-
Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der
US-Regierung unter den Erteilungsnummern CA 22865 und CA 46560 des
National Institutes of Health gemacht. Die US-Regierung hat an der Erfindung gewisse Rechte.
-
Hintergrund
und Zusammenfassung der Erfindung
-
Die Pflanzenfamilie Simaroubaceae
umfasst zahlreiche Spezies, die in erster Linie in pantropischen Regionen
verteilt sind. Diese Pflanzenspezies sind Quelle einer großen Familie
von bitteren Terpenoid-Substanzen, mit dem Sammelbegriff Quassinoide.
Wie bei vielen Pflanzenalkaloiden oder natürlichen isolierten Pflanzenextrakten
wurde herausgefunden, dass Quassinoide vielfältige biologische Aktivität besitzen,
einschließlich
anti-malarische, anti-insektizide, anti-amoebicidale, anti-leukämische und
anti-virale Aktivität.
-
Die große Mehrheit der Quassinoide
sind stark oxidierte Lactone, die das folgende Gerüst mit zwanzig Kohlenstoffatomen
enthalten,
üblicherweise Picrasan genannt,
obwohl Gerüste
mit achtzehn, neunzehn und fünfundzwanzig
Kohlenstoffatomen ebenso bekannt sind. Viele verschiedene Ringstrukturen
und Seitenketten, insbesondere am C-15, sind bekannt (siehe z. B.
Polonsky, „Quassinoid
Bitter Principles 11",
Fortschr. Chem. Org Naturst, Progress in the Chemistry of Organic
Natural Products, 1985, 47, 221). Die vorliegende Erfindung umfasst
sowohl neue als auch synthetisch erhaltene Quassinoid-Analoge ebenso
wie neue Verwendungen für
solche synthetischen Quassinoide und zuvor identifizierte und isolierte
natürliche
Quassinoide. Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine
Verbindung offenbart, die durch die Formel
charakterisiert ist, worin
R Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl darstellt und Y durch die Formel
dargestellt wird, worin die
Y-Seitenkette der obigen Formel III modifiziert werden kann, um
Ringstrukturen wie Aryle oder Cycloalkane zu unterstützen. R
2 und R
3 bilden zusammengenommen
einen C
3- bis C
8-gliedrigen Kohlenstoffring
und R
4 für
sich genommen Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyalkyl, Carboxyl, Aryl,
Alkenyl, Cycloalkane, Cycloalkene, Glycine, Glyco-Saccharide, Aminosäuren, Peptide,
Polypeptide, Proteine und jeden der vorhergehenden gebunden an das
zentrale Kohlenstoffatom über
eine Ether-, Ester-, Carbonyl- oder glycosidische Bindung darstellt.
Im Besonderen können
R
2 und R3 zusammen ein dreigliedriges Cycloalkan
mit R
4 als Hydroxymethyl-Gruppe bilden.
-
In einer weiteren Ausführungsform
kann die Seitenkette Y durch
dargestellt sein, wobei R
5 und R
6 zusammen
einen C
3-bis
C
8-gliedrigen Kohlenstoffring bilden und
R, Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyalkyl, Carboxyl, Aryl, Alkenyl, Cycloalkan,
Cycloalken, Glycin, Glycosaccharid, Aminosäure, Peptid, Polypeptid, Protein
umfasst und jeder der vorhergehenden, an das terminale R
7-Kohlenstoffatom über eine Ether-, Ester-, Carbonyl-
oder glycosidische Bindung gebundene Reste liegt im Schutzbereich
der vorliegenden Erfindung. Weiterhin sind solche Ausführungsformen,
worin R
5 und R
6 zusammen
ein viergliedriges Cycloalkan bilden und R
7 eine
Hydroxylgruppe ist; worin R5 und R6 zusammen ein fünfglied riges
Cycloalkan bilden und R
7 eine Hydroxyl-Gruppe
ist; worin R
5 und R
6 zusammen
ein sechsgliedriges Cycloalkan bilden und R, eine Hydroxyl-Gruppe
ist; worin R
5 und R
6 zusammen
ein siebengliedriges Cycloalkan bilden und R, eine Hydroxyl-Gruppe
ist; R
5 und R
6 zusammen
ein viergliedriges Cycloalkan bilden und R
7 eine
Gruppe mit der Formel
umfasst, als im Schutzbereich
dieser Erfindung liegend, anzusehen.
-
Noch weitere Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung enthalten auch die Verbindung der obigen Formel IV, worin
R
5 und R
6 zusammen
eine Kohlenstoff-Doppelbindung
enthalten und zusammen mit R
7 ein fünfgliedriges
Cycloalken bilden. Alternativ kann die Seitenkette Y der Verbindung
gemäß Formel
II durch
dargestellt werden, worin
R
8 und R
9 für sich genommen
oder zusammen Cycloalkane oder Cycloalkene darstellen.
-
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft die Verwendung der zuvor beschriebenen, synthetisch
erhaltenen Quassinoide oder zuvor bekannter, gereinigter und isolierter
Quassinoide zur Behandlung von neoplastischen Störungen wie festen Tumoren in
Verbindung mit geeigneten pharmazeutischen Trägern.
-
Nach dem Verständnis der Fachleute können die
besonderen pharmazeutischen Träger
Salzlösungen sein,
die geeignete Stabilisatoren, Puffer, antimikrobielle Mittel, Antifungizidemittel
oder andere solche Zusätze,
die zur Lagerung und Lieferung erforderlich sind, enthalten. Zusätzlich betrifft
die vorliegende Erfindung die lyophilisierte Lagerung mit Aktivierung
durch Vermischung oder jede andere Lagerungstechnik, die im pharmazeutischen
Bereich dem Fachmann bekannt und von ihm verwendet wird. Deren Verwendung
oder die Verwendung von Konjugaten anderer Mitglieder der Quassinoid-Familie als Breitspektrum-Antikrebsmittel
ist angezeigt.
-
Die Möglichkeiten für eine Konjugation
sind breit. Die grundsätzlichen
Erfordernisse sind, dass die konjugierten Materialien das Quassinoid
unverändert
belassen und deren Fähigkeit,
das Wachstum durch die Zelloberflächenseite zu hemmen, nicht
beeinflussen. Zusätzlich
wird erwartet, dass die Materialien mit therapeutischem Verwendungszweck
davon profitieren, nicht-toxisch und nicht-immunogen zu sein und
Konjugate bilden, sollten die wasserlöslich und/oder leicht zu verabreichen
sind. Aktive Spezies in hoher Ausbeute und Wirksamkeit bei geringen
Kosten würden
zusätzliche
gewünschte
Eigenschaften ausmachen.
-
Beispiele für geeignete konjugierte Materialien
schließen
ein: Polyethylenglykol, Dextran, Dextrine, Carboxymethylcellulose,
Polyoxyethylen/Polyoxypropylen (Polyoxamin)-Blockpolymere, Polyglutamin
und. andere Polyamine, N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid-copolymere
und andere Polymere, die geeignet funktionalisiert sind, um eine
leichte und funktionelle Konjugatbildung zu erlauben. Der Polymerisationsgrad
des Polymers in den Polymer-Arzneimittelkonjugat kann von N = 1
bis N = 1000 oder mehr variieren, so lange das letztliche Konjugat
unverändert,
wirksam und fähig
ist, die Ziellage zu erreichen, um therapeutische Arzneimittel-Niveaus zu liefern.
Die Bindung kann nicht-hydrolisierbar oder hydrolisierbar sein und
ein oder mehrere Spacer-Atome enthalten, die zur Verbesserung der
Wirksamkeit optimiert sind.
-
Um den wirksamen Transport eines
Antikrebs- oder Antivirenmittels der vorliegenden Erfindung an eine
gewünschte
Körperposition
zu unterstützen,
können
zielführende
Mittel wie monoklonale Antikörper,
chemische Komponenten, die durch cancerogen oder viral infizierte
Zellen unterschiedlich aufgenommen werden oder Mittel, die dafür bekannt
sind, cancerogen oder viral infiziertes Gewebe zu erreichen (z.
B. hepatisches Gewebe, das durch Acetaminophen-Derivaten oder Glycosacchariden
erreicht wird), mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung
gekoppelt werden. Nach dem Verständnis
der Fachleute ist die intravenöse
Zufuhr bevorzugt, obwohl in besonderen Situationen auch, die topische,
orale oder subkutane Zufuhr geeignet sein kann.
-
Um Konjugate herzustellen, die die
Ziel-Spezifität
beeinflussen, können
die Quassinoide unterschiedlich kombiniert werden, z. B. mit Protein-Antikörpern, Nukleinsäuren oder
sogar Lipiden oder derivatisierten Polymersubstanzen und verschiedenen
natürlich
vorkommenden Makromolekülen
wie Immunoglobulin, Wachstumshormone, Insulin, Interferon, Plasma-Albumin,
Fibrinogen, Plasminogen-Aktivator, Heparin, Chondroitinsulfat, Soja-Trypsin-Inhibitor,
L-Asparaginase, Ribonuclease usw., die als Heimkehr-Rezeptoren oder Ziele
für einen
speziellen Zelltyp (z. B. Krebszellen) oder eine bestimmte Position
(z. B. Knochenmark) fungieren.
