ ン Y 発明の属する技術分野
本発明は、 セマフオリンフアミ リーに属する新規なセマフォリンである、 セマフォリン Yおよび該セマフォリン Yの医薬 '診断薬あるいは研究用試 薬への用途に関する。 さらに詳しくは、 神経の伸長に対して抑制的に作用 するセマフォリ ン Y及びその遺伝子、 または該セマフォリン Y遺伝子にハ イブリダイズする他のセマフォリン、 該セマフォリン Yの改変タンパク質、 部分べプチド、 抗体、 該セマフォリン Y遺伝子のアンチセンスヌクレオチ ド、 該セマフォリ ン Yのアンタゴニスト、 トランスジェニック動物、 或い はこれらの物質の医薬 ·診断薬あるいは研究用試薬としての用途に関する 従来の技術
ヒ 卜など高等生物では中枢神経は一度傷害を受けると再生する能力がな いことが広く知られている。 このため交通事故などで脊髄の損傷を受けた 人は、 半生を半身不随として過ごさなければならない。 一方、 末梢神経は これらの高等生物においても旺盛な再生能が保持されており、 手足の神経 は一度切断されても徐々に再生し、 それに伴って機能も回復することが知 られている。
1980年代初期に Aguayoらのグループは、 損傷を与えた高等生物の中枢神 経中に実験的に末梢神経を移植することにより中枢神経の軸索伸長が誘導 されることを見出し、 それまで再生能力はないと一般に考えられていた高 等生物の中枢神経が、 周囲の環境さえ整えば軸索を再生することを明らか にした (Nature, 284. 264-265(1980)、 Science, 214, 931-933(1981))。 この報告は、 高等生物の中枢神経系には 「中枢神経再生阻止因子」 とでも 呼べるような因子が存在しており、 この因子が中枢神経の再生を抑制して いる可能性、 そしてその抑制を解除することにより中枢神経が再生する可 能性を示唆しており、 中枢神経再生治療への道を開いた。
1988年に Schwabらのグループは、 中枢神経系のミエリン由来のタンパク 質の中に、 上記中枢神経再生阻止因子が存在していることを明らかにした。 そして、 該中枢神経再生阻止活性を有するタンパク質を部分的ながら精製 することに成功し、 このタンパク質画分を NI35/250と名付けた（Annu. Rev. Neurosci. , 16, 565- 595(1993)) o しかし、 その単離 ·同定及び遺伝子クロ 一二ングは未だに成功していない。 また、 彼らは粗精製した NI35/250 を 動物に免疫し、 中和活性を有する抗体（IN- 1)を取得することにも成功して いる。 この抗体はウェスタンブロッ 卜で NI35/250 のバンドを認識し、 免 疫染色で NI35/250 が分布していると考えられる部位を染めることができ る。 そして、 実験的に脊髄を損傷させた動物にこの抗体を投与すると、 2 一 3週間後には脊髄の神経が部分的ながら再生すること、 更に 2〜3か月 後には機能も回復することを明らかにしている ( Nature, 343, 269-272(1 990)、 Nature, 378, 498-501 (1995) )0 これは、 まさに前記 Aguayo ら により示唆された中枢神経再生阻止因子の存在、 及び該因子の活性を阻止 することによる中枢神経の再生を実験的に証明したものであり、 その価値 は大きい。 しかし該抗体はヒ 卜型ではなくラッ ト型 NI35/250に対する抗体 であり、 また安定性、 特異性も低い。 また上述のように該抗体の投与によ り再生が認められたものの、 その効果は部分的かつ不完全であり、 全ての 運動機能が回復したわけではない。 従ってこれら問題点の解決策として、 NI35/250あるいはこれに相当する中枢神経再生阻止因子の遺伝子の実体を 明らかにし、 分子生物、 神経科学等の知見に基づいて、 中枢神経再生阻止 活性をより効果的に阻害するアンタゴニストを開発すること、 あるいは該 再生阻止因子の遺伝子の発現抑制方法を開発することが不可欠であると考 えられる。
ところで中枢 ·末梢を問わず神経系がその主な機能である情報伝達 ·処 理を正確に行うためには、 発生段階、 すなわち胚あるいは胎児の過程にお いて、 神経細胞間あるいは神経細胞と末梢の受容器 ·効果器との間に複雑 な神経ネッ 卜ワークを形成しなければならない。 神経ネッ トワーク形成の ためには、 伸長する神経突起を遠く離れた標的部位に正確に導く （ガイ ド する） 巧妙な機構が必要である。
これまでは、 神経ネッ トワークの形成には突起伸長促進因子 ·突起誘引 因子と言った神経の突起伸長を正に制御する因子が主な役割を果たしてい るものと考えられてきた。 しかしそれとは逆の、 つまり伸長阻止活性を持つ た負の因子が正確なガイダンスには重要であることが、 ネッ トワーク形成 メカニズムに関する最近の研究から明らかになりつつある （Cell, 78, 35 3 - 356(細）。
このような伸長阻止活性を有する因子の代表が、 「セマフォリン」 と呼 ばれるタンパク質である。 最初に発見されたセマフォリンはバッ夕から発 見されたファシクリン IVであり、 その後、 ニヮ トリからコラプシン （後に コラプシン Iと命名） が発見され (Cell, 75, 217-227(1993) ； Neuron, 9, 831-845(1992)) 、 ショウジヨウバエ、 力ブトと言った昆虫からヒ トま たはウィルスにまで広く、 10以上のセマフォリンフアミリーに属する遺伝 子が報告されている （Cell, 81, 471-474(1995))。 これらのセマフォリン は、 そのアミノ酸配列上にセマフォリンドメインと呼ばれるおよそ 500ァ ミノ酸からなる類似の構造を有するのが特徴である （Neuron, 14, 941-94 8(1995)、 Cell, 75, 1389-1399(1993))。 しかし、 セマフォリ ン遺伝子相 互の間でセマフォリンドメィンのァミノ酸一次配列上の類似性は 80¾-20% であり、 必ずしも高くはない。
これらのセマフォリンの中で機能が確認されているものはバックのファ シクリ ン IV、 ショウジョゥバエのセマフォリ ン I, II、 ニヮ トリのコラプ シン、 そして ほ乳類におけるコラプシンであるセマフォリン III などご く一部であり、 これらは全て神経突起の伸長、 シナプス形成に対して抑制 的に作用することが知られている。 中でもセマフォリン III は、 in vitro において培養神経の成長円錐を短時間に退縮させる活性 （成長円錐退縮活 性） をも有することが報告されている (Neuron, 14, 941-948(1995)、 Ne uron. 14, 949-959(1995)、 Cell, 81, 631-639(1995) 、 Cell, 75, 1389 -1399(1993) 、 Cell, 75, 217-227(1993)、 Neuron, 9, 831-845(1992) )。 以上のように既知のセマフォリンは、 発生段階において成長円錐退縮活 性及び神経突起の伸長抑制活性を有し、 神経の正確なガイダンスを行う役 割を担っていることが明らかになりつつあるが、 これらのセマフォリンが 発生段階のみならず、 成体においても何らかの機能を有しているのか否か は現在のところ明らかにされていない。 ましてやセマフォリンが、 成体に おける中枢神経の再生阻止因子としての役割を担っているか否かは全く不 明である。 勿論、 既知のセマフォリンについて、 神経突起伸長を抑制する 負のガイダンス因子であることが明らかにされているため、 該セマフォリ ンを中枢神経の再生阻止因子の候補として挙げることもできなくはない （N ature, 378 , 439-440(1995)) 。 しかし、 高等生物で唯一機能解析がなさ れているセマフォリン III (Sema III) は、 末梢神経である感覚神経ある いは交感神経に対しては突起伸長阻止活性を示すが、 中枢神経である網膜 神経に対しては作用しないことが in vitro の実験結果により明らかにさ れている（Cell, 75, 217-227(1993)) 。 加えて、 本発明者らが Semalll の 成体における発現分布をノーザン解析により調べた結果、 主に末梢組織で 発現していることが判明している （後述の参考例 2参照） 。 従って、 この ような Sema III が、 中枢神経再生阻止因子としての機能を有していると は考え難い状況にある。
発明が解決しょうとする課題
本発明が解決しょうとする課題は、 セマフォリンファミ リーに属する新 親なセマフォリンである、 セマフォリン Y及びその遺伝子を提供すること により、 神経疾患に関わる医薬、 中でも中枢神経の再生に関わる医薬、 又 は診断薬あるいは研究用試薬を提供することにある。 さらに詳しくは、 神 経の伸長に対し抑制的に作用するセマフォリン Y及びその遺伝子、 または 該セマフォリ ン Y遺伝子にハイプリダイズする他のセマフォ リ ン、 該セマ フオリン Yの改変タンパク質、 部分べプチド、 抗体、 該セマフォリン Y遺 伝子のアンチセンスヌクレオチド、 或いはこれらの物質の医薬♦診断薬あ るいは研究用試薬としての用途、 さらには該セマフォリン Yを用いたセマ フォリン Yアンタゴニストのスクリーニング方法、 該スクリーニング方法 により得られるセマフォ リ ン Yアンタゴニス ト、 これらアン夕ゴニストを 含有する医薬、 若しくは該セマフォリン Yについてのトランスジヱニック 動物等をも提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
本発明者らは、 神経疾患に関わる医薬、 中でも中枢神経の再生に関わる 医薬、 又は診断薬あるいは研究用試薬の提供のために、 未だクローニング されていない新規なセマフォリンを同定することを考えた。 具体的には、 前述の NI35/250とセマフォリンとの in vitro活性の類似性、 すなわち NI35 /250は in vitroで成長円錐退縮活性及び神経の突起伸長抑制活性を有して いるのに対し（J. Neurosci. , 8, 2381-2393 (1988)、 Science, 259, 80 (1 993) )、 既知のセマフォリンも突起伸長抑制活性を有しており、 中でもセ マフオリン III は成長円錐退縮活性も有しているという点に着目し、 未だ 同定されていない未知のセマフォリンの中に、 中枢神経の再生を阻止する ものが存在している可能性を考えた。 すなわち、 1)神経の再生 （伸長） が 抑制されている成体の中枢神経系全般では広く発現しているが、 2)成体の 末梢組織等ではあまり発現していない、 といった特徴を有するセマフォリ ンは未だ知られていないが、 そのような特徴を有する未知のセマフォリン を同定することができれば、 該セマフォリンは中枢神経の再生阻止に関与 しているのではないかと考えた。
そこでまず、 これまで報告されているセマフォリン遺伝子相互の間で比 較的保存されているァミノ酸配列を基に D N Aデータベースを詳細に検索 した。 すなわち、 末梢組織では発現していないが生後の脳では発現してい る遺伝子であり、 しかもセマフォリン相互の間で比較的保存されているァ ミノ酸配列をコ一ドする D N A配列を、 E S T (Expressed Sequence Tags) データベースにより検索した。 その結果、 7個のアミノ酸からなる配列 (Gin (または Arg)- Asp- Pro-Tyr- Cys-Ala (または Gly)- Trp) を一部配列と してコードする D N A断片配列、 R59527を見出した。 該 R59527の配列情報 は僅か 238塩基であり、 しかもその中で既知のセマフォリンと共通の配列 に翻訳できるのは全体のわずか数％のァミノ酸に限られており、 また該 R5 9527には配列未確定の部分が存在していたためァミノ酸への読み枠も決定 できなかったことから、 該 R59527の塩基配列が新規セマフォリンの一部で あるとは到底結論できない状況であった。 しかし我々は、 この配列情報を 基にして D N Aプライマーを合成し、 該プライマーを用いてヒ 卜の海馬の c D N Aライブラリ一から調製した c D N Aを铸型にして P C Rを行い、 170 塩基からなる新規な D N A断片 （配列番号： 7 ) を得、 この D N A断 片を3 2 Pでラベルして D N Aプローブを合成し、 ラッ ト及びヒ 卜の c D N Aライブラリーをスクリーニングした結果、 最終的に新規セマフォリン遺 伝子をクローニングすることに成功した。 我々は、 この新規セマフォリン を 「セマフォリン Y」 と命名した。
解析の結果、 セマフォリン Υ遺伝子は既知のセマフォリン遺伝子と異な り、 成体の中枢神経系では広く発現している一方、 末梢組織では限られた 組織でしか発現が確認されなかったことから、 本発明者らが意図した新規 セマフォリンであることが明らかとなった。
このような特徵を有する本発明のセマフォリン Υは、 成体において中枢 神経の再生阻止に関与していることが考えられる。 該セマフォリン Υを用 いてセマフォリン Υのアンタゴニストをスクリーニングすることが可能で あり、 そのようなスクリ一二ング系により見出されたアンタゴニストは、 中枢神経の再生を促進することが考えられる。 またセマフォリン Υ遺伝子 のアンチセンス D N Αあるいは R N Αも、 前記アンタゴニス卜と同様に中 枢神経の再生を促進することが考えられる。
さらに、 本発明のセマフォリン Yは神経の伸長に対して抑制的に作用す ることから、 末梢組織に対して適用された場合には、 末梢神経の伸長を抑 制することによりァトビ一性皮膚炎等の免疫疾患及び疼痛等の治療薬、 あ るいは診断薬となることも考えられる。 また該セマフォリン Yは、 セマフォ リンフアミ リ一に属する新規なセマフォリンであり、 かつその発現分布は 前記したように従来にない特徴的なものであり、 さらに、 これまでに報告 されている脊椎動物のセマフォリンに共通に見出されている I g ドメィン は有していないという特徴をも有している。 従って該セマフォリン Yは、 当該分野における重要な研究材料、 研究試薬となる。
本発明は、 これらの研究成果に基づいて完成するに至ったものである。 即ち本発明の要旨は、
(1) 以下の （a) 又は （b) のタンパク質をコードする遺伝子、
(a)配列番号： 3又は配列番号： 6に記載のアミノ酸配列からなるセマ フォ リ ン Yタンパク質
(b)配列番号： 3又は配列番号： 6に記載のアミノ酸配列のうち 1若し くは複数のァミノ酸が欠失、 置換及び 又は付加されたァミノ酸配列から なり、 かつ神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質
(2) 以下の （a) 又は （b) の DNAからなる遺伝子、
(a) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 4又は配列番号： 5に記 載の塩基配列からなるセマフォリン YDNA
(b) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 4又は配列番号： 5に記 載の塩基配列からなる DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダイ ズし、 かつ神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードする DNA
(3) 配列番号： 7に記載の塩基配列からなる DN Aとストリ ンジェン 卜な条件下でハイプリダイズし、 かつセマフォリンドメインを有するタン パク質をコ一ドする DNAからなる遺伝子、
(4) 前記 （1)〜 （3) のいずれか記載の遺伝子を発現することによつ て得られるタンパク質、
(5) 配列番号： 3又は配列番号： 6に記載のタンパク質において 1若 しくは複数のァミノ酸が欠失、 置換及び Z又は付加されたァミノ酸配列か らなり、 かつ神経の伸長に対して促進的に作用するタンパク質をコードす る DNAからなる遗伝子、
(6) 前記 （5)記載の遗伝子を発現することによって得られるタンパ ク質、 (7) ヒ ト c D N Aライブラリー又はヒ トゲノムライブラリーからクロ 一二ングされる DNAであって、 配列番号 ·· 1又は配列番号： 4記載の塩 基配列からなる DN Aの少なくとも一部からなる DNAとストリンジヱン 卜な条件下でハイプリダイズする DNA、
(8) 前記 （1) 〜 （3) 又は （5)記載の遺伝子、 あるいは前記 （7) 記載の DNAのいずれかを発現する発現プラスミ ド、
(9) 前記 （8) 記載の発現プラスミ ドによって形質転換された形質転 換体、
(10) 前記 （9) 記載の形質転換体を培養し、 発現される組換えタン パク質を回収することからなる、 組換えタンパク質の生産方法、
(11) 前記 （4) 又は （6)記載のタンパク質の、 少なくとも 6アミ ノ酸以上の部分よりなるぺプチド、
(12) 神経の伸長に対して促進的に作用する、 前記 （11)記載のぺ プチド、
(13) 配列番号： 6に記載のアミノ酸配列の第 198位のァスパラギ ン酸、 あるいは該ァスパラギン酸の位置に相当するアミノ酸を含有するこ とを特徴とする、 前記 （11) 記載のペプチド、
(14) 前記 （1) ~ (3) のいずれか記載の遣伝子、 あるいは前記 （7 ) 記載の DNAの、 少なくとも 8塩基以上の部分に対応するアンチセンス ヌクレオチド、 あるいはその化学的修飾体、
