DE19641213B4

DE19641213B4 - Cyclische Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE19641213B4
Application number: DE19641213A
Authority: DE
Inventors: Birgit Dr. Krebs; Andrea Dr. Ockhardt; Birgit Höding; Peter Dr. Bendzko; Jewgenij Dr. Maximov; Winfried Dr. Etzel
Original assignee: Peter Dr. Bendzko; Birgit Dr. Krebs; Andrea Dr. Ockhardt
Current assignee: BENDZKO, PETER, DR., 12623 BERLIN, DE; KREBS, BIRGIT, DR., 73061 EBERSBACH, DE; OCKHARDT, ANDREA, DR., 13057 BERLIN, DE
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1996-09-26
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2016-09-27
Also published as: DE19641213A1

Abstract

Cyclische Peptide mit der Aminosäuresequenz

bedeutet
und ein Peptid mit der Aminosäuresequenz

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft cyclische Peptide, Verfahren zu Ihrer Herstellung und ihre Verwendung gemäß den Patentansprüchen.
Die Erfindung betrifft antibiotische Peptide, die sowohl zur Behandlung von Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier als auch zur Verhinderung oder Minimierung von Schädigungen landwirtschaftlicher oder gärtnerischer Kulturen eingesetzt werden können. Die Erfindung betrifft antibiotische Peptide, die zur Verhinderung von Mycotoxinkontaminationen pflanzlicher Nahrungsmittel infolge eines Pilzbefalls während der Kultur oder Lagerung und zur Desinfektion angewendet werden können. Außerdem betrifft sie biologisch aktive Peptide, die zur Steigerung der pflanzlichen Ertragsleistung eingesetzt werden können.

Aus Bacillus subtilis-Species sind antifungal wirksame Peptide isoliert und in der Literatur beschrieben worden (u.a. Loeffler et al.: J. Phytopathol. 115 (1986) 204-213). Besondere Beachtung finden dabei die iturinartigen Verbindungen, bei denen es sich um zyklische Heptapeptide handelt, die über eine β-Aminosäure verknüpft sind. Charakteristisch für diese Verbindungen ist die folgende Anordnung der Stereospezifität der Aminosäuren: L D D L L D L.

Erste Hinweise zu antifungalen Verbindungen von Bacillus subtilis finden sich bereits 1949 bei Michener (Michener; H.P.: Arch. Biochem. 22 (1949), 208-214). Sharon prägt 1954 (Sharon, N.: Nature 174, 1190-1191) den Begriff der antifungalen Antibiotika im Zusammenhang mit Metaboliten von Bacillus subtilis. Er wird von Katz (Katz, A.: Bacteriol. Rev. 41(1977), 449-474) in seinem Übersichtsartikel zu Peptidantibiotika desselben Mikroorganismus aufgegriffen. In der Folgezeit häufen sich die Entdeckungen neuer Vertreter der Substanzklasse der iturinartigen Verbindungen wie: Iturin A (Besson, F. et al.: J. Antibiotics 29 (1976), 1043-1049; Besson, F.: J. Antibiotics 31 (1978), 284-288); Bacillomycin L (Besson, F.: Eur. Biochem. 77 (1977), 61-67), Bacillomycin L (Peypoux, F.: J. Antibiotics 37 (1984) 12, 1600-1604); Bacillomycin D (Peypoux,F. et al.: J. Antibiotics 33 (1980) 10, 1146-9; Peypoux, F. et al.: Eur. J. Biochem. 118 (1981) 2, 323-327; Peypoux, F.: J. Antibiotics 37 (1984) 12, 1600-1604 ); Bacillomycin F (Mhammedi, A. et al.: J. Antibiotics 35 (1982) 3, 306-311; Michel, G. et al.: Fr. Demande FR 2.508.766 CI. A01N63/02 07.01.1983; Peypoux, F.: Eur. J. Biochem. 153 (1985) 2, 335-340); Iturin A_L (Winkelmann, G. et al.: J. Antibiotics 36 (1983) 11, 1451-1457; Allgaier, H.: Liebigs Ann. Chem. 5 (1984) 854-866); Iturin A-2 (Tsuchimori, N.: Comp. Biochem. Physiol.; C: Comp. Pharmacol. Toxicol. 84C (1986) 2, 381-384); Iturin D und E (Besson, F. et al.: J. Antibiotics 40 (1987) 4, 437-442); Bacillomycin F_b und F_c (Besson, F.: J. Antibiotics 41 (1988) 3, 282-288). Auch in jüngerer Zeit sind neue Peptidwirkstoffe aus Bacillus subtilis beschrieben wie Bacillomycin Lc (Eshita, S.M, et al.:J.Antibiotics 48 (1995) 11, 1240-7 und Bacillopeptin (Kajimura, V. et al.:J.Antibiotics 48 (1995)10, 1095-103). Von Bland, J.M., J. Org.Chem. 1996, 61, Seiten 5663 – 5664 wird die erste Synthese von Iturin A2, beschrieben.

Die iturinartigen Substanzen zeichnen sich durch ein breites Wirkungsspektrum gegen phytopathogene Pilze aus; einzelne Vertreter werden aufgrund dieser Eigenschaft auch wirtschaftlich genutzt (Ajinomoto: Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 59.212.416 (CI. A01 N63/02), 01.12.1984; Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 04.166.080, 11.6.1992; Eur. Pat. Appl. EP 536.455, 14.4.1993; Fushimi, S.: Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 0551.397, 02.03.1993).

Allerdings differieren die Wirkungskonzentrationen der einzelnen iturinartigen Verbindungen trotz nur geringer Strukturunterschiede erheblich. Zur Aufklärung ihrer Wirkungsmechanismen werden zahlreiche Untersuchungen beschrieben, z. B. die Bestimmung von minimalen Hemmkonzentrationen gegen eine Vielzahl phytopathogener Mikroorganismen und Untersuchungen zum Einfluß von Iturin A auf Saccharomyces cerevisiae, dabei insbesondere a) die Modifizierung der Membranpermeabilität und der Lipidzusammensetzung unter Peptideinwirkung (Latoud, C. et al.: J. Antibiotics 40 (1987) 11, 1588 -1595), b) die Beeinflussung der Phospholipaseaktivität von Membranvesikeln (Latoud, C.: J. Antibiotics 41 (1988) 11, 1699 -1700) und c) der Einfluß auf die Zusammensetzung der Sterolmembran (Latoud, C. et al.: Can. J. Microbiol. 36 (1990) 6, 384-389). Es erfolgt die Charakterisierung der porenbildenen Eigenschaften von iturinartigen Verbindungen (Maget-Dana, R. et al.: Biochim. Biophys. Acta 815 (1988) 3, 405-409). Weiterhin liegen Untersuchungen zur Charakterisierung von hämolytischen Eigenschaften der Iturine und Bacillomycine gegenüber humanen Erythrozyten vor (Latoud, C. et al. Biochim. Biophys. Acta 85 (1986) 3, 526-535).

Es wurden erste Untersuchungen zum Einfluß einer chemischen Modifizierung der Grundstruktur ausgewählter iturinartiger Verbindungen auf ihre Wirkung durchgeführt (Harnois, I.: Biochimie 71 (1989) 1, 111-116; Tenoux, J. et al.: Microbios 67 (1991) 187-193).

In der Literatur finden sich erste Hinweise zu Antitumorwirkungen (Ikegami, I. et al.:JP 6193,125 12.5.86) der iturinartigen Verbindungen.

Das Ziel der Erfindung ist die Herstellung von mikrobiellen, biologisch aktiven Wirkstoffen mit breitem Wirkungsspektrum und Einsatzgebiet.

Die Aufgabe der Erfindung ist das Auffinden geeigneter Wirksubstanzen und Mikroorganismen, die diese Substanzen synthetisieren, sowie die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung und Aufarbeitung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe und die Ermittlung ihrer Wirkungen.

Der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung sind zyklische, dem Bacillomycin D verwandte Peptide von Bacillus subtillis, die sich neben einem breiten Spektrum antifungaler Wirkungen in überaschender Weise durch antivirale, phytoeffektive und Nematoden hemmende Wirkungen auszeichnen.

Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin die Beschreibung des Herstellungsverfahrens der erfindungsgemäßen Peptide, welches sowohl hohe Ausbeuten als auch sehr hohe Reinheiten der isolierten Verbindungen gewährleistet.

Aus dem Kulturüberstand des erfindungsgemäßen Bacillus amyloliquefaciens-Stammes wurden sechs Peptide mit sehr hoher Reinheit isoliert. Bei den Verbindungen handelt es sich um zyklische Heptapeptide, die durch folgende Aminosäurezusammensetzungen charakterisiert sind:

I Asp, Asn, Tyr, Pro, Glu, Ser, Thr, R-CH(NH)CH₂CO-
II Asn (2x), Tyr, Pro, Glu, Ser, Thr, R-CH(NH)CH₂CO- R = C₈H₁₇ bis C₂₅H₅₁, insbesondere C₁₀H₂₁ bis C₁₃H₂₇

Hierbei stehen
Asp für Asparaginsäure
Asn für Asparagin
Tyr für Tyrosin
Glu für Glutaminsäure
Ser für Serin
Thr für Threonin.

Mit Hilfe von TOCSY-, NOESY-, ROESY- HMBC- und HMQC-Spektren, die mit Hilfe eines BRUKER DMX 600 MHz-NMR-Gerätes von den gereinigten Wirkstoffen gemessen wurden, wurden die nachfolgenden Aminosäuresequenzen und die Struktur der Seitenkette R wie folgt bestimmt: Peptid A

Peptid B bis F

Die stereochemische Konfiguration der Wirkstoffe konnte mit Hilfe chromathografischer Trennungen an Chirosyl-Val-Trägern bestimmt werden. Von den Peptiden A bis F sind die Petide A, C und F neu und die Peptide B, D, und E bekannt aus J. Org. Chem. 1996, 61, 5663 und 5664.

Die erfindungsgemäßen Peptide A, C und F, sowie die bekannten Peptide B ,D und E wurden an einem FINNIGAN MAT TSQ 700 Massenspektrometer analysiert und mittels ESI – MS folgende Molekulargewichte bestimmt:

Analytische Meßergebnisse werden im folgenden am Beispiel des Peptids A dargestellt. Analoge Messungen liegen für die anderen Peptide B – F vor.

1: zeigt die APCI -Molekulargewichtsbestimmung (M + H⁺) des Peptides A

2: zeigt ein Protonenübersichtsspektrum (¹H – NMR, 600 MHz) von Peptid A

3: zeigt einen TOCSY – Ausschnitt der N – H – Protonen von Peptid A

4: zeigt einen TOCSY – Ausschnitt zur Identifizierung von Prolin im Peptid A

5: zeigt einen NOESY – Ausschnitt mit den NOE – Cross – Peaks zwischen den N – H – Protonen und den alpha – H – Protonen zur Bestimmung der Aminosäuresequenz von Peptid A

6: zeigt einen Ausschnitt aus dem Aliphatenbereich des HMQC – Spektrums von Peptid A

7: zeigt einen NOESY – Ausschnitt des alpha – H – bis delta – H – Bereiches von Peptid A

Die 1 bis 7 sind im Anschluß an die Patentbeschreibung wiedergegeben.

Physikochemische Eigenschaften der Peptide werden in Tab. 1 dargestellt.

Löslichkeit:

– sehr gut löslich in H₂O; CH₃OH; C₂H₅OH; C₃H₇OH; C₄H₉OH; Cyclohexanol, Acetonitril
– schlecht löslich in CCl₄; CHCl₃
– unlöslich in n-Alkanen (n-Hexan) und Alkylaromaten (Benzen)

Sowohl die erfindungsgemäßen Peptide A, C, F als auch die bekannten Peptide B, D und E besitzen eine amphiphile Struktur und zeichnen sich aufgrund dessen durch oberflächenaktives Verhalten aus.

Mittels HPLC-Analytik an einer RP-18-Phase konnte folgende natürliche Verteilung der Verbindungen (in %) unter den gewählten Kultivierungsbedingungen (vergl. Beispiel 2) im Kulturüberstand nachgewiesen werden:

Peptid A	50,4 (neues Peptid)
Peptid B	0,2
Peptid C	34,7 (neues Peptid)
Peptid D	8,5
Peptid E	1,6
Peptid F	4,6 (neues Peptid)

Bei Veränderung der Kultivierungsbedingungen kann eine abweichende Verteilung der Wirkstoffkomponenten auftreten.

Die vorstehend genannten Peptide werden von Vertretern der Gattung Bacillus, insbesondere Bacillus amyloliquefaciens DSM10273, synthetisiert oder gegebenenfalls auch von anderen Stämmen der Bacillus subtilis Gruppe (B. subtilis, B. lichiniformis, B. pumilus bzw. B. amyloliquifaciens). Der Stamm wurde unter der Nummer DSM10273 nach den Regeln des Budapester Vertrages hinterlegt.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide A, C, F und der bekannten Peptide B, D und E ist nicht nur auf die Verwendung der bestimmten hier beschriebenen Mikroorganismen beschränkt, sondern betrifft auch alte deren natürlich oder künstlich (mit Hilfe allgemeiner gentechnischer Methoden, z. B. mittels Röntgenstrahlung, UV-Strahlung oder chemischer Behandlung) erzeugten Mutanten und Varianten, die in der Lage sind, eines oder mehrere der Peptide A bis F herzustellen.

Sowohl die erfindungsgemäßen Peptide A, C und F als auch die bekannten Peptide B, D und E können aus Kulturüberständen des Stammes Bacillus amyloliquefaciens DSM10273 isoliert werden.

Die Identifizierung des Stammes Bacillus amyloliquefaciens DSM10273 erfolgte nach den Methoden in "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Teil 2, Williams & Wilkins Co., 1986, und anhand weiterer, in der Literatur (Nakamura, L. A.: Intern. Journ. of System. Bacteriol., Okt. 1987, 444-445) zur Differenzierung von Bacillus subtilis und Bacillus amyloliquefaciens beschriebener Kriterien. Die Merkmale dieses Stammes sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2: Morphologische, physiologische und biochemische Merkmale des Bacillus amyloliquefaciens DSM 10273

Form/Lage der Spore:	oval/zentral
Sporulationsverhalten:	85 % auf Griesagar, 4 d, 37°C
Beweglichkeit:	beweglich
Gramverhalten:	grampositive Kurzstäbchen
Koloniemorphologie auf Blutplatte: Nähragar:	graubeige, glänzend, Rand glatt oder gelappt beige, matt, Zentrum stark gefaltet,Rand gelappt, flach auslaufend, starke Schleimbildung
Säurebildung aus:	Lactose, D-Xylose, Glucose, d-Mannose, d-Fructose, Maltose, Trehalose, Saccherose, D-Mannit, Aesculin
keine Säurebildung aus:	d-Galactose, Dulcit, Rhamnose, Raffinose, Sorbit, D-Ribose
VPR:	positiv
Zitratverwertung:	negativ
Urease:	positiv
Gasbildung aus Nitrat:	negativ
Katalase:	positiv
Stärkehydrolyse:	Hydrolysezone 5,0 mm
Caseinhydrolyse:	Hydrolysezone 6,5 mm
Gelatinehydrolyse:	Hydrolysezone 7,5 mm
Lezithinase:	negativ
starkes Wachstum auf:	Glucose-Nitratagar und Glucose-Asparaginagar
kein Wachstum in:	10% NaCl-Bouillon
Resistenz:	gegen 1500 ppm Streptomycinsulfat

In "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" wird keine Differenzierung zwischen Bacillus subtilis und Bacillus amyloliquefaciens vorgenommen. Der Stamm Bacillus amyloliquefaciens DSM10273 unterscheidet sich jedoch vom type strain Bacillus subtilis ATCC 6051 in folgenden Merkmalen:

– α – Hämolyse
– Säurebildung aus: Xylose, Aesculin und Lactose
– Lipopeptidbildung
– Phagensensibilität
– Streptomycinresistenz

Entsprechend neueren Auffassungen zur Taxonomie der Gattung Bacillus bzw. zur Abgrenzung von Bacillus subtilis und Bacillus amyloliquefaciens kann die Lactoseverwertung als ein Indiz der Zugehörigkeit des Stammes DSM10273 zur Art Bacillus amyloliquefaciens gelten (Nakamura, L. A.: Intern. Journ. of System. Bacteriol., Okt. 1987, 444-445).

