JPS58101684A - けい藻類の増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コノ発明は、耐着性けい藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕ
ｍｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ　）のようなけい藻類を増殖
させる方法に関するものである。

けい藻類は、ＮａＮＯ３およびに２ＨＰＯ４を主体とす
る培養液中で元を与えることによって増殖させることが
でき、この培養液中にある種の物質、たとえば土壌浸出
液、あるいはサイトカイニンと呼ばれている植物ホルモ
ンを添加しておくことによって増殖が促進されることが
知られている。しかしながら土壌浸出液の場合には、増
殖促進効果が不充分であり、また植物ホルモンは、添加
量などの条件によって促進効果を示したシ、逆に増殖抑
制効果を示したりするために確実な効果が期待できない
という欠点があった。

この発明の目的は、常に良好で安定した増殖効果が得ら
れるようなけい藻類の増殖方法を提供することである。

本発明者等が行った数多くの実験の結果によれば、土壌
、堆肥、ヘドロ々どの物質から通常の熱水抽出によって
得られた一般の土壌浸出液は、その筐まの形態で培養液
中に添加した場合の増殖促進効果は顕著ではないが、モ
レキュラーシープを用いて濾過を繰り返すことによシ、
増殖促進効果の顕著なフラクションと、逆に増殖抑制効
果を示すフラクションとに分離することができることが
判明した。すなわち土壌浸出液は、けい藻の増殖に対し
て促進効果を有する成分と抑制効果を有する成分との両
方を含有してい・ることか明らかである。本発明者等は
、増殖促進効果を有するフラクション中の有効成分がど
のような物質であるかについて追究した結果、主要な有
効成分の一つがアデノシンであることを見出し、この発
明を完成するに至った。

この実験の概妥はつぎのとおりである。

増殖促進物質の検索 標準土壌浸出液として、イネワラ完熟堆肥の熱湯抽出濃
縮液を選び、これを凍結乾燥して得た固形物１４４巧（
堆肥２２０２に相当する）を蒸留水１．５　ｙｎｌに懸
濁されたのち、不溶物（２５ｍｙ）を遠心分離（Ｉ　Ｄ
ＯＯＯｒｐｍ、　３０　＝　）によッテ除去した。得ら
れた上澄をゲル濾過クロマトグラフィ（担体：セファテ
ックスＧ１５．１６＋ｍｎＸ　８４７ｍｍ。

溶出溶媒：　０．０３　Ｍ酢酸アンモニウム水溶液、ｐ
Ｈ６，７）にかけた。溶出液は、１フラクシヨン５０ゴ
づつ、全部で９フラク／ヨンに分け、各フラクションを
凍結乾燥によシ乾固した。以上の精製操作の結果、増殖
促進活性はゲル濾過クロマトグラフィの第９クラクシヨ
ンに認められた。

ついで、この第９フラクシヨンから活性物質をさらに精
製するために、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）
で分取を行い、２５４＋ｍの検出ピークにより、１３フ
ラクシヨン（Ａ−Ｍ）に分けた。Ｈ，ＰＬＯの詳細はつ
ぎのとおシである。

カラム　：　マイクロホンダパック０１８溶離液　：　
５％アセトニトリル−酢酸アンモニウム水溶液（Ｑ、Ｑ
　１ＭＸｐＨ４，０）検出法−＝　２５４ｔａｎおよび
２８０ｍ＋における紫外部吸収 生物試験の結果、フラクションＣに顕著な増殖促進活性
が認められた。フラクションＣは、ＨＰＬＣの特性のう
えではほぼ単一の化合物（以下「化合物Ｃ」という）の
みを含んでいることがわかったので、この化合物Ｃを構
造決定が可能な量だけ単離するために、大量の堆肥から
抽出を行った。

堆肥６７に７の熱湯抽出液１．６７１を凍結乾燥して得
た固形物１８．２ｒを蒸留水１２０ｄに懸濁させ、遠心
分離（１００００回転、４０．ｍ）により不溶物を除去
した。上澄を２回に分けてイオン交換クロマトグラフィ
（担体：ＳＰセファデックス、２６ｍｍＸ　９１７ｗｍ
　）にかけた。最初に酢酸アンモニウム水溶液（０，０
１Ｍ、　ｐＨ４，０）　７２０ｄで下部分の不純物を滲
出除去した。つぎに酢酸アンモニウム水溶液（０，０１
ＭＸｐＨ６，５）　７２０−で滲出したフラクションの
うち、化合物Ｃを含有するフラクションをまとめた。こ
の合一フラクションの重量は、凍結乾燥後、堆肥６７匂
に対して７９■でめった。

さらに精製する目的で、ゲル濾過クロマトグラフィ（担
体、：セファデツクスＧ１５、　１０Ｉ＋ｌ＋ｌ＋×５
７０糟、溶出溶媒：０．０３Ｍ酢酸アンモニウム水溶液
、ｐＨ＜Ｓ、５）にかけ、最初の溶出液６８ｍ１を除い
たのち、化合物ｃ６含む１２−を乾固して１巧弱の粗物
質を得た。

最終的に化合物Ｃを単離するために、ＨＰＬＣ（カラム
：ラジアルパックＣ１８、溶離液：８％アセトニトリル
−酢酸アンモニウム水溶液（０，０１ＭＸｐＨ４，０）
、検出法：前述の場合と同じ）で分取を繰返し行った。

