DE69733479T2

DE69733479T2 - Verfahren zum screenen auf elizitären, die die phytroalexinproduktion in reis induzieren und mittel zur bekämpfung von reiskrankheiten, die einen solchen elizitor als wirkstoff enthalten

Info

Publication number: DE69733479T2
Application number: DE69733479T
Authority: DE
Inventors: Jinichiro Fujimi-shi KOGA; Toyozo Nishikanbara YAMAUCHI; Kenji Nishikanbara-gun UMEMURA; Michiaki Nishikanbara-gun IWATA
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1997-04-21
Filing date: 1997-04-21
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2017-04-22
Also published as: EP0922387B1; US6146893A; EP0922387A4; CN1221315A; KR100315619B1; DE69733479D1; WO1998047364A1; EP0922387A1; KR20000022080A; CN1124785C

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aussondern einer Substanz auf Elicitor-Aktivität in Reispflanzen sowie auf Mittel zum Bekämpfen von Reiskrankheiten, die als einen Wirkstoff einen Elicitor enthalten, der mit Hilfe der Screeningmethode gescreent/ausgesondert worden ist. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum raschen und genauen Screenen/Aussondern von Elicitoren, die die Erzeugung von Phytoalexinen in Reispflanzen induzieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Reispflanzen für Tests aufgezogen werden, eine Testprobe auf einen geeigneten Teil des Reissämlings in vivo aufgebracht und speziell Phytoalexine, die in den Körpern der Reispflanze synthetisiert werden, als Screening-Markersubstanzen verwendet werden, um so Substanzen mit der Eigenschaft zum Induzieren der Erzeugung von Phytoalexinen zu Screenen, wie beispielsweise Phytocassane und Momilactone und dergleichen in Reispflanzen. Da derartige Phytoalexine über eine starke antimikrobielle Wirkung über ursächliche Organismen von Erkrankungen der Reispflanze verfügen, wie beispielsweise Reisbräune-Pilz (Magnaporthe grisea, früher bezeichnet als Pyricularia oryzae), Pilz des Reishülsenbrands (Rhizoctonia solani) und Reisbräune-Pilz (Cochliobolus miyabeanus), würden Elicitoren mit der Eigenschaft des Induzierens der Erzeugung von Phytoalexinen in Reispflanzen als wirksame Bestandteile in Mitteln zur Bekämpfung von Reiskrankheiten nützlich sein.
Einschlägiger Stand der Technik
Pflanzen zeigen im Allgemeinen eine antibiotische Reaktion dann, (hypersensitive Reaktion), wenn sie in Kontakt mit einem pathogenen Pilz gelangen, und sind dafür bekannt, Phytoalexine mit antifungaler Wirksamkeit gegen den pathogenen Pilz in dem Gewebe im Bereich der Reaktionsstelle zu erzeugen. Beispiele für Phytoalexine schließen Momilactone A und B ein, Oryzalexine A, B, C, D, E, F und S, Sakuranetin, Oryzalinsäuren A und B, Oryzaliden A und B und Phytocassanen A, B, C und D (Japanische Patentanmeldung 7-43520/1995), die von den Erfindern der vorliegenden Patentanmeldung entdeckt worden sind.
Substanzen, die die Erzeugung von Phytoalexin in Pflanzenkörpern induzieren, werden als Elicitoren bezeichnet (N. T. Keen, Science 187: 74–75 (1975)), von denen bisher die meisten aus pflanzenpathogenen Pilzen isoliert worden sind. Typische Elicitoren schließen ein: Hepta-β-D-glucopyranosid als ein Polysaccharid, das aus Phytophthora megasperma f. sp. glycinea (J. K. Sharp, B. Valentand, P. Albersheim, J. Biol. Chem., 259: 11321–11336 (1984)), isoliert wurde, Monicholin A als eine Proteinsubstanz, die aus Monilinia fructicola (I. A. M. Cruickshank und D. R. Perrin, Life Sci., 7: 44958 (1968)) isoliert wurde und Eicosapentansäure als ein Lipid, das aus Phytophthora-Befall isoliert wurde (R. M. Bostock, J. Kuc und R. A. Laine, Science, 212: 67–69 (1975)).
Da, wie vorstehend ausgeführt, Elicitoren über eine Wirkung zum Induzieren der Erzeugung von Phytoalexinen in Pflanzenkörpern verfügen, die eine antifungale Wirksamkeit gegen pathogene Pilze haben, betrachtet man sie als Substanzen, die als Wirkstoffe in besonders sicheren Mitteln zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten auf der Grundlage einer Wirkung dienen, die von derjenigen konventioneller Agrochemikalien verschieden ist, und es hat ein starkes Verlangen nach der Entdeckung nützlicher Elicitoren und neuartiger Screening-Methoden gegeben, mit denen es möglich wäre, Substanzen, die über eine Elicitor-Aktivität verfügen, rasch und leicht als Methoden zum Entdecken derartiger nützlicher Elicitoren zu screenen.
Unter diesen Umständen haben die Erfinder umfangreiche und mühselige Forschungsarbeiten in Anbetracht des vorstehend ausgeführten Standes der Technik ausgeführt, um eine neuartige Screeningmethode zum Aussondern nützlicher Elicitoren zu entwickeln, die die Phytoalexin-Erzeugung in Reispflanzen induzieren, wobei es jedoch außerordentlich schwierig ist, auf Substanzen mit Elicitor-Aktivität unter Verwendung von Reispflanzenkörpern in einem solchen Umfang auszusondern, so dass sie bis jetzt keine wirksamen Methoden etabliert haben. In ihren zahlreichen Untersuchungen zur Entwicklung einer wirksamen Methode haben die Erfinder insofern Erfolg gehabt, dass sie eine neue allgemeine Technik im Zusammenhang mit der Spezies von Test-Reispflanzen, Reis-Aufzuchtmethoden, Methoden zum Anwenden von Testproben, Phytoalexin-Analysen und dergleichen gefunden haben und auf diese Weise entdeckt haben, dass sich Substanzen, die über Elicitor-Aktivität verfügen, aussondern lassen.
