CN1173898A - 抗菌性萜烯化合物及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供对稻瘟病菌等具有抗菌性的新的双萜化合物、抗菌性萜烯化合物的制造法、具有诱导剂(elicitor)活性的新的植物卡桑EL、其制造方法及稻病害防除剂。本发明涉及一种属于水稻植物防御素,对稻瘟病菌和稻纹枯病菌具有抗菌性,具有由上述通式(Ⅰ)表示的卡桑(cassane)骨架的化合物(式中,R1表示H,H或α－H,β－OH;R2表示α－H,β－OH、H,H或O;R3表示O或α－H,β－OH)。另外,本发明涉及抗菌性萜烯化合物的制造方法,其特征在于,向稻愈伤组织的液体培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物,待其中产生抗菌性萜烯化合物之后将其分离出来。另外,本发明涉及一种对植物防御素在水稻中的生成具有诱导活性,而且对稻瘟病菌、纹枯病菌具有抗菌活性,由上述结构式(Ⅱ)表示的植物卡桑(phytocassane)EL并涉及植物卡桑EL的制造方法,该方法是向稻愈伤组织的液体培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯疫病菌等植物病原菌的菌体提取物,待其中产生植物卡桑EL之后将其分离出来,另外还涉及以植物卡桑EL作为有效成分的稻瘟病害、稻纹枯病害的防除剂。可以提供对稻瘟病菌及稻纹枯病菌具有强抗菌性的双萜化事物及其制造方法等。另外,该化事物可作为稻瘟病害防除剂,稻纹枯病害防除剂的有效成分使用。另外还能提供能有效地抑制稻瘟病菌及稻纹枯病菌发病,低毒性、无公害的防除剂。

Description

抗菌性萜烯化合物及其制造方法
本发明涉及一种水稻的植物防御素即对稻瘟病菌及稻纹枯病菌具有抗菌性的新型二萜化合物-植物卡桑(phytocassane)，更具体地涉及植物卡桑A、B、C和D。本发明中所说的植物卡桑A、B、C、D对稻瘟病菌及稻纹枯病菌具有强抗菌性，因此可以用于保护水稻使其不受稻瘟病和纹枯病的侵害。
另外，本发明涉及一种高产率地制造抗菌性萜烯化合物植物卡桑或稻内酯(モミラクトン)的方法，该方法包括，向稻愈伤组织的液体培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物，待其产生对稻瘟病菌等具有抗菌性的萜烯化合物的植物卡桑和稻内酯后将它们分离出来。
另外，本发明涉及从稻体中提取的具有植物防御素诱导活性的新型二萜化合物的植物卡桑EL，更具体地，涉及一种具有能诱导植物防御素在水稻中生成的活性、或者其本身对稻瘟病菌、稻纹枯病菌具有抗菌活性的植物卡桑EL及其制造方法，以及不需担心所谓残留毒性的、低毒性、无公害的稻类病害防除剂。由于植物防御素对这些病害菌具有强抗菌活性，因此，将本发明中所说的植物卡桑EL施用于水稻时可以使其防止稻瘟病、稻纹枯病的感染。
植物本身对于病原菌的侵入或者紫外线、重金属的作用、伤害等成为病害主要原因的各种作用，根据各种各样的抵抗机理进行自我防御。在这些与植物抵抗病害的反应有关的生理活性物质中，有抗菌性物质和植物激素等。其中，前者能直接地抑制病原菌的发育，后者与症状的产生有关。
关于植物的抗菌性物质，过去就报告过各种形式的物质，其中，一般说，按照发现的机理，可分为预抑制素(prohibitin)、抑制素(inhibitin)、后抑制素(post inhibitin)和植物防御素(phytoalexin)4组。其中，预抑制素是在健全植物组织中以高浓度存在的抗菌性物质，抑制素是在健全植物组织中以低浓度存在，而在受到病原菌感染之后其浓度随之增加的抗菌性物质，后抑制素是一种存在于健全植物组织中，其自身没有抗菌性，但是当受到病原菌侵害时就会发生简单的化学变化，从而发挥其抗菌力的物质。这三者都是预先存在的抗菌性物质。与此不同，植物防御素是一种不存在于健全的植物组织之中，只是在受到病原菌感染之后才开始诱导、合成的抗菌性物质，是一种植物对病害的抵抗反应中起主要作用的机动的防御物质。
植物一旦与病原菌接触就能显示抗体性反应(过敏感反应)，并在反应部位的周边组织中产生对病原菌具有抗菌性的植物防御素，这一点是已知的。虽然这些植物防御素的抗菌活性本身不太高，但是当它被转送到病变部位时就能在局部以高浓度存在，从而能发挥其抗菌力。另外，植物防御素会被健全的植物组织迅速分解(柴田承二编《新编生物活性天然物质》，P66-72，医齿药出版，1988年；西村正蜴、大内成志编《植物感染生理学》，P99-121，分永堂出版，1990年)。
这样，植物防御素是由植物本身产生的，来自植物体的天然物质，且具有容易被健全植物组织分解的性质，因此几乎不会残留，近年来，从环境保护的观点考虑，很有希望作为所谓低毒性、无公害的农药使用，在本技术领域中，人们强烈地希望开发一种抗菌活性较高，具有优良特性的植物防御素，这便是目前的现状。
可是，在植物防御素之中，关于水稻的植物防御素虽然报导了种种研究成果，但是作为代表性的报告有如下的例子。
1)稻内酯A、B(在水稻中植物防御素的稻内酯的生成)
D.Cartwright，P.Langcake，R.J.Pryce，D.P.Leworthy and J.P.Ride，自然(Nature)，267，511-513(1977)
2)稻属防御素A(从患稻瘟病的稻叶中分离新型植物防御素的稻属防御素A)
T.AKatsuka，O.Kodama，H.Kato，Y.Kono和S.Takeuchi：农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)，47，445-447(1983)
3)稻属防御素A、B、C(化学结构的报告，短讯)
Y.Kono，S.Takeuchi，O.Kodama和T.Akatsuka：农业生物化学(Agric.Bial.Chem)，48，253-255(1984)
4)稻属防御素A，B，C(稻属防御素A、B、C的分离、性状、对稻属病菌的抗菌活性)
T.AKatsuka，O.Kodama，H.Sekido，Y.Kono和S.Takeuchi；农业生物化学(Agric.Biol，Chem)，49，1689-1694(1985)
5)稻属防御素A、B、C(关于结构的详细报导)
Y.Kono，S.Takeuchi，O.Kodama，H.Sekido和T.Akatsuka：农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)，49，1695-1701(1985)
