CN106754510B

CN106754510B - 一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用

Info

Publication number: CN106754510B
Application number: CN201611196812.3A
Authority: CN
Inventors: 李坤; 刘明刚; 卢祯鑫
Original assignee: Fujian Luodong Bio Technology Co ltd
Current assignee: Fujian Luodong Bio Technology Co ltd
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2036-12-22
Also published as: CN106754510A

Abstract

本发明涉及了一种保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌和其在促进蛋白分解方面的应用。所述枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶活性强，可强力促进蛋白物质分解。所述枯草芽孢杆菌及其溶剂或包含所述枯草芽孢杆菌组合物可应用于各种领域。在有机肥发酵上可起到能解决有机肥发酵上氨气的挥发的问题，减少氮的损失，保护肥效的作用。在养殖场除臭抑菌应用上，可以使臭味降低。在畜禽尸体无害化处理应用中，可快速无害处理尸体。在生物发酵床应用上，可做到动物粪便的无污染处理，还能产出有机肥。在饲料组合物中，可改善食用饲料的畜禽肠道的菌群，提高畜禽的消化能力和免疫能力，增强食用饲料的畜禽对饲料的消化、转化能力，同时可除臭，减轻动物畜舍或养殖场臭味。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用

技术领域

本发明涉及微生物应用领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

枯草芽孢杆菌是一种多功能的微生物，目前在有机肥发酵、饲料或发酵床制作中有一定的应用，但并非所有的枯草芽孢杆菌株在以上领域是有效的。

堆肥是利用含有肥料成分的动植物遗体和排泄物，加上泥土和矿物质混合堆积，在高温、多湿的条件下，经过发酵腐熟、微生物分解而制成的一种有机肥料。自然堆肥发酵过程长，而且在堆积发酵过程中，温度升高，pH升高，容易造成氨气溢出，总氮减少，以NH₃形式挥发损失的氮含量有时高达氮损失总量的92％，需要解决氨气的挥发问题，减少氮的损失，保护肥效。

近年来，随着我国养殖业的发展，集约化程度的提高，养殖舍内有害细菌滋生，特别是环境中大量存在的致病菌如：葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、变形杆菌、假单胞菌、沙门氏菌等细菌破坏生态环境平衡，能引起各种化脓发炎疾病，畜禽养殖舍氨气臭味严重，场内生态环境脆弱，导致肉类产品质量降低，食用安全性下降。

我国是牲畜养殖大国，畜牧业发展的同时，由于牲畜饲料基数大，每天因自然死亡和病害死亡的牲畜数量相当庞大。对动物尸体不当处理不但对水源、土壤、大气污染严重，还容易造成疫病的传播和蔓延。患有口蹄疫、猪瘟、高致病性禽流感等具有强传染性的染疫动物尸体，甚至严重威胁到人类的生命与健康。传统的动物死尸处理主要有填埋法、消毒法、焚烧法、化制法、生物降解法(发酵法)。其中，利用生物降解法处理动物尸体，但处理尸体的时间过长，处理时有恶臭发生。

目前，微生物饲料添加剂是采用农业部认可的有益微生物经发酵制成的生物制剂，是抗生素的最佳替代品。用于提高畜、禽的健康水平的人工培养菌群及其代谢产物，可调整畜、禽体内的微生态失调，保持微生态平衡。是激发动物自身有益菌种繁殖增长，同时抵制有害菌系生长的微生物制品。微生物饲料添加剂存在的主要问题是优良菌种的选择和由于菌种失活导致的微生物饲料添加剂活性降低。

发明内容

本发明人通过对枯草芽孢杆菌的研究、筛选和验证，提供了一种可促进蛋白分解的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌株制剂和含有其成分的组合物，可有效运用于有机肥发酵、养殖场除臭抑菌、畜禽尸体无害化处理、生物发酵床、微生物饲料添加剂的生产。

为本发明的第一个发明目的，本发明提供了保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学；分类命名为：枯草芽孢杆菌1号，Bacillus Subtilis 1号，保藏编号为：CCTCC M 2016441，保藏日期为：2016年09月1日的枯草芽孢杆菌。本发明的枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶活性强，可强力促进蛋白物质分解。