(15) 前記 （4) 記載のタンパク質の発現を抑制することを特徴とす る、 前記 （14)記載のアンチセンスヌクレオチド、 あるいはその化学的 修飾体、
(16) 前記 （4) 又は （6)記載のタンパク質、 あるいは前記 （11) 〜 （13) いずれか記載のペプチドに対する抗体、 (17) 前記 （ 1 ) 〜 （ 3 ) 又は （ 5 ) 記載の遺伝子、 前記 （ 7 )記載 の DNA、 前記 （4) 又は （6)記載のタンパク質、 前記 （11) 〜 （1 3)記載のペプチド、 前記 （14) 又は （15) 記載のアンチセンスヌク レオチド又はその化学的修飾体、 あるいは前記 （16)記載の抗体の、 い ずれかを有効成分として含有する医薬、
(18) 前記 （4)記載のタンパク質を用いることを特徴とする、 セマ フォリ ン Yアンタゴニストのスクリーニング方法、
(19) 前記 （18)記載のスクリーニング方法を用いて得られる、 セ マフオリ ン Yアンタゴニスト、
(20) 前記 （6)記載のタンパク質、 前記 （11) ~ (13) いずれ か記載のペプチド、 又は前記 （16) 記載の抗体よりなる、 前記 （19) 記載のセマフォリン Yアンタゴニス ト、
(21) 前記 （14)又は （15) 記載のアンチセンスヌクレオチドぁ るいはその化学的修飾体、 前記 （19) 又は （20)記載のセマフォリン Yアンタゴニストの、 少なくとも一つを含有することを特徴とする、 中枢 神経の再生促進剤、
(22) 前記 （4)記載のタンパク質の少なくとも一つを含有すること を特徴とする、 末梢神経の伸長抑制剤、 並びに
(23) 前記 （1) 〜 （3) 又は前記 （5) のいずれか記載の遺伝子、 あるいは前記 （7)記載の DNAのいずれかを人為的に染色体中に挿入し たか、 あるいはいずれかをノックアウ トさせたトランスジヱニック動物、 に関する。
発明の実施の形態
本発明の第 1の態様は、 配列番号： 3又は配列番号： 6に記載のァミノ 酸配列からなるセマフォリン Yをコードする遺伝子、 あるいは前記セマフォ リン Yのアミノ酸配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換及び ノ又は付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ神経の伸長に対して抑制的 に作用するタンパク質をコードする遺伝子である。 また本発明の第 2の態 様は、 配列番号： 1、 2、 4又は 5に記載の塩基配列からなるセマフォリ ン Υ遺伝子、 又はこれらセマフォリン Υ遺伝子とストリンジユン卜な条件 下でハイプリダイズし、 かつ神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパ ク質をコードする遺伝子である。 以下、 これらの遣伝子につき順次説明す
1 ) セマフォリン Υをコードする遺伝子 （セマフォリン Υ遺伝子）
上記遺伝子のうち、 「配列番号： 3に記載のアミノ酸配列からなるセマ フオリン Υタンパク質をコードする遺伝子」 又は 「配列番号： 1、 配列番 号 2に記載の塩基配列からなるセマフォリ ン Υ遺伝子」 とは、 本発明のラッ トセマフオリ ン Υをコードする遺伝子である。 また、 「配列番号： 6に記 載のァミノ酸配列からなるセマフォリン Υタンパク質をコードする遺伝子」 又は 「配列番号： 4、 配列番号 5に記載の塩基配列からなるセマフォリ ン Υ遺伝子」 とは、 本発明のヒ ト型セマフォリ ン Υをコードする遺伝子であ る。 このうち配列番号： 2及び配列番号： 5に記載の遺伝子は、 それぞれ ラッ 卜セマフォリン Υ及びヒ ト型セマフォリン Υのオープンリーディング フレームに相当する。 これらの遺伝子は、 例えば実施例 1に記載したよう に、 E S Tデータベースから発見された 「R59527」 の配列を元に作製した プローブ （例えば配列番号： 7に記載の塩基配列を有する D N Aプローブ） を用いて中枢神経系の組織由来の c D N Aライブラリーをスクリーニング することによりクローニングすることができる。 これらクローニングの個 々の技術は、 例えば Molecular Cloning 2nd Edt. (Cold Spring Harbor L aboratory Press (1989)) 等の基本書を参照することにより行うことがで きる。 クローニングされた D N Aの塩基配列の決定も、 市販のシークェン スキッ 卜等を用いる通常の方法により行うことができる。
なお上記クローニング法によらなくとも、 本発明のラッ ト及びヒ トセマ フォリン Y c D N Aの塩基配列の公開に伴い、 当業者ならば、 該 c D N A の一部をプローブに用いてラッ 卜及びヒ ト型セマフォリン Yをコードする 遺伝子の全長を容易にクローニングすることができる。
2 ) セマフォリ ン Yの改変タンパク質をコードする遺伝子
前記遺伝子のうち、 「セマフォリ ン Yのァミノ酸配列のうち 1若しくは 複数のアミノ酸が欠失、 置換及び 又は付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードする遺伝子」 とは、 いわゆるセマフォリン Yの 「改変タンパク質」 のうち、 神経の伸長 に対して抑制的に作用するタンパク質をコードする遺伝子を指す。 該タン パク質をコードする遺伝子は、 例えば部位特異的突然変異誘発 （Methods in Enzymology, 100, 448- (1983))や P C R法 (Molecular Cloning 2nd Edt. 15 章， Cold Harbor Laboratory Press (1989)、 "PCR A Practical A pproach" IRL Press 200-210(1991)) により、 当業者ならば容易に得るこ とができる。 なおここで、 欠失、 置換及び Z又は付加されるアミノ酸残基 の数は、 上記部位特異的変異誘発等の周知の方法により欠失、 置換及び/ 又は付加できる程度の数を指す。
ここで、 「神経の伸長に対して抑制的に作用する」 とは、 例えば神経の 成長円錐に対する退縮活性を有すること、 あるいは神経の伸長阻害活性を 有することを指す。 該活性は、 例えばセマフォリン Yあるいはその改変タ ンパク質をコ一ドする D N Aの発現産物等の被験物質を用い、 例えば以下 のようにして測定することができる。
セマフォリン Yは膜タンパク質であるため、 セマフォリン Y遺伝子で形 質転換された細胞の細胞膜にセマフォリン Yは存在している。 従って形質 転換された細胞の膜画分を材料に使うことで、 前記被験物質の活性を容易 に測定できる。
活性測定法としては、 前記したように神経の成長円錐に対する退縮活性
(M. Igarashi et al Science vol. 259 PP77- 79(1993)) 、 あるいは神経の 伸長阻止活性 (J. A. Davies et. al. Neuron vol. 2 ppll- 20(1990)や Bast meyer J. Neurosci. vol. 11 pp626- 640(1991)など) などがある。 成長円錐 退縮活性の測定方法は文献 ( . Igarashi et al Science vol. 259 pp77-79 (1993)) に詳しく述べられているが、 簡単には、 セマフォ リ ン Y等の被験 物質を発現する細胞をホモゲナイズし、 細胞膜の画分を含むホモジェネー トを用いる方法、 あるいは精製した膜画分を用いる方法 （E. C. Cox et. al.
Neuron vol. 2 pp31- 37(1990)) 、 あるいは膜画分から抽出した蛋白質を リボソームに再構成したものを材料にする方法（ E. Bandtlow Science vo
1. 259 pp80-84(1993))などが可能である。 これらを材料にして実際に成長 円錐の退縮活性を測定するには、 ラミニンゃコラーゲン、 ポリリ ジン、 ポ リオルニチンといったような神経突起の伸長と成長円錐の形成を促進する 物質をコ一ティングした容器の中で通常の条件で培養した神経細胞（Banke rらの編纂による Culturing Nerve Cells MIT Press(1991)など）に対し、 先に述べたような形状のセマフォリン Y等の被験物質を添加することによつ て行う。 添加後、 成長円錐の退縮が起こるのに充分な時間 （通常添加後 3 0分から 1時間） が経過した時点でこの神経細胞を 1%グルタルアルデヒ ドなどで固定し、 顕微鏡下で退縮を起こした成長円錐の数を計数する。 こ のときセマフォリン Y等の被験物質を発現していない細胞を出発材料にし て、 被験物質発現細胞を用いたときと全く同様にして調整した試料を対照 として観察することが重要である。 通常、 試料の平均化は試料内に含まれ る総蛋白量によって行う。 一方、 突起伸長阻害活性を測定するには上記と 同様にして調整したセマフォリン Y等の被験物質をマイクロポアフィルタ 一やガラスやプラスティ ック製の培養容器の表面の一部分にコーティング し、 通常の条件で培養した神経細胞が、 このコーティング面上では接着で きないこと、 突起の伸長速度が非常に低下すること、 あるいはコーティ ン グ面の外からコーティング面に向かって伸長する神経突起がコーティング 面との境界に達しても、 停止したり、 回避したりして面内に侵入できない ことなどを指標とする。 コラーゲンゲル中で被験物質を発現する細胞の塊 と神経細胞とを同時に培養した場合には、 伸長する神経突起が被験物質発 現細胞の塊の中に侵入できないことも指標とできる （A. Sophia et. al. C ell vol. 81 pp621-629(1995)) D
また上記活性測定用の細胞としては、 中枢神経系及び末梢神経系のいず れの細胞をも用いることができる。 なお 「従来の技術」 の項に述べたよう に、 哺乳類の成体の中枢神経系には元々再生 （伸長） 阻止因子が大量に存 在しているため、 in vivoで中枢神経の伸長に対する抑制作用を測定する ことは非常に困難であり、 通常、 上記のような in vitroの方法を用いて測 定を行う。 これらは in vitroの方法であるため各々に特徴があり、 従って 複数の方法を用いて活性を確認することが好ましい。 また、 該作用の測定 に用いる神経細胞は脊髄や大脳皮質運動野の運動神経などの中枢神経が好 ましいが、 中枢神経再生阻止因子として知られている NI35/250 が、 末梢 神経である上頸神経節や後根神経節の神経細胞に対しても突起伸長阻止や 成長円錐退縮などの活性を有することが判明しているため （J. Cell Biol. ， 106， 1281-1288 (1988) 、 Science. 259, 80-83 (1993)) 、 該末梢神経 を用いることも可能である。
次に、 本態様の改変タンパク質の具体例を以下に示す。 既知のセマフォリンの構造を比較すると、 保存されたァミノ酸は大部分 セマフォリンドメィン内に位置し、 セマフォリンの活性発現にはこれら保 存されたアミノ酸が重要であると考えられる。 さらに、 本発明者らが Sera a IIIのセマフォリンドメィン内の第 1 9 8位のァスパラギン酸がグリシ ンに置換されたタンパク質の成長円錐退縮活性を測定したところ、 該タン パク質は活性を有していなかった （後述の参考例 1参照） 。 従って Sema I IIにおいては、 第 1 9 8位のァスパラギン酸が活性発現に重要であると考 えられる。 既知のセマフォリンにおけるこの位置に相当するァミノ酸は非 常に良く保存されており、 一部のセマフォ リ ンにおいてグルタミン酸であ る以外は全てァスパラギン酸である。 従って、 Sema III以外のセマフォリ ンにおいても、 この位置のァミノ酸が活性発現に重要であると考えられる。 本発明のセマフォリ ン Yにおいて Seraa IIIの第 1 9 8位に相当するァミノ 酸は、 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列中、 第 1 9 7のァスパラギン酸 であると予想され、 また配列番号： 6に記載のヒ トセマフォリン Yのアミ ノ酸配列中、 第 1 9 8位のァスパラギン酸であると予想される。
以上の知見より、 セマフォリン Yの有する活性を、 その改変タンパク質 においても残存させるためには、 上記アミノ酸の欠失、 置換及び/又は付 加は、 セマフォリン間で保存されたァミノ酸以外の部分で行うことが望ま しい。 特に、 配列番号： 3のラッ 卜セマフォリン Yの第 1 9 7位のァスパ ラギン酸、 あるいはヒ トセマフォリン Yの第 1 9 8位のァスパラギン酸は、 改変しないことが望ましい。 一方セマフォリン間で保存されたァミノ酸を 置換しかつセマフォリン Yの活性を残存させる場合は、 類似の側鎖を有す るアミノ酸に置換することが望ましい。 このように保存されたァミノ酸を 類似の側鎖を有するアミノ酸に置換することによって、 セマフォリ ン Yの 有する活性をさらに増強させた改変タンパク質を作製することが可能であ る。 このような活性の増強した改変タンパク質は、 後述の本発明の第 2 2 態様の項に記載の如き末梢神経の伸長抑制剤として非常に好適である。 なお、 本態様において 「保存されたアミノ酸」 とは、 Cell, 75, 1389-1 399 (1993)の図 2、 もしくは Neuron, 14, 941-948 (1995) の図 1におい て、 50¾！ 以上のセマフォリン遺伝子においてァミノ酸が同一となるような 位置に存在するァミノ酸を言う。
3 ) セマフォリン Y遺伝子とストリ ンジヱン卜な条件下でハイプリダイズ する D N A
前記 D N Aのうち、 「セマフォリン Y遺伝子とストリンジェン卜な条件 下でハイプリダイズし、 かつ神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパ ク質をコードする遺伝子」 とは、 すなわち哺乳動物由来のセマフォ リ ン Y 遺伝子のような、 配列番号： 1、 2、 4又は 5に記載の塩基配列からなる ラッ ト又はヒ ト型セマフォリン Y遺伝子とストリンジヱン卜な条件下でハ ィブリダイズする遺伝子を指す。
ここで、 「ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする遺伝子」 と は、 例えばホルムァミ ド濃度： 45¾ί(ν/ν)、 塩濃度： 5 x SSPE、 温度： 42°C 程度の条件下でハイプリダイズさせ、 塩濃度： 2 X SSPE, 温度： 42°C程度 の条件下で洗浄した場合において、 ラッ トあるいはヒト型セマフォリン Y 遺伝子とハイプリダイズするような遺伝子を指す。 これら遺伝子の具体的 なクローニングは、 たとえば配列番号： 1又は配列番号： 4に記載の D N Aの一部又は全部をプローブに用いて各種動物の組織から調製した c D N Aライブラリ一またはゲノムライブラリ一をスクリ一二ングすることによ り行うことができる。 具体的なスクリーニングは、 例えば Molecular Clon ing 2nd Edt. (Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))等の基本書 を参照することにより行うことができる。 このような本態様の遺伝子の具体例としては、 哺乳類、 鳥類の全てのセ マフォリン Y遺伝子が挙げられる。 哺乳動物間あるいは哺乳類と鳥類の間 では相同な遺伝子なら配列は非常に似ており、 通常 8 0 %以上、 多くは 9 0 %以上の塩基配列が共通である。 従って、 該哺乳類、 鳥類の全てのセマ フォリ ン Y遺伝子は、 本態様の遺伝子に該当する。 換言すれば、 8 0 %以 上のホモロジ一を有するものが本態様の遣伝子であり、 好ましくは、 9 0 %以上のホモロジ一を有するものが挙げられる。
本発明の第 3の態様は、 配列番号： 7に記載の塩基配列からなる D N A とストリンジユントな条件下でハイプリダイズし、 かつセマフォリンドメ ィンを有するタンパク質をコードする D N Aからなる遺伝子である。
ここで 「配列番号： 7に記載の塩基配列からなる D N A J とは、 セマフォ リン間でよく保存された 7アミノ酸からなる配列 （Gin (または Arg)- Asp- P ro-Tyr-Cys-Ala (または Gly)- Trp) を一部配列としてコードする D N A 「R 59527」 の配列情報をもとに P C R法によりクローニングした断片であり、 配列表の配列番号： 1に記載されたラッ トセマフオリン Yの塩基配列の第 1574位から第 1743位に、 また配列表の配列番号： 4に記載されたヒ トセマ フォリン Yの塩基配列の第 1524位から第 1693位に相当する D N A断片であ また、 ここで 「ストリンジェントな条件」 は、 前記本発明の第 2態様の 項に記載の条件を指す。
本態様の遺伝子は、 配列番号： 7の D N Aとのハイブリダィゼーシヨン 等によりクローニングされるものであるが、 具体的には、 例えば TINS, 1 5, 319- 323(1992)およびこの引用文献記載の方法によって行うことができ、 さらに具体的には例えば以下の方法により行うことができる。