6)稻属防御素D(分离、构造、活性)
H.Sekido，T.Endo，R.Suga，O.Kodama，T.Akatsuka，Y.Kona和S.Takeuchi：杀虫剂科学期刊(J.Pesticide Sci.)，11，369-372(1986)
7)稻属防御素E(通过紫外线照射水稻来分离新型水稻植物防御素的稻属防御素E、其结构和活性)
H.Kato，O.Kodama和T.Akatsuka：植物化学(Phytochemistry)，33，79-81(1993)
8)稻属防御素F(通过紫外线照射水稻来分离新型水稻植物防御素的稻属防御素F、其结构和活性)
H.Kato，O.Kodama和T.Akatsuka：植物化学(Phytochemistry)，36，299-301(1994)
9)稻属防御素S(通过紫外线照射水稻来分离新型水稻植物防御素的稻属防御素S及其结构)
O.Kodama，W.X.Li，S.Tamogami和T.Akatsuka：生物科学，生物技术，生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)，56，1002-1003(1992)
10)樱花亭(通过紫外线照射水稻来分离以黄烷酮为骨架的植物防御素及其对稻瘟病菌的活性)
O.Kodama，J.Miyakawa，T.Akatsuka和S.Kiyosawa：植物化学(Phytochemistry)，31，3807-3809(1992)
11)オリザラィド A(从对稻白叶枯病具有抵抗性品种的稻叶分离对稻白叶枯病菌具有抗菌性的オリザラィド A短讯)
M·Watanabe，Y.Sakai，T.Teraoka，H.Abe，Y.Kono，J.Uzawa，K.Kobayashi，Y.SuZuki和A.Sakurai：农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)，54，1103-1105(1990)
12)オリザラィド A，B，オリザリックアシド A(从对稻白叶枯病具有抵抗性品种的稻叶分离对稻白叶枯病菌具有抗菌性的オリザリックアシド A，B，オリザリックアシド A)
Y.Kono，J.Uzawa，K.Kobayashi，Y.SuZuki，M.Uramoto，A.Sakurai，M.Watanabe，T.Teraoka，D.Hoso Kawa，M.Watanabe和H.Kondo：农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)，55，803-811(1991)
13)オリザリシクアシド B(オリザリックアシド B及相关的A，B，C的物质结构)
M.Watanabe，Y.Kono，M.Watanabe，J.uzawa，T.Teraoka，D.Hosokawa，Y.SuZuki，A.Sakurai和M.Teraguchi：生物科学，生物技术，生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)，56，113-117(1992)
14)Osteospermum种植物的二萜化合物(虽然它不是植物防御素，但它是一种具有与植物卡桑相同的卡桑(cassane)骨架的化合物。但是，所谓植物卡桑，其结构不同，另外，关于其生理活性也没有任何记载)
Ferdinand Bohlmann，Michael Wallmyer，Jasmin Jakupovic和Jurgen Ziesche：植物化学(Phytochemistry，22(7)，1645-1651(1983)
这样，作为水稻的植物防御素，已知的有稻内酯A、B，稻属防御素A、B、C、D、E、F、S，樱花亭，オリザラィド A、B，オリザリックアシド A、B，但是迄今为止，具有通式(1)结构的化合物仍是未知的化合物。另外，迄今为止，具有通式(1)结构的二萜化合物尚未有报导。
另外，虽然这些植物防御素可以从水稻植物体分离出来，但是有关稻内酯A、B，稻属防御素A、B、C、D从水稻的液体培养细胞分离的方法正在进行研究(特开平1-218591号公报)。然而，该方法是将稻瘟病菌直接进行接种而没有使用稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌的菌体提取物，并且关于该菌体提取液的有效性完全没有讨论，另外，其生产量也很小，没有希望最终达到实用化。植物卡桑是本发明者们发现的新化合物，植物卡桑A、B、C、D可以从患有稻瘟病或稻纹枯病的水稻的抵抗性反应部位采集，但是迄今为止尚没有报导过包含该制造方法的例子。另外，本发明人等根据迄今为止的研究成果，为了利用植物卡桑作为植物病害防除剂，必须大量地栽培水稻并向其接种病原菌，然后从其抵抗性反应部位收集有效成分并将其分离出来。
然而，按照该方法，需要在植物的栽培、病原菌的接种作业等方面花费大量的劳动力，另外，植物体成分与有效物质的分离是麻烦的，这些都是其存在的问题。
另外，一种在植物体中能诱导产生植物防御素的，被称为诱导剂(elicitor)的物质[Keen，N.T.，科学(Science)，187：74-75(1975)]至今已能从植物病原菌中分离出较多物质。作为具有代表性的诱导剂(elicitor)的例子有：作为多糖物质从疫霉属megasperma f.sp.甘氨酸分离出的七-β-D-吡喃葡萄糖苷[Sharp，J.K.，B.Valentand，P.Albershim：生物化学期刊(J.Biol，Chem)，259；11321-11336(1984)]；作为蛋白质从Moniliniafructicola中分离的モニコリンA[Cruickshank，I.A.M.和D.R.Perrin：生命科学(Life Sci.)，7：449-458(1968)]；作为脂质从疫霉属传染体(Phytophthora infestans)中分离的二十碳五烯酸[Bostock，R.M.，J.Kuc和R.A.Laine：科学(Science)，212：67-69(1981)]等。
除了来自病原菌的诱导剂之外，已知某些农药、抗生物质、重金属等也是具有诱导剂活性的物质，但是象植物卡桑EL那样在水稻体的成分中具有诱导剂活性的物质至今尚未见报导。