为本发明的第二个发明目的，本发明提供了保藏于CCTCC，保藏号为CCTCCM2016441的枯草芽孢杆菌在促进蛋白分解方面的应用。

为达到本发明的第三个发明目的，本发明提供一种促进蛋白分解的制剂，所述制剂中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌。

本发明的促进蛋白分解的制剂，所含的活性蛋白酶可促进蛋白物质的分解。

为达到本发明的第四个发明目的，本发明提供保藏于CCTCC，保藏号为CCTCCM2016441的枯草芽孢杆菌在有机肥发酵上的应用。

枯草芽孢杆菌可将料堆的温度快速升到60℃以上，并保持稳定，同时有效将粗蛋白转化为小分子氨基酸和菌体蛋白，枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶、聚谷氨酸和有机酸等高活性物质，增加堆肥的肥效。

为达到本发明的第五个发明目的，本发明提供一种用于有机肥发酵的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌可快速将料堆的温度升到60℃以上，同时所述枯草芽孢杆菌快速有效将粗蛋白转化为小分子氨基酸和菌体蛋白。同时所述枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶、聚谷氨酸和有机酸等高活性物质，增加堆肥的肥效。

为达到本发明的第六个发明目的，本发明提供一种用于养殖场除臭抑菌的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌通过快速分解粪便中蛋白，减少粪便中粗蛋白质分解为氨气，快速改善养殖舍的臭味环境，从而减少环境污染。同时所述枯草芽孢杆菌具有快速的繁殖能力，可极大减少致病菌的数量。

为达到本发明的第七个发明目的，本发明提供一种用于畜禽尸体无害化处理的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌可将埋有畜禽尸体的料堆温度快速升到60℃以上，使该料堆具备很强的发酵能力和抑制病原微生物生长的能力，所建造的堆肥体系可以迅速发酵，快速降解动物组织，并在短期内大幅升高堆肥温度，杀死病原菌和病毒，同时发酵体的抑制病原微生物生长的能力也进一步促进了对病原微生物的杀灭，从而达到提高降解效率和畜禽尸体处理安全性的目的。

为达到本发明的第八个发明目的，本发明提供一种用于生物发酵床的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌通过快速分解生物发酵床中的粪便和尿液中粗蛋白质，使之转化为有机肥。这样减少粪便和尿液中蛋白质分解为氨气，降低处理过程氨气排放量，从而减少环境污染达到减少废气废水排放的目的。

为达到本发明的第九个发明目的，本发明提供一种用于饲料的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌可改善食用饲料的畜禽肠道的菌群，提高畜禽的免疫能力，增强食用饲料的畜禽对饲料的消化、转化能力，促进动物生长，提高畜禽的日增重和饲料利用率；同时可除臭，减轻动物畜舍或养殖场臭味。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌为发明人在生物发酵床分解粪便发酵物中分离筛选出，其能耐高温(在100℃可存活10分钟以上)、耐酸(可在pH值为2.5的环境中存活)、耐胆盐(在胆盐中存活率在90％以上)。该菌株可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和甘露醇，形成酸，不产气，不分解乳糖，不形成吲哚、硫化氢；产酶有淀粉酶、蛋白酶；在培养基形成的菌落表面粗糙，褶皱，有突起，呈火山口状；不透明，成灰白色，细胞杆状，有芽孢，芽孢椭圆形中生或近中生，芽孢囊不明显膨大，在7％氯化钠中生长，V-P测定阳性，硝酸盐还原阳性，能从D-甘露醇产酸，不利用丙酸盐。该枯草芽孢杆菌产生蛋白酶能力强，可快速、强力促进蛋白物质分解。

在分离筛选中，所用的样品为粪便发酵物，所用培养基按1L蒸馏水、0.3％牛肉膏、1％蛋白胨、1.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖的配方配置，并在121℃灭菌20分钟，pH控制在7.2-7.4。用灭菌后的NaCl溶液，稀释样品，得到样品液。将样品液涂布在以上培养基后，在37℃、培养48小时后，挑选长势良好、菌落形态相似且数目最多的菌落，分离纯化直至菌落形态一致的单菌。

将分离出的单菌进行蛋白酶检测试验，筛选出蛋白酶活性最强的单菌。该枯草芽孢杆菌菌种保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016441。该菌种在牛奶培养基上37℃培养24小时后，水解圈直径为10mm，菌落直径在5mm，水解圈直径与菌落直径比为2.0。

