DE60130769T2

DE60130769T2 - Förderer der nervenregeneration die als aktiven bestandteil einen semaphorinhemmer enthalten

Info

Publication number: DE60130769T2
Application number: DE60130769T
Authority: DE
Inventors: Toru Kusatsu-shi KIMURA; Kaoru Takarazuka-shi KIKUCHI; Kazuo Sanda-shi KUMAGAI; Norio Nishinomiya-shi HOSOTANI; Akiyoshi Suita-shi KISHINO
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2001-07-27
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2021-07-28
Also published as: DE60130769D1; JPWO2002009756A1; AU2001276694A1; US7244761B2; EP1306093A4; EP1306093B1; US20030166711A1; ES2294014T3; WO2002009756A1; EP1306093A1; JP4975231B2; US20070015820A1; US7317038B2; ATE374623T1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel zur Förderung der Regeneration zentraler oder peripherer Nerven, die Semaphorin-Inhibitor als einen Wirkstoff enthalten, prophylaktische Mittel und Heilmittel für neurodegenerative Erkrankungen oder dergleichen, die die Mittel zur Förderung der Nervenregeneration enthalten, Nicht-Peptid- und Nicht-Nukleotid-Inhibitoren von Semaphorin, Verbindungen mit Semaphorin-inhibierender Aktivität und ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen oder dergleichen.
Technischer Hintergrund
Nervenzellen sind spezielle Gewebe, die bei einem Adulten kein mitotisches Potential besitzen. Daher wird, wenn sie einmal verletzt sind, der Schaden über eine lange Zeitspanne anhalten. Es wird gesagt, dass es kein regeneratives Potential insbesondere im Zentralnervensystem (ZNS), wie etwa Gehirn und Rückenmark, gibt. Das Fehlen des regenerativen Potentials im Zentralnervensystem kann als einer der Gründe dafür betrachtet werden, dass es weder etablierte Therapien für traumatische Verletzungen, wie etwa Rückenmarksverletzung, noch für neurodegenerative Erkrankungen, wie etwa Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, gibt. Auf der anderen Seite besitzen periphere Nerven Regenerationspotential. Ihre Axone können regenerieren, und ihre Funktionen können wiederhergestellt werden, selbst nach Durchtrennung. In diesem Fall jedoch erfordert die Wiederherstellung eine lange Zeitspanne, die von mehreren Monaten bis sogar zu mehr als einem Jahr reicht, und somit müssen die Patienten beträchtliche Leiden durchmachen. Darüber hinaus ist die Erholungsphase so lang, dass einige Nervenzellen während dieser Zeitspanne sterben können, was oft zu einem Versagen bei der Wiederherstellung der Funktionen führt. Und dennoch, auch wenn die peripheren Nerven Regenerationspotential besitzen, so sind sie vollständig unfähig, in das ZNS, wie etwa das Gehirn und Rückenmark, auszuwachsen. Dies erbringt die Basis für die Hypothese, dass es einige Substanzen im Zentralnervensystem gibt, die das Nervenauswachsen inhibieren. Wenn die inhibitorischen Substanzen im Bezug auf die Nervenregeneration im Zentralnervensystem unter Verwendung von Antikörpern oder dergleichen unterdrückt werden, so wird die Nervenregeneration im ZNS und ebenso die Wiederherstellung ihrer Funktionen beobachtet werden, wenn auch nur teilweise. Als eine dieser inhibitorischen Substanzen im Bezug auf die Regeneration des Zentralnervensystems ist jüngst Nogo entdeckt worden (Nature 403, 434, 2000; Nature 403, 439, 2000). Jedoch wird nur ein kleiner Anteil der Axone durch die Inhibition von Nogo regeneriert, und es wird daher angenommen, dass einige weitere Regenerations-hemmende Substanzen existieren. Die folgenden sind bei spielhaft angegeben als Kandidatensubstanzen, die die Nervenregeneration inhibieren: MAG (Myelin-assoziiertes Glykoprotein), Tenascin, Ganglioside, Ephrin, Netrin, Slit, Semaphorine und dergleichen. Der einzige Grund dafür, dass diese Substanzen beispielhaft als Kandidatensubstanzen genannt werden, besteht darin, dass sie das Neuritenauswachsen in vitro inhibieren. Ob sie tatsächlich so wirken, dass sie die Nervenregeneration in vivo inhibieren, ist bislang noch nicht ermittelt worden.
Was Semaphorin betrifft, so wurde dessen Gen zuerst als ein Faktor isoliert, der an der Ausbildung des Nervensystems bei Heuschrecken in der Entwicklung beteiligt ist. Seit diesem Zeitpunkt ist berichtet worden, dass Semaphorine eine große Genfamilie darstellen, die sich auf Nematoden, Fische, Säuger oder sogar bestimmte Arten von Viren verteilt, und derzeit werden Semaphoringene auf Basis ihrer Strukturen in acht Gensubfamilien oder Klassen klassifiziert (Cell 97, 551, 1999). Semaphorin ist ein endogenes Protein, das identifiziert wurde als ein Faktor, der das Kollabieren des Nervenwachstumskegels bewirkt und das Axon-Auswachsen unterdrückt, und bislang sind etwa 20 molekulare Spezies beschrieben worden (Cell 97, 551, 1999). Jedoch sind die meisten Funktionen vieler Semaphorinfamilien noch nicht im Detail entdeckt worden. Die am besten untersuchte Gengruppe ist die einer Subfamilie, die als Klasse III-Typ bezeichnet wird, bei dem sämtliche Translationsprodukte sekretorische Proteine sind. Obwohl für Proteine, die von diesen Genen codiert werden, bekannt ist, dass sie in vitro eine intensive, das Auswachsen von Neuriten unterdrückende Aktivität sowie Aktivität im Hinblick auf das Kollabieren des Wachstumskegels besitzen, wurde auch berichtet, dass sie das Neuritenauswachsen unter bestimmten Bedingungen induzieren. Unter diesen ist Semaphorin 3A (Sema3A) das am besten untersuchte, und es ist bekannt, dass es das Kollabieren des Wachstumskegels der kultivierten Nervenzellen bei einer Konzentration von nur 10 pM in einer kurzen Zeitspanne induziert (Cell 75, 217, 1993; Cell 75, 1389, 1993). Um die in vivo-Funktionen der Semaphorine zu analysieren, sind Knock-out-Mäuse für Neuropilin-1, das eine der Komponenten des Sema3A-Rezeptors ist, untersucht worden (Neuron 19, 995, 1997). Die besagten Knock-out-Mäuse zeigen embryonale Letalität ebenso wie Motorabnormität bei einigen nervlichen Systemen, wie etwa dem Trigeminalnerv und Angiogeneseabnormität. Obwohl ähnliche Motorabnormität in nervlichen Systemen bei Sema3A-Knock-out-Mäusen beobachtet wird, wird für einzelne Mäuse berichtet, dass sie ohne schwere Probleme bis zu erwachsenen Tieren aufwachsen. Daher bleiben die In vivo-Funktionen von Sema3A weitgehend unbekannt.
Darüber hinaus ist im Hinblick auf Semaphorine auch das folgende bekannt: Antisense-Nukleotide und Antagonisten, wie etwa Antikörper oder dergleichen, für Semaphorin W, Semaphorin Y und Semaphorin Z, werden für fördernde Mittel der Zentralnerven-Regeneration hergestellt ( WO 98/15628 , WO 98/11216 , WO98/20928 ); ebenso ist ein Verfahren bekannt, das Neuritenauswachsen zu induzieren, indem man eine Nervenzelle mit einem Antikörper in Kontakt bringt, der spezifisch an humanes Collapsin bindet ( US-Patent Nr. 5,416,197 ). Jedoch sind die In-vivo-Wirkungen dieser Antikörper oder dergleichen noch immer unbekannt. Darüber hinaus sind außer Peptiden oder Nukleotiden, wie etwa einem Antikörper oder einem Antisense-Nukleotid oder dergleichen, die spezifisch Semaphorin inhibieren, keinerlei entsprechende niedermolekulare Verbindungen bekannt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung von Semaphorin-Inhibitoren und von die Regeneration peripherer oder zentraler Nerven fördernden Mitteln, die diese Semaphorin-Inhibitoren als Wirkstoff enthalten, von prophylaktischen Mitteln und Heilmitteln für neuropathische Erkrankungen und neurodegenerative Erkrankungen, die die fördernden Mittel für die Nervenregeneration enthalten.
Offenbarung der Erfindung
Man nimmt an, dass Semaphorine verschiedene Wirkungen haben, und einige Forscher postulierten, dass Semaphorine nicht nur an der Nervenentwicklung, sondern auch an der Nervenregeneration beteiligt sind, obwohl es nur geringe Anhaltspunkte dafür gab. Weiterhin dient ein gendefizientes Tier nicht immer als Werkzeug zur Bewertung der Funktion eines Gens, da der Verlust der Genfunktion oft eine kompensatorische Wirkung durch andere Gene induziert, wie bei MAG-Knock-out-Tieren beobachtet. Obwohl als Ergebnis einer Reihe von Studien jahrelang für MAG angenommen wurde, dass es eine der inhibitorischen Substanzen der Nervenregeneration ist, zeigten MAG-Knock-out-Mäuse keine Förderung der Nervenregeneration. Die vorliegenden Erfinder begannen daher die Studie über Semaphorin, um zu untersuchen, ob die Inhibition von Semaphorin eine In vivo-Nervenregeneration bewirkt, ohne Semaphorin-Knock-out-Tiere zu verwenden.
Zunächst wurde ein Screen im Hinblick eine Substanz hin durchgeführt, die die Semaphorin-Aktivität in vitro vollständig inhibiert, und der so gescreente Semaphorin-Inhibitor wurde bei einem Tiermodell der Nervenregeneration verabreicht, um die die Nervenregeneration in vivo fördernde Aktivität dieses Semaphorin-Inhibitors zu klären. Als ein Ergebnis dieser Studie haben die vorliegenden Erfinder eine Substanz gefunden, die nicht nur die den Wachstumskegel zum Einsturz bringende Aktivität von Semaphorin vollständig inhibiert, sondern außerdem in anhaltender Weise die Semaphorin-Aktivität in einem Collagengel inhibiert, das Neuritenauswachsen in Gegenwart von Semaphorin unterstützt und fördernde Aktivität bei der Nervenregeneration in vivo zeigt. Die vorliegenden Erfinder haben ferner herausgefunden, dass die Nervenregeneration nicht nur im peripheren Nervensystem, sondern auch im ZNS gefördert wurde, wenn man den Semaphorin-Inhibitor verwendete. Die Studie deckte nicht nur die In vivo-Wirkung von Semaphorin auf, sondern machte es auch möglich, ein die Nervenregeneration förderndes Mittel bereitzustellen, das einen Semaphorin-Inhibitor enthält, der als Wirkstoff vollständig unentdeckt war, sowie ein Medikament, das das die Nervenregeneration fördernde Mittel enthält. Die Studie hat außerdem aufgedeckt, dass eine Verbindung mit einer spezifischen Struktur in dem Molekül, das in der Kultur von Penicillium sp. SPF-3059 entdeckt wurde, die von den vorliegenden Erfindern durchgescreent wurde, Semaphorin-inhibierende Aktivität zeigt. Die vorliegende Erfindung erfolgte auf Basis dieser Entdeckungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung, repräsentiert durch Formel [8], oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration in einem Patienten zu fördern, der diese benötigt,
wobei R⁴ ein Wasserstoffatom, eine Carboxylgruppe oder eine Alkoxycarbonylgruppe repräsentiert und R⁵ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Acyloxygruppe repräsentiert und R⁶ und R⁷ entweder durch (1) oder (2) unten repräsentiert werden:

(1) R⁶ repräsentiert eine Methylgruppe und R⁷ repräsentiert eine Gruppe, wie sie durch die Formeln [2], [9] oder [10] gezeigt ist,
wobei R¹ ein Wasserstoffatom, eine Carboxylgruppe oder eine Alkyloxycarbonylgruppe repräsentiert und R² ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Acyloxygruppe repräsentiert und R³ ein Wasserstoffatom, eine Methoxymethylgruppe oder Formel [3] repräsentiert
wobei R¹ und R² die gleiche Bedeutung haben wie in Formel [2],
wobei R¹ und R² die gleiche Bedeutung haben wie in Formel [2],
(2) R⁶ repräsentiert eine Gruppe, wie sie durch Formel [5] oder [11] gezeigt ist, und R⁷ repräsentiert eine Acetylgruppe,
wobei R¹ und R² die gleiche Bedeutung haben wie in Formel [2].