Das bedeutet, dass sie als Ergebnis ihrer Untersuchungen an Reis, der in den Tests eingesetzt wurde, festgestellt haben, dass die Fragen im Zusammenhang mit der Varietät und Spezies von Test-Reispflanzen, der Aufzuchttemperatur und Feuchtigkeit, des Alters der Test-Reispflanzen, des Orts, wo die Testprobe angewendet wird und dergleichen, außerordentlich wichtig sind, so dass sie festgestellt haben, dass verschiedene optimale Bedingungen in diesen Fragen unter Anwendung ein und der gleichen Screeningmethode ermittelt werden können. Sie haben außerdem eine Methode zum Extrahieren von Phytoalexinen ermittelt, die in Reispflanzenkörpern induziert werden, sowie zu deren Analysieren mit Hilfe der HPLC unter Verwendung von Phytocassanen und Momilactonen als bevorzugte Beispiele für Phytoalexine.
Die Tests zahlreicher Substanzen mit Hilfe der vorgenannten Methoden haben eine Reihe von Verbindungen ergeben, die über Elicitor-Aktivität verfügen.
Die Erfinder haben das Aussondern von Substanzen mit Elicitor-Aktivität aus mikrobiellen Produkten unter Anwendung der vorgenannten Screeningmethode in Angriff genommen und dabei die Substanzen entdeckt, die über eine solche Elicitor-Aktivität verfügen, wie sie weithin in Fadenpilzen und einschließlich pflanzenpathogenen Pilzen vorkommen.
Darüber hinaus haben sie auch solche Substanzen mit Hilfe der Lösemittelextraktion, Säulenchromatographie oder dergleichen isoliert, um 3 Arten von resultierenden aktiven Substanzen zu erhalten, und haben sie strukturell analysiert und haben dadurch bestätigt, dass es sich bei den Substanzen um die Cerebrosid-Verbindungen PO8, PO9 und R2 handelte, die die folgenden Strukturformeln haben, und haben bestätigt, dass diese Substanzen als aktive Inhaltsstoffe in Mitteln zum Bekämpfen von Krankheiten in Reispflanzen wirksam sind und sind zu der vorliegenden Erfindung gelangt.
PO8
PO9
R2
Die chemischen Strukturen der Cerebrosid-Verbindungen PO8, PO9 und R2, die von den Erfindern als Substanzen entdeckt wurden, die über Elicitor-Aktivität verfügen, sind in Fundstellen bereits veröffentlicht worden. PO8 hat die gleiche Struktur wie Cerebrosid A (R. D. Sitrin et al., J. Antibiot. 41, 46980 (1988)), PO9 hat die gleiche Struktur wie PENII (G. Kawai et al., Agric. Biol. Chem. 49, 2137–2146 (1985)) und R2 hat die gleiche Struktur wie Cerebrosid B (G. Kawai et al., J. Lipid, Res., 26, 338–343 (1985)). Die Substanzen, die über die Elicitor-Aktivität verfügen und die vorliegende Erfindung betreffen, sind jedoch in keinen Fundstellen beschrieben worden, so dass die Erfinder erstmalig nachgewiesen haben, dass diese Cerebrosid-Verbindungen über eine Aktivität zum Bekämpfen von Krankheiten in Reispflanzen verfügen.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Aussondern einer Substanz auf Elicitor-Aktivität in Reispflanzen sowie ein Mittel zum Bekämpfen von Reiskrankheiten zu gewähren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aussondern von Elicitoren, die die Erzeugung von Phytoalexinen in Reispflanzen induzieren, welches Verfahren die Verwendung von Reissämlingen als Testpflanze umfasst, das Anwenden einer Testprobe auf einen geeigneten Teil der Reissämlinge in vivo und deren Aussondern auf Elicitoren unter Verwendung der in den Pflanzenkörpern erzeugten Phytoalexine sowie Mittel zum Bekämpfen von Reiskrankheiten, die als Wirkstoff eine spezielle Verbindung enthalten, die über eine Wirkung beim Induzieren der Erzeugung von Phytoalexinen in Reispflanzen verfügt.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, auf einfache Weise mit hoher Genauigkeit auf Elicitoren zu auszusondern, die die Erzeugung von Phytoalexin in Reispflanzen induzieren, und es werden nichttoxische, verschmutzungsfreie Bekämpfungsmittel für Krankheiten der Reispflanze mit geringer Resttoxizität gewährt.
Offenbarung der Erfindung
Wie vorstehend beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Aussondern einer Substanz auf Elicitor-Aktivität in Reispflanzen und betrifft außerdem ein Verfahren, worin Phytoalexine (wie beispielsweise Phytocassane und Momilactone und dergleichen), die in Reispflanzenkörpern erzeugt werden, mit Hilfe der HPLC analysiert werden. Die Erfindung betrifft ebenfalls Substanzen mit Elicitor-Aktivität, die mit Hilfe eines solchen Verfahrens erhalten werden.