筛选出的菌种保存在砂土管、冷冻干燥管中，将处于休眠状态。使用时需要进行活化、培养，获得一定数量的纯种菌。

枯草芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：

a、菌种活化：将处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化

b、菌种扩大培养：将菌种依次经过一级种子摇床培养、二级种子罐培养、三级种子罐培养、发酵罐进行扩大培养。

所述菌种扩大培养用培养基包括如下组分：玉米淀粉、豆粕粉、玉米浆、酵母浸粉、K₂HPO₄、蛋白胨、MgSO₄.7H₂0；所述培养基的pH值为7.5。

实施例1有机肥发酵试验

本试验设2个对照组和1个测试组。每组按85％猪粪、15％稻草秸秆的重量比例堆制3组有机肥。其中，对照组2在堆肥原料中添加了重量比例0.2％的活菌含量为1.0×10¹⁰CFU/g的市售枯草芽孢杆菌(保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC1.3358)；测试组在堆肥原料中添加重量比例0.2％的保藏号为CCTCC M2016441，活菌含量为1.0×10¹⁰CFU/g的枯草芽孢杆菌。3组有机肥混匀后堆堆，每隔一天翻倒一次。

对照组1发酵时间为28天，其中第3～12天为高温期，高温期温度在58～70℃。

对照组2发酵时间为25天，其中第3～10天为高温期，高温期温度在62～75℃。

测试组发酵时间为20天，其中第3～8天为高温期，高温期温度在65～72℃。

发酵堆肥结束后对3组的堆肥取样并测定养分含量，结果如下：

	全碳/g.kg<sup>-1</sup>	全氮/g.kg<sup>-1</sup>	总养分含量(N,P,K)/g.kg<sup>-1</sup>	C/N
					对照组1	340	18.1	51.1	18.8:1
对照组2	356	19.7	52.7	18.1:1
					测试组	359	21.3	54.3	16.9:1

选用三组菠菜，每组种植面积均为20平方米，播种45天后进行采收。第一组采用对照组1堆肥，第二组采用对照组2堆肥，第三组采用测试组堆肥。第一组产量为36.7公斤，平均亩产1225公斤；第二组产量为40.5公斤，平均亩产1352公斤，第三组产量为43.1公斤，平均亩产1438公斤。第三组的产量高出第一组17.4％，高出第二组6.4％。

试验结果表明，在有机肥料堆中添加保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌具有明显的发酵温度升高、发酵时间减少，堆肥的肥效增强。

实施例2养鸡场试验

本试验选用20周龄的海兰褐蛋鸡300只，随机分为对照组和测试组各150只，试验期为24天。试验日粮：玉米61.5％，豆粕23.4％，麦麸2％，石粉8.1％，复合预混料5％，试验期间不投喂保健类抗生素。

测试组在试验期间在饲料中添加重量份0.1‰的微生物饲料添加剂。微生物饲料添加剂由1.0％重量比保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10¹¹cfu/g)和99.0％重量比的葡萄糖混合制得。

对照组在饲料中添加同等量葡萄糖。其他饲喂条件相同。

试验结果如下：

项目

单蛋重(g)

产蛋率(％)

破蛋率(％)

次蛋率(％)

只日耗料(g)

料蛋比

对照组

63.4±1.25

87.3±4.29

0.68±0.34

0.44±0.33

125.2±9.3

2.26

试验组

63.1±0.69

87.3±3.23

0.55±0.30

0.32±0.22

116.3±6.0

2.12

以上试验结果显示，测试组的单蛋重、产蛋率与对照组无明显差异，但从标准偏差可知对照组的蛋鸡产蛋稳定性较差，其波动性要大于测试组，测试组破蛋和次蛋的产生显著降低，分别较对照组低0.13％和0.12％。在饲料利用方面，测试组日耗料量降低7.1％，料蛋比降低6.2％。

试验结果表明，养鸡场在饲料中添加保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌可提高畜禽的消化能力和免疫能力，增强食用饲料的畜禽对饲料的消化、转化能力，促进动物生长，显著地提高畜禽的饲料利用率，具有明显的经济价值。

实施例3保育猪饲喂试验

本试验在猪场保育舍随机选取初重相当、公母各半的2栏保育猪进行试验，每栏数量为18头，设其中1栏为对照组，1栏为试验组。试验组在普通日粮中添加0.1‰的保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌，对照组不添加菌种，饲喂普通日粮。

