KR101494624B1 - 제아라레논 분해 활성을 가지는 아그로마이세스 속 m15 균주 및 이의 용도 - Google Patents

제아라레논 분해 활성을 가지는 아그로마이세스 속 m15 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제아라레논 분해 활성을 가지는 아그로마이세스 속 M15 균주 (KCTC18260P) 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 토양으로부터 분리한 균주가 곰팡이 독소 제아라레논을 효과적으로 분해하는 것을 통해, 본 발명의 신규 균주를 이용하여 곡류를 포함한 농산물에 처리하여 제아라레논을 제거할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

제아라레논 분해 활성을 가지는 아그로마이세스 속 M15 균주 및 이의 용도{Agromyces sp. M15 strain having degradation activity of zearalenone and uses thereof}
본 발명은 제아라레논 분해 활성을 가지는 아그로마이세스 속 M15 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 토양에서 분리한 제아라레논(zearalenone) 분해 활성을 가지는 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주, 상기 균주, 균주의 배양물 또는 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 포함하는 제아라레논 분해용 조성물, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 제아라레논(zearalenone) 분해용 조성물의 제조 방법, 상기 제아라레논 분해용 조성물을 농산물에 처리하는 단계를 포함하는 농산물에 존재하는 제아라레논의 분해 방법, 상기 제아라레논 분해용 조성물을 농산물에 처리하는 단계를 포함하는 제아라레논이 제거된 가공식품의 제조 방법 및 상기 제아라레논 분해용 조성물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제에 관한 것이다.
최근 국내 곡류의 재배양식이 친환경 유기농업을 선호하고 농약 사용이 감소하여 곰팡이 독소의 오염원이 되고 있는 푸자리움(Fusarium) 속의 진균의 밀도가 증가하고 이에 따라 곡류 생산에 피해가 증가하고 있다. 또한 지구 온난화로 인해 푸자리움균에 의한 붉은 곰팡이병이 곡류에서 대량 발생하고 있는 추세이다. 특히, 푸자리움 그라미니어룸(Fusarium graminearum)(완전세대 Gibberella zeae)에 의한 밀, 보리, 벼, 옥수수 등의 곡류에 발생하는 붉은 곰팡이병에 의해 여러 가지 곰팡이 독소가 곡류에 축적되어 인축에 위협을 주고 있다.
곡류를 오염하는 곰팡이 독소 중 제아라레논(zearalenone)은 비스테로이드계 에스트로겐성의 곰팡이 독소로서 F-2 독소(F-2 mycotoxin) 또는 FES(fermentation estrogenic substance)로도 불리며 여성호르몬의 일종인 에스트로겐(estrogen)과 유사한 화학구조와 성질을 가지고 있어서 인축에 내분비 교란을 유발할 수 있다. 특히 제아라레논은 급성독성이 약해 단기간에 독성이 나타나지 않기 때문에 제아라레논의 중독은 초기에 확인이 어렵다. 제아라레논으로 오염된 곡류를 장기간 섭취하는 경우 돼지에서는 불임을 유발하며 인축에 중독된 경우 암이나 돌연변이를 일으킬 수도 있다. 제아라레논은 우리나라에 수입되는 곡류에서 자주 검출되나 급성독성이 보고되어 있지 않고 제아라레논이 열에 안정하여 오염된 곡류를 통한 가공 식품과 사료에도 잔류하여 인축에 축적되어 문제를 야기할 수 있다.
곰팡이 독소로 오염된 곡류로부터 제아라레논을 제거하기 위한 생물학적 방법은 미생물을 이용하여 독소를 분해하는 방법이 있다. 특히 세균에 의한 제아라레논의 분해는 1997년 Megharaj(Letters in Applied Microbiology 24:329-333) 등에 의해 한가지 세균이 아닌 몇 가지 미생물의 혼합 배양에 의해 제아라레논의 분해가 가능함이 알려졌으나 제아라레논 전 분해 활성을 보이는 한가지 미생물은 분리되지 못했다. 2010년에는 조(Biotechnology Letter 32:1921-1924) 등에 의해 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주가 제아라레논을 분해할 수 있음이 보고되었다. 또한 2011년에 유(Biodegradation 22:613-622) 등에 의해 토양에서 분리한 아시네토박터(Acinetobacter) 균주가 제아라레논을 분해하며 그 배양액에 분해에 관련된 단백질이 있음을 확인하였으나 그 기능을 확인하지는 못했다. 2012년 Kriszt(PLoS One 7(9):e43608) 등은 비병원성의 로도코커스 피리디니오보란(Rhodococcus pyridiniovoran) 균주가 제아라레논을 효율적으로 분해하였으며 그 결과 에스트로겐 활성이 완전히 제거됨을 확인하였다. 상기와 같이 최근들어 미생물을 이용한 제아라레논 독소의 분해가 가능한 방법임이 확인되었으나 아직까지 정확하게 제아라레논이 어떤 효소나 분해경로를 통해 분해되는지는 아직까지 밝혀진 바가 없다.