Es sind ähnliche Verbindungen wie die oben beschriebenen bekannt. Beispielsweise betrifft die EP-A-0537622 die Verbindung Xanthofulvin, von der gesagt wird, dass sie Antipilz-Eigenschaften besitzt.
Die WO-A-92/16517 und Wrigley et al, Pure & Applied Chemistry, 66(10/11), 2383–2386 (1994) beziehen sich beide auf Xanthonderivate, die CD4-bindende Mittel und Inhibitoren der Enzyme Proteinkinase C (PKC) und Collagenase sind. Diese Verbindungen werden als nützlich bei der Behandlung von Autoimmunerkrankung, Graft-versus-Host-Erkrankung, Organabstoßung, rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematodes, Diabetes mellitus, Multipler Sklerose, primärer Gallenzirrhose, allergischen Erkrankungen, entzündlichen Erkrankungen und HIV bezeichnet.
Aoki et al, Tetrahedron Letters, 32(36), 4737–4740 (1991) bezieht sich auf den Phospholipase-C-Inhibitor Vinaxanthon, der von Penicillium vinaceum produziert wird.
Jedoch legt keines der obigen Dokumente nahe, dass die von diesen beschrieben Verbindungen nützlich als Semaphorin-Inhibitoren sein könnten oder verwendet werden könnten, um die Nervenregeneration zu unterstützen.
Demgegenüber lehrt Yoshio Goshima et al, Jpn. J. Pharmacol., 82, 273–279, (2000), dass Semaphorine, wie etwa sema 3A, als potente abweisende Moleküle, die das Neuritenauswachsen inhibieren oder zurückdrängen, erkannt werden, und dass die Inhibition der abweisenden Aktivität die Regeneration von ZNS-Neuronen verstärken kann, erwähnen jedoch keinerlei Verbindungen, die für diesen Zweck verwendet werden könnten.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung einer Verbindung, repräsentiert durch Formel [12], oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration in einem Patienten zu fördern, der diese benötigt (Anspruch 2).
wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8].
Für den Zweck dieser Verwendung ist es bevorzugt, dass in Formel [12]:
wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 3);
R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 4);
sowohl R² als auch R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren (Anspruch 5);
R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert (Anspruch 6);
R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 7).
Zusätzlich betrifft die Erfindung eine Verbindung, repräsentiert durch Formel [12],
wobei wenigstens einer von R¹, R², R⁴ und R⁵ durch ein Wasserstoffatom repräsentiert wird, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon (Anspruch 8).
Weiterhin ist es bei der Verbindung der allgemeinen Formel [12] bevorzugt, dass wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 9);
R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 10);
sowohl R² als auch R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren (Anspruch 11);
R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert (Anspruch 12);
R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 13).
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Verbindung, repräsentiert durch Formel [13], oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon,
wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8], für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration in einem Patienten zu fördern, der diese benötigt (Anspruch 14).
Für die Zwecke dieser Verwendung ist es bevorzugt, dass bei der Verbindung der Formel [13]:
wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 15);
R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 16);
sowohl R² als auch R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren (Anspruch 17);
R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert (Anspruch 18);
R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, R¹ eine Carboxylgruppe repräsentiert und R⁴ ein Wasserstoffatom repräsentiert (Anspruch 19);
R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 20).
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Verbindung, repräsentiert durch Formel [13]:
wobei wenigstens einer von R¹, R² und R⁵ ein Wasserstoffatom repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon (Anspruch 21).
Bei der Verbindung der Formel [13] ist es bevorzugt, dass wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 22);
R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 23);
sowohl R² als auch R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren (Anspruch 24);
R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert (Anspruch 25);
R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert (Anspruch 26);
R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 27).
Die Erfindung stellt außerdem eine Verbindung bereit, repräsentiert durch Formel [14], oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon,
wobei R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8] (Anspruch 28).
Bei der Verbindung der Formel [14] ist es bevorzugt so, dass:
wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 29);
R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 30);
sowohl R² als auch R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren (Anspruch 31);
R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert (Anspruch 32);
R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren (Anspruch 33);
R¹ eine Carboxylgruppe repräsentiert, R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren und R³ eine Methoxymethylgruppe repräsentiert (Anspruch 34);
R¹ eine Carboxylgruppe oder eine Methoxycarbonylgruppe repräsentiert, R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, R³ ein Wasserstoffatom repräsentiert und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 35);
R¹ eine Carboxylgruppe oder eine Methoxycarbonylgruppe repräsentiert, R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, R² und R³ ein Wasserstoffatom repräsentieren und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 36);
R³ durch eine Gruppe der Formel [3] repräsentiert wird (Anspruch 37).
Die Verbindung betrifft weiterhin eine Verbindung der Formel [14] wie oben beschrieben oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration in einem Patienten zu fördern, der diese benötigt (Anspruch 38).
Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung bereit, repräsentiert durch Formel [15], oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon:
wobei R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in Formel [8] (Anspruch 39).
In der Verbindung von Formel [15] ist es so, dass:
R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert (Anspruch 40);
R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert (Anspruch 41);
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung einer Verbindung der Formel [15], wie oben definiert, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration in einem Patienten zu fördern, der diese benötigt (Anspruch 42).
Die Erfindung betrifft in einem anderen Aspekt eine Verbindung, repräsentiert durch Formel [16], oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon:
wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8] (Anspruch 43).
Bei der Verbindung der Formel [16] ist es bevorzugt, dass:
wenigstens einer von R² und R⁵ ein Wasserstoffatom repräsentiert (Anspruch 44);
R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren (Anspruch 45);
R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert (Anspruch 46).
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel [16] oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration bei einem Patienten zu fördern, der diese benötigt (Anspruch 47).
Die Erfindung betrifft außerdem die oben dargestellte Verwendung, wobei das Medikament zur Behandlung oder Prävention von neuropathischen Erkrankungen und/oder neurodegenerativen Erkrankungen bestimmt ist (Anspruch 48).
Die neuropathischen Erkrankungen und/oder die neurodegenerativen Erkrankungen können mit einer Verletzung des Spinalnervs und/oder einer Verletzung eines peripheren Nervs einhergehen (Anspruch 49).
Die neuropathischen Erkrankungen und/oder neurodegenerativen Erkrankungen können beispielsweise olfaktorische Abnormitäten, traumatische Neuropathie, Hirninfarkt-Neuropathie, Lähmung des Gesichtsnervs, diabetische Neuropathie, Glaukom, Retinitis pigmentosa, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, neurodegenerative Erkrankungen, muskuläre hypoplastische Lateralsklerose, Lou-Gehrig'sche Krankheit, Chorea Huntington, Hirninfarkt oder traumatische neurodegenerative Erkrankungen sein (Anspruch 50).
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel [12], [13], [14], [15] oder [16], wobei das Verfahren umfasst, dass man einen Pilz kultiviert, welcher eine Verbindung der Formel [12], [13], [14], [15] oder [16] produziert und zur Gattung Penicillium gehört, und diese Verbindung aus der Kultur gewinnt (Ansprüche 51–57).
Der zur Gattung Penicillium gehörende Pilz ist bevorzugt Penicillium sp. SPF-3059 (Anspruch 58).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die konzentrationsabhängige inhibitorische Wirkung der Semaphorin-Inhibitoren SPF-3059-1, M162 und A721 der vorliegenden Erfindung auf die den Zusammenbruch des Wachstumskegels bewirkende Aktivität von Sema3A.
2 zeigt die konzentrationsabhängige inhibitorische Wirkung der Semaphorin-Inhibitoren SPF-3059-1, SPF-3059-2 und SPF-3059-5 der vorliegenden Erfindung auf die den Zusammenbruch des Wachstumskegels bewirkende Aktivität von Sema3A.
3 zeigt die konzentrationsabhängige inhibitorische Wirkung des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 der vorliegenden Erfindung auf die den Zusammenbruch des Wachstumskegels bewirkende Aktivität von Sema6C.
4 stellt Photographien dar, die die inhibitorische Wirkung der Semaphorin-Inhibitoren SPF-3059-1, M162 und A721 der vorliegenden Erfindung auf die das Neuritenauswachsen inhibierende Aktivität von Sema3A im Verfahren der Collagen-Gel-Co-Kultur zeigen.
5 zeigt die fördernde Wirkung des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 der vorliegenden Erfindung auf die in vivo erfolgende Nervenregeneration bei einem Einschnitt in den Riechnerv.
6 zeigt die fördernde Wirkung der Semaphorin-Inhibitoren M162 und A721 der vorliegenden Erfindung auf die in vivo erfolgende Nervenregeneration bei einem Einschnitt in den Riechnerv.
7 zeigt die die Nervenregeneration fördernde Wirkung des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 der vorliegenden Erfindung bei der Verwundung des Ischiasnervs.
8 zeigt das Ergebnis der Untersuchung des Einflusses des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 der vorliegenden Erfindung auf die Proliferation von COS7-Zellen.
9 zeigt das Ergebnis der Untersuchung des Einflusses des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 der vorliegenden Erfindung auf die Semaphorin-3A-Rezeptor-(Neuropilin-1)-Bindung.
10 zeigt das Ergebnis der Untersuchung, ob das Zielmolekül des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 der vorliegenden Erfindung Semaphorin 3A ist.
11 stellt Photographien dar, die die Ergebnisse der Untersuchung der fördernden Wirkung des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 der vorliegenden Erfindung auf die in vivo erfolgende Nervenregeneration beim Einschnitt in den Spinalnerv (Cerebralkortex-Rückenmarksstrang) zeigen.
12 stellt Photographien dar, die die Ergebnisse der Untersuchung der fördernden Wirkung von PBS als einer Kontrolle auf die in vivo erfolgende Nervenregeneration beim Einschnitt in den Spinalnerv (Cerebralkortex-Rückenmarksstrang) zeigen.
Beste Weise zur Durchführung der Erfindung
Es gibt keine spezielle Einschränkung im Hinblick auf ein förderndes Mittel der Nervenregeneration der vorliegenden Erfindung, solange das fördernde Mittel einen Inhibitor für einen das Nervenauswachsen zurückdrängenden Faktor wie etwa Semaphorin oder dergleichen als einen Wirkstoff enthält.
Hier ist „Semaphorin" eine allgemeine Bezeichnung für Proteine, die Semaphorin-Domänen mit ähnlichen Strukturen besitzen, die aus etwa 500 Aminosäureresten bestehen (Neuron 14, 941–948, 1995), und es sind etwa 20 Varianten oder mehr bis heute beschrieben worden. Bei der vorliegenden Erfindung jedoch, sind die Semaphorine nicht auf diese öffentlich bekannten beschränkt. Die folgenden können als solche Semaphorine beispielhaft benannt werden: Semaphorine von Säugern, wie etwa Mensch etc., bevorzugt Semaphorine der Klassen 3, 4, 5 oder 6, wie in der Literatur definiert (Cell 97, 551, 1999), bevorzugter Semaphorine der Klasse 3 oder 6, und am bevorzugtesten Semaphorin 3A (Cell 75, 217, 1993; Cell 75, 1389, 1993) bei den Semaphorinen von Klasse 3, und Semaphorin 6C ( WO98/11216 , Moll. Cell. Neurosci. 13, 9–23 (1999)) bei den Semaphorinen von Klasse 6. Da Sequenzinformationen im Hinblick auf Gene, die für diese Semaphorine codieren, in der Datenbank Genbank, der vorstehend genannten Literatur und dergleichen offenbart sind, kann cDNA, die für Semaphorin codiert, gemäß dieser Sequenzinformation kloniert werden, dies unter Verwendung beispielsweise einer vom Gehirn abgeleiteten cDNA-Bibliothek oder dergleichen, mit einem geeigneten DNA-Stück als Sonde zur Hybridisierung oder als einem Primer für die PCR. Fachleute auf dem Gebiet können diese Klonierung leicht anhand grundlegender Protokolle, wie etwa Molecular Cloning 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), etc. durchführen. Darüber hinaus kann die Herstellung von Proteinen gemäß verschiedenen Lehrbüchern und unterschiedlicher Literatur, wie etwa dem zuvor genannten „Molecular Cloning" oder dergleichen erfolgen, indem man ein Gen exprimiert, das für das so erhaltene Semaphorin codiert. Weiterhin ist das Semaphorin der vorliegenden Erfindung nicht allein auf ein natürliches oder ein rekombinantes Protein beschränkt, sondern beinhaltet außerdem: ein Protein, bei dem die extrazelluläre Domäne eines membrangebundenen Semaphorins exprimiert und solubilisiert wird, ein Fusionsprotein mit einem anderen Protein, wie etwa einem Antikörper, alkalischer Phosphatase oder dergleichen; ein Protein, an das ein Tag, wie etwa ein His-Tag, Flag oder dergleichen angefügt wird, oder eine Mutante, bei der ein Teil der Aminosäuren deletiert, ersetzt oder hinzugefügt wird.
So ist beispielsweise Semaphorin 6C (Sema6C) ein Membran-gebundenes Protein, und die extrazelluläre Domäne von Sema6C wird für gewöhnlich so verwendet, um die Aktivität einer Test-Substanz unter Nutzung fördernder oder hemmender Wirkungen auf die Aktivitäten von Sema6C zu messen. Es sind zwei Isoformen bei der extrazellulären Domäne von Sema6C bekannt ( WO98/11216 und Moll. Cell. Neurosci. 13, 9–23 (1999)), von denen jede die Aktivität besitzt, den Wachstumskegel zum Einsturz zu bringen. Ein Fusionsprotein, in dem die extrazelluläre Domäne von Sema6C und ein Markerprotein und/oder ein Peptid-Tag verbunden sind, kann vorteilhafter Weise für solche Fälle verwendet werden, um die Aktivität einer Test-Substanz zu messen, solange die Aktivität von Sema6C nicht beeinträchtigt wird. Beispiele von Markerproteinen sind konventionell wohlbekannte Markerproteine, wie etwa alkalische Phosphatase (Cell 63, 185–194 (1990)), die Fc-Region eines Antikörpers (Genbank Zugangsnummer M87789), HRP und dergleichen, und Peptid-Tags, beispielhaft vertreten durch das konventionelle und wohlbekannte Mic-Tag, His-Tag, Flag-Tag und dergleichen.
Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet ein Semaphorin-Inhibitor eine Substanz, die eine Aktivität eines der vorstehend genannten Semaphorine hemmt, wie z. B. eine Aktivität im Bezug auf die Wanderungsaktivität einer Zelle, die Zelltod-induzierende Aktivität, morphologische Veränderungen einer Zelle, wie etwa Zellabrundung oder den Zusammenbruch des Wachstumskegels, die Unterdrückung oder Förderung der Aktivität des Neuritenauswachsens, die Unterdrückung oder Förderung der Aktivität des Dendritenauswachsens von Nervenzellen, die Aktivität der Nervenaxon-Führung oder dergleichen. Jedwede Substanz, die die zuvor genannten Semaphorin-Aktivitäten hemmt, kann ohne eine spezielle Einschränkung als ein solcher Semaphorin- Inhibitor angenommen werden. Bevorzugt werden als Beispiele Verbindungen mit fördernder Wirkung auf die Regeneration zentraler und/oder peripherer Nerven benannt, bevorzugter eine Verbindung mit unterdrückender Wirkung gegenüber der Aktivität, den Wachstumskegel zum Einsturz zu bringen, und/oder gegenüber der inhibitorischen Aktivität auf das Nervenauswachsen in einem Collagen-Gel, und, noch bevorzugter, eine Verbindung mit unterdrückender Wirkung sowohl gegenüber der den Wachstumskegel kollabierenden Aktivität von Semaphorin als auch gegenüber der Aktivität der Inhibition des Nervenauswachsens in einem Collagen-Gel.
Die oben beschriebene fördernde Wirkung auf die Regeneration zentraler und/oder peripherer Nerven bezieht sich auf eine Wirkung, die die Nervenregeneration im zentralen Nervensystem (Gewebe) fördert, umfassend etwa das Gehirn, Rückenmark und dergleichen, und/oder im peripheren Nervensystem (Gewebe), wobei sich dieses in Organen an der Körperoberfläche oder im Körper befindet, die die randständigen und peripheren Teile und nicht das Zentralnervensystem (Gewebe) ausmachen. Hier beinhaltet die fördernde Wirkung auf die Regeneration zentraler Nerven eine fördernde Wirkung nicht nur auf die Nervenregeneration, bei der ein Axon aus einem Nervenzellkörper in der zentralen Region, wie etwa einem Retinanerv oder einem Nerv des Cerebralkortex, hervortritt und auf andere Nervenzellen projiziert wird, die sich auch im Zentralnervensystem befinden, sondern auch auf die Nervenregeneration, bei der ein Nervenaxon im Zentralnervensystem (Gewebe) regeneriert wird, selbst unter Bedingungen bzw. in einem Umfeld, bei dem ein Nerv, wie etwa eine afferente Faser eines Riechnervs oder eines sensorischen Nervs des Dorsalwurzelganglions, aus einem Nervenzellkörper in der Peripherie hervorgeht. Weiterhin beinhaltet die fördernde Wirkung auf die Regeneration peripherer Nerven eine fördernde Wirkung nicht nur auf die Nervenregeneration eines Nervs, der aus einem peripheren Nervenzellkörper hervortritt und sich in einem peripheren Gewebe verlängert, sondern auch auf die Nervenregeneration, bei der die Umstände bzw. das Umfeld für die Regeneration das periphere Nervensystem (Gewebe) ist, selbst dann, wenn ein Nerv aus einem Nervenzellkörper des zentralen Systems (Gehirn, Rückenmark oder dergleichen) hergeht. Das letztere kann beispielhaft vertreten werden von der die Nervenregeneration fördernden Wirkung wie etwa für einen motorischen Nerv des Rückenmarks, einen Präganglion-Nerv in den autonomen Nervensystemen, wie etwa sympathische und parasympathische Nerven und dergleichen. Eine fördernde Wirkung auf die Regeneration eines Nervs, wie etwa eines Ischiasnervs, der beide der oben genannten Nerven besitzt, ist ebenfalls in die beispielhafte Darstellung einbezogen. Eine Verbindung mit fördernder Wirkung auf die Regeneration zentraler und peripherer Nerven ist besonders bevorzugt für einen Semaphorin-Inhibitor der vorliegenden Erfindung. Das zuvor beschriebene Zentralnervensystem (Gewebe) bezieht sich auf ein Gewebe, umfassend Gehirn, Medulla oblongata, Rückenmark, Auge und dergleichen, und spezifischer bezieht es sich auf eine Region, bei der der Transport von Polymersubstanzen durch Strukturen wie etwa die Blut-Hirn-Schranke und die Blut-Retina-Schranke eingeschränkt wird. Das periphere Nervensystem (Gewebe) bezieht sich auf die Region der anderen Teile des Körpers. Nervenfasern sind in den peripheren Nervengeweben allge mein dazu befähigt, sich zu regenerieren, jedoch sind sie in den Geweben des Zentralnervensystems nicht zur Regeneration befähigt.
Die oben beschriebene Aktivität von Semaphorin, den Wachstumskegel zu kollabieren, bedeutet eine Aktivität, Wachstumskegel zum Verschwinden zu bringen. Diese Aktivität wird beobachtet, nachdem die folgenden Schritte durchgeführt werden: Kultivieren von Nervenzellen (im Allgemeinen Gewebeexplantate von Ganglien) für eine gegebene Zeitspanne in vitro, bis die verlängerten Neuriten und ebenso die Wachstumskegel an den Rändern der Neuriten beobachtet werden können; dann Hinzugeben einer gegebenen Konzentration (z. B. etwa 3 Units/ml; 1 Unit/ml ist als eine Semaphorin-Konzentration definiert, bei der 50% der Wachstumskegel kollabiert werden) an Semaphorin und Kultivieren für eine weitere Zeitspanne (z. B. eine Stunde). Um die verlängerten Neuriten und die Wachstumskegel an den Rändern der Neuriten für die Beobachtung bereit zu machen, werden die Nervenzellen allgemein für 10 bis 20 Stunden in vitro kultiviert, wobei die Dauer gemäß der Nervenvariante und den Kulturbedingungen verändert werden kann. Wenn der Zusammenbruch des Wachstumskegels, der von Semaphorin hervorgerufen wird, unterdrückt wird, z. B. durch die Zugabe einer Verbindung zu diesem experimentellen System in einer geeigneten Konzentration etwa eine Stunde vor der Zugabe von Semaphorin, so wird eine solche Verbindung als ein Semaphorin-Inhibitor betrachtet, insbesondere als eine Verbindung, die die Wirkung der den Wachstumskegel kollabierenden Aktivität von Semaphorin unterdrückt. Obwohl es keine bestimmte Einschränkung im Hinblick auf eine solche Verbindung mit einer solchen supprimierenden Wirkung auf die Wachstumskegel-kollabierende Aktivität gibt, können beispielhaft Verbindungen genannt werden, die die supprimierende Wirkung bei einer Konzentration von 100 μg/ml oder weniger, bevorzugt von 30 μg/ml oder weniger, bevorzugter von 10 μg/ml oder weniger, und am bevorzugtesten von 3 μg/ml oder weniger zeigen. Weiterhin ist als Semaphorin-Inhibitor eine Verbindung bevorzugt, die nicht wesentlich die Proliferation solcher Zellen, wie etwa Nervenzellen, Semaphorin-exprimierenden Zellen oder dergleichen beeinflusst, um die Wirkung der Semaphorin-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung zu bestätigen, sowie im Hinblick auf die Sicherheit, wenn diese als ein Arzneimittel verwendet werden.
Die das Nervenauswachsen inhibierende Aktivität von Semaphorin in einem Collagen-Gel, wie oben beschrieben, bedeutet z. B., dass die inhibitorische Aktivität im Bezug auf das Neuritenauswachsen in einem Collagen-Gel beobachtet wird, das z. B. sowohl Semaphorin-produzierende Zellen als auch Nervenzellen (für gewöhnlich Ganglien) enthält; und die supprimierende Wirkung gegenüber dieser inhibitorischen Aktivität auf das Neuritenauswachsen ist eine Wirkung, um die Semaphorin-Aktivität in einem Collagen-Gel in andauernder Weise zu inhibieren, und sie ist z. B. eine Wirkung, durch die die Neuriten, wenn man Beobachtungen anstellt, nachdem man Semaphorin-produzierende Zellen und Nervenzellen für gewöhnlich über Nacht oder sogar länger in einem Collagen-Gel benachbart kultiviert, unter Versuchsbedingungen, bei denen die Neuriten im Vergleich mit dem an der den Semaphorin-produzierenden Zellen gegenüberliegenden Seite zu beobachtenden Wachstum nur bis auf 1/3 oder weniger in Richtung der Semaphorin- produzierenden Zellen auswachsen können, in Gegenwart der Zielsubstanz zur Seite der Semaphorin-produzierenden Zellen immerhin um 1/2 oder mehr des an der gegenüber liegenden Seite zu beobachtenden Auswachsens auswachsen können.
Weiterhin gibt es keine spezielle Einschränkung im Hinblick auf eine Verbindung mit supprimierender Wirkung auf die das Neuritenauswachsen inhibierende Aktivität von Semaphorin in dem Collagen-Gel. Jedoch lassen sich beispielhaft solche nennen, die die vorstehend genannte supprimierende Wirkung bei einer Konzentration von 100 μg/ml oder weniger, bevorzugt von 30 μg/ml oder weniger, bevorzugter von 10 μg/ml oder weniger und am bevorzugtesten von 3 μg/ml oder weniger zeigen.
Semaphorin, das verwendet wird, um die oben erwähnten zwei Typen von Semaphorinaktivitäten zu messen, ist nicht auf ein natürliches Semaphorin beschränkt, und die folgenden, früher beschriebenen Semaphorine können ebenfalls verwendet werden: Semaphorin, bei dem nur die extrazelluläre Domäne eines membranbindenden Semaphorins exprimiert und solubilisiert wird; ein Fusionsprotein mit einem anderen Protein, wie etwa einem Antikörper, alkalischer Phosphatase oder dergleichen; Semaphorin, an das ein Tag, wie etwa ein His-Tag oder ein Flag angefügt wird; oder Semaphorin, in dem einige Aminosäuren verändert werden. Weiterhin werden als Nervenzellen für die Kultur günstiger Weise Dorsalwurzelganglien von Hühnerembryonen im Alter von 7 oder 8 Embryonaltagen verwendet. Jedoch können Dorsalwurzelganglien von anderen Tieren als Hühnern oder beliebige andere Nervenzellen, wie etwa sympathische Ganglien, Retina-Ganglien, übergeordnete Zervix-Ganglien oder gleichen, die keine Dorsalwurzelganglien sind, ebenfalls verwendet werden, solange die Nervenzellen befähigt sind, ihre Neuriten in der In vitro-Kultur auszustrecken. Es gibt keine spezifische Einschränkung hinsichtlich der Kulturbedingung, solange Neuritenauswachsen beobachtet werden kann und Semaphorin-Aktivitäten gemessen werden können.