Das Lysotypiemuster des Stammes DSM10273 ist dem des Stammes Bacillus amyloliquefaciens (ATCC 23844) wesentlich ähnlicher als dem des Stammes Bacillus subtilis (ATCC 6051).

Die Sequenz des Subtilisingens des Stammes DSM10273 weist in einem zentralen Fragment von 250 Basenpaaren 97% Homologie zu der Sequenz von Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23844 auf.

Aufgrund dieser Ergebnisse wurde eine Zuordnung des Stammes DSM10273 zu Bacillus amyloliquefaciens vorgenommen.

Nährmedien für die Produktion bzw. Synthese der erfindungsgemäßen Peptide A, C, F und der bekannten Peptide B, D und E können wäßrig oder fest sein; sie enthalten Kohlenstoff und Stickstoffquellen, Mineralsalze und definierte oder komplexe organische Zusätze. Geeignete Nährmedien enthalten beispielsweise eine Kohlenstoffquelle wie Glucose, Lactose, Maltose oder Saccharose, eine Stickstoffquelle wie Ammoniumsalze, Glutaminsäure oder andere Aminosäuren, oder komplexe Nährbodenbestandteile wie Sojaschrot, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Pepton, Casein. Die Zugabe von Aminosäuren oder Fettsäuren kann das Spektrum der gebildeten Peptide qantitativ verändern.

Die Kultivierung erfolgt bei 23 bis 35°C, vorzugsweise bei 25°C, in üblichen Kulturgefäßen, beispielsweise in Schüttelkolben oder Fermentoren unterschiedlicher Größe.

Nach Beendigung der Fermentation werden die gewünschten Peptide aus der Kulturlösung gewonnen. Die Peptide können direkt aus der Kulturlösung mit organischen Lösungsmitteln extrahiert werden oder alternativ nach Separation der Mikroorganismen durch Ultrafiltration vom Kulturüberstand getrennt werden. Die Kulturlösung kann auch nach Abtrennung der Mikroorganismen und anderer fester Bestandteile mit Aktivkohle, Adsorberharzen oder entsprechendem Trägermaterial in Kontakt gebracht werden, so daß die Peptide auf dem Trägermaterial adsorbiert werden. Danach werden die Verbindungen durch geeignete Lösungsmittel wie niedere Alkohole, Cycloalkanole, Ketone eluiert. Es bietet sich dabei eine Kombination von Reinigungsschritten zur Aufreinigung an. Nach der Abtrennung der Zellen vom Kulturüberstand mittels Zentrifugation der Fermentationslösung kann durch Verringerung des ph-Wertes des Kulturüberstandes auf 2,5 bis 3,5 mittels starker Säuren wie Salzsäure oder Schwefelsäure bzw, durch Zugabe zweiwertiger Ionen wie z.B. Mg²⁺, Mn²⁺, Ba²⁺ die Präzipitation der Peptide ausgelöst werden. Das durch Zentrifugation gewonnene Präzipitat kann in alkalischem Puffer oder organischem Lösungsmittel aufgenommen werden, auf eine mit Trägermaterial wie Sephadex^® G20 , Superdex^® Peptide (HR 10/30)(Pharmacia), XAD-Adsorberharze^®(Serva), Toyopearl^® HW 40 (Tosohaas) u.a. gefüllte Säule gepumpt und die adsorbierten Peptide mit Puffer-Lösungsmittel-Gemisch eluiert werden. Nach der Vereinigung der antifungal aktiven Fraktionen und Entfernen des Lösungsmittels sind weitere an sich bekannte chromatografische Aufreinigungsschritte erforderlich. Durch wiederholte Verwendung von Lösungsmittelgradienten aus polaren Eluenten (R=OH, R=C₁-C₃) in Kombination mit basischen Pufferlöungen wie (NH₄)₂HPO)₄ können die erfindungsgemäßen Peptide in einer Reinheit von 96 bis 98,5 % gewonnen werden.

Nach der ersten chromatografischen Aufreinigung können die peptidangereicherten lyophilisierten Fraktionen auch an einer präparativen Reversed-Phase-HPLC-Säule (RP18; Tosohaas, Macherey-Nagel) unter Verwendung polarer Lösungsmittel (Trifluoressigsäure, -CH₃OH – H₂O-Gemische) bis zu einer Reinheit von 98 bis 99 aufgereinigt werden. Nach abschließender Einengung und Lyophilisation der aufgereinigten Fraktion kann mittels einer HPLC Analyse die erhaltene Reinheit mittels einer RP-18-Säule (Merck, LiChrospher^® 100RP-18, 5 μm, L124 mm / ID 4 mm) ermittelt werden. Die erfindungsgemäßen Peptide A, C, F und die bekannten Peptide B, D und F liegen nach der Aufreinigung in Pulverform vor. Sie können aber auch als wäßriges Konzentrat, am Träger getrocknetes Granulat bzw. in Tablettenform bei T = 0 °C bis 50°C gelagert werden.

Die Peptide A, B, C, D, E, F zeigen ein breites antimikrobielles Wirkungsspektrum, das eine Vielzahl wirtschaftlich bedeutender Pilze, insbesondere phyto- und humanpathogene Arten, einschließt (Tabelle 3). Besonders hervorzuheben ist die Wirkung gegen wichtige Vertreter der Basidiomyceten.

Tabelle 3: Pilze, die durch die erfindungsgemäßen Peptide gehemmt werden

filamentöse Pilze:

– Alternaria radicina
– Alternaria chrysanthemi
– Aspergillus avamori
– Aspergillus fumigatus
– Aspergillus niger
– Aureobasidium pullans
– Botrytis cinerea
– Chaetomium globosum
– Cladosporium herbarum
– Cochliobolus lunata
– Coniophora puteana
– Coriolus versicolor
– Curvularia inequalis
– Curvularia radicina
– Cylindrocarpon destructans
– Fusarium avenaceum
– Fusarium culmorum
– Fusarium equiseti
– Fusarium graminearum
– Fusarium oxysporum f.sp. callistephus
– Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum
– Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis
– Fusarium oxysporum f.sp. dianthi
– Fusarium oxysporum f.sp. gerberae
– Fusarium oxysporum f.sp. gladioli
– Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici
– Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici
– Fusarium oxysporum f.sp. pisi
– Fusarium solani
– Gäumannomyces graminis
– Gerlachia nivale
– Gloeophyllum trabeum
– Humicola grisea
– Penicillium chrysogenum
– Penicillium islandicum
– Penicillium roqueforti
– Petriella setifera
– Phialophora cinerescens
– Phoma chrysanthemicola f.sp. chrysanthemicola
– Phoma lingam
– Phoma medicagenes
– Phomopsis sclerotioides
– Phytophthora nicotianae
– Pleurotus ostreatus
– Polyspora sydowina
– Porea placenta
– Pyrenochaeta lycopersici
– Rhizoctonia solani
– Sclerotinia sclerotiorum
– Serpula lacrimans
– Stromatinia fresiae
– Thilaviopsis basicolae
– Trichoderma lignorum
– Trichorus specialis
– Verticillium dahliae

Hefen:

– Candida albicans
– Candida famata
– Candida glabrata
– Candida guilliermondii
– Candida kruseii
– Candida parapsilosis
– Candida pseudotropicalis
– Candida tropicalis
– Candida utilis
– Cryptococcus neoformans
– Endomycopsis lipolytica
– Saccharomyces cerevisae
– Trichospora cutaneum

Durch die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (im folgenden MHK genannt) mittels Agarverdünnungstest wurde die antifungale Aktivität der Peptide gegen ausgewählte Pilze bewertet und mit der Wirkung ausgewählter kommerzieller Antimykotika und Fungizide verglichen (Tabelle 4).