미생물이나 그 유전자를 이용하여 제아라레논 분해를 위한 특허들이 출원되어 있으나 극히 몇종의 미생물만 알려져 있고 미생물의 유전자를 식물에 형질전환하여 곰팡이 독소 오염을 저감화하려는 연구가 진행되고 있으나 획기적인 진전이 있는 상태는 아니다.
한편, 한국등록특허 제1280811호에는 '제아라레논 분해 활성을 갖는 미생물, 이를 이용한 제아라레논 분해 방법 및 사료첨가세'가 개시되어 있고, 미국등록특허 제08404477호에는 '바실러스 리케니포르미스와 제아라레논의 해독 방법(Bacillus licheniformis and method for detoxification of zearalenone)'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 제아라레논 분해 활성을 가지는 아그로마이세스 속 M15 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 밀 붉은 곰팡이가 자주 발생하는 토양으로부터 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주를 분리하였다. 상기 균주를 제아라레논을 첨가한 배지에서 배양한 결과, 대조구에 비해 제아라레논을 효과적으로 분해하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 토양에서 분리한 제아라레논(zearalenone) 분해 활성을 가지는 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주 (KCTC18260P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 균주, 균주의 배양물 또는 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 포함하는 제아라레논 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 제아라레논(zearalenone) 분해용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제아라레논 분해용 조성물을 농산물에 처리하는 단계를 포함하는 농산물에 존재하는 제아라레논의 분해 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제아라레논 분해용 조성물을 농산물에 처리하는 단계를 포함하는 제아라레논이 제거된 가공식품의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제아라레논 분해용 조성물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제를 제공한다.
본 발명에서는 토양에서 분리한 아그로마이세스 속 새로운 균주가 곰팡이 독소인 제아라레논을 효과적으로 분해하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 신규 균주를 이용하여 곡류를 포함한 농산물에 처리하여 제아라레논을 효과적으로 제거할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 토양에서 분리한 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주에 의한 제아라레논 분해의 박막 크로마토그래피 결과 사진이다. ZEA 표시의 화살표는 제아라레논을 나타내며, 표시없는 화살표는 M15 균주에서 생성되는 새로운 대사물을 나타낸다. 레인 1: 제아라레논 표준물질, 레인 2: LB 배지 추출물, 레인 3: LB 배지에 제아라레논을 첨가하고 대장균을 7일 배양한 대조구, 레인 4: LB 배지에 제아라레논을 첨가하고 M15 균을 7일 배양한 추출물.
도 2는 분리한 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주에 의한 제아라레논 분해의 박막 크로마토그래피 결과를 배양시간별로 나타낸 사진이다. 빈 화살표는 제아라레논을 나타내며, 채운 화살표는 M15 균주에서 생성되는 새로운 대사물을 나타낸다. 레인 1~4: 제아라레논이 첨가되지 않은 LB 배지에서 배양한 M15 균주 배양액의 추출물, 레인 5: 제아라레논 표준물질, 레인 6~9: 제아라레논이 첨가된 LB 배지에서 배양한 M15 균주 배양액의 추출물, 각 레인 하단의 아라비아 숫자는 배양일을 나타냄.
도 3은 본 발명의 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주의 16S rRNA 유전자 분석 결과를 나타낸 계통도이다.