Der Wirkungsmechanismus der Semaphorin-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung kann wie folgt angenommen werden. Die Inhibition des Neuritenauswachsens oder des Kollabierens des Wachstumskegels, die/das von Semaphorin verursacht wird, wird durch die Bindung von Semaphorin an seinen Rezeptor auf der Nervenzelloberfläche (Wachstumskegel) ausgelöst. Das Signal wird von dem Rezeptor, an den Semaphorin gebunden hat, an den intrazellulären Signalweg weitergeleitet, und es wird schließlich die Depolymerisation von Aktinfasern ausgelöst, was im Ergebnis die Unterdrückung des Neuritenauswachsens und den Zusammenbruch des Wachstumskegels bewirkt. Die Inhibition der Semaphorin-Aktivität wird erreicht durch Inhibieren oder Blockieren beliebiger der Schritte im Verlauf dieser Reaktionen. Als oben genannter Rezeptor für Semaphorin kann ein Rezeptor für ein beliebiges der vorstehenden Semaphorine angenommen werden, und es kann außerdem eine Mutante oder eine Komponente oder ein Teil eines solchen Rezeptors angenommen werden, vorausgesetzt, dass Semaphorin daran binden kann. Beispiele sind Neuropilin-1, Plexin und dergleichen. Die Semaphorin-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind nicht durch ihre Wirkungsmechanismen beschränkt, und ein Inhibitor, der einen belie bigen der Schritte in dem oben beschriebenen Wirkungsmechanismus inhibiert, wird in die Kategorie der vorliegenden Erfindung einbezogen. Das heißt, eine Verbindung wird auch in die Kategorie der vorliegenden Erfindung einbezogen, wenn die Verbindung Semaphorin-Aktivität inhibiert, indem sie die Reaktionen inhibiert, die den intrazellulären Signalweg betreffen, der ab der vorstehend genannten Rezeptorbindung von Semaphorin bis hin zur Depolymerisation von Aktinfasern stattfindet. Daneben kann ein Verfahren zur Messung der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Rezeptorbindung von Semaphorin ein beliebiges Verfahren sein, wenn es von Fachleuten in geeigneter Weise ausgewählt wird, wobei dies beispielhaft vertreten wird durch ein Verfahren zur Messung der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Rezeptorbindung von Semaphorin, bei dem Semaphorin, fusioniert mit einem anderen Protein, wie etwa einem Antikörper, alkalischer Phosphatase oder dergleichen, oder Semaphorin, an das His-Tag, Flag oder dergleichen angefügt wurde, wie zuvor beschrieben, in Gegenwart einer Testsubstanz an einen Rezeptor dieses Semaphorins oder an eine Zelle, die eine Rezeptorkomponente exprimiert, gebunden wird.
Beispielsweise wurde die inhibitorische Aktivität von SPF-3059-1 für die Bindung von Sema3A an Neuropilin-1 in der Praxis untersucht, indem man das mit alkalischer Phosphatase fusionierte Sema3A (= Sema3A-AP) und Neuropilin-1-exprimierende COS7-Zellen verwendete. SPF-3059-1 ist eine Verbindung, die von den vorliegenden Erfindern entdeckt wurde, und die sowohl das Kollabieren als auch die Hemmung des Neuritenauswachsens, die durch Semaphorin 3A (Sema3A) induziert wird, inhibiert. Die vorliegende Studie deckte auf, dass SPF-3059-1 die Bindung von Sema3A-AP an Neuropilin-1 in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibiert. Weiterhin, um den Mechanismus dieser Inhibition aufzuklären, d. h. um zu ermitteln, ob SPF-3059-1 mit Sema3A oder mit dessen Rezeptor interagiert, wurde der Vergleich angestellt, indem man die kollabierende Aktivität vergleichend maß zwischen: (1) der das Kollabieren bewirkenden Aktivität, die beobachtet wurde, wenn eine Probe, in der vorab Sema3A und SPF-3059-1 bei einer auf hinreichende inhibitorische Aktivität ansteigenden Konzentration (0,25 μg/ml an SPF-3059-1) gemischt worden waren, zu der Kulturlösung von Dorsalwurzelganglien gegeben wurde und (2) der das Kollabieren bewirkenden Aktivität, die beobachtet wurde, wenn Sema3A nach der Zugabe von SPF-3059-1 zu der oben genannten Kulturlösung hinzugegeben wurde. Die Endkonzentration von SPF-3059-1 (0,05 μg/ml) in der Kulturlösung war bei (1) und (2) gleich. Bei dieser Konzentration von SPF-3059-1 wurde bei (2) keine Inhibition der das Kollabieren bewirkenden Aktivität beobachtet. Jedoch wurde bei (1) eine Inhibition der das Kollabieren bewirkenden Aktivität beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt an, dass Sema3A seine das Kollabieren bewirkende Aktivität verloren hat, da SPF-3059-1 mit diesem interagierte. Ausgehend von den obigen Überlegungen nimmt man an, dass SPF-3059-1 durch einen Mechanismus wirkt, bei dem die Bindung von Sema3A an den Rezeptor durch die direkte Wirkung von SPF-3059-1 auf Sema3A inhibiert wird. Wenn diese Erkenntnis berücksichtigt wird, so ist eine Verbindung, die die Bindung von Semaphorin an seinen Rezeptor inhibiert, indem sie direkt mit dem Semaphorin interagiert, und die dabei die Funktion und Aktivität des Semaphorins inhibiert, bevorzugt als ein Semaphorin-Inhibitor der vorliegenden Erfindung. Nach einem Semaphorin-Inhibitor, insbesondere einer Verbindung, die die Funktion von Semaphorin inhibiert, indem sie mit diesem interagiert, kann durch die oben genannten Verfahren gescreent werden, wobei bei den Verfahren die das Kollabieren bewirkende Aktivität oder die inhibitorische Aktivität im Hinblick auf die Rezeptorbindung oder dergleichen gemessen wird.
Eine bevorzugte Verbindung für den Semaphorin-Inhibitor der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung, bei der der Semaphorin-Inhibitor die Zellproliferation nicht wesentlich beeinflussen wird, d. h. eine Verbindung, die keine supprimierende Wirkung auf die Zellproliferation hat, z. B. eine Verbindung, die keine unterdrückende Wirkung auf die Zellproliferation bei einer Konzentration zeigt, die dem 50–3.000-fachen oder mehr der Konzentration entspricht, bei der die Semaphorin-Inhibitoraktivität beobachtet werden kann. Weiterhin, obwohl es keine bestimmte Einschränkung hinsichtlich des Molekulargewichts des Semaphorin-Inhibitors der vorliegenden Erfindung gibt, ist eine Verbindung mit einem niedrigen Molekulargewicht im Hinblick auf die Diffusionsfähigkeit, Membranpermeabilität, Gewebeverteilung, insbesondere die Durchlässigkeit gegenüber der Blut-Hirn-Schranke oder dergleichen, erstrebenswert, und geeignete Beispiele beinhalten eine niedermolekulare Verbindung mit einem Molekulargewicht von 10.000 oder weniger, bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 5.000 oder weniger, bevorzugter mit einem Molekulargewicht von 1.000 oder weniger, und besonders eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von 600 oder weniger. Weiterhin können für die Semaphorin-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung Nicht-Peptid- und Nicht-Nukleotid-Verbindungen beispielhaft benannt werden. Diese Nicht-Peptid- und Nicht-Nukleotid-Verbindungen sind beispielhaft vertreten durch eine aliphatische synthetisierte Verbindung, M162, eine von Actinomyceten abgeleitete Verbindung, A721, und, am bevorzugtesten, Verbindungen, die aus der Kultur von Penicillium sp. SPF-3059 erhalten wurden, die später beschrieben wird.
Ein Beispiel der oben genannten Verbindungen, die aus der Kultur von Penicillium sp. SPF-3059 erhalten werden, ist eine Verbindung mit Semaphorin-inhibierender Aktivität, repräsentiert durch die oben genannte allgemeine Formel [8] und bevorzugter eine Verbindung, repräsentiert durch eine der oben genannten allgemeinen Formeln [12] bis [16]. In den allgemeinen Formeln [2], [9], [10], [11], [12], [13], [14] und [16] bei diesen Verbindungen repräsentiert R¹ ein Wasserstoffatom, eine Carboxylgruppe oder eine Alkoxycarbonylgruppe, bevorzugt ein Wasserstoffatom oder eine Carboxylgruppe, und eine Methoxycarbonylgruppe, eine Ethoxycarbonylgruppe, eine Propoxycarbonylgruppe und dergleichen, die beispielhaft genannt werden als die oben genannte Alkoxycarbonylgruppe, worunter eine Methoxycarbonylgruppe bevorzugt ist. Insbesondere repräsentiert R¹ in den allgemeinen Formeln [9], [10], [11], [12], [13] und [16] bevorzugt ein Wasserstoffatom oder eine Carboxylgruppe, und R¹ in den allgemeinen Formeln [2] und [14] repräsentiert bevorzugt ein Wasserstoffatom, eine Carboxylgruppe oder eine Methoxycarbonylgruppe, wobei ein Wasserstoffatom oder eine Carboxylgruppe bevorzugter sind. Entsprechend repräsen tiert R² in den allgemeinen Formeln [2], [9], [10], [11], [12], [13], [14] und [16] ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Acyloxygruppe, bevorzugt ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe. Als die oben genannte Acyloxygruppe werden beispielhaft eine Acetoxygruppe, eine Propionyloxygruppe, eine Pivaloyloxygruppe und der gleichen genannt. R³ in den allgemeinen Formeln [2] und [14] repräsentiert ein Wasserstoffatom, eine Methoxymethylgruppe oder eine Gruppe, die durch die Formel [3] dargestellt wird. R⁴ in den allgemeinen Formeln [8], [12], [13], [14], [15] und [16] repräsentiert ein Wasserstoffatom, eine Carboxylgruppe oder eine Alkoxycarbonylgruppe, bevorzugt ein Wasserstoffatom oder eine Carboxylgruppe. Beispiele der oben genannten Alkoxycarbonylgruppe sind eine Methoxycarbonylgruppe, eine Ethoxycarbonylgruppe, eine Propoxycarbonylgruppe und dergleichen, wobei hierunter eine Methoxycarbonylgruppe bevorzugt ist. Entsprechend repräsentiert R⁵ in den allgemeinen Formeln [8], [12], [13], [14], [15] und [16] ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Acyloxygruppe, bevorzugt ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe. Und eine Acetoxygruppe, eine Propionyloxygruppe, eine Pivaloyloxygruppe und dergleichen wird beispielhaft als die oben genannte Acyloxygruppe benannt. Im Hinblick auf R⁶ und R⁷ in der allgemeinen Formel [8] ist es so, dass (1) wenn R⁶ eine Methylgruppe repräsentiert, R⁷ eine Gruppe repräsentiert, die durch die Formeln [2], [9] oder [10] dargestellt ist, und (2) wenn R⁶ eine Gruppe repräsentiert, die durch die Formel [5] oder [11] dargestellt ist, R⁷ eine Acetylgruppe repräsentiert.
Eine Verbindung mit einer Gruppe, repräsentiert durch die oben genannte allgemeine Formel [8] und insbesondere eine Verbindung, die durch die oben genannten allgemeinen Formeln [12] bis [16] repräsentiert wird, kann aus der Kultur von Penicillium sp. SPF-3059 mit der Semaphorin-inhibierenden Aktivität als einem Index erhalten werden. Darüber hinaus kann eine solche Verbindung auch durch bekannte Umsetzungsverfahren und synthetische Verfahren aus der derart erhaltenen Verbindung mit Semaphorin-inhibierender Aktivität oder dergleichen erhalten werden, wobei die Semaphorin-inhibierende Aktivität als ein Index dient. Verbindungen, die Semaphorin-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung darstellen, sind beispielhaft vertreten durch diejenigen, die durch die Formeln [17]–[37] gezeigt sind, die später in den Beispielen in dieser Beschreibung beschrieben sind. Spezifischer sind sie beispielhaft vertreten durch: die Verbindungen, die durch die allgemeine Formel [12] dargestellt sind, die durch die Formeln [17], [20], [23], [24] und [32] gezeigt wird; die Verbindungen, die durch die allgemeine Formel [13] dargestellt sind, die durch die Formeln [18], [19], [21], [25], [26], [27] und [28] gezeigt wird; die Verbindungen, die durch die allgemeine Formel [14] dargestellt sind, die durch die Formeln [22], [30], [31], [34], [36] und [37] gezeigt wird; die Verbindungen, die durch die allgemeine Formel [15] dargestellt sind, die durch die Formeln [29] und [35] gezeigt wird; die Verbindungen, die durch die allgemeine Formel [16] dargestellt sind, die durch die Formel [33] gezeigt wird. Diese oben spezifisch beispielhaft benannten Verbindungen sind neuartige Verbindungen, mit Ausnahme der folgenden: die Verbindung SPF-3059-1, dargestellt durch die Formel [17] ( japanische offen gelegte Patentanmeldung Nr. 1993-239050 ); die Verbindung SPF-3059-2, dargestellt durch die Formel [18] (Pure & Appl. Chem. 66, 2383–2386, 1994); und die Verbindung SPF-3059-5, dargestellt durch die Formel [19] (Pure & Appl. Chem. 66, 2383–2386, 1994, und veröffentlichte japanische Übersetzung der internationalen PCT-Veröffentlichung Nr. 1994-506202 ).
Weiterhin ist es bei den Verbindungen, die Semaphorin-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung darstellen so, dass Salze oder Derivate der Verbindungen, bevorzugt pharmazeutisch oder veterinär-pharmazeutisch verträgliche Salze oder Derivate, ebenfalls in die Kategorie der vorliegenden Erfindung einbezogen sind. Die Beispiele für Salze sind: anorganische basische Salze, wie etwa Natriumsalz, Kaliumsalz, Calciumsalz, Magnesiumsalz, Aluminiumsalz, Ammoniumsalz oder dergleichen; organische basische Salze, wie etwa Triethylammoniumsalz, Triethanolammoniumsalz, Pyridiniumsalz, Diisopropylammoniumsalz oder dergleichen; basische Aminosäuresalze, wie etwa Argininsalz, Lysinsalz, oder dergleichen. Die Derivate lassen sich beispielhaft darstellen durch solche, bei denen die Carboxylgruppe oder die Hydroxylgruppe einer Verbindung in eine Estergruppe umgewandelt wird, wobei die Beispiele ein Derivat beinhalten, bei dem die Hydroxylgruppe durch eine Acylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen acyliert wird, wie etwa einer Acetylgruppe, einer Propionylgruppe oder dergleichen, sowie ein Derivat, bei dem die Carboxylgruppe zu Estern mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen umgesetzt wird, wie etwa Methylester, Ethylester oder dergleichen.
Beispiele für eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, bevorzugt für eine Verbindung mit Semaphorin-inhibierender Aktivität, und insbesondere für eine Verbindung, die aus der Kultur von Penicillium sp. SPF-3059 erhalten wird und Semaphorin-inhibierende Aktivität besitzt, beinhalten eine Verbindung, bei der wenigstens einer von R¹, R², R⁴ und R⁵ in der oben genannten allgemeinen Formel [12] (wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ so sind, wie zuvor beschrieben) repräsentiert werden durch ein Wasserstoffatom, bevorzugt eine Verbindung, bei der wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, z. B. eine Verbindung, bei der R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert (eine Verbindung, bei der R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe bzw. ein Wasserstoffatom repräsentieren, etc.), eine Verbindung, bei der R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, die oben genannte Verbindung, bei der R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, und die oben genannte Verbindung, bei der R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert und dergleichen. Dies wird in spezifischer Weise beispielhaft dargestellt durch die Verbindung SPF-3059-3, dargestellt durch die Formel [20], die Verbindung SPF-3059-7, dargestellt durch [23], die Verbindung SPF-3059-9, dargestellt durch [24] und die Verbindung SPF-3059-30, dargestellt durch [32]. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhalten außerdem pharmazeutisch verträgliche Salze oder Derivate der Verbindungen, die durch die oben genannte allgemeine Formel [12] repräsentiert sind.
Beispiele für eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, bevorzugt für eine Verbindung mit Semaphorin-inhibierender Aktivität, und insbesondere eine Verbindung, die aus der Kultur von Penicillium sp. SPF-3059 erhalten wurde und Semaphorin-inhibierende Aktivität besitzt, beinhalten eine Verbindung, bei der wenigstens einer von R¹, R² und R⁵ in der oben genannten allgemeinen Formel [13] (wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ so sind wie zuvor beschrieben) durch ein Wasserstoffatom repräsentiert wird, bevorzugt eine Verbindung, bei der wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, z. B. eine Verbindung, bei der R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert (eine Verbindung, bei der R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe bzw. ein Wasserstoffatom repräsentieren, etc.), eine Verbindung, bei der R² und R³ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, die oben genannte Verbindung, bei der R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, und die oben genannte Verbindung, bei der R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert und dergleichen. In spezifischerer Weise wird sie beispielhaft vertreten durch die Verbindung SPF-3059-4, dargestellt durch die Formel [21], die Verbindung SPF-3059-12, dargestellt durch [25], die Verbindung SPF-3059-24, dargestellt durch [26], die Verbindung SPF-3059-25, dargestellt durch [27] und die Verbindung SPF-3059-26, dargestellt durch [28]. Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhalten außerdem pharmazeutisch verträgliche Salze oder Derivate der Verbindung, die durch die oben genannte allgemeine Formel [13] dargestellt ist.
Beispiele für eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, bevorzugt für eine Verbindung mit Semaphorin-inhibierender Aktivität, und insbesondere eine Verbindung, die aus der Kultur von Penicillium sp. SPF-3059 erhalten wurde und Semaphorin-inhibierende Aktivität besitzt, beinhalten eine Verbindung, die repräsentiert wird durch die oben genannte allgemeine Formel [14] (bei der R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ so sind, wie zuvor beschrieben), bevorzugt eine Verbindung, bei der wenigstens einer von R² und R⁵ durch eine Hydroxylgruppe repräsentiert wird, z. B. eine Verbindung, bei der R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert (eine Verbindung, bei der R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe bzw. ein Wasserstoffatom repräsentieren, etc.), eine Verbindung, bei der R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, die oben genannte Verbindung, bei der R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, eine Verbindung, bei der R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, eine Verbindung, bei der R¹ eine Carboxylgruppe repräsentiert, R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren und R³ eine Methoxymethylgruppe repräsentiert, eine Verbindung, bei der R¹ entweder eine Carboxylgruppe oder eine Methoxycarbonylgruppe repräsentiert, R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, R³ ein Wasserstoffatom repräsentiert und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, insbesondere eine Verbindung, bei der R¹ entweder eine Carboxylgruppe oder eine Methoxycarbonylgruppe repräsentiert, R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, R² und R³ ein Wasserstoffatom repräsentieren und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, eine Verbindung, bei der R³ eine Gruppe repräsentiert, die durch die oben genannte Formel [3] dargestellt wird, und so weiter. In spezifischerer Weise wird sie beispielhaft vertreten durch die Verbindung SPF-3059-6, dargestellt durch die Formel [22], die Verbindung SPF-3059-28, dargestellt durch [30], die Verbindung SPF-3059-29, dargestellt durch [31], die Verbindung SPF-3059-35, dargestellt durch [34], die Verbindung SPF-3059-37, dargestellt durch [36], und die Verbindung SPF-3059-39, dargestellt durch [37]. Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhalten außerdem pharmazeutisch verträgliche Salze oder Derivate der Verbindung, die durch die oben genannte allgemeine Formel [14] dargestellt ist.
Beispiele für eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, bevorzugt für eine Verbindung mit Semaphorin-inhibierender Aktivität, und insbesondere eine Verbindung, die aus der Kultur von Penicillium sp. SPF-3059 erhalten wurde und Semaphorin-inhibierende Aktivität besitzt, beinhalten eine Verbindung, die durch die oben genannte allgemeine Formel [15] (bei der R⁴ und R⁵ ebenso sind, wie zuvor dargestellt) ist, bevorzugt eine Verbindung, bei der R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, die oben genannte Verbindung, bei der R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert und dergleichen. In spezifischerer Weise wird sie beispielhaft vertreten durch die Verbindung SPF-3059-27, dargestellt durch die Formel [29] und die Verbindung SPF-3059-36 dargestellt durch [35]. Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhalten außerdem pharmazeutisch verträgliche Salze oder Derivate der Verbindung, die durch die oben genannte allgemeine Formel [15] dargestellt ist.
Beispiele für eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, bevorzugt für eine Verbindung mit Semaphorin-inhibierender Aktivität, und insbesondere eine Verbindung, die aus der Kultur von Penicillium sp. SPF-3059 erhalten wurde und Semaphorin-inhibierende Aktivität besitzt, beinhalten eine Verbindung, die durch die oben genannte allgemeine Formel [16] (bei der R¹, R², R⁴ und R⁵ ebenso sind, wie zuvor dargestellt) ist, bevorzugt eine Verbindung, bei der wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, insbesondere eine Verbindung, bei der R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, die oben genannte Verbindung, bei der R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, und dergleichen. In spezifischerer Weise wird sie beispielhaft vertreten durch die Verbindung SPF-3059-34, die durch die Formel [33] repräsentiert wird. Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhalten außerdem pharmazeutisch verträgliche Salze oder Derivate der Verbindung, die durch die oben genannte allgemeine Formel [16] dargestellt ist.
Eine Verbindung mit einer Gruppe, repräsentiert durch die oben genannten allgemeinen Formeln [2] oder [5] im Molekül und mit Semaphorin-inhibierender Aktivität, bevorzugt eine Verbindung, die durch die oben genannte allgemeine Formel [8] repräsentiert wird, bevorzugter eine Verbindung, die durch die oben genannten allgemeinen Formeln [12] bis [16] repräsentiert wird, in spezifischerer Weise Verbindungen, die die Semaphorin-Inhibitoren der vorliegenden darstellen, und die in den oben genannten Formeln [17] bis [37], etc. dargestellt sind, alle diese Verbindungen können wirksam erhalten werden, indem man den Pilzstamm SPF-3059 kultiviert, der zur Gattung Penicillium gehört. Der Stamm wurde von den vorliegenden Erfindern aus einer Bodenprobe isoliert, die in der Präfektur Osaka, Japan, gesammelt wurde. Der Stamm SPF-3059 besitzt die folgenden taxonomischen Eigenschaften.
(a) Kultureigenschaften und morphologische Eigenschaften
Auf einem Malzextrakt-Agar wuchsen langsam Kolonien heran, die in 21 Tagen bei 25°C einen Durchmesser von 2,8 bis 2,9 cm erreichten. Die Kolonien waren weiß bis gelb und wollig im Aussehen. Die Farbe der Rückseite war dunkelgelb. Es wurde weder eine Produktion von löslichem Pigment noch eine Sporenbildung beobachtet. Auf Kartoffel-Dextrose-Agar wuchsen in 21 Tagen bei 25°C langsam Kolonien heran, die einen Durchmesser von 3,2 bis 3,3 cm erreichten.
Die Kolonien waren weiß bis cremegelb und wollig im Aussehen. Die Farbe der Rückseite war dunkelgelb bis braun. Es wurde weder eine Produktion von löslichem Pigment noch eine Sporenbildung beobachtet. Auf Czapek-Agar wuchsen in 21 Tagen bei 25°C langsam Kolonien heran, die einen Durchmesser von 3,1 bis 3,2 cm erreichten. Die Kolonien waren weiß bis grau und wollig im Aussehen. Die Farbe der Rückseite war cremegelb. Es wurde weder eine Produktion von löslichem Pigment noch eine Sporenbildung beobachtet. Auf Czapek-Agar wuchsen in 21 Tagen bei 25°C langsam Kolonien heran, die einen Durchmesser von 3,1 bis 3,2 cm erreichten. Die Kolonien waren weiß bis grau und wollig im Aussehen. Die Farbe der Rückseite war cremegelb. Es wurde weder eine Produktion von löslichem Pigment noch eine Sporenbildung beobachtet. Auf Hafermehl-Agar (Actino Medium No. 3 "DAIGO", Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) wuchsen in 21 Tagen bei 25°C langsam Kolonien heran, die einen Durchmesser von 2,0 bis 2,1 cm erreichten. Die Kolonien waren weiß bis gelb oder gräulich-grün und wollig im Aussehen. Die Farbe der Rückseite war cremegelb bis grau. Es wurde kein lösliches Pigment produziert, jedoch wurde Sporenbildung beobachtet. Die Conidiophoren waren glattwandig mit einer Länge von 5 bis 20 μm und erzeugten 3 bis 6 Phialiden in einer monoverticillaten Weise an den Enden der Stiele. An den oberen Enden der Phialiden, die eine Länge von 3 bis 4 μm hatten, wurden Konidien in einer Kettenform ausgebildet, mit 2 bis 10 Konidien pro Kette. Die Konidien sind kugelförmig mit einem Durchmesser von 2,2 bis 2,4 μm mit gestreifter Oberfläche (im Allgemeinen 10 longitudinale Linien auf der Oberfläche). Teleomorphe wurden nicht beobachtet.
(b) Physiologische Eigenschaften
(1) pH-Bereich für das Wachstum
Das Wachstum wurde in Schüttelkultur unter Verwendung von Sabouraud-Brühe überprüft.
Die Beobachtung erfolgte nach Kultur für 3 Tage bei 27°C. Das Ergebnis war wie folgt:

pH Wachstum

3,1 –

4,5 +

5,5 ++

7,1 +++

8,0 ++

9,0 ±

10,0 –
(2) Temperaturbereich für das Wachstum
Das Wachstum wurde unter Verwendung von Hafermehl-Agar untersucht. Die Beobachtung erfolgte nach Inkubation für 5 Tage bei 38°C. Das Ergebnis war, dass der Stamm bei dieser Temperatur wuchs.
Basierend auf den oben genannten taxonomischen Eigenschaften wurde der Stamm als ein Stamm der Gattung Penicillium identifiziert und als Penicillium sp. SPF-3059 bezeichnet. Der Stamm wurde am 13. Juli 2001 bei der internationalen Patentorganismen-Hinterlegungsstelle, dem National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Japan (1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan) unter der Zugangsnummer FERM BP-7663 als der internationalen Hinterlegungsnummer gemäß dem Budapestvertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck des Patentverfahrens hinterlegt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Kultivierung für die Herstellung der Semaphorin-Inhibitoren durch den Stamm SPF-3059 in einem Nährmedium durchgeführt werden. Das Nährmedium kann entweder flüssig oder fest sein. Eine Schüttelkultur oder Submerskultur mit Belüftung ist bevorzugt. Die Zusammensetzung des Mediums kann über einen weiten Bereich variiert werden. Der für die Verwendung vorgesehenen Mediumzusammensetzung ist keine spezielle Einschränkung auferlegt. Was essentiell benötigt wird, ist eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle. Anorganische Spurenelemente können ebenfalls hinzugefügt werden. Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen sind Glukose, Sucrose, Glycerin, Stärke, Dextrin, Molasse oder dergleichen. Beispiele geeigneter Stickstoffquellen sind Pepton, Casein oder dessen Hydrolysat, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser, Aminosäuren, wie etwa Histidin, Ammoniumsalze, Nitratsalze oder dergleichen. Beispiele von Quellen geeigneter anorganischer Elemente sind Phosphatsalze, wie etwa Natriumphosphat und Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat oder dergleichen. Anorganische Substanzen können einem Medium auch zugegeben werden, um den osmotischen Druck einzustellen, um den pH-Wert einzustellen, um Spurenelemente zu supplementieren oder dergleichen. Darüber hinaus können diverse Additive, wie etwa Vitamine, Nukleinsäuren oder dergleichen zu dem Medium hinzugegeben werden, um das Wachstum des produzierenden Stammes zu unterstützen. Es ist auch möglich, ein Antischaummittel, wie etwa ein Siliciumöl, Polypropylenglykol-Derivat, Sojabohnenöl oder dergleichen, während der Kulturphase hinzu zu geben. Ein bevorzugter Temperaturbereich für die Kultur ist bevorzugt 20 bis 35°C, bevorzugter 25 bis 30°C, und bevorzugte pH-Werte für das Medium sind z. B. solche, die sich um neutral herum bewegen, und die Kulturphase entspricht z. B. einer Zeitspanne von 5 bis 10 Tagen.
Für die Gewinnung der Semaphorin-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung, dargestellt durch die oben genannten Formeln [17] bis [37], aus der Fermentationsbrühe nach der Kultivierung kann jedwedes konventionelle Verfahren angewendet werden, wie es für die Isolierung und Reinigung von Sekundärmetaboliten, die von Mikroorganismen produziert werden, angewendet wird. Diese Verfahren beinhalten Lösungsmittelextraktion, Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie, Verteilungschromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Dünnschichtchromatographie und dergleichen. Diese Isolierungs- und Reinigungsverfahren können entweder alleine oder in Kombination angewendet werden. Um die Zielverbindungen aus dem Kulturüberstand zu erhalten, können diese Isolierungs- und Reinigungsverfahren angewendet werden. Zusätzlich, wenn die Zielverbindungen sich im kultivierten Pilzmyzel befinden, so kann das Myzel durch Mittel wie etwa Filtration oder Zentrifugation gesammelt werden, und es kann direkt extrahiert werden, indem man ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel, wie etwa Aceton, Methanol oder dergleichen, verwendet. Dann kann eine Verbindung von Interesse durch ähnliche Verfahren wie den oben beschriebenen aus dem Extrakt erhalten werden. Diese Verbindung von Interesse kann auch zu einem Salz umgesetzt werden, indem man eine geeignete Menge an Base in Lösungsmitteln, wie etwa Wasser, Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Ether oder dergleichen, hinzu gibt. Darüber hinaus kann bei der interessierenden Verbindung mittels konventionellen Verfahren eine Hydroxylgruppe acyliert werden, und eine Carboxylgruppe kann verestert werden. Beispielsweise kann eine Hydroxylgruppe durch die Zugabe eines Acylierungsmittels, wie etwa Essigsäureanhydrid, Acetylchlorid oder dergleichen, in einem geeigneten organischen Lösungsmittel und in Gegenwart von Basen acyliert werden. Alternativ kann eine Carboxylgruppe durch Verwendung von Alkylhalogeniden, wie etwa Methyliodid, Ethylbromid oder dergleichen, in einem geeigneten organischen Lösungsmittel und in Gegenwart von Basen verestert werden. Was die organischen Lösungsmittel betrifft, so können beispielhaft Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Ether, DMF, Pyridin oder dergleichen genannt werden. Als Basen können beispielhaft Triethylamin, Pyridin, Kaliumcarbonat oder dergleichen genannt werden.
Weiterhin werden M162 oder A721, die in den Beispielen beschrieben sind, ebenfalls beispielhaft als weitere Semaphorin-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung benannt. M162 ist eine aliphatische Verbindung mit einer schwachen Ultraviolettabsorption, wogegen A721 ein Naturprodukt ist, das aus der Kulturbrühe eines Actinomycetenstammes isoliert wird, mit einem Molekulargewicht von 437 und einem Maximalwert λ max der Absorption im UV-sichtbaren Spektrum (in Methanol) bei 397 nm. Wenn man dies berücksichtigt, so sind M162 und A721 niedermolekulare Verbindungen, deren chemische Strukturen vollständig verschieden von denen der Verbindungen sind, die durch die oben genannten Formeln [17]–[37] und dergleichen dargestellt sind.
Es gibt keine spezifische Einschränkung im Hinblick auf präventive Mittel oder Heilmittel der vorliegenden Erfindung für neuropathische Erkrankungen und/oder neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich einer Verletzung des Spinalnervs und/oder einer Verletzung eines peripheren Nervs, solange sie die zuvor beschriebenen fördernden Mittel der Nervenregeneration enthalten, die einen Inhibitor für einen das Nervenauswachsen zurückdrängenden Faktor, insbesondere die oben genannten Semaphorin-Inhibitoren, als einen Wirkstoff aufweisen. Zu den präventiven Mitteln und Heilmitteln können diverse dispensierbare Zusammensetzungen hinzu ge geben werden, wie etwa pharmazeutisch verträgliche gebräuchliche Träger, Bindemittel, Stabilisatoren, Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel, pH-Puffer, Desintegrationsmittel, Lösungsvermittler, lösliche Co-Adjuvantien, isotonische Mittel oder dergleichen. Daneben können diese präventiven Mittel und Heilmittel entweder oral oder parenteral verabreicht werden. Mit anderen Worten können sie in gewöhnlichen Verabreichungsmitteln verabreicht werden, z. B. können sie oral in Mittelformen wie etwa Pulver, Granulat, Kapseln, Sirup, Suspensionsflüssigkeit oder dergleichen verabreicht werden, oder sie können parenteral verabreicht werden, indem man in Mittelformen wie etwa einer Lösung, Emulsion, Suspension oder dergleichen injiziert. Alternativ können sie nasal in Form von Sprühmitteln verabreicht werden.
Obwohl die Dosierung und die Häufigkeit der Verabreichung in Abhängigkeit vom Verfahren der Verabreichung und dem Alter, dem Gewicht, den medizinischen Umständen etc. eines Patienten differieren, ist es bevorzugt, lokal an die Stelle einer Erkrankung zu verabreichen. Da Nerven mehrere Tage bis mehr als einige Monate benötigen, um sich zu regenerieren, werden die präventiven Mittel oder die Heilmittel bevorzugt einmal oder mehr als zweimal während dieser Zeitspanne verabreicht, um die Aktivitäten von Semaphorin zu unterdrücken. Wenn die Verabreichung zweimal oder öfter erfolgt, so ist es bevorzugt, die präventiven Mittel oder die Heilmittel wiederholt an aufeinander folgenden Tagen oder in geeigneten Intervallen zu verabreichen. Die Dosierung kann definiert werden als mehrere hundert μg bis 2 g pro Verabreichung in Form eines Semaphorin-Inhibitors, bevorzugt mehreren duzend mg oder weniger. Um die Verabreichungsfrequenz zu reduzieren, können Mittel mit verlängerter Freisetzung, eine osmotische Pumpe oder dergleichen verwendet werden. Bei sämtlichen dieser Verabreichungsverfahren ist es bevorzugt, eine Verabreichungsroute und ein Verabreichungsverfahren anzuwenden, bei der/dem die Konzentration das hinreichende Niveau erreichen sollte, um die Semaphorinaktivität an der Wirkungsstelle zu inhibieren.
Die oben genannten neuropathischen Erkrankungen und/oder neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich einer Verletzung des Spinalnervs und/oder einer Verletzung peripherer Nerven bedeutet die Verletzung oder degenerative Erkrankungen peripherer oder zentraler Nerven, die sich aufzählen lassen als: olfaktorische Abnormität aufgrund von Alterung oder dergleichen; eine andere Nervenverletzung als die des Riechnervs, verursacht durch Trauma, wie etwa Rückenmarksverletzung oder dergleichen; Nervenschaden aufgrund von Hirninfarkt oder dergleichen; Lähmung des Gesichtsnervs; diabetische Neuropathie, Glaukom; Retinitis pigmentosa; neurodegenerative Erkrankungen, wie etwa Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und ALS; muskuläre hypoplastische Lateralsklerose; Lou Gehrig'sche Krankheit; Chorea Huntington; Hirninfarkt; traumatische neurodegenerative Erkrankungen, und so weiter. Erkrankungen, die von Angiogenese begleitet sind, an der VEGF165 beteiligt ist, sind ebenfalls Ziele, da VEGF165 ebenfalls Neuropilin als seinen Rezeptor verwendet.
Zusätzlich ist die Anwendung der die Nervenregeneration fördernden Mittel der vorliegenden Erfindung nicht auf Medikamente wie etwa präventive Mittel oder Heilmittel für neuropathi sche Erkrankungen und/oder neurodegenerative Erkrankungen beschränkt, sondern es ist auch eine geeignete Anwendung für Veterinärmedikamente möglich, oder, weiterhin, für industriell wichtige experimentelle Reagenzien, wie etwa Inhibitoren der Semaphorin-Signalerzeugung. Da sie Semaphorin-Inhibitoren als einen Wirkstoff enthalten, unterstützen die Nervenregenerations-Förderer der vorliegenden Erfindung die Regeneration des Riechnervs, der ein peripherer Nerv ist, und sie unterstützen die Regeneration von Nerven in der zentralen Region, bei denen es sich um Bulbus olfactorius, Cerebralkortex, Hippocampus, Corpus striatum, Thalamus, Diencephalon, Mesencephalon, Cerebellum, Pons, Medulla oblongata, Rückenmark, Retina und dergleichen handelt.
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail mittels der Beispiele erklärt. Der technische Schutzumfang der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1 (Herstellung der Verbindungen SPF-3059-1, SPF-3059-2, SPF-3059-5)
Ein 75 ml-Medium, enthaltend 2% Glukose, 5% Sucrose, 2% Baumwollsamenpulver, 0,1% Natriumnitrat, 0,1% L-Histidin, 0,05% Dikalium-Phosphat, 0,07% Kaliumchlorid und 0,0014% Magnesiumsulfat-Heptahydrat mit einem pH, der auf 7,0 eingestellt ist, wurde in einen Sakaguchi-Kolben mit 500 ml Volumen pipettiert und in einem Autoklaven sterilisiert. Eine Abstrichmenge („loopful") von Penicillium sp. SPF-3059 (FERM BP-7663) auf einer Schrägkultur wurde in diesem Medium angeimpft und unter Schütteln bei 130 rpm für 5 Tage bei 27°C als Vorkultur kultiviert. Ein Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie das oben genannte Medium wurde mit jeweils 300 ml in 10 Sakaguchi-Kolben mit einem Volumen von 2 Litern pipettiert und in einem Autoklaven sterilisiert. Danach wurden je 6 ml der oben genannten Vorkulturlösung zu diesen Kolben hinzugefügt, die dann unter Schütteln bei 110 rpm für 7 Tage bei 27°C kultiviert wurde.
Nach der Kultivierung wurde die Fermentationsbrühe bei 10.000 rpm für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um den Überstand und das Myzel zu trennen. Die Überstandsfraktionen wurden mit 3 l an Ethylacetat:Ameisensäure (99:1) extrahiert. Die Fraktion des Myzels wurde mit 3 Litern an Aceton extrahiert, dann filtriert und konzentriert. Nach der Konzentrierung in wässrige Lösung erfolgte eine Extraktion mit 1 Liter an Ethylacetat:Ameisensäure (99:1). Beide Extrakte wurden dann gemischt und unter reduziertem Druck konzentriert, um 10,4 g an Rohextrakt zu erhalten. Dieser Extrakt wurde dann in 100 ml Methanol gelöst und auf eine Säulenchromatographie mit Sephadex^TM LH-20 (Amersham Biosciences K.K.) appliziert und mit Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft, um 2,6 g an Rohmaterial zu erhalten. Dieses Rohmaterial wurde dann für eine Säulenchromatographie unter Verwendung von TSKgel TOYOPEARL HW-40F (Tosoh Corporation) in 100 ml Methanol gelöst und mit Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft, um 1,6 g an Rohsubstanz zu erhalten. Diese Rohsubstanz wurde dann in Aliquots von 50 mg in 1 ml an Dimethylsulfoxid (DMSO) für eine Reversphasen-HPLC gelöst. Die Bedingungen der Reversphasen-HPLC waren: Säule: Wakopak^® Wakosil-II5C18RS (Verbindung von 20 × 50 mm und 20 × 250 mm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Lösung A: 1% wässrige Ameisensäurelösung, Lösung B: Methanol; Gradient: ein linearer Gradient für 90 min von 35% bis 65% für den Anteil der Lösung B; Fließgeschwindigkeit: 5 ml/min; Detektion: Extinktion bei 260 nm. Die eluierten Fraktionen bei 59, 74 und 81 Minuten wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde reduziertem Druck verdampft, und so wurden die Verbindungen SPF-3059-5 (34,2 mg), SPF-3059-1 (64,1 mg) bzw. SPF-3059-2 (12,0 mg) erhalten. Die physikochemischen Eigenschaften dieser so erhaltenen Verbindungen sind wie folgt:
(Verbindung SPF-3059-1)