如上所述，诱导剂在植物体中可以诱导产生一种对病害菌具有抗菌性的植物防御素，因此可以期待作为一种与以往合成农药具有不同作用的，安全性高的植物病害防除剂，但至今达到实用化的例子却很少，这是实际情况，因此，在本技术领域中，人们强烈地要求开发一种能够诱导产生植物防御素物质的安全性高的植物病害防除剂。
鉴于这种情况，本发明者们对于那些由于植物的抵抗性反应而产生的，与新的植物保护素有关的物质进行了广泛的探索并对其进行了深入的研究，结果发现了一种至今尚未见报导的新型二萜化合物，并且发现，这种新化合物对稻瘟病菌和稻纹枯病菌具有强的抗菌性。也就是说，本发明者们发现，那些感染了稻瘟病菌或稻纹枯病菌的水稻在其显示抵抗性反应(过敏感反应)的植物体部位(叶部、茎部)产生了一种对稻瘟病菌及稻纹枯病菌具有抗菌性的物质，并且已经成功地通过溶剂萃取、柱色谱等方法将这种活性物质分离出来。而且已经查明，这些抗菌性物质是具有下述通式(1)的结构的新物质植物卡桑A、B、C、D，进而发现，这些物质可以作为稻瘟病防除剂及稻纹枯病防除剂的有效成分使用。
本发明的第1个目的是提供一种属于水稻植物防御素，对稻瘟病菌和稻纹枯病菌具有抗菌性的新型二萜化合物的植物卡桑A、B、C或D。
本发明的第2个目的是提供一种对稻瘟病菌具有强的抗菌性，可以作为稻瘟病害防除剂的有效成分使用的新物质。
本发明的第3个目的是提供一种对稻纹枯病菌具有强的抗菌性，可以作为稻纹枯病害防除剂的有效成分使用的新物质。
另外，本发明者们虽然知道在植物成分的制造中使用的方法，但是更着重于使用较大量植物的愈伤组织液体培养法，试验了向稻愈伤组织培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原茵的菌体提取物作为植物卡桑和稻内酯的诱导物质进行培养的方法，结果发现，通过使用稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原茵的菌体提取物，可以容易地在短时间内以高产率获得大量的植物卡桑或稻内酯。
本发明的第4个目的是提供一种植物卡桑的制造方法，其特征在于，向稻愈伤组织培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物作为植物卡桑的诱导物质，待其中产生植物卡桑后将植物卡桑分离出来。
本发明的第5个目的是提供一种稻内酯的制造方法，其特征在于，向稻愈伤组织培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物作为稻内酯的诱导物质，待其中产生稻内酯后将稻内酯分离出来。
另外，本发明者们对稻体中能够产生，诱导植物防御素的物质进行了种种检索，结果发现，稻成分中的一种成分具有这种活性。另外还发现，这种物质对病原菌具有抗菌性，并且通过稻愈伤组织的培养可以高效地将其生产出来。进而，用溶剂萃取法将该物质提取出来，再用柱色谱等方法将其分离并进行结构分析，结果查明，该物质是一种具有下述结构的新物质植物卡桑EL，另外还查明，该物质作为稻瘟病、稻纹枯病的防除剂是有效的。
Figure A9619187000101
本发明的第6个目的是提供一种在水稻中能够诱导植物防御素产生的诱导剂，并且对稻瘟病菌、稻纹枯病菌具有抗菌性的新物质植物卡桑EL。
本发明的第7个目的是提供一种通过从稻愈伤组织培养液中提取植物卡桑EL来制造植物卡桑EL的方法。
本发明的第8个目的是根据向水稻施用植物卡桑EL可以防除稻瘟病害、稻纹枯病害的事实，提供一种稻瘟病害和稻纹枯病害的防除剂。
本发明用于解决上述课题的第1方案是一种属于水稻植物防御素，对稻瘟病菌和稻纹枯病菌具有抗菌性并由下述通式(I)表示的二萜化合物中被称为植物卡桑A、B、C或D的物质(但是式中的R1、R2、R3表示下述的各个取代基)。
    R1     R2     R3
  植物卡桑A植物卡桑B植物卡桑C植物卡桑D  H，Hα-H，β-OHα-H，β-OHH，H  α-H，β-OHα-H，β-OHH，HO  Oα-H，β-OHα-H，β-OHα-H，β-OH
如上所述，本发明中所说的植物卡桑A、B、C、D是一些在感染了稻瘟病菌或稻纹枯病菌的水稻中显示出抵抗性反应(过敏感反应)的植物体部位(叶部、茎部)产生的，来自植物体的物质，这些活性物质集中于所说的水稻植物体的叶部、茎部等适宜的部位，以这些部位的植物体作为起始原料，用乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂进行提取处理，再用柱色柱、高速液相色谱、藻层色谱等方法进行纯化处理，从而可以将其分离成单一成分的物质。
作为纯化的具体方法，例如，优选的方法有，在用溶剂提取后，使用セップパックC-18的柱色谱进行吸附和解吸处理以将其分离出植物卡桑级分，然后使用装备TSKgel ODS120等柱子的高速液相色谱(HPLC)进行分级、浓缩干固操作等纯化步骤的纯化、分离方法，但不限于该方法，也可以与其他同样的纯化方法适宜地组合进行实施，此处所说其他纯化方法没有特殊限定。
本发明的植物卡桑A、B、C、D是新的物质，它们具有如下的性质。
1)植物卡桑A、B、C、D全都是无色的树胶状物质，可溶于丙酮、氯仿、甲醇、乙醇中，在含有表面活性剂的水中可溶解到100ppm左右的浓度。
2)利用高分解能质量分析获得的精密分子量如下：
植物卡桑A：316.2052(按C20H28O3的计算值为316.2065)
植物卡桑B(作为加氢1原子的化合物)：335.2286(按C20H31O4的计算值为335.2223)
植物卡桑C：318.2164(按C20H30O3的计算值为318.2133)
植物卡桑D：316.2048(按C20H28O3的计算值为316.2065)
3)植物卡桑A、B、C、D具有如图1～4所示的红外区域吸收光谱。
4)植物卡桑A、B、C、D具有如图5～8所示的1H-NMR谱。
5)植物卡桑A、B、C、D具有如图9～12所示的13C-NMR谱。
6)植物卡桑A、B、C、D具有如图13～16所示的CD谱(Circular Dichroism，圆偏光2色性)。
7)植物卡桑A、B、C、D具有抑制稻瘟病菌孢子发芽的性质，将它们施用于水稻时可以抑制稻瘟病的发生。能够将稻瘟病菌的孢子发芽抑制50％所需的植物卡桑的浓度，植物卡桑A为10ppm，植物卡桑B为3ppm，植物卡桑C为6ppm，植物卡桑D为20ppm。
8)植物卡桑A、B、C、D具有抑制稻纹枯病菌的菌丝伸张的性质，将它们施用于水稻时可以抑制稻纹枯病的发生。能够抑制稻纹枯病菌菌丝伸张所需的植物卡桑的浓度，植物卡桑A17ppm能很好地抑制菌丝的伸张，植物卡桑B15ppm和植物卡桑C10ppm能完全抑制菌丝的伸张。植物卡桑D50ppm能很好地抑制菌丝的伸张。