Das bedeutet, eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung eines Verfahrens zum Aussondern einer Substanz auf Elicitor-Aktivität in Reispflanzen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung einer Screeningmethode zum raschen und genauen Aussondern einer Substanz auf Elicitor-Aktivität, die über die Eigenschaft des Induzierens der Erzeugung von Phytoalexin in Reispflanzen verfügt, indem Phytocassan und Momilacton A als Reispflanzen-Phytoalexine für Markersubstanzen verwendet werden.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung von Mitteln zur Bekämpfung von Reispflanzenkrankheiten, die als Wirkstoff eine spezielle Substanz enthalten, die über eine Wirkung zum Induzieren der Phytoalexin-Erzeugung in Reispflanzen verfügt.
Zur Lösung der vorgenannten Aufgaben betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Aussondern einer Substanz auf Elicitor-Aktivität, die die Phytoalexin-Erzeugung in Reispflanzen induziert, dadurch gekennzeichnet, dass Reissämlinge als die Testpflanze in vivo verwendet wird, eine Testprobe auf einen geeigneten Teil der Reissämlinge angewendet wird und die Elicitoren unter Verwendung der in den Pflanzenkörpern als Markersubstanzen erzeugten speziellen Phytoalexine gescreent werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das vorgenannte Verfahren zum Aussondern einer Substanz auf einen Elicitor, worin eine Testprobe in Form von Tropfen auf die Spitzen der Blattspreiten eines Reissämlings gegeben wird und die in den Pflanzenkörpern erzeugten Phytoalexine mit Lösemittel extrahiert und mit Hilfe der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung von Phytocassanen und/oder Momilacton A als die Reispflanzen Phytoalexine als Markersubstanzen analysiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Mittel zum Bekämpfen von Reispflanzenkrankheiten, die als Wirkstoff eine oder mehrere Substanzen enthalten, die ausgewählt sind aus 2-Pyrazincarbonsäure, Pyrrol-2-carbonsäure, Oxonsäure und Cerebrosid-Verbindungen PO8, PO9 und R2 sowie Derivate davon, die mit Hilfe der vorgenannten Screeningmethode gescreent werden und über eine Wirkung zum Induzieren der Erzeugung von Phytoalexinen in Reispflanzen verfügen.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend detaillierter beschrieben.
Die Erfinder haben eine detaillierte Untersuchung an Varietäten von Test-Reispflanzen, Aufzuchtbedingungen, Bedingungen der Phytoalexin-Analyse und dergleichen als ein Verfahren zum Aussondern von Substanzen ausgeführt, die die Phytoalexin-Erzeugung in Reispflanzen induzieren. Sie haben festgestellt, dass "Akitakomachi", "Koshihikari" und dergleichen geeignete Varietäten von Reispflanzen zur Verwendung in Tests sind und dass körnige Kulturböden und speziell HONENS Kulturboden Nr. 1 (National Federation of Agricultural Cooperative Associations), die Stickstoff enthalten, Phosphate und Kalium als Düngemittel und die zur Aufzucht von Reispflanzen notwendig sind, geeignete Kulturböden sind und dass es darauf ankommt, Temperatur, Feuchtigkeit und Lichtbedingungen für die Aufzucht der Test-Reispflanzen zu kontrollieren. Speziell werden beispielsweise gekeimte Sämlinge in Töpfe gepflanzt und für etwa 2 bis 3 Tage in einem dunklen Raum bei 30° bis 32°C aufgezogen und in einen Raum mit künstlichem Klima umgesetzt, sobald die Sprösslinge um etwa 2 bis 3 cm oberhalb des Bodens aufgeschossen sind. Der Raum mit künstlichem Klima wird bei einer Temperatur von 18° bis 20°C, einer Feuchte von 80 bis 85% und einer Beleuchtung von 2.000 bis 3.000 lux gehalten. Im zweiten Wachstumsstadium werden Hauptblätter entwickelt, die Bedingungen in dem Raum auf eine Beleuchtung von 3.000 bis 4.000 lux, eine Feuchtigkeit von 95 bis 100% und eine Tagestemperatur von 27° bis 30°C verändert und die Pflanzen so lange aufgezogen, bis die fünften Hauptblätter vollständig entwickelt sind. Diese Aufzuchtbedingungen lassen sich selbstverständlich in geeigneter Weise innerhalb der vorstehend angegebenen Bereiche modifizieren. Die Testproben wurden bevorzugt in Form von Tropfen unter Verwendung einer Kapillarpipette auf die Spitzen der Blattspreiten der fünften Hauptblätter gegeben.
Es wurden Reispflanzen, auf die die Testproben aufgetragen wurden, für eine weitere Woche aufgezogen und die Blätter, auf denen die Testproben aufgetragen worden waren, zu Stücken für die Extraktion mit einem Lösemittel geschnitten, wie beispielsweise Ethylacetat, Methanol und dergleichen. Der Extrakt wurde mit Hilfe der HPLC beispielsweise auf Phytocassane und Momilacton analysiert, wobei die Menge der Phytoalexine, die induziert worden sind, aus den Peak-Höhen von Phytocassan A bei einer Retentionszeit von etwa 35 min, Phytocassan B bei einer Retentionszeit von etwa 43 min und Momilacton A bei einer Retentionszeit von etwa 50 min bestimmt werden können. Andere Phytoalexine lassen sich in ähnlicher Weise analysieren. Die vorgenannte Screeningmethode umfasst im Wesentlichen die folgenden Teile:
(1) Testpflanzen (Reispflanzen)