-
Zusätzliche Aufgaben, Merkmale
und Vorteile der Verbindungen ähnlich
den erfinderischen Verbindungen und bekannt aus dem Stand der Technik,
sind anhand der folgenden detaillierten Beschreibung und den begleitenden
Zeichnungen in Betracht zu ziehen. Die Beispiele umfassen die Herstellung
und weitere Untersuchungen hinsichtlich der Eigenschaften der Quassinoid-Verbindungen,
die aus dem Stand der Technik bekannt sind (z. B. P. Grieco et al.,
J. Am. Chem. Soc; 1993, 115(14) 6078–93).
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
1 zeigt
die chemische Struktur von Peninsularinon;
-
2 zeigt
die chemische Struktur von Glaucaruboion, gereinigt und isoliert
aus natürlichen
Quellen;
-
3 zeigt
die mit ORTEP erhaltene physikalische Struktur von Peninsularinon
wie in 1 gesehen;
-
4 ist
ein Diagramm, das die logarithmische Konzentration von Glaucarubolon
mit der zunehmenden Zahl von Zellen, die mit dem felinen Immunodeffizitvirus
(FIV) infiziert sind, und nicht infizierten Kontrollzellen nach
48 Stunden, vergleicht;
-
5 ist
ein Diagramm, das die logarithmische Konzentration von Glaucarubolon
mit der zunehmenden Zahl von Zellen, die mit dem felinen Immunodeffizitvirus
(FIV) infiziert sind, und nicht infizierten Kontrollzellen nach
72 Stunden, vergleicht;
-
6 ist
ein Diagramm, das die Zellkonzentration gegen die Zeit für Zellen,
die mit dem felinen Immunodeffizitvirus (FIV) infiziert sind, und
Crandall-Felin-Nieren-Zellen als Kontrollzellen, kontaktiert mit
einem Glaucarubolon-Brefeldin-A-Konjugat, vergleicht;
-
7 ist
ein Diagramm, das die Zellkonzentration gegen die Zeit für Zellen,
die mit dem felinen Immunodeffizitvirus (FIV) infiziert sind, und
Crandall-Felin-Nieren-Zellen als Kontrollzellen, kontaktiert mit
einem Glaucarubolon, vergleicht;
-
8 ist
ein Diagramm, das die logarithmische Konzentration von Glaucarubolon
mit der Zunahme der Zellzahl von Zellen, die mit dem humanen Immunodeffizit-Virus
(HIV) infiziert sind, und nicht-infizierten Kontrollzellen vergleicht;
-
9 ist
ein Diagramm, das die logarithmische Konzentration von Glaucarubolon-Brefeldin-A-Konjugat mit der
Zunahme der Zellzahl von Zellen, die mit dem humanen Immunodeffizit-Virus (HIV) infiziert
sind, und nichtinfizierten Kontrollzellen vergleicht;
-
10 ist
ein Diagramm, das die Inhibierung der NADH-Oxidation sowohl in HeLa
und isolierten Plasmamembranen von Leberzellen durch Glaucarubolon
zeigt;
-
11 zeigt
die Inhibierung der NADH-Oxidation in pflanzlichen Sojazellen, die
mit Glaucaruboion behandelt wurden;
-
12 zeigt
ein Diagramm, das die Wirkung des Redox-Gleichgewichts auf die Inhibierung
der NADH-Oxidation in HeLa-Zellplasmamembran durch Glaucarubolon
zeigt und
-
13 ist
ein Diagramm, das die Inhibierung der NADH-Oxidaseaktivität von HeLa-Zellplasmamembranen
durch ein Glaucarubolon-Aminopolyethylenglykol-Arzneimittelkonjugats
zeigt.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
In den folgenden Beispielen wird
die Isolation, Reinigung, Synthese und Verwendung von Quassinoiden
beschrieben. Nach dem Verständnis
der Fachleute ist die Isolation neuer Quassinoide gemäß der vorliegenden
Erfindung nicht nur aus den Wurzeln der Castela peninsularis möglich, sondern
auch aus anderen Castela-Spezies,
-Subspezies oder Variationen und von verwandten Mitgliedern der
Familie Simaroubaceae. Die Reinigung und Trennung der neuen Quassinoide
kann durch Verwendung von Lösungsmittelextrakten
wie Methanol, Ethanol, aromatischen Lösungsmitteln oder anderen geeigneten
Extraktionsmitteln erfolgen. Die Synthese umfasst alles von kleineren
Seitenketten-Additionen oder -Subtraktionen des Picrasan-Kohlenstoffgerüsts bis
zur kompletten Synthese wie sie in Grieco et al., „Synthetic
Studies on Quassinoids: Total Synthesis of (-)-Chaparrinone, H-Glaucarubolone,
and (+) Glaucarubinone",
Jour. Am. Chem. Soc. 1993, 115, pp. 6078–6093 offenbart ist, auf deren
Offenbarungsgehalt hier ausdrücklich
Bezug genommen wird. Wie für
den Fachmann aus der Offenbarung verständlich, wurden zahlreiche Verbindungen
innerhalb des Schutzbereiches der vorliegenden Erfindung und mit
Seitenkettenmodifikationen an der C-15-Position natürlich isoliert
oder syntheti siert. Die therapeutische Anwendbarkeit der Verbindungen
der vorliegenden Erfindung beruht hauptsächlich auf der Erkenntnis,
die aus Zellkulturstudien und Lebend-Tierversuchen erlangt wurden.
Die Aktivität
gegen Krebsformen mit festen Tumoren und viral-infizierte Zellen
sowie die unterschiedliche zytotoxische Aktivität basierend auf der Hemmung
der NADH-Oxidase sowie die herbizide und herbistatische Aktivität werden
in den folgenden Beispielen beschrieben. Wie für die Fachleute verständlich,
kann dennoch ein breiterer Schutzbereich der therapeutischen Aktivität für gewisse
Verbindungen existieren.
-
Beispiel 1 Isolierung
und Identifizierung von Peninsularinon und Glaucarubolon
-
Die Isolierung und Charakterisierung
des Quassinoids (-)-Peninsularinon (siehe 1) zusammen mit einem zuvor identifizierten
Quassinoid Glaucarubolon (siehe 2)
wurde durch Verwendung eines Methanolextrakts der Wurzeln von Castela
peninsularis durchgeführt.
Die Struktur des Glaucarubolons wurde durch Vergleich der 1H- und 13C-NIVIR-Spektren
von natürlich
isoliertem und gereinigtem Glaucarubolon mit denen, die von synthetischem
Glaucarubolon erhalten wurden, identifiziert.
-
Die Struktur von Peninsularinon wurde
durch eine Kombination von 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie
und Röntgenstrahl-Kristallographie
bestimmt. Das Massenspektrum von Peninsularinon zeigte eine Molekülformel
von C28H40O10. Zusätzlich
zeigte das Massenspektrum einen größeren Peak bei M-C8H15O3. Ein Vergleich
von 1H- und 13C-NMR-Spektren
von Peninsularinon mit denen von Glaucarubolon ergab, dass die Spektren
sehr ähnlich
waren und legte nahe, dass das C(15)-Hydroxyl vom Glaucarubolon acyliert
wurde. In Übereinstimmung
mit den Daten des Massenspektrums ergab das
13C-NMR-Spektrum
deutlich acht zusätzliche
Kohlenstoffatome: Ein Carbonyl (168,4 ppm), ein quaternäres Kohlenstoffatom,
das einen Sauerstoff trägt
(75,4 ppm), zwei Methylen (40,8 und 29,6 ppm), drei Methylgruppen
(17,2, 17,4 und 8,3 ppm) und ein Methin-Kohlenstoff (34,7 ppm).
Das 1H-NMR-Spektrum zeigte einen AB-Quartett
mit einem Zentrum bei 6 2,88 (J = 15 Hz), was zusammen mit den 13C-Daten die Anwesenheit einer Methylen-Gruppe
benachbart zum Carbonyl und einem quaternären Kohlenstoff mit einem Sauerstoffatom
nahe legte: C(q)CH2C=O. Aus dem Protonen-Spektrum
war auch deutlich die Anwesenheit einer Isopropylgruppe und einer
Ethylgruppe, die vermutlich an das gleiche quaternäre, eine
Hydroxylgruppe tragende Kohlenstoffatom gebunden waren, zu erkennen.
Die absolute Konfiguration des carbocyclischen Picrasan-Netzwerks
der Quassinoide folgt aus biosynthetischen Überlegungungen, Röntgen-Kristallographiedaten
und der Totalsynthese. Die Bestimmung der absoluten Konfiguration
des quaternären
Kohlenstoffatoms in der C-15-Seitenkette wurde über eine einzelne Röntgenstruktur-Analyse
von Peninsularinon durchgeführt.
Die Analyse der röntgen-kristallographischen
Daten von Peninsularinon ergaben einen orthorhombischen Kristall
(C2, Z = 8) mit den folgenden Dimensionen: a = 28, 538 (25)Å, b = 6,
866 (5)Å,
c = 30, 300 (26)135 und β =
116, 57 (2)° .