从后面的实施例所示的稻瘟病菌感染防御试验及稻纹枯病菌的菌丝伸张抑制试验结果可以看出，本发明的植物卡桑A、B、C、D具有抑制稻瘟病菌孢子发芽及菌丝伸张的性质和抑制稻纹枯病菌的菌丝伸张的性质，它们可作为稻瘟病害防除剂、稻纹枯病害防除剂的有效成分使用。由于本发明的植物卡桑A、B、C、D具有上述的各种性质，因此将该化合物作为适宜形态的药剂施用于水稻时，可以抑制稻瘟病的发生和稻纹枯病的发生。为了将该化合物施用于水稻，对药剂的状态、其使用方案、施用方法等没有特殊限定，例如，以能够抑制上述稻瘟病菌孢子发芽的50％所需的浓度为基准，将该化合物作为有效成分配制成适宜的分量和状态的药剂，按照常规方法施用。
本发明的植物卡桑A、B、C、D是在水稻植物体内产生的天然起源的物质，而且具有容易被健全的植物组织分解，几乎不会残留的性质，因此不仅对稻瘟病菌及稻纹枯病菌具有高的抗菌活性，而且，特别是从环境保护的观点考虑，可以作为人们期待开发的所谓低毒性、无公害的抗菌剂使用，具有十分显著的有用性。
另外，用于解决上述课题的本发明第2方案涉及抗菌性萜烯化合物的制造方法，其特征在于，向稻愈伤组织的液体培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物，待抗菌性萜烯化合物产生后将其分离。在本方法中使用的稻愈伤组织的液体培养基可以是由碳源、氮源、无机盐类、维生素、植物激素等构成的在过去用于稻类组织培养的任一种培养基，但优选是DK培养基。
在这些培养基中，作为碳源，可以使用蔗糖等碳水化合物，作为无机盐类和氮源，可以使用硝酸钾、硫酸铵、氯化钙、天冬氨酸、谷氨酰胺等。另外，作为维生素类，可以使用烟酸、盐酸噻嗪、盐酸吡哆醇等。作为植物激素，适宜使用2，4-D、激动素、脱落酸、吲哚乙酸等。
对使用的水稻的品种、组织部位没有特殊限定，但优选是使用こレひかヮ的种子来配制愈伤组织。为了形成稻愈伤组织，可以按常规方法进行，对此没有特殊限定，但优选是例如把已除去了稻壳的胚乳和胚胎部位，使用一种在上述液体培养基中倍量地加入2，4-D并除去了天冬氨酸和谷氨酰胺的培养基在无菌条件下进行培养，例如在PH5.8，25℃的条件下在暗处静置培养30天，从而形成稻愈伤组织。
按照本方法，向稻愈伤组织的液体培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物，以诱导生成抗菌性的萜烯化合物。
作为植物卡桑诱导物质的稻瘟病菌、马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取成分的配制方法，优选的是如下例示的方法。在黑麦液体培养基(在1升溶液中含有黑麦种子60g的水提取物和蔗糖20g、酵母提取物2g)中分别接种各种菌株，将稻瘟病菌在28℃下振荡培养5～7日，将马铃薯晚疫病菌在18℃下静置培养1个月。将这些培养液分别过滤以分离出菌体。向50g菌体中加入180ml水，用匀浆器磨碎，再用超声波破碎后，用高压釜(121℃，60分钟)进行热分解。将分解物进行离心分离，将所获上清液作为植物卡桑的诱导物质试料使用。稻内酯的诱导物质也可按同样的方法配制。菌体提取成分的配制方法不限于上述方法，只要是具有同等效果的方法均能同样地使用。
向愈伤组织的培养液中添加上述的植物卡桑和稻内酯诱导物质后，进行几天培养，离心分离出上清液。将上清液用乙酸乙酯等溶剂萃取，蒸去溶剂，从而获得植物卡桑和稻内酯混合物的粗产品。植物卡桑A、B、C、D各成分的含量和稻内酯A、B各成分的含量可以通过高速液相色谱法(HPLC)来确认，而且，通过分别收集相当于各成分的峰值区段级分，可以获得各成分的单一产品。用于分离植物卡桑的HPLC的条件如下所述。
柱子：TSK-gel ODS120T(4.6mm×300mm)
溶剂：乙腈(45)：水(55)(体积比)
流速：1ml/min
检出器：UV280nm
另外，用于稻内酯的条件如下所述。
柱子：TSK-gel ODS120T(4.6mm×300mm)
溶剂：乙腈(45)：水(55)(体积比)
流速：1ml/min
检出器：UV215nm
将上述培养的上清液作为起始原料，与上述同样地使用乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂进行萃取处理，使用柱色谱、高速液相色谱、薄层色谱等方法进行纯化处理，从而可以将其分离成单一成分的，本发明的植物卡桑A、B、C、D。
另一方面，稻内酯A、B已知是一种能够抑制水稻种子发芽，对稻瘟病菌具有抗菌性的物质，稻内酯A、B的分子式及分子量如下所示。
稻内酯A    C20H26O3    314
稻内酯B    C20H26O4    330
另外，稻内酯A、B具有下述化学结构。
稻内酯A
Figure A9619187000151
稻内酯B
稻内酯A、B可用上述培养的上清液作为起始原料，使用与纯化上述植物卡桑时同样的方法进行纯化。
如后面的实施例所示，按照过去的方法，稻内酯A、B的生产量相当于每1ml培养液分别可获0.245μg、0.864μg，而按照本发明的方法则分别可获3.3μg、10.5μg，可见本发明的方法显著地提高了生产量，也就是使得过去难以达到高生产率化的稻内酯的产量获得大幅度的提高。
另外，用于解决上述课题的本发明的第3方案涉及上述植物卡桑EL的制造方法，所说植物卡桑是一种对于在水稻中植物防御素的生成具有诱导活性，并且对于稻瘟病菌、纹枯病菌具有抗菌活性的由下述结构式表示的植物卡桑EL，其特征在于，向稻愈伤组织的液体培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物，待其中产生植物卡桑EL之后将其分离出来。另外，本发明还涉及一种使用上述植物卡桑EL作为有效成分的稻瘟病害、稻纹枯病害的防除剂。
本发明者们以探索一种能够诱导产生植物防御素的物质作为目标，在水稻的叶面上涂布试料，在经过适当时间栽培后，测定在稻体中产生的植物防御素的量，在实施各种试验的过程中，可以看出，从添加了稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物的稻愈伤组织的液体培养液中用溶剂萃取获得的提取物对于植物防御素具有高的诱导活性。因此，该有效成分(植物卡桑EL)例如可以通过向稻愈伤组织的液体培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物进行适当时间的培养来产生，然后，在确认已产生植物卡桑EL的基础上，将培养液例如用乙酸乙酯、氯仿、乙醚等水不溶性的有机溶剂萃取，再用高速液相色谱、薄层色谱等方法进行纯化处理而分离成各种单一成分。