Aussehen: gelbes Pulver
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS)m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 579,0772
Berechneter Wert: 579,0776
Molekülformel: C₂₈H₁₈O₁₄
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(å): 241(31.600), 315(23.400), 365(16.500)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3400, 1701, 1615, 1570, 1457, 1273
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) ä ppm: 2,28, 2,67, 2,69, 4,6–4,7, 5,02, 6,40, 6,91, 7,91, 8,52, 9,33, 11,1–11,6, 12,8
¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ ppm: 16,5, 17,0, 32,4, 56,2, 65,7, 68,0, 102,3, 104,2, 108,8, 110,1, 118,2, 118,5, 120,6, 122,2, 125,8, 127,7, 132,4, 134,9, 137,6, 139,1, 140,7, 140,8, 150,1, 150,2, 152,2, 153,8, 154,5, 156,3, 167,5, 167,6, 172,7, 172,8, 186,3, 199,1, 202,7, 202,9

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-1 als die folgende Formel [17] (Tautomer) bestimmt: (Chemische Formel 32)
(Verbindung SPF-3059-2)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 533,0710
Berechneter Wert: 533,0721
Molekülformel: C₂₇H₁₆O₁₂
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 209(40.600), 236(42.600), 283(28.500), 323(25.400)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3266, 1678, 1654, 1623, 1562, 1471, 1296
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,53(6H, s), 6,93(1H, s), 6,95(1H, s), 7,47(1H, s), 8,15(1H, s), 8,54(1H, s), 9,38(1H, brs), 9,89 (1H, brs), 10,78(1H, brs), 11,37(1H, brs), 12,68(1H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 29,1, 32,1, 102,3, 103,1, 108,7, 112,5, 113,5, 119,6, 119,8, 120,9, 126,2, 132,4, 133,6, 136,1, 141,7, 144,5, 150,71, 150,74, 152,49, 152,54, 152,7, 154,4, 167,4, 172,9, 173,4, 199,2, 201,2

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-2 als die folgende Formel [18] bestimmt: (Chemische Formel 33)
(Verbindung SPF-3059-5)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS)m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 577,0615
Berechneter Wert: 577,0619
Molekülformel: C₂₈H₁₆O₁₄
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 229(35.800), 284(22.600), 322(21.000)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3260, 1684, 1626, 1567, 1467, 1288
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,53(3H, s), 2,55(3H, s), 6,93(1H, s), 6,96(1H, s), 8,17(1H, s), 8,53(1H, s), 9,5–13,0(6H)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 29,1, 32,1, 102,26, 102,32, 109,9, 112,4, 119,6, 119,8, 120,3, 120,9, 126,3, 132,5, 133,4, 136,2, 141,2, 141,7, 150,4, 150,8, 152,1, 152,68, 152,73, 154,5, 167,4, 167,5, 172,5, 172,9, 199,1, 201,1

Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde die Struktur von SPF-3059-5 als folgende Formel [19] bestimmt: (Chemische Formel 34)
Beispiel 2 (Unterdrückende Wirkung der Verbindungen SPF-3059-1, SPF-3059-2, SPF-3059-5, M162 und A721 der vorliegenden Erfindung auf die das Kollabieren bewirkende Aktivität von Sema3A)
Eine 96-Well-Platte (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), vorab beschichtet mit Polylysin, wurde weiter mit Laminin beschichtet (20 μg/ml an Laminin, für 1 Stunde bei Raumtemperatur). Zu jedem Well wurden 100 μl an Medium (F12-Medium, enthaltend 10% fetales Rinderserum, 20 ng/ml an NGF, 100 Units/ml an Penicillin und 100 μg/ml an Streptomycin) hinzugegeben, und dieses Medium wurde dann mit Dorsalwurzel-Nervenganglien, die aus E7 (embryonaler Tag 7)-Hühnerembryonen ausgeschnitten worden waren, inokuliert, wonach für 16 bis 20 Stunden unter 5% CO₂ und bei 37°C kultiviert wurde. Nachfolgend wurden die Ziel-Verbindungen in variierenden Konzentrationen zu dem Medium hinzugegeben, und 2 Units/ml an Maus-Semaphorin 3A (Sema3A) wurden hinzugegeben, nachdem für 1 Stunde kultiviert worden war. Die Kulturen wurden für eine weitere Stunde inkubiert. Nach dieser Stunde wurde rasch Glutaraldehyd dazu hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 1% herzustellen. Man ließ die Kulturen dann für 15 Minuten auf Raumtemperatur, sodass die Gewebeschnitte fixiert wurden, und die Rate des Zusammenbruchs der Wachstumskegel wurde mikroskopisch betrachtet. Ein Well ohne Zugabe von Sema3A diente als Kontrolle. Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 dargestellt.
Die 1 und 2 zeigen, dass die Rate des Zusammenbruchs der Wachstumskegel mit steigender Konzentration der Verbindung abnahm. Im Gegensatz dazu beeinflussten die Verbindungen alleine die Raten überhaupt nicht. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Verbindungen (SPF-3059-1, SPF-3059-2, SPF-3059-5, M162 und A721) die den Zusammenbruch des Wachstumskegels bewirkenden Aktivitäten von Sema3A in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibieren. Die longitudinale und laterale Achse in den Figuren repräsentieren die Rate des Zusammenbruchs der Wachstumskegel bzw. die Konzentration der Verbindungen.
zeigen die Ergebnisse, wenn Sema3A nach der Zugabe der Verbindungen hinzugegeben wurde, und o☐Δ zeigen diese, wenn Sema3A nicht hinzugeben wurde. Weiterhin wurde die IC₅₀ (μg/ml) des Inhibitors durch ein Verfahren bestimmt, das folgendes umfasste: Berechnung der Rate des Zusammenbruchs von Wachstumskegel mit A(%) der Negativkontrollen (hier wurden weder Verbindungen noch Sema3A hinzu gegeben); nachfolgend Berechnung der Rate des Zusammenbruchs der Wachstumskegel mit (B)% der Positivkontrollen (es wurde Sema3A, jedoch keine der Verbindungen hinzugegeben); und die Konzentration wurde für jede Verbindung aus der folgenden Tabelle ausgewählt, wo die Zusammenbruchsrate des Wachstumskegels (A + B)/2 (%) entsprach, was als IC₅₀-Niveau definiert wird.
Das Folgende sind die Ergebnisse:

Verbindung IC₅₀ (μg/ml)

SPF-3059-1 < 0,1

SPF-3059-2 < 0,1

SPF-3059-5 < 0,1

M162 2,0

A721 5,0
Diese Ergebnisse zeigen, dass SPF-3059-1, SPF-3059-2 und SPF-3059-5 Semaphorin wirkungsvoll inhibieren.
Beispiel 3 (Unterdrückende Wirkung von SPF-3059-1 auf die das Kollabieren bewirkende Aktivität von Sema6C)
Der Versuch wurde in derselben Weise durchgeführt wie in Beispiel 2, mit dem Unterschied, dass Ratten-Semaphorin 6C-AP (Sema6C-AP: ein Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne von Sema6C und aus humaner Plazenta stammender alkalischer Phosphatase) anstelle von Maus-Semaphorin 3A (Sema3A) verwendet wurde, und dass Dorsalwurzelganglien, die aus 8 Tage alten Hühnerembryonen ausgeschnitten wurden, anstelle derjenigen, die aus 7 Tage alten Hühnerembryonen ausgeschnitten wurden, verwendet wurden. Die Rate des Zusammenbruchsbruchs des Wachstumskegels wurde gemessen, wenn Sema6C-AP eine Stunde nach der Zugabe der Verbindung SPF-3059-1 bei verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wurde. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Die longitudinale Achse und die laterale Achse in der Figur stellen die Rate des Zusammenbruchs der Wachstumskegel bzw. die Konzentration von SPF-3059-1 dar, • zeigt das Ergebnis, wenn Sema6C-AP nach der Zugabe von SPF-3059-1 hinzugefügt wurde, und o zeigt das Ergebnis, wenn Sema6C-AP nicht zugegeben wurde. Die 3 zeigt, dass die Rate des Zusammenbruchs der Wachstumskegel mit steigender Konzentration an SPF-3059-1 abnimmt. Im Gegensatz dazu beeinflusste SPF-3059-1 alleine die Rate überhaupt nicht. Diese Ergebnisse zeigten, dass SPF-3059-1 die das Kollabieren des Wachstumskegels bewirkende Aktivität von Sema6C-AP in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibiert.
Beispiel 4 (Suppression der Neuritenauswuchs-inhibierenden Wirkung von Sema3A durch die Inhibitoren)
Ob die Ziel-Verbindungen (SPF-3059-1, M162, A721) eine anhaltende inhibitorische Wirkung auf Sema3A besitzen, wurde durch das Verfahren der Collagen-Gel-Co-Kultur (Neuroprotocols 4, 116, 1994) analysiert, indem man Sema3A-exprimierende COS7-Zellklumpen und 7- oder 8-Tage alte Hühnerembryo-Dorsalwurzelganglien verwendete. Die Sema3A-exprimierenden COS7-Zellklumpen wurden wie folgt erzeugt. 1 pg an Sema3A-Expressionsplasmid wurde in COS7-Zellen eingeführt (100.000 Zellen/35-mm-Kulturplatte), die über Nacht mit dem FuGENE6-Transfektionsreagenz (Roche) kultiviert wurden.
2,5 Stunden nach dem Start der Transfektion wurden die COS7-Zellen durch Trypsinisierung und Zentrifugation gesammelt und in einem Medium von 200 μl resuspendiert. 20 μl der Zellsuspension wurden auf den Deckel der Kulturplatte (Innenseite) gegeben, und dann wurde der Deckel umgedreht, und die Suspension wurde für 20 Stunden kultiviert („Hanging Drop"-Kultur) (Cell 78, 425, 1994). Wenn die Kultur abgeschlossen war, wurden die aggregierten COS7- Zellen (Klumpen) gesammelt und auf einen Durchmesser von 0,5 mm zurechtgestutzt. Die Sema3A-exprimierenden COS7-Zellklumpen und die oben genannten Dorsalwurzelganglien wurden parallel in einem Abstand von 0,5 bis 1 mm in einem 0,2% Collagen-Gel angeordnet, das dann in einem Medium kultiviert wurde, das die zuvor genannten Verbindungen in variablen Konzentrationen enthielt, und zwar für 2 Tage bei 37°C unter 5% CO₂. Es wurde dann rasch Glutaraldehyd hinzugegeben, um die Endkonzentration auf 1% zu bringen. Man beließ die Kulturen dann für 1 Stunde auf Raumtemperatur, sodass die Gewebe fixiert wurden, und das Neuritenauswachsen wurde mikroskopisch betrachtet. Die Ergebnisse finden sich in 4.
Die Konzentrationsgradienten wurden in den oben genannten Collagen-Gelen erzeugt, da Sema3A von dem COS7-Zellklumpen sekretiert wurde, in den die Sema3A-exprimierenden Plasmide eingeführt wurden (dasjenige, das näher zu dem COS7-Zellklumpen war, besaß eine höhere Konzentration). Wenn ein Medium verwendet wurde, das keine Testverbindung enthielt, so waren die Neuriten nicht befähigt, in Richtung zu dem COS7-Zellklumpen mit der hohen Konzentration an Sema3A zu wachsen und wuchsen nur in die entgegengesetzte Richtung. Wenn jedoch die Verbindung SPF-3059-1 oder M162 zu dem Medium hinzugegeben wurde, so wurde Neuritenauswachsen in Richtung zu dem Sema3A-exprimierenden COS7-Zellklumpen hin beobachtet. Ein solches Neuritenauswachsen hin zu dem Sema3A-exprimierenden COS7-Zellklumpen war stärker bemerkbar, wenn die Konzentration der Verbindung höher war, was Konzentrationsabhängigkeit nahe legt. Dieses Ergebnis zeigte die Befähigung von SPF-3059-1 und M162, die Aktivitäten von Sema3A dauerhaft zu inhibieren. Wenn jedoch nur A721 hinzugegeben wurde, so wurde Neuritenauswachsen in Richtung des Sema3A-exprimierenden COS7-Zellklumpens, das bei der Zugabe von SPF-3059-1 und M162 beobachtet wurde, nicht beobachtet. Dies zeigte, dass A721 nicht die anhaltende inhibitorische Aktivität gegenüber Sema3A besaß.
Beispiel 5 (Suppression der das Neuritenauswachsen inhibierenden Wirkung von Sema3A)
Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 4 wurde die Suppression der das Neuritenauswachsen inhibierenden Aktivität für die Verbindungen SPF-3059-1, SPF-3059-2 und SPF-3059-5 analysiert. Wenn die Neuriten in einer vollständig konzentrisch zirkulären Form auswuchsen, genau wie bei den Kontrollgruppen, bei denen COS7-Zellen ohne die Expression von Sema3A verwendet wurden, so wurde dies mit +++ bewertet (starker inhibitorischer Effekt gegenüber Sema3A). Wenn das Auswachsen weitgehend in einer konzentrischen zirkulären Form zu finden war, begleitet von einer geringen Suppression des Auswachsens in Richtung der Sema3A-exprimierenden COS-Zellen, so wurde dies mit ++ bewertet. Wenn das Auswachsen in Richtung der Sema3A exprimierenden COS-Zellen weitgehend unterdrückt wird, um eine Halbmondform zu ergeben, so wurde dies mit + bewertet. Wenn das Auswachsen in Richtung der Sema3A- exprimierenden COS-Zellen gar nicht mehr zu finden war (kein inhibitorischer Effekt gegenüber Sema3A), so wurde dies mit – bewertet. Die ermittelten Ergebnisse sind unten dargestellt.

Verbindung Konzentration der Testverbindungen (μg/ml)

0,5 1,0 2,0

SPF-3059-1 + ++ +++

SPF-3059-2 + ++ +++

SPF-3059-5 + ++ ++

PBS (Kontrolle) – – –
Diese Ergebnisse offenbarten, dass die Verbindungen SPF-3059-1, SPF-3059-2 und SPF-3059-5 in anhaltender Weise die Wirkung von Sema3A inhibierten, das von den Sema3A-exprimierenden COS7-Zellen während der 48-Stunden-Kultur sekretiert wurde.
Beispiel 6 (In vivo wirksame, die Nervenregeneration fördernde Wirkung des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 bei der Axotomie des Riechnervs)
Männliche Wister-Ratten (6,5 Wochen alt) wurden von CHARLES RIVER JAPAN, INC. erworben und in dem zugedachten Aufzuchtraum bei freier Fütterung und Wasseraufnahme gehalten. Es wurde eine Probenlösung hergestellt, indem man SPF-3059-1 mit PBS auf 1 mg/ml verdünnte und in eine osmotische Druckpumpe (Alzet 2004, ALZA Co., USA) einfüllte. Eine mit PBS gefüllte Pumpe wurde als Kontrolle verwendet. Die Probenlösung und dergleichen wurden am Tag vor der Operation hergestellt, und die osmotische Druckpumpe wurde in PBS gebadet und über Nacht auf Raumtemperatur belassen. Genau vor der Operation wurde eine L-Kanüle mit einem Ende eines Siliziumröhrchens verbunden, das mit der Probenlösung und dergleichen gefüllt war, und das andere Ende des Röhrchens wurde mit der Pumpe verbunden. Eine Ratte wurde mit Pentobarbital (50 mg/kg, intraperitoneal injiziert) betäubt, und ihr Kopf wurde auf der stereotaktischen Apparatur fixiert. Die Kopfhaut wurde entlang der Mittellinie eingeschnitten, und die Schädeldecke wurde über dem Bulbus olfactorius geöffnet, um den Bulbus olfactorius (anteriorer Teil) freizulegen. Um eine Axotomie des Riechnervs durchzuführen, wurde ein Messer (ein Rasiermesser wurde auf eine Breite von 1,5 mm zurechtgeschnitten) zwischen dem Bulbus olfactorius und der Siebplatte eingesetzt. Der Riechnerv, der auf den oberen Bulbus olfactorius projiziert, wird durch diese Handlung axotomiert. Die L-Kanüle wurde mit chirurgischem Sofortkleber und Dentalzement an der Schädelöffnung über dem Riechnerv fixiert, sodass sich der Rand der Kanüle in der Nähe des Einschnitts befindet. Der Probenausfluss wurde auf 6 μl ((6 μg)/Tag) eingestellt. Die Pumpe wurde subkutan in den dorsalen Hals eingesetzt, und der Einschnitt wurde vernäht. Danach ließ man das Tier wieder zu sich kommen.
Zwei und drei Wochen nach der Operation wurde die Ratte mit Pentobarbital betäubt, auf den Rücken gelegt, und es wurden 100 μl an 1% WGA-HRP/PBS (TOYOBO) unter Verwendung einer Mikrospritze in die Nasenhöhle injiziert. 24 Stunden nach der HRP-Injektion wurde die Ratte wiederum mit Pentobarbital (50 mg/kg, intraperitoneal injiziert) betäubt, und es wurde ein thorakaler Einschnitt vorgenommen. Nachfolgend wurde PBS vom linken Ventrikel aus perfundiert, und dann wurde PBS mit 200 ml an 4% Paraformaldehyd perfundiert. Der Bulbus olfactorius wurde ausgeschnitten und in PBS eingelegt, das 30% Sucrose enthielt, wurde darin über Nacht bei 4°C gebadet und wurde dann mit Trockeneis eingefroren. Der Bulbus olfactorius wurde auf Trockeneis in eine OTC-Verbindung eingebettet, und es wurden dann mittels eines Kryostaten 30 μm-Schnitte hergestellt. Die Schnitte wurden als Aliquots in Tris-gepufferte Saline (TBS) (eines für je drei Stücke) verteilt. Die Schnitte wurden in TBS gewaschen, wobei 0,1 M TBS mit 0,48% DAB, 0,096% NiCl und 0,036% H₂O dann hinzugegeben wurde und die Reaktion für 15 Minuten stattfand. Nachdem sie in TBS gewaschen worden waren, wurden die Schnitte auf einen Glasobjektträger aufgebracht, und versiegelt, nachdem sie getrocknet waren. Die Schnitte wurden mikroskopisch ausgewertet, und es wurde die HRP-Reaktion des Glomerulus am äußeren Teil des Bulbus olfactorius betrachtet.

