JPS585196A - 抗腫瘍性物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般式 で表わされるトリプトライド（Ｒ＝Ｈ）及びトリプデイ
オライド（Ｒ＝０１（）の製造法に関する。

諌物質は米国のカブチャン（８，Ｍ、Ｋｕｐｏｈａｎ　
）らによ〉、ｌり７コ年ににし自ぎ科植物であるフルオ
ルより単離され良化金物で、強い杭朧瘍活性を有する化
合物である。

本発明者らは、先にトリプテリギウム・ウィルフォルデ
ィ（Ｔｒｉｐｔ＠ｒｙＩＨ１ｗ　ｖｉｌｆｏｒｌｉｉ、
和名：フルオル）を組繊培養するととＫよって腋化会物
を製造することができることを見出し九（４１願１８１
１−７４１１デＪ４　）。

その後、賦化合物のよ抄有利１ｋＩｌ造法について研究
を行った結果、培地中にＮ−（Ｊ−置換−夢−ビリジル
）尿素類ま九はチオ尿素類を培養基に遍当量加えるとと
により、目的物の生成蓄積量を増大せしめることを見出
した。

陳尿素類は一般式（１） 〔式中Ｒ／はハ四ゲン、ヒドロキシル、低級アルコキシ
、低級アルキルチオ、低級アルコキシカルボニル、ベン
シイ次ア（〕、低級アルコキシカルポニルア建ノ、シア
ノ又はトリフルオルメチルを示し、　　ＲＪは水素又は
低級アルキルを示し、ＲＪは酸素又は硫黄を示し、Ｒダ
は非置換又紘低級アルキル、低級アルコキ７、ヒドロキ
シル又はハ胃ゲンで置換された芳香族炭化水嵩を示す〕
で表わされる化金物〔以下　化合物（ｔ）という〕を意
味する。

上記式Ｏ定義において、ハ四ゲンは塩素原子、臭素原子
、曹つ素原子、フッ素原子を包含する。

低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルコキシカ
ルボニル、低級アルコキシカルポエルア建ノ、低級アル
キルにおいてはアルキルを九はアルキル部分の炭素数が
／−１１０アルキルを意味し、メチル、エチル、プ■ビ
ル、１−ブチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル等を包含する
。

Ｒヂにお昨る芳香族炭化水素としてはフェニル、ベンジ
ルが例示される。

化合物（１）は公知の化金物で、そ０製法については特
−昭ｊ参−ｒｉＪ’ｉｚ、岡１ｌ−４ＪＯ４４岬に開示
されている。

本発明によれば、トリプテリギウム属に属する植物の茎
、票、芽、種子その他の部分から組謙片壇九はこれから
誘導され九麟麿群いわゆるカルスを囲体上および液体培
養基中化金物（１）の存在下に好気的に培養すると、綴
轍培養物九とえば増殖したカルス、増殖し九−胞、一部
曾丸は完全に分化し九細胞ならびに培養基に目的物が主
書蓄積されるので皺組線培養物および／壕九は培養基か
ら目的化合物を採堆することができる。

本発明に用いる植物はトリプテリギウム属に属し、目的
化合物を主意する能力を有するものであればいずれも用
いうる。トリプテリギウム属植物としてはトリプテリギ
ウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔ＠ｒｙｇｉｕｍ　
ｖｉｌｆｏｒｄｉｉ　）、トリプテリギウム・レゲリー
（Ｔ、ｒ＠ｇ・ｘｔｔ）、）リプテリギウム・フオレス
テイ（Ｔ、ｆｏｒｒ・−ｔｌｌ）などがあげられ、トリ
ブテリギウム・ウィルフォルディ（クロメル）について
は大井次三部着１日本植物誌”Ｊ４参ページ、昭和参〇
年至文堂にその他についてはＲ，Ｂｒシｎｉｎｇ　ｅｔ
、ａｌ。