向愈伤组织的培养液中加入上述的植物卡桑EL诱导物质试料，将其培养几天后，分离出上清液。作为植物卡桑纯化的具体方法，例如，将上清液用乙酸乙酯等溶剂进行萃取处理后，将提取的成分用TSKgel ODS120A(东ソ-社制)、ODS120T(东ソ-社制)等高速液相色谱(HPLC)进行分级、浓缩干固等纯化步骤进行纯化、分离的方法，该方法可作为优选的方法，但不限于该方法，也可以将其他同样的纯化方法适当地组合起来实施，对这些纯化方法没有特殊限定。
本发明的植物卡桑EL是一种新物质，它具有如下性质。
1)植物卡桑EL是一种无色的树胶状物质，可溶于丙酮、氯仿、甲醇、乙醇中，在水中可溶解以100ppm左右的浓度。
2)通过高分解能质量分析获得的植物卡桑EL的精密分子量为316.2062(按C20H28O3的计算值为316.2065)。
3)植物卡桑EL具有如图23所示的红外吸收光谱。
4)植物卡桑EL具有如图24所示的1H-NMR谱。
5)植物卡桑EL具有如图25所示的13C-NMR谱。
6)植物卡桑EL具有如图26所示的CD谱(Circulardichroism，圆偏光2色性)。
7)植物卡桑EL具有诱导植物防御素在水稻中产生的性质。作为被诱导的植物防御素是植物卡桑A、B、C、D，稻内酯A、B等。这些物质对于稻瘟病菌、稻纹枯病菌具有强的抗菌活性，因此可以认为，受到这些物质诱导的水稻对病害菌具有抵抗性。
8)植物卡桑EL具有抑制稻瘟病菌的孢子发芽及菌丝伸长的作用。能够将孢子的发芽抑制50％所需的植物卡桑EL的浓度为7ppm，而且在该浓度下可以明显地抑制菌丝的伸长。
9)植物卡桑EL在10ppm的浓度下可以抑制稻纹枯病菌的菌丝伸长。
本发明的植物卡桑EL，如后面的实施例所示，具有诱导抗菌性物质的植物防御素在水稻中产生的性质、抑制稻瘟病菌的孢子发芽及菌丝伸长的性质以及抑制稻纹枯病菌的菌丝发芽的性质，因此，植物卡桑EL可作为稻瘟病害防除剂、稻纹枯病害防除剂的有效成分使用。由于植物卡桑EL具有上述的各种性质，因此，将该化合物从适宜状态的药剂形式施用于水稻时，可以抑制稻瘟病的发生和稻纹枯病的发生。本发明的药剂可以象后面实施例所述那样，根据其使用目的，制成含有上述有效量的适宜状态的制剂，但对于其状态、制备制剂的方法没有特殊限定。
作为将该化合物施用于水稻的方法，可以象后面实施例10所述那样，例如，将该化合物溶解在含有0.1％吐温20的、pH5.5的20mM磷酸缓冲液中，然后将该溶液喷雾散布于水稻上的方法等，该方法可作为优选方法的例子，但不限于该方法，也可以使用其他方法，将该化合物施用于水稻的药剂的状态、其使用方式、施用方法等没有特殊限定。
对附图的简单说明
图1表示在本发明的植物卡桑A的红外区域吸收光谱。
图2表示在本发明的植物卡桑B的红外区域吸收光谱。
图3表示在本发明的植物卡桑C的红外区域吸收光谱。
图4表示在本发明的植物卡桑D的红外区域吸收光谱。
图5表示在本发明的植物卡桑A的1H-NMR谱。
图6表示在本发明的植物卡桑B的1H-NMR谱。
图7表示在本发明的植物卡桑C的1H-NMR谱。
图8表示在本发明的植物卡桑D的1H-NMR谱。
图9表示在本发明的植物卡桑A的13C～NMR谱。
图10表示在本发明的植物卡桑B的13C-NMR谱。
图11表示在本发明的植物卡桑C的13C-NMR谱。
图12表示在本发明的植物卡桑D的13C-NMR谱。
图13表示在本发明的植物卡桑A的CD谱。
图14表示在本发明的植物卡桑B的CD谱。
图15表示在本发明的植物卡桑C的CD谱。
图16表示在本发明的植物卡桑D的CD谱。
图17表示按本发明制造的植物卡桑A的质谱。
图18表示按本发明制造的植物卡桑B的质谱。
图19表示按本发明制造的植物卡桑C的质谱。
图20表示按本发明制造的植物卡桑D的质谱。
图21表示按本发明制造的稻内酯A的质谱。
图22表示按本发明制造的稻内酯B的质谱。
图23表示本发明的植物卡桑EL的红外区域吸收光谱。
图24表示本发明的植物卡桑EL的1H-NMR谱。
图25表示本发明的植物卡桑EL的13C-NMR谱。
图26表示本发明的植物卡桑EL的CD谱(Circular dichroism，圆偏光2色性)。
用于实施发明的最佳方案
下面通过实施例来更具体地解释本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。
实施例1
(植物卡桑A、B、C、D的相互分离)
收集一种被Rhizoctonia Solani(稻纹枯病菌)感染的水稻(こレひかヮ)的茎部2kg，将其用乙酸乙酯提取，将所获提取成分用ミリポアリミッテッド社制的セップパックC-18吸附，然后将其用40％的乙醇洗脱，从而分离出植物卡桑的级分。然后将收集到的级分作为试料，使用高速液相色谱(HPLC)按3阶段的分离操作进行纯化。作为第1阶段，向东ソ-社制的TSKgel ODS-120A中注入试料，用52.5％的乙醇洗脱，分离出植物卡桑级分。作为第2阶段，向东ソ-社制的TSKgelODS-120A中注入试料，用60％的乙腈洗脱，分离出植物卡桑级分。作为第3阶段，向东ソ-社制的TSKgel ODS-120T中注入试料，用50％的乙腈洗脱，分离出植物卡桑B、C，接着用55％的乙腈洗脱，分离出植物卡桑A，最后用60％的乙腈洗脱，分离出植物卡桑D。表1中示出在各阶段柱子的条件下，植物卡桑A、B、C、D的保持时间(分)。
表1使用HPLC分离植物卡桑A、B、C、D
  柱子条件     保持时间(分)
植物卡桑A 植物卡桑B 植物卡桑C 植物卡桑D
 ODS-120A52.5％乙醇ODS-120A60％乙腈ODS-120T50％乙腈ODS-120T55％乙腈ODS-120T60％乙腈     383745     443748     443745     444444
按照以上的3阶段高速液相色谱(HPLC)进行分级，作为各个单一的植物卡桑级分，获得了植物卡桑A约20mg、植物卡桑B约10mg、植物卡桑C约3mg、植物卡桑D约8mg。
另外，在图1～16中示出了植物卡桑A、B、C、D的红外区域吸收光谱、1H-NMR谱、13C-NMR谱和CD谱。
实施例2
(稻瘟病菌感染的防御试验)