Die Regeneration der Riechnerven wurde quantitativ bestimmt, indem man beobachtete, in welchem horizontalen Schnitt des Bulbus olfactorius der HRP-positive Glomerulus aus dem Vertex hervortrat. Die Ergebnisse sind in 5 und Tabelle 1 dargestellt. Alle Ratten außer derjenigen, die in Woche 2 an Erstickung bei der HRP-Injektion starb, wurden für die Bestimmung verwendet. Wenn SPF-3059-1 injiziert wurde, wurden HRP-positive Schnitte in oberflächlicheren Stücken gefunden als bei den Kontrollen, die sowohl in Woche 2 als auch in Woche 3 Injektionen von PBS erhalten hatten. Die signifikanten Unterschiede wurden bei der mit SPF-3059-1 injizierten Gruppe gegenüber der Gruppe mit PBS-Injektion beurteilt, und die HRP-Positiven wurden in oberflächlicheren Schnitten gefunden als bei der mit PBS-Injektion versehenen Gruppe in Woche 3. Diese Ergebnisse zeigen, dass SPF-3059-1 eine merkliche, die Nervenregeneration fördernde Wirkung in den adulten Rattenmodellen der Riechnerv-Axotomie besitzt. Tabelle 1

Mittel	Positiver Schnitt Nr. (mit Schnitt vom Vertex, Durchschnittswert ± SE)	Anzahl der Ratten
Woche 2: PBS	11,8 ± 0,3	4
Woche 2: SPF3059-1	8,3 ± 1,9	3
Woche 3: PBS	8,0 ± 1,4	4
Woche 3: SPF3059-1	5,2 ± 1,9*	5
*:p < 0,05 vs. PBS Student t-Test

Beispiel 7 (In vivo Nerven-Regenerations-fördernde Wirkung der Semaphorin-Inhibitoren M162 und A721 bei der Axotomie des Riechnervs)
Der gleiche Versuch wie in Beispiel 6 wurde mit M162 und A721 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass M162 die in vivo vorliegende fördernde Wirkung auf die Nervenregeneration besitzt, A721 jedoch nicht.
Beispiel 8 (In vivo Nerven-Regenerations-fördernde Wirkung des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 beim Abquetschen des Ischiasnervs)
Männliche Wister-Ratten wurden 7 Wochen alt erworben (CHARLES RIVER JAPAN, INC.) und bei Licht- und Dunkel-Zyklen von 12 Stunden gehalten. Die Ratten hatten freien Zugang zu festem Futter (CLEA Japan, Inc., CE2) und Wasser und wurden nach etwa einer Woche vorbereitender Haltung in dem Versuch verwendet. Unter Pentobarbital-Betäubung wurde der Ischiasnerv an den Oberschenkeln der Ratten freigelegt, für 30 Sekunden mit Pinzetten von 5 mm Breite festgeklemmt und dadurch gequetscht. Die Quetschstelle wurde mit 10-0-Nylonfaden markiert. SPF-3059-1 wurde mit 8.3 μg/ml in PBS gelöst und wurde an der Stelle der Läsion an 14 aufeinander folgenden Tagen mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 μg/Tag lokal verabreicht, wobei hierfür eine osmotische Druckpumpe (2ML2, 5 μl/h, Alzet) verwendet wurde. Den Kontrollen wurde PBS verabreicht. An Tag 14 der Verabreichung wurden die Ischiasnerven ausgeschnitten und an den Gebieten distal zur Quetschstelle (den Positionen der Markierung) in der Größenordnung von 2 mm, 6 mm und 10 mm zurechtgestutzt. Die geschnittenen Ischiasnerven wurden für einen Tag und eine Nacht in 2,5% Glutaraldehyd/0,1 M Phosphatpuffer fixiert. Nachdem sie fixiert waren, wurden die Nerven mit Alkohol dehydriert und in Epoxyharz eingebettet. Es wurden Transversalschnitte der Ischiasnerven hergestellt und mit Toluidinblau angefärbt, und ihre Photographien wurden unter einem optischen Mikroskop aufgenommen, um die Anzahl der myelinisierten Fasern zu bestimmen. Nachdem die Areale der Ischiasnerven ausgemessen waren, wurde die myelinisierte Faserdichte berechnet, indem man jedes Areal durch die Anzahl der myelinisierten Fasern teilte. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Bei der Gruppe mit der Injektion von SPF-3059-1 war die myelinisierte Faserdichte im Vergleich zu der Gruppe mit PBS-Injektion in den distalen Arealen 2 mm und 6 mm von der Quetschstelle stärker erhöht. Dieses Ergebnis zeigt, dass SPF-3059-1 einen fördernden Effekt auf die Regeneration gequetschter Ischiasnerven besitzt.
Beispiel 9 (Wirkung des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 auf die Zellproliferation)
COS7-Zellen wurden auf einer 96-Well-Platte (Medium: 100 μl/Well) mit 10.000 Zellen pro Well ausgesät. Zur gleichen Zeit wurde SPF-3059-1 mit verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben, und die Zellen wurden für zwei Tage in Gegenwart von 5% CO₂ bei 37°C kultiviert. Zu jedem Well wurden dann 10 μl an MTT-Lösung mit 5 mg/ml hinzugegeben und für eine weitere Stunde kultiviert. Nachfolgend wurde der Kulturüberstand entfernt und Formazan (ein MTT-Derivat, produziert in lebensfähigen Zellen), das sich in diesen Zellen angereichert hatte, wurde durch die Zugabe von 50 μl DMSO gelöst, und es wurde dann die Extinktion bei 570 nm gemessen, um die Proliferation der COS7-Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Wie in 8 gezeigt, war das Niveau der Zellproliferation in der Kultur, die in Gegenwart von SPF-3059-1 durchgeführt wurde, ähnlich dem Niveau, das in Abwesenheit von SPF-3059-1 beobachtet wurde. Dieses Ergebnis zeigt, dass SPF-3059-1 keine unterdrückende Wirkung auf die Zellproliferation hat. Die longitudinale Achse und die laterale Achse in der Figur zeigen die Zellproliferation bzw. die Konzentration von SPF-3059-1. Darüber hinaus wurde bei jedem Balken die Standardabweichung (n = 4) hinzugefügt.
Beispiel 10 (Wirkungen der Semaphorin-Inhibitoren SPF-3059-1, SPF-3059-2 und SPF-3059-5 auf die Zellproliferation)
Die gleiche Wirkung auf die Zellproliferation wie in Beispiel 9 wurde für die Verbindungen SPF-3059-1, SPF-3059-2 und SPF-3059-5 untersucht. Die Wells mit diesen Verbindungen dienten als Proben, die Wells mit PBS dienten als Kontrollen, und die Wells, bei denen das Experiment durchgeführt wurde, ohne die Zellen hinzu zu geben, dienten als Blindwert. IC₅₀ (μg/ml), die inhibitorische Rate für die Zellproliferation, wurde bestimmt, wobei diese gemäß der unten gezeigten Gleichung berechnet wird. Inhibitorische Rate im Bezug auf die Zellproliferation (%) = (1 – (Extinktion eines Probenwells – Extinktion des Blindwells)/(Extinktion des Kontrollwells – Extinktion des Blindwells)) × 100
Die bestimmten Ergebnisse im Hinblick auf die inhibitorische Rate gegenüber der Zellproliferation der oben genannten Verbindungen sind wie folgt, was zeigt, dass keine Zytotoxizität bei dem 1000- bis 3000-fachen oder sogar höheren Konzentrationen, bei denen Semaphorin-inhibitorische Aktivitäten beobachtet werden können, beobachtet wurde.

Verbindung IC₅₀ (μg/ml)

SPF-3059-1 > 300

SPF-3059-2 > 100

SPF-3059-5 > 300
Beispiel 11 (Inhibitorische Aktivität im Bezug auf die Sema3A-Rezeptor-Bindung)
Ob SPF-3059-1 die Bindung von Sema3A und Neuropilin-1, das eine Komponente des Sema3A-Rezeptorkomplexes darstellt, inhibiert, wurde in dem Rezeptor-Bindungsexperiment bestimmt. Neuropilin-1 und Plexin A1 sind derzeit als aufbauende Bestandteile von Sema3A-Rezeptoren bekannt. Jedoch ist hauptsächlich für Neuropilin-1 bekannt, dass es zu der Sema3A-Bindung beiträgt. Sema3A, fusioniert mit alkalischer Phosphatase (vom Menschen abgeleitet, hitzebeständig) (Sema3A-AP) wurde als Ligand bei dem Rezeptor-Bindungsversuch verwendet, und die an den Rezeptor gebundene Menge wurde mittels der alkalischen Phosphatase-Aktivität als einem Index detektiert. Es wurde von der Maus abgeleitetes Sema3A verwendet. Es wurde ein rekombinantes Gen erzeugt, bei dem alkalische Phosphatase an der 758. Aminosäure an die C-terminale Seite von Sema3A fusioniert wurde. Dieses rekombinante Gen wurde dann in eine COS7-Zelle eingeführt, wo es exprimiert und sekretiert wurde, und Sema3A-AP wurde präpariert.
Das Rezeptor-Binde-Experiment wurde durchgeführt wie unten beschrieben. Das Neuropilin-1 exprimierende Plasmid (pUCSRα-Neuropilin-1) wurde in COS7-Zellen eingeführt und für 24 Stunden kultiviert. Diese Zellen exprimieren Neuropilin-1 auf der Zelloberfläche. Die Zellen wurden einmal in HBH-Puffer-Lösung (Hank's balanced Salzlösung mit 20 mM HEPES, pH 7,2, und 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin) gewaschen, und dann wurde gleichzeitig HBH-Pufferlösung mit Sema3A-AP und mit SPF-3059-1 in verschiedenen Konzentrationen (0 bis 10 μg/ml) hinzugegeben. Nach Stehenlassen für eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln wurde Sema3A-AP an Neuropilin-1-exprimierende Zellen gebunden, wonach der Überstand entfernt wurde. Nachfolgend wurden die Zellen 6-mal in HBH-Pufferlösung gewaschen, um das überschüssige Sema3A-AP zu entfernen. Danach wurde das an die Zellen gebundene Sema3A-AP mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% Triton X-100-Lösung solubilisiert (Zellextrakt). Die unlöslichen Materialien in dem Zellextrakt wurden durch Zentrifugation entfernt, und dann wurde die endogene alkalische Phosphatase der Zelle als solche durch die Behandlung für eine Stunde bei 65°C inaktiviert. Es wurde die von Sema3A-AP stammende alkalische Phosphatase-Aktivität in dem Zellextrakt (Bindemenge von Sema3A-AP) bestimmt. Ein Aliquot des Zellextrakts wurde mit SEAP-Puffer (1M Diethanolamin, 0,5 mM MgCl₂, 10 mM L-Homoarginin) und einem fluoreszenten Substrat (10 mM p-Nitrophenylphosphat) gemischt und bei 37°C warm gehalten. Die Lösung wurde dann auf ihre Extinktion bei 405 nm hin gemessen (p-Nitrophenol: erzeugt aus p-Nitrophenylphosphat mit alkalischer Phosphatase). Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von Sema3A-AP bei steigender Konzentration von SPF-3059-1 in einer konzentrationsabhängigen Weise abnimmt. Dies zeigt klar, dass SPF-3059-1 die Sema3A-Aktivität inhibiert, da die Verbindung die Bindung von Sema3A an seinen Rezeptor inhibiert.
Beispiel 12 (Inhibition der Kollabieren bewirkenden Aktivität durch den Kontakt von Sema3A und dem Inhibitor)
Sema3A wurde mit SPF-3059-1 gemischt, dessen Konzentration hoch genug war, um inhibitorische Aktivität zu zeigen (0,25 μg/ml) (Vormix-Probe). Danach wurde die Vormix-Probe zu der Kulturlösung der Dorsalwurzelganglien hinzugegeben, um zu untersuchen, ob die den Wachstumskegel zum Einsturz bringende Aktivität von Sema3A inhibiert wurde. Die Menge an Vormix-Probe betrug ein Viertel der Menge der Kulturlösung. Dies bedeutet, dass die SPF-3059-1-Konzentration von 0,25 μg/ml auf 0,05 μg/ml (auf 1/5) verdünnt wird, wenn die Vormix-Probe zu der Kulturlösung der Dorsalwurzelganglien hinzugegeben wird. Dies ist die Konzentration, bei der die inhibitorische Aktivität nicht beobachtet werden wird, wenn SPF-3059-1 und Sema3A unabhängig voneinander zugegeben werden. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. 10 zeigt, dass die Sema3A-Aktivität inhibiert wurde, wenn die Vormix-Probe zu der Kulturlösung der Dorsalwurzelganglien hinzugegeben wurde, trotz der Tatsache, dass die Endkonzentration von SPF-3059-1 0,05 μg/ml betrug (Konzentration der nicht-inhibitorischen Aktivität). Dies bedeutet, dass die Aktivität von Sema3A in dem Moment verloren ging, als Sema3A und SPF-3059-1 miteinander in Kontakt traten. Ausgehend von diesem Ergebnis wird angenommen, dass das Zielmolekül von SPF-3059-1 Sema3A ist.
Beispiel 13 (In vivo-Nervenregenerations-fördernde Wirkung des Semaphorin-Inhibitors SPF-3059-1 bei der Transaktion des Spinalnervs (Cerebralkortex-Rückenmarkstrakt)
Männliche Wister-Ratten (10 Wochen alt) wurden von Charles River Japan, Inc. erworben und in einem zugedachten Aufzuchtbehälter bei freiem Futter und freier Wasseraufnahme gehalten. Nach etwa einer Woche der vorbereitenden Haltung wurden sie in dem Experiment verwendet. SPF-3059-1 wurde mit PBS mit 0,1 mg/ml angesetzt. PBS wurde als Kontrolle verwendet. Das Mittel wurde in eine osmotische Druckpumpe eingefüllt (Alzet, Modell 2004, Dosierung für vier Wochen, Fließgeschwindigkeit 0,25 μl/h). Eine Kanüle, die mit der Probenlösung etc. gefüllt war, wurde mit der Pumpe verbunden und übernacht bei Raumtemperatur in Saline präinkubiert.
Eine Ratte erhielt intraperitoneale Injektionen von Pentobarbital (50 mg/kg). Haut und Muskeln in der dorsal-thorakalen Rückenmarksregion der betäubten Ratte wurden eingeschnitten, und die Wirbel T8-T12 wurden freigelegt. Die Laminektomie erfolgte unter dem Mikroskop für den Thorakalwirbel T11. Ein Paar ophthalmologischer Scheren, die an einem Manipulator befestigt waren, wurden eingestochen und quer durch die Mittellinie in einer Tiefe von 1,5 mm von der Oberfläche der Dura mater (harte Rückenmarkshaut) eingesetzt, und es wurde der Cerebralkortex-Rückenmarksstrang eingeschnitten und durchtrennt. Die Wirbelöffnung wurde mit einem Schwämmchen aufgefüllt. Die Kanüle wurden vom Wirbel T9 aus angebracht, der mit einem chirurgischen Bohrer perforiert wurde, um die Dura mater freizulegen. Der Teil der Dura mater, in den die Kanüle eingesetzt werden sollte, wurde mit einer Injektionsnadel perforiert, und das mit der Pumpe verbundene Siliziumröhrchen wurde darin eingesetzt. Es wurde sichergestellt, dass der Rand der Kanüle den Bereich der Rückenmarksverletzung an T11 erreichte. Dann wurde ein Schwämmchen in die Wirbelöffnung gefüllt, wo dann ein Tropfen an chirurgischem Sofortkleber infiltriert wurde. Die Kanüle wurde mit Nahtmaterial an dem angrenzenden Muskel fixiert, um ein Wegrutschen zu verhindern. Nach Vernähen des operierten Muskels wurde die eingeschnittene Haut mit Klammern aus Nahtmaterial zusammen genäht. Die Probe wurde für vier aufeinander folgende Wochen verabreicht, mit einer Fließgeschwindigkeit der Probe von 0,6 μg/Tag.
Zwei Wochen nach der Operation wurde die Ratte mit Pentobarbital (50 mg/kg, intraperitoneal injiziert) betäubt, wobei der Kopf mit einer stereotaktischen Apparatur fixiert wurde. Die Kopfhaut wurde entlang der Mittellinie eingeschnitten, und die Schädeldecke wurde mit einem Bohrer perforiert, um das Gehirn freizulegen. 10% DBA (Dextran-Biotinyliertes-Amin) wurde mit einer Mikrospritze mit je 0,1 μl an 18 Punkten in der Cerebralkortex-Motorregion injiziert, wonach der Einschnitt vernäht wurde und man das Tier wieder zu sich kommen ließ. DBA wird vom Nerven-Nukleus zu den Nerven des Rückenmarksstrangs transportiert. Nach zwei Wochen der Haltung wurde die Ratte wiederum mit Pentobarbital betäubt, ihre Thoraxregion wurde eingeschnitten, und es wurde dann PBS vom linken Ventrikel aus perfundiert. Nachfolgend wurde PBS mit 200 ml an 4% Paraformaldehyd perfundiert. Das Rückenmark (einschließlich des verletzten Teils) wurde entnommen und über Nacht in der Lösung fixiert, und es wurde dann in PBS mit 30% Sucrose eingebracht und darin bei 4°C gebadet. Das Rückenmark wurde in die OTC-Verbindung eingebettet und auf Trockeneis gefroren. Es wurden mit einem Kryostaten 30 μm-Schnitte hergestellt und in Tris-Pufferlösung (TBS) aliquotiert. Die Schnitte wurden in TBS gewaschen und für zwei Stunden in ABC-Reaktionslösung gebadet. Nachdem die Schnitte gewaschen worden waren, wurden sie mit DBA-Substrat visualisiert, und die Präparationen wurden erstellt. Die regenerierten Nervenfasern in dem verletzten Gebiet wurden mikroskopisch betrachtet. 11 zeigt das Ergebnis der Injektion von SPF-3059-1 der vorliegenden Erfindung, und 12 zeigt das Ergebnis der PBS-Injektion als Kontrolle. Die 11A, B und C sowie 12A, B und C zeigen serielle Schnitte im Proximalbereich der verletzten Region. Die 11D und 12D sind Großabbildungen von 11B bzw. 12B. Wenn SPF-3059-1 verabreicht wurde, so wurde die Zurückhaltung von DBA (dunkle Pfeilspitze) im rostralen Teil zu der Verletzungsstelle beobachtet, wie in 11D gezeigt. Es wurden viele DBA-positive Fasern beobachtet, die sich vom Gebiet der Zurückhaltung bis hin zum Caudalbereich entlang der verletzten Region erstrecken (helle Pfeilspitze), und regenerierte Nervenfasern, die sich unter Umgehung der Einschnittstelle ausstreckten, wur den häufig beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde, wenn PBS verabreicht wurde, DBA-Zurückhaltung (dunkle Pfeilspitze) im rostralen Teil zu der Verletzungsstelle beobachtet, wie in 12D gezeigt. Dabei wurden einige wenige DBA-positive Fasern an der caudalen Seite entlang der verletzten Region beobachtet (helle Pfeilspitze), und es wurden nur einige wenige Nervenfasern beobachtet. Diese Ergebnisse offenbaren, dass SPF-3059-1 eine die Nervenregeneration fördernde Wirkung im Rückenmarksverletzungsmodell adulter Ratten besitzt.
Beispiel 14 (Produktion der neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung)
Ein 10 ml-Medium, enthaltend 2% Glukose, 5% Sucrose, 2% Baumwollsamenpulver, 0,1% Natriumnitrat, 0,1% L-Histidin, 0,05% Dikaliumphoshat, 0,07% Kaliumchlorid und 0,0014% Magnesiumsulfat-Heptahydrat, mit einem auf 7,0 eingestellten pH-Wert, wurde in einen Erlenmeyerkolben von 50 ml Volumen pipettiert und in einem Autoklaven sterilisiert. Eine Abstrichmenge („loopful") von Penicillium sp. SPF-3059 (FERM BP-7663) auf Schrägkultur wurde in diesem Medium angeimpft und unter Schütteln bei 180 rpm bei 27°C für 4 Tage als Vorkultur kultiviert. Ein Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie das oben genannte Medium wurde mit jeweils 125 ml in fünf Erlenmeyerkolben von 500 ml Volumen pipettiert und in einem Autoklaven sterilisiert. Nachfolgend wurde die oben genannte Vorkulturlösung mit je 4 ml zu den fünf Kolben hinzu gegeben und unter Schütteln bei 180 rpm für 4 Tage bei 27°C kultiviert. 30 Liter an Medium, enthaltend 1,43% Glukose, 3,57% Sucrose, 1,43% Baumwollsamenpulver, 0,07% Natriumnitrat, 0,07% L-Histidin, 0,036% Dikaliumphosphat, 0,05% Kaliumchlorid, 0,001% Magnesiumsulfat-Heptahydrat und 0,01% Adekanol LG-295S (Schaumhemmer von Asahi Denka Co., Ltd), mit einem auf 7,0 eingestellten pH-Wert, in einem Gefäß-Fermenter („Jar Fermentor”) von 50 Litern Volumen, wurden unter Hochdruckdampf (121°C, 20 min) sterilisiert. Dann wurden 500 ml der oben genannten Kulturbrühe zu dem Fermenter hinzugegeben und für 9 Tage mit einer Bewegung von 400 rpm und einer Belüftung von 15 Litern/min bei 27°C kultiviert.
Nachdem die Kultur abgeschlossen war, wurde die Kulturbrühe bei 10.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, um den Überstand und das Myzel zu trennen. Die Überstandsfraktion wurde zweimal mit 20 l an Ethylacetat:Ameisensäure (99:1) extrahiert. Die Fraktion des Pilzmyzels wurde mit 30 Litern an Aceton extrahiert, dann filtriert und konzentriert. Nach der Konzentrierung in wässrige Lösung erfolgte eine Extraktion mit 10 Liter an Ethylacetat:Ameisensäure (99:1). Beide Extrakte wurden dann gemischt und unter reduziertem Druck konzentriert, um 224 g an Rohextrakt zu erhalten. 100 g dieses Rohextrakts wurde dann in 500 ml Methanol gelöst und auf eine Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex^TM LH-20 (Amersham Biosciences K. K.) appliziert und mit Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft, um 48,8 g an öliger Substanz zu erhalten. Diese Substanz wurde dann in 400 ml Methanol gelöst und auf eine Säulenchromatographie unter Verwendung von TSKgel TOVOPEARL HW-40F (Tosoh Corporation) appliziert und mit Me thanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft, um 21,8 g an Rohsubstanz zu erhalten. Diese Rohsubstanz wurde dann in Aliquots von 200 mg in 2 ml an DMSO gelöst und auf eine präparative Reversphasen-HPLC appliziert. Die Bedingungen der präparativen Reversphasen-HPLC waren: Säule: Wakopak^® Wakosil-II5C18HGprep (Verbindung von 5 i.d. × 10 cm und 5 i.d. × 25 cm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Lösung A: 1% wässrige Ameisensäurelösung, Lösung B: Methanol; Gradient: ein linearer Gradient für zwei Stunden von 45% bis 75% für den Anteil der Lösung B; Fließgeschwindigkeit: 25 ml/min; Detektion: Extinktion bei 260 nm. Das Eluat wurde nach 1 Minute aufgetrennt.