((1)) Varietät: Akitakomachi und Koshihikari
((2)) Alter: Reissämlinge, speziell mit fünften Hauptblättern
((3)) Aufzucht: bis zu den sechsten Hauptblättern in vollständiger Entwicklung aufgezogen;

(2) Aufbringung von Testproben

((1)) Stelle der Aufbringung: Blattspreite der Testpflanzen und speziell deren Spitze
((2)) Methode der Aufbringung: die Testproben wurden in Form von Tropfen unter Verwendung einer Kapillarpipette und dergleichen aufgebracht
((3)) Aufzuchtdauer nach der Aufbringung: etwa 1 Woche;

(3) Extraktion und Analyse

((1)) Herstellung von Proben: die mit den Testproben behandelten Blattspreiten wurden zu Stücken geschnitten
((2)) Extraktion: die Proben wurden mit Lösemittel extrahiert, wie beispielsweise Ethylacetat und Methanol und dergleichen
((3)) Analyse: HPLC-Analyse

Nach dieser Screeningmethode wurden die in Beispiel 2 nachfolgend angegebenen Verbindungen und dergleichen als Substanzen nachgewiesen, die die Erzeugung von Phytoalexin in Reispflanzen induzieren.
Im Verlaufe der zahlreichen Versuche zum Assayieren der Menge der in Reispflanzenkörpern nach dem Auftrag der Proben auf die Oberfläche der Blattspreite der Reispflanze erzeugten Phytoalexine und nach einer geeigneten Aufzuchtdauer zur Anwendung der vorgenannten Screeningmethode zum Aussondern von Substanzen, die die Erzeugung von Phytoalexin induzieren, haben die Erfinder bestätigt, dass Produkte, die mit organischen Lösemitteln aus Zellen von Fällen von Fadenpilzen extrahiert wurden, einschließlich Pflanzenpathogene, wie beispielsweise der Reisbräune-Pilz und der Pilz des Reishülsenbrandes und dergleichen, eine hohe Aktivität hinsichtlich des Induzierens von Phytoalexinen zeigten. Substanzen, die die Erzeugung von Phytoalexin induzieren, wie beispielsweise PO8 und PO9, können in Form einzelner Komponenten jeweils durch Extrahieren von Zellen aus Reisbräune-Pilz mit einem Lösemittel isoliert werden, wie beispielsweise Ethylacetat, Aceton oder Ethanol und dergleichen, und durch Reinigen des Extraktes mit Hilfe der HPLC, Dünnschichtchromatographie oder dergleichen.
Beispiele für flüssige Medien, die zur Aufzucht der Pflanzenpathogene angewendet werden können, wie sie in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen, schließen jedes beliebige konventionelle Medium ein, das für die Aufzucht von Pilzen unter Verwendung von Pflanzen- oder mikrobiellen Extrakten verwendet wird, obgleich beispielsweise das PSY-Medium und dergleichen bevorzugt sind. Als solche Medien lassen sich Pflanzenextraktkomponenten von Kartoffeln oder dergleichen oder Extrakt von Hefe oder dergleichen verwenden.
Angestrebte Beispiele für spezielle Verfahren der Extraktion und Abtrennung von PO8 und PO9 schließen solche ein, in denen Zellen von Reisbräune-Pilz mit einem Lösemittel extrahiert werden, wie beispielsweise Ethylacetat und dergleichen, wobei die Extrakte mit Hilfe der HPLC unter Verwendung einer Säule fraktioniert werden, wie beispielsweise TSG-Gel ODS 120A oder ODS 120T (von Tosoh), mit Hilfe eines Reinigungsprozesses gereinigt und isoliert werden, wie beispielsweise Einengung bis zur Trockene und dergleichen, ohne auf diese Verfahren beschränkt zu sein. Andere ähnliche Reinigungsmittel lassen sich in geeigneten Kombinationen verwenden. R2 kann auch aus Pilz des Reishülsenbrandes mit Hilfe ähnlicher Reinigungsmittel gereinigt und isoliert werden.
Die PO8, PO9 und R2 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung haben die folgenden Eigenschaften:

1) Massenspektrometrie mit Hilfe der FAB-MS ergab eine relative Molekülmasse von 725 bei PO8, 753 bis PO9 und 727 bei R2.
2) PO8, PO9 und R2 zeigten die in 1 bis 3 dargestellten IR-Absorptionsspektren.
3) PO8, PO9 und R2 zeigten die in 4 bis 6 dargestellten ¹H-NMR-Spektren.
4) PO8, PO9 und R2 zeigten die in 7 bis 9 dargestellten ¹³C-NMR-Spektren.
5) PO8, PO9 und R2 verfügen über eine Wirkung zum Induzieren der Erzeugung von Phytoalexin in Reispflanzen. Beispiele von Phytoalexinen, die induziert werden, schließen Phytocassane A, B, C und D ein sowie Mumilactone A und B und dergleichen. Da diese Phytoalexine über eine starke antifungale Aktivität gegen Reisbräune-Pilz, Pilz des Reishülsenbrandes und Pilz der Braunfleckenkrankheit verfügen, wird angenommen, dass Reispflanzen, in denen solche Substanzen induziert worden sind, Widerstandsfähigkeit gegen eine Infektion durch diese Pathogene zeigen würden.

Wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt wird, verfügen die PO8, PO9 und R2 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung über die Eigenschaft zum Induzieren der Erzeugung von antimikrobiellem Phytoalexin in Reispflanzen und sind damit nützliche Wirkstoffe in Mitteln zum Bekämpfen von Krankheiten in Reispflanzen, wie beispielsweise Reisbräune, Reishülsenbrand und Braunfleckenkrankheit. Das bedeutet, dass der Auftrag dieser Verbindungen in Form geeigneter Präparate auf Reispflanzen verhindern kann, dass die Reispflanzen von diesen Erkrankungen befallen werden.
Wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt wird, sollten die Mittel zum Bekämpfen von Krankheiten der Reispflanze in der vorliegenden Erfindung in geeigneten Formulierungen hergestellt werden, die die vorgenannten Wirkstoffe in geeigneten Mengen enthalten, und zwar in Abhängigkeit von der Aufgabe, für die sie angewendet werden. Die Konfiguration, Herstellungswege und dergleichen sind nicht speziell beschränkt. Wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt wird, schließen angestrebte Methoden, mit denen die Verbindungen, die über eine Wirkung zum Induzieren der Erzeugung von Phytoalexin in Reispflanzen verfügen, auf Reispflanzen aufgebracht werden, solche ein, in denen die Verbindung in einem 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit einem Gehalt von 0,1% Tween 20 aufgelöst sind und die resultierende Lösung auf Reispflanzen gespritzt wird, ohne auf solche Methoden beschränkt zu sein. Es können auch andere Methoden zur Anwendung gelangen, wobei es keine Beschränkungen auf die Konfiguration der Mittel zum Auftragen der Verbindung auf die Reispflanzen gibt auf die Art und Weise, in der sie verwendet werden sowie auf die Auftragsmethode und dergleichen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigen:
1 das IR-Absorptionsspektrum für die Cerebrosid-Verbindung PO8 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung;
2 das IR-Absorptionsspektrum für die Cerebrosid-Verbindung PO9 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung;
3 das IR-Absorptionsspektrum für die Cerebrosid-Verbindung R2 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung;
4 das ¹H-NMR-Spektrum für die Cerebrosid-Verbindung PO8 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung;
5 das ¹H-NMR-Spektrum für die Cerebrosid-Verbindung PO9 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung;
6 das ¹H-NMR-Spektrum für die Cerebrosid-Verbindung R2 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung;
7 das ¹³C-NMR-Spektrum für die Cerebrosid-Verbindung PO8 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung;
8 das ¹³C-NMR-Spektrum für die Cerebrosid-Verbindung PO9 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung;
9 das ¹³C-NMR-Spektrum für die Cerebrosid-Verbindung R2 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Beispiele detailliert beschrieben, wobei die vorliegende Erfindung jedoch in keiner Weise durch die folgenden Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1
(1) Aufzucht von Reispflanzen, die als Testpflanzen verwendet werden
Nach dem Sortieren in Salzwasser zur Entfernung defekter Sämlinge wurden Reispflanzensämlinge (Varietäten: Akitakomachi oder Koshihikari) zum Keimen gebracht. Es wurden 8 gekeimte Sämlinge in Töpfe mit einem Durchmesser von 6 cm gepflanzt, die mit HONENS-Aufzuchterde Nr. 1 (National Federation of Agricultural Co-operative Associations) gefüllt war und für etwa 2 bis 3 Tage in einem dunklen Raum bei 32°C aufgezogen. Nachdem die Sprösslinge mit etwa 2 bis 3 cm über dem Erdboden aufgegangen waren, wurden sie in Glaskästen in einen Raum mit künstlichem Klima umgesetzt. Der Raum mit künstlichem Klima wurde bei einer Temperatur von 18°C, einer Feuchte von 80% und einer Beleuchtung von 2.000 lux gehalten, wobei die Reispflanzentöpfe jedoch an Stellen aufgestellt wurden, die von dem Licht etwas abgeschattet waren. In dem Stadium nach der Entwicklung des zweiten Hauptblattes wurden die Bedingungen auf eine Beleuchtung von 3.000 lux, eine Feuchte von 100% und eine Tagestemperatur von 27° bis 30°C geändert und die Pflanzen bis zur vollständigen Entwicklung der fünften Hauptblätter aufgezogen. In den folgenden Tests wurden Reispflanzensämlinge verwendet, die auf diese Weise aufgezogen worden waren.
(2) Aufbringen von Proben und Induktion von Phytoalexinen
Die Proben 1 bis 6 wurden entsprechend den Angaben in Tabelle 1 hergestellt.
Es wurden 20 μl jeder Probenlösung unter Verwendung einer Kapillarpipette in 10 Tüpfeln an den Spitzen der Blattspreiten der fünften Hauptblätter von Reissämlingen aufgebracht, die entsprechend der vorstehenden Beschreibung aufgezogen worden waren. Die Proben wurden bis zur vorgeschriebenen Konzentration in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit einer Gehalt von 0,1% Tween 20 zur Verwendung in den Tests aufgelöst, um Phytoalexine zu induzieren.
Es wurden Reispflanzen, auf die die Proben aufgebracht worden waren, für 3 Tage in einem Raum mit künstlichem Klima mit einer Feuchte von 80%, einer Beleuchtung von 2.000 lux, einer Nachttemperatur von 18°C und einer Tagestemperatur von 23°C aufgezogen. Die Tagesfeuchte wurde auf 100% eingestellt und die Pflanzen weitere 4 Tage aufgezogen.
3) Phytoalexin-Extraktion und Analyse
Es wurden acht Reispflanzen-Blattspreiten, auf die Proben aufgetragen worden waren, zu Stücken geschnitten und 10 ml einer Mischung von Ethylacetat und 0,1 N Na₂CO₃ (1:1) zugegeben und die Blattspreiten unter Schütteln über Nacht extrahiert. Der Extrakt wurde durch Zentrifugieren (5.000 U/min, 4°C, 20 min) aufgetrennt, der Überstand (Ethylacetat-Phase) aufgeteilt und bis zur Trockene eingeengt. Der trockene Extrakt wurde in 0,4 ml Ethanol aufgelöst und 0,6 ml 0,02 N HCl zugesetzt und der Extrakt anschließend gemischt. Diese Mischung wurde zentrifugiert und 100 μl des resultierenden Überstandes mit Hilfe der HPLC analysiert. Die HPLC-Bedingungen sind nachstehend angegeben.
Säule: TSK-Gel ODS 120T (4,6 mm × 300 mm)
Lösemittel: Acetonitril-Wasser (45:55) (Volumenverhältnis)
Durchflussrate: 1,2 ml/min
Temperatur: 50°C
Detektor: UV 280 nm (Phytocassan)/215 nm (Momilacton)
(4) Ergebnisse
Als Ergebnis des Aussonderns einer großen Reihe von Verbindungen mit Hilfe des vorstehend ausgeführten Verfahrens ist gezeigt worden, dass die folgenden Proben 1 bis 3 über eine Wirkung zum Induzieren der Erzeugung von Phytoalexin in den Reispflanzen verfügen.