Zur Bestimmung der MHK wurden Petrischalen mit einem biomalzhaltigen Medium oder einem Hefeminimalmedium eingesetzt, denen die erfindungsgemäßen Peptide in verschiedenen Konzentrationsstufen zugesetzt wurden.

Die ausgewählten Pilze wurden 10 Tage auf einem geeigneten Agarmedium wie Kartoffeldextrose- oder Sabouraud-Agar in Petrischalen kultiviert, und durch Abschwemmung und ggf. Verdünnung mit physiologischer Kochsalzlösung wurde eine Sporen- bzw. Zellsuspension mit definierter Keimdichte in Abhängigkeit von der Pilzspecies hergestellt. Von diesen Suspensionen wurden je 5 μl punktförmig auf die vorbereiteten Testpetrischalen aufgeimpft.

Die Inkubation erfolgte bei 21 °C, 25°C bzw. 30°C in Abhängikeit von der Pilzart. Nach 2 bis 5 d, je nach Entwicklungsgeschwindigkeit der Testpilze, wurde ausgewertet.

Als MHK wurde die Konzentration des Wirkstoffs in der ersten nicht bewachsenen Testpetrischale bewertet.

Die Erfindung betrifft im besonderen Maße die pharmazeutische Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide.

Hierbei betrifft die Erfindung insbesondere die Verwendung eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Peptide allein oder neben anderen Substanzen als antimykotische oder antivirale Wirksubstanz in einem therapeutisch anwendbaren Präparat.

Die Peptide A bis F sind hochwirksam gegen humanpathogene pilzliche Erreger, wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist. Die MHK – Werte der einzelnen Peptide A bis F unterscheiden sich aufgrund ihrer differenzierten Struktur und in Abhängigkeit von den untersuchten humanpathogenen Pilzen, sie liegen etwa im Bereich zwischen 1 bis 100 μg/ml. Insbesondere die Peptide D und E sind dabei mit den parallel untersuchten kommerziellen Wirkstoffen unter den gegebenen Testbedingungen vergleichbar.

Die Wirkung der untersuchten Peptide gegen humanpathogene Pilze ist insbesondere bedeutungsvoll, da weltweit zunehmend chronische, rezidivierende oder andere massiv verlaufende Pilzinfektionen mit ihren Auswirkungen auf das Immunsystem auftreten. Forciert wird die Zunahme von systemischen pilzlichen Infektionen bei entsprechender Prädisposition durch eine Schwächung der Immunkompetenz aufgrund der Verwendung von immunsuppressiven Mitteln, Karzinostatika u.a. Dabei stellt die Zunahme von Resistenzen der pilzlichen Erreger gegen therapeutisch eingesetzte Antibiotika ein besonderes Problem dar. Die Resistenzentwicklung und die oft damit verbundene Ausbildung von Kreuzresistenzen wird dadurch begünstigt, daß Wirkstoffe ähnlicher Struktur zum Einsatz kommen. So zeichnet sich bei den Antimykotika eine Favorisierung azolhaltiger Wirkstoffe ab, die gegen ein breites Spektrum pilzlicher Erreger wirksam sind und sich chemisch synthetisieren lassen, z.B. Clotrimazol, Ketokonazol und Itraconazol (Imidazol) oder Fluconazol (Triazol). Die Peptide A bis F unterscheiden sich in ihrer Struktur grundlegend von dieser Wirkstoffgruppe und stellen damit eine echte Alternative für die Behandlung von Pilzinfektionen dar.

Es wurde überaschend gefunden, daß sowohl die erfindungsgemäßen Peptide A, C, F als auch die bekannten Peptide B, D ,E eine antivirale Wirkung haben. Beispielsweise wird durch die Peptide A, E und F die Virusreproduktion bei infizierten Zellen und/oder isolierten Viren in vitro hemmend beeinflußt. Desweiteren wird die Adsorption der Viren an die Zellen unterdrückt.

Untersuchungen zu möglichen allergieauslösenden Wirkungen durch die in dieser Erfindung untersuchten Peptide an einem Modellsystem zur Histaminfreisetzung aus Mastzellen ergaben, daß derartige Wirkungen erst bei Konzentrationen auftreten, die medizinisch nicht mehr relevant sind.

Das unterstützt die Möglichkeit einer therapeutischen Nutzung der erfindungsgemäßen Peptide bei Mensch und Tier.

Für eine Anwendung in der Landwirtschaft ist der Einsatz von hochreinen Peptidwirkstoffen nicht erforderlich.

Wirkstoffextrakte, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide und der Peptide B, D und E enthalten, im folgenden als Extrakte bezeichnet, werden unter standardisierten Bedingungen hergestellt, sind in ihrem Peptidspektrum definiert zusammengesetzt und können aufgrund ihrer relativ einfachen Herstellungsweise großflächig, zum Beispiel als Fungizid gegen phytopathogene Pilze, eingesetzt werden.

Zur Herstellung der Extrakte können Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln, Batchverfahren, bei denen die Kulturlösung über das Trägerbett gespült und anschließend eliminiert wird, verwendet werden, oder die Extrakte werden nach Präzipitation bzw. Zentifugation über Säulenchromathographie, anschließende Entfernung der organischen Lösungsmittelanteile und abschließende Lyophylisation gewonnen.

Die Extrakte können als Pulver, Granulat, in Tabletten- oder Stäbchenform bei einer Temperatur von 0°C bis 50°C gelagert werden. Aufgrund ihrer guten wasserlöslichen Eigenschaften kann bedarfsgerecht Sprüh- oder Tauchlösung aus dem Pulver/Granulat hergestellt werden, während die Stäbchen z. B. insbesondere für Langzeitbehandlungen geeignet sind.

Die Extrakte haben ein antifungales Wirkungsspektrum, das mit dem der hochreinen Peptide A bis F vergleichbar ist. Ihre minimalen Hemmkonzentrationen liegen aufgrund der unterschiedlichen qualitativen und quantitativen Zusammensetzung, entsprechend dem angewendeten Herstellungsverfahren, höher als die der hochreinen Peptide (Tabelle 5). Die MHK wurden ermittelt wie für die MHK der hochreinen Peptide beschrieben.

Tabelle 5: Antifungale Aktivität der Extrakte im Vergleich zu einem kommerziellen Fungizid (MHK in μg/ml)

Verwendungsmöglichkeiten für die beschriebenen Extrakte oder die erfindungsgemäßen Peptide sowie die Peptide B, D und E sind aufgrund ihrer antifungalen Wirkung die Anwendung im Pflanzenschutz, z.B. bei der Bekämpfung von Pilzkrankheiten bei Pflanzen, bei Gewächshaus- und Feldkulturen, bei der Pflege von infizierten Bäumen, bei der Wiederaufforstung zu rekultivierender Flächen sowie auch als antifungaler Zusatz zu Desinfektionsmitteln.

Dabei können die Wirkstoffkomplexe als lagerfähiges trockenes Pulver, Granulat, Zuschlagsstoff oder Sprüh- bzw. Tauchlösung formuliert sein.

Die Extrakte oder die genannten Peptide können mit verschiedenen Trägerstoffen in einem beliebigen herkömmlichen Verfahren zur Formulierung von Agrochemikalien kombiniert werden und sind so als biogenes Fungizid in Landwirtschaft und Gartenbau einsetzbar.

Neben der primären antifungalen Wirkung wurden überraschend weitere Wirkungen der Peptide/Extrakte nachgewiesen, die in Land- und Forstwirtschaft sowie Landschafts- und Gartenbau bedeutungsvoll sind. Das betrifft insbesondere pflanzenwachstumsfördernde, pflanzenvermittelte nematodenhemmende, pflanzenvirenhemmende und spezifische antibakterielle Effekte.