Die eluierten Fraktionen gemäß obiger Beschreibung wurden mittels analytischer HPLC analysiert. Die Bedingungen der analytischen HPLC waren: Säule: Wakopak^® Wakosil-II5C18RS (4,6 × 150 mm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); Lösung A: 1% wässrige Ameisensäurelösung, Lösung B: Methanol; Gradient: ein linearer Gradient für 71,1 min von 20% bis 67% für den Anteil von Lösung B; Fließgeschwindigkeit: 1,3 ml/min; Detektion: Extinktion bei 260 nm. Die Fraktionen, die die Zielverbindung enthalten, wurden gesammelt, mit der Retentionszeit bei dieser analytischen HPLC als dem Index, sowie unter Verdampfen des Lösungsmittels unter reduziertem Druck. Das resultierende Material wurde wiederum auf die präparative HPLC aufgetragen und in einer ähnlichen Weise gereinigt wie oben, und es wurde weiterhin unter Verwendung von TSKgel TOYOPEARL HW-40F (Tosoh Corporation) auf eine Säulenchromatographie appliziert und in ähnlicher Weise gereinigt wie oben. Die Fraktionen, die die Zielverbindung enthalten, wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft. Dadurch wurden die unten beschriebenen gereinigten Verbindungen erhalten.

Verbindung	Erhaltene Menge (mg)	Retentionszeit bei der analytischen HPLC (min)
SPF-3059-12	6,2	34,4
SPF-3059-24	28,0	34,5
SPF-3059-4	10,2	36,0
SPF-3059-25	4,0	39,3
SPF-3059-34	2,9	40,8
SPF-3059-6	34,9	45,6
SPF-3059-27	17,4	46,1
SPF-3059-26	6,2	46,5
SPF-3059-28	11,8	46,6
SPF-3059-7	13,0	47,0
SPF-3059-39	2,8	49,95
SPF-3059-37	4,0	50,0
SPF-3059-3	118,2	50,1
SPF-3059-35	11,0	51,5
SPF-3059-9	100,9	52,7
SPF-3059-29	45,6	54,0
SPF-3059-36	3,7	57,8
SPF-3059-30	23,5	63,0

Die physikochemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindungen sind wie folgt:
(SPF-3059-3)

Aussehen: gelbes Pulver
Molekulargewicht: 534
Molekülformel: C₂₇H₁₈O₁₂
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z (positiv): 535(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z (negativ): 533(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS)m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 535,0905
Berechneter Wert: 535,0877 (C₂₇H₁₉O₁₂)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm (ε): 242(30.800), 317(22.700), 367(14.000)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3356, 1700, 1652, 1610, 1515, 1475, 1283
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,28, 2,29, 2,68, 2,69, 4,62, 4,62, 4,64, 4,72, 5,03, 6,38, 6,40, 6,90, 6,91, 7,44, 7,98, 8,54, 8,90–11,10, 12,70
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 16,5, 17,0, 32,3, 32,4, 56,2, 65,8, 68,0, 103,0, 104,2, 108,7, 108,8, 109,4, 113,5, 118,2, 118,6, 122,2, 125,7, 127,5, 129,8, 132,0, 132,6, 134,8, 137,6, 137,9, 138,8, 144,3, 150,5, 150,6, 152,0, 152,6, 154,2, 154,5, 155,5, 156,3, 167,6, 167,7, 173,4, 183,5, 186,2, 199,2, 202,8, 203,0
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-3 als die folgende Formel [20] bestimmt (Tautomer). [Chemische Formel 35]
(SPF-3059-4)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekulargewicht: 560
Molekülformel: C₂₈H₁₆O₁₃
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 561(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 559(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z (M + H)⁺:
Gemessener Wert: 561,0667
Berechneter Wert: 561,0670 (C₂₈H₁₇O₁₃)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm (ε): 221(35.600), 250(38.100), 276sh(25.800), 323(24.300)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3412, 1665, 1619, 1563, 1465, 1427, 1263
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,53(3H, s), 2,56(3H, s), 6,84(1H, d, 2,1), 6,95(1H, s), 6,96(1H, d, 2,1), 8,17(1H, s), 8,52(1H, s), 10,10–11,40(3H, brs), 12,71(1H, brs), 13,26(1H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 29,2, 32,1, 102,3, 103,2, 110,1, 112,4, 112,8, 119,6, 120,3, 120,8, 126,3, 133,1, 133,4, 136,7, 137,5, 141,7, 150,8, 152,3, 152,7, 152,8, 157,2, 163,9, 167,4, 169,3, 172,2, 172,9, 199,3, 201,0
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-4 als die folgende Formel [21] bestimmt. [Chemische Formel 36]
(SPF-3059-6)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekulargewicht: 592
Molekülformel: C₂₉H₂₀O₁₄
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 593(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 591(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS)m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 593,0949
Berechneter Wert: 593,0932 (C₂₉H₂₁O₁₄)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm (ε): 210sh(45.900), 223(47.700), 317(25.800), 358sh(14.700)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3418, 1701, 1617, 1565, 1465, 1301
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,22(3H, s), 2,72(3H, s), 3,11(3H, s), 3,98(2H, brs), 6,78(1H, s), 6,88(1H, s), 8,21(1H, s), 9,00–13,00(6H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 16,8, 32,4, 57,8, 64,4, 102,1, 102,3, 109,3, 111,9, 118,4, 118,6, 119,1, 119,6, 127,6, 128,2, 131,6, 139,0, 141,6, 142,1, 150,7(2C), 151,9, 152,9, 155,5, 162,0, 167,8, 167,9, 172,4, 174,6, 202,6
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-6 als die folgende Formel [22] bestimmt. [Chemische Formel 37]
(SPF-3059-7)

Aussehen: gelbes Pulver
Molekulargewicht: 562
Molekülformel: C₂₈H₁₈O₁₃
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 563(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 561(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS)m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 563,0843
Berechneter Wert: 563,0826 (C₂₈H₁₉O₁₃)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 242(31.600), 312(24.500), 385(10.200)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3424, 1701, 1603, 1504, 1448, 1420, 1270
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,28, 2,29, 2,68, 2,69, 4,62, 4,67, 4,71, 5,04, 6,38, 6,41, 6,81, 6,92, 6,93, 7,95, 8,52, 9,33, 11,22, 11,35, 12,93
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 16,6, 17,0, 32,3, 32,4, 56,2, 65,7, 67,9, 102,3, 102,8, 103,1, 104,3, 108,7, 109,3, 110,1, 112,5, 112,6, 118,5, 118,7, 121,6, 122,1, 125,9, 127,6, 130,1, 131,9, 132,4, 135,3, 137,4, 137,6, 138,9, 139,7, 151,9, 152,3, 154,5, 155,5, 156,2, 157,1, 163,6, 167,6, 169,3, 172,7, 172,8, 183,7, 186,2, 199,1, 202,5, 202,7
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-7 als die folgende Formel [23] bestimmt (Tautomer). [Chemische Formel 38]
(SPF-3059-9)

Aussehen: gelbes Pulver
Molekulargewicht: 534
Molekülformel: C₂₇H₁₈O₁₂
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 535(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 533(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS)m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 535,0876
Berechneter Wert: 535,0877 (C₂₇H₁₉O₁₂)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 207(47.600), 243(41.800), 314(34.000), 369(23.000)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3444, 1702, 1614, 1474, 1289
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,29, 2,31, 2,67, 2,70, 4,60, 4,65, 4,69, 5,97, 6,32, 6,35, 6,89, 6,90, 7,03, 7,17, 7,94, 8,50, 12,50, 9,20–10,80
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 16,6, 17,1, 32,3, 32,4, 56,2, 65,9, 68,2, 102,3, 103,0, 103,2, 103,9, 109,9, 110,0, 110,4, 110,5, 111,9, 112,2, 118,2, 118,6, 120,5, 125,7, 127,7, 130,0, 131,9, 132,4, 134,8, 138,2, 139,1, 140,9, 141,1, 141,5, 150,2, 150,3, 151,7, 152,2, 154,1, 154,6, 154,9, 155,8, 156,6, 167,5, 172,6, 172,7, 183,5, 187,2, 199,3, 202,7, 202,9
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-9 als die folgende Formel [24] bestimmt (Tautomer). [Chemische Formel 39]
(SPF-3059-12)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekulargewicht: 560
Molekülformel: C₂₈H₁₆O₁₃
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 561(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 559(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS)m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 561,0680
Berechneter Wert: 561,0670 (C₂₈H₁₇O₁₃)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 232(37.400), 250sh(34.800), 285(28.000), 308sh(23.200), 360sh(9.000)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3080, 1698, 1608, 1468, 1291
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,54,(3H, s), 2,55(3H, s), 6,82(1H, d, 2,1), 6,87(1H, s), 6,95(1H, d, 2,1), 8,22(1H, s), 8,55(1H, s), 9,50– 13,50 (5H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 29,1, 32,2, 102,1, 103,0, 109,4, 112,1, 113,5, 119,8, 120,0, 121,7, 126,6, 132,0, 133,3, 135,9, 136,7, 141,7, 150,6, 152,1, 153,0, 155,4, 157,6, 162,4, 167,4, 167,6, 172,2, 172,9, 199,1, 201,1
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-12 als die folgende Formel [25] bestimmt. [Chemische Formel 40]
(SPF-3059-24)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekulargewicht: 532
Molekülformel: C₂₇H₁₆O₁₂
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 533(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 531(M – H)^– Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS)m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 531,0621
Berechneter Wert: 531,0564 (C₂₇H₁₇O₁₂)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 212(36.900), 229sh(34.500), 283(26.300), 323(21.700)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3447, 1697, 1629, 1578, 1470, 1290
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,52(3H, s), 2,54(3H, s), 6,92(1H, s), 6,93(1H, s), 7,28(1H, s), 8,13(1H, s), 8,54(1H, s), 9,50–13,00(5H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 29,1, 32,3, 102,3, 102,9, 107,9, 110,0, 115,8, 119,8, 120,4, 120,7, 126,5, 133,0, 133,3, 136,0, 141,2, 145,0, 150,4, 151,1, 152,2, 152,9, 153,0, 154,3, 167,5, 172,6, 173,6, 199,1, 201,1
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-24 als die folgende Formel [26] bestimmt. [Chemische Formel 41]
(SPF-3059-25)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekülformel: C₂₇H₁₆O₁₁
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 517(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 515(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 517,0778
Berechneter Wert: 517,0771 (C₂₇H₁₇O₁₁)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 215(35.000), 253(35.100), 276sh(25.200), 323(23.400)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3417, 1691, 1625, 1471, 1293
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,54(6H, s), 6,82(1H, brs), 6,92(2H, brs), 7,27(1H, s), 8,14(1H, s), 8,53(1H, s), 9,5–14,0(4H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 29,2, 32,3, 102,9, 103,0, 107,8, 109,9, 113,0, 115,7, 120,4, 120,6, 126,4, 133,3, 133,4, 136,4(2C), 145,0, 151,2, 152,3, 152,98, 153,01, 157,3, 164,2, 169,4, 172,6, 173,6, 199,2, 201,0
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-25 als die folgende Formel [27] bestimmt. [Chemische Formel 42]
(SPF-3059-26)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekulargewicht: 488
Molekülformel: C₂₆H₁₆O₁₀
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z (positiv): 489(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 487(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 489,0823
Berechneter Wert: 489,0822 (C₂₆H₁₇O₁₀)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 212(31.500), 235(30.900), 284(23.900), 324(19.500)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3454, 1694, 1625, 1517, 1471, 1293
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm:
2,53(3H, s), 2,54(3H, s), 6,91(1H, s), 6,92(1H, s), 7,27(1H, s), 7,47(1H, s), 8,11(1H, s), 8,57(1H, s),
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 29,1, 32,2, 102,9, 103,0, 107,9, 108,5, 113,3, 115,7, 119,8, 120,7, 126,3, 132,7, 133,5, 135,8, 144,6, 145,0, 150,8, 151,1, 152,5, 152,9(2C), 154,7, 173,3, 173,6, 199,1, 201,2
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-26 als die folgende Formel [28] bestimmt. [Chemische Formel 43]
(SPF-3059-27)

Aussehen: gelbes Pulver
Molekulargewicht: 642
Molekülformel: C₃₃H₂₂O₁₄
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 643(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 641(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 643,1088
Berechneter Wert: 643,1089 (C₃₃H₂₃O₁₄)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 213(46.100), 246(46.600), 287(31.700), 354(19.900)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3400, 1694, 1640, 1604, 1468, 1290
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,41(3H, s), 2,45(3H, s), 2,67(3H, s), 6,34(1H, s), 6,63(1H, s), 6,90(1H, s), 7,48 (1H, d, 2,1), 7,97(1H, d, 2,1), 8,49(1H, s), 11,9(1H, brs), 12,5(1H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 27,4, 30,2, 32,7, 102,3, 102,8, 109,8, 111,8, 117,4, 119,6, 119,7, 120,3, 126,7, 127,5, 128,4, 133,0, 133,4, 135,1, 135,8, 138,6, 139,9, 141,3, 150,5, 151,7, 154,6, 155,8, 157,5, 158,3, 167,5, 172,5, 196,3, 200,0, 201,6, 205,3
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-27 als die folgende Formel [29] bestimmt. [Chemische Formel 44]
(SPF-3059-28)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekulargewicht: 532
Molekülformel: C₂₇H₁₆O₁₂
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 533(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 531(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 533,0735
Berechneter Wert: 533,0721 (C₂₇H₁₇O₁₂)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 217(35.300), 236(34.100), 309(26.100)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3502, 3096, 1690, 1598, 1503, 1434, 1303
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,39(3H, s), 2,71(3H, s), 6,52(1H, s), 6,85(1H, d, 2,1), 6,92(1H, d, 2,1), 6,98(1H, d, 2,1), 8,25(1H, s), 9,5–13,5(5H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 17,3, 32,4, 102,3, 103,3, 110,0, 112,1, 112,3, 113,4, 118,8, 120,6, 127,6, 128,9, 132,1, 136,1, 138,8, 140,9, 150,2, 152,0, 154,1, 157,8, 162,2, 162,6, 167,5, 169,2, 172,6, 175,3, 202,7
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-28 als die folgende Formel [30] bestimmt. [Chemische Formel 45]
(SPF-3059-29)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekulargewicht: 548
Molekülformel: C₂₈H₂₀O₁₂
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 549(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 547(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 549,1027
Berechneter Wert: 549,1034 (C₂₈H₂₁O₁₂)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 226(48.900), 316(26.200), 352sh(17.400)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3388, 1687, 1662, 1626, 1469, 1296
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,23 (3H, s), 2,72(3H, s), 3,11(3H, s), 3,98(2H, brs), 6,89(1H, s), 6,93(1H, s), 7,44 (1H, s), 8,27(1Hs), 9,00–13,00(5H, brs),
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 16,8, 32,4, 57,8, 64,4, 102,3, 103,1, 108,6, 112,0, 113,5, 118,46, 118,48, 119,1, 127,7, 128,1, 131,8, 138,9, 141,8, 144,3, 150,6, 150,7, 151,9, 152,6, 154,2, 162,1, 167,8, 173,5, 174,6, 202,7
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-29 als die folgende Formel [31] bestimmt. [Chemische Formel 46]
(SPF-3059-30)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekulargewicht: 490
Molekülformel: C₂₆H₁₈O₁₀
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 491(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 489(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 491,0966
Berechneter Wert: 491,0979 (C₂₆H₁₉O₁₀)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 206(36.000), 240(32.700), 315(26.500), 372(17.900)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3396, 1704, 1618, 1518, 1479, 1294
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,28, 2,30, 2,67, 2,69, 4,62, 4,66, 4,70, 4,96, 6,32, 6,36, 6,90, 6,91, 7,03, 7,17, 7,43, 7,98, 8,54, 9,20–10,80
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 16,5, 17,0, 32,3, 32,4, 56,2, 65,9, 68,3, 103,0, 103,2, 103,8, 108,6, 110,4, 111,8, 113,4, 118,6, 125,6, 127,5, 129,5, 132,1, 132,6, 134,4, 137,9, 138,8, 141,2, 141,5, 144,3, 150,6, 152,0, 152,5, 154,3, 154,6, 154,9, 155,8, 156,6, 172,6, 173,4, 183,5, 187,2, 199,3, 202,7, 202,9
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-30 als die folgende Formel [32] bestimmt (Tautomer). [Chemische Formel 47]
(SPF-3059-34)