도 4는 토양에서 분리한 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주의 제아라레논 분해 효능을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 결과이다. Only LB: LB 배지 자체의 추출물, LB+ZEARALENONE: 제아라레논을 포함하고 있는 LB 배지 자체의 7일간 균주없이 배양후 추출물, LB+M15: 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15만 제아라레논 없이 LB 배지에서 7일간 배양한 후 추출물, LB+M15+ZEARALENONE: 신균주 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15를 제아라레논을 포함하고 있는 LB 배지에서 7일간 배양한 후 추출물.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토양에서 분리한 제아라레논(zearalenone) 분해 활성을 가지는 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주를 제공한다.
밀 붉은 곰팡이병이 자주 발생하는 토양으로부터 유일한 탄소원으로 제아라레논을 제공하는 최소배지를 사용하여 미생물을 분리하였고, 수차례 계대배양함으로써 단일균주를 분리하였다. 분리한 균주의 16S rRNA의 염기서열(서열번호 1)을 분석한 결과, 아그로마이세스 속 균주들과 16S rRNA 유전자의 유사도가 대부분 97% 이상으로 높게 확인되었으나 정확한 종 동정이 되지 않는 새로운 종의 균주임을 확인하였다.
상기 아그로마이세스 속 M15 균주는 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC, Korean Collection for Type Culture)에 2013년 10월 30일자로 기탁하였다(기탁번호는 KCTC18260P임).
제아라레논은 곰팡이 독소 중 하나로, 곰팡이 독소란 곰팡이가 발육 과정에서 생산하는 2차 대사산물 중 경구 섭취한 동물에 대하여 독작용을 하여, 병적인 중독증을 일으키는 물질을 총칭한다.
본 발명의 상기 제아라레논은 푸자리움 로제움(Fusarium roseum), 푸자리움 트리치니툼(Fusarium tricinitum), 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 또는 푸자리움 그라미니어룸(Fusarium graminearum)이 생산하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 푸라지움 그라미니어룸(Fusarium graminearum)이 생산할 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 균주의 배양물 또는 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 포함하는 제아라레논 분해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제아라레논 분해용 조성물은 유효성분으로서 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주를 이용하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 제아라레논(zearalenone) 분해용 조성물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 아그로마이세스 속 M15 균주를 배양하는 방법은 당업계에서 공지된 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제아라레논 분해용 조성물을 농산물에 처리하는 단계를 포함하는 농산물에 존재하는 제아라레논의 분해 방법을 제공한다. 상기 농산물은 옥수수, 쌀, 보리, 수수, 밀, 호밀, 귀리, 조, 피, 트리트케일, 메밀 등의 곡류, 대두박, 들깨묵, 참깨묵, 채종박, 면실박, 낙화생박, 고추씨박, 아마박, 야자박, 해라라기씨박, 피마자박, 옥수수배아박, 소맥배아박, 옥수수글루텐, 밀글루텐, 주정박, 맥주박, 귀리박, 전분박 등의 박류 또는 그 부산물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 제아라레논 분해용 조성물의 처리는 농산물의 재배 또는 수확 단계에서 처리하는 것으로, 그 처리 방법은 당업자에게 알려진 방법으로 수행될 수 있으며 살포, 혼합 또는 침지의 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 제아라레논 분해용 조성물을 농산물에 처리하는 단계를 포함하는 제아라레논이 제거된 가공식품의 제조 방법을 제공한다. 상기 농산물 및 제아라레논 분해용 조성물의 처리방법은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 제아라레논 분해용 조성물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제에는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제와 같은 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 사료첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 사료 첨가제는 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 리파제와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 가축 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 가축 사료 첨가용 조성물에는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 사료 첨가제에 포함되는 본 발명의 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주의 양은 특별히 한정되지 않으나, 사료로 제공되는 곡류 등의 농산물에 존재하는 제아라레논을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명의 아그로마이세스 속( Agromyces sp .) M15 균주의 분리
본 발명자들은 푸자리움 곰팡이가 생산하는 곰팡이 독소 제아라레논을 제거하거나 분해하는 미생물을 분리하기 위하여 밀 붉은 곰팡이가 자주 발생하는 밭토양 1g을 멸균수 9㎖로 현탁하여 10- 2 에서 10-5배 희석한 후에 유일한 탄소원으로 제아라레논을 제공하는 최소배지(증류수 1ℓ에 다음의 성분을 포함함: (NH4)2SO4, 0.5g; MgSO4·7H2O, 0.2g; CaCl2, 0.05g; Na2HPO4, 2.44g; KH2PO4, 1.52g; 제아라레논 0.1g; 한천 15g)에 상기 현탁액을 0.1㎖씩 평판배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 48시간 지난 후에 평판배지에 나타난 균종들 중에서 서로 다른 형태의 임의의 균총들을 15 종류 선발하여 총 3회 이상 계대배양하여 순수분리하였다. 순수분리한 미생물들 중 실제로 제아라레논 분해 또는 제거능이 있는 후보 미생물을 선발하기 위해 박막 크로마토그래피(TLC, thin layer chromatography)를 수행하였다.