Daher bezieht sich die Erfindung aufgrund der pflanzenwachstums- bzw. vitalitätsfördernden Eigenschaften auch auf die Verwendung der in dieser Erfindung beschriebenen erfindungsgemäßen Peptide in geeigneter Formulierung als pytoeffektiver Wirkkomplex (wachstumsfördernd, toleranz- und resistenzinduzierend) bzw. Pflanzenstärkungsmittel. Beispielsweise können Wurzelwachstum, Blattmasse und/oder Fruchtgewicht positiv beeinflußt werden. Das Auflaufen von Saatgut und die Entwicklung der Keimpflanzen werden gefördert.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Peptide in geeigneter Formulierung als selektives Nematoden hemmendes Mittel, da über eine Pflanzenbehandlung eine hemmende Wirkung auf Phytonematoden, z. B. Meloidogyne spp., vermittelt wird.

Im Gegensatz zur generellen Schädigung von Phytonematoden und ökologisch nützlichen Nematoden durch kommerzielle Nematizide wird somit durch die vorstehend beschriebenen Peptide bzw. Extrakte eine selektive Hemmung der Vermehrung von Phytonematoden bewirkt.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäß untersuchten Peptide in geeigneter Formulierung als Mittel zur Verhinderung und/oder Bekämpfung von Viruskrankheiten bei Pflanzen, wie z. B. Tabakmosaikvirus.

Die Peptide/Extrakte üben eine spezifische antibakterielle Wirkung aus, die insbesondere in einer Hemmwirkung gegen Clavibacter michiganense und Streptomyces spp., insbesondere Streptomyces scabies, besteht. Hierdurch können die erfindungsgemäßen Peptide in geeigneter Formulierung als Mittel zur Bekämpfung spezieller Bakterienerkrankungen bei Kulturpflanzen, wie zum Beispiel von Kartoffelschorf und der bakteriellen Tomatenwelke, eingesetzt werden.

Die Erfindung soll anhand folgender Beispiele näher erläutert werden:
Beispiel 1: Fermentation im Schüttelkolbenmaßstab

Bacillus amyloliquefaciens DSM10273 wird in folgendem Medium kultiviert, um die in der Beschreibung genannten Peptide zu erhalten:

Pankreatisches Pepton (Casein, Fleisch)	22,5 g
Glucose	1,0 g
Dikaliumhydrogenphosphat	2,0 g
Natriumchlorid	3,0 g
Destilliertes Wasser	1,0 l
pH	7,2
(Sterilisation 15 Min. bei 121 °C)

Die Fermentation wird in Rundschüttelkolben (500 ml Volumen) durchgeführt. Die Schüttelkolben werden mit 100 ml Medium gefüllt. Beimpft wird mit einer Impföse von einem frisch bewachsenen Schrägagarröhrchen (24 h, 30°C). Die Kultivierung erfolgt bei 25°C und 220 rpm, der Abbau nach 72 Stunden.
Beispiel 2: Fermentation im 5 l – Maßstab
Die Fermentation wird in folgendem Medium durchgeführt, um eine hohe Ausbeute der Peptide zu erhalten:

Sojaschrot 12,0 g

Casein 1,5 g

Lactose 22,4 g

Natriumchlorid 2,0 g

Dinatriumhydrogenphophat 2,0 g

Leitungswasser ad 1,0 l
Die Fermentation erfolgt in einem 5 l – Laborfermentor mit einer Füllmenge des Mediums von 2,5 l. Beimpft wird mit einer 8 – Stunden – Kultur des Stammes DSM10273 im Medium aus Beispiel 1. Die Beimpfungsdichte beträgt 1 × 10⁷ cfu/ml. Die Kultivierung erfolgt bei 25°C, 700 rpm und einem Sauerstoffeintrag von 30 l/h. Zur Unterdrückung der Schaumbildung wird nach Bedarf Antischaummittel hinzudosiert.
Der Abbau erfolgt nach ca. 56 Stunden.
Beispiel 3: Aufarbeitung der Kulturlösung
Nach dem Abbau der Schüttelkultur bzw. des Fermentors erfolgte eine Kombination von Reinigungsschritten zur Aufreinigung.
Die Fermentationslösung wird 20 min bei 5°C und 9000 U/min zentrifugiert. Die Zellen und unlöslichen Medienbestandteile werden durch Dekantieren vom Kulturüberstand getrennt, und mit einem Wasser-Methanol-Gemisch (50%) gewaschen und erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Die methanolhaltigen Fugate können nach der Entfernung des Methanol im Vakuum mit dem Kulturüberstand vereint werden.
Es wird 6n HCL (5 bis 20 ml/l) zum Fugat unter Rühren zugesetzt bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 3,0 bei einer Temperatur von 5°C bis 10°C; nach mehrstündigem Stehen (2 bis 6 h) wird das Präzipitat durch Zentrifugation 10 bis 20 min bei 5°C und 7000 bis 9000 U/min abgetrennt und der Überstand verworfen. Das Präzipitat wird in 1 molarem (NH)₂HPO₄ aufgenommen und die pH-neutralen wasserlöslichen Anteile werden einer chromatografischen Trennung zugeführt.
Beispiel 4: Hochreinigung der Peptide
A
Das Präzipitat wird in alkalischem Puffer, vorzugsweise in Ammoniumhydrogenphosphat – Puffer, aufgenommen und an einer Adsorberharzsäule z.B. aus Polyacrylesterharzen, vorzugsweise mit einer Porengröße <10 nm, mittels Gradiententechnik unter Verwendung eines Wasser-Methanol-Gradienten vorgereinigt.
Nach der Vereinigung und Konzentration der antifungal aktiven Fraktionen im Vakuum, welche durch die Hemmung des Wachstums von Endomycopsis lipolytica mittels eines Agardiffusionstests definiert werden, wird das Konzentrat (2-4% des Säulenvolumens) auf eine Toyopearl^® HW 40-F-Säule (TosoHaas) zur weiteren Trennung aufgebracht und unter Verwendung von Lösungsmittelgradienten aus polaren Lösungsmitteln und alkalischem Puffer, wie zum Beispiel 0,05m (NH)₂HPO₄-Puffer und Methanol im Verhältnis 5:1 bis 1:2 in Gradiententechnik, eine Auftrennung der Komponenten erreicht. Durch Wiederholung des gesamten Regimes und anschließender Entsalzung und Lyophilisation können die erfindungsgemäßen Peptide in einer Reinheit von 96 bis 98,5 % gewonnen werden.
B
Nach der ersten Aufreinigung mittels Gelchromatografie, vorzugsweise bestehend aus Copolymerisaten aus Ethylenglykol und polymerem Metacrylaten, können die peptidangereicherten Fraktionen auch an einer präparativen HPLC-Säule (Silasorb^® C8, 250 × 16, 5 μm) unter Verwendung polarer Lösungsmittel, vorzugsweise Methanolgemische in verschiedenen Konzentrationen mit Trifluoressigsäure-Zusatz (TFA), bis zu einer Reinheit von 98 bis 99 % aufgereinigt werden. Nach erfolgter Einengung der aufgereinigten aktiven Fraktion und Lyophilisation derselben kann mittels einer HPLC-Analyse an einer RP-18-Säule (Merck, LiChrospher^® RP-18, 5μm, L124mm/ID 4mm) die erhaltene Reinheit bestimmt werden.
Beispiel 5: Herstellung von Extrakten
A aus Schüttelkulturen:
Die Fermentationslösung wird 30 min bei 5°C und 9000 U/min zentrifugiert. Die Zellen und unlöslichen Medienbestandteile werden durch Dekantieren vom Kulturüberstand getrennt, mit einem Wasser-Methanol-Gemisch (50%) gewaschen und erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Die methanolhaltigen Fugate können nach der Entfernung des Methanol im Vakuum mit dem Kulturüberstand vereint werden.
Es wird 6n HCL (ca. 10 ml/l) zum Fugat unter Rühren zugesetzt bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 3,0 bei einer Temperatur von 10°C; nach mehrstündigem Stehen (2 bis 6 h) wird das Präzipitat durch Zentrifugation 20 min bei 5°C und 9000 U/min abgetrennt und der Überstand verworfen.
Das Präzipitat wird in alkalischem Puffer, 0,05 M Ammoniumhydrogenphosphat, aufgenommen und an einer Adsorberharzsäule, vorzugsweise Polyacrylesterharze wie Serdolit^® (Serva), mittels Gradiententechnik unter Verwendung von Methanol-Wasser-Gemischen vorgereinigt. Dazu wird die beladene Säule zunächst mit zwei Säulenvolumina Wasser und anschließend mit 20%igem Methanol gewaschen. Die Elution der Wirkstoffe erfolgt dann mit zwei Säulenvolumina 75%igem Methanol und die Reinigung der Säule mit Methanol. Die antifungal aktiven Fraktionen werden mikrobiologisch bestimmt und vereinigt, im Vakuum eingeengt und erneut an der Adsorberharzsäule gereinigt. Die antifungalen Fraktionen werden lyophilisiert und mittels HPLC die Zusammensetzung der Extrakte bestimmt.
B aus Fermentorbrühen
I)
Bei Kultivierung in 300 l bis 3000 l – Fermentoren wird im ersten Schritt die Abtrennung des Bioschlammes im Separator vorgenommen. Der Fermentationsüberstand mit den extrazellulären Peptiden wird mittels Ultrafiltration (30 kD cut off) für die anschließende Umkehrosmose vorbereitet. Dabei erfolgt eine Aufkonzentrierung um den Faktor 10. Die verbleibende Kulturlösung wird im Batchverfahren in 300 l Rührkesseln mit den mechanisch stabilen Adsorberharzen wie Serdolit^® (Serva) intensiv vermischt. Anschließend erfolgt die Abtrennung des Trägers in einer Siebkorbzentrifuge. Der so vom Kulturüberstand befreite Träger wird mit Wasser und anschließend einem Lösungsmittel-Wasser-Gemisch, vorzugsweise CH₃OH im Verhältnis von 25:75, gewaschen, abzentrifugiert und anschließend mit Lösungsmittel bzw. einem Gemisch, vorzugsweise CH₃OH/H₂O-Gemisch im Verhältnis 75:25, das Produkt eluiert. Das durch Zentrifugation abgetrennte produktenthaltende Eluat wird nach der Entfernung des Methanols im Vakumrotationsverdampfer zur Trocknung mittels Lyophilisation, Sprühtrocknung oder Wirbelschichttrocknung an Trägern überführt.
II)
Nach der Abtrennung der Biomasse im Separator werden die Kulturüberstände in große Hängegefäße à 300 l überführt und im Verhältnis von 1 : 4 mit iso-Butanol eine Stunde kräftig verrührt; nach 3 h ist die Phasentrennung erfolgt und die organische Phase wird vom Kulturüberstand abgetrennt und im Vakuum vom Produkt entfernt.
Die Prozesse I) und II) sind ebenso kontinuierlich durchführbar.
Beispiel 6: Wirkung gegen azolresistente humanpathogene Hefen
Es wurde die Wirkung des erfindungsgemäßen Peptides C und des bereits bekannten Peptides E gegen verschiedene humanpathogene Pilze im Agarverdünnungstest in Form eines MHK-Testes untersucht.
Als Agarmedium wurde ein Hefe-Minimalmedium verwendet, zu dem die lyophylisierten Peptide (weißes Pulver) in verschiedenen Verdünnungen bzw. als Vergleichssubstanz der therapeutische Wirkstoff Fluconazol zugegeben wurden. Es wurden humanpathogene Laborstämme und azolresistente Patientenstämme getestet.
Tabelle 6: Wirkung der Peptide C und E gegen azolresistente humanpathogene Hefen
Hieraus ist ersichtlich, daß die geprüften azolresistenten Stämme sensibel sind gegen die Peptide.
Beispiel 7: Wirkung gegen Influenzaviren
Es wurde der Einfluß der erfindungsgemäßen Peptide A und F sowie des bekannten Peptides E auf die Reproduktion des Influenzavirus A/Viktoria/35/72 untersucht. Im Vergleich dazu wurde Remantadin getestet, ein therapeutisch relevanter Wirkstoff, dessen Wirkung in der Frühphase der Virusvermehrung einsetzt und auf der Blockierung der viralen RNA-Synthese in der Transkriptionsphase beruht.
Zur Vermehrung der Viren wurden Chorioallantoismembranen von 12 bis 15 Tage alten Hühnerembryonen verwendet, deren Nährlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (1 bis 100 μg/ml) der Wirkstoffe versetzt wurden. Mittels der Bestimmung der Hämagglutination wurde nach 48 h festgestellt, bei welcher Konzentration die Virusvermehrung gehemmt wurde (Tabelle 7).
Das Peptid E zeigte bereits bei geringerer Konzentation als Remantadin eine vergleichbare virusreproduktionshemmende Wirkung (Peptid E: 10 μg/ml = 3,5; Remantadin: 25 μg/ml = 3,5). Tabelle 7: Einfluß der zyklischen Peptide A, E und F und von Remantadin auf die Reproduktion des Influenzavirus A/Viktoria/35/72