即ち、 配列番号： 7に記載の塩基配列からなる D N Aをプローブとして、 各種動物の組織から調製した c D N Aライブラリ一またはゲノムライブラ リ一をスクリ一二ングすることにより行うことができる。 スクリ一二ング 方法としては、 例えば、 実施例 1に示したような方法が挙げられる。 また、 c D N Aライブラリーとしては成人の中枢神経系の組織由来の c D N Aラ イブラリーを用いることが好ましく、 更に好ましくは海馬、 線条体、 小脳 由来の c D N Aライブラリーを用いる。 ハイブリダィゼーションの条件は、 例えば前述のように実施例 1に示した条件、 あるいは TINS, 15, 319-323 (1992)およびこの引用文献等に記載されている条件が挙げられる。
また、 本態様の遺伝子は、 「セマフォリンドメィンを有するタンパク質 をコードする D N AJ でもある。 ここで 「セマフォリ ンドメィン」 とは、 例えば Cell, 75, 1389-1399(1993) または Neuron, 14, 941- 948(1995)に 記載された既知の 1 0個のセマフォリン （G- Sema I, T-Seiaa I, D-Sema I I, H-Sema III, C-Collapsin, Sera A, Sem B， Sem C, Sem D, Sera E ) の いずれか 1つのセマフォ リ ンドメィンを構成するァミノ酸と 2 0 %以上が —致し、 かつ 300- 600のアミノ酸残基からなる配列で構成される ドメイン をいう。 特に好ましいものとしては、 3 0 %以上のアミノ酸が一致するセ マフォリ ンドメインを有するものが挙げられる。 ここで、 アミノ酸の一致 は、 例えば日立ソフ トウェアーエンジニアリ ング社製の D N A S I S Ver. 2. 0を、 ktup=l, cutoff=l の条件で比較することでなされる。 さらに好 ましくは、 既知の 1 0個のセマフォ リ ンのセマフォリ ンドメィンにおいて 保存されている 1 3個のシスティン （このシスティンは例えば Neuron, 1 4， 941- 948(1995)の 942頁図 1においてマークされているものが挙げられ る） のうち、 1 0個以上が保存されたものが挙げられ、 特に 1 2個以上が 保存されたものが好ましい。
このような本態様の遺伝子の具体例としては、 配列番号： 7に記載の塩 基配列からなる DNAとス トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 セマフォリンドメインを有し、 かつ神経伸長抑制活性を有するようなセマ フォ リ ン遺伝子、 あるいは前記第 2態様と同様の哺乳類、 鳥類の全てのセ マフオリ ン Y遺伝子が挙げられる。
本発明の第 4の態様は、 前記本発明の第 1〜第 3態様のいずれか記載の遺 伝子を発現することによって得られるタンパク質である。
本態様に含まれるタンパク質の代表例として、 配列番号： 3に記載のァ ミノ酸配列からなるラッ トセマフォリパ、 、 あるいは配列番号： 6に記載 のアミノ酸配列からなるヒ トセマフォリン Yが挙げられる。 また、 該ラッ ト及びヒ ト型セマフォリン Yは N末端にシグナル配列を有するが、 該シグ ナル配列は、 配列番号： 3に記載のアミノ酸配列の第 1位から第 23位ま でに、 また配列番号： 6に記載のアミノ酸配列の第 1位から第 24位まで に相当すると予想される。 該シグナル配列は膜に移行する際にプロセシン グを受けて除去されるため、 このようなシグナル配列の除去された成熟型 セマフォリン Yも、 本態様に含まれる。
次に本態様のタンパク質の調製法であるが、 たとえばクローニングされ たラッ トセマフォリン YcDNAを、 pET、 pCDM8等の公知の発現 ベクターに連結した後、 適当な宿主に導入することにより発現 ·生産する ことができる。 宿主としては、 原核性生物細胞または真核性生物細胞のい ずれでもよく、 例えば大腸菌株や動物細胞株は既に広く普及しており入手 は可能である。 例えば動物細胞宿主としては、 COS— 1、 COS— 7、 CHO細胞等が挙げられる。
発現プラスミ ドを用い適当な動物細胞宿主を形質転換するには、 例えば DEAEデキストラン法 （F.M.Ausubelらの編慕による Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987)) 等の公知の方法を用い ればよい。 実施例 6にて確認したように、 セマフォリ ン Yは細胞膜画分に 存在しており、 この細胞膜画分はそのまま種々のアツセィに使用され得る 程度のセマフォリ ン Yを含んでいる。 従って、 適当な細胞を用いて調製し た細胞膜画分を用いて、 本態様のタンパク質の種々の活性測定を容易に行 うことができる。
また本態様のタンパク質は、 後述の本発明の第 1 6態様のセマフォリン Y認識抗体を用いたァフィ二ティー精製、 あるいは通常のカラムクロマト グラフィ一等の方法により精製することができる。
本発明の第 5の態様は、 配列番号： 3又は配列番号： 6に記載のラッ ト 又はヒ 卜型セマフォリン Yにおいて 1若しくは複数のァミノ酸が欠失、 置 換及びノ又は付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ神経の伸長に対して 促進的に作用するタンパク質をコードする遺伝子である。 また本発明の第 6の態様は、 本発明の第 5態様の遺伝子を発現することによって得られる タンパク質である。
上記第 5態様の遺伝子における欠失、 置換及びノ又は付加は、 本発明の 第 1態様の改変タンパク質をコードする遺伝子と同様の手法により行うこ とができる。 また、 神経の伸長に対する促進的な作用は、 例えば本発明の 第 1態様の項に記載のセマフォリン Y活性測定系にセマフォリン Yを添加 し、 さらにそこへ被験物質 （すなわち候補となるセマフォリン Y改変タン パク質） を添加することにより、 容易に測定することができる。 詳しくは 本発明の第 1 8態様の項を参照されたい。
本発明の第 6態様のタンパク質の具体例として、 セマフォリン Yの有す る神経伸長抑制活性を消失させたような改変タンパク質が考えられる。 セ マフオリン Yの活性を消失させた改変タンパク質が、 セマフォリン Yの代 わりに該セマフォリン Yのリセプター、 あるいはセマフォリン Yそのもの に結合することなどによってセマフォリン Yがリセプタ一に結合するのを 阻害することにより、 上述の神経の伸長に対する促進活性を発揮すること が考えられる。 本発明の第 1態様の項に記載したように、 セマフォリンの 活性部位はセマフォリンドメィン内に、 そしてラッ 卜セマフォリン Yにお いてはおそらく第 1 9 7位のァスパラギン酸に、 またヒ 卜セマフォリン Y においては第 1 9 8位のァスパラギン酸に、 おそらく存在しているものと 示唆される。 従って、 セマフォリン Y活性を、 その改変タンパク質におい て消失させるためには、 上記アミノ酸の欠失、 置換及びノ又は付加は、 該 セマフォリンドメィン内の保存されたァミノ酸に対して、 好ましくはラッ 卜セマフォリン Yの第 1 9 7位のァスパラギン酸に対して、 またヒ トセマ フオリン Yの第 1 9 8位のァスパラギン酸に対して行うのが望ましい。 そ の際、 もとのァミノ酸と異なった性質の側鎖を有するアミノ酸への置換が 望ましい。 ヒ ト及びラッ ト以外のセマフォリン Yにおいても、 この位置に 相当する位置にあるァスパラギン酸、 即ち該セマフォリン Yのアミノ酸配 列をラッ トあるいはヒ トセマフオ リ ン Yと最も一致するように並べた場合、 ラッ 卜セマフォ リン Yの第 1 9 7位、 ヒ トセマフォリ ン Yの第 1 9 8位に 相当する位置にあるアミノ酸に対して改変を行うのが望ましい。
以上のように本発明の第 6態様のタンパク質は、 神経の伸長に対して促 進的に作用するものであるため、 後述の第 2 1態様の項に記載の如き中枢 神経の再生促進剤となるものが含まれる。
本発明の第 7の態様は、 ヒ ト c D N Aライブラリー又はヒ トゲノ厶ライ ブラリーからクローニングされる D N Aであって、 配列番号： 1又は配列 番号： 4記載のラッ 卜又はヒ ト型セマフォリン Y D N Aの少なくとも一部 からなる D N Aとストリンジヱン卜な条件下でハイブリダイズする D N A である。 クローニングの方法は、 例えば Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spr ing Harbor Laboratory Press (1989) 等に詳しく述べられており、 具体 的には、 ハイブリダィゼーシヨンを用いる方法、 P C Rを用いる方法等が 挙げられる。 ライブラリ一としては、 ここではヒト由来のゲノム性ライブ ラリーを用いることが好ましく、 成人の中枢神経由来の c D N Aライブラ リーを用いることもできる。 ハイブリダィゼーションを用いる方法の場合 は、 例えば TINS, 15, 319-323 (1992) 及びこの引用文献等に従い行うこ とができる。 また P C R法を用いる場合は、 McPherson らの編纂による P CR (1991) IRL Press 等に従い行うことができる。
クローニングされる D N Aはその全長に限らず、 そのうちの 200塩基以 上からなる D N A断片、 あるいは該 D N A断片の一本鎖 （正鎖、 あるいは 相補鎖） の形態のものも含む。 本発明の第 7態様の D N Aの具体例として は、 アミノ酸をコードする領域は言うに及ばず、 5'、 3'転写調節領域、 ェ キソンのノ ンコーディ ング配列、 イントロンなどを含む染色体 DNAが挙げ られる。 これらアミノ酸をコ一ドしない配列も、 後述のアンチセンス技術 を用いて薬剤を開発する場合などに非常に有用である。
本発明の第 8の態様は、 本発明の第 1、 第 2、 第 3又は第 5態様の遺伝 子、 あるいは第 7態様の D N Aのいずれかを発現する発現ブラスミ ドであ る。 また、 本発明の第 9の態様は、 第 8態様の発現プラスミ ドによって形 質転換された形質転換体である。 また本発明の第 1 0の態様は、 第 9態様 の形質転換体を培養し、 発現される組換えタンパク質を回収することから なる、 組換えタンパク質の生産方法である。 これら発現プラスミ ド及び形 質転換体の作製方法、 あるいは組換タンパク質の生産方法は、 本発明の第 4の態様の項に記載したように、 全て当業者にとって周知の方法である。 本発明の第 1 1の態様は、 本発明の第 4態様又は第 6態様のタンパク質 の、 少なくとも 6アミノ酸以上の部分よりなるぺプチドである。 ここで、 「少なくとも 6アミノ酸以上」 との限定は、 安定な構造をとり得る最小の サイズが 6アミノ酸であることによるが、 好ましくは 8アミノ酸以上の部 分よりなるペプチドが、 より好ましくは 1 0〜2 0個程度のアミノ酸から なるぺプチドが好ましい。 該ぺプチドは、 1 0〜2 0個程度の短いもので あればぺプチド合成装置により合成することができるし、 長いものであれ ば通常の遺伝子工学的手法により調製された D N Aを、 上述の動物細胞等 により発現させることにより得ることができる。 なお、 このようにして作 製されたべプチドを、 通常の方法により修飾することも可能である。 これらペプチドは、 後述の第 1 2、 第 1 3態様の項に記載の医薬への応 用が可能である他、 抗体作製のためにも使用することができる。
本発明の第 1 2の態様は、 本発明の第 1 1態様のぺプチドのうち、 神経 の伸長に対して促進的に作用するものである。 該ペプチドは、 前記第 1 1 態様の項に記載の方法で作製することができる。 また神経の伸長に対する 促進的な作用は、 本発明の第 5態様の項に記載の如く、 本発明の第 1態様 の項に記載の活性測定系にセマフォリン Yを添加し、 さらにそこへ被験物 質 （すなわち候補となるセマフォリン Yのペプチド） を添加することによ り、 容易に測定することができる。 詳しくは本発明の第 1 8態様の項を参 照されたい。
これらべプチドの具体例として、 セマフォリン Yの有する神経の伸長抑 制作用を消失させたぺプチドが考えられる。 セマフォリン Y活性を有さな ぃぺプチドがセマフォリン Yのレセプター、 あるいはセマフォリン Yその ものに結合することによって、 セマフォリン Yがそのレセプターに結合す るのを阻害し、 神経の伸長促進作用を発揮すると考えられる。 このような ペプチドは、 後述の第 2 1態様の項に記載のように、 中枢神経の再生促進 剤となるものが存在する。
本発明の第 1 3の態様は、 本発明の第 1 1態様のペプチドのうち、 配列 番号： 6に記載のァミノ酸配列の第 1 9 8位のァスパラギン酸、 あるいは 該ァスパラギン酸の位置に相当するアミノ酸を含有することを特徴とする ぺプチドである。 該ぺプチドは、 前記第 1 1態様に記載の方法にて作製す ることができる。
本発明の第 1態様の項に記載したように、 配列番号： 6に記載のヒ トセ マフォリン Yの第 1 9 8位のァスパラギン酸 （ラッ トでは第 1 9 7位のァ スパラギン酸） は、 セマフォ リ ン Yの活性発現に重要であると考えられる ァミノ酸である。 従ってこのアミノ酸は、 セマフォリン Yとそのレセプタ 一との結合に関与している可能性があり、 それゆえ該ァミノ酸を含有する 本態様のぺプチドはセマフォリン Yのレセプタ一、 あるいはセマフォリン Yそのものに結合することによってセマフォリン Yがそのレセプターに結 合するのを阻害し、 セマフォリン Yの有する神経の伸長抑制作用を阻害す る （すなわち神経の伸長を促進する） ことが可能である。 このような作用 を有するペプチドは、 後述の第 2 1態様の項に記載のように、 中枢神経の 再生促進剤となるものが存在する。 なお該神経の伸長促進活性は、 本発明 の第 5態様の項に記載の如く、 本発明の第 1態様の項に記載の活性測定系 にセマフォリン Yを添加し、 さらにそこへ被験物質 （すなわち候補となる セマフォリン Yのべプチド） を添加することにより容易に測定することが できる。 詳しくは本発明の第 1 8態様の項を参照されたい。
本態様中 「該ァスパラギン酸の位置に相当するアミノ酸」 とは、 本発明 の第 4又は第 6態様のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 6に記載の ヒ トセマフォリン Yのァミノ酸配列と最も一致するように並べた場合、 ヒ トセマフオリン Yの 1 9 8位に相当する位置にあるアミノ酸を指す。 従つ て、 「該ァスパラギン酸の位置に相当するアミノ酸を含有することを特徴 とするぺプチド」 とは、 このヒ トセマフオリン Yの第 1 9 8位に相当する 位置にあるァミノ酸を有し、 かつその前後のァミノ酸からなるぺプチドを 指す。
本発明の第 1 4の態様は、 本発明の第 1〜第 3態様のいずれか記載の遺 伝子、 あるいは第 7態様の D N Aの、 少なくとも 8塩基以上の部分に対応 するアンチセンスヌクレオチド、 あるいはその化学的修飾体である。 ここで 「アンチセンスヌクレオチ 2ド」 とは、 アンチセンスオリゴヌクレ ォチド、 もしくは、 アンチセンス R N A又はアンチセンス D N Aなどと呼 ばれるものを指し、 合成機を用いて人工的に合成したり、 通常と逆の向き (すなわちアンチセンスの向き） に遺伝子を発現させることなどによって 得ることができる。 詳しくは、 本発明の第 2 1態様の項を参照されたい。 これらアンチセンスヌクレオチドは、 後述の第 1 5態様の項に記載した ようなセマフォリン Yの発現を抑制する目的で使用される他、 in situノヽ イブリダィゼーシヨン等の研究用試薬としても有用である。 また、 本発明 において 「化学的修飾体」 とは、 具体的にはアンチセンスヌクレオチドの 細胞内への移行性または細胞内での安定性を高めることができる化学的修 飾体を表し、 例えばホスホロチォエート、 ホスホロジチォエート、 アルキ ルホスホトリエステル、 アルキルホスホナ一ト、 アルキルホスホアミデー 卜等の誘導体 ("Antisense RNA and DNA" WILEY - LISS刊 1992 P. 1-50, J. Med. Chem. 36, 1923- 1937(1993))が挙げられる。 この化学的修飾体は、 同 文献等に従って調製することができる。
本発明の第 1 5の態様は、 本発明の第 4態様のタンパク質の発現を抑制 することを特徴とする、 前記第 1 4態様のアンチセンスヌクレオチド、 あ るいはその化学的修飾体である。
通常の遺伝子の転写によって生産される mRNAはセンス鎖であるが、 アン チセンスヌクレオチドあるいはその化学的修飾体は、 細胞内でセンス鎖 mR NAに結合し、 該遣伝子の発現を抑制することができる。 従って、 該アンチ センスヌクレオチドあるいはその化学的修飾体は、 セマフォ リ ン Yの発現 を抑制することができ、 該発現を抑制することによりセマフォ リ ン Yの有 する活性を抑制することができる。 このような効果を有するアンチセンス ヌクレオチドあるいはその化学的修飾体には、 後述の本発明の第 2 1態様 の項に記載の如く、 中枢神経の再生促進剤となるものが存在する。
作製したァンチセンスヌクレオチドあるいはその化学的修飾体が目的の 抑制効果を有しているか否かは、 セマフォリ ン Yを発現する細胞に外から アンチセンスオリゴヌクレオチドそのものを直接導入するか、 或いは転写 によって該ァンチセンス R N Aを生成する遺伝子を導入し、 該セマフォリ ン Yの発現量が減少するか否かを指標にして、 容易に見い出すことができ る。
