AT397599B - Verhinderung der mycotoxinkontamination in landwirtschaftlichen produkten, welche durch einen pilz der gattung fusarium hervorgerufen wird - Google Patents
Verhinderung der mycotoxinkontamination in landwirtschaftlichen produkten, welche durch einen pilz der gattung fusarium hervorgerufen wird Download PDFInfo
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Description
AT 397 599 B
Einige Pilzspezies, welche zur Gattung Fusarium gehören, wie Fusarium graminearum u.ä., sind als pathogene Pilze bekannt, welche "rosa Kolbenfäule" bei landwirtschaftlichen Produkten, umfassend Weizen, Gerste und Mais, hervorrufen. Der Grund hiefür ist, daß diese pathogenen Fusarium-Pilze Mycotoxine bilden, wie Trichothecene, welche Vomitoxin, Nivalenol und 3-Acetyldeoxynivalenol, ebenso wie Zearalenon, 5 umfassen.
Zearalenon bewirkt Fehlgeburten und Unfruchtbarkeit bei Haustieren, wie Schweinen, wohingegen Trichothecene eine Serie von Vergiftungssymptomen, welche allgemein als "Vergiftung durch rosa Kolben-faule” bezeichnet werden und welche in Japan seit Alters her bekannt sind.
Mycotoxine wurden in landwirtschaftlichen Produkten, wie Weizen, Gerste und Mais, ebenso wie in io bearbeiteten Nahrungsmitteln, welche aus diesen Produkten hergestellt wurden, gefunden. Es besteht auch die Möglichkeit, daß ein Bereich, in welchem Produkte geerntet werden, mit derartigen Mycotoxinen kontaminiert sind, durch Mycotoxin bildende Pilze, welche zur Gattung Fusarium gehören, verunreinigt sind.
Gegenwärtig wurden Felder, welche mit Mycotoxin bildenden Pilzen, welche zur Gattung Fusarium gehören, verunreinigt sind in den mittleren und höheren Lagen, gefunden, in welchen Kornspeicher mit 75 derartigen landwirtschaftlichen Produkten verbreitet sind (Proc. Jpn. Assoc. Mycotoxicol, Nr. 19, Seiten 8-9, 1984).
Tatsächlich ist nichts bekannt über eine wirksame Methode zur Kontrolle und Entfernung von Mycotoxin bildenden Pilzen, welche zur Gattung Fusarium gehören. Zusätzlich wurde berichtet, daß bestimmte Mycotoxine, wie Vomitoxin und Nivalenol, selbst während der Verarbeitung der kontaminierten Materialien 20 zur Nahrungsmitteln nur schwer zersetzt oder entgiftet werden können (Proc. Jpn. Assoc. Mycotoxicol., Nr. 19, Seiten 13-19,1984).
Aus diesem Grund wurden in den Vereinigten Staaten und Kanada amtliche Richtlinien in bezug auf die Vomitoxin-Verunreinigung durch Ausarbeiten von entsprechenden Richtlinien gegeben (Proc. Jpn. Assoc. Mycotoxicol, Nr. 13, Seiten 4-5,1984). 25 Mit dem Ziel, ein Verfahren zur Verhinderung der Kontamination mit Mycotoxin und Aflatoxin in landwirtschaftlichen Produkten, wie Getreiden und Nüssen unter Verwendung eines Mikroorganismus, welcher frei von hygienischen Problemen ist, zu entwickeln, wurden Mikroorganismen, welche von Bodenproben, die an verschiedensten Orten genommen wurden, um zwei Bacillus subtilis Stämme, nämlich NK-330 und NK-C-3, zu isolieren, bearbeitet. Von diesen Stämmen wurde gefunden, daß sie die Fähig-keit 3o besitzen, nicht nur die Menge an Aflatoxin in einer Lösung zu verringern, sondern auch das Wachstum von Aflatoxin bildenden Pilzen und die Produktion von Aflatoxin durch die Pilze zu inhibieren (US-PS 4 931 398, ausgegeben am 5.Juni 1990). Auch wurde gefunden, daß die Stämme Iturin A produzieren können, und es wurde ein Verfahren zur Verhinderung der Aflatoxinkontamination unter Verwendung von Iturin A oder Iturin A produzierenden Stämmen entwickelt (AU-PS 609 631, ausgegeben am 29.August 1991). 35 Jedoch gibt es keinen Bericht über die Wirkung von Iturin A oder eines Iturin A produzierenden Stammes, welcher zu Bacillus subtilis gehört, daß er die Mycotöxinproduktion durch einen Pilz, welcher zur Gattung Fusarium gehört, durch Inhibition seines Wachstums reduziert und so die Mycotoxinkontamination, welche durch einen derartigen Pilz verursacht wird, verhindert.