1) 2-Pyrazincarbonsäure
2) Pyrrol-2-carbonsäure
3) Oxonsäure, Kaliumsalz

1. 2-Pyrazincarbonsäure
2. Pyrrol-2-carbonsäure
3. Oxonsäure, Kaliumsalz
Beispiel 2 Tabelle 1 Menge der induzierten Phytoalexine
Tabelle 1 zeigt, dass die Proben 1 bis 3 über eine Wirkung zum Induzieren der Erzeugung von Phytoalexin in den Reispflanzen verfügen und es hat sich erwiesen, dass sie als Wirkstoffe in Mitteln zum Bekämpfen von Reispflanzenkrankheiten nützlich sind.
Beispiel 3
Herstellung von PO8 und PO9
(1) Aufzucht von Reisbräune-Pathogenen
Es wurden 200 g geschälte Kartoffeln zu Stücken geschnitten, 1 l destilliertes Wasser zugegeben und das Material für 60 min bei 121°C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurden die Feststoffe mit Siebgewebe abfiltriert, um 1 l Filtrat herzustellen. Zu dem Filtrat wurden 2% Sucrose und 0,5% Hefeextrakt zugesetzt, um ein PSY-Medium herzustellen. Jeweils 200 ml des Mediums wurden in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, für 40 min bei 121°C sterilisiert und gekühlt. Das Medium wurde mit Reisbräune-Pathogenen (Gattung 031 Stamm) beimpft und für 7 Tage bei 26°C einer Schüttelkultur unterworfen (150 U/min).
(2) Extraktion und Reinigung von PO8 und PO9
Nach dem Abschluss der Aufzucht wurde das aufgezogene Produkt durch Siebgewebe filtriert, um die Reisbräune-Pathogenzellen abzutrennen. Den Zellen wurde in einer Menge von näherungsweise dem 5-fachen des Gewichts der Zelle destilliertes Wasser zugesetzt und ihr pH-Wert auf 10,5 eingestellt und die Zellen anschließend unter Rühren mit Ethylacetat extrahiert, das in einem gleichen Volumen zu dem des Wassers zugesetzt wurde. Die Ethylacetat-Phase wurde aufgeteilt und unter Vakuum destilliert, um das Ethylacetat zu entfernen und einen öligen Rückstand zu erhalten. Der Rückstand wurde in 85%igem Ethanol aufgelöst und die resultierende Probe in eine TSK-Gel ODS 120A HPLC-Säule (21,5 mm × 375 mm, Tosoh) eingeführt und mit 91%igem Ethanol (10 ml/min) eluiert. PO8 wurde mit einer Retentionszeit von etwa 25 min eluiert, während PO9 bei einer Retentionszeit von etwa 30 min eluiert wurde. Die Fraktionen wurden aufgenommen und nochmals der gleichen Säulenchromatographie unterworfen. Das PO8 wurde bei einer Retentionszeit von etwa 60 min mit 81%igem Ethanol (10 ml/min) eluiert, während das PO9 bei einer Retentionszeit von etwa 40 min 86%igem Ethanol (10 ml/min) eluiert wurde. Anschließend wurden die Fraktionen aufgenommen und einer HPLC unter Verwendung einer TSK-Gel-ODS 120T-Säule (21,5 mm × 375 mm, Tosoh) unterworfen und mit 95%igem Acetonitril (10 ml/min) fraktioniert, um PO8 bei einer Retentionszeit von etwa 43 min und PO9 bei einer Retentionszeit von etwa 60 min zu eluieren. Die Fraktionen wurden aufgenommen und destilliert, um das Lösemittel zu entfernen und PO8 und PO9 in Form reiner Produkte zu erhalten.
Beispiel 4
Herstellung von R2
Nach der Aufzucht und der Roh-Extraktion mit Ethylacetat von Reishülsenbrand-Pathogenen unter den gleichen Bedingungen wie für die Reisbräune-Pathogene wurden die aufgenommenen Fraktionen einer HPLC unterworfen. Die Fraktionen wurden in einen TSK-Gel-ODS 120A-Säule (21,5 mm 375 mm, Tosoh) in der ersten Reinigung mit Hilfe der HPLC eingeführt, um R2 bei einer Retentionszeit von etwa 26 min mit 91%igem Ethanol (10 ml/min) zu eluieren.
Anschließend wurden die Fraktionen mit Hilfe der Chromatographie mit 86%igem Ethanol (10 ml/min) in einer zweiten Reinigung gereinigt, um R2 bei einer Retentionszeit von etwa 50 min zu eluieren. Die erhaltenen Fraktionen wurden weiterhin einer TSK-Gel-ODS 120T-Säule (21,5 mm × 375 mm, Tosoh) bei einer Durchflussrate von 10 ml/min mit einer Mischung behandelt, die 46,5% von jeweils Acetonitril und Ethanol enthielt, um vollständig gereinigtes R2 bei einer Retentionszeit von etwa 53 min zu eluieren und zu erhalten.
Beispiel 5
Phytoalexin-Induktion mit PO8, PO9 und R2
(1) Phytoalexin-Erzeugung
Das PO8, PO9 und R2, die in Beispiel 1 erhalten wurden, wurden in einem 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) mit einem Gehalt von 0,1% Tween 20 zur Herstellung von 100 ppm Probelösungen aufgelöst. Die Probelösungen mit diesen Konzentrationen und Lösemittellösungen, die keine Proben enthielten, wurden auf die Reispflanzen aufgetragen (Varietät: Akitakomachi), die in Töpfen aufgezogen wurden und deren Aktivität zum Induzieren der Phytoalexin-Erzeugung assayiert wurde. In diesem Fall war der Ort, wo die Proben aufgebracht wurden, die Spitze der Blattspreite von vollständig entwickelten fünften Hauptblättern sowie 20 μl (pro Blatt) jeder Probelösung, die in Form von Tropfen unter Verwendung einer Kapillarpipette auf zehn Stellen in geeigneten Abständen aufgebracht wurde.
(2) Extraktion von Phytoalexinen