この抑制効果を有するアンチセンスヌクレオチドとしては、 上記各態様 のセマフォリン遺伝子のコーディング部分、 5 ' ノンコーディング部分の いずれの部分に対するものであっても良いが、 好ましくは転写開始部位、 翻訳開始部位、 5 ' 非翻訳領域、 ェクソンとイントロンとの境界領域もし くは 5 ' CAP領域に対するアンチセンスヌクレオチドであることが望まし い。
本発明の第 1 6の態様は、 本発明の第 4又は第 6態様のタンパク質、 あ るいは第 1 1〜第 1 3態様のぺプチドに対する抗体である。 該抗体は、 マ ウスやゥサギを用いて、 例えばカレント プロトコルズ イン ィムノロ ジー 2. 4. 1 -2. 6. 6 頁 （1992刊、 ジユー 'ィー ' コリガン編集） に記載され た方法により、 容易に作製することができる。 また前記参考書に述べられ ている手法を用いることで、 容易にモノクローナル抗体を作製することも 可能である。 該抗体の用途としては、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 c D N Aライブラリーのスクリーニング、 あるいは医薬 '診断薬 ·研究用 試薬等が挙げられる。 該抗体の中にはセマフォリン Yに対する中和活性を 有するものが存在する。 これら中和活性は、 本発明の第 5態様の項に記載 の如く、 本発明の第 1態様の項に記載の活性測定系にセマフォリ ン Yを添 加し、 さらにそこへ被験物質 （すなわち候補となるセマフォ リ ン Yの抗体） を添加することにより、 容易に測定することができる。 そして該中和抗体 には、 本発明の第 2 1態様の項に記載の如く、 中枢神経の再生促進剤とな るものが存在する。
本発明の第 1 7の態様は、 本発明の全ての遺伝子 （D N A ) 、 タンパク 質、 ペプチド、 アンチセンスヌクレオチド又はその化学的修飾体、 あるい は抗体の、 いずれかを有効成分として含有する医薬である。
該医薬のうち、 中枢神経の再生促進剤及び末梢神経の伸長抑制剤につい ては本発明の第 2 1及び第 2 2態様の項に記載した。 従ってこれら用途に ついては、 該 2 1及び 2 2態様の項を参照されたい。
近年、 ある種のセマフォリンが、 神経系のみならず非神経系においても 重要な機能を担っていることが明らかになりつつある。 すなわち、 心筋の 成長抑制に働いて t、るという可能性が示唆されている (Nature, 383, 525-5 28 (1996))。 また、 免疫系においても、 ある種のセマフォリンが Bリンパ 球の凝集及び生存維持に関与していることが示唆されている （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 11780-11785 (1996))。 さらに最近、 ある種のセマフォ リンがリウマチにおける免疫反応において何らかの役割を担っていること も示唆されている (B. B. R. C. , 234, 153-156 (1997))。 また、 肺癌への関与 も示唆されている (Pro Natl. Acad. Sci USA, 93. 4120-4125 (1996)) 。 従って本発明のセマフォリ ン Y、 あるいはその改変タンパク質、 ぺプチ ド、 アンチセンスヌクレオチド等が、 抗アレルギー剤、 免疫抑制剤、 ある いは抗癌剤として利用できることが考えられる。 なお、 これら医薬の具体 的な用法 ·用量等については、 本発明の第 2 1又は第 2 2の態様の項を参 照されたい。
本発明の第 1 8の態様は、 本発明の第 4態様のタンパク質を用いること を特徴とする、 セマフォリン Yアン夕ゴニス卜のスクリ一二ング方法であ る。 ここで、 「セマフォリ ン Yアンタゴニス ト」 とは、 例えばセマフォ リ ン Yの有する神経の伸長抑制作用を阻害する物質を指す。
該スクリーニングは、 本発明の第 1態様の項に述べたセマフォリン Y活 性測定系にセマフォリン Yを添加し、 さらにそこへ被験物質を添加するこ とによって行う。 即ち、 セマフォリ ン Yを添加して行うセマフォ リ ン Yの 活性測定実験において、 培養の期間を通して或いはその一時期だけ、 被験 物質を培養液に添加することによって、 セマフォリ ン Yの活性が阻害され ることを指標とする。 また、 同濃度の被験物質単独では神経細胞の生存、 突起伸長などに対して影響しないことを確認することも重要である。 この 両者が満たされた場合、 この被験物質をセマフォリン Yアンタゴニストと 認定することができる。 被験物質はあらかじめ水溶液であることが好まし いが、 D M S Oなどの有機溶媒を溶媒として用いることもできる。 いずれ の場合も神経細胞に対する溶媒の影響を除くために、 加える体積は最小限 にすることが大切であり、 具体的には培養液に対して等量以下、 好ましく は 1/10以下、 更に好ましくは 1/100以下になるようにする。 このようにし て得られたセマフォリン Yアンタゴニス卜には、 後述の本発明の第 2 1態 様の項に記載したように、 中枢神経の再生促進剤となるものが存在する。 本発明の第 1 9の態様は、 本発明の第 1 8態様のスクリーニング方法を 用いて得られるセマフォリン Yアンタゴニストである。 該アンタゴニスト は、 セマフォリン Yの活性を阻害する物質であればその構造 ·形状等は問 わない。
本発明の第 2 0の態様は、 本発明の第 6態様のタンパク質、 第 1 1〜第 1 3態様いずれか記載のぺプチド、 あるいは第 1 6態様の抗体からなる、 第 1 9態様のセマフォリン Yアンタゴニス卜である。 すなわち、 本発明の 第 6態様のタンパク質、 第 1 1〜第 1 3態様いずれか記載のポリべプチド、 あるいは第 1 6態様の抗体のうち、 セマフォリン Yの有する活性を阻害す る効果を有するものである。 これらアンタゴニス卜は、 本発明の第 1 8態 様のスクリ一二ング系に上記いずれかの物質を供することにより選び出す ことができるものであり、 選び出された該アンタゴニストには、 後述の本 発明の第 2 1態様に記載の如き中枢神経の再生促進剤となるものが含まれ 本発明の第 2 1の態様は、 本発明の第 1 4又は第 1 5態様のアンチセン スヌクレオチド又はその化学的修飾体、 あるいは第 1 9又は第 2 0態様の セマフォリン Yアンタゴニス卜の少なくとも一つを含有することを特徴と する、 中枢神経の再生促進剤である。 本態様は 「中枢神経の再生洽療」 と いう用途に係わるものであるため、 以下、 具体的な用法 ·用量等につき説 明する。
1 ) ァンチセンスヌクレオチドあるいはその化学的修飾体
種々の疾患に対してアンチセンスヌクレオチドの適用が試みられている が、 近年、 神経系疾患に対しても、 該アンチセンスヌクレオチドが適用可 能であるとの認識がなされている （TINS 20, No. 8, 321-322 (1997)) 。
本発明の第 1 4又は第 1 5態様の項に記載したように、 本発明の第 1 4 又は第 1 5態様のアンチセンスヌクレオチドまたはその化学的修飾体を用 いてセマフォリン Y遺伝子の発現を制御することができるため、 セマフォ リンタンパク質の存在量を減らし、 中枢神経の再生を促進することができ ると思われる。 治療方法としては、 アンチセンスオリゴヌクレオチドまた はその化学的修飾体をそのまま投与する方法、 およびアンチセンス R N A を細胞内で生産する方法がある。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体をそのまま投 与する方法において、 このアンチセンスォリゴヌクレオチドの好ましい長 さとしては、 例えば 5— 2 0 0塩基のものが挙げられ、 さらに好ましくは 8— 2 5塩基が挙げられ、 特に好ましくは 1 2— 2 5塩基のものが挙げら れる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を安定化 材、 緩衝液、 溶媒などと混合して製剤化した後、 投与時には抗生物質、 抗 炎症剤、 麻酔薬などと同時に用いることもできる。 こうして調製された製 剤は様々な方法で投与可能であるが、 好ましくは神経の障害の著しい部位 に局所的に投与される。 神経の再生は通常数日から数力月を要するもので あり、 その間、 投与は連日または数日から数週間おきになされる。 また、 この様な頻回の投与を避けるために徐放性のミニペレツ ト製剤を調製し患 部近くに埋め込むことも可能である。 あるいはォスモチックポンプなどを 用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。 通常投与量は作 用部位における濃度が 0. Ιη -ΙΟ ^ Μ になるように調製する。
一方、 アンチセンス R N Aを細胞内で生産する方法において、 このアン チセンス R N Aの好ましい長さとしては、 例えば 1 0 0塩基以上が挙げら れ、 好ましくは 3 0 0塩基以上が挙げられ、 さらに好ましくは 5 0 0塩基 以上が挙げられる。
アンチセンス R N Aを産生する遺伝子の患者への導入方法としては、 直 接生体内の細胞に遺伝子を導入する in vivo法、 及び体外である種の細胞 に遺伝子を導入し、 その細胞を体内に戻す ex vivo法がある （日経サイェ ンス， 1994年 4月号， 20- 45頁、 月刊薬事， 36(1), 23- 4 8 (1994)、 実験医 学増刊， 12(15), (1994) 、 およびこれらの引用文献等） が、 in vivo法が より好ましい。
in vivo法としては、 組換えウィルスを用いる方法及びその他の方法 （日 経サ ィエンス、 1994年 4月号、 20- 45頁、 月刊薬事、 36 (1) 、 23-48 (199 4) 、 実験医学増刊、 12 (15) 、 全頁 （1994) 、 及びこれらの引用文献等） のいずれの方法も適用することができる。
組換えウィルスを用いる方法としては、 例えばレ トロウイルス、 アデノ ウィルス、 アデノ関連ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニアウィルス、 ポリオウィルス、 シンビスウィルス等のウィルスゲノムにセマフォ リ ン遺 伝子を組み込んで生体内に導入する方法が挙げられる。 この中で、 レトロ ウィルス、 アデノウイルス、 アデノ関連ウィルス等を用いた方法が特に好 ましい。
その他の方法としては、 リボソーム法、 リボフヱクチン法等が挙げられ、 特にリボソーム法が好ましい。
ex vivo法としては上記方法以外にマイクロインジヱクション法、 リン 酸カル シゥム法、 エレク トロボレ一ション法等も用いることができる。 患者への投与方法は、 治療目的の疾患、 症状などに応じた適当な投与経 路により投与される。 例えば、 静脈、 動脈、 皮下、 筋肉内等に投与するか、 または神経などの疾患の対象部位に直接投与することができる。 例えば、 脊髄に感染させると脊髄で特異的にセマフォリン遺伝子の発現が抑制され る。 通常、 本願のアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現は数日から数力 月持続し、 この 1回の感染で神経の再生が十分に起こる。 発現が弱いとき は、 再感染することもできる。 in vivo法により投与される場合は、 製剤 形態 （例えば、 液剤など） をとりうるが、 一般的には有効成分であるセ マフオリン遺伝子を含有する注射剤等とされ、 必要応じて、 慣用の担体等 を加えてもよい。 また、 セマフォリン遺伝子を含有するリボソームまたは 膜融合リボソーム （センダイウィルス （HVJ)—リボソーム等） においては、 懸濁剤、 凍結剤、 遠心分離濃縮凍結剤などのリボソーム製剤の形態とする ことができる。
製剤中のセマフォリン遺伝子の含量は、 治療目的の疾患、 患者の年齢、 体重等により適宜調節することができるが、 通常セマフォリ ン遺伝子とし て、 0. 0001- lOOmg 、 好ましくは 0. 001-lOragであり、 これを数日ないし数 力月に 1回投与するのが好ましい。
2 ) セマフォリン Yの改変タンパク質
本発明の第 5、 第 6態様の項に記載したように、 セマフォリン Yの有す る中枢神経伸長抑制活性を消失させた改変タンパク質を作製することがで き、 該改変夕ンパク質を生体内に投与することにより、 セマフォリン Yの 代わりに該セマフォ リ ン Y改変タンパク質がセマフォリ ン Yのリセプター に結合し、 その結果、 セマフォリ ン Yの活性が抑制され、 中枢神経の再生 が促進されることが考えられる。
治療においては該セマフォリン Yの改変タンパク質を安定化剤、 緩衝液、 希釈液と共に製剤化して患者に投与する。 投与は様々な方法で可能である 力 好ましくは病床部位に局所的に投与する。 神経の再生には通常数曰か ら数カ月を要するので、 その間セマフォリ ン Yの活性を抑制するために 1 回もしくは 2回以上投与する。 2回以上投与するときは連曰あるいは適当 な間隔をおいて繰り返し投与することが望ましい。 注射によって中枢神経 系、 例えば脊髄内に投与するときは、 一回当たり数百 から 2 g 、 好ま しくは数十 Dig以下を用いる。 投与回数を減らすために徐放性製剤を利用し たり、 ォスモティックポンプなどで長期間に渡って少量ずつ投与する方法 も可能である。 あるいは該セマフォリン Y改変タンパク質を発現する細胞 を生体内に移植することによつても可能である。
3 ) セマフォリ ン Yのべプチド
本発明の第 1 1〜第 1 3態様のぺプチドの中には、 セマフォリン Yの受 容体への結合を阻害することによって、 セマフォリン Yの有する中枢神経 の伸長抑制活性を抑制し、 その結果、 中枢神経の再生を促進するものが存 在する。 このような効果を有するペプチドの具体例として、 例えば本発明 の第 1 3態様の項に記載したように、 配列番号： 6に記載のヒ 卜セマフォ リン Yの第 1 9 8位のァスパラギン酸、 或いは該ァスパラギン酸の位置に 相当するアミノ酸を含有することを特徴とするぺプチドが挙げられる。 な お阻害の様式は、 競争阻害、 非競争阻害、 不競合阻害、 ァロステリック阻 害のいずれの様式であるかを問わない。
これらポリペプチドの製剤化、 投与法、 投与量については上記 「2 ) セ マフォリン Yの改変タンパク質」 の項を参照されたい。
4 ) セマフォリ ン Yの抗体
セマフォ リ ン Yの活性を中和する中和抗体を生体内に投与することによ り、 セマフォリ ン Yの活性が阻害され、 中枢神経の再生治療が促進される ことが考えられる。
該中和抗体の製剤化、 投与法、 投与量については上記 「2 ) セマフォリ ン Yの改変タンパク質」 の項に記載の通りであるが、 別の方法として、 Na ture, 343, 269- 272(1990)に記載されているように、 モノクローナル抗体 を産生する細胞を直接中枢神経系に移植する方法も可能である。
本発明の第 2 2の態様は、 本発明の第 4態様のタンパク質の少なくとも 一つを含有することを特徴とする、 末梢神経の伸長抑制剤である。 本発明 の第 4態様のタンパク質は、 中枢神経の伸長に対して抑制的に作用し得る が、 同時に末梢神経にもセマフォ リ ン Yに対するリセプタ一が発現してい る可能性があること、 また、 他のセマフォリ ンのリセプターがセマフォリ ン Yに対しても反応する可能性があることなどから、 末梢神経に対しても その伸長を抑制することが考えられる。 従って末梢神経の伸長を抑制する ことにより、 ァトビ一性皮膚炎、 疼痛等の治療薬となることが考えられる。 これらタンパク質の製剤化、 投与法、 投与量については上記 「2 ) セマ フオリン Yの誘導タンパク質」 の項を参照されたい。
本発明の第 2 3の態様は、 本発明の第 1〜第 3又は第 5態様の遺伝子、 あるいは第 7態様の D N Aのいずれかを人為的に染色体中に挿入したか、 あるいはいずれかをノックァゥ 卜させたトランスジヱニック動物である。 本発明のセマフォリン Yの遺伝子情報を持ってすれば、 以下の文献 （ビ —=ホーガンらの編纂によるマニピュレーションォブマウスェンブリォ 1986年コールドスプリングハーバーラボラ トリー、 相澤慎ー著 ジーン夕 ーゲッティング 1995年 羊土社、 など） で明らかなように、 現在の技術 レベルでは当該領域の研究者にとって本発明の第 1、 第 4、 第 7又は第 9 態様の遺伝子を発現するトランスジュニック動物を作製することはいとも 簡単であり、 こうして得られるトランスジエニック動物も当然のこととし て本発明に含まれるものである。 このようにして得られたトランスジヱニッ ク動物は医薬品開発のためのモデル動物として、 あるいは医薬品のスクリ 一二ング用の動物として非常に有用である。 さらに、 本発明の第 1、 第 4、 第 7、 第 9態様の遺伝子を欠失した動物いわゆるノックァゥ 卜動物は当該 遺伝子を有しないのが特徴である力 文献に述べられているようにあるい は当該領域の研究者の常識として、 本発明のセマフォリン Yの遺伝子情報 を利用して初めて作成が可能なものであり、 従って本発明に含まれること は言うまでもない。
なお、 上に述べたようにセマフォリン Yは神経の再生に関する生体内の 重要な機能を担っているが、 一方で、 前記したように、 セマフォリ ン Yは それ以外の免疫抑制作用などの未知の機能を有している可能性も指摘され ており （Cell, 75, 1389-1399 (1993)) 、 該セマフォ リン Yの遺伝子発現、 蛋白の分布、 機能などを調べることは当該領域の研究にとって、 あるいは 神経疾患などの患者の診断にとつて非常に重要であり、 本発明はかかる目 的のために利用可能な遺伝子プローブ、 抗体、 組換タンパク質、 トランス ジヱニック動物なども提供することができる。