Es ist nichts bekannt über ein wirksames Verfahren zur Mycotoxinkontamination, welche durch Pilze, 40 die zur Gattung Fusarium gehören, hervorgerufen wird. Für diese Mycotoxinkontamination gibt es nur einige Berichte über die Vorhersage der Proliferation von Fusarium-Pilzen in Kulturen (Can. J. Plant. Pathol. Vol. 4, Seiten 195-209, 1982) und über die Abtrennung von sauberen Körnern von jenen, welche mit Fusarium Infiziert sind, indem der Unterschied ihres Schwimmverhaltens in Wasser und 30%-iger Zuckerlösung herangezogen wird (J. Food Protect, Vol. 48, Seite 416,1985). 45 Jedoch selbst, wenn die erwartete Proliferation von Pilzen, welche zur Gattung Fusarium gehören, vorhergesagt werden kann, gibt es keine geeigneten Verfahren zur Vorbeugung der Proliferation. Auch ist das Verfahren zur Abtrennung von mit Fusarium verunreinigten Körnern nicht praktikabel, da es nicht die Gesamtmenge an verunreinigten Körnern entfernen kann, sondern statt dessen langwierige Verfahren zur Entfernung von verunreinigten Körnern erfordert, welche zusätzliche Zeit und Kosten verursachen. Darüber-50 hinaus resultiert aus dem Wässerungsschritt der Körner eine Verringerung der Komqualität, da das Erfordernis besteht, die einmal getrockneten Körner neuerlich zu trocknen.
Im Hinblick auf das oben Gesagte ist es daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verhinderung der Mycotoxinkontamination in landwirtschaftlichen Produkten, welche durch Pilze, die zur Gattung Fusarium gehören, hervorgerufen wird, zur Verfügung zu stellen und auch landwirtschaftliche 55 Produkte, welche frei von Mycotoxinkontaminationen, welche durch Fusarium-Piize hervorgerufen werden, sind.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Verhinderung der Mycotoxinkontamination in landwirtschaftlichen Produkten, welche durch einen Mycotoxin bildenden Pilz, welcher zur Gattung Fusarium 2
AT 397 599 B gehört, hervorgerufen wird, zur Verfügung, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß ein zum Bacillus subtilis gehörender iturin A produzierender Stamm auf die landwirtschaftlichen Produkte, die auszusäenden Samen oder auf ein Feld, auf welchem die landwirtschaftlichen Produkte kultiviert werden sollen oder wachsen, aufgebracht wird.
Weiters wird, gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur Verhinderung der Mycotoxinkontamination in einem landwirtschaftlichen Produkt, hervorgerufen durch einen zur Gattung Fusarium gehörenden Pilz, hergestellt, welche Zusammensetzung eine landwirtschaftlich wirksame Menge eines Iturin A produzierenden Bakterienstammes, welcher zu Bacillus subtilis gehört, und landwirtschaftlich verträgliche Verdünnungsmittel, Hilfsmittel oder Mischungen davon, enthält.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die Kontamination in landwirtschaftlichen Produkten, wie Getreiden, mit Mycotoxinen, welche durch Pilze, die zur Gattung Fusarium gehören, durch Inhibition ihres Wachstums und ihrer Produktion Mycotoxine zu verhindern.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung umfaßt das Anwenden eines Iturin A produzierenden Bakterienstammen, welcher zu Bacillus subtilis gehört, auf dem landwirtschaftlichen Produkt oder den zu säenden Samen davon oder auf einem Feld, auf welchem das landwirtschaftliche Produkt kultiviert werden soll oder wächst.
Landwirtschaftliche Zielprodukte für das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung sind jene, welche mit einem Pilz, welcher zur Gattung Fusarium gehört, infiziert wurden und welche die mögliche Gefahr einer Mycotoxinkontamination aufweisen oder jene, welche mit einem derartigen Pilz infiziert werden könnten. Die Beispiele umfassen Getreide, wie Mais, Weizen, Gerste und Reis. Inbesondere Mais und Weizen sind die wichtigsten Subjekte, welche in bezug auf die gegenwärtige Situation der Mycotoxinkontamination behandelt werden sollen.