将水稻(品种十石)播种于一些装有培养土的盆中，每个盆播8粒种子，将培育至4、5叶展开期，以每12盆作为1区进行3区试验。使用一种含有500ppm吐温20的水配制成含植物卡桑A6ppm的溶液和含植物卡桑B3ppm的溶液。向每一区的水稻喷雾30ml的水和各种试料溶液，在室温下放置4小时以使叶面干燥。向这些叶面上按每一区喷雾50ml含有稻瘟病菌レ-ス007株(亲和性株)的孢子悬浮液，然后在加湿、黑暗的条件下放置24小时以进行接种处理。之后，将它们转移入人工气象室中栽培，5日后点数各区的感染叶和无感染叶的数目，对稻瘟病的发病度进行比较。将结果示于表2中。
                            表2
  试料区 无感染叶数(片) 感染叶数(片) 发病率(％)
对照植物卡桑A植物卡桑B     178178184     885436     493020
在水处理区，无感染叶数178片，感染叶数88片，发病率49％；在植物卡桑A处理区，无感染叶数178片，感染叶数54片，发病率30％；在植物卡桑B处理区，无感染叶数184片，感染叶数36片，发病率20％，因此可以认为，植物卡桑A、B对稻瘟病的发病具有明显的抑制效果。另外，对植物卡桑C、D也进行了同样的试验，获得了几乎同样的结果。
实施例3
(稻瘟病菌的菌丝伸张抑制试验)
使用一种含有100ppm吐温20的水将稻瘟病菌(PyriculariaOryzaeレ-ス007)的孢子配制成悬浮液，将25μl悬浮液加在观察玻璃板上。在28℃的温度下将该玻璃板上的孢子培养6小时以使孢子发芽。另外，将植物卡桑的试料溶解在含有500ppm吐温20的水中使其达到规定浓度。在试料区中，向玻璃板上已发芽的孢子悬浮液中加入具有规定浓度植物卡桑的水溶液25μl，另外，在对照区中，加入含有500ppm吐温20的水25μl，然后用显微镜观察这两种样品在28℃下培养1夜后的菌丝伸张状态。其结果示于表3中。
                    表3
  试料区 菌丝长度为对照区的约50％时的植物卡桑浓度(ppm)
对照植物卡桑A植物卡桑B植物卡桑C植物卡桑D     -103620
菌丝长度相当于对照区的约50％时试料区的试料浓度，用植物卡桑A时为10ppm，用植物卡桑B时为3ppm，用植物卡桑C时为6ppm，用植物卡桑D时为20ppm。
实施例4
(稻纹枯病菌的菌丝伸张抑制试验)
将市售的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(荣研化学株式会社制)3.9g溶解成100ml，分别向每个试管注入2ml，在高压釜中以121℃杀菌15分钟后，将其冷却至60℃。另外，将植物卡桑试料溶解于含有500ppm吐温20的水中使其达到规定浓度后，进行无菌过滤。将植物卡桑溶液加入琼脂培养基溶液中混合均匀并注入培养皿中，将其配制成含有规定浓度试料的琼脂板。另外，作为对照，把不含各种植物卡桑试料而只是含有相当量的500ppm吐温20的水溶液加入琼脂培养基中，制成空白观察板。
在这些培养板的中央放入一小片培养有稻纹枯病菌(Rhizoctonia Solani)的琼脂培养基，在28℃下培养40小时后观察菌丝的伸张情况。其结果示于表4中。另外，菌丝没有受到抑制而是以中央的接种源为中心进行伸张，形成圆形的菌落。
                表4
  试料区 植物卡桑的浓度(ppm) 菌落的直径(mm)
对照植物卡桑植物卡桑植物卡桑植物卡桑     -17151050     185--5
在对照培养板中菌落的直径为18mm，与此不同，在含有植物卡桑A17ppm的区域为5mm，在含有植物卡桑B15ppm的区域和含有植物卡桑C10ppm的区域看不到菌丝的伸张。在含有植物卡桑D50PPm的区域，菌落的直径为5mm左右。
实施例5
(抗菌性萜烯化合物的制造)
1)稻愈伤组织的形成
把已除去了水稻(こレひかヮ)种子稻壳部分后的胚胎和胚乳部分，用70％的乙醇溶液和1％的次氯酸钠溶液杀菌，然后将其种植在一种加有2倍量的从DK培养基中除去天冬氨酸和谷氨酰胺的2，4-D和1％琼脂糖的培养基中。在对愈伤组织诱导30天后，将其移入液体培养基中。
2)稻愈伤组织的增殖
将水稻(こレひかヮ)的愈伤组织用DK培养基(在1升中含有蔗糖30g、KNO30.809g、)(NH4)SO40.066g、NaH2PO4·2H2O0.312g，CaCl22H2O0.148g、MgSO4·7H2O0.246g，Fe-EDTA0.02g、维生素类0.101g、甘氨酸2mg、天冬氨酸0.7g、谷氨酰胺0.7g、2，4-D1mg、必要量的其他的盐，MnSO4·4～6H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、Na2M0O4·2H2O、H3BO3的液体培养基)，在pH5.8，25℃的条件下旋转培养(90rpm，25℃，3000勒克司)14天以使其增殖。取出适量的该愈伤组织，用刮刀将其细细地压碎，使用20目的金属网进行过筛，仅使愈伤组织通过金属网。
3)植物卡桑的制造
将已过筛的愈伤组织加入一个500ml的三角烧瓶中，再向其中加入90ml的DK培养基，进行2天的旋转培养(90rpm，25℃，3000勒克司)，然后向培养液中加入经过无菌过滤的马铃薯晚疫病菌的菌体提取成分溶液1ml，继续进行旋转培养4天。培养结束后，将培养液进行离心分离(12,000rpm)，向所获上清液中加入等量的乙酸乙酯，用萃取法提取植物卡桑，将萃取液在减压下浓缩至干固。取出适量的浓缩物，将其溶解于乙醇40％的溶液中，用高速液相色谱分析的结果，所获植物卡桑各成分的含量如表5所示。
                        表5
植物卡桑的种类 植物卡桑的产生量μg/培养上清液1ml
  植物卡桑A植物卡桑B植物卡桑C植物卡桑D     6.30.615.41.2
在用HPLC将植物卡桑的各成分分离后，分别收集相当于各自峰值的部分并将其浓缩干固。将其溶解于少量丙酮中，用气相色谱质量分析计分析的结果，获得了表示相当于各自分子量的分子离子峰的质谱(图17～图20)。另外，在使用稻瘟病菌的菌体提取成分同样地进行实施时，获得了几乎同样的结果。
4)稻内酯的制造