LB 액체배지에 5㎖에 15개의 후보 미생물을 30℃에서 흔들면서 24시간 전배양하였다. 전배양한 미생물 배양액 0.05㎖을 제아라레논이 10㎍/㎖의 농도로 첨가된 LB 액체배지에 접종하여 30℃에서 7일간 배양하였다. 각 미생물 배양액을 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 유리 시험관으로 옮겼다. 상등액과 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 강하게 교반하고 층이 날릴 때까지 기다린 후 상층인 에틸아세테에트 층만을 유리 바이엘에 옮겨서 용액을 질소기체로 처리하여 용매를 모두 제거하였다. 이후 남은 물질에 메탄올을 최종 0.2㎖ 첨가하여 박막 크로마토그래피를 수행하였다. 박막은 실리카 플래이트를 사용하였고 표준 물질로 제아라레논 (1mg/㎖) 용액을 5㎕ 점적하였다. 각 미생물 배양액의 메탄올 용액도 5㎕를 점적하고 전개용매는 아세톤과 클로로포름이 2:8로 혼합된 용매를 사용하여 전개하였고 전개가 완료된 후 용매를 말리고 365nm의 자외선을 조사하여 관찰하였다(도1). 그 결과 M15 균주의 배양액에서 제아라레논은 현저하게 줄어들고 새로이 생성되는 대사물질(도 1, 화살표)이 관찰되었다.
또한 동일한 방식의 박막 크로마토그래피를 미생물 배양시간별로 수행하였는데 M15 균주를 제아라레논이 10㎍/㎖의 농도로 첨가된 LB 액체배지와 제아라레논이 첨가되지 않은 LB 액체배지에 접종하고 배양시간별로 제아라레논 분해 여부를 확인하였다. 그 결과 M15 균주의 배양시간이 증가함에 따라 제아라레논(도 2, 빈 화살표)이 줄어들면서 새로운 대사물(도 2, 채운 화살표)이 나타남을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명자들은 상기 분리된 M15 균주의 장기 보존을 위해 40% 글리세롤 용액에 균주를 현탁시켜 -80℃에 보관하였으며 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 동일한 균주를 기탁하였다.
실시예 2. 본 발명의 신균주인 아그로마이세스 속( Agromyces sp .) M15 균주의 동정
상기에서 분리한 균주를 동정하기 위하여 현미경 관찰과 염색반응을 실시한 결과 분리한 균주는 막대형의 그람양성 간균으로 확인되었다. 정확한 계통분류학적 동정을 위해 16S rRNA 유전자의 DNA 서열분석을 실시하였다. LB 액체배지에서 1일간 배양한 M15 균주의 전체 DNA를 Dokdo-Prep Bacterial Genomic DNA Purification Kit(엘피스바이오텍, 한국)로 분리하여 게놈 DNA를 준비하였다. 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기의 PCR 프라이머를 사용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였다.
프라이머 서열정보
정방향 프라이머 8F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'(서열번호 2)
역방향 프라이머 1492r 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'(서열번호 3)
PCR 반응 조건은 초기변성을 95℃에서 5분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 52℃에서 30초), 연장(elongation, 72℃에서 1분 30초) 단계를 총 30회 반복하였다. 최종적으로 72℃에서 7분간 유지시키면 PCR 반응을 종결시켰다.
증폭된 PCR 산물은 FavorPrep GEL/PCR Purificatiob Mini Kit(Favorgen Biotech, 한국)를 이용하여 정제한 후, pGEM-T Easy 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하고, DNA 서열은 마크로젠(한국)에 의뢰하여 분석결과를 획득하였으며, 획득된 염기 서열을 BLASTN 프로그램을 이용하여 분석하였다.