Von Iturin A ist bekannt, daß es eine Peptidmischung der folgenden Formel (!) R-(CH2)8—CHCH2CO-Asn—Tyr—Asn-j (i)
NH
Ser—Asn—Pro-Gin ist, worin R eine Alkylgruppe bedeutet.
Iturin A ist als Mischung von acht Peptiden identifiziert, worin jedes R der Formel (I) Ethyl, Propyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, Butyl, 3-Methylbutyl, Pentyl oder 3-Methylpentyl bedeutet.
Der zu Bacillus subtilis gehörende Stamm, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sollte ein Stamm sein, welcher Iturin A produziert. Jeder Iturin A produzierende Stamm ist in dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung anwendbar. Beispiele derartiger Stämme umfassen Bacillus subtilis ATCC 10774 und die zuvor beschriebenen zwei Stämme, nämlich Bacillus subtilis NK-330 und Bacillus subtilis NK-C-3. Die letzteren zwei Stämme wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter den Hinterlegungsnummern FERM P-9162 (Hinterlegungsdatum: 30.Jänner 1987) und FERM P-9404 (Hinterlegungsdatum: 6.Juni 1987) hinterlegt, welche dann am 27.November 1987 die Hinterlegungsnummern FERM BP-1580 und FERM BP-1581 nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren erhielten.
Im allgemeinen werden diese Stämme, welche zu Bacillus subtilis gehören, vor ihrer Anwendung inkubiert. Für ihre Inkubation werden übliche, flüssige Medien, wie Kartoffeldextrose-Kulturmedium oder Nährlösungs-Kulturmedium, verwendet. Gegebenenfalls kann das flüssige Medium mit Mineralsalzen, wie Dikaliumhydrogenphosphat und Magnesiumsulfat, ergänzt sein. Vorzugsweise können diese Stämme bei einer Temperatur von 20 bis 35 *C für eine Zeit von 2 bis 7 Tagen unter aeroben Bedingungen mit Belüftung inkubiert werden. Nach der Inkubation können die Bakterienzellen in dem kultivierten Produkt mit Hilfe von Zentrifugierung und Filtration abgetrennt werden. Die isolierten Zellen können durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung od.ä. getrocknet werden und dann erforderlichenfalls in eine Pulverzubereitung überführt werden. Alternativ kann das zellhaltige, kultivierte Produkt direkt konzentriert oder getrocknet werden für die Verwendung in dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, ohne daß die Zellen isoliert 3
AT 397 599 B werden.
Nach der vorliegenden Erfindung wird ein Iturin A produzierender Stamm, welcher zu Bacillus subtilis gehört, auf einem landwirtschaftlichen Produkt oder auszusäenden Samen oder auf ein Feld, auf welchem das landwirtschaftliche Produkt kultiviert werden soll oder wächst, beispielsweise durch Sprühen oder Vermischen, aufgebracht. In den beiden vorgenannten Fällen wird der Bakterienstamm vorzugsweise auf das landwirtschaftliche Produkt vor oder nach seiner Ernte oder auf die Sameri des landwirtschaftlichen Produktes vor dem Säen aufgebracht.
Genauer können die vorgenannten Zellen oder das kultivierte Produkt des Iturin A produzierenden Stammes auf ein landwirtschaftliches Produkt, welches auf einem Feld kultiviert wird oder welches gelagert wird, auf das Produkt gleich nach der Ernte, auf Samen des Produktes während des Beschichtens oder vor einem Aussäen auf den Boden eines Feldes, auf welchem das interessierende Produkt kultiviert werden soll, oder das Produkt kultiviert wird oder auf die zu kultivierenden Pflanzen aufgebracht werden.
Die Menge der aufzubringenden Zellen kann in Abhängigkeit von den Aufbringungsverfahren variieren. Wenn die Samen des Produktes mit den Zellen vor dem Säen beschichtet werden, werden diese Samen vorzugsweise in einer Zellsuspension von 106 bis 107 Zellen/ml getaucht, so daß die Oberfläche von jedem Samen mit den Zellen bedeckt ist.
Wenn die Zellen direkt auf den Boden eines Feldes vor dem Säen der Samen durch Sprühen oder Mixen aufgebracht werden, ist es wünschenswert, 1011 bis 1013 Zellen/ha zu verwenden. Wenn die Zellen auf die zu kultivierenden Pflanzenkörper oder das Kultivationsfeld aufgebracht werden, können die Zellen so verwendet werden, daß ein Verhältnis von 1011 bis 1013 Zellen/ha eingestellt wird.