ＰｈｙｔｏｏＭｍｉｓｔｒｙ　／　７巻、／Ｉコ／−／
ＩＩＩページ（／デフ１年）Ｋ記載がある。よ）好適に
はトリプテリギウム・ウィルフォルディが用いられゐ・ ｊｌｌｌｌＫＩＩＬ、ては、トリプテリギウム属植愉の
墓、票、機、芽、果実そＯ倫Ｏｍｌ轍片また＃ｉ細胞群
を材料とし、これを任意の大亀１！＊に＠晴し、表面を
脱イオン水で洗浄し、ついで例えば次亜塩素酸ソーダ、
エチルアルコールなどで殺菌し九のち、殺菌水でよく洗
う、仁のように表ｍ＊曹した小片をたとえばムラシゲ−
スクーグス氏培地（Ｗｎｓｈｉｇｓ　Ｔ、ａｎｄ　＄閃
区Ｆ、”ＴｈｙｓｉｏＬ−１ｚ１＝／ｊ巻、参γＪ−参
２７ページ（／ＦｊＪｊｌｌｌ））に砂糖Ｊｌｌ／ｄｉ
、カイネチンｌ略４．シダージクロロフェノキシ酢酸１
時４および嘩天龜１１ＡＩを加えた寒天培地上に置床後
、約１遍間一定温度（／ｊ−Ｊｊ’Ｃ）で培養するとカ
ルスが誘導される。

上記の如くにして誘導されるカルスは固体培養基上、を
九は液体培養基中にて、通常微生物の培養を行うのと同
様な操作を応用してさらに培養できる。九とえば培養Ｏ
ＩＩはｍ斂培養法ま九は無菌空気を通気しつつ培養する
タンク培養法によシ行うことかで會為。

これらの培養基組成としては、たとえば上述の培地を利
用できるが、これＫ１１Ｊｉ定されるもので杜なく、植
物組線培養用培地である、ホワイ）　（Ｗｈｉｔｅｓ）
氏、ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）氏、ニッチ（Ｎｔｔ
ｃｈ）氏その他（植物細胞組織培養、実際・応用・展望
−理工学社、／Ｆ７Ｆ年原田宏。

駒嶺穆氏編）を用いることが可能であり、炭素源として
砂糖（シュークロース）の代りにグルコース、フラクト
ース、マンノース、　［１１１，−ｔ’ん粉その他を用
いることができる。まえ酵母工Φス、ペプトン、肉エキ
ス、カザミノ酸なども加えることができる。

カイネチンの代妙に、ベンジルアデニンのよう１に他の
サイトカイニン類、シ夢−ジクロロフェノ中シ齢駿の代
りにインドール―′ト酸、ナフタレン酢酸などの生育調
節物質を使用することもで−る。種々の無機微量成分は
、天然物を利用した抄、脱イオン水の代りに水道水を用
いることで足りる場合は、必ずしも添加する必要はない
。

化合−（１）は化合物の種類によって有効な範囲で加え
られるが、通常０．０／−１１１の範囲で添加される。

用いられる化合物の具体例としては、 Ｎ−（コークロルー夢−ビリジル）−Ｎ’−（１１−メ
チル−フェニル）ＷＬ素、Ｎ−（Ｊ−クロル−１−ビｌ
Ｊジル）−Ｎ’−（ｏ−クロルフェニル）Ｅｌｍ、Ｎ−
（コーフルオルー夢−ビリジル）−Ｎ１−フェニル尿素
、Ｎ−（コーメトキシー弘−ビリジル）　　Ｎｌ−フェ
ニル尿素、Ｎ−（コープロム−参−ピリシル）　−Ｎ’
−フェニルｆｆ１Ｌ　Ｎ−（コーアセトアミドー参−ピ
リジル）−Ｎしフェニル尿素、Ｎ−（コーメトキシー参
−ピリジル）−Ｎ１−フェニルチオ尿素、Ｎ−（Ｊ−ク
ロル−弘−ビリシル）　−Ｎｌ−フェニルＪＩＬ　Ｎ−
（コークミル−ｌ−ピリジル）−Ｎ’−（ｏ−メチル−
フェニル尿素）等があげられる。

培養ＦｉＪｊ−ＪＪ”Ｃ，の温度、＠Ｉ〜ＩＩのｐＨで
行われｌ−コ遍間で完了する。

かくして培養し増殖し九ｌｌ８ｊｌｌｉ群（カルス）、
分化した植物細胞を濾過して集め、ホモゲナイザーなど
により細胞を破壊し、−過あゐいは遠心機嫌どで得た上
澄液あるいはＦ液中より、あ為いは培養物から細胞群や
植物細胞を除去して得た培養Ｆ液から目的化合物を分離
することができる。これらの分離法は、カブチャン′（
ｘｕｐｃｈａｎ）　ラの方法（ジャー−ナル・オプ・ア
メリカン・ケミカル・ソサイエテイ、デ参巻７／９＃ベ
ージ　ｌり７Ｊ年）を利用することができるが、好まし
くは次の方法によって分離できる。