(t) zytotoxische Wirkung
n.d. nicht durchgeführt

Beispiel 8: Wirkung gegen HIV- Erreger
Es wurde der Einfluß der Peptide auf das HIV-1-Virus untersucht. Insbesondere wurde das erfindungsgemäße Peptid A zu zwei verschiedenen Zeitpunkten der Infektion der Wirtszelle mit HIV-1-Viren appliziert (1 h bzw. 5 d bei 37°C) und nach fünftägiger Inkubation sowohl seine Wirkung auf die Adsorption des HIV-1-Virus an die Wirtszelle als auch auf die Virusreproduktion geprüft.
Mit Hilfe eines ELISA -Tests zum quantitativen Nachweis eines definierten Antigens (Expression des Hüllproteins p24) wurde die Menge der löslichen viralen Antigene des HIV-1-Virus bestimmt. Es zeigte sich, daß das erfindungsgemäße Peptid A einen Einfluß auf die Adsorption des Virus an der Zelloberfläche ausübt.
Parallel wurde in einem Immunofluoreszenznachweis mittels markierter monoklonaler Antikörper gegen das HIV-I-R24-Protein an der Zellinie MT4 der Einfluß des Peptides auf die Vermehrung gemessen.
Die Ergebnisse (Tabelle 8) zeigen, daß das Peptid A sowohl die Adsorption als auch die Reproduktion des HIV- 1- Virus an der geprüften Zellinie inhibiert.
Konzentrationen von <10 μg/ml Peptid A verringern die Reproduktion des HIV-1-Virus um ca. 50 bzw. 40%. Damit liegt es im Wirkungsbereich des vergleichsweise in diesem Test geprüften Azidothymidin (AZT), einem bei der HIV-Therapie eingesetzten Virostatikum. Im untersuchten Konzentrationsbereich gibt es keine Hinweise für zytotoxische Wirkungen.
Tabelle 8: Nachweis der Wirkung des Peptides A auf die Adsorption und Reproduktion des HIV-1 an humanen Lymphozytenzellkulturen MT 4
Beispiel 9: Wirkung auf Papilloma-Viren
Es wurde der Einfluß des erfindungsgemäßen Peptides C auf DNA-Viren, speziell das Papilloma-Virus, untersucht.
Als Testsystem diente eine humane epitheliale Cervixcarzinomzellinie mit integriertem Humanpapillomvirus (HPV)-18-Genom (HeLa).
Die Untersuchung des Einflusses der Peptide auf den Gehalt an virusspezifischer Sequenz wurde mit NORTHERN-Blot-Analysen mit zellulärer Gesamt-RNS durchgeführt.
Dazu wurden 5000 HeLa-Zellen/ml über 96 h mit verschiedenen Peptidkonzentrationen inkubiert, die RNS der subkonfluenten Kultur isoliert, an Nylonfilter gebunden und mit radioaktiv markierten HPV 18 bzw. HPV 16 Proben hybridisiert. Es wurde die Abschwächung des Hybridisierungssignals im Vergleich zur unbehandelten Kontrollkultur bestimmt:
Tabelle 9: Beeinflussung der Translation der Virus-RNS (HPV)-18-Genom(HeLa) durch das erfindungsgemäße Peptid C (NORTHERN-Blot-Analyse)
In Abhängigkeit von der Peptidkonzentration konnte eine unterschiedliche Beeinflussung der Translation der Virus-RNS nachgewiesen werden.
Beispiel 10: Nachweis allgemeiner phytoeffektiver Aktivität im Testsystem mit Lemna perpusilla
Unter Anwendung eines Testsytems zum Nachweis phytoeffektiver Verbindungen (Jungnickel P. et al.: Wiss. Zeitschr.d. FSU Jena, 35 (1986) 5) wurde das Vermögen der reinen Peptidwirkstoffe getestet, allgemein das Pflanzenwachstum zu beeinflussen.
Es wurde der Einfluß des erfindungsgemäßen Peptides A und des bekannten Peptides E auf die Vermehrung von Wasserlinsen der Art Lemna perpusilla untersucht. Dazu wurden die Pflänzchen in einem Flüssigmedium ausreichend vermehrt (ca. 14 d) und jeweils drei in ein Reagenzglas, das Flüssigkulturmedium und die Peptide in unterschiedlicher Konzentration enthielt, geimpft. Eine Variante enthielt 15 Reagenzgläser, die zur Kultivierung schräg gelegt wurden. Nach 10 Tagen wurde die Anzahl der Wasserlinsen bestimmt.
Tabelle 10: Nachweis phytoeffektiver Aktivität durch erfindungsgemäße Peptide im Modellsystem mit Lemna perpusilla
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Peptide A und E die Vermehrungsrate der Wasserlinsen erheblich erhöhten.
Beispiel 11: Förderung des Wurzelwachstums
Vorgekeimtes Maissaatgut mit einer durchschnittlichen Keimwurzellänge von 2 cm wurde zur Untersuchung des Einflusses der Peptide/Extrakte auf die Wurzelentwicklung mit der Keimwurzel durch die Löcher eines vorgestanzten Plasteschalendeckels gefädelt und so in eine dazugehörige Schale gehängt. Die Schale enthielt Knop'sche Nährlösung (50%). Nach 3 Tagen wurde die Wurzellänge gemessen.
Tabelle 11: Beeinflussung des Längenwachstums der Keimwurzel (Radicula) bei Mais durch Wirkstoffextraktbehandlungen in Abhängigkeit von der Konzentration
Aus den Ergebnissen ist abzuleiten, daß bestimmte Extraktkonzentrationen die Entwicklung des pflanzlichen Wurzelsystems günstig beeinflussen. In einer 10tägigen Nachbeobachtungszeit wurde außer der Verbesserung der Wurzellänge der Maispflanzen gefunden, daß sich auch die Zahl der Adventivwurzeln und die Zahl der Seitenwurzeln in der Variante mit 10 μg/ml deutlich verbesserte.
Beispiel 12: Beschleunigung der Keimung bei Mais
Maiskörner wurden in Extraktlösungen unterschiedlicher Konzentrationen für 20 min. eingelegt, anschließend rückgetrocknet und in feuchtem Millieu zur Keimung gebracht.
Der Prozeß des Keimens wurde regelmäßig bonitiert, die Längen der Koleoptile und Radikula gemessen. Nach 3 Tagen wurden die Keimwurzeln von jeweils 15 gekeimten Maiskörnern zum Verfolgen der weiteren Entwicklung durch die Löcher eines vorgestanzten Plasteschalendeckels gefädelt und so in eine dazugehörige Schale gehängt. Die Schale enthielt Knop'sche Nährlösung (50%). Nach weiteren 3 Tagen wurden erneut die Wurzeln und die Primärblätter gemessen.
Aus den Ergebnissen in Tabelle 12 ist ersichtlich, daß die Peptide/Extrakte in der Lage sind, in überraschender Weise konzentrationsabhängig den Keimungsprozeß von Maissaatgut und die nachfolgende Entwicklung der Pflanzen zu fördern.
Tabelle 12: Wirkung von Wirkstoffextraktbehandlungen in unterschiedlicher Konzentration auf die Keimung bei Zea mays
Beispiel 13: Reduktion des Welkeauftretens bei Callistephus chinensis
In einem Modellsystem mit Callistephus chinensis der Sorte "Silberturm" wurde der zeitliche Welkeverlauf an mit Extrakten behandelten Pflanzen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollpflanzen untersucht.
Zehn Tage alte Asternpflänzchen wurden in 5 ml- Topfpaletten in quarzsandhaltiges Substrat pikiert und mit einer extrakthaltigen Lösung in Form einer Gießapplikation, Vergleichspflanzen mit Leitungswasser, behandelt.
Ein Teil der Pflanzen aus der behandelten und unbehandelten Variante wurden sofort bzw. drei Tage später mit Fusarium oxysporum f.sp. callistephus als Gießbehandlung inokuliert.
Es kamen 24 Pflänzchen pro Variante zum Einsatz. Der Welkeverlauf wurde regelmäßig visuell bewertet (Boniturnoten 0...5; 5=tot).
Tabelle 13: Effekt einer Wirkstoffextraktbehandlung auf den Erreger des Asternsterbens (Fusarium oxysporum f.sp.callistephus) in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Inokulation bei Callistephus chinensis
Das Beispiel zeigt, daß eine Behandlung mit Peptiden/Extrakten den Welkeverlauf direkt hemmt und diese in Abhängigkeit vom Infektionsdruck (Fusarium sofort bzw. 3 Tage später inokuliert) ihre fungizide Wirkung entfalten.
Beispiel 14: Wirkung gegen Fusarium oxysporum fsp. dianthi sowie Effekte auf das Wachstum bei Dianthus caryophyllus
Unter Gewächshausbedingungen wurde die Wirkung der Peptide/Extrakte auf die Welkeentwicklung und das Längenwachstum von Dianthus caryophyllus der Sorte "Wiener Mischung" geprüft. Dazu wurden die Pflanzen mittels Aussaat in humose Einheitserde 23 Tage vor dem Versuchsansatz angezogen und in 6 cm Multitopfpaletten pikiert. Drei Tage später erfolgte die Behandlung der Pflanzen mit einer Extraktlösung bzw. Leitungswasser (Kontrolle). Die Hälfte der Pflanzen einer Behandlungsvariante wurde durch Gießen von 2 ml einer Konidiensuspension von Fusarium oxysporum f.sp. dianthi (106 Konidien/ml) inokuliert. Die Zahl der Wiederholungen betrug 12, die Versuchsdauer 70 Tage.