Wenn die Zellen auf landwirtschaftliche Produkte nach dem Ernten oder während der Lagerung durch Sprühen oder Mixen aufgebracht werden, können die Zeilen in einem Verhältnis von 5 bis 500 000 Zellen, vorzugsweise 50 bis 5 000 Zellen/g Körner verwendet werden.
Der Bakterienstamm kann in Form einer Zusammensetzung, welche eine landwirtschaftlich wirksame Menge der Zellen des Stammes enthält, aufgebracht werden. Die Zusammensetzung umfaßt den Wirkstoff und ein landwirtschaftlich verträgliches Verdünnungsmittel, Hilfsmittel oder Mischungen davon. Die Zusammensetzung kann in Form einer Lösung oder einer Suspension, verdünnt mit einem landwirtschaftlich verträglichen Verdünnungsmittel, wie Wasser oder anderen Lösungsmitteln, vorliegen und auch in anderen Formulierungen, wie einem befeuchtbaren Pulver, einer Emulsion, einem Pulver oder Granulat. Die Anwendungsform kann in Übereinstimmung mit der Zeit und dem Verfahren gewählt werden. Beispielsweise beim Beschichten der Samen vor dem Säen kann eine exzellente Fixierung der Zellen auf den Samen und bessere Ergebnisse durch Verwendung einer Zellsuspension für Samenbeschichtung verwendet werden, welche wie folgt hergestellt wird. Die Zellen werden gemeinsam mit einem Verdünnungsmittel, wie einem verzweigten Dextrin, getrocknet und mit einem Verteilungsmittel, wie Gummi, Methylzellulose, Ligninsulfonat oder einem Kondensat von Natriumdinaphthylmethansulfonat/Formalin vermischt. Die resultierende Mischung wird dann in Wasser suspendiert, um eine Suspension mit einer Konzentration von 102 bis 107 Zellen/ml zu ergeben.
Die Menge des Wirkstoffes in der Zusammensetzung kann in Abhängigkeit von der Art der Zusammensetzung und den Anwendungsverfahren variieren. Im allgemeinen wird die Menge des Bakterienstammes im Bereich von 107 bis 1010 Zellen/g Zusammensetzung liegen.
Die vorliegende Erfindung wird in der Folge im Detail unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele erläutert.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele erläutern die Inkubation von Iturin A produzierenden Stämmen, welche zu Bacillus subtilis gehören, und die Wirkung der kultivierten Zellen der Stämme bei der Verhinderung der Mycotoxinkontamination in landwirtschaftlichen Produkten im Vergleich mit Vergleichsbeispielen.
Beispiel 1: 200 g geschälte und geschnittene Kartoffeln werden in 1000 g destilliertem Wasser auf einem kochenden Wasserbad ca. 20 min gekocht, und dann werden die gekochten Kartoffeln unter Verwendung von Gaze entfernt. Die resultierende Lösung wurde mit 20 g Glucose vermischt, und ihr pH-Wert wurde auf 6,7 bis 6,8 eingestellt. Eine 50 ml-Portion des so hergestellten Mediums wurde in einen 100 ml-Kolben gegeben und unter Verwendung eines Autoklaven bei 121 *C für 15 min sterilisiert. Eine Einheit Zellen Bacillus subtilis NK-330 wurde in dem sterilierten Medium inokuliert und bei 30 * C über Nacht inkubiert, um eine Samenkulturbrühe zu erhalten. 4
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Dann wurden 7 I des Kartoffel-Dextrose-Mediums auf die selbe Weise, wie oben beschrieben, hergestellt und in einen 10 I-Fermenter gegeben und unter den selben Bedingungen, wie oben beschrieben, sterilisiert. Eine 50 ml-Portion der oben erhaltenen Samenkuiturbrühe wurde in dem Hauptkulturmedium inokuliert und bei 30*C 3 Tage unter Rühren (300 U/min) und Belüftung (1/2 V/V.min) inkubiert. Die 5 resultierende Kulturbrühe wurde bei 10 000 U/min 10 min zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen, weiche darin in einem geeigneten Volumen Wasser suspendiert wurden. Indem die hergestellte Zellsuspension über Nacht einer Gefriertrocknung unterworfen wurde, wurden 9,5 g getrocknete Zellen vom Bacillus subtilis NK-330 erhalten.
Auch wurden getrocknete Zellen vom Bacillus subtilis NK-C-3 und Bacillus subtilis ATCC 10774 auf die io selbe Weise, wie oben beschrieben, erhalten.