図面の簡単な説明
図 1 ： ノーザン解析による種々の組織におけるセマフォリン Yの発現分 布を示す電気泳動の写真。
6週令のラッ 卜の組織から全 RN Aを抽出し、 1%寒天一ホルムアミ ド ゲル中で電気泳動し、 フィルターにプロッティング後32 Pで標識したラッ トセマフォリン YDNAプローブでハイブリダイズし、 セマフォリン Ym RNA発現分布を調べた。 各レーン 15 igの RNAを泳動した。 上図、 ォ ートラジオグラムの結果。 18S、 28 Sリボソーム RNAの位置を図の左 端に示した。 下図、 ゲルの臭化工 チジゥム染色像。 上、 下、 2本のバン ドは、 それぞれ、 28S、 18Sリボソーム RNA。
図 2： ノーザン解析による中枢神経系でのセマフォリン Yの発現分布を 示す電気泳動の写真。
6週令のラッ 卜の中枢神経組織から全 RN Aを抽出し、 1%寒天一ホル ムアミ ドゲル中で電気泳動し、 フィルターにブロッテイング後32 Pで標識 したラッ 卜セマフォリン YDNAプローブでハイプリダイズし、 セマフォ リ ン YmRNA発現分布を調べた。 各レーン の RNAを泳動した。 上図、 オートラジオグラム の結果。 18 S、 28 Sリボソーム RNAの位置 を図の左端に示した。 下図、 ゲル の臭化工チジゥム染色像。 上、 下の 2 本のバンドは、 それぞれ、 28 S、 18Sのリボソーム RNA。
図 3 ： ノーザン解析によるヒ ト中枢神経組織におけるセマフォリン Ym RNAの発現分布を示す電気泳動の写真。
ヒ ト中枢神経組織の種々の領域から調製された mRN A (2 ^ レー ン） を電気泳動後、 転写された膜フィルター （クローンテック） を、 32P で標識したセマフォリン YDN Aプローブでハイプリダイズし、 セマフォ リン YmRNAの発現分布を調べた。 図はそのォー卜ラジオグラムの結果 を示す。 図中、 矢印はセマフォ リ ン YmRNAのバン ドの位置を示す。 図 の左側にはサイズマーカ一 （k b) の位置を示した。
図 4 ： セマフォリン Yタンパク質の COS 7細胞における発現を示す電 気泳動の写真。
セマフォリン Yの C末端にヒ 卜 c- Myc由来の 10ァミノ酸を付加した発現 プラスミ ドを構築し、 これを CO S 7細胞に導入して一過的に発現させた (図中、 rSYmyc；) 。 コントロールにはセマフォリ ン Y遺伝子を含まないプ ラスミ ドを用いた （図中、 Control) 。 プラスミ ド導入後 3日目に細胞を 回収し、 膜画分を調製した。 膜画分を SDS- PAGEで分画後、 抗 Myc抗体を用 いてウェスタンブロッ トを行った。 図中の矢印は、 Mycペプチド付加セマ フオリン Yタンパク質のバンドの位置を示す。 図の左側に分子量マーカ一 の各バンドの位置と分子量 （kD) を示した。
図 5 ： ノーザン解析による生体組織でのセマフォリン ΙΠの発現分布を 示す電気泳動の写真。
成体マウスの種々の組織から全 RNAを抽出し、 1%寒天—ホルムァミ ドゲル中で電気泳動し、 フィルターにブロッテイング後、 3 2 Pで標識した マウスセマフォ リ ン III D N Aプローブでハイプリ し、 セマフォ リ ン III m R N A発現分布を調べた。 各レーン の R N Aを泳動した。 上図、 オートラジオグラムの結果。 18S. 28S リボソーム R N Aの位置を図の左端 に示した。 下図、 ゲルの臭化工チジゥム染色像。 上、 下の 2本のバンドは、 それぞれ、 28S、 18S のリボゾーム R N A。
実施例
基本的な実験方法は Maniatisらによって編纂された Molecular Cloning 2nd Edt. ( Cold Harbor Laboratory Press, 1989), Ausubelらによって 編纂された Cii rrent Protocols in Molecular Biology( John Wiley & So ns, 1987) および東 京大学医科学研究所制癌研究部編纂の細胞工学実験 プロ トコール （秀潤社、 1991) などの多くの出版物に詳しく記載されてい る。 尚、 本発明は以下の実施例にのみ限定されるものでなく、 本発明の技 術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。
実施例 1
ラッ トセマフオリン Y遺伝子の単離
( 1 ) 新規セマフォリン遺伝子のデーターベースからの検索
ナショナルセンター フォー バイオテクノロジ一 リサーチ （ァメリ 力合衆国メ リーランド州べセスダ） のディービーィーエスティー （dbEST ) データべ一スを用い、 既知のセマフォリン遺伝子において比較的保存され ているアミノ酸配列をコードしており、 しかも末梢組織の cDNAからは得ら れず生後脳の cDNAのみから得られる配列を検索した。 その結果、 ファイル 番号アール 59527 ( R 59527 ) の塩基配列が既知のセマフォリン遣伝子に 共通している 7個のアミノ酸からなる配列 （Gin (または Arg)- Asp-Pro-Tyr -Cys-Ala (または Gly)-Trp) をコードすることを発見した。 しかし、 R595 27の配列情報は僅か 238塩基と、 既知のセマフォリ ン遺伝子の cDNAと比較 して非常に短く、 しかもその中で既知のセマフォリンと共通の配列に翻訳 できるのは全体のわずか数％のァミノ酸に限られていたこと、 更にこの 9527には配列未確定の部分が存在していたためァミノ酸への読み枠も決定 できなかったなどの理由から、 この R59527の塩基配列が新規セマフォリン 遺伝子の一部であることは結論できなかった。 そこで、 この配列を持つ遺 伝子が成体の脳で発現していることを確認した上で、 この配列を含む cDNA の全長をクローニングして遺伝子の構造を決定することとした。
( 2 ) 脳における R59527の配列を有する遺伝子の発現の確認
成人ヒ ト中枢神経系でこの遺伝子が発現していることを確認するため、 B59527の塩基配列を基にして、 約 170bp の配列部分を挟む 2本の D N Aプ ライマー (5' TGGCTGTATTGTCTACCT3' (配列番号： 8 )、 5' TGGATTCCTGGTTC CNAGCC3' (配列番号： 9 ) ) を合成し、 ヒ ト脳の c D N Aライブラリー （ク ローンテック社製） から調製した c D N Aを铸型にして通常の条件で P C Rを行った。 その結果、 期待通り約 170bpの断片が増幅されてきた。 続い てその断片が R59527と同じ塩基配列 を有していることを確認するため、 D NAを pCRII (インビトロジヱン社製） にイン ビトロジェン社のプロ トコ一 ルに従ってクローニングし、 塩基配列を決定した。 その結果得られた配列 (配列番号 : 7に記載) は R59527と 98%—致していたため、 R59527の配列 を含む遺伝子が成人ヒ ト脳において発現していることが確認できた。
( 3 ) ラッ トセマフォリン Y遺伝子の単離
次に、 前記 （2 ) でクローニングした R59527の一部に相当する 170bp の 断片をプローブにしてこの配列を含む cDNA全長をクローニングし、 構造を 決定することとした。 なお、 ヒ トに比べて c D N Aライブラリーの作製が たやすいためラッ トの遺伝子をまずクローニングすることにした。 ラッ ト 脳及び筋肉から通常の方法で調製した m R N Aとラムダザップツー （义 Za pll ) c DNAライブラリ一作製キッ ト （ス トラタジーン社製） とを用い て、 上記実験書に紹介されている通常の方法にて cDNAライブラリーを 作製した。 続いて、 この c DNAライブラリ一を用いて寒天プレート上に 約 15万プラークを作製し、 このプラークをナイロン膜 （日本ポール社製） に写し、 DNAの変性、 中和を行った後、 0.6J/CID2の紫外線で固定し、 ハ イブリダィゼーシヨンに用いた。 ハイブリダィゼーシヨンは、 このナイ口 ン膜とプローブとなる32 Pでラベルした 170bpの DNA断片 （アマ一 シャ ム社製メガブライム DN Aラベリングシステムを用いてアマ一シャム社の プロ トコールに従って作製した） とをハイブリダィゼーシヨン溶液 （45%(v /v)ホルムアミ ド、 5 Xエスエスピィ一ィー溶液（SSPE，ここで 1XSSPEと は 0.15M塩化ナトリウム、 ΙΟπιΜリン酸二水素ナトリウム、 lmM エチレンジ ァミン四酢酸ニナトリゥムの混合物を pH7.0に調製したものを表す） 、 2 Xデンハルト溶液 （和光純薬製） 、 0.5¾(w/v) ドデシル硫酸ナトリウム（S DS) 、 20/zg/mlサケ精子 DNA (和光純薬製） ） に入れ、 42°C48時間静置 することにより行った。 反応後、 ナイロン膜を室温で 2- 3回 2xSSPE、 0. 5¾(w/v)SDS中で 10分間洗浄した後、 更に、 42°Cで 2- 3回 2xSSPE、 0.5¾(w /v)SDS中で 10分間洗浄した。 こうして得られたフィルタ一を BAS2000 バイ ォイメージアナライザ一 （富士フィルム製） で解析し、 6個の陽性シグナ ルを得た。 陽性シグナルの位置にあるプラークを寒天プレー卜から切り出 し、 クロロフオルムを添加した 500^1 エスエム（SM)バッファー （1 OOmM 塩化ナトリウム、 15mM硫酸マグネシウム、 50mM卜リス（pH 7.5)、 0.0 1% ゼラチン） に入れた後、 4 °C—晚放置し、 ファージを溶出した。 こう して得られた組換ラムダファージを先と同様の手順で 2次スクリーニング し、 単一プラークを分離した。 得られたファージを以下に示すようにスト ラタジーン社のプロ トコールに従って処理し、 c DNAィンサートを持つ ファージミ ドのインビボ切り出しを行った。 すなわち、 二次スクリーニン グから得られた 4個のシングルプラークを含む寒天ゲルをそれぞれ 500 1 の SMバッファーに入れ 20^1 のクロ口ホルムを加えた後 4°C一晚静置 した。 このファージ溶液 250 1 と、 OD600=1.0 になるように 10mM塩化マ グネシゥム中に懸濁した大腸菌 XL- lBlueMRF' 200 ΐ 、 更に、 1 jul のエツ クスアシスト （ExAssist) ヘルパーファージ （>lxl06 pfu/ral) とを混ぜ、 37°C15分間培養した。 続いて、 3ml のエルビー培地 （0.5¾(w/v) 塩化ナ卜 リウム、 l¾(w/v) バク ト トリプトン （ディフコ社製） 、 0.5%(w/v) ィース トエキストラク ト （ディフコ社製） を混合後 5M水酸化ナ卜リウムで pH7.0 に調製） を加えて 37°Cで 2-3時間振とう培養した。 2000xg 15分間遠心し て菌体を除去し上清を 70°C15分加熱処理した。 その後、 再び 2000xg 15分 間遠心し、 上清を c DN Aインサートを持ったファージミ ドの保存液とし て回収した。 このファージミ ドの保存液 10- 100〃 1 を 200 l の大腸菌 S OLR(OD600=1.0)に混合し、 15分間 37°Cで培養した後、 アンピシリ ンプレー 卜に 10- 50 1 まき、 37。C—晚培養し、 上記陽性プラークのファージミ ド を有する大腸菌株を取得した。
(4) DNAシーゲンシング
得られた c DNAクローンの塩基配列をパーキンエルマ一社の 377型 D NAシーケンサーを用いて解析し、 全塩基配列を決定した。 なお、 反応に はプリズムダイタ一ミネーシヨンキッ ト （パーキンエルマ一社製） を用い た。 決定した DNA塩基配列 （3195塩基） を配列番号： 1に、 また推定さ れるオープンリーディングフレーム （2787塩基） を配列番号： 2に、 また ァミノ酸配列 （929ァミノ酸） を 配列番号： 3に示す。
この遺伝子は、 そのアミノ酸配列の第 46位から第 570位に、 いわゆるセ マフオリンドメィンを有していたことから、 確かにセマフォリンファミ リ —に属する夕ンパクであることが確認されたため、 この遺伝子をセマフォ リ ン Yと名付けた。 またこの配列番号 1に示すセマフォリン Y遺伝子の 15 74番目から 1811番目の塩基配列が 238bpからなる R59527の配列全長に対し て 89%の一致を示したころから、 R59527 がヒ ト型セマフォリン Y遺伝子 の部分配列であることが明らかになった 。
実施例 2
ノーザン解析によるラッ トセマフオリ ン Yの発現分布
ラッ 卜の組織におけるセマフォリン Y遺伝子の発現分布を調べるために 種々の組織から RNAを調製しノ一ザン解析を行つた。 RNAの調製は以下のよ うにラッ 卜の様々な組織を材料にしてエージ一ピーシ一法 （辻孝、 中村敏 -；実験医学 1991年 9巻 1937-1940頁、 エフ ·ェム 'ァウスベルら編 力 レントプロ トコルズィンモレキュラーバイオロジー 1989年 4. 2. 4— 4. 2. 8 頁 （グリーンァソシエイツァンドウイ リ f ンタ一サイエンス社） ） で 行った。 簡単に述べると、 切り出した組織 lg当たり 10mlの変性溶液 （4Mグ ァニジンチォシアン酸、 25πιΜクェン酸ナトリウム （ρΗ7. 0)、 0. 5¾サルコシ ル、 0. 1M2-メルカプトエタノール） を加えポリ トロンホモゲナイザーを用 いて素早くホモゲナイズした。 その後、 0. 1 容の 2Μ酢酸ナ トリウム （ΡΗ4. 0)、 一容の水飽和フヱノール、 0. 2 容のクロ口ホルム一イソアミルアルコ ール (49 : 1)を加えて激しく攪拌した後、 遠心して水層を分取し、 イソプロ ピルアルコールを等容加えて - 20でで 1時間放置した。 遠心で沈殿を回収 し、 再び lg組織当たり 2-3mlの変性溶液に溶解、 等容のイソプロピルアル コールを加え -20°C 1時間静置した後、 R N Aを遠沈した。 75% のェチル アルコールで沈殿を洗い軽く乾燥させた後適当な体積の水に溶解した。 続いて、 以下に述べる通常の方法で R N Aの電気泳動とノーザンプロッ ティングを行った。 まず、 様々な組織から調製した RN Aをホルムアルデ ヒ ドを含む 1%ァガロースゲル中で電気泳動した。 そのゲルを 50mMNaOHで 20 分間振とうした後、 10XSSPE中で 40分間振とうした。 その後、 RNAを毛 細管現象を利用してナイロン膜 （バイオダイン B、 日本ポール社製） にブ ロッテイングし、 スタラタジーン社の UVクロスリンカ一を用いて固定し （0 .6J/cm2) ハイブリダィゼーシヨンに用いるナイロン膜を得た。 プローブ の作製は以下のようにした。 まず、 2本のプライマー （5' TGTGTAAACGTGAC ATGG3' (配列番号： 10) 、 5' TGCTAGTCAGAGTGAGGA3 (配列番号： 11) ) を用いて上記実施例 1で得られたラッ トセマフオリ ン YDNAを铸型にし て PCRを行い、 477bpの断片を増幅した。 この断片を上記と 同様の方法 で pCRIIにクローニングした後、 塩基配列を決定し、 ラッ トセマフォ リ ン Yの遺伝子断片であることを確認した。 このプラスミ ド DNAを铸型にして 上 記のプライマ一を用いて通常の方法で PCRを行い目的の 545bpの断片を 増幅した。 増幅された DN Aをァガロースゲルを用いて分離 ·精製したも のを、 上記実施例 1と同様にアマ一シャム社製メガプライム DNAラベリ ングシステムを用いて32 Pで標識し、 プローブとした。 ハイブリダィゼー シヨン反応は、 RN Aをブロッティングしたナイロン膜とプローブ DN A を上記 （2) と同様のハイブリダィゼーシヨ ン溶液中で 42°C48時間放置し 行った。 反応後、 ナイロン膜を 42°Cの 2XSSPE、 0.5!¾(w/v)SDS中で 10分間 2- 3回洗浄した後、 更に、 55°Cの 2XSSPE、 0.5%SDS(w/v)中で 10分間 2- 3回洗 浄した後、 膜上の放射活性を BAS2000バイオイメージアナライザーで解析 した。 その結果、 図 1及び図 2に示したように、 セマフォリン Yの mRNAは 成体の中枢神経系で広く発現している一方、 末梢組織では筋肉のみでしか 発現が確認されず中枢神経再生阻止因子たるセマフォ リ ン遺伝子の期待し た特徴を備えていた。 実施例 3
ヒ ト型セマフォリン Yの配列決定
