JPH01218591A - 抗菌性物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ この発明はイネの液体培養細胞にいもち病菌を接種して
抗菌性物質を産生せしめた後、これを分離する抗菌性物
質の製造方法に関する。

［従来の技術］ 植物は病原菌の感染時に、誘導的に抗菌性物質（フィト
アレキシン）を産生し、その病原菌の進展を防ぐことが
知られている。

このフィトアレキシンについては、現在かなり多くのも
のが知られているが、植物により産生すするフィトアレ
キシンの種類は異なり、イネの産生ずるフィトアレキシ
ンとしては、モミラクトン２種類（Ａ、Ｂ）とオリザレ
キシン４種類（Ａ。

Ｂ、Ｃ，Ｄ）が報告されている。

これらのフィトアレキシンを植物の病害防除等に利用す
るために、大量取得が試みられているが、一般にフィト
アレキシンは病原菌の感染部位の周辺部にしか産生され
ず、植物体を用いてこれを大量に産生せしめるには、病
原菌を植物に接種し、その病斑部を大量に得る必要があ
った。

［発明の解決課題］ しかし、この方法では植物の栽培に労力と時間がかかる
うえ、季節的にも制約され、また病斑形成は天候などの
環境条件にも左右されるという問題点がある。

一方、フィトアレキシンを化学的に合成するには構造が
複雑過ぎて、技術的、コスト的に問題があり、いまだ実
現していない。

［課題を解決するための手段］ この様な状況下、本発明者らは組織培養の手法に着目し
、大量生産に適している液体培地を用いてイネ培養細胞
を増殖する方法を確立し、この液体培養細胞にいもち病
菌を接種することにより短期間で大量のフィトアレキシ
ンが産生できることを見出だし、本発明を完成した。

すなわち、本発明はイネの液体培養細胞にいもち病菌を
接種して抗菌性物質（特に、モミラクトン及びオキザレ
キシン）を産生せしめた後、これを分離することを特徴
とする抗菌性物質の製造方法を提供するものである。

本発明で使用される培地はイネの組織培養に用いられる
液体培地である。

この液体培地は、炭素源、無機塩類、窒素源、ビタミン
等からなる従来からイネの組織培養に用いられている培
地ならいずれも使用できるが、好ましくはムラシゲスク
ーグの培地、Ｎ６培地などである。

これらの培地には炭素源として蔗糖等の炭水化物が用い
られ、無機塩類、窒素源として硝酸カリ、塩化カルシウ
ム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素カリ、その他多く
の塩類が使用されている。またビタミン類としてニコチ
ン酸、塩酸ピリドキシン、塩酸チアミンが用いられる他
、グリシン等のアミノ酸などを含有している。　そのほ
か、液体培地中にはオーキシン類、たとえば、２．４−
ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ＞、ナフタレン酢
酸、インドール酢酸などの化合物が０．１〜１００μＭ
含有されている。

また、液体培地中には必要に応じてさらにイーストエキ
ス、麦芽エキス、カザミノ酸などの栄養物を添加しても
よい。

なお、これら培地の組成の詳細については、例えば理工
学礼服「植物細胞組織培養」　（原田他編）の第２３２
頁、表５，１１を参照されたい。

組織培養に使用するイネ植物体の部位は特に限定されな
いが、保存その他の取り扱いに適した種子が好ましい。

次に、本発明の組織培養方法の好適例を示す。

イネの植物体、例えば種子などの組織を７０％エタノー
ルに１分間浸漬後、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に２
０分間浸漬して滅菌する。

該滅菌組織をシャーレ（径９ｃＩＲ）内のＮ６寒天培地
上に置床し、２０〜３０℃、好ましくは２４〜２７℃で
培養しカルス誘導する。約１か月間培養後カルスを分割
して継代培養する。

継代培養で生育速度が高まり安定したカルスが得られた
ら、これを２〜３週間、２０〜３０℃でＮ６液体培地中
にて、振とう培養する。

一方、いもち病菌は次のようにして調製したものを用い
る。

ＰＤＡ培地（じゃがいも寒天培地）で継代したいもち病
菌を、稲藁煎汁液を添加したＰＤＡ培地に移植して、２
６〜２８℃、１０〜１４日間培養した後、培地上に滅菌
水を注ぎ、筆で培地表面の苔層をこすりとったうえ、更
にガーゼで濾過することにより、胞子含有液を得る。

該いもち病菌の胞子濃度を調整して、上記のイネ液体培
養細胞に接種し、前記と同じ組織培養法で培養すると、
接種後１日以内にフィトアレキシンの産生が誘導される
。

次に産生されたフィトアレキシンの抽出、精製、定量、
分離の一例を以下に示す。

まずフイｉ・アレキシンの産生誘導されたイネ液体培養
細胞を遠心または濾過により細胞と培養液に分離する。

細胞は７０％メタノール中で煮沸後、磨砕してから遠心
し、その上清を減圧濃縮後凍結乾燥する。一方、培養液
はそのまま凍結乾燥する。

凍結乾燥した試料は５０％メタノール液で溶解したのち
減圧濃縮・し、その後ジエチルエーテル抽出する。その
抽出液を濃縮乾固し、ざらに約１０倍量の蒸溜水を加え
た後＾ｎａｌｙｔｉｃｈｅｍ　１ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａ１社製ボンドエルート（０１８）に通してフィトアレ
キシン画分を吸着する。吸着後、８０％メタノールで溶
出して両分をとり、濃縮乾固後、メタノールで溶解する
ことにより精製する。

