JPS595274B2 - けい藻類の増殖方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、耐着性げい藻（Ｐｈａｅｏｄａｃ ｔｙｌ
ｕｍｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ）のようなげい藻類を増
殖させる方法に関するものである。

げい藻類は、ＮａＮＯ３およびに２ＨＰＯ４を主体とす
る培養液中で光を与えることによって増殖させることが
でき、この培養液中にある種の物質、たとえば土壌浸出
液、あるいはサイトカイニンと呼ばれている植物ホルモ
ンを添加しておくことによって増殖が促進されることが
知られている。

しかしながら土壌浸出液の場合には、増殖促進効果が不
充分であり、また植物ホルモンは、添加量などの条件に
よって促進効果を示したり、逆に増殖抑制効果を示した
りするために確実な効果が期待できないという欠点があ
った。

この発明の目的は、常に良好で安定した増殖効果が得ら
れるようなけい藻類の増殖方法を提供することである。

本発明者等が行った数多くの実験の結果によれば、土壌
、堆肥、ヘドロなどの物質から通常の熱水抽出によって
得られた一般の土壌浸出液は、そのままの形態で培養液
中に添加した場合の増殖促進効果は顕著ではないが、モ
レキュラーシープを用いて濾過を繰り返すことにより、
増殖促進効果の顕著なフラクションと、逆に増殖抑制効
果を示すフラクションとに分離することができることが
判明した。

すなわち土壌浸出液は、けい藻の増殖に対して促進効果
を有する成分と抑制効果を有する成分との両方を含有し
ていることが明らかである。

本発明者等は、増殖促進効果を有するフラクション中の
有効成分がどのような物質であるかについて追究した結
果、主要な有効成分の一つがアデノシンであることを見
出し、この発明を完成するに至った。

この実験の概要はつぎのとおりである。

増殖促進物質の検索 標準土壌浸出液として、イネワラ完熟堆肥の熱湯抽出濃
縮液を選び、これを凍結乾燥して得た固形物１４４７７
１ｐ（堆肥２２０１に相当する）を蒸留水１．５ｍｌに
懸濁されたのち、不溶物（２５〜）を遠心分離（１００
００ｒｐｍ、３０ｍｖＬ）によって除去した。

得られた上澄をゲル濾過クロマトグラフィ（担体：セフ
ァデツクスＧ１５．１６ｍｔＸ８４７ｍｍ、溶出溶媒：
０．０３Ｍ酢酸アンモニウム水溶液、ｐＨ６，７）にか
けた。

溶出液は、１フラクション５０ｍ１づつ、全部で９フラ
クシヨンに分け、各フラクションを凍結乾燥により乾固
した。

以上の精製操作の結果、増殖促進活性はゲル濾過クロマ
トグラフィの第９フラクシヨンに認められた。

ついで、この第９フラクシヨンから活性物質をさらに精
製するために、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）
で分取を行い、２５４闘の検出ピークにより、１３フラ
クシヨン（Ａ〜Ｍ）に分けた。

ＨＰＬＣの詳細はつぎのとおりである。

カラム：マイクロホンダパックＣ１８ 溶離液：５％ア七トニトリルー酢酸アンモニウム水溶液
（０，０１Ｍ、 ｐＨ４，０） 検出法： ２５４ ｍｒｎおよび２８０ｍｍにおける紫
外部吸収 生物試験の結果、フラクションＣに顕著な増殖促進活性
が認められた。

フラクションＣは、ＨＰＬＣの特性のうえではほぼ単一
の化合物（以下「化合物Ｃ」という）のみを含んでいる
ことかわったので、この化合物Ｃを構造決定が可能な量
だけ単離するために、大量の堆肥から抽出を行った。

増殖促進物質の単離 堆肥３７ｋｇの熱湯抽出液１．６７１を凍結乾燥して得
た固形物１８．２Ｐを蒸留水１２０ｍ１に懸濁させ、遠
心分離（］、 ００００回転、４０ｍη）により不溶物
を除去した。

上澄を２回に分けてイオン交換クロマトグラフィ（担体
：ＳＰセファデックス、２６ｍｍ×９１７ｍｍ）にかけ
た。

最初に酢酸アンモニウム水溶液（０，０１Ｍ、 ｐＨ４
，０） ７２０ｍｌで下部分の不純物を滲出除去した。

つぎに酢酸アンモニウム水溶液（０，ＯＬＭ、 ｐＨ６
，５） ７２０＋ｒｔｇで滲出したフラクションのうち
、化合物Ｃを含有するフラクションをまとめた。

この合一フラクションの重量は、凍結乾燥後、堆肥３７
ｋｇに対して７９グであった。

さらに精製する目的で、ゲル濾過クロマトグラフィ（担
体：セファデックスＧ１５．１０１０ｍｍ１０１Ｏ，溶
出溶媒：０．０３Ｍ酢酸アンモニウム水溶液、ｐＨ６，
５）にかけ、最初の溶出液６ａｍｌを除いたのち、化合
物Ｃを含む１２ｒｎｌを乾固して１ｍ９弱の組物質を得
た。

最終的に化合物Ｃを単離するために、ＨＰＬＣ（カラム
：ラジアルパックＣ１８、溶離液：８％アセトニトリル
−酢酸アンモニウム水溶液（０，０１Ｍ、ｐＨ４，０）
、検出法：前述の場合と同じ）で分取を繰返し行った。