Beispiel 2:
Eine 20 g-Portion Körner von auf dem Markt erhältlichen Mais wurde in einen Erlenmeyer-Kolben 75 gegeben und in einem Autoklaven bei 121 *C 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Körner wurden mit Bacillus subtilis NK-330 (10 000 Sporen/Flasche) gemeinsam mit einem Mycotoxin produzierenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Nach der Inkubation bei 25 · C wurde der Gehalt an Vomitoxin in den Körnern und das Wachstum des Pilzstammes mit der Zeit bestimmt. 20 Ais Vergleichsbeispiel 1 wurde das selbe Verfahren wiederholt, außer daß Bacillus subtilis NK-330 nicht inokuliert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wirkung der Inokulation von B. subtilis NK-330 Vomitoxingehalte (p pm) Wachstum von Fusarium graminearum Tage 4 8 12 16 4 8 12 16 Beispiel 2 N.D. N.D. N.D. T.R. - + - 4- 4- Vergleichsbeispiel 1 2.28 3.46 4.80 4.46 + + + + 4 + 4 4 4 4 4 4 35 Der Gehalt an Vomitoxin in den Getreidekörnern wurde durch Extrahieren derselben mit 85%-igen Acetonitril, Aufgeben des Extraktes auf eine Säule, gepackt mit Schichten eines Kationenaustauscherharzes, Aktivkohle und Aluminiumoxid. Trocknen des resultierenden Eluats, Lösen der getrockneten Probe in Methylalkohol, Aufgeben der Lösung auf eine Säule, gepackt mit Schichten von Aktivkohle und Zeolit, um Verunreinigungen zu entfernen und dann Analysieren des resultierenden Eluats durch HPLC gemessen 40 (J.O.A.C., Vol. 70, Nr. 3, Seiten 479-483, 1987).
Die Ausdrücke "N.D." und "T.R.", welche in der obigen Tabelle verwendet wurden, bedeuten "nicht-detektiert" und "detektiert in Spurenmengen", wobei das Detektionslimit 50 ppb war. Die Ausdrücke " + ", "++" und "+ + +" bedeuten "kein Wachstum", "Wachstum von nicht mehr als 25%", "Wachstum von nicht mehr als 50%", "Wachstum von nicht mehr als 75%" und "Wachstum über die 45 gesamte Oberfläche" in bezug auf die Fläche des Pilzwachstums auf der Komoberfläche. Die selben Kriterien wurden in den Tabellen der folgenden Beispiele angewandt.
Beispiel 3: so Analog zu Beispiel 2 wird eine 20 g-Portion an Körnern des am Markt erhältlichen, eßbaren Maises in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben und in einem Autoklaven bei 121 *C 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Körner werden mit Bacillus subtilis NK-C-3 (10 000 Sporten/Flasche) gemeinsam mit dem Mycotoxin bildenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Nach Inkubation unter 25 *C wird der Gehalt an Vomitoxin in den Körnern und das Wachstum des Pilzstammes 55 mit der Zeit bestimmt.
Als Vergleichsbeispiel 2 wurde das selbe Verfahren wiederholt, außer daß Bacillus subtilis NK-C-3 nicht inokuliert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. 5
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Tabelle 2
Wirkungen der Inokulation von B. subtilis NK-C-3 Vomitoxin gehalte (ppm) Wachstum von Fusarium graminearum Tage 4 8 12 16 4 8 12 16 Beispiel 3 N.D. N.D. N.D. N.D. - - - - Vergleichsbeispiel 2 2.28 3.46 4.80 4.46 + + + + + + + + + + + +
Beispiel 4:
Eine 20 g-Portion Körner des am Markt erhältlichen, eßbaren Maises wurde in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben und in einen Autoklaven bei 121 *C 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Körner wurden mit Bacillus subtilis NK-330, wobei die Inokulationsgrößen (10 Sporen/Flasche, 100 Sporen/Flasche und 1 000 Spo-ren/Flasche) variierten, gemeinsam mit dem Mycotoxin bildenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Nach Inkubation bei 25 *C für 14 Tage wurde der Gehalt an Vomitoxin in den Körnern und das Wachstum des Pilzstammes bestimmt.