将经过筛分的愈伤组织加入一个500ml的三角烧瓶中，再加入90ml的DK培养基，进行2天的旋转培养(90rpm，25℃，3000勒克司)后，向培养液中加入经过无菌过滤的马铃薯晚疫病菌的菌体提取成分溶液1ml，继续进行4天的旋转培养。培养结束后，向培养液进行离心分离(12,000rpm)后获得的上清液中加入等量的乙酸乙酯，萃取回收稻内酯，将提取液在减压下浓缩干固。取出适量的浓缩物，将其溶解于40％的乙醇溶液中，用高速液相色谱分析的结果，获得了表6所示的稻内酯各成分的含量。另外，按过去方法(直接接种稻瘟病菌的方法)生产的稻内酯A、B的产量分别为0.245μg/ml、0.864μg/ml左右，而按本发明方法生产的稻内酯产量要比按过去的方法高得多。
                    表6
稻内酯的种类 稻内酯的产生量μg/培养上清液1ml
    稻内酯A稻内酯B     3.310.5
用HPLC将稻内酯的各成分分级后，分别收集相当于其峰值部分并将其浓缩干固。将其溶解于少量丙酮中，用气相色谱质量分析计分析的结果，获得了表示相当于各自分子量的分子离子峰的质谱(图21～图22)。另外，使用稻瘟病菌的菌体提取成分进行同样的实施时，获得了几乎同样的结果。
实施例6
(植物卡桑EL的制造)
1)水稻愈伤组织的增殖
将水稻(品种：こレひかヮ)的愈伤组织用DK培养基(1升中含有蔗糖30g、KNO30.809g、(NH4)2SO40.066g、NaH2PO4·2H2O0.312g、CaCl2·2H2O0.148g、MgSO4·7H2O0.246g、Fe-EDTA0.02g、维生素类0.101g、甘氨酸2mg、天冬氨酸0.7g、谷氨酰胺0.7g、2，4-D1mg以及必要量作为其他盐的MnSO4·4～6H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4.5H2O、Na2MoSO4·2H2O、H3BO4的液体培养基)，在pH5.8，25℃的条件下旋转培养(90rpm，25℃，3000勒克司)以使其增殖。取出适量的该愈伤组织，用刮刀将其细细地压碎，使用20目的的金属网进行过筛，使得仅有愈伤组织通过金属网。
2)植物卡桑EL的生产
将已过筛的愈伤组织加入一个500ml的三角烧瓶中，再向其中加入90ml的DK培养基，在25℃进行2天的旋转培养(90rpm，25℃，3000勒克司)，然后向培养液中加入经过无菌过滤的马铃薯晚疫病菌的菌体提取成分溶液1ml，继续进行旋转培养4天。培养结束后，将培养液用离心器(11,500rpm，2hr)分离出上清液。
3)植物卡桑EL的提取、纯化
向上清液中加入碳酸钠以将pH值调节至10.7，然后加入等量的乙酸乙酯来萃取植物卡桑EL，将萃取液浓缩干固。将残渣溶解于乙醇中，将此溶液作为试料溶液，用2阶段的高速液相色谱(HPLC)进行分离、纯化。也就是说，作为第1阶段，将试料溶液注入一个TSKgel ODS-120A的柱子(21.5mm×375mm，)中，然后用55％的乙腈洗脱(10ml/min)。收集保持时间41分钟前后的植物卡桑EL级分，将收集的洗脱液浓缩干固，将残渣溶解于乙醇中。接着，作为第2阶段，将该试料溶液注入一个TSKgel ODS-120T的柱子(21.5mm×375mm，东ソ-社制)中，然后用50％的乙腈洗脱(10ml/min)。收集保持时间46分钟前后的植物卡桑EL级分，将收集的洗脱液浓缩干固，从而获得单一的植物卡桑EL。结果，从1升的培养上清液中获得约3mg的植物卡桑EL。
实施例7
(用植物卡桑EL诱导植物防御素)
1)植物防御素的产生
将实施例1中获得的植物卡桑EL溶解于一种含有0.1％吐温20(和光纯药社制)的磷酸缓冲液(20mM，pH5.5)中，将其配制成10、20ppm的试料溶液。将各种浓度的试料溶液和不含试料的溶液施用于盆栽水稻(品种：こレひかヮ)上，测定植物防御素产生的诱导活性。这时，施用部位定于完全展开的第6叶的前端部分，向相互具有适当间隔的10个点，用毛细管吸液管滴加各试料溶液20μl(每一叶片)。
2)植物防御素的提取
把经试料溶液处理过的水稻置于人工气象室中培养7天后，摘取8张叶片，将其切细，向其中加入乙酸乙酯5ml和0.1N碳酸钠溶液5ml(pH10)，振荡1夜。分出乙酸乙酯层并将其浓缩干固，向残渣中加入0.4ml乙醇以将其溶解。
3)用HPLC分析
向该溶液中加入0.02N的盐酸0.6ml，将其混合，用离心机分离，从所获上清液中取100μl用高速液相色谱(HPLC)分析。HPLC的条件如下。
柱子：TSK-gelODS120T(4.6mm×300mm，东ソ-社制)
溶剂：乙腈(45)∶水(55)(体积比)
洗速：1.2ml/min
温度：50℃
检出器：UV280nm(植物卡桑)，215nm(稻内脂)
在下面表7中示出了被诱导的植物防御素的量。从表7的结果可以明显地看出，本发明的植物卡桑EL具有以高水平的生产量诱导在水稻中生成植物防御素(植物卡桑A、B、C、D、植物卡桑EL、稻内酯A、B)的活性。
                        表7
植物卡桑EL     被诱导的植物防御素的量(μg/g叶)
(μg/ml)   植物卡桑A   植物卡桑B   植物卡桑C   植物卡桑D   植物卡桑EL  稻内酯A  稻内酯B
    0   1.3   1.5   0.3     0.1   0.2   6.2     0.8
    20   11.4   15.6   8.6     2.2   5.4   33.4     5.1
    40   21.3   12.5   0.3     4.1   12.7   42.1     6.9
实施例8
(稻瘟病菌的菌丝伸张抑制试验)
1)方法
将稻瘟病菌(Pyricularia oryzaeレ-ス007)的孢子悬浮于一种含有100ppm吐温20(和光纯药社制)的水中，将其制成悬浮液，从其中取25μl加到一块观察玻璃板上。将该玻璃板在28℃下培养6小时以使孢子发芽。另外，将植物卡桑EL的试料溶解于含有500ppm吐温20的水中使其达到规定浓度。向玻璃板上已发芽的孢子悬浮液中加入规定浓度的植物卡桑EL的水溶液25μl，以此作为试料区，而把加入含有500ppm吐温20的水25μl的区作为对照区，将各区分别在28℃下培养1夜后，用显微镜观察各区中菌丝的伸张状态。
2)结果
其结果，在含有植物卡桑EL的试料区，稻瘟病菌的菌丝伸张被抑制，由此可以看出，植物卡桑EL对稻瘟病菌的菌丝伸张具有抑制作用。另外，使得菌丝长度相当于对照区的约50％时所需的植物卡桑EL的浓度为7ppm。
实施例9
(稻纹枯病菌的菌丝伸张抑制试验)
1)方法