记录每只猪饲喂前后的重量，饲喂过程均由同一名饲养员完成。

试验结果显示，试验组在饲喂31天后，均增重比对照组均高1.2kg以上，料肉比均下降了0.3以上。

试验结果表明，养猪场在饲料中添加保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌可提高保育猪的消化能力和免疫能力，增强食用饲料的畜禽对饲料的消化、转化能力，促进动物生长，显著地提高畜禽的饲料利用率，具有明显的经济价值。

实施例4育肥猪圈舍除臭抑菌试验

在猪场选取2栋猪舍为测试对象，猪舍1为对照组，猪舍2为测试组，两个圈舍面积和空间均相同，猪舍内各有1000头育肥猪。配制活菌数为1×10¹⁰cfu/g的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1kg，溶于100L清水构成的组合溶剂100L进行猪舍喷雾试验，测试组采用保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌；对照组用100L清水喷雾。

用喷雾器均匀喷洒除臭溶剂在猪舍的地面、墙壁上，5天后进行臭气、氨气气体的浓度检测。试验组与对照组相比臭味去除率为80％，其中氨气的去除率为50％。其中，臭气浓度采用三点比较式臭袋法(GB/T14675),氨气采用次氯酸钠-水杨酸分光光度法(GB/T14679)。

试验结果表明，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌通过快速分解粪便中蛋白，减少粪便中蛋白质分解为氨气，降低畜舍氨气浓度，快速改善养殖舍的臭味环境，从而减少环境污染。

实施例5生物发酵床试验

本试验使用生物发酵床对固液混合的猪排泄物进行发酵，生物发酵床的垫料层采用锯末、稻壳为发酵基质，并添加0.2％发酵菌组合，发酵菌组合为10.0％重量比的枯草芽孢杆菌(保藏号为CCTCC M2016441，活菌数量1.0×10¹¹cfu/g)和90.0％重量比的葡萄糖混合物，调水分到50％启动发酵，发酵床基质厚度为1.5米。其中，对照组使用市售枯草芽孢杆菌(保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC 1.3358)，测试组使用保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌。

测试组和对照组每天添加30kg/m³养猪粪污水，持续添加50天，每天翻动垫料1次。到30天时对照组发酵床温度为即降到50℃以下，而试验组到50天时仍能正常运行，发酵温度为60℃以上。

生物发酵床的基本原理是利用微生物分解畜禽粪便，利用发酵产生的生物能将水分以水蒸气的形式蒸发到空气中，发酵残渣存于生物发酵床垫料中，使之转化为有机肥原料。保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌通过快速分解生物发酵床中的粪便和尿液中蛋白质，使之转化为有机肥。这样减少粪便和尿液中蛋白质分解为氨气，降低处理过程氨气排放量，从而减少环境污染达到减少废气废水排放的目的。

实施例6畜禽尸体无害化处理

选取20只病死鸡和10头死猪尸体，分为相同质量的2份，每份加入由锯末、稻壳等基质组成的5立方米垫料中。

测试组使用100克保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1×10¹⁰cfu/g)和1000g的葡萄糖混合物。

对照组仅使用1000g的葡萄糖。

堆肥发酵完成后，取样测试试验组和对照组菌均未检出沙门杆菌(25g)，鸡瘟等病毒检测结果也均为阴性。其中测试组10天完成发酵，发酵过程无臭味；对照组26天完成发酵，发酵过程产生恶臭味。结果表明试验组促进了病死畜禽的分解，并能有效抑制病原微生物。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims

1.保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌；所述枯草芽孢杆菌在100℃可存活10分钟以上。

2.保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌在促进蛋白分解方面的应用。

3.一种促进蛋白分解的制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌。

4.保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌在有机肥发酵方面的应用。

5.一种用于有机肥发酵的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

6.一种用于养殖场除臭抑菌的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

7.一种用于畜禽尸体无害化处理的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

8.一种用于生物发酵床的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

9.一种用于饲料的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

10.保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌在养殖场除臭抑菌方面的应用。

11.保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌在禽畜尸体无害化处理方面的应用。

12.保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌在生物发酵床方面的应用。

13.保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌在饲料方面的应用。