Als Vergleichsbeispiel 3 wurde das selbe Verfahren wiederholt, wobei jedoch Bacillus subtilis NK-330 nicht inokuliert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Wirkungen der Inokulation von B. subtilis NK-330 Proben Vergleichsbeispiel 3 Beispiel 4 Anzahl der inokulierten Bakteriensporen 0 1,000 100 10 Vomitoxin (ppm) 8.70 T.R. T.R. 2.81 Pilzwachstum + + + +- + + + +
Beispiel 5:
Eine 20 g-Portion von Körnern des am Markt erhältlichen, eßbaren Maises wurde in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben und in einem Autoklaven bei 121 °C 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Körner wurden mit Bacillus subtilis NK-C-3 mit verschiedenen Inokulierungsgrößen (10 Sporen/Flasche, 100 Sporen/Flasche und 1 000 Sporen/Flasche) gemeinsam mit dem Mycotoxin bildenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Nach Inkubation bei 25 *C für 14 Tage wurde der Gehalt an Vomitoxin in den Körnern und das Wachstum des Pilzstammes bestimmt.
Als Vergleichsbeispiel 4 wurde das selbe Verfahren wiederholt, mit· der Ausnahme, daß Bacillus subtilis NK-C-3 nicht inokuliert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. 6
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Tabelle 4
Wirkungen der Inokulation von B. subtilis NK-C-3 Proben Vergleichsbeispiel 4 Beispiel 5 Anzahl der inokulierten Bakteriensporen 0 1,000 100 10 Vomitoxin (ppm) 5.77 T.R. T.R. 0.77 Pilzwachstum + + + - + - +
Beispiel 6: 75 Eine 20 g-Portion Körner des am Markt erhältlichen, eßbaren Maises wurde in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben und in einem Autoklaven bei 121 'C 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Körner wurden mit Bacillus subtilis NK-330 (10 000 Sporen/Flasche) gemeinsam mit dem Mycotoxin bildenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Danach wurden die Komproben bei 18· C, 20‘C, 25 °C und 30 *C 14 Tage inkubiert, wobei der Gehalt an Vomitoxin in den Körnern und das 20 Wachstum des Pilzstammes bestimmt wurde.
Als Vergleichsbeispiel 5 wurde das selbe Verfahren wiederholt, mit Ausnahme, daß Bacillus subtilis NK-330 nicht inokuliert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. 25
Tabelle 5
Wirkungen der Inokulation von B. subtilis NK-330 Inkubationstemperatur (°C) 18 20 25 30 Vomitoxin (ppm) Vergleichsbeispiel 5 33.2 19.1 8.69 1.81 Beispiel 6 9.83 2.04 N.D. N.D. Pilzwachstum Vergleichsbeispiel 5 + + + + + + + + + + + + Beispiel 6 + + + + + + - -
Beispiel 7:
Eine 20 g-Portion Körner des am Markt erhältlichen, eßbaren Maises wurden in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben und in einem Autoklaven bei 121 *C 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Körner wurden mit Bacillus subtilis NK-C-3 (10 000 Sporen/Flasche) gemeinsam mit dem Mycotoxin bildenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Danach wurden die Komproben bei 18'C, 20*C, 25*C und 30'C 14 Tage unter Bestimmung des Gehaltes an Vomitoxin in den Körnern und des Wachstums des Pilzstammes inkubiert.
Als Vergleichsbeispiel 6 wurde das selbe Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme, daß Bacillus subtilis NK-C-3 nicht inokuliert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. 50 55 5 10
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Tabelle 6 Wirkungen der Inokulation von B. subtilis NK-C-3 Inkubationstemperatur (°C) 18 20 25 30 Vomitoxin (ppm) Vergleichsbeispiel 6 33.2 19.1 8.69 1.81 Beispiel 7 9.24 0.88 N.D. N.D. Pilzwachstum Vergleichsbeispiel 6 + + + + + + + + + + + + Beispiel 7 + + + + + - -
Beispiel 8:
Weizenkömer wurden mit einem Hammer gemahlen und gesiebt unter Verwendung eines 16 Mesh-Siebes, um große Stücke der gemahlenen Körner zu sammeln, welche nicht durch das Sieb hindurchgehen. Nach Einweichen der so gesammelten Weizenkomstücke über Nacht in Wasser wurde eine 20 g-Portion der eingeweichten Stücke in einen Erienmeyer-Kolben gegeben und in einem Autoklaven bei 121 *C 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Kornstücke wurden mit Bacillus subtilis NK-330 (10 000 Sporen/Flasche) gemeinsam mit dem Mycotoxin bildenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Nach Inkubation bei 25 °C für 14 Tage wurden der Gehalt an Vomitoxin in den Weizenkornstücken und das Wachstum des Pilzstammes bestimmt.