본 발명의 M15 균주의 16S rRNA 유전자의 DNA 염기서열은 서열번호 1에 나타내었다. 16S rRNA 유전자 분석결과는 M15 균주가 다수의 아그로마이세스 종들을 포함하는 아그로마이세스 종들과 99% 유사도를 보여서 아그로마이세스 속의 미생물이나 정확한 종으로 동정은 어려웠다. 따라서 본 발명에서는 16S rRNA 유전자 분석결과로 M15 균주를 Agromyces sp. M15로 우선 동정하였다. 16S rRNA 유전자의 염기서열을 이용한 계통수 분석방법은 하기와 같다.
우선 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)의 유전자은행(GenBank) 데이터베이스에서 M15 균주의 16S rRNA 유전자와 유사도가 높은 21개 균주의 아그로마이세스 종들의 16S rRNA 유전자 서열을 확보하였다. 확보된 21개의 유전자 염기서열과 M15 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 Clustal X(버전 2.1) 프로그램을 이용하여 다중정렬(multiple alignment)하였다. 다중정렬 결과 생성된 결과 파일을 이용하여 MEGA5 프로그램(www.megasoftware.net/)에서 DNA 서열 유사도에 따른 유전적 거리 분석을 실시하였다. 해당 결과는 Neighbor-joining 방법을 이용하여 16S rRNA 유전자 계통수를 제작하였다.
그 결과, 본 발명의 M15 균주는 16S rRNA 유전자 DNA서열 분석에서 아그로 마이세스 종 OAct-353 균주와 가장 높은 유사도인 99% 유사도를 보였으며, 다른 아그로마이세스 종들의 16S rRNA 유전자와도 대부분 97% 이상의 높은 유사도를 보였다. 계통수 분석의 결과도 본 발명의 M15 균주가 아그로 마이세스 종 OAct-353 균주와 가장 가까운 근연 균주임을 확인하였다(도 3). 또한 본 발명자들은 동정한 균주가 기존에 존재하지 않는 신규한 균주임을 확인함으로써, 2013년 10월 30일 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC 18260P를 부여받았다.
이하 본 발명에서는 상기 동정한 신균주를 “아그로마이세스 속(Agromyces sp) M15”로 명명하였다.
실시예 3. 아그로마이세스 속( Agromyces sp ) M15 균주의 제아라레논 분해 효과 확인
상기 실시예 1에서 박막 크로마토그래피(TLC, thin layer chromatography) 방법으로 일부 확인된 본 발명의 아그로마이세스 속(Agromyces sp) M15 균주의 제아라레논 분해 효과를 기기분석을 통해 정확히 평가하기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, High perfomance liquid chromatography) 방법으로 검정하였다.
LB 액체배지 5㎖에 M15 균주 미생물을 30℃에서 흔들면서 24시간 전배양하였다. 전배양한 미생물 배양액 0.05㎖을 제아라레논이 10㎍/㎖의 농도로 첨가된 LB 액체배지에 접종하여 30℃에서 7일간 배양하였다. 미생물 배양액을 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 유리 시험관으로 옮겼다. 상등액과 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 강하게 교반하고 층이 날릴 때까지 기다린 후 상층인 에틸아세테에트 층만을 유리 바이엘에 옮겨서 용액을 질소기체로 처리하여 용매를 모두 제거하였다. 이후 남은 물질에 메탄올 최종 1㎖를 첨가하여 녹인후 아세토니트릴과 증류수가 55:45의 비율로 혼합된 용매에 100배 희석한 후 다음의 조건에서 HPLC를 수행하였다. 이때 대조구로는 LB 배지 자체의 추출물, LB 배지에 제아라레논이 첨가된 뒤 7일 균주 없이 배양한 추출물 및 LB 배지에 제아라레논이 첨가되지 않은 채 M15 균주만 7일 배양한 추출물을 사용하였다.