Das Volumen des Kristalls betrug 5310.1313 mit
einer Dichte von 1,342 g/cm3. Proton (1H) – und
Kohlenstoff (13C)-Kernspinnresonanzspektren wurden
entweder mit einem Varian VXR-400
MHz (100 MHz) Spektrometer oder einem Bruker AM-500 MHz (125 MHz) Spektrometer (wie
angezeigt), aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm
(6) in Bezug zu Tetramethylsilan (6 0.0) angegeben. Die Infrarot
(IR)-Spektren wurden auf einem FTIR-Spektrometer der Mattson Galaxy
4020 Serie aufgenommen. Die Absorptionsintensitäten sind als stark (s), mittel
(m) oder schwach (w) angegeben. Die hochauflösenden Mas senspektren wurden
mit einem Spektrometer vom Typ Kratos MS 80/RFRQ erhalten. Die Elementaranalysen
wurden von den Galbraith Laboratorien, Inc., Knoxville, TN durchgeführt. Die
Schmelzpunkte wurden mit einer Fisher-Johns Heiztisch-Apparatur
erhalten und sind unkorrigiert. Die optischen Rotationen wurden
mit einem Perkin-Elmer Modell 241-Polarimeter erhalten. Die Dünnschicht-Chromatographie
wurde unter Verwendung von vorbeschichteten Silicagel-Platten vom
Typ 60 F-254 (0,25 mm Dicke) von E. Merck durchgeführt. Die
Platten wurden durch Eintauchen in eine p-Anisaldehyd-Lösung und
Aufwärmen
auf einer Heizplatte visualisiert. Für die Flash-Silicagel-Chromatographie
wurde Silicagel vom Typ 60 (230 bis 400 Mesh) der Firma E. Merck
verwendet. Alle chromatographischen Lösungsmittel sind analysenrein,
sofern nichts anderes angegeben ist. Das Sammeln der Fraktionen
wurde nach der Elution einer Lösungsmittelfront
von der Säule
begonnen.
-
Pflanzenmaterial: Die Wurzeln der
Rose Castela peninsularis wurden am 18. April 1993 durch World Botanical
Associates aus Baia California besorgt.
-
Extraktion und Isolation: Getrocknete
Bodenwurzeln (962 g) wurden in 2800 ml Methanol eingeweicht. Nach
drei Tagen wurde das Pflanzenmaterial abgegossen und mit Methanol
(1 × 2800
ml) gespült.
Das Verfahren wurde mit den gleichen 962 g des Pflanzenmaterials
insgesamt neun Mal wiederholt. Die vereinigten Methanolextrakte
und Methanolwaschlösungen
wurden im Vakuum zu einem braunen Schlamm aufkonzentriert (ca. 120
g), der mit 20% Methanol/Chloroform (1000 ml) verdünnt wurde,
24 Stunden lang gerührt
wurde, durch eine Unterlage aus Flash-Silicagel filtriert und mit
20% Methanol/Chloroform gut gewaschen wurde. Das Filtrat und die
Waschlösungen
wurden im Vakuum zu einem braunen Öl (ca. 32 g) aufkonzentriert.
Das braune Öl
wurde chro matographisch über
690 g Flash-Silicagel (gepackt mit 10% Methanol/Chloroform) getrennt.
Die Säule
wurde im Anschluss eluiert, wobei 150 ml Fraktionen gesammelt wurden:
die Fraktionen 3 bis 16 (Teil I) wurden vereinigt und in Vakuum
auf konzentriert, wodurch 19 g eines braunen Schlamms erhalten wurden; Fraktionen
17 bis 28 (Teil II) wurden vereinigt und im Vakuum aufkonzentriert,
wobei 2,0 g eines gelben Schaums zurückblieben. Teil I (19 g) wurde über 400
g Flash-Silicagel (gepackt in 3 : 1 Ethylacetat/Hexane) chromatographisch
getrennt. Die Säule
wurde im Anschluss eluiert, wobei 75 ml Fraktionen gesammelt wurden:
Fraktionen 48 bis 66 (IA) (3 : 1/Ethylacetat : Hexane) und Fraktionen
67 bis 98 (113) (5 : 1/Ethylacetat : Hexane) wurden vereinigt. Die
Fraktionen 48 bis 66 (IA) wurden im Vakuum zu einem matten gelbfarbigen Festkörper (684
mg) aufkonzentriert, der aus Ethylacetat auskristallisiert wurde,
wobei 2 als lange Nadeln (161 mg) erhalten wurde. Die Mutterlösung wurde über 130
g Flash-Silicagel (gepackt in 2% Methanol/Chloroform) chromatographisch
getrennt. Die Säule
wurde im Anschluss eluiert, wobei 40 ml Fraktionen gesammelt wurden:
Die Fraktionen 43 bis 49 (5% Methanol/Chloroform) wurden gesammelt
und vereinigt, wobei weitere 2 als weißer Feststoff (260 ml) erhalten
wurde. Der Teil IB wurde im Vakuum zu einem gelben Schaum (864 mg)
auf konzentriert, der über
125 g Flash-Silicagel (gepackt in 5% Methanol/Chloroform) chromatographisch
getrennt wurde. Die Säule
wurde im Anschluss eluiert, wobei 12 ml Fraktionen gesammelt wurden:
die Fraktionen 43 bis 55 wurden vereinigt und im Vakuum aufkonzentriert,
wobei ein weißlicher
Feststoff (371 mg) zurückblieb, der
aus Ethylacetat auskristallisierte und 1 als kleine weiße Nadeln
(148 mg) lieferte. Eine Reinigung der Mutterlösung durch präparative
Dünnschicht-Chromatographie
(11 Böden
(0,5 mm Dicke, 5% Methanol/Chloroform, doppelte Elution) lieferten
1 als weißen
Feststoff (94 mg).
-
Teil II (2,0 g) wurde über 200
g Flash-Silicagel (gepackt in Ethylacetat) chromatographisch getrennt. Die
Säule wurde
im Anschluss eluiert, wobei 40 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die
Fraktionen 17 bis 41 wurden vereinigt und im Vakuum auf konzentriert,
wobei 681 mg kristallines Glaucarubolon erhalten wurden, welches
durch Vergleich seiner spektroskopischen Daten (IR, IVIS, 1H-NMR, 13C-NMR)
mit denen zuvor in der Literatur genannten Daten identifiziert wurde.
-
(-)-Peninsolarinon 1: Rf 0,14 (Ethylacetat
: Hexan, 2 : 1), 0,20 (5% Methanol/Chloroform); FTIR KBO 3520 (s),
2969 (m), 2884 (m), 1728 (s), 1680 (s), 1460 (w), 1385 W, 1254 (m),
1229 (m), 1192 (m), 1115 (m), 988 W, 961 (w), 916 W cryfl; 400 MHz 1H-NMR (C5D5N) δ 9,
78 (br s, 1H), 9, 43 (br s, 1H), 7,46 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 6,42
K 1H, J = 11,2 Hz), 6,09 (s, 1H), 4,79 (s, 1 H), 4,23 (s, 1H), 4,14
K 1H, J = 8,6 Hz), 4,03 (br s, 1H), 3,83 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 3,39
(s, 1H), 3,09 (br d, 1H, J = 12,4 Hz), 2,95 und 2,81 (AB-Quartett, 2 H, J
= 15 Hz), 2,66 bis 2,54 (m, 2H), 2,25 bis 2,10 (m, 211), 2,08 bis
1,85 (m, 3H), 1,71 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,39 (d, 3H, J = Hz),
1,12 bis 1,01 (m, 9H); 100 MHz 13C-NMR (C5D5N) δ 197,38,
172,02, 168,36, 162,29, 126,16, 110,73, 84,34, 79–97, 78,56,
75,41, 71,30, 70,78, 48,09, 45,99, 45,58, 45,44, 45,19, 40,85, 34,69,
32,74, 29,59, *25,90, 22,34, 17,445, 17,23, 15,52, 10,74, 8, 30.
Hochauflösendes
MS (CI) berechnet für
C28H41O10 (M
+ 1) m/e 537.2700, gefunden 537.2686; C20H25O7 (M-C8H15O3) m/e 377.1601,
gefunden 377.1594.
-
Eine Analysenprobe wurde durch Rekristallisation
aus Ethylacetat hergestellt: Schmelzpunkt: 221 bis 223 °C; [a]2D5 – 22,6° (c 0,19,
Pyridin). Anal. berechnet für
C28H40O10 :
C, 62, 67; H, 7.51, gefunden: C, 62.34; H, 7, 62.
-
Röntgen-Daten
für Penisularinon
: Monokline Kristalle mit a 28.538 (25), b = 6. 866 (5), c = 30.300 (26)Å, β = 116.57
(2)° und
V 5310.1 (9) Å3 bei –172°C. Die Raumgruppe
war C2 mit Z = 8 und Dber. = 1,342 g/cm3, F(000) = 2304. Die Reflektionen wurden
auf einem bereichsweise modifizierten Picker-Goniostaten gemessen, λ(MoKa) =
0,71069 Å.
Intensitäten
wurden durch Verwendung eines kontinuierlichen Scan-Modus mit festen
Hintergründen
für 3818
einzelne Reflektionen gemessen, von denen 2512 beobachtet wurden
[F > 2,33 σ (F)]. Die
Struktur wurde durch direkte Methoden (SHELXS-86) gelöst und durch
die Gesamtmatrix-Methode der ganzen Quadrate verfeinert. Letztlich
betrug der Abweichungsindex R = 0,072.
-
Beispiel 2: Quassinoid-Analoge
-
Zusätzlich zu gereinigten, isolierten
natürlichen
Produkten schließt
die vorliegende Erfindung Seitenketten-modifizierte Analoge von
natürlich
vorkommenden Quassinoiden ein. Am wichtigsten sind hier Modifikationen
der C-15-Seitenkette, obwohl gewisse Modifikationen der Ringstruktur
oder variierende Substituenten an der C-4-Position als im Schutzbereich
der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet werden.