産生された抽出液中に含まれるフィトアレキシン類の定
量はＧＯ−ＭＳ　（マスフラグメントグラフィー）によ
り行うことができる。ＧＣ−ＭＳの条件は以下の通りで
ある。

機　種：島津Ｑ　ｐ−１０００ カラム：　ＵＩｔｒａｐｅｒｆＯｒｍａｎＣｅ　Ｃａｐ
ｉ　ｌ１ａｒｙ　ｃｏｌｕｍｎｆｌＰ−１０，２ｓφＸ
２５ｍ キャリアーガス：ヘリウム カラム温度：初期２５０℃、最終３００℃、昇温１０℃
／分 注入口温度＝２５０℃ イオン源温度＝２５０℃ イオン化電圧ニア０ｅＶ 又、抽出液中に含まれるフィトアレキシン類の分離は高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＧ）により行うこと
ができる。トＩＰＬｃの条件は以下の通りである。

機　種二島津ＬＣ−６Ａ カラム：　ＬｉＣｈｒｏＳＯｒｂ　５ｉ−６０２５８φ
ｘ２５０ｍ溶媒：　Ｈｅｘａｎｅ−Ｉｓｏｐｒｏｐｙ！
　ａｌｃｏｈｏｌ　（９５：　５　）流速：　１．ｏ　
＊／ｍｔｎ 検出器：ＵＶ２１０ ［発明の効果］ 本発明は液体培地を用いるので大量培養、タンク培養が
可能であり、ざらに液体培養細胞は植物体と異なり植物
繊維などが少ないため磨砕が容易であり、また色素など
の妨害成分が少ないためフィトアレキシンの抽出、精製
にも有利である。

従って、本発明によりフィトアレキシンの大量取得が可
能となり、フィトアレキシンを利用した植物の病害防除
の通が拓かれた効果は極めて大きいといえる。

［実　施　例］ 以下実施例で本発明を具体的に説明する。

実施例　１ イネの種子を７０％エタノールに１分間浸漬後、５％次
亜塩素酸すトリウム溶液に２０分間浸漬して滅菌する。

次いで該滅菌組織をシャーレ（径９　ｃｍ　＞内のＮ６
寒天培地（ショ糖３０ｇ／、１！　、　　ＫＮＯ３２，
８３９／、１！　、　　（ＮＨ４＞　２３０４０．４６
３９／、１！　、　Ｋ１−１２ＰＯ４０，４９／Ｎ　、
　　ＣａＣ，ｌ！２−２８２００．１６６　’ｊ／ｆｌ
　。

＋ｇｓｏ４　・７１１□００．１８５　ｑ／ｆｌ　、そ
の他の塩必要量。

グリシン２ｍｙ／１．ビタミン類２２ｍ’Ｊ／（Ｊ　、
　　２．４−０１０−５Ｍ寒天９ｇ／Ｊ！を含む）上に
置床し、２６°Ｃで培養しカルス誘導する。約１か月間
培養後カルスを分割して継代培養する。

次に、５００＃ｌＩ２の三角フラスコに上記Ｎ６液体培
地を２００ｄ入れ、オートクレーブ（平田製作所製。

トＩＡ−３０型）中にて１２０℃、１５分間加熱滅菌し
た。

これを室温ま温まで冷却後、上記のイネカルスを１０ｇ
入れ、２６℃で１４日間ロータリーシェーカー（いわし
や生物科学製、ＰＧＲ−１型）上で旋回培養（１００ｒ
ｐｍ＞　Ｌ、た。

この液体培養細胞に、ＰＤＡ培地（じゃがいも寒天培地
）で継代したいもち病菌を、稲藁煎汁液を添加したＰＤ
Ａ培地に移植して、２６℃、１０〜１４日間培養した後
、培地上に滅菌水を注ぎ、筆で培地表面の苔層をこすり
とり、ガーゼで濾過して得たいもち病菌胞子（１０５個
）を接種した。

次いで、これをざらに２日間培養した後、イネ培養細胞
と培養液を分離し培養細胞の生重量と培養液の容量、及
びそれぞれのフィトアレキシン含有量を前記の条件にて
ＧＣ−ＭＳで測定した。

結果を第１表に示す。

手続主１打止書（自発） 昭和６３年４月７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イネの液体培養細胞にいもち病菌を接種して抗菌性
   物質を産生せしめた後、これを分離することを特徴とす
   る抗菌性物質の製造方法。 ２、抗菌性物質がモミラクトン及びオリザレキシンであ
   ることを特徴とする請求項１記載の製造方法。