먼저 컬럼은 C18 컬럼(C18(ZORBAX Eclipse Plus, 5 um, 4.6 X 250mm)을 사용하였고, 이동상은 아세토니트릴과 증류수가 55:45의 비율로 혼합된 용매를 사용하였으며 유속은 분당 1㎖ 이었다. 각 추출물은 20㎕를 주입하였으며 검출은 236nm 파장에서 용출되는 물질을 검출하였다. 그 결과 제아라레논은 도 4에서 나타나듯이 8.2분대에 특이적인 피크를 보였으며, 대조구인 LB 배지 자체나 제아라레논이 첨가되지 않은채 배양된 M15 균주 배양액에서는 제아라레논이 동일한 시간대에 검출되지 않았다. 한편, 제아라레논이 첨가된 LB 배지에서 M15가 배양되었을 때에는 8.2분대에 제아라레논 피크가 완벽히 사라지고 대신 도 4의 화살표와 같이 3분 30초대와 5분 35초대에서 새로운 피크가 검출되었는데, 이는 다른 대조구에서는 검출되지 않아 M15 균주가 제아라레논을 제거하거나 분해한 결과의 대사물로 여겨졌다(도 4).
한국생명공학연구원 KCTC18260P 20131030
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Agromyces sp. M15 strain having degradation activity of zearalenone and uses thereof <130> PN13369 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1489 <212> DNA <213> Agromyces sp. M15 <400> 1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60 gatgaagccc agcttgctgg gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgagtaacc 120 tgccctggac tctgggataa ccccgagaaa tcggagctaa taccggatag gaccttggat 180 cgcatgattt ttggtggaaa gtttttcggt ttgggatgga ctcgcggcct atcagcttgt 240 tggtgaggta atggctcacc aaggcgtcga cgggtagccg gcctgagagg gtgaccggcc 300 acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac 360 aatgggcgca agcctgatgc agcaacgccg cgtgcgggat gacggccttc gggttgtaaa 420 ccgcttttag taaggaagaa ggggcttcgg ccttgacggt acttgcagaa aaaggaccgg 480 ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtccg agcgttgtcc ggaattattg 540 ggcgtaaaga gctcgtaggc ggtttgtcgc gtctgccgtg aaatcctccg gctcaacctg 600 aggtctgcgg tgggtacggg cagacttgag tggtgtaggg gagactggaa ttcctggtgt 660 agcggtggaa tgcgcagata tcaggaggaa caccgatggc gaaggcaggt ctctgggcac 720 ttactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780 acgccgtaaa cgttgggcgc tagatgtggg gacctttcca cggtttccgt gtcgtagcta 840 acgcattaag cgccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac 900 gggggcccgc acaagcggcg gagcatgcgg attaattcga tgcaacgcga agaaccttac 960 caaggcttga catgaccgag aacgccgcag aaatgtggaa ctctttggac actcggttac 1020 aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080 gcgcaaccct cgtcgcatgt tgccagcacg ttatggtggg gactcatgtg agactgccgg 1140 ggtcaactcg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gtcttgggct 1200 tcacgcatgc tacaatggcc ggtacaaagg gctgcgatgt cgtaaggcgg agcgaatccc 1260 aaaaagccgg tctcagttcg gattgaggtc tgcaactcga cctcatgaag tcggagtcgc 1320 tagtaatcgc agatcagcaa cgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380 cgtcaagtca tgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ctaacccttg tggagggagc 1440 cgtcgaagat gggatcggtg attaggacta agtcgtaaca aggtaacca 1489 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

  1. 토양에서 분리한 제아라레논(zearalenone) 분해 활성을 가지는 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주(KCTC18260P).
  2. 제1항의 균주, 균주의 배양물 또는 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 포함하는 제아라레논(zearalenone) 분해용 조성물.
  3. 제1항의 아그로마이세스 속(Agromyces sp.) M15 균주(KCTC18260P)를 배양하는 단계를 포함하는 제아라레논(zearalenone) 분해용 조성물의 제조 방법.
  4. 제2항의 제아라레논(zearalenone) 분해용 조성물을 농산물에 처리하는 단계를 포함하는 농산물에 존재하는 제아라레논(zearalenone)의 분해 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 농산물은 곡류, 박류 또는 그 부산물인 것을 특징으로 하는 농산물에 존재하는 제아라레논의 분해 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제아라레논 분해용 조성물의 처리는 농산물의 재배 또는 수확 단계에서 처리하는 것을 특징으로 하는 농산물에 존재하는 제아라레논의 분해 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제2항의 제아라레논(zearalenone) 분해용 조성물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제.
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