In regelmäßigen Abständen wurden die Nelken auf Welkesymptome untersucht (visuelle Bonitur: 0...5; 5=tot) und die Pflanzenhöhe gemessen.
Tabelle 14: Effekt einer Wirkstoffextraktbehandlung auf den Erreger der Weißgefäßfusariose (Fusarium oxysporum f.sp. dianthi) bei Dianthus caryophyllus und das Längenwachstum der Nelken
Die Ergebnisse zeigen eine erhebliche Hemmung der Welkeentwicklung durch Applikation von 1 μg/ml Extraktlösung in das Modellsystem, wobei ein relativ hoher Befallsdruck durch den eingebrachten Welkeerreger vorlag. Bei Nelkenpflanzen ohne Fusariuminokulation war eine signifikante Längenwachstumsförderung nachweisbar.
Beispiel 15: Beeinflussung von Gesundheit und Fruchtbildung bei Tomaten
In einem Gefäßversuch mit Tomatenpflanzen der Sorte "Harzfeuer" wurden unter Gewächshausbedingungen die gesundheits- und ertragsfördernden Wirkungen der Peptide/Extrakte untersucht.
Es wurden 6 Wochen alte Tomatenpflanzen in die Versuchsgefäße gepflanzt und einer Behandlung mit Extrakt (0,7 μg/ml bzw. 70 μg/ml) oder Leitungswasser (Kontrollvarianten) unterzogen. Zusätzlich wurde mit einer Inokulationssuspension des Tomaten-Welkepathogens Fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersici (10⁷ Kanidien/ml) ein latenter Krankheitsstreß gesetzt. Jeweils die Hälfte der behandelten bzw. unbehandelten Pflanzen wurden entweder mit 50 ml der Fusariumsuspension als Gießapplikation sofort nach erfolgter Behandlung inokuliert (Methode A) oder 6 Wochen nach der Behandlung mittels Verletzung im Wurzelraum und nachfolgendem Gießen von ebenfalls 50 ml der gleichen Fusariumsuspension (Methode B). Nach 6 Wochen wurden die Tomatenpflanzen gestutzt. Die Pflanzen wurden regelmäßig ausgegeizt und gedüngt. Im Verlaufe der Kultur traten nur geringfügige Welkesymptome im Versuchsteil A auf. Am Versuchsende wurde bei diesen Pflanzen durch eine Stengelquerschnittsbonitur und anschließende Erregerisolierung der Anteil erkrankter Pflanzen festgestellt. Die Pflanzen, die mittels Inokulationsmethode A inokuliert waren, wurden hinsichtlich der Merkmale "Blütenzahl" und "Welkebefall" nach 8 Wochen beurteilt. Da keine Welkesymptome auftraten, wurden die Pflanzen, die mittels Inokulationsmethode B inokuliert waren, bis zur Fruchtbildung weiterkultiviert und hinsichtlich der Fruchtbildung bewertet. Tabelle 15: Beeinflussung des Welkebefalls (Fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersici) und der Fruchtbildung bei Tomaten durch Behandlungen mit Wirkstoffextrakten
Die Ergebnisse zeigen, daß sowohl ein aufgetretener Welkebefall eingeschränkt als auch das Blühen und Fruchten der Tomatenpflanzen durch die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Extrakten in den untersuchten Konzentrationen begünstigt werden.
Beispiel 16: Spezifische antibakterielle Wirkung der Wirkstoffextrakte
Es wurde die antibakterielle Wirkung eines Wirkstoffextraktes, hergestellt nach Beispiel 5, untersucht. Die Testungen erfolgten mittels Agardiffusionsmethode. Mit einer definierten Menge Nähragar befüllte Petrischalen (Durchmesser 9 cm) wurden gleichmäßig mit einer Suspension des entsprechenden Testbakteriums (ca. 104 cfu/Platte) beimpft. In den Agar wurden pro Platte mittels Korkbohrer vier Löcher (Durchmesser 8 mm) gestanzt, in welche je 100 μl der verschiedenen Wirkstoffverdünnungen eingefüllt wurden. Die Inkubation der Platten erfolgte je nach Testbakterium 48 h bis 96 h bei 25°C. Die Bewertung der antibakteriellen Aktivität der Wirkstoffe erfolgte über die Bestimmung der Hemmhofdurchmesser.
Tabelle 16: Antibakterielle Wirkung der Wirkstoffextrakte ( Durchmesser des Hemmhofes (mm) im Agardiffusionstest
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Wirkstoffextrakte eine spezifische antibakterielle Wirkung gegen Clavibacter michiganense und Streptomyces spp. besitzen.
Beispiel 17: Selektive phytonematodenhemmende Wirkung
Es wurde die phytonematodenhemmende Wirkung eines Extraktes, hergestellt nach Beispiel 5, enthaltend die Peptide in definierter Zusammen-setzung, ermittelt. Dazu erfolgte eine Quarzsandanzucht von Salatpflanzen der Sorte "Attraktion" in 4cm-Topfpaletten. Nach 28 Tagen wurden die Pflanzen mit dem Extrakt behandelt. Hierbei wurden 5 Verdünnungsstufen (100 μg bis 0,01 μg/ml) im Sprühverfahren auf die Blätter mit einer Aufwandmenge von 0,5 ml ausgebracht. Als eine weitere Variante wurde der gleiche Extrakt in 3 Verdünnungsstufen (100 ###g bis 1 ###g/ml) im Gießverfahren mit einer Aufwandmenge von 5 ml/Gefäß in den wurzelnahen Raum der Salatpflänzchen appliziert. Pro Variante wurden 36 Pflanzen getestet.
Vier Tage nach der Behandlung wurden 500 Larven von Meloidogyne hapla in jeden Topf gegossen. Die Inkubation der Pflanzen erfolgte bei 22°C und 16 h Licht. 21 Tage nach Zugabe der Larven wurde die Anzahl der gebildeten Gallen bestimmt.
Tabelle 17: Wirkung von Wirkstoffextrakten auf die Invasion und die Vermehrung von Meloidogyne hapla an Salatpflanzen
Die Ergebnisse zeigen, daß konzentrationsabhängig eine deutliche Verminderung der Zahl gebildeter Gallen durch Meloidogyne hapla infolge einer Extraktapplikation erreicht wird. Die ermittelten Effekte, die insbesondere durch jeweils geringe Konzentrationen ausgelöst wurden, werden indirekt über den beeinflußten Stoffwechsel der Pflanze vermittelt.
Beispiel 18: Wirkung gegen Pflanzenviren
Es wurde die virushemmende Wirkung einer Extraktbehandlung bei Gurkenjungpflanzen untersucht. Die Anzucht der Gurkenpflanzen der Sorte "Bidretta" erfolgte in gedämpftem humosen Substrat ea. 14 Tage unter Gewächshausbedingungen. Danach wurden die Pflanzen in 3-l-Plastgefäße ebenfalls in gedämpfte humose Erde umgetopft und mit Peptidextrakt (1 μg/ml; 10μg/ml) behandelt, eine entsprechende Menge Pflanzen blieb unbehandelt als Kontrolle. Die Extraktbehandlungen erfolgten mit jeweils 5 ml der verschiedenen Konzentrationen in Form einer Sprühbehandlung auf die Blätter der Versuchspflanzen. Nach weiteren 3 Tagen erfolgte die Inokulation mit vorbereitetem Virusinokulum: Das Inokulationsmaterial war zuvor typisch erkrankten Pflanzen in Form von Blattgewebe entnommen worden und wurde unter Zusatz eines Phosphatpuffers (Verhältnis 1:3) extrahiert. Die Inokulation der Pflanzen in den entsprechend vorgesehenen Varianten erfolgte durch Verreiben der Gewebeextrakte auf der Blattoberfläche mittels desinfizierter Glasspatel. Danach wurde die inokulierte Blattoberfläche mit sterilem Leitungswasser abgespült. Pro Variante kamen 37 Pflanzen zum Einsatz. Die Kultivierung erfolgte unter Gewächshausbe dingungen. Nach einem Zeitraum von 30 Tagen wurde die Zahl erkrankter Pflanzen anhand einer visuellen Bonitur ermittelt.
Tab.18: Wirkung von Wirkstoffextrakt – Blattapplikationen auf den Befall von Gurkenpflanzen mit CMV – Virus
Die Ergebnisse zeigen, daß eine präinfektionelle Extraktbehandlung in der Lage ist, eine Virusinfektion bei Gurkenpflanzen erheblich zu reduzieren.

Claims

Cyclische Peptide mit der Aminosäuresequenz
bedeutet und ein Peptid mit der Aminosäuresequenz
Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Bacillus amyloliquefaciens DSM 10273 oder einen Vertreter der Bacillus subtilis-Gruppe jeweils in an sich bekannter Weise – fermentiert, – die gebildeten Peptide adsorbtiv und/oder extraktiv oder durch Ultrafiltration und/oder Umkehrosmose aus der Kulturlösung anreichert und – reinigt.
Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 einzeln oder im Gemisch als Antimykotikum, Virostatikum, Fungizid, antibakterielles, pflanzenwachstumsförderndes, nematodenhemmendes Mittel oder als Desinfektions- und Konservierungsmittel.
Verwendung der Peptide mit der Aminosäuresequenz
bedeutet, einzeln oder im Gemisch als pflanzenwachstumsförderndes oder nematodenhemmendes Mittel.