将市售的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(荣研化学株式会制)3.9g溶解于100ml的水中，将该琼脂培养基溶液分注入多个试管中，每试管2ml，在高压釜中以121℃的温度杀菌15分钟，然后将其冷却至60℃。另外，将植物卡桑EL的试料溶解于一种含有500ppm吐温20的水中使其达到规定浓度，然后对其进行无菌过滤。将植物卡桑EL的溶液加入琼脂培养基的溶液中混合均匀并注入培养皿中，将其配制成含有10ppm植物卡桑EL的琼脂板。另外，作为对照，把不含植物卡桑EL而只含有相当量的500ppm吐温20的水溶液加入琼脂培养基中，制成空白的观察板。在这些培养板的中央放入一小片培养有稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的琼脂培养基，在28℃下培养40小时后观察菌丝的伸张情况。结果，菌丝没有被抑制而是以中央的接种源为中心进行伸张，形成圆形的菌落。
2)结果
其结果，含有植物卡桑EL的试料能够抑制纹枯病菌的菌丝伸张，因此表明，植物卡桑EL具有抑制纹枯病菌的菌丝伸张的作用。另外，在对照观察板上的菌落直径为18mm，与此不同，在使用植物卡桑EL10ppm的区域，看不出菌丝的伸张。
实施例10
(水稻对稻瘟病菌感染的防御试验)
将水稻(品种：こレひかヮ)种子播种在一些装有培养土的盆中，每盆种8粒，培育至6叶展开期，以18盆为1区，共试验2区。将植物卡桑EL溶解在一种含有0.1％吐温20(和光纯药社制)的磷酸缓冲液(20mM，pH5.5)中，使其浓度为35ppm，配制成试料溶液。分别使用含有0.1％吐温20的磷酸缓冲液和试料溶液各50ml对各区的水稻喷雾，在约23℃下放置24小时以使叶面干燥。向各区的水稻叶面上喷雾稻瘟病菌Pyricularia oryzaeレ-ス007株(亲和性株)的孢子悬浮液50ml，然后在加湿、黑暗的条件下放置24小时以进行接种处理。之后，将其转移入人工气象室中栽培，5天后点数各区稻叶上观察到的灰色病斑数(18盆，共144株水稻平均每株的病斑数)，以此比较稻瘟病的发病率。
2)结果
其结果，每一株水稻的平均病斑数，在含有0.1％吐温20的磷酸缓冲液的处理区为2.17个，与此不同，在植物卡桑EL的试料溶液处理区为0.91个，因此可以明显地看出，植物卡桑EL对稻瘟病的发病具有抑制效果。
实施例11
(稻瘟病害防除剂)
将植物卡桑EL及其他成分按以下比例配合并按常规方法配制成液剂。
植物卡桑EL                   35μg/ml
吐温20(和光纯药社制)         500ppm
磷酸钾缓冲液(20mM，pH5.5)    100ml
实施例12
(稻纹枯病害防除剂)
将植物卡桑EL及其他成分按以下比例配合并按常规方法配制成液剂。
植物卡桑EL                   35μg/ml
吐温20(和光纯药社制)         500ppm
磷酸钾缓冲液(20mM，pH5.5)    100ml
产业上利用的可能性
本发明涉及水稻的植物防御素，它们是一些对稻瘟病菌及稻纹枯病菌具有抗菌性的属于新型二萜化合物的植物卡桑A、B、C或D，可以获得以下效果
(1)可以提供一种对稻瘟病菌及稻纹枯病菌具有强抗菌性的新型二萜化合物。
(2)由于植物卡桑A、B、C、D对稻瘟病及稻纹枯病菌具有强的抗菌活性，因此该化合物可作为稻瘟病害防除剂和稻纹枯病害防除剂的有效成分使用。
(3)可以提供一种不必担心所谓残留问题的、低毒性、无公害的防除剂。
另外，由于本发明中所说的抗菌性萜烯化合物的制造方法使用液体培养基，因此可以采用发酵罐培养，从而允许配制大量的试料。另外，作为提取原料，使用愈伤组织培养液的上清液，因此，与使用稻植物体的情况相比，不必进行磨碎作业，而且色素的混入也很少，因此，提取和纯化作业容易，可以容易地进行大量试料的配制。
另外，作为诱导物质，使用稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取液，因此可以显著地提高抗菌性萜烯化合物的生产量。
另外，本发明中所说的植物卡桑EL具有诱导植物防御素在水稻中生成的诱导剂活性，而且对稻瘟病菌和稻纹枯病菌具有抗菌活性，因此可获得以下效果。
(1)可以提供一种能够诱导植物防御素在水稻中产生而且对稻瘟病菌和稻纹枯病菌具有抗菌性的新型二萜化合物。
(2)可以提供一种能有效地制造植物卡桑EL的方法。
(3)植物卡桑EL由于能够诱导植物防御素在水稻中产生并且对稻瘟病菌及稻纹枯病菌具有抗茵活性因此该化合物可作为稻瘟病害防除剂及稻纹枯病害防除剂的有效成分使用。
(4)可以提供一种没有所谓残留毒性问题的、低毒性、无公害的稻病害防除剂。

Claims (8)

1.一种属于水稻植物防御素的对稻瘟病菌及稻纹枯病菌具有抗菌性的具有由下述通式(I)表示的卡桑(cassane)骨架的化合物
Figure A9619187000021
(式中，R1表示H，H或α-H，β-OH；R2表示α-H，β-OH、H，H或O；R3表示O或α-H，β-OH)。
2.一种抗菌性萜烯化合物的制造方法，其特征在于，向稻愈伤组织的液体培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物，待其中产生抗菌性萜烯化合物之后将抗菌性萜烯化合物分离出来。
3.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于，其中所说的抗菌性萜烯化合物是植物卡桑(phytocassane)A、B、C或D。
4.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于，其中所说的抗菌性萜烯化合物是稻内酯(モミラクトン)A或B。
5.一种对植物防御素在水稻中的生成具有诱导活性并且对稻瘟病菌、纹枯病菌具有抗菌活性的由下述结构式(II)
Figure A9619187000022
表示的植物卡桑(phytocassane)EL。
6.权利要求5所述的植物卡桑EL的制造方法，其特征在于，向稻愈伤组织的液体培养液中添加稻瘟病菌或马铃薯晚疫病菌等植物病原菌的菌体提取物，待其中产生植物卡桑EL之后将植物卡桑EL分离出来。
7.一种稻瘟病害防除剂，以权利要求5中所述的植物卡桑EL作为有效成分。
8.一种稻纹枯病害防除剂，以权利要求5中所述的植物卡桑EL作为有效成分。
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