培養細胞からの分離法は、細胞を凍結乾燥しこれにデｊ
嘔のエチルアルコールを加え、ソックスレー抽出器を用
い九抄あるいはビーカー・フラスコ埠で加温して、抽出
を行う。抽出液を減圧凝縮漬水とｎ−へキサンを加えて
分液−斗を用いてよく撮り、不純物をｎ−ヘキサン層に
転溶して除く。別の分離法として、細胞の抽出液や培養
Ｖ液を材料として用いる時には、これらの箪Ｋｎ−ヘキ
サンを加えて不純物をζ０層に転溶させる。

いずれの場合でもｎ−ヘキサンを用いる分配操作は二、
三度繰り返し、できる限りｎ−ヘキサン可溶な不純物を
除い先方がよい。次に水層区分に酢酸エチルを加え、分
ｔＦ斗を用いて分配を行い、酢酸エチル層を県める。こ
の操作も二、三度繰り返した方がよい。

かくして得られ九酢酸エチル層を減圧濃縮し、＾速液体
クロマトグラフィー（使用カラム、Ｕｎｉｇｌｌ　Ｑ　
Ｃｔｔ　　ガスクロ工業、ソルベント系ＪＯ−エタノー
ル）を用いて、トリプデイオライドとトリプトライドを
分堆すゐことができる。

このようにして得られ九二ｍｌＯジテルペノイド・トリ
エポキサイドはＫＢ、Ｌ−／Ｊ１０゜ｐ−Ｊ　Ｉ　ｔな
ど各種腫瘍細胞の生育を抑えることが確かめられ、特に
ＫＢ細胞は、これらの精製。

培養時の定量などの際に恒常的な定量法の一つとして使
用することができる。

以下に実施例を述べる。

実施例１゜ 約７５１位の長さに切つ九り一ズルの墓を、次亜塩素酸
ソーダ液（有効塩素Ｊｌｌ）Ｋ１０分間浸漬して殺菌す
る。この殺菌洗浄したクロメルの墓を、ムラシゲ・スク
ーグ氏培地にシュークロースＪ　Ｆ１７ｆＬｌ　、シ参
ディクロ四フェノキシ酢酸／　１１　、カイネチン／呼
々、寒天σｌル爾を含む培地／　０ｔｊ（ｐＨ４，７）
に試験管１本当り７個置床し、Ｊｊ”Ｃで約ｌケ月培養
する。蓬の切断面よ抄形成されてきたカルス全量を同じ
組成の培地ＩＯ−にＮ−（Ｊ−クロル−参−ピリジル）
−Ｎ１−フェニル尿素０．　／　鴫々加えた培地に移植
する。さらにコｔＣでｌケガ間培養し増殖したカルスを
集め凍結乾燥する。

このようにして集めたカルスの乾燥物コＯＩにデｊＩｓ
エチルアルコールコｏｏｗｔを加え、ソックスレー抽出
器を用いて４時間抽出を行う。この操作をＪ１ｇｌ繰り
返して得られたエチルアルコール部分的４００ｄを減圧
下で濃縮乾固してから水をＪＯｍｊ加え、できる限抄溶
かす。

これＫｎ−へ午サンｊＯｄを加え分液Ｆ斗で１１秒、不
純物を除く。さらに２回同橡に操作して水層を集′め、
これに酢酸エチル１０−を加え目的物質を酢酸エチル層
に分ｔＰ斗を用いて転溶する。この操作をさらにコ度繰
や返して酢酸エチル層を集め、減圧濃縮し九のちＵｎｉ
ｓｉｌ　Ｑ　−Ｃ／Ｉのカラム、ＪＯ−エタノールを用
いて高速液体クロマトグラフィーを行う。標準品と同一
部位に現われるピーク（検出はＵＶＪ／ｆｎｍ）を集め
濃縮して、トリブデイオライドまコ−，トリプトライド
０，７＃を得た。因みに培養基ＫＮ−（コークロルー参
−ヒリシル）−Ｎ’−−ｙ工二ル尿素を加えない培地に
移植し、培養した場合のトリプデイオライドの蓄積量は
ａｊ＠、）リプドライドはａ、／Ｈであった。