その結果、ＨＰＬＣ的に単一な化合物Ｃを得ることがで
きた。

化合物Ｃの物理化学的データは下記のとおシである。

２）質量分析スペクトル： ｍ／ｅ　：　２６７　（Ｍ＋）、２６７．１７８．１６
４．１６６．１６５（ベースピ ーク）、１１９．１０８ ３）核磁気共鳴スペクトル： （２７０ＭＨｚ、　ＤＭＳＯ−ｄ６．δ）３．５６（工
Ｈ，ｄｄ、　Ｆ＝３．７　、１２．Ｉ　Ｈｚ　）６゜６
７（工Ｈ，ｄｄ、　Ｆ＝３．７　、１２．１　）６．９
６（工Ｈ，ｄｄ、　１’＝３．７　、７．０　＞４．１
４　（工Ｈ，ｄｄ、　ｐ＝４．９　、７．０　）４．６
０（工Ｈ，ｄｄ、　ｐ＝４．９　、６．０　）５．８７
（工Ｈ，ｄ　、　ｒ−６，０）ａ１５　（工Ｈ，５） ａ３７　（ＩＨ，Ｓ） 化合物Ｃの構造 化合物Ｃは、上記のような物理化学的データおよびクロ
マトグラム上の挙動から、アデノシンであると推定され
た。そこでアデノシンの標準品と物理学的データを比較
したところ、両者はよく−致した。またＨＰＬＣにおい
ても両者は同一の保持時間を示した。以上の結果から、
増殖促進物質は、下記の構造式で表わされるアデノシン
であることが化学的に確定した。

なお６７に４の堆肥の抽出液から単離された化合物Ｃは
、微量のため秤量不可能であったが、標準品のアデノシ
ンを用いてＨＰＬＣでｆｔしたところ、約０．１１ｎｇ
であった。

すなわちこの発明方法では、アデノシンを添加した培養
液中でけい藻類の増殖が行われる。ここで重要なことは
、アデノシンの添加による増殖促進効果は、培養液に対
するアデノシンの添加量によって著るしく異なるという
ことである。実験の結果によれば、アデノ７ンの添加量
が少ない場合には著るしい増殖促進効果が得られるが、
添加量がある限界以上に増加すると増殖抑制作用が現わ
れ、この限界は約０．０００１　ｐｐｍであることが確
認された。なおアデノシンは、酵母核酸を酵素または加
圧加水分解して得られたものでも、合成されたものでも
その増殖促進効果は変わらない。

この発明方法で使用さｎる好ましい培養液は、たとえば
つぎのような基本組成を有する。

培養液の基本組成 ＮａＮＯ３３２０ｒｎｆ！ に２ＨＰＯ４８５ｔダ Ｆ’ｅＣ１ａ　　　　　　０．７８ｑ ＭｎＣ１ｚ　　　　　　Ｏ，０６？９ ＥＤＴＡ　　　　　　　　８ｎｙ 海　　　水　　　　　　　　　６００ｄ純　　　水　　
　　　　　　　　２００ｍＪこのような基本組成に約０
．０００１　ｐｐｍのアデノシンを添加した培養液を用
いて常法にしたがってけい藻類の増殖を行わせることに
よって、個体数の増加率では大きい差は認められないが
、乾燥重量では著るしい増加が確認された。

実施例１ 前記の基本組成を有する培養液８００ｄをそれぞれ収容
した培養瓶を用意し、その各々に所定量のアデノシンを
添加したのち、耐着性けい藻（Ｐｈａｅｏｄｏｃｔｙｌ
ｕｍ　　ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）の所定量を接種して
培養を行った。この培養は、約１ａＯ００ルツクスの人
工光を連続的に照射しながら、Ｃ０２の供給のために空
気を約１．２５１！／ｍの流量で導入し、２０℃で１０
日間にわたって行われた。培養の終了後、けい藻の個体
数、圧縮量および乾燥重量が測定された。また同様の条
件で、アデノシンを添加しないもの、およびアデノシン
の代すに土壌浸出液４　ｍｌを加えたものについて培養
を行った。

これらの結果をまとめて第１表に示す。なお個体数は、
培養液１　ｒａｌ当シのＣｏｕｌｔｅｒ　　Ｃｏｕｎｔ
ｅｒ値で表わす。

実施例２ 実施例１と同様の培養実験を行い、第２表に示す結果を
得た。

実施例３ 実施例１と同様の条件で培養実験を繰シ返し、第３表に
示す結果が得られた。

上記の実施例１〜３で得られた結果ＶＣもとづいて、基
本組成のみの培養液？用いて得られたけい藻の乾燥重量
を１００として、他の培養液の場合の乾燥恵ｔを計算し
た結果を第４表に示す。

第　　　４　　　衣 以上の結果から明らかなように、培養液中に約０．００
０１　ｐｐｍ以下の割合でアデノシンを添加した場合に
は、基本組成のみの場合、土壌浸出液を添加した場合、
あ−よびアデノシンを０．０００１以上の割合で添加し
た場合と比較して、乾燥重量が著るしく増加しているこ
とがわかる。　　　以　上特許出願人　　　財団法人工
業開発研究所特許出願人　　西山ゴム株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 約０．０００１　ｐｐｍ以下の割合でアデノシンを添加
   した培養液中でけい藻類を増殖させることを特徴とする
   けい藻類の増殖方法。