-
Zum Beispiel ist es, wie in dem folgenden
schematischen Syntheseschema zu sehen (Formeln VIII bis XIII, nachfolgend),
ausgehend von Glaucarubolon (Formel VI-II) möglich, durch entsprechende
chemische Modifikationen 15-Oxy-(hydroxypivaloyl)-glaucarubolon
(Formel XI) oder 1,,5-Oxy(N,N-dimethylglycin)-glaucarubolon (Formel
XIII) herzustellen:
Die Synthese
und Charakterisierung der obigen Verbindungen umfasst magnetische
Protonen (
1H)- und Kohlenstoff (
13C)-Kernresonanz-Spektren, die mit einem
Spektrometer vom Typ Varian VXR-400 MHz (100 MHz) oder Bruker AM
500 MHz (125 MHz) aufgenommen worden. Die chemischen Verschiebungen
werden in ppm (6) in Bezug auf Tetramethylsilan (6 0.0) angegeben.
Die Infrarot-Spektren
(IR) wurden mit einem Spektrophotometer vom Typ Perkin-Elmer Modell
298 oder einem FTIR-Spektrometer
vom Typ Mattson Galaxy 4020 aufgenommen. Die Adsorptionsintensitäten sind
mit stark (s), mittel (m) oder schwach (w) bezeichnet. Die hochauflösenden Massenspektren
wurden mit einem Spektrometer vom Typ Kratos MS 80/RFAQ erhalten.
Die Elementaranalysen wurden durch die Galbraith Laboratorien Inc.
Knoxville, TN, oder durch die Roberton Microlit Laboratorien Inc,
Madison, NJ durchgeführt.
Die Schmelzpunkte wurden mit einem Fisher-Johns-Heiztisch erhalten
und sind unkorrigiert. Die optischen Rotationen wurden mit einem
Polarimeter vom Typ Perkin-Elmer Modell 241 erhalten. Die Reaktionen
wurden mittels Dünnschicht-Chromatographie
unter Verwendung von vorbeschichteten Silicagel 60 F-254-Platten
(0,25 mm Dicke) von E. Merck beobachtet. Die Platten wurden durch
Eintauchen in eine p-Anisaldehyd-Lösung und
Aufwärmen
auf einer Heizplatte visualisiert. Für die Flash-Silicagel-Chromatographie
wurde Silicagel 60 (230 bis 400 mesh) von E. Merck verwendet.
-
Alle Reaktionen wurden in bei 110 °C im Ofen
getrockneten Glaswaren unter Argon-Atmosphäre unter Verwendung wasserfreier
Lösungsmittel
durchgeführt.
Alle Lösungsmittel
sind analysenrein, sofern nichts anderes angegeben ist. Dichlormethan,
Triethylamin, 2,6-Lutidin,
Pyridin, Chlorotrimethylsilan und Trimethylsilyl-trifluoromethansulfonat
wurden mit Calciumhydrid destilliert. Tetrahydrofuran wurde mit
Natriumben zophenonketyl destilliert.
-
1,11-Bis(trimethylsilyloxy)glaucarubolon
(Formel IX):
-
Eine Lösung von 300 mg (0,761 mmol)
Glaucarubolon (Formel VIII) in 8,5 ml Pyridin enthaltend 1,3 ml (9,13
mmol) Triethylamin bei 0 °C
wurde mit 898 μl
(4,56 mmol) Trimethylsilyl-Trifluromethansulfonat behandelt. Nach
Erwärmen
auf Raumtemperatur und einstündigem
Rühren
wurde die Reaktion wieder auf 0 °C
abgekühlt
und mit 761 μl
(0,761 mmol) einer 1,0 M Lösung
von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran alle 30 Minuten
behandelt bis eine Gesamtmenge von 5 Äquivalenten (3,81 mmol) Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung zugesetzt
waren. Nach weiterem 30-minütigem
Rühren
bei 0 °C
und 30 minütigem
Rühren
bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung auf 17 ml einer gesättigten
wässrigen
Lösung
von Natriumbicarbonat gegossen und mit 20 ml Ethylacetat verdünnt. Die
Phasen wurden getrennt und die organische Phase mit 1 × 17 ml
Kochsalzlösung
gewaschen. Die vereinigten wässrigen
Phasen wurden mit 1 × 10
ml Ethylacetat gewaschen, getrocknet (Na2SO4), gefiltert und im Vakuum zu einem braunen Öl auf konzentriert.
Das Öl
wurde über 80
g Flash-Silicagel chromatographisch aufgetrennt, wobei mit Ethylacetat/Hexane
(4 : 1) eluiert wurde und wobei 270 ml (66%) 1,11-bis(trimethylsilyoxy)glaucarubolon
(Formel IX) als weißer
Feststoff erhalten wurden: Rf 0,72 (Ethylacetat/Hexane, 4 : 1);
IR (KBr) 3595 (m), 3545 (w), 2970 (m), 2895 (w), 1720 (s), 1690
(s), 1327 (m), 1250 (s), 1152 (m), 1057 (s), 922 (s), 840 (s) ,
758 (m), cm–1;
400 MHz 1H NMR (C5D5N) δ 7,
93 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 6,04 (br S, 1H), 5,88 (d, 1H, J = 4,8 HZ),
5,32 (dd, 1H J = 11,2, 5,2 Hz), 4,57 (br s, 1H), 4,2 3/s, 1H), 4,00
(d, 1H, J = 8,2 Hz), 3,88 (t, 1H, J = 4, 8 Hz), 3,73 (d, 1H, J =
8,2 Hz), 3,11–3,02
(m, 1H), 3,06 (s, 1H), 2,54 (m, 1H), 2,26 (dd, 1H, J – 11, 2,6,
4 Hz), 2,06 (dt, 1H, J = 14,2, 2,8 Hz), 1,88 (t, 1H, J = 14,2 Hz),
1,71 (s, 3H), 1,66 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,32 (s, 3H), 0,36 (s, 9H),
0,32 (s, 9H); 100 MHz 13C NMR (C5D5N) J 198,49, 174,06, 160,92,
127,08, 113,61, 88,04, 81,02, 77,96, 71,71, 68,58, 49,83, 47,26,
46,04, 44,28, 44,09, 33,55, 25,85, 22,36, 16,25, 10,651 3,01, 1,
55; hochauflösendes
MS El berechnet für
C26H42O8Si2 (M) m/e 538,2419, gefunden 538,2393. Eine
analytische Probe wurde durch Rekristallisierung aus Ethylacetat
hergestellt: Schmelzpunkt 228–230°C (dec);
[a]D25 – 12,0
(c 0,55 Pyridin). Anal. berechnet für C26H42O8Si2;
C, 57.96; H, 7,86, gefunden C, 57,85; H, 8,09.
-
15-Oxy-(hydroxypivaloyl)glaucarubolon
(Formel XI):
Eine Lösung
von 69 mg (0,13 mmol) 1,11-Bis(Trimethylsilyloxy)glaucarubolon (Formel
IX) und 31 mg (0,26 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 0,64 ml Dichlormethan
wurde auf 0 °C
gekühlt
und mit 89 μl
(0,64 mmol) Triethylamin, gefolgt von 80 mg (0,32 mmol) des sauren
Chlorids ddas aus dem Tertbuyldimethylsilylether von Hydroxypivalinsäure (Formel
X) erhalten wurde, behandelt. Nach Aufwärmen auf Raumtemperatur und
2-stündigem
Rühren
wurde die heterogene Mischung mit Hexan (1 ml) verdünnt und
durch einen schmalen Pfopfen Silicagel mit Ethylacetat (10 x 1 ml)
gefiltert. Das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert und das Rohprodukt über 20 g
Flash-Silicagel, eluiert mit Hexan-Ethylacetat (5 : 1) chromatographisch
gereinigt, wobei sich 96 mg (100%) des gewünschten Produktes ergaben.
-
Das gereinigte Material (96 mg) wurde
in 2,5 ml Acetonitril aufgelöst
und bei 0°C
gekühlt.
Unter Rühren wurden
635 μl einer
1 M Lösung
von Fluorsäure
in Acetonitril zugesetzt und man ließ die resultierende Lösung auf
Raumtemperatur erwärmen
und eine halbe Stunde rühren.
Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat/Methanol (1 : 1, 2 ml)
verdünnt
und mit 200 μl
einer gesättigten
Natriumhydrogencarbonat-Lösung
behandelt und anschließend
durch einen schmalen Pfropfen Silicagel mit Ethylacetat/Methanol
(20 : 1, 10 × 1
ml) gefiltert. Das Filtrat wurde im Vakuum auf konzentriert und über 20 g
Flash-Silicagel chromatographisch aufgereinigt, wobei mit Chloroform/Methanol
(10 : 1) eluiert wurde. Hierbei ergaben sich 55,8 mg (88 o) eines
weißen
Feststoffs der Formel X: Rf 0,19(Chloroformmethanol, 10: 1) ; IR
(Kbr) 2517 (s), 3468 (s), 2974 (m), 2928 (m), 1746 (s), 1715 (s),
1682 (s), 1383 (m), 1248 (m), 1121 (s), 1053 (s) cm–1;
500 MHz 1H NMR (C5D5N) σ 9,74 (br
s, 1H), 9.41 (br s, 1H), 7,44 (d, 1H, J = 4,7 Hz), 6,40 (br d, 1H,
J = 11,7 Hz), 6,27 (br t, 1H, J = 6,0 Hz), 6,09 (br s, 1H), 4,81
(br s, 1H, 4,19 (br s, 1H), 4,13 (d, 1H J = 8,8 Hz), 4,05–3,98 (m,
3H), 3,79 K 1H, J = 8,8 Hz), 3,37 (s, 1H), 3,10 (br d, 1H, J = 13,3
Hz), 2,67 (dd, 1H, J = 11,7, 6,3 Hz), 2,59 (m, 1H), 2,14, (dt, 1H,
J = 14,5, 3,2 Hz), 2,00 (br t, 1H, J = 14,5 Hz), 1,70 (s, 3H), 1,55
(s, 3H), 1,48 (s, 6H), 1,46 (d, 3H, J 7,4 Hz); 125 MHz-13C NMR
(C5D5N) σ 197,26,
176,38, 168,54, 162,41, 126,13, 110,67, 84,40, 80,09, 78,46, 71,33,
71,21, 69,43, 48,19, 46,23, 45,59, 45,45, 42,23, 32,81, 25,93, 22,25,
22,23, 22,17, 15,71, 10,70. Eine Analysenprobe wurde durch Rekristallisierung
aus Ethylacetat-Methanol hergestellt: Schmelzpunkt 259–261 °C; [a]D25 – 17,1
(c 0,59, Pyridin). Anal. berechnet für C25H34O10 : C, 60, 72;
H, 6,93, gefunden: C, 60,63; H, 6,92.
-
15 Oxy-(N,N-dimethylglycin)glaucarubolon
(Formel XIII), 10 mg (0, 02 mmol) von 1, 11-Bis-(Trimethylsilyloxyl)glaucarobolon
(Formel IX), 4 mg (0,04 mmol)) von N,N-Dimethylglycin (Formel XII),
5 mg (0,04 mmol) von 4-Dimethylaminopyridin und 10 mg (0,04 mmol)
von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid wurden in einer schmalen Ampulle
zusammengegeben. Es wurden 93 μl
Dichlormethan zugefügt
und man ließ die
resultierende Lösung
12 Stunden bei Raumtemperatur rühren.
Die heterogene Mischung wurde durch einen schmalen Pfropfen Silicagel
mit Ethylacetat (10 × 1
ml) filtriert und das Filtrat im Vakuum aufkonzentriert. Eine Chromotographie über 10 g
Flash-Silicagel, eluiert mit Chloroform-Methanol (20 : 1) lieferte
das Rohprodukt, das noch stark mit Dicyclohexyl-Harnstoff verunreinigt
war.
-
Das Rohprodukt (20,3 mg) wurde in
370 μl Acetonitril
aufgelöst
und bei 0°C
gekühlt.
Unter Rühren
wurden 185 μl
einer 1 M Lösung
von Fluorsäure
in Acetonitril zugesetzt und die resultierende Lösung eine halbe Stunde bei
0 °C gerührt. Zusätzliche
185 μl einer
1 M Lösung
von Fluorsäure
in Acetonitril wurden zugesetzt und man ließ die Lösung bis auf Raumtemperatur
erwärmen
und für
eine halbe Stunde rühren.
Die Reaktion wurde mit 200 μl
Wasser verdünnt,
es wurden 50 mg (0,60 mmol) Natriumhydrogencarbonat zugesetzt und
die Mischung wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis keine Schaumbildung
mehr beobachtet werden konnte. Die Mischung wurde durch einen kleinen
Pfropfen Silicagel mit Ethylacetat/Methanol (20 : 1 10 × 1 ml)
filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert und über 10 g
Flash-Silicagel chromatographisch auf gereinigt, wobei mit Chloroform-Methanol
(20 : 1 → 5
: 1) eluiert wurde. Hierbei ergaben sich 217,7 mg (87 o) von (4)
als weißer Feststoff:
Rf 0,30 (Chloroform-Methanol, 5 : 1); IR (Kbr) 3520 (m), 3395 (m),
2944 (m), 2890 (m), 1740 (s), 1674 (s), 1458 (w), 1385 (w), 1229
(m), 1192 (m), 1049 (m) cm–1; 500 MHz 1H
NMR C5D5N σ 9,78 (br
s, 1H), 7,46 (d, 1H J = 4,7 Hz), 6,51 (br d, 1H, J = 11,3 Hz), 6,10
(br s, 1H), 4,78 (br s, 1H), 4,24 (br s, 1H), 4,15 (d, 1H, J = 8,8
Hz), 4,03 (br t, 1H, J = 4,7 Hz), 3,85 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 3,43
(scheinbar q, 2H, J = 16,6 Hz), 3,40 (s, 1H), 3, 08 (br d, 1H J
= 12,4 Hz), 2,58 (m, 2H), 2,38 (s, 6H), 2,16 (dt, 1H, J = 14, 7,2,
8 Hz), 2,03 (br t, 1H J = 14,7 Hz), 1,73 (s, 3H), 1,56 (s, 3H),
1,32 (d, 3H, J = 6,7 Hz); 125 MHz 13C NMR
(C5D5N σ 197,36,
170,15, 168–12, 162,22,
126,16, 110,73, 84,29, 79,90, 78,55, 71,27, 70,43, 60,64, 48,00,
46,06, 45,51, 45,45, 45,04, 42,16, 32,69, 25,88 22,28, 15,2, 10,65.
-
Wie für den Fachmann ersichtlich,
können
die synthetischen Verfahren, die für die vorhergehenden Verbindungen
bereitgestellt wurden, erweitert werden, um die erfinderischen C-15-Seitenketten
mit unterschiedlicher Selektivität,
Toxizität,
Wirkkraft, Löslichkeit
und therapeutischer Wirksamkeit einzuschließen.
-
Beispiel 3 Anti-cancerogene
Aktivität
von Penisularinon, Glaucarubinon und verwandten Analogen.
-
Bei der in vitro-Untersuchung von
Glaucarubinon stellte sich dieses als selektiv gegenüber festen
Tumoren heraus (Tabelle 1, nachfolgend), wobei sich ein Zonendifferential
von 400 Einheiten zwischen C38 und L1210 (bei 1μg/Disk) zeigte. Ein ähnliches
oder größeres Differential
wurde für
P03 festgestellt, während
für M 17/Adr
kein Differential gefunden wurde, was eine wahrscheinliche Kreuzresistenz
mit anderen natürlichen Produkten
wie z. B. Adriamycin, anzeigt. Weiterhin konnte in Abhängigkeit
von der im Assay verwendeten menschlichen Zellinie eine unterschiedliche
Cytotoxizität
(H 125, MX-1) oder keine Cytotoxizität (CX-1, H-8) gezeigt werden.
-
Die sich anschließende in vivo-Untersuchung
(Tabelle 2, nachfolgend) zeigte eine Heilwirkung sowohl gegen C38
und P03. Ebenso konnte eine Antitumor-Aktivität gegenüber zwei weiteren untersuchten
Tumortypen, Co126 und Mam 16/C, festgestellt werden. Als einer der
interessantesten Erkenntnisse über
diese Verbindungen wurde festgestellt, dass die Dosis während der
Behandlung bis zu mehr als einer Größenordnung der Differenz vom
Therapiebeginn gesteigert werden konnte. Das bedeutet, dass supralethale
Dosen von Glaucarubinon verabreicht werden konnten, wenn die Tiere über einige
Tage mit geringeren, nicht-toxischen Dosen der Verbindung vorbehandelt
wurden.
-
Es wurden auch Quassinoid-Analoge
mit verschiedenen Substituenten an der C-15-Position auf ihre anticancerogene
Aktivität
untersucht. Die Ergebnisse fünf
solcher Verbindungen sind in Tabelle 1 dargestellt. Überraschenderweise
zeigte Ailanthinon, dem in der C-15-Kette eine Hydroxylgruppe fehlt, keine
Selektivität gegenüber festen
Tumoren, obwohl es eine ähnliche
Wirksamkeit wie Glaucarubinon aufweist. Aus diesem Grunde wurde
nicht in vivo getestet, allerdings zeigten die bei der Verminderung
der Länge
der Seitenkette verbleibenden drei Komponenten Holacanthon (der
Acetatester), Glaucarubolon (das Hydroxy-Analoge) und Chapparinon
(bei dem die C-15-Seitenkette fehlt) nicht nur eine Selektivität bezüglich fester
Tumoren sowohl muriner als auch humaner Zellen, sondern zeigte auch
eine Selektivität
gegen den gegen viele Arzneimittel resistente Brusttumor (Mam 17/Adr),
der die Expression des p-Glycoproteins bewirkt. Schließlich erscheint Peninsularion,
eine neuere Entwicklung, das zwei Kohlenstoffatome mehr als Glaucarubinone
besitzt, eine ähnliche
Wirksamkeit und ein ähnliches
Aktivitätsspektrum
zu besitzen.
-
Zwei dieser Komponenten Glaucarubolon
und Chaparrinon, wurden in vivo untersucht. Wie Tabelle 2 zeigt,
besitzen beide eine therapeutische Aktivität gegen C38, wobei die letztere
Verbindung ebenfalls eine Aktivität gegen Mam 16/C und Mam 17/Adr
aufweist. Wie in den in vitro-Untersuchungen beobachtet, dass die Wirksamkeit
sowohl von Glaucarubolon als auch von Chapparinon um etwa eine Größenordnung
geringer als die von Glaucarubinon war, wurde dies ebenfalls in
den in vivo-Untersuchungen
beobachtet.