Als Vergleichsbeispiel 7 wurde das selbe Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme, daß Bacillus subtilis NK-330 nicht inokuliert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7
Wirkungen der Inokulation von B. subtilis NK-330 Vomitoxin (ppm) Pilzwachstum Vergleichsbeispiel 7 27.64 + + + Beispiel 8 0.63 +
Beispiel 9: 40
Weizenkörner wurden mit einem Hammer gemahlen und gesiebt unter Verwendung eines 16 Mesh-Siebes, um große Stücke der gemahlenen Körner zu sammeln, welche nicht durch das Sieb hindurchgehen. Nach Einweichen der gesammelten Weizenkornstücke über Nacht in Wasser wurde eine 20 g-Portion der eingeweichten Stücke in einen Erienmeyer-Kolben gegeben und in einem Autoklaven bei 121 * C 15 min 45 sterilisiert. Die sterilisierten Kornstücke wurden mit Bacillus subtilis NK-C-3 (10 000 Sporen/Flasche) gemeinsam mit dem Mycotoxin bildenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Nach Inkubation bei 25’C für 14 Tage wurden der Gehalt an Vomitoxin in den Weizenkornstücken und das Wachstum des Pilzstammes bestimmt.
Als Vergleichsbeispiel 8 wurde das selbe Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme, daß Bacillus subtilis so ’ NK-C-3 nicht inokuliert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. 8 55
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Tabelle 8
Wirkungen der Inokulation von B. subtilis NK-C-3 Vomitoxin (ppm) Pilzwachstum Vergleichsbeispiel 8 27.64 + + + Beispiel 9 0.63 + 10
Beispiel 10:
Eine 20 g-Portion von Körnern des am Markt erhältlichen, eßbaren Maises wurde in einen Erienmeyer-Kolben gegeben und in einem Autoklaven bei 121 °C 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Körner wurden mit 15 Bacillus subtilis NK-330 (10 000 Sporen/Flasche) gemeinsam mit dem Mycotoxin bildenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Nach Inkubation bei 25 ”C für 14 Tage wurden die Mengen an Vomitoxin, 3-Acetyldeoxynivalenol und Zearalenon in den Körnern und das Wachstum des Pilzstammes bestimmt.
Ais Vergleichsbeispiel 9 wurde das selbe Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme, daß Bacillus subtilis 20 NK-330 nicht inokuliert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9
Wirkungen der Inokulation von B. subtilis NK-330 Vomitoxin (ppm) 3-Acetyldeoxy nivalenol (ppm) Zearalenon (ppm) Pilzwachstum Vergleichsbeispiel 9 3.47 2.75 229.2 + + + Beispiel 10 N.D. N.D. N.D. + -
In diesem Beispiel wurden die Gehalte an 3-Acetyldeoxynivalenol und Zearalenon wie folgt bestimmt. Nach Extrahieren der inkubierten Körner mit 85%-igem Acetonitil wurde der resultierende Extrakt mit Hexan 35 behandelt, um Verunreinigungen zu entfernen und dann getrocknet. Die trockene Substanz wurde auf eine Florisil-Säule aufgegeben. Nach Waschen der Säule mit Hexan wurden die Mycotoxine mit einer Chloro-form/Methylalkohol-Mischung (9:1) eluiert und ihr Gehalt in dem Eluat wurde mit Hilfe der Gaschromatographie (Elektronenladungsdetektor) und der Flüssigkeitschromatgraphie bestimmt (Proc. Jpn. Assoc. Mycoto-xicol., Nr. 26, Seiten 17-18, 1987). 40
Beispiel 11:
Eine 20 g-Portion von Körnern des am Markt erhältlichen, eßbaren Maises wurden in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben und bei 121 ’C 15 min in einem Autoklaven sterilisiert. Die sterilisierten Körner wurden mit 45 Bacillus subtilis NK-C-3 (10 000 Sporen/Flasche) gemeinsam mit dem Mycotoxin bildenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Nach Inkubation bei 25’C für 14 Tage wurde der Gehalt an Vomitoxin, 3-Acetyldeoxynivalenol und Zearalenon in den Körnern und das Wachstum des Pilzstammes bestimmt.