その結果、ＨＰＬＣ的に単一な化合物Ｃを得ることがで
きる。

化合物Ｃの物理化学的データは下記のとおりである。

（１）紫外部吸収スペクトル：λＨ２Ｏ２５９ｍｍａＸ （２）質量分析スペクトル： ｍ／ｅ ： ２６７ （Ｍ＋）、２３７．１７８゜１６
４．１３６．１３５（ベースピーク）、１１９１０８ （３）核磁気共鳴スペクトル： （２７０ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ−ｄ６、δ）３．５６ （
ＩＨ，ｄｄ、 Ｆ＝ ３．７．１２．１Ｈｚ）３．６７
（ＩＨ，ｄｄ、Ｆ＝３．７．１２１）３．９６ （Ｉ
Ｈ，ｄｄ、 Ｆ＝ ３．７．７．０）４．１４ （ＩＨ
，ｄｄ、 Ｆ＝４．９．７．０）４．６０ （ＩＨ，ｄ
ｄ、 Ｆ＝４．９．６．０）５．８７ （ＩＨ，ｄ、
Ｆ＝６．０ ）８．１５（Ｉｎ、、Ｓ） ８．３７（Ｉｎ、Ｓ） 化合物Ｃの構造 化合物Ｃは、上記のような物理化学的データおよびクロ
マトグラム上の挙動から、アデノシンであると推定され
た。

そこでアデノシンの標準品と物理学的データを比較した
ところ、両者はよく一致した。

またＨＰＬＣにおいても両者は同一の保持時間を示した
。

以上の結果から、増殖促進物質は、下記の構造式で表わ
されるアデノシンであることが化学的に確定した。

なお３７ｋｇの堆肥の抽出液から単離された化合物Ｃは
、微量のため秤量不可能であったが、標準品のアデノシ
ンを用いてＨＰ ＬＣで定量したところ、約０．１ｒｒ
ＩＪ？であった。

すなわちこの発明方法では、アデノシンを添加した培養
液中でけい藻類の増殖が行われる。

ここ−で重量なことは、アデノシンの添加による増殖促
進効果は、培養液に対するアデノシンの添加量によって
著るしく異なるということである。

実験の結果によれば、アデノシンの添加量が少ない場合
には著るしい増殖促進効果が得られるが、添加量がある
限界以上に増加すると増殖抑制作用が現われ、この限界
は約０．０００１ｐＦ１１であることが確認された。

なおアデノシンは、酵母核酸を酵素または加圧加水分解
して得られたものでも、合成されたものでもその増殖促
進効果は変わらない。

この発明方法で使用される好ましい培養液は、たとえば
つぎのような基本組成を有する。

培養液の基本組成 ＮａＮＯ３３２０ｍ９ に２ＨＰＯ４８５１ｎ９ ＦｅＣ１３０，７８■ ＭｎＣｌ２０．０６１ｎ９ ＥＤＴＡ ８ ■海 水
６００ ｒｎｌ。

純 水 ２００ ｍｌこのような基
本組成に約０．０００ ｌｐｐｍのアデノシンを添加し
た培養液を用いて常法にしたがって叶い藻類の増殖を行
わせることによって、個体数の増加率では大きい差は認
められないが、乾燥重量では著るしい増加が確認された
。

実施例 １ 前記の基本組成を有する培養液８００ＴＬｌをそれぞれ
収容した培養瓶を用意し、その各々に所定量のアデノシ
ンを添加したのち、晴着性けい藻（Ｐｈａｅｏｄｏｃｔ
ｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ）の所定量を接
種して培養を行った。

この培養は、約１８．０００ルツクスの人工光を連続的
に照射しながら、ＣＯ２の供給のために空気を約１．２
５７： ／ｍｉｎの流量で導入し、２０℃で１０日間に
わたって行われた。

培養の終了後、げい藻の個体数、圧縮量および乾藻重量
が測定された。

また同様の条件で、アデノシンを添加しないもの、およ
びアデノシンの代りに土壌浸出液４ｍｌを加えたものに
ついて培養を行うた。

これらの結果をまとめて第１表に示す。なお個体数は、
培養液１ ｍ、ｌ当りのＣｏｕｌ ｔｅｒ Ｃｏｕｎｔ
ｅｒ値で表わす。

実施例 ２ 実施例１と同様の培養実験を行い、第２表に示す結果を
得た。

実施例 ３ 実施例１と同様の条件で培養実験を繰り返し、第３表に
示す結果が得られた。

上記の実施例１〜３で得られた結果にもとづいて、基本
組成のみの培養液を用いて得られたけい藻の乾燥重量を
１００として、他の培養液の場合の乾燥重量を計算した
結果を第４表に示す。

以上の結果から明らかなように、培養液中に約０．００
０ ｌｐｐｍ以下の割合でアデノシンを添加した場合に
は、基本組成のみの場合、土壌浸出液を添加した場合、
およびアデノシンをＯ，０Ｏ０１以上の割合で添加した
場合と比較して、乾燥重量が著るしく増加していること
がわかる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 約０．０００１ｐｐｍ以下の割合でアデノシンを添
   加した培養液中でけい藻類を増殖させることを特徴とす
   るげい藻類の増殖方法。