-
-
-
Mäuse:
Es wurden gezüchtete
Mäuse C57131/6,
C3H/He, Balb/c und DBA/2 verwendet, als Hybride wurden B6D2F1 (C57B1/6
weiblich × DBA/2
männlich)
und CD2F1 (Balb/c weiblich × DBA/2
männlich)
verwendet. Alle Mäuse
wurden von der Frederick Cancer Research Facility, Frederick, Maryland
erhalten.
-
Tumore: Die folgenden transplantierbaren
festen Tumore von Mäusen
wurden für
die in vitro- und/oder in vivo-Untersuchungen
verwendet: Adenokarzinom des Ductus pancreatiucus #02[P02] (3),
Adenokarzinom des Ductus pancreaticus #03 [P03], Kolon-Adenokarzinome
#07/A [C7], #38 [C38] und #51/A [C51], undifferenziertes Kolon-Karzinom
#26 [C26], Brust-Adenokarzinom 1 6/C [Mamm 16/C], 17/A [Mamm 17]
und 17/A/ADR. [Mamm 17 Adr]. Die untersuchten Leukämien waren
L1210, P388, lymphozytische Leukämie
und C1498 Rückenmarks-Leukämie. Alle
Tumore gehören
zu dem Aufbewahrungsort gefrorener Tumore des Entwicklungsprogramms
für Therapeutika
(DTP), die vom biologischen Untersuchungszweig in Frederick, Maryland,
erhalten wurden. Jeder Tumor hat eine detaillierte Beschreibung,
eine Code-Identifikationsnummer
und eine Liste von Literaturstellen beim nationalen Aufbewahrungsort
für Tumore.
-
Die Tumore wurden aus den originären Mausstämmen erhalten
und entweder in das entsprechende Fl-Hybrid oder den originären Stamm
für die
Therapieuntersuchungen transplantiert. Alle Mäuse wogen beim Beginn der Therapie
etwa 17 g, wobei der Schwankungsbereich des individuellen Körpergewichts
in jedem Versuch innerhalb von 2 g lag. Die Mäuse wurden nach Belieben mit
Nahrung und Wasser versorgt.
-
Folgende humane Tumore wurden eingesetzt:
Humaner adenosquamöser
Lungentumor H-125 (7) und die Kolontumore H8, HCT-116 und CX-1 wurden
für die
in vitro-Untersuchung HCT-116 und CX-1 wurden für die in vitro-Untersuchung
separat eingesetzt. Jede humane Zelllinie wurde in der Kultur gehalten,
bis eine Plattenkultur vorlag. HCT-116, H8 und CX-1 wurden aus McCoy-Medien
und durch mit Hitze inaktivierten fetalen Bovinenserum (11% FBS)
erhalten. Man ließ dies
zweimal die Woche durchlaufen (Verdünnung 1 : 5), gefolgt von einer
enzymatischen Dissoziation unter Verwendung einer Trypsin/PBS-EDTA-Mischung.
H-125 wurde aus CMRL/Fischer-Medium (1 : 1) mit 11% FBS erhalten.
Es wurde mechanisch dispergiert und man ließ es wöchentlich durchlaufen (Verdünnung 3
: 10). Für
die Plattenkultur wurden alle Zellen mechanisch dispergiert und
in CMRL/Fischer-Medium
verdünnt.
-
Antitumormittel: Die Verbindung war
in einem Verdünnungsmittel,
das aus 3% [V/V (100%-Reinheit)] Ethanol, 1 (V/V) Polyoxyethylansorbitan-Monopalmitat
(P. O. E. 40) und 96% sterilem destilliertem Wasser bestand, leicht
löslich.
Die intravenöse
Verabreichung war bevorzugt (IV).
-
In vitro-Untersuchungen: Für das Assay
wurden Leukämiezellen
und feste Tumorzellen in einer Plattenkultur mit weichem Agar eingesetzt.
Der Wirkstoff wurde auf eine Filterpapier-Disk gegeben, die dann
auf das die Tumorzellen (9, 10) enthaltende weiche Agar gegeben
wurden. In Kürze,
es wurde eine harte Unterschicht [enthaltend eine tryptische Sojakultur
(0,8%), Edel-Agar (0,8%), CMRL/Fischer-Medium und Pferdeserum (11%)
bei 480] in 60 mm-Kunststoffschalen gegeben (3 ml in jede), man
ließ diese
erstarren und bewahrte sie bei 37°C
in 5% CO2 auf. Die Unterschichten wurden
4 bis 10 Tage nach der Herstellung verwendet. Eine weiche Agar-Oberschicht,
enthaltend Edel-Agar (0,44 o), das CMRL/Fischer-Medium, Pferdeserum
(11 ) und einen Tumorzellen-Titer wurden darübergegeben und man ließ diese
erstarren.
-
50 μl jeder Wirkstoff-Verdünnung in
Ethanol wurden 6,5-mm-Disks
zugesetzt, die man trocknen ließ und
dann in die die Tumorzelle enthaltende Schale gab. Die Platten wurden
6 bis 10 Tagen inkubiert und mit einem Le-Chatellier-Mikroskop geprüft (40fache
Vergrößerung).
In Abhängigkeit
von der den Zellen innewohnenden Empfindlichkeit für den Wirkstoff
(und die Konzentration des Wirkstoffs) trat eine Inhibierungszone
der Kolonienbildung auf. Die Inhibierungszone (gemessen von der
Kante der Disk bis zu den ersten Kolonien) wurde in Einheiten bestimmt:
200 Einheiten = 6,5 mm (die Größe der Filterpapier-Disk).
-
Präparierung der Zellen: sowohl
die Tumorzellen der Maus als auch die Leukämie L1210 ließ man subkutan
in den entsprechend erzeugten Mäusen
durchlaufen. P388 wurde durch Gewebskulturen für die beschriebenen in vitro-Studien
erhalten. Zellen für
das in vitro-Assay wurden direkt von diesen SC-Durchlauftumoren
wie zuvor erörtert,
erhalten. Die Titer wurden so eingestellt, um mehr als 500 Kolonien
pro Schale herzustellen.
-
In vivo-Chemotherapie: Die Verfahren
des Protokolldesigns, der Tumortransplantation, der Wirkstoffbehandlung
der Endpunktbestimmung der Zeitraumsbestimmung, der Evaluierung
der Toxizität,
der Datenanalyse der Quantifizierung der Tumorzellenabtötung und
die biologische Bedeutung der Ergebnisse der Wirkstoffbehandlung
von transplantierbaren Tumoren sind vorgestellt worden. Im Folgenden
ist eine kurze Zusammenfassung dieser Methoden aufgeführt, die
die beschriebene Arbeit betreffen.
-
Die Tiere, die zum Beginnen eines
Experiments notwendig sind, wurden gepoolt, es wurden doppelseitig
SC am Tag 0 bis 60 mg Tumorfragmente unter Verwendung eines 12-Gauge- Trokars implantiert
und vor der Randomisierung der verschiedenen Behandlungs- und Kontrollgruppen
erneut gepoolt. Die Chemotherapie wurde jeweils innerhalb von 3
Tagen nach der Tumorimplantation begonnen, als die Zellenzahl pro
Maus relativ gering war (107 bis 108 Zellen) oder man ließ sie bis zur Palpation im
fortgeschrittenen Stadium (etwa 3 × 108 Zellen)
wachsen.
-
Die Tumore wurden jeweils einmal
oder zweimal wöchentlich
(wie erforderlich) mit einem Caliper gemessen, bis jeder Tumor 1500
mg übertraf
oder die Heilung gesichert war. Die Tumorgewichte wurden aus zweidimensionalen
Messungen berechnet: Tumorgewicht (mg) = (a × b2)/2,
wobei a und b die Tumorlänge
bzw. Tumorbreite (mm) darstellen.
-
Endpunkte für die Bewertung der Antitumor-Aktivität: Die folgenden
quantitativen Endpunkte wurden zur Bewertung der Antitumor-Aktivität verwendet:
Verzögerung des
Tumorwachstums: (T-C-Wert), worin T den zeitlichen Mittelwert (in
Tagen) darstellt, der erforderlich ist, dass die Tumore der Behandlungsgruppe
eine vorbestimmte Größe erreichen,
und C den zeitlichen Mittelwert (in Tagen) für die Tumore der Kontrollgruppe
darstellt, um die gleiche Größe zu erreichen.
Tumor-freie Überlebende
wurden von diesen Berechnungen ausgeschlossen (die Heilungen wurden
separat tabelliert).
-
Berechnungen der Zerstörung der
Tumorzellen: Für
SC-wachsende Tumore wurde der Log
10-Kill
aus folgender Formel berechnet:
worin
T-C die Verzögerung
des Tumorwachstums (in Tagen), wie zuvor beschrieben, darstellt
und Td die Verdoppelungszeit des Tumorvolumens (in Tagen) ist, wobei
letztere aus der Linearität
der Best-Fit-Straight-Live (BFSL) für den logarithmisch-linearen
Wachstumsplot der Tumoren der Kontrollgruppe im exponentiellen Wachstum
(500 bis 1500 mg-Bereich)
berechnet wird. Die Umwandlung der T-C-Werte des Log
10-Kills
ist möglich,
da die Td-Werte der Tumore in unbehandelten Kontroll-Mäusen durch
die Td der Tumore, die bei der Nachbehandlung nachwachsen, angenähert wurde.