実施例よ 実施例１で得られたカルス（新鮮重量として約ＪＩりを
ムラシゲ・スクーグ氏培地Ｋ、カイネチンａ　／　ｗ￥
４　、ナフタレン酢酸ｌ鴫４．シュークロースＪｉ７ｆ
ｔｌ、を加え友ものにＮ−（Ｊ−クロル−≠−ピリジル
）　　ｓ＋−フェニル１ｌｉｌｌＯ，／吟４を添加し友
液体培地１０１）−の人つ九ＪＯＯ−容三角フラスコに
植え、毎分ｔｉｅ回転、λｔ℃、暗黒下でコ週間培養す
ると、七の生育は培地１ＩＩｊ当抄／ｊｗ（乾物量）で
あった。この細胞を一過法によって集め、細胞および培
養Ｆ液中の目的物を定量し九ところ、細胞中にトリプデ
イオライド、トリプトライドがそれぞれ／、　／　１μ
ｍ１ｔＯ，０デμｇ（各々培地／ｌＩｊ当りに換算）Ｊ
培養Ｐ液中にトリプディオライド、トリプトライドがそ
れぞれ／、ＪＷｉｔｌ、　ｏ、／Ｊｔｔｌ（各々培地／
−当りに換算）が含まれていた。因みＫＮ−（コークロ
ルー参−ビリジル）　　Ｎｌ−フェニル尿素をｌ略ｌ加
えて同様に培養した時の細胞中のトリブデイオライド、
トリプトライドの蓄積量は同じ＜　７．０ＪｆｉＬ　Ｏ
，０ｊＡ１１　（培地／１当りニ換算）、培養Ｐ液中に
それぞれ０．２＃声ｆｉ　ｒ　ｏ、　ｏ参μｇであった
。また、Ｎ−（ａ−クロル−夢−ピリジル）　　Ｍｌ−
フェニル尿素を加えずに同様に培養し走時のこれらの生
成量は、細胞中にトリプテイオライドａ、／ｊμｇ、ト
リプトライ）”　００２μｌ（各々培地ｌ−当妙に換算
）、培養Ｐ液中には’ｔｔＬソｔＬＯ，／７ｆｉｌｅ　
ＱＯＪｔｔｌｌ（各に培地ＩＷｈｌ幽シに換算）であっ
た。

Ｎ−（Ｊ−クロル−参−ピリジル）−Ｎ１−フェニル尿
素ｃＬ／　ｗ＊’４を加えた培養基／ＩＩから得九細胞
／＃コｆ（乾燥重量）中よ襲、トリプデイ第２イド１．
４１Ｑ、トリプトツイド０．７！嗜を、また、培養液か
らはトリメディオライド１１噌。

トリットライドＱ、ｔλ−の白色粉末を得ることができ
た。

実施例よ Ｎ−（コークロルー弘−ビリジル）−Ｎ１−フェニル尿
素の代シに第１ＩＩＫ示される化食物を用いる他は実施
例コを繰返し第１ＩＩＫ示す結果を得九。

第７表 Ａ：）ｉ−（−一りロルー参−ビリジル）　−Ｎｌ　−
（、−メチル−フコニル）尿素 Ｂ：Ｎ−（Ｊ−クロル−参−ビリジル）　−Ｍｌ　−（
０−クロルフェニル）尿素 ｃ：ｗ−（ａ−フルオル−夢−ビリジル）　−Ｍｌ−フ
ェニル尿素 ｎ：Ｎ−（コーメトキシー参−ビリジル）　−）Ｊｌ−
フェニル尿素 ＫＩＮ−（コープロム−参−ビリジル）　−Ｎｌ　−フ
ェニル尿素 ｙ：Ｎ−（コーアセトアミドー参−ビリジル）−Ｎ’−
フェニル尿素 Ｇ：Ｎ−（コーメトキシー参−ビリジル）−Ｎｌ−フェ
ニルチオ尿素 特許出願人 岡　　本　　敏　　豪 ４９Ｆ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 トリプテリギウム属に属し、トリプトライドおよび／ま
   たはトリプデイオライドを生産する能力を有する植物を
   一般式 〔式中Ｒ１はハロゲン、ヒドロキシル、低級アルコキシ
   、低級アルキルチオ、低級アルコキシカルボニル、ベン
   ゾイルアミノ、低級アルコキシカルボニルアミノ、シア
   ノ又はトリフルオルメチルを示し、Ｒ２は水素又は低級
   アルキルを示し、Ｒ３は酸素又は硫黄を示し、Ｒ４は装
   置換又は低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシル
   又はハロゲンで置換された芳香族炭化水素を示す〕で表
   わされる化合物の存在下に組織培養し、培養物又は培養
   基中に該物質を生成蓄積せしめ、蓄積した該化合物を採
   取することを特徴とするトリプトライドおよび／または
   トリプデイオライドの製造法。