上に述べたように R59527の配列がヒ ト型セマフォリン Y遺伝子の一部分 であることが確実となったため、 R59527の配列を含んでいる ESTクローン ( # 41581) を米国ジエノムシステムズ社より入手し、 上記の方法で全塩 基配列を決定した。 この決定された塩基配列は配列番号 1のラッ 卜セマフォ リン Yの塩基配列と全長にわたって高い相同性を示し、 74%の塩基が一致 していた。 またこの 5 ' 側にはオープンリーディングフレームの一部と思 われる連続して 427個のァミノ酸に翻訳できる領域が存在した。 このァミ ノ酸配列は配列番号 3のラッ トセマフオリ ン Y遺伝子の 504番目から 929番 目までの配列と 82%の一致を示し、 この配列が間違いなく ヒ 卜型セマフォ リン Yの一部分であることが示された。 しかしながら、 この # 41581のク ローンからはヒ トセマフオリン Yの N末に相当する配列は決定できなかつ た。 続いてヒ 卜セマフォリン Yの全長の塩基配列を決定するため、 種々の ラッ トセマフォリン YcDNA断片をプローブにして、 上記と同様の方法で、 ストラ夕ジーン社より購入したヒ ト海馬と前脳の cDNAライブラリーをスク リーニングし、 クローン # 1 0を得た。 上記と同様の方法でクローン # 1 0の塩基配列を決定したところ、 この配列は先の # 41581のクローンと約 2 00塩基の重なりをもち、 更に 5 ' 側に 1700塩基以上の cDNA配列を含んでい た。 # 41581と # 10により構築されたヒ ト型セマフォリン Yの全塩基配列 (3432塩基） を配列番号： 4に、 またオープンリーディングフレーム （27 90塩基） を配列番号： 5に、 またアミノ酸配列 （930アミノ酸） を配列番 号： 6に、 それぞれ示す。 ヒ ト型セマフォリン Yはラッ ト型セマフォリン Yと、 アミノ酸レベルで 87%が一致していた。
なお、 上記クローン # 10のィンサート部分 （ヒト型セマフォリン Yの c D N A部分） をベクター pBluescriptに組み込んだプラスミ ド （hSYlO) を E. coli SOLR株に導入して得られた形質転換体である E. coli S0LR(hSY 10)は、 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号、 工業技術院生命工学工業技術 研究所に寄託されている （微生物の表示： E. coli SOLR(hSYlO)；受託日 ： 平成 9年 7月 11曰 ；受託番号： FERM BP- 6021) 。
また、 上記クローン # 41581のィンサー 卜部分 （ヒ ト型セマフォ リ ン Y の c D N A部分） をベクター LafmidBAに組み込んだプラスミ ド、 N041581 を E. coli DH10B株に導入して得られた形質転換体 E. coli DH10B(NO41581) は、 上記と同様に、 工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている (微生物の表示： E. coli DH10BCN041581)；受託曰 ：平成 9年 7月 11日 ；受 託番号： FERM BP- 6022) 。
実施例 4
ノーザン解析によるヒ トセマフォ リ ン Yの発現分布
ヒ ト niRNAブロッテイングメンブレン （クローンテック社） を用い、 P C Rによって得られた配列番号： 1の第 8 3 2位から第 1 3 1 0位までの 4 7 9 b pのラッ トセマフォリン YcDNAをプローブとして、 実施例 2と同様 の方法によりノーザン解析を行ない、 ヒ ト成体の中枢神経組織内の種々の 領域でのセマフォリン YmRNAの発現分布を調べた。 図 3に示したように、 ヒトセマフォリン YmRNAは成体の中枢神経組織内各領域において広く発現 しており、 小脳で特に強い発現が認められた。
以上のようにヒ 卜でのセマフォリン Yもラッ トと同様、 中枢神経組織に おいて広く発現しており、 セマフォリン Yは齧歯類から霊長類に共通の機 能を担っているものと思われる。
実施例 5
動物細胞におけるセマフォリ ン Yの発現 ラッ トセマフオ リン Y遺伝子の終始コ ドンの直前に Asp- lie- Gly- Gly- G1 u- Gin- Lys- Lue- Ile-Ser- Glu- Glu- Asp-Leuの配列からなる Mycタグをコード する断片を挿入し、 発現プラスミ ド pUCSKひに導入した。 この発現プラス ミ ドを DEAEデキストラン法 （F. M. Ausubelらの編纂による Current Protoco Is in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987)) で COS 7細胞にト ランスフヱクションし、 48時間後にセルスクレーパーを用いて細胞を回収 した。 回収した細胞を、 蛋白分解酵素阻害剤を含む A液 （lOmM HEPES PH7. 4， lmM EDTA, ロイぺプチン、 2 Mぺプスタチン、 0. 5mM PMSF， 7. 8m
TlU/mlァプロチニンを含むハンクス生理食塩水） の存在下でホモジヱナイ ズし、 12000g、 10分間の高速遠心で沈殿物と上清に分離した。 膜画分を含 む高速遠心の沈殿物は A液で 2回洗った後、 2倍量の 2. 25Mしょ糖 ZPBSに 懸濁し、 2. 25Mしょ糖 ZPBS液上に重層し、 更にその上に 0. 8Mしょ糖/ PBS 液を重層した後、 12000g、 20分間遠心した。 下側の界面から膜画分を回収 し、 その後更に 2回洗い、 使用時まで- 80°Cで保存した。
得られた膜画分を SDS-PAGE (10!¾- 20¾濃度こう配ゲル） の後、 常法どお りにウェスタンプロッティングし、 本発明のセマフォリン Yが産生されて いることを確認した。 その際、 一次抗体には抗 Myc抗体 9E10 (カルバイオケ ム社製）を、 二次抗体にはアル力リフォスファターゼ標識の抗マウス IgG抗 体 （バイオソース社製） を用いた。 ウエスタンブロッテイ ングの結果、 図 4に示したように約 130kDaの位置に特異的なバンドが観察され、 Myc標識 のラッ トセマフォリン Y蛋白が COS細胞で発現し膜に存在していることが 確認できた。
実施例 6
セマフォリン Yの活性測定
前記実施例 5で得られた細胞膜画分と、 同様の方法でセマフォリン Yを 導入していない C O S 7細胞から調製した細胞膜画分とを、 in vitroで培 養した中枢神経や後根神経節神経等の培養液に添加し、 M. Igarashi et al. ， Science, 259, 77-79(1993)に記載の方法で成長円錐の退縮活性を比較 すると、 該セマフォリン Y蛋白の発現プラスミ ドを導入した C O S 7細胞 の膜画分が有為に高い成長円錐の退縮活性を有することが明らかとなる。
参考例 1
セマフォリン III を用いたセマフォリン活性必須部位の同定
Neuron, 14， 941-948 (1995)に記載のセマフォリン ΠΙ の配列情報をも とに PCR 反応を行い、 発現プラスミ ド pUCSR ひにセマフォリン IIIの構造 遺伝子を組み込んだ。 この発現プラスミ ドを DEAEデキストラン法で C0S7細 胞に導入し、 2日後に培養上清に含まれるセマフォリン IIIの活性を、 Cel 1, 75, 217-227 (1993) に 記載の方法と同様の方法にてニヮ トリ後根神経 節神経の成長円錐退縮活性を指標に調べたところ、 全く活性を示さないク ローンが 1 つ発見された。 そこで、 このクローンの塩基配列を決定したと ころ、 198番目のァスパラギン酸がグリシンに 変化していた。 この 198 番 目を含む前後の領域を他の既知の動物のセマフォリンと比較すると、 この 領域はセマフォリンドメィン内では際だって保存されている領域ではなか- たが、 このァスパラギン酸に相当する部位だけは一部のセマフォリンでグ ルタミン酸になっている以外では非常に良く保存されていた。 このことか ら、 このァスパラギン酸が活性発現に必須であることが示唆された。 次に この遺伝子に通常の方法で部位特異的突然変異を導入し、 このグリシンを ァスパラギン酸に修復したところ強い退縮活性が回復したため、 この発現 プラスミ ドのこれ以外の領域は正常に機能することを確認した。 以上より、 セマフォリン IIIの 198番目のァスパラギン酸がセマフォリンの機能発現に 必須であると考えられる。 なおこのァスパラギン酸に相当するのが配列番 号 3のラッ トセマフォリン Yのァミノ酸配列では 1 9 7番目のァスパラギ ン酸であり、 配列番号 6のヒ トセマフォリン Yのァミノ酸配列では 198番 めのァスパラギン酸である。
参考例 2
ノーザン解析によるセマフォリン III の組織特異的遺伝子発現
マウスの組織におけるセマフォリン ΙΠ 遺伝子の発現分布を調べるため に成体マウスの種々の組織から R N Aを調製し、 ノーザン解析を行つた。 R N Aの調製、 プロッティ ング、 ハイブリダィゼーションは、 実施例 2と 同様の方法によって行った。 プローブには参考例 1に記載したマウスセマ フォリン III D N Aの 560bp の Mspl断片を用いた。 その結果、 図 5に示し たように、 成体におけるセマフォリ ン III の発現分布は、 肺において非常 に強い一方、 中枢神経系ではむしろ弱いことが分かった。
発明の効果
本発明によって、 神経の伸長に対し抑制的に作用するセマフォリン Y及 びその遺伝子、 該セマフォリン Y遺伝子にハイプリダイズする他のセマフォ リン、 該セマフォリン Yの改変タンパク質、 部分べプチド、 抗体、 該セマ フオリン Y遺伝子のアンチセンスヌクレオチド、 これらの物質の医薬 ·診 断薬あるいは研究用試薬としての用途、 さらには該セマフォリン Yを用い たセマフォリン Yアンタゴニス 卜のスク リーニング方法、 該スク リーニン グ方法により得られるセマフォリン Yアンタゴニスト、 これらアンタゴニ ストを含有する医薬、 若しくは該セマフォリ ン Yについてのトランスジェ ニック動物等が提供される。 配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 3195
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列： No
ァンチセンス ： No
起源
生物名 ： ラッ 卜 (Rattus norvegicus) 組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号： 5' UTR
存在位置 ： 1. . 50
特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： CDS
存在位置： 51. . 2837
特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： 3' UTR
存在位置 ： 2838. . 3195
特徴 'を決定した方法： E
配列 GCGGCCGCGT CGACGGGGTA CTCCCTGGGG CTTGAGCTGC CCCGCACAGG ATGCCCCGTG 60 CCCCCCACTC CATGCCCTTG CTGCTGCTGT TGCTGCTGTC ACTCCCCCAA GCCCAGACTG 120 CCTTTCCCCA GGACCCCATC CCTCTGTTGA CCTCTGACCT ACAAGGTACC TCTCCGTCAT 180 CCTGGTTCCG GGGCCTGGAG GACGATGCTG TGGCTGCGGA ACTTGGGCTG GACTTTCAGA 240 GATTCCTGAC CTTGAACCGG ACCTTGCTTG TGGCTGCCCG GGATCACGTT TTCTCCTTCG 300 ATCTTCAAGC CCAAGAAGAA GGGGAGGGGC TGGTGCCCAA CAAGTTTCTG ACATGGCGGA 360 GCCAAGACAT GGAGAAHGT GCTGTCCGGG GAAAGCTGAC GGACGAATGC TACAACTACA 420 TCCGTGTTCT TGTTCCCTGG GACTCGCAGA CACTCCTTGC CTGTGGAACA AATTCCTTCA 480 GCCCTGTGTG TCGCAGCTAT GGGATAACAT CTCTGCAACA GGAGGGTGAG GAGCTGAGTG 540 GGCAAGCTCG ATGCCCCTTT GATGCCACCC AGTCCACTGT GGCCATCTCT GCAGAGGGTA 600 GTTTGTACTC AGCCACAGCA GCAGATTTCC AGGCCAGTGA TGCTGTGGTT TACAGAAGCC 660 TTGGACCTCA GCCCCCACTC CGTTCTGCAA AGTATGACTC CAAGTGGCTT CGAGAGCCAC 720 ACTTTGTCTA TGCTTTGGAG CATGGAGACC ATGTCTACTT CTTTCTTCCG GAGAAGTCTC 780 TGTGGAGGAC GCCCGGCCTG GGGAGGGTGC AGTTTTCCCG GGTGGCCCGG GTGTGTAAAC 840 GTGACATGGG TGGCTCACCA CGGGCCTTGG ATCGCCACTG GACATCCTTC CTTAAGCTGA 900 GGCTCAACTG CTCCGTCCCT GGGGACTCTA CCTTCTACTT TGATGTCTTA CAGTCCTTAA 960 CTGGGCCTGT GAACCTGCAT GGGCGCTCTG CCCTCTTTGG GGTCTTCACT ACTCAGACCA 1020 ATAGCATTCC TGGGTCTGCA GTCTGCGCCT TCTACCTAGA TGACATTGAA CGTGGCTTTG 1080 AGGGCAAGTT CAAGGAGCAG AGGAGTCTGG ATGGGGCCTG GACTCCTGTG TCTGAGGACA 1140 AAGTCCCCTC ACCCAGGCCA GGGTCCTGTG CAGGTGTGGG TGCAGCTGCC HATTCTCCT 1200 CCTCTCAAGA CCTGCCTGAC GATGTCCTGC TCTTCATCAA GGCACACCCA CTGCTGGATC 1260 CCGCTGTGCC ACCTGCCACC CATCAACCTC TCCTCACTCT GACTAGCAGG GCTCTACTGA 1320 CCCAGGTAGC TGTGGATGGT ATGGCTGGCC CCCACAGAAA TACTACAGTC CTGTTTCTTG 1380 GCTCCAATGA TGGGACAGTG CTGAAGGTGC TACCTCCAGG GGGACAGTCT CTGGGACCCG 1440 AGCCTATCAT ATTGGAAGAG ATTGATGCCT ACAGCCATGC CCGGTGCAGT GGGAAGCGGT 1500 CACCCCGAGC TGCTCGACGG ATCATAGGGC TGGAGCTGGA CACTGAGGGT CACAGGCTTT 1560 TTGTGGCCTT TCCTGGATGC ATCGTCTACC TCTCTCTCAG CCGCTGTGCC CGGCATGGAG 1620 CATGTCAGAG GAGCTGCCTG GCTTCTCTGG ACCCATACTG TGGATGGCAT CGGTTCCGAG 1680 GCTGTGTGAA TATCAGGGGA CCTGGAGGGA CTGATGTGGA TCTGACTGGG AACCAGGAAT 1740 CCATGGAGCA TGGTGACTGC CAAGATGGAG CGACTGGGAG TCAGTCTGGC CCTGGAGATT 1800 CTGCCTATGG CGTGCGCAGG GACCTTTCCC CAGCCTCAGC CTCCCGATCC ATCCCCATCC 1860 CACTCCTCCT GGCCTGTGTG GCGGCGGCCT TCGCTTTGGG CGCCTCAGTC TCCGGCCTCT 1920 TGGTGTCCTG TGCTTGTCGT CGCGCGAACC GCCGTCGGAG CAAGGACATC GAGACCCCGG 1980 GGCTGCCGCG CCCCCTCTCC CTTCGCAGTC TGGCGAGGCT GCACGGTGGC GGTCCTGAGC 2040 CCCCGCCTCC GCCCAAGGAT GGTGATGCAG CGCAAACGCC CCAGCTCTAC ACTACCTTCC 2100 TGCCTCCGCC CGAGGGCGGA TCCCCACCGG AGCTGGCCTG CCTGCCCACC CCGGAGACCA 2160 CGCCCGAGCT GCCGGTGAAG CACCTCCGTG CCTCCGGGGG TCCCTGGGAG TGGAACCAGA 2220 ACGGGAACAA CGCTTCGGAG GGCCCAGGCC GCCCACGGGG CTGCAGCGCG GCGGGCGGGC 2280 CCGCCCCGCG CGTGCTGGTG AGGCCACCGC CCCCTGGCTG CCCCGGGCAG GAGGTGGAGG 2340 TGACCACGCT GGAGGAACTG CTGCGCTACC TGCACGGCCC GCAGCCGCCC AGGAAGGGCA 2400 GCGAACCTCT CGCCTCCGCC CCGTTCACCT CCCGGCCGCC TGCCTCGGAG CCCGGCGCCG 2460 CCTTGTTCGT GGACTCCAGC CCGATGCCTC GTGATTGCGT GCCGCCGCTG AGGCTCGACG 2520 TACCGCCCGA CGGCAAGCGC GCGGCCCCGA GCGGGCGGCC TGCTCTCTCG GCCCCGGCTC 2580 CACGCCTGGG CGTCAGCGGC AGCCGAAGAT TGCCCTTCCC CACGCACCGG GCGCCCCCGG 2640 GCCTGCTCAC CCGAGTCCCC TCGGGAGGCC CGTCCAGGTA CTCCGGGGGG CCCGGGAGGC 2700 ACCTCCTGTA CCTGGGCCGG CCCGACGGCC ACCGCGGCCG CTCCCTGAAG AGGGTGGACG 2760 TGAAGTCTCC ACTGTCGCCC AAACCGCCCC TCGCCACACC GCCGCAGCCC GCCCCGCACG 2820 GCAGCCATTT TAACTTCTGA CAGAAGCTGC TAGCGCCCGT CGAGGCGCTG GAGGCCTAGG 2880 CCTGCGGAGG CCGCTGGCCT TCCCGGACTC CAAGAGTCTC CCGGGGTCCC CTCTCGCCTC 2940 GGTTTATTTA TTGACTGTCT TTCCCCCTGT CCTTTGGCGA GGAGCTCGCC GCTCGGAGCG 3000 CCAGCATTTC AGGGGACCTG GCCGACTCCC ACTCCCCGCT CCCTTCCAGC CACGCTGCCT 3060 TAACTCGTCG CTCCGGACTC CCGCGGACTG GGCCCCGGGC GGGCCGGCCG GGGCTGGAGC 3120 CGCGCGCTGT GTACAGAGTC CTCCGGCCTC CTGGGGCCGG GACGTGCCTC CTCCTACTGT 3180 GTAGGAGCCC CCACC 3195 配列番号： 2