Als Vergleichsbeispiel 10 wurde das selbe Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme, daß Bacillus so subtilis NK-C-3 nicht inokuliert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. 9 55
Claims (8)
- AT 397 599 B Tabelle 10 Wirkungen der Inokulation von B. subtilis NK-C-3 Vomitoxin (ppm) 3-Acetyldeoxy nivalenol (ppm) Zearalenon (ppm) Pilzwachstum Vergleichsbeispiel 10 3.47 2.75 229.2 + + + Beispiel 11 N.D. N.D. N.D. + - Beispiel 12: Eine 20 g-Portion Körner des am Markt erhältlichen, eßbaren Maises wurde in einem Erlenmeyer-Kolben gegeben und in einem Autoklaven bei 121 ’C 15 min sterilisiert. Die sterilisierten Körner wurden mit Bacillus subtilis ATCC 10774 (10 000 Sporen/Flasche) gemeinsam mit dem Mycotoxin bildenden Pilz, Fusarium graminearum ATCC 34909 (etwa 10 000 Sporen/Flasche) inokuliert. Nach Inkubation bei 25* C für 14 Tage wurde der Gehalt an Vomitoxin, 3-Aceyldeoxynivalenol und Zearalenon in den Körnern und das Wachstum des Pilzstammes bestimmt. 20 Als Vergleichsbeispiel 11 wurde das selbe Verfahren wiederholt, mit der Ausnahme, daß Bacillus subtilis ATCC 10774 nicht inokuliert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11 25 Wirkungen der Inokulation von B. subtilis ATCC 10744 Vomitoxin (ppm) 3-Acetyldeoxy nivalenol (ppm) Zearalenon (ppm) Pilzwachstum Vergleichsbeispiel 11 3.47 2.75 229.2 + + + Beispiel 12 N.D. N.D. N.D. +- 35 Analoge Ergebnisse können erhalten werden, indem eine Kulturlösung ohne oder nach der Abtrennung der kultivierten Bakterienzellen oder durch Verwendung von gereinigtem Iturin A, anstelle der Verwendung der isolierten Zellen eines Stamms von Bacillus subtilis verwendet wird. Es wurde so beobachtet, daß die Anwendung der Zeilen von Iturin A produzierenden Stämmen von Bacillus subtilis auf landwirtschaftliche Produkte, welche mit Mycotoxin produzierenden Pilzen, welche zur 40 Gattung Fusarium gehören, kontaminiert sind, sowohl das Wachstum der Pilze als auch die Produktion der Mycotoxine inhibieren. Aus diesen Ergebnissen ist es evident, daß die Mycotoxinverunreinigung, weiche durch Mycotoxin bildende Pilze, welche zur Gattung Fusarium gehören, durch Anwendung eines Bakterienstammes, welcher zu Bacillus subtilis, Iturin A oder einer Mischung davon gehört, auf ein landwirtschaftliches Produkt und/oder Felder, auf welchen diese Produkte kultiviert werden oder wachsen, verhindert 45 werden kann. Patentansprüche 1. Verfahren zur Verhinderung von Mycotoxinkontamination in landwirtschaftlichen Produkten, hervorgeru-50 fen durch einen zur Gattung Fusarium gehörenden Mycotoxin produzierenden Pilz, dadurch gekennzeichnet, daß ein zu Bacillus subtilis gehörender, Iturin A produzierender Stamm auf die landwirtschaftlichen Produkte, die auszusäenden Samen, oder auf ein Feld, auf welchem das landwirtschaftliche Produkt kultiviert werden soll oder wächst, aufgebracht wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm auf das landwirtschaftliche Produkt vor oder nach seiner Ernte aufgebracht wird. 10 AT 397 599 B
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das landwirtschaftliche Produkt aus Getreide gewählt wird.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das landwirtschaftliche 5 Produkt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen und Gerste gewählt ist.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein zu Bacillus subtilis gehörender Iturin A produzierender Stamm ein NK-330 (FERM BP-1580) Stamm oder eine zur Bildung von Iturin A fähige Variante davon ist. w
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein zu Bacillus subtilis gehörender Iturin A produzierender Stamm ein NK-C-3 (FERM BP-1581) Stamm oder eine zur Bildung von Iturin A fähige Variante davon ist. rs
- 7. Zusammensetzung zur Verhinderung der Mycotoxinkontamination in einem landwirtschaftlichen Produkt, hervorgerufen durch einen zur Gattung Fusarium gehörenden Pilz, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine landwirtschaftlich wirksame Menge eines Iturin A produzierenden Bakterienstammes, welcher zu Bacillus subtilis gehört, und landwirtschaftlich verträgliche Verdünnungsmittel, Hilfsmittel oder Mischungen davon enthält. 20
- 8. Verwendung eines Iturin A produzierenden Bakterienstammes, welcher zu Bacillus subtilis gehört, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verhinderung der Mycotoxinkontamination in einem landwirtschaftlichen Produkt, hervorgerufen durch einen zur Gattung Fusarium gehörenden Mycotoxin bildenden Pilz. 25 11
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