Es wurden mit den Probelösungen behandelte Reispflanzen für 7 Tage in einem Raum mit künstlichem Klima aufgezogen, acht behandelte Blätter genommen und zu Stücken zerschnitten und das Material in 10 ml einer Mischung von Ethylacetat und 0,1 N Natriumcarbonat (1:1, pH 10) über Nacht geschüttelt und zugesetzt. Die Ethylacetat-Phase wurde aufgeteilt, bis zur Trockene eingeengt und anschließend wiederum in 4 ml Ethanol aufgelöst.
(3) HPLC-Analyse
Es wurden 0,6 ml einer 0,02 N HCl zu der Lösung zugesetzt und gemischt und die Mischung anschließend zentrifugiert. 100 μl des resultierenden Überstandes wurden mit Hilfe der HPLC analysiert.
Die HPLC-Bedingungen waren folgende:
Säule: TSK-Gel-ODS 120T (4,6 mm × 300 mm, Tosoh)
Lösemittel: Acetonitril-Wasser (45:55) (Volumenverhältnis)
Durchflussrate: 1,2 ml/min
Temperatur: 50°C
Detektor: UV 280 nm (Phytocassan)/215 nm (Momilacton)
Die nachfolgende Tabelle 2 zeigt die Menge von Phytoalexinen, die induziert worden ist. Aus Tabelle 2 geht eindeutig hervor, dass PO8, PO9 und R2 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung über eine Aktivität zum Induzieren hoher Konzentrationen von Phytoalexinen (Phytocassane A und B und Momilactone A und B) in Reispflanzen verfügt.
Tabelle 2 Menge der induzierten Phytoalexine
Beispiel 6
Test zur Bekämpfung der Reisbräune-Krankheit
(1) Methode
Es wurden 8 Reispflanzen (Varietät: Akitakomachi) als Sämlinge pro Topf gepflanzt und in einem Raum mit künstlichem Klima aufgezogen und eine Probe auf die Sämlinge im Stadium der dritten bis vierten Hauptblätter gespritzt. PO8 wurde (50 μg/ml) in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit einem Gehalt von 0,1% Tween 20 aufgelöst und 2 ml der Probe pro Topf auf die Sämlinge mit fünf Töpfen pro Abschnitt gespritzt: Die Sämlinge wurden mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit einem Gehalt von 0,1% Tween sowie Wasser als Kontrolle gespritzt. Die Pflanzen ließ man für 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen, gefolgt von der Behandlung, um die Oberfläche der Blätter trocknen zu lassen, wonach sie wiederum in dem Raum mit künstlichem Klima aufgezogen wurden. Die Oberfläche der Sämlinge wurde mit einer Suspension von Conidia dem Reisbräune-Erreger (Gattung 007 Stamm: mit Affinität) drei Tage nach der chemischen Behandlung gespritzt. Sie wurden anschließend mit dem Erreger infiziert, nachdem man sie für 36 Stunden in einem dunklen feuchten Raum stehengelassen hat. Sodann wurden sie in einen Raum mit künstlichem Klima umgesetzt, um die Aufzucht fortzusetzen, wobei infizierte krankhafte Veränderungen auf den vierten Hauptblättern in jedem Abschnitt nach 5 Tagen erschienen und gemessen wurden, um die Wirkungen der Bekämpfung zu bewerten.
(2) Ergebnisse
Es wurden 21,8 krankhafte Veränderungen pro Blatt in dem nur mit Wasser gespritzten Abschnitt und 19,3 krankhafte Veränderungen pro Blatt in dem Abschnitt festgestellt, wo mit Phosphatpuffer gespritzt wurde, der keine Probe enthielt. Im Gegensatz dazu wurden 2,7 krankhafte Veränderungen pro Blatt in dem Abschnitt festgestellt, der mit PO8 gespritzt wurde, was zeigt, dass PO8 zweifelsfrei bei der Bekämpfung der Krankheiten wirksam war. In Bezug auf die separat getesteten PO9 und R2 wurden die gleichen Wirkungen ermittelt.
Beispiel 7
Testmittel zum Bekämpfen der Reis-Braunfleckenkrankheit
(1) Methode
Es wurden die Wirkungen von PO9 zum Bekämpfen der Reis-Braunfleckenkrankheit unter den gleichen Bedingungen wie bei dem Test zum Bekämpfen von Reisbräune (Aufzucht von Testpflanzen, Aufbringung von Proben und Methode der Erregerinfektion) untersucht. Allerdings wurde die Zahl der krankhaften Veränderungen zur Bewertung der Wirkungen nach dem Spritzen einer Suspension von Conidia der Reis-Braunfleckenkrankheit zwei Tage später gezählt.
(2) Ergebnisse
Es wurden 51,3 krankhafte Veränderungen pro Blatt in dem Kontrollabschnitt festgestellt, der mit Wasser gespritzt worden war, während 13,4 krankhafte Veränderungen pro Blatt in dem Abschnitt festgestellt wurden, der mit PO9 in einer Konzentration von 25 μg/ml gespritzt wurde, und 10,8 krankhafte Veränderungen pro Blatt in dem Abschnitt festgestellt wurden, der mit PO9 in einer Konzentration von 50 μg/ml gespritzt wurde, was eindeutig die Wirkungen von PO9 zum Bekämpfen der Krankheiten demonstriert.
Die vorstehend ausgeführten Beispiele zeigen, dass die Cerebrosid-Verbindungen PO8, PO und R2 im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als Wirkstoffe in Mitteln zum Bekämpfen der Reispflanzenkrankheiten verwendbar sind.
Beispiel 8
Formulierungsbeispiel 1: flüssige Formulierung
Die über Elicitor-Wirkung verfügende Substanz nach der vorliegenden Erfindung sowie andere Komponenten wurden in den folgenden Anteilen zur Herstellung einer flüssigen Formulierung nach einer üblichen Methode abgemischt:

PO8 0,25%

Tween 20 (Wako Junyaku) 5%

20 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) 94,75%
Zum Zeitpunkt ihrer Anwendung wurde die vorgenannte flüssige Formulierung zum Spritzen 50- bis 200-fach verdünnt.
Formulierungsbeispiel 2: wasserdispergierbares Pulver
Die über Elicitor-Wirkung verfügende Substanz nach der vorliegenden Erfindung sowie andere Komponenten wurden in den folgenden Anteilen zur Herstellung eines wasserdispergierbaren Pulvers mit Hilfe einer üblichen Methode abgemischt:

PO9 5%

SORUPOLU 8070 (Aniontensid: Toho Kagaku Kogyo) 10%

NEW CALUGEN WG-2 (Aniontensid: Takemoto Yushi) 5%

Carboxymethylcellulose 3%

neutrales wasserfreies Natriumsulfat 16%

Ton 61%
Zum Zeitpunkt ihrer Anwendung wurde die vorgenannte flüssige Formulierung zum Spritzen 500- bis 4.000-fach verdünnt.
Formulierungsbeispiel 3: Pulver
Die über Elicitor-Wirkung verfügende Substanz nach der vorliegenden Erfindung sowie andere Komponenten wurden in den folgenden Anteilen zur Herstellung eines Pulvers mit Hilfe einer üblichen Methode abgemischt:

R2 3%

Weißruß 1%

Diisopropylphosphat 2%

Talkum 94%
Formulierungsbeispiel 4: rieselfähige Formulierung
Die über Elicitor-Wirkung verfügende Substanz nach der vorliegenden Erfindung sowie andere Komponenten wurden in den folgenden Anteilen zur Herstellung eines rieselfähigen Pulvers mit Hilfe einer üblichen Methode abgemischt:

PO8 5%

Polyethylenglykol 10%

Xanthan 0,4%

NEW CALUGEN FS-1 (nichtionisches Tensid: Takemoto Yushi) 6%

NEW CALUGEN FS-4 (Aniontensid: Takemoto Yushi) 10%

Silicon 0,2%

Wasser 68,4%
Zum Zeitpunkt ihrer Anwendung wurde die vorgenannte flüssige Formulierung zum Spritzen 500- bis 4.000-fach verdünnt.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aussondern einer Substanz auf Elicitor-Aktivität in Reispflanzen zur Verhütung von Reispflanzenkrankheiten, die als Wirkstoff eine spezielle Substanz enthält, die über eine Wirkung zum Induzieren der Erzeugung von Phytoalexin in Reispflanzen verfügt.
Die vorliegende Erfindung hat die folgenden Wirkungen:

1) Elicitoren, die die Erzeugung von Phytoalexin in Reispflanzen induzieren lassen sich mühelos und genau aussondern.
2) Es werden Methoden und Analysen zur Verwendung von Phytocassanen und Momilacton A der Reis-Phytoalexine als Markersubstanzen bereitgestellt, um auf Elicitoren auszusondern, die die Erzeugung von Phytoalexin in Reispflanzen induzieren.
3) Es werden Mittel zum Bekämpfen von Reispflanzenkrankheiten bereitgestellt, die als einen Wirkstoff spezielle Substanzen enthalten, die über eine Wirkung zum Induzieren der Erzeugung von Phytoalexin in Reispflanzen verfügen.
4) Phytoalexine verfügen über antimikrobielle Wirkung gegen Reispflanzenkrankheiten, wie beispielsweise Reisbräune, Reishülsenbrand, Reis-Braunfleckenkrankheit und dergleichen, so dass die Substanzen, die mit Hilfe der Screening-Methode der vorliegenden Erfindung gescreent wurden, als Wirkstoffe in Mitteln zur Bekämpfung von Reispflanzenkrankheiten verwendbar sind, wie beispielsweise Reisbräune, Reishülsenbrand und Reis-Braunfleckenkrankheit.

Claims

Verfahren zum Aussondern einer Substanz auf Elicitor-Aktivität in Reispflanzen, welches Verfahren das Anwenden einer Testprobe der Substanz auf ein Reissämling in vivo umfasst und anschließendes Analysieren eines Teils der Reispflanze auf ein spezifisches Phytoalexin, um die Elicitor-Aktivität der Substanz zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Phytoalexin Phytocassan und/oder Momilacton A ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem die Testprobe in Form von Tropfen auf die Spitzen der Blattspreiten des Reissämlings aufgebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem die Testprobe auf die Spitzen der fünften Hauptblätter aufgebracht wird.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem der Reissämling unter Standardbedingungen aufgezogen wird, bevor die Testprobe aufgebracht wird.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem die Pflanze einem Prozess der Lösemittelextraktion unterzogen wird, um jegliches, durch die Wirkung der Testprobe erzeugtes Phytoalexin zu extrahieren, und der Extrakt auf das Phytoalexin unter Anwendung der Hochleistungschromatographie (HPLC) analysiert wird.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem die Substanz ein Reispflanzen-Pathogen ist, das von Pilzzellen deriviert ist.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem die Reissämlinge die Varietäten Akitakomachi oder Kashihikari sind.
Verfahren zum Behandeln von Reispflanzen, umfassend das Aufbringen einer Zusammensetzung, die als einen Gesamtwirkstoff über eine oder mehrere Substanzen verfügt, die ausgewählt sind aus Pyrrol-2-carbonsäure, Oxonsäure und Cerebrosid-Verbindungen PO8, PO9 und R2 sowie Derivaten davon, die Phytoalexine in Reispflanzen hervorlocken.
Verfahren zum Behandeln von Reisbräune-Pilz, Pilz des Reishülsenbrandes oder Pilz der Braunfleckenkrankheit, wobei die befallenen Reispflanzen mit einer Zusammensetzung behandelt werden, die über einen Wirkstoff von einer oder mehreren Substanzen verfügt, die ausgewählt sind aus Pyrrol-2-carbonsäure, Oxonsäure und Cerebrosid-Verbindungen PO8, PO9 und R2 sowie Derivaten davon, die in den Reispflanzen Phytoalexine hervorlocken.