配列の長さ ： 2787
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列： No
アンチセンス ： No
起源
生物名： ラツ 卜 (Rattus norvegicus)
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1. . 2787
特徴を決定した方法： E
配列
ATGCCCCGTG CCCCCCACTC CATGCCCTTG CTGCTGCTGT TGCTGCTGTC ACTCCCCCAA 60 GCCCAGACTG CCTTTCCCCA GGACCCCATC CCTCTGTTGA CCTCTGACCT ACAAGGTACC 120 TCTCCGTCAT CCTGGTTCCG GGGCCTGGAG GACGATGCTG TGGCTGCGGA ACTTGGGCTG 180 GACTTTCAGA GATTCCTGAC CHGAACCGG ACCTTGCTTG TGGCTGCCCG GGATCACGTT 240 TTCTCCTTCG ATCTTCAAGC CCAAGAAGAA GGGGAGGGGC TGGTGCCCAA CAAGTTTCTG 300
ACATGGCGGA GCCAAGACAT GGAGAATTGT GCTGTCCGGG GAAAGCTGAC GGACGAATGC 360
TACAACTACA TCCGTGTTCT TGTTCCCTGG GACTCGCAGA CACTCCTTGC CTGTGGAACA 420
AATTCCTTCA GCCCTGTGTG TCGCAGCTAT GGGATAACAT CTCTGCAACA GGAGGGTGAG 480
GAGCTGAGTG GGCAAGCTCG ATGCCCCTTT GATGCCACCC AGTCCACTGT GGCCATCTCT 540
GCAGAGGGTA GTTTGTACTC AGCCACAGCA GCAGATTTCC AGGCCAGTGA TGCTGTGGTT 600
TACAGAAGCC TTGGACCTCA GCCCCCACTC CGTTCTGCAA AGTATGACTC CAAGTGGCTT 660
CGAGAGCCAC ACTTTGTCTA TGCTTTGGAG CATGGAGACC ATGTCTACTT CTTTCTTCCG 720
GAGAAGTCTC TGTGGAGGAC GCCCGGCCTG GGGAGGGTGC AGTTTTCCCG GGTGGCCCGG 780
GTGTGTAAAC GTGACATGGG TGGCTCACCA CGGGCCTTGG ATCGCCACTG GACATCCTTC 840
CTTAAGCTGA GGCTCAACTG CTCCGTCCCT GGGGACTCTA CCTTCTACTT TGATGTCTTA 900
CAGTCCTTAA CTGGGCCTGT GAACCTGCAT GGGCGCTCTG CCCTCTTTGG GGTCTTCACT 960
ACTCAGACCA ATAGCATTCC TGGGTCTGCA GTCTGCGCCT TCTACCTAGA TGACATTGAA 1020
CGTGGCTTTG AGGGCAAGTT CAAGGAGCAG AGGAGTCTGG ATGGGGCCTG GACTCCTGTG 1080
TCTGAGGACA AAGTCCCCTC ACCCAGGCCA GGGTCCTGTG CAGGTGTGGG TGCAGCTGCC 1140
TTATTCTCCT CCTCTCAAGA CCTGCCTGAC GATGTCCTGC TCTTCATCAA GGCACACCCA 1200
CTGCTGGATC CCGCTGTGCC ACCTGCCACC CATCAACCTC TCCTCACTCT GACTAGCAGG 1260
GCTCTACTGA CCCAGGTAGC TGTGGATGGT ATGGCTGGCC CCCACAGAAA TACTACAGTC 1320
CTGTTTCTTG GCTCCAATGA TGGGACAGTG CTGAAGGTGC TACCTCCAGG GGGACAGTCT 1380
CTGGGACCCG AGCCTATCAT ATTGGAAGAG ATTGATGCCT ACAGCCATGC CCGGTGCAGT 1440
GGGAAGCGGT CACCCCGAGC TGCTCGACGG ATCATAGGGC TGGAGCTGGA CACTGAGGGT 1500
CACAGGCTTT TTGTGGCCTT TCCTGGATGC ATCGTCTACC TCTCTCTCAG CCGCTGTGCC 1560
CGGCATGGAG CATGTCAGAG GAGCTGCCTG GCTTCTCTGG ACCCATACTG TGGATGGCAT 1620
CGGTTCCGAG GCTGTGTGAA TATCAGGGGA CCTGGAGGGA CTGATGTGGA TCTGACTGGG 1680
AACCAGGAAT CCATGGAGCA TGGTGACTGC CAAGATGGAG CGACTGGGAG TCAGTCTGGC 1740 CCTGGAGATT CTGCCTATGG CGTGCGCAGG GACCTTTCCC CAGCCTCAGC CTCCCGATCC 1800 ATCCCCATCC CACTCCTCCT GGCCTGTGTG GCGGCGGCCT TCGCTTTGGG CGCCTCAGTC I860 TCCGGCCTCT TGGTGTCCTG TGCTTGTCGT CGCGCGAACC GCCGTCGGAG CAAGGACATC 1920 GAGACCCCGG GGCTGCCGCG CCCCCTCTCC CTTCGCAGTC TGGCGAGGCT GCACGGTGGC 1980 GGTCCTGAGC CCCCGCCTCC GCCCAAGGAT GGTGATGCAG CGCAAACGCC CCAGCTCTAC 2040 ACTACCTTCC TGCCTCCGCC CGAGGGCGGA TCCCCACCGG AGCTGGCCTG CCTGCCCACC 2100 CCGGAGACCA CGCCCGAGCT GCCGGTGAAG CACCTCCGTG CCTCCGGGGG TCCCTGGGAG 2160 TGGAACCAGA ACGGGAACAA CGCTTCGGAG GGCCCAGGCC GCCCACGGGG CTGCAGCGCG 2220 GCGGGCGGGC CCGCCCCGCG CGTGCTGGTG AGGCCACCGC CCCCTGGCTG CCCCGGGCAG 2280 GAGGTGGAGG TGACCACGCT GGAGGAACTG CTGCGCTACC TGCACGGCCC GCAGCCGCCC 2340 AGGAAGGGCA GCGAACCTCT CGCCTCCGCC CCGTTCACCT CCCGGCCGCC TGCCTCGGAG 2400 CCCGGCGCCG CCTTGTTCGT GGACTCCAGC CCGATGCCTC GTGATTGCGT GCCGCCGCTG 2460 AGGCTCGACG TACCGCCCGA CGGCAAGCGC GCGGCCCCGA GCGGGCGGCC TGCTCTCTCG 2520 GCCCCGGCTC CACGCCTGGG CGTCAGCGGC AGCCGAAGAT TGCCCTTCCC CACGCACCGG 2580 GCGCCCCCGG GCCTGCTCAC CCGAGTCCCC TCGGGAGGCC CGTCCAGGTA CTCCGGGGGG 2640 CCCGGGAGGC ACCTCCTGTA CCTGGGCCGG CCCGACGGCC ACCGCGGCCG CTCCCTGAAG 2700 AGGGTGGACG TGAAGTCTCC ACTGTCGCCC AAACCGCCCC TCGCCACACC GCCGCAGCCC 2760 GCCCCGCACG GCAGCCATTT TAACTTC 2787 配列番号： 3
配列の長さ： 929
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源 OH οει
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355 360 365
Arg Pro Gly Ser Cys Ala Gly Val Gly Ala Ala Ala Leu Phe Ser Ser
370 375 380
Ser Gin Asp Leu Pro Asp Asp Val Leu Leu Phe lie Lys Ala His Pro 385 390 395 400
Leu Leu Asp Pro Ala Val Pro Pro Ala Thr His Gin Pro Leu Leu Thr
405 410 415
Leu Thr Ser Arg Ala Leu Leu Thr Gin Val Ala Val Asp Gly Met Ala
420 425 430
Gly Pro His Arg Asn Thr Thr Val Leu Phe Leu Gly Ser Asn Asp Gly
435 440 445
Thr Val Leu Lys Val Leu Pro Pro Gly Gly Gin Ser Leu Gly Pro Glu
450 455 460
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485 490 495
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t9lC0/Z.6dT/XDd 9ΠΤΪ/86 OAV 配列番号： 4
配列の長さ ： 3432
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to niRNA ハイポセティカル配列： No アンチセンス： No
起源
生物名： ヒ卜 (Homo sapiens) 組織の種類：小児脳組織 配列の特徴
特徴を表す記号： 5' UTR 存在位置： 1. . 187
特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： CDS
存在位置： 188. . 2977
特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： 3' UTR 存在位置： 2978. . 3407
特徴を決定した方法： E 特徴を表す記号： olyA signal 存在位置： 3408. . 3432
特徴を決定した方法： E
配列
AAAACCACGG ATTGCGAACT CAGCGCAGCG CGTGGCCGCT GGCCGCCCGC GGCGATCTCG 60 ATCCCGCTGA CCCGAATCCT GGAGTCAGAG GTTTCCTATC CCCCTCAAGC CCCCACAGGA 120 GTCACCAACC CAGGGCCGGC TTATGGGTGA GGGGGCACCC CCTGGGGCCT GAGCTGCCCC 180
ACACAGGATG CCCCGTGCCC CCCACTTCAT GCCCTTGCTG CTACTGCTGC TGCTGCTCTC 240
ACTTCCCCAT ACTCAGGCCG CCTTTCCCCA GGACCCCCTC CCTCTGTTGA TCTCTGACCT 300
TCAAGGTACT TCCCCATTAT CCTGGTTTCG GGGCCTGGAG GATGATGCTG TGGCTGCAGA 360
ACTTGGGCTG GACTTTCAGA GATTCCTGAC CTTGAACCGG ACCTTGCTAG TGGCTGCCCG 420
GGATCACGTT TTCTCCTTCG ATCTTCAAGC CGAAGAAGAA GGGGAGGGGC TGGTGCCCAA 480
CAAGTATCTA ACATGGAGAA GCCAAGATGT GGAGAACTGT GCTGTACGGG GAAAGCTGAC 540
GGATGAGTGC TACAACTATA TTCGTGTTCT TGTTCCCTGG GACTCCCAGA CGCTCCTTGC 600
CTGTGGAACG AACTCATTCA GCCCTGTGTG CCGCAGCTAT GGGATAACTT CGCTGCAGCA 660
GGAGGGTGAG GAACTGAGTG GGCAGGCTCG ATGCCCCTTT GATGCCACCC AGTCCAACGT 720
GGCCATCTTT GCAGAGGGCA GCCTGTACTC AGCCACAGCT GCGGATTTCC AGGCCAGTGA 780
TGCTGTAGTT TACAGAAGCC TTGGGCCCCA GCCCCCACTC CGCTCCGCCA AGTATGACTC 840
CAAGTGGCTC CGAGAGCCAC ACTTTGTCCA GGCCTTGGAG CATGGAGACC ATGTCTACTT 900
CTTCTTCCGC GAGGTCTCTG TGGAGGATGC TCGGCTGGGG AAGGTGCAGT TCTCCCGCGT 960
AGCCCGAGTA TGTAAACGTG ACATGGGCGG CTCGCCTCGG GCCTTGGACC GCCACTGGAC 1020
ATCCTTCCTG AAGCTTCGGC TCAACTGCTC TGTCCCTGGG GACTCTACTT TCTATTTTGA 1080
TGTTTTACAG GCCTTGACTG GGCCTGTGAA CCTGCATGGC CGCTCTGCTC TCTTTGGGGT 1140
CTTCACCACC CAGACCAATA GCATCCCTGG CTCTGCCGTC TGCGCCTTCT ACCTGGATGA 1200
GATTGAGCGT GGGTTTGAGG GCAAGTTCAA GGAGCAGAGG AGTCTGGATG GGGCCTGGAC 1260
TCCTGTGTCT GAGGACAGAG TTCCCTCACC CAGGCCAGGA TCCTGTGCAG GAGTAGGGGG 1320 AGCTGCCTTG TTCTCCTCTT CCCGAGACCT CCCTGATGAT GTCCTGACCT TCATCAAGGC 1380 TCACCCGCTG CTGGACCCCG CTGTACCACC TGTCACCCAT CAGCCTCTAC TCACTCTCAC 1440 TAGCAGGGCC CTACTGACCC AAGTAGCTGT GGATGGCATG GCTGGTCCCC ACAGTAACAT 1500 CACAGTCATG TTCCTTGGCT CCAATGATGG GACAGTGCTG AAGGTGCTGA CCCCAGGTGG 1560 GCGATCCGGG GGACCTGAGC CCATCCTCCT GGAAGAGATT GATGCCTACA GCCCTGCCCG 1620 GTGCAGTGGG AAGCGGACAG CCCAAACAGC ACGACGGATC ATAGGGCTGG AGCTGGACAC 1680 TGAGGGTCAC AGGCTTTTTG TGGCTHTTC TGGCTGTATT GTCTACCTCC CTCTCAGCCG 1740 GTGTGCCCGG CATGGGGCCT GTCAGAGGAG CTGTTTGGCT TCTCAGGACC CATACTGTGG 1800 ATGGCATAGC TCCAGGGGCT GTGTGGATAT CAGGGGATCT GGTGGGACTG ATGTGGATCA 1860 GGCTGGGAAC CAGGAATCCA TGGAGCATGG TGACTGCCAA GATGGAGCTA CTGGGAGTCA 1920 GTCTGGCCCT GGGGATTCTG CTTATGGCGT GCGCCGGGAC CTGCCCCCAG CCTCGGCCTC 1980 CCGCTCCGTC CCCATCCCAC TCCTCCTGGC CAGTGTGGCC GCAGCTTTTG CCCTGGGCGC 2040 CTCAGTCTCT GGCCTCCTGG TCTCCTGTGC TTGTCGCCGC GCCCACCGAC GTCGGGGCAA 2100 GGACATCGAG ACTCCCGGGC TCCCGCGCCC TCTCTCCCTC CGCAGTTTGG CCCGGCTCCA 2160 CGGTGGGGGC CCAGAGCCCC CGCCGCCCTC CAAGGACGGG GACGCGGTGC AGACGCCGCA 2220 GCTCTACACC ACCTTCCTGC CGCCTCCGGA GGGCGTGCCC CCGCCGGAGC TGGCCTGCCT 2280 GCCCACCCCC GAGTCCACGC CGGAGCTGCC GGTCAAGCAC CTCCGCGCCG CCGGGGACCC 2340 CTGGGAGTGG AACCAGAACA GGAACAACGC CAAGGAGGGT CCGGGCCGCT CACGGGGCGG 2400 GCACGCGGCG GGCGGGCCCG CGCCCCGCGT GCTGGTGAGG CCACCGCCGC CCGGCTGTCC 2460 CGGGCAGGCC GTGGAAGTCA CCACCCTGGA GGAACTGCTG CGCTACCTGC ACGGCCCGCA 2520 GCCGCCCAGA AAGGGGGCCG AGCCCCCCGC CCCTTTAACC TCGCGGGCGC TCCCGCCGGA 2580 GCCCGCCCCC GCCCTCTTGG GCGGCCCCAG CCCCAGGCCC CACGAGTGCG CCTCGCCGCT 2640 GAGGCTGGAC GTGCCCCCCG AGGGCAGGTG CGCCTCTGCC CCCGCCCGGC CCGCGCTCTC 2700 CGCCCCCGCT CCCCGGCTGG GCGTCGGCGG AGGCCGGAGG TTGCCTTTCT CCGGCCACCG 2760 GGCCCCCCCT GCCCTGCTCA CTCGAGTCCC CTCGGGAGGT CCCTCCAGGT ACTCCGGGGG 2820 TCCCGGGAAG CACCTCCTGT ACCTGGGCCG GCCCGAGGGC TACCGGGGCC GCGCCCTGAA 2880