-
Bestimmung der Aktivität durch
Inhibierung des Tumorwachstums (T/C-Wert)
-
Die Messungen wurden gleichzeitig
sowohl in der Behandlungsgruppe als auch in der Kontrollgruppe durchgeführt. Das
mittlere Tumorgewicht jeder Gruppe wurde bestimmt (einschließlich 0),
wenn die Tumore der Kontrollgruppe ungefähr 750 bis 1500 mg (Mittelwert
der Gruppe) erreichten. Der T/C-Wert in Prozent ist ein Anzeichen
für die
Antitumor-Effizienz. Ein T/C von weniger oder gleich 42 o wird als
signifikante Antitumor-Aktivität
betrachtet. Ein T/C-Wert < 10 o zeigt einen
hohen Grad an Antitumor-Aktivität
an und stellt das Niveau dar, das von NO verwendet wird, um eine
weitere Entwicklung zu rechtfertigen, wenn andere Erfordernisse
erfüllt
sind (genannt DN-Niveau-Aktivität).
-
Ein Gewichtsverlust-Nadir von 20
o pro Maus oder mehr (Mittelwert der Gruppe) oder 20 oder mehr Arzneimittel-Sterbefällen wird
ausdrücklich
als tödliche
Dosis betrachtet. Die Körpergewichte
der Tiere schlossen die Gewichte der Tumore ein.
-
Beispiel 4 Antivirale
Aktivität
und Inhibierungsaktivität
der NADH-Oxidase
-
Gereinigtes und isoliertes Glaucarubolon
und bestimmte synthetische Analoga wurden auf die Möglichkeit
einer antiviralen und einer Anti-NADH-Oxidase-Aktivität untersucht.
Wie in den nachfolgenden 4 bis 7 und Tabellen 3 bis 5 dargestellt,
zeigt Glaucarubolone und identifizierte Analoga in einer Serie von
Experimenten eine wirksame antivirale Aktivität gegen Rhinoviren die Aujeszky-Krankheit
und bei Retroviren wie den FIV-Virus und den HIV-Virus wurde die
Inhibierung der NADH-Oxidasen mit Glaucarubolon sowohl in tierischen
Zellkulturen als auch in aus Pflanzen ausgeschnittenen Gewebssegmenten
beobachtet.
- A. Crandall-Feline-Nierenzellen
(CFK-Zellen) wurden mit dem felinen Immunodefizit-Virus (FIV) infiziert und
mit Glaucarubolon und Glaucarubolon-Brefeldin-A-Konjugat, wie es in 6 zu sehen ist, geprüft. Wie in den nachfolgenden 6 und 7 und Tab. 3 zu sehen, zeigten beide
unterschiedliche Zerstörungen
infizierter Zellen im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen.
- B. Wie in 8 zu sehen,
wurden menschliche HIVinfizierte MOLT-4-Zellen unterschiedlich zerstört, wobei dieser
Unterschied zwei logarithmische Einheiten für Glaucarubolon gegenüber nicht-infizierten
Zellen betrug. Wie in 9 zu
sehen, konnte eine ähnliche
Aktivität
mit einem Glaucarubolon-Brefeldin-A-Konjugat beobachtet werden.
- C. HeLa-Zellen (Wisconsin-Stamm, Berlin, Deutschland) wurden
mit menschlichem Rhinovirus-14 in Kontakt gebracht. Die infizierten
Zellen (Wisconsin-Stamm) wurden beobachtet. Cytopathische Effekte
wurden durch Glaucarubolon, Simalikalacton D, Quassimarin und Peninsularinon
verzögert.
HeLa-Zellen wurden von keiner einzigen verwendeten Verbindung zerstört. Zellen
anderer HeLa-Linien (z. B. ATCC CCL2) wurden zerstört. Glaucarubolon,
Simalikalacton D und Chaparinon wurden auf die Zellzerstörung und
Virus-Produktion durch primäre
Blutmonozyten getestet. Alle drei Arzneimittel wurden bei fünf Konzentrationen
( 0, 10–9,
10–8,
10–7 und
10–6 M)
getestet . Die Arzneimittel wurden zu unterschiedlichen Zeiten vor
der Infektion, zum Zeitpunkt der Infektion oder zu verschiedenen
Zeiten nach der Infektion gegeben. Es wurden gleiche Resultate erzielt,
was dafür
spricht, dass die toxischen Effekte eher gegen die infizierten Zellen
als gegen den Virus an sich gerichtet waren.
- D. Nierenzellen von Kaninchen wurden mit porcinen Viren der
Aujeszky-Krankheit in Kontakt gebracht und visuell beobachtet. Glaucarubolon
inhibierte cytopathische Effekte des Virus und zeigte keine cytopathischen
Effekte auf nicht-infizierte Kontrollzellen, die mit Glaucarubolon
behandelt wurden. Inhibierende Effekte wurden ebenso mit Quassimarin,
Similakalacton D, Bruceantin und Peninsularinon beobachtet.
- E. Die Inhibierung der NADH-Oxidase-Aktivität in tierischen und pflanzlichen
Zellen wird mit Bezug auf Tab. 4 und 10 und 11 gezeigt. Es wurde herausgefunden,
dass Glaucarubolon die NADH-Oxidation der Plasmamembran in FIV-infizierten
HeLa-Zellen ebenso wie in nicht-infizierten Zellen inhibiert. Wie
in 10 zu sehen, inhibiert
Glaucarubolon die NADH-Oxidation
sowohl in HeLa (ATCC CCL2-Stamm) als auch in isolierten Plasmamembranen
von Leberzellen. Wie in 11 zu
sehen, ist die NADH-Oxidation in Hypocotyl-Gewebe von pflanzlichen
Sojabohnen ähnlich
inhibiert.
-
Tabelle
3: Zeit zur kompletten Zellzerstörung
(> 98 %) durch Glaucarubolon
-
Tabelle
4 zeigt die Inhibierung der NADH-Oxidase-Aktivität von Zellfraktionen durch
Glaucarubolon.
-
Tabelle 5 zeigt die Inhibierung durch
variierende Konzentrationen von Simalikalacton D der NADH-Oxidase-Aktivität isolierter
Plasmamembran-Vesikel, die aus verlängerten Bereichen dunkler Sojabohnen-Hypokotylen
und vom Wachstum von 1 cm-Bereichen, die aus den verlängerten
Bereichen der dunklen Sojabohnen-Hypokotylen geschnitten wurden
und auf der Lösung
schwimmen. Die Inhibierung der NADH-Oxidase wurde durch Zusatz der
Simalikalacton D-Lösungen
direkt zu den isolierten Plasmamembran-Vesikeln bestimmt.
-
-
Beispiel 5 Herbistatische
und herbizide Aktivität
-
Es wurde herausgefunden, dass die
erfindungsgemäßen Verbindungen
den Wachtums-Phenotypen von Pflanzen beeinflussen, typischerweise
durch Inhibierung des fortgesetzten Wachstums der Pflanzen oder durch
Auslösung
einer Zellzerstörung
der Pflanzen. Die vorliegende Erfindung umfasst daher die Verwendung der
Quassinoide wie Glaucarubolon als Herbistatika oder Herbizide, nützlicherweise
in Verbindung mit konventionellen herbistatischen oder herbiziden
Trägern,
die dem Fachmann zur Kontrolle des Pflanzenwachstums bekannt sind.
Es wird vermutet, dass herbistatische und herbizide Vorgänge von
Modifikationen der zellulären NADH-Oxidase-Aktivität abhängen. Außerordentlicherweise
wurde die Inhibierung sowohl basaler als auch auxin-stimmulierter
Komponenten der NADH-Oxidase in Pflanzen identifiert.
-
Um den Wachstums-Phenotypen einer
Gruppe von Pflanzen zu bewerten, wurde eine 1 mg-Probe von Glaucarubolon
in DMSO oder Ethanol mit einer endgültigen Konzentration von 100
mM (Lösung
QD-2) gelöst. Diese
Lösung
wurde reihenweise mit Wasser mit oder ohne Triton X-100, Ethanol
oder DMSO verdünnt
und direkt für
die Messungen der Effekte auf die Samenkeimung verwendet oder mittels
einer Mikroliter-Spritze
den Blättern
zugeführt,
um die Wachstumseffekte auf die Pflanzen zu bestimmen.
-
Hinsichtlich der Samenkeimung wurde
die Verbindung hinsichtlich fünf
Spezien bewertet: Kohl (Early Jersey Wakefield), Rettich (Scarlet
Turnip White Tipped), Karotten (Denvers Half Long), Tomaten (Rutgers) und
Sorghum (DeKalb 18). Für
die Wasserverdünnungen
wurde die Samenkeimung aller Spezien bei 10 um (eine wässrige Verdünnung von
10 μl von
100 mM 1 : 1000 in 100 μl
Wasser) inhibiert (Endgültige
DMSO-Konzentration von 1 : 10.000 = 0,01%). Die Keimung der Tomaten
wurde bei 10 μl/100 μl einer wässrigen
Verdünnung
von 1 : 10.000 = 1 μM
endgültige
Konzentration inhibiert. Mit DMSO- und Ethanol-Verdünnungen
wurden Inhibierungen bei einer endgültigen Verdünnung von 1 : 106 oder
1 : 107 (10-100 Nm) beobachtet, aber die Lösungsmittel
an sich tendieren dazu, die Keimung ebenfalls zu hemmen.
-
Bei Anwendung gegenüber Arabadopsis
(var. Columbia), das im Boden in 4-inch-Kunststofftöpfen wuchs,
wirkte die Glaucarubolon-Zubereitung bei Verdünnungen von 1 : 100 und 1 :
1000 (10 μl/halber
Topf) herbizid. Die Pflanzen wurden nach 10 Tagen Keimungszeit behandelt.