Aussehen: gelbes Pulver
Molekulargewicht: 550
Molekülformel: C₂₇H₁₈O₁₃
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS)m/z(positiv): 551(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 549(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 551,0846
Berechneter Wert: 551,0826 (C₂₇H₁₉O₁₃)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 211(35.600), 240(31.100), 283(24.100), 349(14.500)
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,18(3H, s), 2,66(3H, s), 4,39(1H, d, 11,9), 4,64(1H, d, 11,9), 6,37(1H, s), 6,84(1H, s), 7,09(1H, s), 8,47(1H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 16,8, 32,4, 72,5, 80,0, 102,1, 103,0, 109,5, 110,6, 111,1, 117,7, 120,0, 126,5, 131,8, 133,6, 138,6, 141,4, 141,5, 150,5, 151,7, 154,9, 155,0, 156,2, 167,7, 172,6, 188,5, 202,8, 204,0
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-34, als die folgende Formel [33] bestimmt. [Chemische Formel 48]
(SPF-3059-35)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekulargewicht: 546
Molekülformel: C₂₈H₁₈O₁₂
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 547(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 545(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 547,0911
Berechneter Wert: 547,0877 (C₂₈H₁₉O₁₂)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 216(38.600), 237(37.300), 307(30.100), 356sh(8.800)
Infrarot-Absorptionsspektrum ν_max (KBr) cm^–1: 3460, 3076, 1734, 1699, 1629, 1466, 1302
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,39(3H, s), 2,71(3H, s), 3,82(3H, s), 6,49(1H, s), 6,86(1H, d, 2,1), 6,92(1H, s), 7,01(1H, d, 2,1), 8,25(1H, s), 9,5–13,5 (4H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 17,3, 32,4, 52,5, 102,3, 103,8, 110,0, 112,1, 112,8, 113,5, 118,8, 120,6, 127,7, 129,0, 132,1, 134,3, 138,8, 140,9, 150,3, 152,1, 154,1, 157,7, 162,2, 162,8, 167,5, 168,6, 172,6, 175,1, 202,7
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-35 als die folgende Formel [34] bestimmt. [Chemische Formel 49]
(SPF-3059-36)

Aussehen: cremefarbenes Pulver
Molekulargewicht: 598
Molekülformel: C₃₂H₂₂O₁₂
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 599(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 597(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M + H)⁺:
Gemessener Wert: 599,1198
Berechneter Wert: 599,1190 (C₃₂H₂₃O₁₂)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 213(46.300), 246(48.700), 287(33.200), 360(20.000)
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,41(3H, s), 2,45(3H, s), 2,66(3H, s), 6,34(1H, s), 6,63(1H, s), 6,90(1H, s), 7,46(1H, d, 2,0), 7,46(1H, s), 7,95(1H, d, 2,0), 8,52(1H, s)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 27,3, 30,2, 32,7, 102,8, 103,1, 108,6, 111,7, 113,4, 117,3, 119,6(2C), 126,7, 127,5, 128,5, 133,2, 133,4, 135,1, 135,6, 138,6, 139,7, 144,6, 150,8, 152,1, 154,6, 155,9, 157,5, 158,4, 173,3, 196,3, 200,0, 201,6, 205,2
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-36 als die folgende Formel [35] bestimmt. [Chemische Formel 50]
(SPF-3059-37)

Aussehen: gelbes Pulver
Molekulargewicht: 806
Molekülformel: C₄₁H₂₆O₁₈
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 807(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 805(M – H)^–
Hochauflösendes Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (HRFAB-MS) m/z(M – H)^–:
Gemessener Wert: 807,1197
Berechneter Wert: 807,1198 (C₄₁H₂₇O₁₈)
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 219(68.900), 323(30.700), 349(30.600)
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,08(3H, s), 2,20(3H, s), 2,53(3H, s), 3,42(1H, d, 15,6), 3,56(1H, d, 15,6), 4,64(1H, d, 13,4), 4,71(1H, d, 13,4), 6,27(1H, s), 6,83(1H, s), 6,84(1H, s), 6,88(1H, s), 8,15 (1H, s), 9,0–13,0(8H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 16,6, 17,7, 20,0, 32,0, 62,3, 102,1, 102,25, 103,8, 106,0, 108,4, 108,7, 109,9, 111,55, 118,56, 119,2, 119,6, 120,4, 121,7, 127,9, 129,13, 131,1, 139,5, 140,6, 141,00, 141,7, 150,1, 150,23, 150,46, 150,51, 151,6, 152,3, 154,09, 154,17, 158,7, 161,1, 167,7, 168,0, 172,5, 173,2, 175,1, 202,2
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-37 als die folgende Formel [36] bestimmt. [Chemische Formel 51]
(SPF-3059-39)

Aussehen: gelbes Pulver
Molekulargewicht: 548
Molekülformel: C₂₇H₁₆O₁₃
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(positiv): 549(M + H)⁺
Schnell-Atom-Beschuss-Massenspektrum (FAB-MS) m/z(negativ): 547(M – H)^–
UV-SICHTBARES Absorptionsspektrum λ_max (in Methanol) nm(ε): 223(40.000), 319(23.900), 349(20.100)
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 2,37(3H, s), 2,71(3H, s), 6,47(3H, s), 6,91(1H, s), 6,98(1H, s), 8,22(1H, s), 9,0–13,0(6H, brs)
¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ ppm: 17,3, 32,4, 102,3, 102,7, 109,9, 111,49, 112,4, 118,64, 118,8, 120,5, 127,5, 129,12, 132,1, 138,8, 140,96, 142,5, 150,29, 151,1, 152,0, 152,6, 154,24, 162,1, 167,5, 167,9, 172,6, 175,5, 202,7
Löslichkeit:
Unlöslich: Wasser, Hexan
Löslich: Methanol, DMSO

Dies zusammengenommen, wurde die Struktur von SPF-3059-39 als die folgende Formel [37] bestimmt. [Chemische Formel 52]
Beispiel 15 (Inhibitorische Wirkung der neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung gegenüber der das Kollabieren bewirkenden Aktivität von Sema3A)

In einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 2 wurden die inhibitorischen Wirkungen der neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung gegenüber der Kollabieren bewirkenden Aktivität von Sema3A gemessen. Die IC₅₀-Werte waren wie folgt, und alle von ihnen zeigten eine starke Inhibition von Sema3A.

Verbindung	IC₅₀ (μg/ml)
SPF-3059-3	0,2
SPF-3059-4	2,0
SPF-3059-6	0,1
SPF-3059-7	1,0
SPF-3059-9	0,1
SPF-3059-12	2,0
SPF-3059-24	0,1
SPF-3059-25	4,0
SPF-3059-26	0,2
SPF-3059-27	0,5
SPF-3059-28	2,0
SPF-3059-29	0,1
SPF-3059-30	0,2
SPF-3059-34	0,1
SPF-3059-35	2,0
SPF-3059-36	4,0
SPF-3059-37	< 0,1
SPF-3059-39	0,1

Beispiel 16 (Inhibition der das Neuritenauswachsen inhibierenden Wirkung von Sema3A durch den Inhibitor)

In einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 5 wurden die inhibitorischen Wirkungen der neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung gegenüber der das Neuritenauswachsen inhibierenden Wirkung von Sema3A gemessen. Die Ergebnisse der Messungen sind unten dargestellt.

Verbindung	Verbindung – Konzentration (μg/ml)
	2	6	20
SPF-3059-2	+++	NT	NT
SPF-3059-3	+++	NT	NT
SPF-3059-5	++	NT	NT
SPF-3059-4		+	++
SPF-3059-6	++	++	+++
SPF-3059-7	+	+	++
SPF-3059-12	+	+	++
PBS (Kontrolle)		–	–
(NT = nicht getestet)

Dieses Ergebnis zeigt, dass die das Neuritenauswachsen inhibierende Wirkung, die von Sema3A gezeigt wird, durch die neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung in anhaltender Weise inhibiert werden kann.
Beispiel 17 (Bestimmung der Zytotoxizität der neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung)

Die Wirkungen der Verbindungen auf die Zellproliferation wurden unter Verwendung von COS7-Zellen in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 10 bestimmt. Die bestimmten Ergebnisse für die Inhibition der Zellproliferation durch die neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung waren wie folgt. Es wurde aufgedeckt, dass keine Zytotoxizität bei einer Konzentration beobachtet wurde, die immerhin das 50- bis 1000-fache der Konzentration betrug, bei der Aktivitäten im Bezug auf Semaphorin beobachtet werden können.

Test-Verbindung	IC₅₀ (μg/ml)
SPF-3059-3	> 100
SPF-3059-4	> 100
SPF-3059-6	> 100
SPF-3059-7	> 100
SPF-3059-9	> 100
SPF-3059-12	> 100
SPF-3059-24	> 100
SPF-3059-29	> 100
SPF-3059-30	> 100

Beispiel 18 (Herstellung von Salzen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung)
Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung wird in Methanol gelöst, um eine 1 mM Lösung herzustellen. Eine Methanollösung mit 1 mM Natriumhydroxid wird mit 2 ml zu 1 ml der obigen Lösung hinzugegeben, wenn eine Verbindung der vorliegenden Erfindung zwei Carboxylgruppen besitzt, und mit 1 ml, wenn die Verbindung eine Carboxylgruppe besitzt, wonach gründlich gemischt wird. Das Lösungsmittel der Lösung wird unter reduziertem Druck verdampft, und die Rückstände werden getrocknet, und so wird 1 μmol des Natriumsalzes einer Verbindung der vorliegenden Erfindung erhalten.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Semaphorin-Inhibitoren als ein Wirkbestandteil der Nervenregenerations-Förderer der vorliegenden Erfindung besitzen ihre fördernde Wirkung auf die periphere oder zentrale Nervenregeneration selbst bei einer niedrigen Konzentration, und sie besitzen eine supprimierende Wirkung auf die das Kollabieren des Wachstumskegels bewirkende Aktivität von Semaphorin und/oder auf die das Neuritenauswachsen inhibierende Aktivität von Semaphorin in einem Collagen-Gel. Dabei wird besonders eine niedermolekulare Verbindung als Semaphorin-Inhibitor, mit einem Molekulargewicht von 1000 oder weniger, in vorteilhafter Weise als präventives Mittel oder als ein Heilmittel für diverse neuropathische und neurodegenerative Erkrankungen verwendet, bedingt insbesondere durch ihre signifikante molekulare Diffusionsfähigkeit, ihre Membranpermeabilität, Organverteilung, ihre Durchlässigkeit gegenüber der Blut-Hirn-Schranke oder dergleichen.

Claims

Verwendung einer Verbindung, repräsentiert durch Formel [8], oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration in einem Patienten zu fördern, der diese benötigt,
wobei R⁴ ein Wasserstoffatom, eine Carboxylgruppe oder eine Alkoxycarbonylgruppe repräsentiert und R⁵ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Acyloxygruppe repräsentiert und R⁶ und R⁷ entweder durch (1) oder (2) unten repräsentiert werden: (1) R⁶ repräsentiert eine Methylgruppe und R⁷ repräsentiert eine Gruppe, wie sie durch die Formeln [2], [9] oder [10] gezeigt ist,
wobei R¹ ein Wasserstoffatom, eine Carboxylgruppe oder eine Alkyloxycarbonylgruppe repräsentiert und R² ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Acyloxygruppe repräsentiert und R³ ein Wasserstoffatom, eine Methoxymethylgruppe oder Formel [3] repräsentiert
wobei R¹ und R² die gleiche Bedeutung haben wie in Formel [2],
wobei R¹ und R² die gleiche Bedeutung haben wie in Formel [2], (2) R⁶ repräsentiert eine Gruppe, wie sie durch Formel [5] oder [11] gezeigt ist, und R⁷ repräsentiert eine Acetylgruppe,
wobei R¹ und R² die gleiche Bedeutung haben wie in Formel [2].
Verwendung einer Verbindung, repräsentiert durch Formel [12], oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration in einem Patienten zu fördern, der diese benötigt,
wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8].
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 2, wobei wenigstens einer von R² und R⁵ in Formel [12] eine Hydroxylgruppe repräsentiert.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 3, wobei R² in Formel [12] eine Hydroxylgruppe repräsentiert.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 3, wobei R² und R⁵ in Formel [12] eine Hydroxylgruppe repräsentieren.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 2–5, wobei R⁴ in Formel [12] eine Carboxylgruppe repräsentiert.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 2, wobei in Formel [12] R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert.
Verbindung, repräsentiert durch Formel [12],
wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in Formel [2] und [8], wobei jedoch wenigstens einer von R¹, R², R⁴ und R⁵ durch ein Wasserstoffatom repräsentiert wird, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei sowohl R² als auch R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 8–11, wobei R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung einer Verbindung, repräsentiert durch Formel [13], oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon,
wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8], für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration in einem Patienten zu fördern, der diese benötigt.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 14, wobei in Formel [13] wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 15, wobei R² in Formel [13] eine Hydroxylgruppe repräsentiert.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 15, wobei R² und R⁵ in Formel [13] eine Hydroxylgruppe repräsentieren.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 14–17, wobei R⁴ in Formel [13] eine Carboxylgruppe repräsentiert.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 14, wobei in Formel [13] R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, R¹ eine Carboxylgruppe repräsentiert und R⁴ ein Wasserstoffatom repräsentiert.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 14, wobei in Formel [13] R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert.
Verbindung, repräsentiert durch Formel [13]:
wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8], wobei jedoch wenigstens einer von R¹, R² und R⁵ ein Wasserstoffatom repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 21, wobei wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 22, wobei R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 22, wobei R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 21–24, wobei R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 21, wobei R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 21, wobei R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung, repräsentiert durch Formel [14], oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon,
wobei R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8].
Verbindung nach Anspruch 28, wobei wenigstens einer von R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R² eine Hydroxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 28–31, wobei R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 28, wobei R¹ und R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentieren und R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 28, wobei R¹ eine Carboxylgruppe repräsentiert, R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren und R³ eine Methoxymethylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 28, wobei R¹ eine Carboxylgruppe oder eine Methoxycarbonylgruppe repräsentiert, R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, R³ ein Wasserstoffatom repräsentiert und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 35, wobei R¹ eine Carboxylgruppe oder eine Methoxycarbonylgruppe repräsentiert, R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, R² und R³ ein Wasserstoffatom repräsentieren und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 28–33, wobei R³ durch eine Gruppe der Formel [3] repräsentiert wird, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 28–37 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration in einem Patienten zu fördern, der diese benötigt.
Verbindung, repräsentiert durch Formel [15], oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon:
wobei R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in Formel [8].
Verbindung nach Anspruch 39, wobei R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 39 oder 40, wobei R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 39 bis 41 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration in einem Patienten zu fördern, der diese benötigt.
Verbindung, repräsentiert durch Formel [16], oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon:
wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8].
Verbindung nach Anspruch 43, wobei wenigstens einer von R² und R⁵ ein Wasserstoffatom repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 43, wobei R² und R⁵ eine Hydroxylgruppe repräsentieren, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 43–45, wobei R⁴ eine Carboxylgruppe repräsentiert, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 43–46 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Semaphorin-Aktivität, um die Nervenregeneration zu fördern.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–7, 14–20, 38, 42 oder 47, wobei das Medikament zur Behandlung oder Prävention von neuropathischen Erkrankungen und/oder neurodegenerativen Erkrankungen bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 48, wobei die neuropathischen Erkrankungen und/oder die neurodegenerativen Erkrankungen mit einer Verletzung des Spinalnervs und/oder einer Verletzung eines peripheren Nervs einhergehen.
Verwendung nach Anspruch 48, wobei die neuropathischen Erkrankungen und/oder neurodegenerativen Erkrankungen olfaktorische Abnormitäten, traumatische Neuropathie, Hirninfarkt-Neuropathie, Lähmung des Gesichtsnervs, diabetische Neuropathie, Glaukom, Retinitis pigmentosa, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, neurodegenerative Erkrankungen, muskuläre hypoplastische Lateralsklerose, Lou-Gehrig'sche Krankheit, Huntington-Chorea, Hirninfarkt oder traumatische neurodegenerative Erkrankungen sind.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach einem der Ansprüche 8–13, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Pilz kultiviert, welcher eine Verbindung nach einem der Ansprüche 8–13 produziert und zur Gattung Penicillium gehört, und diese Verbindung aus der Kultur gewinnt.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach einem der Ansprüche 21–27, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Pilz kultiviert, welcher eine Verbindung nach einem der Ansprüche 21–27 produziert und zur Gattung Penicillium gehört, und diese Verbindung aus der Kultur gewinnt.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach einem der Ansprüche 28–37, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Pilz kultiviert, welcher die Verbindung nach einem der Ansprüche 28–37 produziert und zur Gattung Penicillium gehört, und diese Verbindung aus der Kultur gewinnt.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach einem der Ansprüche 39–41, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Pilz kultiviert, welcher die Verbindung nach einem der Ansprüche 39–41 produziert und zur Gattung Penicillium gehört, und diese Verbindung aus der Kultur gewinnt.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach einem der Ansprüche 43–46, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Pilz kultiviert, welcher die Verbindung nach einem der Ansprü che 43–46 produziert und zur Gattung Penicillium gehört, und diese Verbindung aus der Kultur gewinnt.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel [12]
wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8], oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, wobei das Verfahren umfaßt, daß man den die Verbindung produzierenden Pilz Penicillium sp. SPF-3059 kultiviert und die Verbindung aus der Kultur gewinnt.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel [13]
wobei R¹, R², R⁴ und R⁵ die gleiche Bedeutung haben wie in den Formeln [2] und [8], oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, wobei das Verfahren umfaßt, daß man den die Verbindung produzierenden Pilz Penicillium sp. SPF-3059 kultiviert und die Verbindung aus der Kultur gewinnt.
Herstellungsverfahren nach einem der Ansprüche 51–55, wobei der produzierende, zur Gattung Penicillium gehörende Pilz Penicillium sp. SPF-3059 ist.