AAGGGTGGAC GTCGAGAAGC CCCAGTTGTC CCTGAAGCCT CCCCTCGTCG GGCCCTCCTC 2940
CCGCCAGGCC GTCCCGAACG GCGGCCGTTT CAACTTTTAA AGGGAGCGGT CCACGGCCTC 3000
CAGCGTGGGG AGCGCCCGAG TCCTCTCGGT CACGAGCTGG ACGCTCTTCA GGACGTTTCA 3060
CCGCCCCCTC GCCCCGCACC TCCAGCCTTC CCGACTCGCA GAGTCTCCCG AGGCCCCTTT 3120
TCGCCTCGGG TTTATTTATT GACTGTCTTT CCCCCTGTCC TCGACAGAAG AGTGGGAGGT 3180
GAGAAGCCCG TCTCCTCAGT GAGCCAGCAT TTCAGGGGGA GCTGGCGGAC TCCCACTCCC 3240
CGCTCCCTTC CAGCCAAGCT GCCTTAACTC GCCCCTCGGG GCTCCCCCAG AGACTGTGCC 3300
CCGGGCGGGC CGCGCGCGCT GTGTCCAGAG TCCTCGGGCC TCCTGGGTCT GGGACGTGCC 3360
TCTCCTACTG TGTAGGAGCC TCCGCTTCCC AATACAGCCG TGTCTGCAAA AAAAAAAAAA 3420
AAAAAAAAAA AA 3432
配列番号： 5
配列の長さ ： 2790
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列： No
ァンチセンス ： No
起源
生物名： ヒ 卜 (Homo sapiens)
組織の種類：小児脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1. . 2790
特徴を決定した方法： E
配列
ATGCCCCGTG CCCCCCACTT CATGCCCTTG CTGCTACTGC TGCTGCTGCT CTCACTTCCC 60 CATACTCAGG CCGCCTTTCC CCAGGACCCC CTCCCTCTGT TGATCTCTGA CCTTCAAGGT 120 ACTTCCCCAT TATCCTGGTT TCGGGGCCTG GAGGATGATG CTGTGGCTGC AGAACTTGGG 180 CTGGACTTTC AGAGATTCCT GACCTTGAAC CGGACCTTGC TAGTGGCTGC CCGGGATCAC 240 GTTTTCTCCT TCGATCTTCA AGCCGAAGAA GAAGGGGAGG GGCTGGTGCC CAACAAGTAT 300 CTAACATGGA GAAGCCAAGA TGTGGAGAAC TGTGCTGTAC GGGGAAAGCT GACGGATGAG 360 TGCTACAACT ATATTCGTGT TCTTGTTCCC TGGGACTCCC AGACGCTCCT TGCCTGTGGA 420 ACGAACTCAT TCAGCCCTGT GTGCCGCAGC TATGGGATAA CTTCGCTGCA GCAGGAGGGT 480 GAGGAACTGA GTGGGCAGGC TCGATGCCCC TTTGATGCCA CCCAGTCCAA CGTGGCCATC 540 <z=> =>
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配列の長さ ： 930
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
起源
生物名： ヒ 卜 (Homo sapiens)
組織の種類：小児脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号： peptide
存在位置： 1. . 930 特徴を決定した方法： P
配列
Met Pro Arg Ala Pro His Phe Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
5 10 15
Leu Ser Leu Pro His Thr Gin Ala Ala Phe Pro Gin Asp Pro Leu Pro
20 25 30
Leu Leu lie Ser Asp Leu Gin Gly Thr Ser Pro Leu Ser Trp Phe Arg
35 40 45
Gly Leu Glu Asp Asp Ala Val Ala Ala Glu Leu Gly Leu Asp Phe Gin
50 55 60
Arg Phe Leu Thr Leu Asn Arg Thr Leu Leu Val Ala Ala Arg Asp His 65 70 75 80
Val Phe Ser Phe Asp Leu Gin Ala Glu Glu Glu Gly Glu Gly Leu Val
85 90 95
Pro Asn Lys Tyr Leu Thr Trp Arg Ser Gin Asp Val Glu Asn Cys Ala
100 105 110
Val Arg Gly Lys Leu Thr Asp Glu Cys Tyr Asn Tyr lie Arg Val Leu
115 120 125
Val Pro Trp Asp Ser Gin Thr Leu Leu Ala Cys Gly Thr Asn Ser Phe
130 135 140
Ser Pro Val Cys Arg Ser Tyr Gly lie Thr Ser Leu Gin Gin Glu Gly 145 150 155 160
Glu Glu Leu Ser Gly Gin Ala Arg Cys Pro Phe Asp Ala Thr Gin Ser
165 170 175
Asn Val Ala lie Phe Ala Glu Gly Ser Leu Tyr Ser Ala Thr Ala Ala i9
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Leu Leu Asp Pro Ala Val Pro Pro Val Thr His Gin Pro Leu Leu Thr
405 410 415
Leu Thr Ser Arg Ala Leu Leu Thr Gin Val Ala Val Asp Gly Met Ala
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Pro lie Leu Leu Glu Glu lie Asp Ala Tyr Ser Pro Ala Arg Cys Ser 465 470 475 480
Gly Lys Arg Thr Ala Gin Thr Ala Arg Arg lie lie Gly Leu Glu Leu
485 490 495
Asp Thr Glu Gly His Arg Leu Phe Val Ala Phe Ser Gly Cys lie Val
500 505 510
Tyr Leu Pro Leu Ser Arg Cys Ala Arg His Gly Ala Cys Gin Arg Ser
515 520 525
Cys Leu Ala Ser Gin Asp Pro Tyr Cys Gly Trp His Ser Ser Arg Gly
530 535 540
Cys Val Asp lie Arg Gly Ser Gly Gly Thr Asp Val Asp Gin Ala Gly 545 550 555 560
Asn Gin Glu Ser Met Glu His Gly Asp Cys Gin Asp Gly Ala Thr Gly
565 570 575
Ser Gin Ser Gly Pro Gly Asp Ser Ala Tyr Gly Val Arg Arg Asp Leu 08i
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Z.9I€0/Z.6«If/XDd 91111/86 OAV トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列： No
ァンチセンス ： No
起源
生物名： ヒ 卜 (Homo sapiens)
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1. . 170
特徴を決定した方法： E
配列
TGGCTGTATT GTCTACCTCC CTCTCAGCCG GTGTGCCCGG CATGGGGCCT GTCAGAGGAG 60 CTGTTTGGCT TCTCAGGACC CATACTGTGG ATGGCATAGC TCCAGGGGCT GTGTGGATAT 120 CAGGGGATCT GGTGGGACTG ATGTGGATCA GGCTNGGAAC CAGGAATCCA 170 配列番号： 8
配列の長さ ： 18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DM
ハイポセティカル配列： No
アンチセンス ： No
配列の特徴 特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1. . 18
特徴を決定した方法： P
配列
TGGCTGTATT GTCTACCT 18 配列番号： 9
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
ハイポセティカル配列： No
アンチセンス ： Yes
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1. . 20
特徴を決定した方法： P
配列
TGGATTCCTG GTTCCNAGCC 20 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
ハイポセティカル配列： No
ァンチセンス ： No
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1. . 18
特徴を決定した方法： E
配列
TGTGTAAACG TGACATGG 18 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
ハイポセティカル配列： No
アンチセンス ： Yes
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 1. . 18
特徴を決定した方法： E
配列
TGCTAGTCAG AGTGAGGA 18

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の （a) 又は （b) のタンパク質をコードする遺伝子：
(a) 配列番号： 3又は配列番号： 6に記載のアミノ酸配列からなるセマ フオ リ ン Yタンパク質
(b)配列番号： 3又は配列番号： 6に記載のアミノ酸配列のうち 1若し くは複数のァミノ酸が欠失、 置換及び/又は付加されたァミノ酸配列から なり、 かつ神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質。
2. 以下の （a) 又は （b) の DNAからなる遺伝子：
(a) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 4又は配列番号： 5に記 載の塩基配列からなるセマフォリン YDNA
(b)配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 4又は配列番号： 5に記 載の塩基配列からなる DN Aとストリンジヱン卜な条件下でハイプリダイ ズし、 かつ神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードする DNA。
3. 配列番号： 7に記載の塩基配列からなる DN Aとストリ ンジヱン ト な条件下でハイプリダイズし、 かつセマフォリンドメィンを有するタンパ ク質をコードする DN Aからなる遺伝子。
4. 請求項 1〜請求項 3のいずれか記載の遺伝子を発現することによつ て得られるタンパク質。
5. 配列番号： 3又は配列番号： 6に記載のタンパク質において 1若し くは複数のァミノ酸が欠失、 置換及び Z又は付加されたァミノ酸配列から なり、 かつ神経の伸長に対して促進的に作用するタンパク質をコードする DN Aからなる遺伝子。
6. 請求項 5記載の遺伝子を発現することによって得られるタンパク質 c
7. ヒ 卜 c DNAライブラリ一又はヒ トゲノムライブラリ一からクロ一 ニングされる DNAであって、 配列番号： 1又は配列番号： 4記載の塩基 配列からなる D N Aの少なくとも一部からなる DNAとス トリンジ ント な条件下でハイブリダイズする D N A。
8. 請求項 1〜請求項 3又は請求項 5記載の遺伝子、 あるいは請求項 7 記載の DN Aのいずれかを発現する発現プラスミ ド。
9. 請求項 8記載の発現プラスミ ドによって形質転換された形質転換体。
10. 請求項 9記載の形質転換体を培養し、 発現される組換えタンパク 質を回収することからなる、 組換えタンパク質の生産方法。
11. 請求項 4又は請求項 6記載のタンパク質の、 少なくとも 6アミノ 酸以上の部分よりなるぺプチド。
12. 神経の伸長に対して促進的に作用する、 請求項 11記載のぺプチ
13. 配列番号： 6に記載のアミノ酸配列の第 198位のァスパラギン 酸、 あるいは該ァスパラギン酸の位置に相当するァミノ酸を含有すること を特徴とする、 請求項 11記載のぺプチド。
14. 請求項 1〜請求項 3のいずれか記載の遣伝子、 あるいは請求項 7 記載の DNAの、 少なくとも 8塩基以上の部分に対応するアンチセンスヌ クレオチド、 あるいはその化学的修飾体。
15. 請求項 4記載のタンパク質の発現を抑制することを特徴とする、 請求項 14記載のアンチセンスヌクレオチド、 あるいはその化学的修飾体。
16. 請求項 4又は請求項 6記載のタンパク質、 あるいは請求項 11〜 13いずれか記載のぺプチドに対する抗体。
17. 請求項 1〜請求項 3又は請求項 5記載の遺伝子、 請求項 7記載の DNA、 請求項 4又は請求項 6記載のタンパク質、 請求項 11〜13記載 のべプチド、 請求項 1 4又は請求項 1 5記載のアンチセンスヌクレオチド 又はその化学的修飾体、 あるいは請求項 1 6記載の抗体の、 いずれかを有 効成分として含有する医薬。
1 8. 請求項 4記載のタンパク質を用いることを特徴とする、 セマフォ リ ン Yアンタゴニストのスク リ一二ング方法。
1 9. 請求項 1 8記載のスクリーニング方法を用いて得られる、 セマフォ リ ン Yアンタゴニス ト。
2 0. 請求項 6記載のタンパク質、 請求項 1 1〜請求項 1 3いずれか記 載のペプチド、 又は請求項 1 6記載の抗体よりなる、 請求項 1 9記載のセ マフォリン Yアンタゴニス ト。
2 1 . 請求項 1 4又は請求項 1 5記載のアンチセンスヌクレオチドある いはその化学的修飾体、 請求項 1 9又は請求項 2 0記載のセマフォリン Y アンタゴニス トの、 少なくとも一つを含有することを特徴とする、 中枢神 経の再生促進剤。
2 2. 請求項 4記載のタンパク質の少なくとも一つを含有することを特 徵とする、 末梢神経の伸長抑制剤。
2 3. 請求項 1〜請求項 3又は請求項 5記載の遺伝子、 あるいは請求項 7記載の D N Aのいずれかを人為的に染色体中に挿入したか、 あるいはい ずれかをノックアウトさせたトランスジヱニック動物。
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