Bei einer Verdünnung von
1 : 10.000 wurden die Pflanzen nicht zerstört, aber das Wachstum wurde
für 3 Wochen
vollständig
gestopt. Das Wachstum setzte nach mehr als 30 Tagen nach der Behandlung
wieder ein. Die Anwendungsdosis für den behandelten Bereich (schätzungsweise
ein 2-Inch-Kreisdurchmesser) wurde mit 2,5 × 10–4 oz/A
berechnet. Etwa 10 der Pflanzen, die eine Verdünnung von 1 : 1000 überlebten,
wuchsen für > 50 Tage nicht. Die
berechnete Anwendungsdosis betrug 2,5 × 10–3 oz/A.
-
Im Boden wachsendes Sorghum (DeKalb
18)-Pflanzen wurden wie zuvor Arabadopsis thaflani nach 6 Tagen
Keimung, wenn. die Pflanzen über
5 cm hoch waren (wenn das Blatt aus der Coleoptilen-Umhüllung hervortritt),
behandelt. Das Wachstum wurde gebremst. 20 Tage nach der Behandlung
waren die Kontroll-Pflanzen 16 cm hoch und die behandelten Pflanzen
12 cm hoch. Die Anwendungsdosis betrug 10 μl von 1 : 1000/halber Topf =
2,5 × 10–3 oz/A.
-
Tomatenpflanzen, die über zum
Zeitpunkt der Behandlung 3,5 cm hoch waren, wurden in Torf in Bereichen
von 1,5-inch-Durchmesser-Zellen
gezüchtet
und wurden entweder mit wässrigen
Simalikalacton (Lösung
QD-1) oder wässrigen
Glaucarubolon (Lösung
QD-2), enthaltend 0,1% Triton X-100,
behandelt. Das letztliche Volumen pro Pflanze betrug 10 μl für die wässrige Lösung und
200 μl für die wässrige Lösung enthaltend
Triton X-100. Bei einer Anwendungsdosis von 100 mM, verdünnt 1 :
100 (10 μl
im 200 μl
0,1% Triton X-100), wachsen die behandelten Pflanzen nicht und sind
schließlich
nach etwa 30 Tagen zerstört.
30 Tage nach der Behandlung waren die behandelten Pflanzen, die
1 : 1000 und 1 : 10.000 Verdünnungen
in Detergenzlösungen
erhielten, noch inhibiert. Bei der wässrigen Behandlung waren die
Pflanzen ebenfalls inhibiert, aber nicht so beachtlich wie mit einem
Detergenz.
-
In einem Experiment mit Arabadopsis,
bei dem die Quassinoid-Zubereitung in Ethanol verabreicht wurde,
wurde eine herbizide Aktivität
bis hinab, zu einer Verdünnung
von 1 : 104 (2,5 × 10–5 oz/A)
beobachtet, und eine Verdünnung
von 1 : 105 (2,5 × 10–6 oz/A)
schien das Wachstum für
wenigstens 30 Tage zu beenden. Alle Pflanzen wurden von unten bewässert, um
eine Oberflächenverbreiterung
der Pflanzen zu vermindern. Der inhibierte Phänotyp schließt eine
beeinträchtigte
Wachstumsfähigkeit
der Pflanzen ein, d. h. die Zellverlängerung/Zellvergrößerung wird
verhindert oder um mindestens 50 über mehrere Wochen reduziert.
-
Beispiel 6 Die Herstellung
von Antikrebs-Arzneimittelkonjugaten enthaltend Quassinoide, die
ein spezifisches Target für
eine Zelloberfläche,
die NADH-Oxidase-spezifisch für
Krebszellen ist und als tNOX benannt ist, bildet
-
Die wirkstoffaktive Stelle für tNOX ist
an der äußeren Oberfläche der
Krebszelle angeordnet. Somit braucht das Arzneimittel nicht in die
Zelle einzudringen, um wirksam zu sein. Tatsächlich ist ein Ziel der hier beschriebenen
Konjugate, die Toxizität
zu vermindern, indem das Eindringen der Arzneimittel in die Zellen
verhindert wird.
-
Der Wachstum der Zellen, die Herstellung
der Plasmamembranen und die spektrophotometrischen Messungen wurden
wie zuvor beschrieben, durchgeführt.
-
Während
vorbereitender Studien wurde ein derivatisiertes Glaucarubolon (unten)
zur Verbindung mit Antikörpern
hergestellt. Das derivatisierte Arzneimittel wurde an Amino-Propylenglykol (durchschnittliches
Molekulargewicht 5.000) in Gegenwart von 10 mM des Kupplungsreagenzes
Dicyclohe xylcarbodiimid (DCC) (Sigma) gekoppelt.
-
-
Diese Ausführungsform ist die Grundlage
für eine
neue Strategie zur Herstellung von Antikrebsmitteln, wobei die als
Targetmolekül
für tNOX
dienenden Antikrebs-Quassinoide mit Polymeren kombiniert werden,
um die Wirksamkeit zu erhöhen
und ungewünschte
Toxizitäten
zu reduzieren. Die konjugierten Arzneimittel brauchen nicht in die
Zelle einzudringen, um wirksam zu sein und können als Targetmolekül für Zellen,
die spezifische Determinanten tragen, spezifiziert werden. Die Erfindung
ist eine Verbesserung gegenüber
dem was bis dato existiert, da ein Zelloberflächen-Target bereitgestellt und ein hoher
Spezifizitätsgrad
erreicht wird. Demgemäß brauchen
die Arzneimittel nicht in die Zelle einzudringen, um wirksam zu
sein. Durch die spezifische Ansteuerung der Krebszellen werden nur
die Krebszellen zerstört
und normale Zellen bleiben unbeschädigt.
-
Das Wesen des Kleinmoleküls, das
durch die Konjugation mit einem Polymer unbeständig ist, kann jedes Quassinoid
einschließen,
das tNOX-inhibiert, einschließlich
aber nicht beschränkt
auf Glaucarubolon. Die Polymere kommen alle wasserlöslichen,
geeignet fraktionalisierten Makromoleküle in Frage, einschließlich aber
nicht beschränkt
auf Proteine, Dextrane, Cyclodextrine, Polyethylenglykole, Nukleinsäuren, Polymere
von Ethylen- oder Propylenglykol und ver schiedene 35 einfache und
komplexe Carbohydrat-Polymere. Charakteristiken von Polymeren, die
für die
Herstellung effektiver Anti-tNOX-Arzneimittelkonjugate für die Verwendung in
der Krebsbehandlung geeignet sind, schließen einen hohen Grad an Wasserlöslichkeit,
eine geringe Toxizität
und eine geringe Antigenizität
ein. Cyclodextrine, Polyethylenglykole und Ethylen- oder Propylenoxid-Polymere
zeigen nahezu ideale Eigenschaften in dieser Hinsicht. Die Zahl
der Polymeruntereinheiten kann zwischen n = 1 bis n = 1000 oder
höher variieren,
was von der Löslichkeit
und der Permeationscharakteristik, die für die Optimierung der Bereitstellung
des Arzneimittels an der aktiven Targetposition erforderlich ist,
abhängt. Im
einfachsten Beispiel, wo n = 1 ist, wurde das Arzneimittel nur konjugiert,
um den Transport zum tNOX-Target sicherzustellen und den Zelleintritt
zu verhindern, aber nicht den Eintritt des Arzneimittels in feste
Tumore und Tumorzellenaggregate zu begrenzen, wodurch die Entwicklung
eines Konjugates mit guter oraler Bioverfügbarkeit ausgeschlossen wird.
Die Bindung der kleinen Moleküle
und der Polymere kann auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden,
einschließlich
aber nicht beschränkt
auf die zuvor genannten Beispiele. Für die Bindungsmethode wichtige
Faktoren können
die Einfachheit der Herstellung, die Reproduzierbarkeit und die
relative Stabilität
des Konjugates einschließen.
-
Wie in 12 zu
sehen, wird die Abhängigkeit
der NADH-Oxidase-Aktivität der HeLa-Zell-Plasmamembranen
auf die Konzentration von Glaucarubolon vom Redox-Gleichgewicht
wenig beeinflusst. Es scheint, dass es einen vom Redoxgleichgewicht
unabhängigen
tNOX-Inhibitor darstellt. Weiterhin scheint es, wie es 13 zeigt, dass das Glaucarubolon-Aminopolyethylenglykol-Arzneimittel-Konjugat
die grundlegende tNOX-Aktivität
bei subnanomolaren Konzentrationen in Gegenwart von GSSG, oxidiert
bei 1 μM
in Gegen wart von GSH, zu inhibieren.
-
Tabelle 6 zeigt die Redox-Unabhängigkeit
der Wachstumsinhibierung von HeLa-Zellen durch das Glaucarubolon-Aminopolyethylenglykol-Konjugat
im Vergleich zu Glaucarubolon alleine. Die reduzierte Umgebung wurde
durch Zusatz von 100 μm
Cystein und die oxidierte Umgebung durch Zusatz von 10 μm tert-Butylhydroperoxid
erhalten.
-
-
Tabelle 7 zeigt die Antwort normaler
und anhaltend infizierter CFK-Zellen auf Glaucarubolon-Amino-PEG-Konjugate,
untersucht bei 10–6 M.
-